Tesis Electrónicas UACh - Universidad Austral de Chile

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Agronomía
Selección y evaluación de aislamientos de bacterias del género Bacillus
Cohn, antagonistas de Fusarium solani (Mart.) Sacc. y Fusarium
oxysporum Schlecht, presentes en calas de colores.
Tesis presentado como parte de
los requisitos
para optar al
grado
de licenciado en
Agrónomía.
Elizabeth Vanessa Venegas Gonzalez
VALDIVIA – CHILE
2006
PROFESOR PATROCINANTE
Luigi Ciampi P.
____________________
Ing. Agr. Ph. D.
PROFESOR INFORMANTE
Roberto Carrillo
____________________
Ing. Agr. Ph. D.
PROFESOR INFORMANTE
Eduardo Valenzuela
____________________
Ciencias Ph. D.
INSTITUTO DE PRODUCCIÓN Y SANIDAD VEGETAL
I
ÍNDICE DE MATERIAS
Capítulo
Página
1
INTRODUCCIÓN
1
2
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3
2.1
El cultivo de la cala
3
2.1.1
Clasificación de Zantedeschia
3
2.1.1.1
Grupo 1
3
2.1.1.2
Grupo 2
3
2.1.2
Cultivares
4
2.1.3
Desarrollo en el ámbito mundial
4
2.1.4
El cultivo en Chile
5
2.1.5
Patologías de relevancia económica
5
2.2
Fusarium spp.
6
2.2.1
Distribución y rangos de hospederos
6
2.2.2
Características taxonómicas
7
2.2.3
Ciclo de vida
8
2.2.3.1
Sintomatología
9
2.2.4
Métodos de control de Fusarium
10
2.3
Control biológico
10
2.3.1
Antibiosis
11
2.3.2
Bacillus sp.
13
2.3.2.1
Hábitat
14
2.3.2.2
Identificación de especies del género Bacillus
15
2.3.2.3
Posibles aplicaciones de Bacillus como controlador
15
II
Página
Capítulo
18
3
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1
Materiales de laboratorio
18
3.1.1
Equipos
18
3.1.2
Otros materiales
18
3.1.3
Medios de cultivo
19
3.1.4
Reactivos
19
3.1.5
Tinciones
19
3.2
Material biológico
19
3.2.1
Fuentes de aislamientos
19
3.2.2
Caracterización y procedencia de las cepas de Fusarium
spp.
20
3.3
Aislamiento de antagonistas
20
3.4
Pruebas de antagonismo
23
3.5
Evaluación de resultados
25
3.6
Análisis estadístico
26
3.7
Pruebas de patogenicidad
26
3.8
Identificación de especies de Bacillus
27
3.8.1
Sistema API
28
3.9.2
Test tradicional
29
3.9
Microscopía electrónica de barrido (MEB)
31
3.10
Almacenaje y conservación de las cepas bacterianas
32
4
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
33
4.1
Aislamiento de antagonistas de Fusarium spp
33
4.1.1
Primera prueba de antagonismo
34
4.1.1.1
Características de las cepas
34
4.1.2
Segunda prueba de antagonismo
34
4.2
Análisis estadístico de la segunda prueba de antagonismo
40
4.2.1
Análisis de conglomerado
40
4.2.2
Tablas de Contingencia
43
III
Capitulo
Pàgina
4.3
Prueba de patogenicidad
45
4.4
Identificación de los aislamientos de Bacillus spp.
48
4.4.1
Sistema API
48
4.4.2
Sistema tradicional
49
5
CONCLUSIONES
54
6
RESUMEN
55
SUMMARY
7
BIBLIOGRAFIA
ANEXOS
59
65
IV
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro
1
Página
Caracterización de las cepas de Fusarium spp., en función del
color de las colonias y nivel de virulencia
2
Ponderación de efectos causados por el antagonista, según el
grado de inhibición sobre las cepas fúngicas
3
25
Origen de los 138 aislamientos bacterianos a partir de diferentes
muestras de calas de colores
4
21
33
Preselección de bacterias antagonistas, enfrentadas a F. solani y
F. oxysporum
34
5
Resumen de análisis de conglomerado
42
6
Tabla de Contingencia. Relación entre la inhibición de las 6 cepas
de Bacillus y nivel de patogenicidad de las cepas de Fusarium
7
43
Tabla de contingencia. Relación entre las especies de Fusarium y
su inhibición causada por las seis cepas de Bacillus
44
8
Resultados del análisis de patogenicidad
45
9
Resultados de pruebas para determinar la especie
51
V
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
1
Características de hongos del género Fusarium spp.
2
Ciclo de la enfermedad “marchitez vascular de la cala”,
causada por Fusarium spp
3
22
Algunos ejemplos de coloración de cepas de Fusarium
solani sobre placas con APD
6
20
Algunos ejemplos de coloración de cepas de Fusarium
oxysporum sobre placas con APD.
5
9
Esquema de muestreo de plantas en los invernaderos del
vivero
4
7
22
Representación esquemática de aislamiento de bacterias
formadoras de endosporas, pertenecientes al grupo Bacillus
spp.
23
7
Esquema que ilustra la primera prueba de antagonismo
24
8
Esquema que ilustra la segunda prueba de antagonismo
25
9
Galerías del sistema API, antes de comenzar las pruebas
bioquímicas para la identificación de especies. Arriba, API 50
CH. Abajo, API 20E
10
Efecto de las bacterias antagonistas sobre una cepa de
Fusarium
11
28
35
Pruebas de antagonismo con algunas cepas de Fusarium
spp. Izquierda, 8 de julio del 2004 (una semana). Derecha,
16 de julio del 2004 (dos semanas)
12
Vista frontal y lateral de placa Petri con un ejemplo de la
segunda prueba de antagonismo, sobre APD
13
36
37
Fusarium solani en APD, enfrentado a bacterias del genero
Bacillus en microscopio de barrido
37
VI
Figura
14
15
Página
Fusarium solani en APD, observado en microscopio de
barrido
38
Fusarium oxysporum en agar APD, enfrentadas a las
39
Bacillus subtilis.
16
Observados en microscopio de barrido
Fusarium oxysporum en APD, observado en microscopio de
39
barrido
17
Conglomerado de las cepas antagonistas luego de una
40
semana
18
Resumen de análisis luego de una semana
41
19
Cluster de las cepas antagonistas después de la segunda
41
semana
20
Resumen de análisis para la segunda semana
21
Resultado de testigos y fotografía microscópica (X1000) a
41
túbero con Bacillus
46
22
Prueba de patogenicidad de las cepas de Bacillus
47
23
Resultados de las galerías API, luego de 48 h de incubación
a 30° C, bajo condiciones aerobias
24
49
Método de Wirtz para tinción de endosporas de cepas de
Bacillus subtilis. Cepa N° 6.
25
Cepas antagonistas del grupo Bacillus subtilis liofilizadas
26
Fotos de microscopía electrónica de barrido, para determinar
el tamaño de la especie de Bacillus
51
52
53
VII
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo
Página
1
Medio de cultivo agar papa dextrosa
66
2
Medio de cultivo agar peptona
66
3
Medio de cultivo agar inclinado
66
4
Medio de cultivo caldo Peptona
67
5
Medio de cultivo agar almidón
67
6
Medio de cultivo caldo nutriente
67
7
Medio de cultivo agar leche
68
8
Medio de cultivo agar Sabouraud dextrosa
68
9
Medio de cultivo Voges Proskauer
68
10
Agar cerebro corazón
69
11
Tinción de Gram.
69
12
Tinción de endosporas, método de Wirtz
69
13
Resultado de test API 50CH para las cepas 6,7,8,9 y 44
70
14
Resultado de API 20 E para las cepas 6, 7, 8, 9 y 44
70
15
Resultado cepa 10 de API 50 CH
71
16
Resultado de API 20 E, para la cepa Nº 10
71
17
Resultados de medición de las cepas del grupo Bacillus subtilis
72
18
Resultados de la identificación mediante API bioMéreux, para las
19
cepas 6, 7, 8, 9 y 44
72
Resultados de la identificación mediante API bioMéreux, para la
cepa 10
72
20
Resultados de antagonismo, primera semana
73
21
Resultados de antagonismo, segunda semana
79
1 INTRODUCCIÓN
En Chile, la floricultura se percibe como una buena alternativa de producción,
ya que otorga una alta rentabilidad. Dentro de la amplia variedad de flores factibles de
cultivar, se encuentran las calas de colores (Zantedeschia Spreng), muy valoradas en
el extranjero por sus hermosos tonos y larga vida tanto en el medio, como después de
cortada.
Debido a su producción intensiva bajo invernadero, esta especie puede
presentar diferentes tipos de problemas fitosanitarios, ya que el ambiente en el que se
cultiva, es propicio para la actividad de diversos agentes fitopatógenos, tales como
hongos y bacterias.
En Chile, se destaca la bacteria de la familia Enterobacteriaceae, Erwinia
carotovora Jones, por los graves problemas que produce en el cultivo. Asimismo,
existen estudios realizados en el extranjero que demuestran la presencia de Fusarium
Link, como un agente causal de la marchitez vascular en calas de colores. Este agente
fue estudiado en plantaciones de la Décima Región, Chile, donde investigaciones
señalan la presencia de cepas de Fusarium solani (Mart.) Sacc. y Fusarium oxysporum
Schlecht , con distintos grados de virulencia.
Las técnicas utilizadas para el control de agentes fitopatógenos, están basadas
en diferentes aspectos. Por ejemplo, se puede trabajar con mejorar la resistencia
genética del hospedero, o favorecer el medioambiente para la planta o aplicar
pesticidas sintéticos. Sin embargo, existe una gran demanda mundial por otro tipo de
control más “amigable” con el medio y que supla o reemplace a los ya utilizados.
En la actualidad, el control biológico de patógenos en plantas ofrece una
novedosa alternativa al manejo químico. Este último ha generado muchos problemas
2
ambientales y subsecuentemente ha disminuido su efectividad, aumentando en
numerosos casos la resistencia de los patógenos a este tipo de tratamiento.
El género Bacillus Cohn es conocido por incluir especies que ejercen un buen
control de patógenos vegetales. Las características propias de este grupo las hace
resistentes a diversas condiciones del medio ambiente, lo que sugiere que puedan ser
utilizadas como biocontrolador.
Debido a lo anteriormente expuesto, esta tesis plantea la siguiente hipótesis:
En la naturaleza existen cepas del género Bacillus que inhiben el crecimiento in
vitro de aislamientos de las especies de F. oxysporum y F. solani.
Para ello se ha planteado el siguiente objetivo general:
Obtener, evaluar e identificar aislamientos pertenecientes al género Bacillus que
sean antagonistas in vitro de cepas de F. oxysporum y F. solani que afectan el cultivo
de calas de colores.
Los siguientes son los objetivos específicos:
- Aislar bacterias de diferentes fuentes de calas de colores que sean
esporuladores, aerobios, Gram (+) (Bacillus spp.).
- Realizar un cepario de cultivos puros de aislamientos de Bacillus.
- Identificar aislamientos del género Bacillus que causen inhibición in vitro de las
cepas de F. oxysporum y F. solani.
- Efectuar pruebas de patogenicidad de las cepas del Bacillus seleccionadas,
para evaluar su efecto sobre las calas de colores.
- Preservar las cepas seleccionadas.
3
2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.
2.1
El cultivo de la cala.
Según HERTOGH y LE NARD (1993), Zantedeschia spp. pertenece a la familia
Araceae y fue descrito por primera vez en 1829 por Sprengel. Los primeros testimonios
sobre este género nacieron en 1687 adoptando una serie de nombres comunes, entre
ellos, calla, aroides, arodes y richardia. Sus representantes son endémicos de
Sudamérica, Asia y África continental.
2.1.1
Clasificación de Zantedeschia.
Según el NATIONAL BIODIVERSITY
INSTITUTE (2005), la clasificación de este género es la siguiente:
Reino
Plantae.
Phylum
Magnoliophyta
Clase
Liliopsida.
Orden
Arales.
Familia
Araceae.
Genero
Zantedeschia.
.
Se divide en dos grupos los cuales se describen a continuación.
2.1.1.1 Grupo 1. Una sola especie llamada Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng “cala
blanca”, se caracteriza como “siempre verde”, adaptada a zonas húmedas. En cuanto a
su ciclo de vida se propaga por rizomas, presenta dormancia estival y florece a fines de
invierno y primavera (SEEMANN y HOFFENS, 1999).
2.1.1.2 Grupo 2. Contiene seis especies las cuales se caracterizan por ser deciduas y
propagarse por túberos. De éstas, la mayoría tiene dormancia invernal, menos Z.
odorata Per., que presenta dormancia estival (SEEMANN y HOFFENS, 1999).
4
Según GARDNER (2000) las especies y las subespecies, son las siguientes:
Z. rehmannii Engl.
Z. jucunda Let.
Z. elliottianna (Watson) Engl.
Z. pentlandii Why.
Z. odorata
Z. albomaculata (Hook.) Baill.
Z. albomaculata subsp. albomaculata
Z. albomaculata subsp. valida
Z. albomaculata subsp. macrocarpa
2.1.2
Cultivares. Al realizar cruzamientos entre individuos del segundo grupo se
pudo crear más de 120 híbridos de diferentes colores, de ellos solo la mitad es
comercializada para cultivo en maceta, flor cortada o doble uso (SEEMANN y
HOFFENS, 1999).
2.1.3 Desarrollo en el ámbito mundial. HERTOGH y LE NARD (1993), explican
que en 1990 Nueva Zelanda produjo una gran cantidad de calas, en ese año exportó
mas de 3 millones de flores de un total de 120 cultivares. Otros países productores de
importancia fueron los Países Bajos, USA, Israel y Japón. Siendo este último, además
importador de túberos y flores.
WRIGHT y BURGE (2000), señalan que dentro de la industria florícola, Nueva
Zelanda continua ocupando un rol importante, alcanzando en el año 1999 una
participación de 19,9%. En la actualidad, esta posición se mantiene y dentro de los
volúmenes totales de flores exportados, las calas ocupan el segundo lugar. El éxito de
este país se debe a la existencia de un programa de mejoramiento, que tiene una data
de ocho años. Además, de su desarrollo comercial, que esta enfocado a la entrega de
variedades que puedan ser producidas en el extranjero, estableciendo alianzas con
compañías para que las produzcan y lograr extenderse a nivel mundial (CHILE,
FUNDACIÓN PARA LA INNOVACIÓN AGRARIA (FIA), 2004).
5
2.1.4
El cultivo en Chile. Según Münzenmayer, citado por FERNANDEZ (2004),
Chile tiene ventajas comparativas con respecto a los otros países productores, gracias
a la contraestación con el Hemisferio Norte y que los dos grandes productores de
Sudamérica (Ecuador y Colombia), por su clima, no producen flores bulbosas de
calidad (lilium, tulipanes, calas de colores) a diferencia de Chile.
Según SEEMANN y HOFFENS (1999), las calas de colores comenzaron a ser
comercializadas en el país desde los años 90; la producción se localizaba en las
Regiones VIII, X y XI.
A partir del año 1999, se observa una mayor importancia de las calas de colores
como cultivo emergente entre los bulbos florícolas de exportación de la zona sur. En
este mismo año, aumentó la importación de bulbos de calas desde Nueva Zelanda, ya
que comenzó el trabajo cooperativo entre empresas chilenas y neozelandesas
(FUNDACIÓN CHILE, 2003;CHILE, OFICINA DE ESTUDIOS DE POLÍTICAS
AGRARIAS (ODEPA), 2004; FIA, 2004).
Actualmente se está realizando un proyecto (Innova Bío Bío) cuyo propósito es
comercializar calas de colores a EEUU. Un intermediario adquirirá la producción de
proveedores locales que no poseen un volumen suficiente para la exportación por sí
solos, otorgándoles una salida a un mercado externo a mejores precios que los del
chileno. Además, en el valle de Casa Blanca se creó una empresa modelo de
micropropagación de flores (Vitro Centre Chile VCC), que exportará bulbos de calas de
colores a Nueva Zelanda, con lo cual se espera que a un plazo diez años, Chile
tendrá una participación de 10% en este mercado (FERNANDEZ, 2004).
2.1.5 Patologías de relevancia económica. Según HERTOGH y LE NARD (1993),
los organismos que provocan pudrición de túberos y raíces en terreno son: Erwinia
carotovora, Phytophthora Bary., Pythium Pringsh y Rhizoctonia D.C. También se
reconoce la importancia del genero Penicillium Link, como causante de pudrición de
túberos en almacenaje; en tanto que los agentes causantes de daño en la parte aérea
corresponden a Phytophthora spp., Xanthomona campestris (Pamm.) Dow. Entre los
6
hongos que producen daño a la flor desde su cosecha hasta el transporte se encuentra
Alternaria Nees ex Fr.
En general, existe escasa información sobre problemas que causa el género
Fusarium en plantas de calas. La aproximación mas cercana al problema, fue un
estudio realizado en Nueva Zelanda por WRIGHT (1998), donde se aislaron cuatro
agentes patógenos que ocasionan grandes daños al cultivo; estos fueron Fusarium
solani, Rhizoctonia spp., Pythium spp y Erwinia carotovora subsp. carotovora. Si bien
F. solani, fue caracterizado como un patógeno de importancia, se encontró un mayor
daño en plantas infectadas con Erwinia carotovora subsp. carotovora.
2.2
Fusarium spp.
Según MONZÓN y RODRÍGUEZ (2005), este género tiene la siguiente
taxonomía:
Reino: Fungi
Phylum: Deuteromicotina
División: Ascomycota
Clase: Euascomycete
Orden Hypocreales
Familia: Hypocreaceae
Género: Fusarium
Estos hongos se caracterizan por vivir en el suelo en forma permanente, así
como también en plantas muertas o vivas; siendo un fitopatógeno común
(SUBRAMANIAN, 1983).
El género presenta especies anamorfas, pero existen algunas que presentan
estados perfectos. Los telomorfos se incluyen en los géneros Gibberella y Nectria;
ejemplo de esto es Nectria haematococca Berk. & Br., cuyo estado imperfecto es F.
solani (ALEXOPOULOUS et al., 1996).
7
2.2.1 Distribución y rango de hospederos. Ampliamente distribuidos en el mundo,
estos hongos pueden atacar principalmente a flores, hortalizas anuales, plantas
perennes herbáceas, ornamentales y arbóreas (AGRIOS, 1996).
Cabe destacar que el desarrollo de Fusarium es favorecido en cultivos bajo
invernadero, ya que las condiciones de temperatura, luz, alta densidad de plantas,
elevada humedad y regímenes de fertilización son favorables tanto para el patógeno
como para la planta (PAULITZ y BELANGER, 2001).
2.2.2 Características taxonómicas. Según lo señalado por la UNIVERSIDAD DE
TORONTO (2005), este género produce tres tipos de esporas asexuales, las cuales
son microconidias, macroconidias y clamidiosporas (Figura 1). Estas últimas son las
esporas de resistencia que le permiten soportar ambientes adversos. Las
macroconidias se agrupan en esporodoquios que se encuentra frecuentemente en la
superficie de plantas que han sido destruidas. Las macro y microconidias se generan
de las fiálides, para luego ser liberadas al medio. Estos son elementos de importancia
para su clasificación.
macroconidia
macroconidia
clamidiospora
monofiálides
esporodoquio
monofiálides
microconidia
microconidia
A
B
clamidiospora
FIGURA 1 Signos microscópicos que caracterizan a los hongos del género
Fusarium.
*
A, F. oxysporum. B, F. solani
FUENTE: MONZÓN y RODRÍGUEZ (2005).
8
Con respecto a la taxonomía de este género, existe un gran problema para
caracterizarlo a nivel de especie, ya que éste presentan una amplia variabilidad al
modificarse el ambiente en el que se encuentran; por esto es que se pueden adaptar a
un gran rango de sustratos, cambiando su estructura esporal y septos. Además de
esto, varía la pigmentación según el pH del medio de cultivo (BOOTH, 1975).
En la Figura 1B, se observa la característica de la macroconidia de F. solani
que tiene forma de canoa. Además, presenta una monofiálide que da origen a una
microconidia con forma cilíndrica a oval. Luego, en la Figura 1A, se aprecia a F.
oxysporum, que tiene monofiálides cortas que se insertan en ángulo recto en las hifas
del hongo, y pueden estar solas o en verticilos. Las macroconidias son similares a la
especie anterior, pero son mas aguzadas (BOOTH, 1977).
2.2.3
Ciclo de vida. Este hongo es un organismo saprófito cuya característica es
sobrevivir indefinidamente; infectando a las plantas a través de las raíces en proceso
de elongación o ingresando por heridas de órganos subterráneos. Comienza el ciclo
con la penetración del hongo en los órganos subterráneos, formando inmediatamente
micelio y conidias en el interior, lo que provoca el síntoma llamado pudrición seca (ver
Figura 2). En la superficie de los túberos y raíces, se forman pústulas llamadas
esporodoquios; al estar los túberos almacenados, se produce la inoculación de los
propágulos sanos, por causa de la liberación de las macroconidias provenientes de los
esporodoquios, lo que lleva a un ciclo recurrente. Al plantar los túberos con Fusarium
spp., se infesta el suelo y se inoculan las plantas sanas, generando la formación de
microconidias que se extienden a los vasos xilemáticos, luego el micelio y las esporas
del hongo ascienden en la planta a través de sus vasos xilemáticos, los cuales son
bloqueados por el cuerpo del hongo o las sustancias (polisacáridos) que producen. La
obstrucción se incrementa, al formarse geles y gomas por la acumulación y oxidación
de los productos de degradación de las células vegetales atacadas por las enzimas del
hongo (AGRIOS, 1996).
Cuando muere la planta, o al terminar el ciclo del cultivo, el hongo inverna en el
suelo o restos de plantas como espora, micelio o clamidiospora, pudiendo ser
9
dispersados por el agua del suelo, equipos agrícolas, túberos y viento, entre otros,
Para luego continuar con el ciclo (AGRIOS, 1996).
Túberos infectados en
cosecha,
almacenaje
transporte. (Heridas)
Formación de micelio y conidias en
el interior de las células
la
y
Germinación de conidias y
penetración del hongo a
través del tejido
Túberos con pudrición
seca, formación de
conidias en esporodoquios
Infección de túberos por
inóculos del suelo
Plantación de túberos
infectados
Estados del hongo en
tejidos infectados del
suelo
Formación de
micelios y esporas
en el suelo
l
l
FIGURA 2 Ciclo de la enfermedad “marchitez vascular de la cala”, causada por
Fusarium spp.
FUENTE: Adaptado de AGRIOS (1996).
2.2.3.1 Sintomatología. El síntoma inicial es una amarillez de las hojas, continuando
con la marchitez de la planta. Las hojas más viejas pueden tender a enrollarse y caer,
luego hay empardecimiento y muerte de vástagos y hojas, terminando en pocas
semanas con la muerte de sus órganos que se encuentran sobre el punto de invasión;
ocasionalmente se puede observar la muerte de la planta infectada. En los órganos de
10
reproducción vegetativa se visualiza una pudrición seca ( AGRIOS, 1996; ESCAFF,
2001).
2.2.4 Métodos de control de Fusarium.
Según ESCAFF (2001), el control
preventivo consiste en: seleccionar órganos vegetativos sanos para el almacenaje,
evitar producir heridas durante la cosecha del material de propagación, desinfectar los
túberos antes de plantarlos. Por último, rotación de cultivos durante cuatro años, lo
que no puede ser practicado en este caso, ya que es un cultivo intensivo bajo
invernadero.
Otro tipo de control es a través de productos químicos, pero como este hongo
actúa internamente, el uso de funguicidas de contacto no funciona. En general, la
fumigación con pesticidas es costosa y de efecto poco duradero, sin embargo, en
algunos casos ha tenido éxito (AGRIOS, 1996).
PAULITZ y BELANGER (2001), señalan que no existen funguicidas registrados
para controlar enfermedades bajo invernadero, ya que este mercado es muy pequeño
y el costo de registro e investigación es alto. Además, de un bajo retorno de la
inversión, lo que no es ventajoso para las industrias dedicadas a producir pesticidas
químicos. Asimismo, los funguicidas tienen una residualidad más larga, con el riesgo
de que el patógeno se haga resistente a los funguicidas aplicados, debido a la
aplicación reincidente de funguicidas, única alternativa posible en el control químico, al
existir poca variedad de ellos. Este dato es importante ya que a nivel comercial el
cultivo de las calas de colores se realiza principalmente bajo invernadero.
2.3
Control biológico.
La definición de control biológico según BAKER y COOK (1989), es “la
reducción de la densidad del inóculo o de las actividades que causan el daño
producido por el patógeno o parásito en estado activo o dormante, para cualquier
microorganismo; esto puede ser en forma natural o a través de la manipulación del
medioambiente, hospederos, antagonistas o por la introducción de cantidades de uno o
varios antagonistas”. Esta definición es muy amplia, ya que abarca prácticamente a
todo tipo de control fuera del químico. En esta oportunidad se hará referencia a la
11
utilización de organismos antagonistas. Entendiendo este término como aquellos seres
vivos que interfieren en la supervivencia o desarrollo de los patógenos.
Los controladores biológicos se visualizan como una buena alternativa para
disminuir las enfermedades de cultivos bajo invernadero, como es el caso de la cala,
puesto que las condiciones controladas del medio son óptimas para el agente
biocontrolador. Además, se puede costear el alto valor que se requiere para utilizarlos,
ya que estos cultivos se caracterizan por dar buenos retornos al productor (PAULITZ y
BELANGER, 2001).
Es posible aislar antagonistas en forma simple, pero al introducirlo en
ambientes complejos, como la rizósfera (la capa de interacción entre el tejido vegetal
de las raíces y la solución suelo) o el filoplano (relación entre la superficie foliar y la
microflora), es casi inexistente la información sobre características que debe tener el
ecosistema para que el organismo logre sobrevivir y ser activo como agente
controlador. Sin embargo, en el mundo existen más de 80 productos de biocontrol de
patógenos, los que han sido formulados a base de hongos, tales como Gliocladium y
Trichoderma, o bacterias como Pseudomonas y Bacillus (CAMPBELL y MACDONALD,
1989; PAULITZ y BELANGER, 2001).
Según EMMERT y HANDELSMAN (1999), entre las bacterias Gram-positivas,
Bacillus y Streptomyces ofrecen propiedades de resistencia al calor y desecación por
tener esporas, lo que permite que se puedan hacer formulaciones exitosas, pudiendo
presentarse como polvos secos. Todo lo dicho antes eliminaría los problemas al ser
almacenados y fermentar en algún momento dado.
Los antagonistas logran diferentes modos de acción. Según, los mecanismos
de biocontrol son clasificados en: Competencia, parasitismo/predación, antibiosis e
inducción a la resistencia (BAKER y COOK, 1989).
2.3.1 Antibiosis. Es descrita como una forma de antagonismo en donde se utilizan
metabolitos específicos y no específicos, de origen microbial. Estos compuestos
12
pueden ser sustancias volátiles, enzimas o algún metabolito tóxico (FRAVEL, 1988;
BAKER y COOK, 1989).
MADIGAN et al., (1998) señalan que existen dos tipos de metabolitos:
- Los metabolitos primarios, son el producto de la fase inicial del crecimiento del
microorganismo, por ejemplo etanol, obtenido por fermentación.
- Los metabolitos secundarios, no están asociados a procesos biosintéticos
primarios, ni al crecimiento, sino más bien, se relacionan con la fase estacionaria (el
plateau de la curva de crecimiento microbial), pero se originan a partir de precursores
primarios. Estas son complejas moléculas orgánicas, que se pueden producir en forma
industrial. Dentro de los metabolitos secundarios se encuentran los antibióticos,
pigmentos y otros compuestos útiles.
Los autores definen a los antibióticos como “sustancias químicas producidas
por microorganismos, que matan o inhiben el crecimiento de otros microorganismos”.
Existen miembros de pocos géneros capaces de producirlos, tales como Streptomyces,
Penicillium y Bacillus (MADIGAN et al., 1998).
Se
han
identificado
decenas
de
nuevas
sustancias
antimicrobianas
provenientes de bacterias del género Bacillus, algunas de las cuales tienen
propiedades favorables para el control de hongos y bacterias; dentro de las sustancias
antifúngicas, se encuentran zwittermicina A (aminopol), baculomicina (iturina), y las
fusaricidinas B, C y D (depsipéptidos) (STABB et al., 1994; ESCHITA et al., 1995;
KAJIMURA y KANEDA, 1997). En la mayoría de los casos el antibiótico se libera al
llegar a la fase de esporulación (MADIGAN et al., 1998).
Cabe señalar que la antibiosis en un medio de cultivo, no necesariamente indica
que sea efectivo en el suelo; existiendo una pequeña posibilidad de que el
microorganismo antagonista in vitro, logre ser utilizado a nivel de campo (BAKER,
1968). Aun así, BAKER y COOK (1974), señalan que este tipo de método es útil para
seleccionar individuos antagonistas, para el uso subsecuente en el suelo.
13
FRAVEL (1988), indica que del total de microorganismos encontrados en el
suelo, un 40 % tiene la posibilidad de inhibir a uno o mas especies de patógenos en
agar, de estos el 4 % puede ser efectivo en el control en condiciones ambientales
reales. Aun así, explica que los microorganismos que no provocan efectos inhibitorios
sobre los patógenos in vitro, tampoco lo harán en el suelo.
2.3.2 Bacillus spp. La taxonomía de este género es la siguiente:
Reino: Bacteria.
Phylum: Firmicutes.
Clase: Bacilli.
Orden: Bacillales.
Familia: Bacillaceae.
Género: Bacillus.
Presentan forma de bastón, formadores de endosporas, mesófilos, la
temperatura promedio varía según la especie, pero se observa
un máximo de
crecimiento entre los 30-45º C. Usualmente son Gram positivos. Las endosporas
formadas en las células, pueden permanecer en dormancia por largos periodos de
tiempo, ya que les permite resistir condiciones desfavorables como calor, radiación
gamma y ultravioleta, ácidos y agentes químicos (como peróxidos); facultándolas para
sobrevivir durante meses o años (BAKER y COOK, 1989; MADIGAN et al., 1998). Son
aeróbicos o anaeróbicos facultativos y catalasa positivos. La apariencia de las colonias
varían dependiendo de factores ambientales (CLAUS y BERKELEY, 1984).
El género Bacillus es conocido como un buen productor de antibióticos con
actividad antifúngica, que además tienen propiedades químicas de termoestabilidad
(BERNAL et al., 2002). Conjuntamente, estas bacterias presentan la ventaja
comparativa de que las proteínas producidas, deben atravesar solo una membrana
para ser vertidas al medio ambiente extracelular, lo que implica la capacidad de
producir comercialmente una enorme cantidad de ellas ( VAN WELY, 2000).
Según EMMERT y HANDELSMAN (1999), el primer éxito de control biológico
se logró con bacterias del género Bacillus. La especie Bacillus thuringiensis Berliner ha
14
sido un exitoso bio-insecticida desde hace 25 años. Actualmente se está
experimentando con cepas de Bacillus subtilis Ehrenberg, que han demostrado ser
eficaces controladores de especies del género Fusarium. En el año 1994 la cepa GB03
fue usada en 2.000.000 ha. de cultivos. Esta última especie, presenta tres familias de
lipopéptidos que actúan como antibióticos: Iturinas, surfactinas y fengycinas, de las
cuales las dos primeras poseen propiedades antifúngicas (AKPA et al., 1999).
Actualmente, el biofungicida más utilizado es Serenade® (introducido a
Sudamérica en 1999), cuyo ingrediente activo es B. subtilis QST713, su espectro de
actividad incluye 40 patologías. Posee la característica de presentar antibióticos del
grupo de las iturinas (lipopéptidos), que tiene una amplia actividad antifúngica;
generada por la interacción del lipopéptido con la membrana plasmática de la célula a
controlar. Dentro de la célula, se forman poros conductores de iones, debido a la
asociación de la iturina con lípidos de la membrana; de esta forma se aumenta la
permeabilidad del K+, de tal forma que causa la liberación de este junto con otros
constituyentes vitales, provocando la muerte celular (MAGET- DANA et al., 1985;
MARRONE et al., 2000).
Cabe señalar, que se ha demostrado que la mayoría de las cepas aisladas de
B. subtilis, presentan las características de producir antibióticos que no inhiben el
crecimiento de antagonistas asociados y organismos saprofiticos actinomycetes; lo
cual es un punto a favor para ser considerados buenos antagonistas (BAKER y COOK,
1974).
2.3.2.1 Hábitat. En cuanto al hábitat, generalmente se encuentran en el suelo, por lo
que fácilmente pueden ser llevados a diversos lugares. Existen otros ambientes como
el agua, sedimentos marinos, alimentos, leche, restos de plantas, entre otros. Es
conocido por ser cosmopolita (CLAUS y BERKELEY, 1984).
MADIGAN et al., (1998), señalan que estos microorganismos son fáciles de
aislar desde el suelo o partículas de polvo en suspensión, para luego incorporarlas en
placas con medios de cultivo con pH neutro, regulando la temperatura, los nutrientes y
el oxígeno.
15
Para lograr un cultivo in vitro de Bacillus, es necesario disponer de medios
sintéticos que contengan fuentes de carbono, tales como azúcares, ácidos orgánicos,
alcoholes, entre otros. El amoníaco se utiliza como única fuente de nitrógeno. Dentro
de este género, existen bacterias que producen enzimas hidrolíticas extracelulares que
rompen los ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos, para que los organismos logren
usarlos como fuente de energía y carbono (MADIGAN et al., 1998).
2.3.2.2 Identificación de especies del género Bacillus. Según lo Indicado por LOGAN y
BERKELEY (1984), la identificación de las especies de Bacillus se conoce desde hace
mucho tiempo, existiendo numerosas publicaciones que discuten este tema, ya que
este género tiene una alta importancia en el ámbito medicinal e industrial.
La identificación se realiza a través de la caracterización fenotípica descrita por
Claus y Berkeley (1986) y Gordon et al., (1973), y genotípica definido por Aquino de
Muro y Priest (1993) con la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, conocida
como PCR (REVA et al., 2001).
LOGAN y BERKELEY (1984), señalan que entre las pruebas fenotípicos se
encuentra el clásico descrito por Smith et al., (1946) y Gordon et al., (1973), que tiene
la desventaja de requerir de medios especiales con baja vida media, tiempo
prolongado de aplicación y de alto valor económico; factores que en conjunto provocan
un encarecimiento del test. Se pueden obtener resultados inconsistentes, como
consecuencia de tener mala estandarización de los medios.
Existe otro sistema de caracterización fenotípica, llamado API bioMerieux, que
se muestra como una buena alternativa para identificar en forma rápida las especies de
Bacillus, a través de la discriminación de valores. Sin embargo, los autores aseguran
que este sistema, a pesar de sus excelentes cualidades, no puede separar claramente
algunas cepas con características intermedias, por esta razón es necesario conocer la
morfología de estas (cadena de células, cuerpo paraesporal, esporas, motilidad,
vacuolas, inclusiones cristalinas y tamaño de la célula) (LOGAN Y BERKELEY, 1984).
16
2.3.2.3 Posibles aplicaciones de Bacillus como controlador. Según MARTÍNEZ et al.,
(1997), existen tres posibles aplicaciones en el uso de una bacteria antifúngica en el
control de enfermedades de plantas:
a) Puede ser aplicada directamente en campo, como agente de control de la
enfermedad; sin embargo, su uso es difícil debido a las complejas interacciones
ambientales asociadas a las condiciones de campo, tales como la colonización
bacteriana pobre en las partes de la planta involucradas, debido a la competencia,
sensibilidad a la luz ultravioleta u otras condiciones adversas de crecimiento, como por
ejemplo los factores edáficos del suelo, incluyendo la temperatura, pH, humedad y la
proporción de coloides (MARTÍNEZ et al., 1997; WELLER, 1988).
Según BAKER (1968), al tratar el suelo con vapor caliente, se eliminan los
patógenos, sin destruir algunos organismos saprófitos residentes, de esta forma, el
efecto del antagonista es mayor, al ser inoculado luego del tratamiento. Ejemplo de
esto una cepa de B. subtilis, que fue probado como antagonista en forma in vitro de
Rhizoctonia spp., al ser inoculado en un suelo previamente tratado, logró efectos
inhibitorios, sobre el agente patógeno Sin embargo, no es necesario realizar este tipo
de operación en todos los casos, existiendo algunas cepas, como B. subtilis A13, que
logran el objetivo de biocontrol en diferentes cultivos con la posibilidad de estimular el
crecimiento de la planta, sin importar el tratamiento del suelo (WELLER, 1988).
b) El compuesto antifúngico producido por la bacteria puede ser extraído y aplicado en
el campo para el control de la enfermedad; el problema es que debe producir en
suficiente cantidad estos compuestos, así como también aplicarlo en el tiempo correcto
durante el ciclo de la enfermedad (MARTINEZ et al., 1997). Se han realizado estudios
para solucionar estos problemas, por ejemplo BERNAL et al., (2002), obtuvo cepas de
Bacillus A 47 mutadas, con la finalidad de que estas produzcan una mayor cantidad de
antibióticos (grupo Iturina), para poseer una superior actividad antifúngica en forma in
vitro al compararlo con la cepa original.
Sin embargo, se debe tomar en cuenta la adsorción de estos, a través de la
acción coloidal de las arcillas y partículas de humus, inestabilidad del pH y actividad
17
microbial; de todo lo anteriormente dicho, lo mas importante es la adsorción (BAKER,
1968).
c) Los genes responsables de la producción del compuesto antifúngico, pueden ser
aislados y usados para desarrollar plantas transgénicas que sean resistentes a hongos.
Sin embargo, su uso no ha sido del todo exitoso dado que no existen casos conocidos
con niveles aceptables de resistencia. Esto se debe probablemente al complejo control
genético de la producción de estos metabolitos antifúngicos (MARTINEZ et al., 1997).
Finalmente, MARTÍNEZ et al., (1997) señalan que la manera más adecuada
para explotar exitosamente las ventajas del control biológico de una cepa bacteriana,
podría ser aislando directamente el compuesto antifúngico para uso directo en campo.
El aislamiento de ellos en cultivos bacterianos sería más efectivo si la bacteria pudiera
ser modificada para producir mayores cantidades del compuesto.
18
3 MATERIAL Y MÉTODO
Este trabajo se realizó en el Laboratorio Fitopatología de Instituto de Producción
y Sanidad Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de
Chile, en donde se investigó in vitro los posibles antagonistas (Bacillus) de distintas
cepas de dos especies de Fusarium (F. oxysporum y F. solani). Actividades anexas se
realizaron en los Laboratorios de Microscopía del Instituto de Embriología y
Microscopía Electrónica de Barrido del Instituto de Histología de la Facultad de
Ciencias de la misma Universidad.
La obtención de material para aislar Bacillus fue realizada desde un vivero local
dedicada a la producción
de calas de colores, que se encuentra ubicado en la
localidad de Cayumapu, a 22 km de la ciudad de Valdivia.
3.1
Materiales de Laboratorio.
Los materiales necesarios para la realización de los distintos procedimientos
son los siguientes.
3.1.1
Equipos. Baño María termoregulado Memmert, autoclave semiautomático
Quimis, estufa de cultivo Memmert, Refrigerador Fensa, balanza de precisión analítica
Boeco Germany, agitador orbital Lab- Line, cámara de flujo laminar Labconco, agitador
magnético Thermolyne Nuova II, microscopio Zeiss (X1000), liofilizador Labconco, lupa
estereoscópica Zeiss (X400), microscopio electrónico de barrido LEO-420.
3.1.2
Otros materiales. Bandejas y bolsas de plástico, placas Petri de uso común,
sacabocado Nº 2 y Nº 5, matraces (250, 500 y 1000 mL), agua destilada, tubos de
ensayo, bisturí, asa de siembra, pipetas Pasteur, pipetas graduadas de 1 a 10 mL,
papel aluminio, mechero, alcohol de quemar, alcohol de 95°, algodón hidrófilo, algodón
cardé, tórulas de papel, gradillas, portaobjetos y cubreobjetos.
19
3.1.3 Medios de cultivo. Se necesitó medios para cultivar los hongos y bacterias,
para ello se utilizó agar papa dextrosa, agar peptona y caldo peptona respectivamente;
se pueden observar en los Anexos 1 al 4. Además, se utilizó medios de cultivo
descritos por GORDON et al., (1973) y CLAUS y BERKELEY (1984), para desarrollar
pruebas bioquímicas, estos son agar Sabouraud dextrosa, caldo de nutriente más 7 %
de NaCl, agar almidón, agar leche, agar cerebro corazón y Voges Proskauer (Anexo 5
al 10).
3.1.4
Reactivos. Se requiere de peróxido de hidrógeno (H2O2), Anaerocult A Merck y
reactivo de Kovacs. Para la microscopía electrónica de barrido, se utilizó lactofenol,
acetona, glutaraldehido, tetróxido de osmio, buffer fosfato.
3.1.5
Tinciones. Estas fueron necesarias para evaluar, a través de la morfología, el
género y la especie de las cepas de bacterias seleccionadas: Tinción de Gram, Tinción
de endosporas de Wirtz. Para ello se necesitó de alcohol acetona y colorantes (cristal
violeta, safranina, lugol y verde malaquita) (Anexos 11 y 12).
3.2
Material biológico.
Para efectuar las pruebas fue necesario obtener cepas de Fusarium spp., como
también muestras de calas de colores, con estas ultimas se obtuvo asilamientos de
Bacillus spp. y se realizaron pruebas de patogenicidad.
3.2.1
Fuentes de aislamientos. Se utilizaron 20 plantas de estructura completa y
libres de patógenos, provenientes de dos invernaderos; la distribución de muestreo es
la exhibida a continuación en la Figura 3, los agentes antagonistas fueron aislados y
colectados desde los mismos invernaderos donde se ocasionó la enfermedad;
aumentando la posibilidad de que sea viable la corrección del problema por medio de
un biocontrolador.
Además, se colectaron 27 túberos sanos de la variedad Florex Gold, y con un
diámetro aproximado de 3,5 cm, que se encontraban almacenados en estado
dormante, para su posterior uso en las pruebas de patogenicidad.
20
Invernadero 1
Invernadero 2
: Muestras de calas
: Cultivares de calas
FIGURA 3 Esquema de muestreo de plantas en los invernaderos del vivero.
3.2.2
Caracterización y procedencia de las cepas de Fusarium spp. En una tesis
que actuó en forma paralela a esta, se demostró la existencia de dos especies
(Fusarium solani y Fusarium oxysporum) causantes de marchitez vascular en plantas
de calas. De estos dos, se determinó que las cepas más virulentas pertenecen a F.
oxysporum. Las cepas aisladas fueron 60, las cuales se estudiaron en esta tesis y se
muestran a continuación en el Cuadro 1.
Las cepas se agrupan según su coloración y se subdividen por el grado de
virulencia. Se impuso valores descriptivos a cada grado de virulencia según la
importancia que estas tengan, en orden creciente según mayor grado de incidencia
(Figura 4 y 5).
3.3
Aislamiento de antagonistas.
Los métodos para aislar el género Bacillus según CLAUS y BERKELEY (1984);
BAKER y COOK (1989), se basan en la resistencia de sus esporas a elevadas
temperaturas, provocando la
destrucción de todas las células vegetativas de las
bacterias, asegurando que sobrevivan solo las que tiene esporas y otras bacterias
extremadamente termófilas.
21
CUADRO 1 Caracterización de las cepas de Fusarium spp., en función del color
de las colonias y nivel de virulencia.
Nivel de virulencia de las cepas
Color colonia
N° de cepa
Caída de
Enanismo
plántula
Fucsia
(F. oxysporum)
Morado café
(F.oxysporum)
Violeta oscuro
(F. oxysporum)
intensa
leve
síntomas
(2)
(1,5)
(1)
176, 121, 133,
-
-
121
176,133
-
163, 177, 106, 190
-
-
163,106
177,190
-
108, 187, 200, 102
200, 102
108
-
187
-
202,143, 113,103,
181,142
175, 184, 142,145, 131, 175,117,
103, 135, 197, 114,
184
114,137
123,178,137, 117
159,189, 251,149,
Melón claro
213,111,162, 144, 345,
(F. oxysporum)
252, 105,169,158, 168,
Amarillo café
194, 191, 179, 304,
(F. solani)
360
(F. solani)
Naranjo café
(F. solani)
Total
180,145, 131,173,
135,
182, 178
123,
197
251,169,
-
111, 105 168, 161
345, 356
161, 356
Rojo intenso
Sin
(2,5)
202,143,181,182, 180,
(F. oxysporum)
Marchitez
( 3)
139,165, 113, 173,
Violeta claro
Marchitez
-
-
120, 128
-
-
351, 118, 303, 253
351
60
9
179,304,
139,165,
159,189,
149,213,
158,162,
-
144,252
194,191
-
-
120, 128
-
-
303, 118
253
4
20
25
360
2
22
A
B
C
FIGURA 4 Algunos ejemplos de coloración de cepas de Fusarium oxysporum
sobre placas con agar papa dextrosa.
*
A, melón claro; B, violeta claro; C, amarillo café; D; violeta oscuro; E, morado café; F, fucsia.
FIGURA 5 Algunos ejemplos de coloración de cepas de Fusarium solani sobre
placas con agar papa dextrosa.
*
A, violeta oscuro; B, amarillo café, C, naranjo café.
Esta etapa se realizó a partir de 20 plantas, se tomaron por separado túberos,
raíces, hojas, tallos y flores. Posteriormente se procedió a pesar 10 g de cada muestra
en matraces estériles (de 1000 mL) con 20 mL de agua destilada, una agitación
posterior de 10 min ayudó a integrar las muestras, luego se tomo una alicuota de 5 mL,
que fue depositado en tubos con 5 mL de caldo peptona; en total fueron 4 tubos por
muestra.
23
Los tubos se incubaron en baño María a una temperatura de 80° C durante 10
min; luego de esto fueron incubados por tres días a 25ºC, permitiendo con esto el
desarrollo de las bacterias (Figura 6).
Agitador
Muestra
10g
Baño María
80ºC 10min
Agua destilada (20mL)
Cepario con
tres
repeticiones
Caldo peptona (5mL)
Aislar
cepas
25ºC por
3 días
Placas Petri
con AP + bacterias
(2-3 días)
FIGURA 6 Representación esquemática de aislamiento de bacterias formadoras
de endosporas, pertenecientes al grupo Bacillus spp.
De los tubos, se sembró por estrías las bacterias en placas con agar peptona
que se incubaron a 25ºC por tres días, posteriormente se aislaron cepas puras, del
conjunto de aislamientos se tomaron en total 138, con estas se realizó un cepario con
tres repeticiones por cepa, cada una sembrada en tubo inclinado con agar peptona.
3.4
Pruebas de antagonismo.
Antes de comenzar con las pruebas de antagonismo, para contar con
ejemplares, se repicaron los hongos y bacterias a partir de los correspondientes
ceparios, para sembrarlos en placas Petri medianas (de 9 cm de diámetro) con agar
papa dextrosa (APD) y dejarlos crecer según lo señalado por BAKER y COOK (1974);
BERNAL et al., (2002). Se midió la velocidad de crecimiento, en donde se advirtió que
todos los hongos luego de cinco días llenaron la placa Petri; se logró observar las
colonias de Bacillus en las placas luego de 24 horas de incubación.
24
Fusarium
Bacterias
A
B
FIGURA 7 Esquema que ilustra la primera prueba de antagonismo.
*
A, Ordenamiento en placas Petri de una cepa de Fusarium y 28 aislamientos bacterianos.
B, Inhibición del crecimiento de Fusarium spp., después de una semana de incubación.
Por causa de la gran cantidad de placas a utilizar, se comenzó con un
“screening”, por lo que se utilizaron sólo dos cepas pertenecientes a las dos especies
de Fusarium.
Se sembraron 5 placas grandes ( de 14 cm de diámetro) con una cepa de F.
oxysporum y otras cinco para F. solani, ambos sobre un medio de cultivo APD. La
depositación de estas cepas fue mediante cuatro discos obtenidos con sacabocado N°
5 y localizadas equidistantemente en la placa. Además, se inocularon 28 aislamientos
de bacterias por placa con tórulas previamente esterilizadas (Figura 7 A). La
incubación se realizó a 25ºC y se observaron durante una semana, cuando los hongos
cubrieron la placa se puso atención a los halos de inhibición del crecimiento de las dos
cepas de Fusarium, para determinar cuales aislamientos bacterianos presentan
antagonismo (Figura 7B).
Se seleccionaron las bacterias que produjeron inhibición del crecimiento de las
dos especies de Fusarium, para luego ser nuevamente aislados en APD. Después de
esto se realizó una tinción de Gram para corroborar que se trataba de aislamientos
25
bacterianos del género Bacillus, se observó al microscopio la morfología, además se
llevó a cabo la prueba de la catalasa.
En la segunda etapa, las bacterias aisladas, que resultaron ser positivas en la
inhibición de las dos cepas, fueron puestas en placas grandes con APD junto a las 60
cepas de Fusarium, repitiéndose lo anteriormente hecho, para comprobar su inhibición
ante las demás cepas del hongo. Posteriormente, se inocularon los aislamientos de
bacterias con tórulas frente a una cepa de Fusarium; la formación de estas en la placa
fue diferente, ya que el número de aislamientos de Bacillus era menor (Figura 8).
Fusarium spp
Bacillus spp
A
B
FIGURA 8 Esquema que ilustra la segunda prueba de antagonismo.
*
A, Ordenamiento en placas Petri de una cepa de Fusarium y 15 aislamientos bacterianos.
B, Inhibición del crecimiento de Fusarium spp., después de dos semanas de incubación.
3.5
Evaluación de los resultados.
Luego de esperar dos semanas para que el hongo cubra la placa
completamente, se analizó uno a uno los aislamientos de Bacillus, observando en
forma descriptiva si existe una inhibición de las bacterias hacia los hongos. Se evaluó
otorgando un puntaje a las características observadas, como se muestra en el Cuadro
2.
26
CUADRO 2 Ponderación de efectos causados por el antagonista, según el grado
de inhibición sobre las cepas fúngicas.
Resultado
Puntaje
Sin inhibición.
1
Con inhibición de crecimiento, pero sin halo.
2
Con inhibición de crecimiento y con halo.
3
3.6
Análisis estadístico.
Sobre los resultados, se utilizaron dos análisis descriptivos; estos son el análisis
de Conglomerado y Tablas de Contingencia. Se efectuaron primero dos estudios de
conglomerado o “Cluster”, cuyo objetivo fue crear grupos homogéneos en función de
características similares, y a su vez encontrar diferencias entre estas segmentaciones.
Se dividieron los aislamientos del género Bacillus en función del grado de
inhibición que ocasionaban sobre las cepas fúngicas. El resultado entonces, muestra el
grupo que posiblemente pueda ser utilizadas para controlar al género Fusarium,
obtenidas del universo de bacterias que se logran encontrar en el filoplano y rizósfera
de plantas de calas de colores.
Además, a través de un análisis de Tablas de Contingencia, se compararon los
aislamientos bacterianos que provocaron un mayor antagonismo según el promedio del
grado de inhibición que estas presentaban sobre las cepas fúngicas; de esta forma se
logró observar el antagonismo provocado por las seis cepas sobre los hongos y
relacionarlos con la patogenicidad de cada uno. Finalmente, se realizó otra Tabla de
Contingencia para observar la relación entre las especies y la inhibición producida por
los microorganismos bacterianos.
3.7
Pruebas de patogenicidad.
Las bacterias seleccionadas a partir del análisis estadístico, se evaluaron para
observar su incidencia sobre los tejidos de calas y así descartar la posibilidad de que
las cepas seleccionadas ocasionen daño en las plantas. Para ello, se utilizó el método
de LAPWOOD y READ (1985).
27
Se colectaron 27 túberos, para realizar tres repeticiones de las cepas
seleccionadas. Los túberos fueron lavados con agua y una escobilla suave, para luego
desinfectarlos con hipoclorito de sodio al 30% por 10 min, luego se enjuagó tres veces
con agua destilada (durante 5 minutos cada uno) y se secaron con papel filtro.
En la cámara de flujo laminar se procedió a seccionar los túberos en rodajas
con un bisturí; se perforaron las rodajas con un sacabocado Nº 2, para depositar
posteriormente con una micropipeta, una suspensión lechosa de bacterias (100 μL).
Esto se realizó con cepas puras de Bacillus con 24 h de desarrollo.
Fuera de esto, se inocularon 100 μL con un testigo positivo, el cual corresponde
a la especie E. carotovora, microorganismo causante de la pudrición blanda. Además
de un testigo negativo con 100 μL de agua destilada estéril y otro testigo negativo
seco; cada uno con tres repeticiones.
Las rodajas se pusieron en cámaras húmedas sobre placas chicas (4 cm de
diámetro), a una temperatura de 25º C por una semana, y se observó diariamente él o
los cambios que podrían suceder, los cuales se compararon con los testigos.
Los materiales utilizados, fueron previamente esterilizados a 160ºC durante dos
horas, para mantenerlos libres de cualquier inoculo microorganismos no deseados.
3.8
Identificación de especies de Bacillus.
Luego de saber que las bacterias aisladas pertenecían al género Bacillus, se
realizó un análisis taxonómico para caracterizar a nivel de especie, para esto los
métodos empleados fueron: el sistema API bioMérieux relatado por LOGAN y
BERKELEY (1984) ( API 50CH complementado con API 20E), y el clásico test descrito
por GORDON et al.,(1973); CLAUS y BERKELEY (1974). De esta forma, se garantiza
la obtención de resultados precisos.
28
3.8.1 Sistema API. Con el propósito de una mejor identificación de la especie, se
utiliza la galería API 50 CH, complementado con la galería API 20E para obtener un
perfil bioquímico más acabado de las bacterias investigadas (Figura 9).
El API 50CH se utilizó para el estudio del metabolismo de hidratos de carbono en
los microorganismos y así lograr identificar el género Bacillus, en aproximadamente 24
y 48 h a 30º C, bajo condiciones aerobias. El principio de esto, es que la galería esta
compuesta por 50 microtubos, que permiten el estudio de la fermentación de
substratos; los ensayos son inoculado con API 50 CH Medium, para poder hidratarlos.
Durante el periodo de incubación, la fermentación se traduce en un cambio de color en
el tubo, debido al cambio de pH, revelado a través de un indicador.
FIGURA 9 Galerías del sistema API, antes de comenzar las pruebas bioquímicas
para la identificación de especies. Arriba, API 50 CH. Abajo, API 20E.
El API 20E permite la identificación de Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram
negativos no exigentes. Para lograr resultados se mantuvieron los tests por 24 h a
30º C, en condiciones aerobias. Esta galería se compone de 20 microtubos, que
29
contienen substratos deshidratados, al ser inoculados con una suspensión bacteriana,
se reconstituyen, y luego del tiempo de incubación, ocurre un cambio de color.
Las galerías de los API fueron inoculadas según las instrucciones del fabricante
con cepas puras de 24 h de desarrollo. Para el API 20E se efectuó una suspensión
bacteriana en agua destilada; en cambio, para las galerías del API 50CH, se necesitó
realizar una suspensión en API CHB/E Médium.
Cada ensayo se interpretó como positivo, negativo o dudoso, lo que se anotó en
la hoja de resultados que entregó el fabricante. De acuerdo a esto, se asignaron
valores numéricos a los tests y se enviaron estos valores al fabricante el cual luego de
una semana, envía los resultados identificando el porcentaje de probabilidad de que
correspondan las cepas a diferentes especies del género Bacillus.
3.8.2
Test tradicional. Según lo descrito por GORDON et al., (1973) y CLAUS y
BERKELEY (1984) se necesitó de preparación de medios de cultivos para realizar
diversas pruebas fenotípicas; de esta forma, de acuerdo a las respuestas de las cepas,
se logró identificar la especie de la cual se trata.
Para la caracterización fenotípica se realizaron las siguientes pruebas:
a) Producción
de catalasa.
En un portaobjeto se ubica parte del cultivo en
forma densa, para luego añadir una gota de peróxido de hidrógeno (H2O2) y luego de
un momento el indicio de burbujas (O2) indica que la reacción es positiva, lo que
demuestra que el cultivo posee respiración aeróbica, y por lo tanto tienen la enzima
catalasa que hidroliza el peróxido de hidrógeno.
b) Prueba de oxidasa. Esta prueba sirve para determinar la presencia de
enzimas oxidasas en el cultivo, las que no existen en organismos anaerobios estrictos;
y va ligada a la degradación de peróxidos (prueba de catalasa). Al aplicar 2 o 3 gotas
de reactivo de Kovacs sobre la colonia (en placa Petri con agar), luego de 15 segundos
se observará un cambio a un color azulado o marrón si la reacción es positiva.
30
c)
Crecimiento en Cloruro de Sodio (NaCl). Es necesario utilizar, caldo de
nutriente más 7 % de NaCl, en tubos de ensayo esterilizados. Se inclinan los tubos
para tener mas aireación; se inocula y luego de 7 a 14 días, al ser positivos, se observa
el crecimiento de las bacterias incubadas.
e) Crecimiento a pH 5,7. Se siembran las bacterias en placas chicas más agar
Sabouraud dextrosa, el resultado es positivo si los microorganismos crecen en el
medio.
f)
Hidrólisis del almidón. Para esto se requiere preparar agar almidón en
placas, las bacterias se inoculan, se aplica lugol sobre las placas y se dejan a 37ºC por
24 horas. Si el resultado es positivo, se traducirá en que las bacterias serán resistentes
al colorante y pueden hidrolizar el almidón formándose un halo transparente alrededor
del la colonia; lo que no sucede si es negativo.
g) Reacción de Voges Proskauer. Es una prueba cualitativa de la presencia de
acetil metil corbinol entre los productos finales de la fermentación de la glucosa. Se
inocula en tubos con medio Voges Proskauer, para luego reaccionar después de 30 a
60 min a temperatura ambiente; da un color rosado que es la característica de las
colonias positivas.
h) Descomposición de caseína. Se emplea placas con agar leche, se inoculan
las cepas y luego de 24 horas, se observa una transparencia alrededor de los
microorganismos que han degradado la caseína, lo que indica que es positivo para
esta prueba.
i) Crecimiento en anaerobiosis. En placas Petri chicas con agar cerebro
corazón, se inocularon las cepas y se depositaron las placas en una jarra de sellado
hermético. Paralelamente se le agregaron 35 mL de agua destilada estéril a un sobre
de Anaerocult A (Merck), para luego incluirlo en la jarra que se sella, posteriormente
comienza una reacción química que extrae el oxigeno
creando una atmósfera
anaeróbica, luego de esto se espera 7 días para que crezcan colonias bacterianas, si
sucede esto el test es positivo.
31
3.9
Microscopía electrónica de barrido (MEB).
Se utilizó esta técnica, para observar las características de la especie
bacteriana y utilizarlo como complemento a los métodos anteriores para lograr
reconocer la especie. Además, se observó el cambio morfológico de las dos especies
de Fusarium, al ser enfrentadas a los antagonistas.
Para lograr el objetivo, previamente se cultivaron los hongos y bacterias en
APD, luego de tres días de incubación se les agregó un cubreobjeto para que se
desarrollaran en este. Después de ocho días, en el Laboratorio de Microscopía del
Instituto de Embriología, se fijaron los microorganismos que se encontraban en los
cubreobjetos según el protocolo para MEB.
- Fijación: Se utilizó glutaraldehido al 3%, mas el tampón fosfato de sodio, pH 7,2 – 7,4
(0,2 M). Se cubrieron las muestras durante dos horas a 4° C.
- Lavado. Las muestras fueron sumergidas en el mismo buffer, se agitaron y
enjuagaron tres veces, dejándolas reposar por 5 min entre estas.
- Post-fijación.
Se aplicó tetróxido de osmio (OsO4) al 1% diluido en la solución
tampón, luego las muestras se dejaron por 2 horas a 4°C.
- Lavado. Igual procedimiento del punto N° 2.
- Deshidratación.
Etanol o acetona 50% (v/v), durante 10 min
Etanol o acetona 70% (v/v) , durante 10 min
Etanol o acetona 90% (v/v), durante 10 min
Etanol o acetona 96% (v/v), durante 10 min
Etanol o acetona 100% (v/v), durante 10 min
Etanol o acetona 100% (v/v), durante 15 min
- Montaje. En porta especimenes de MEB
- Ionización o recubrimiento de las muestras con oro, película de 10 a 15 nm.
- Observación en un microscopio LEO- 420.
- Almacenamiento de las muestras en campana al vacío o con sílica gel.
32
En el Laboratorio de Histología y Patología, se obtuvieron las fotografías de los
microorganismos y sus diferentes estructuras, tomando en consideración los tamaños
de cada uno de estos y su morfología.
3.10
Almacenaje y conservación de las cepas bacterianas.
Este paso es necesario para poder liofilizar las cepas, para ello se prepararon
las muestras, comenzando con la incubación de las bacterias en caldo peptona por 2448 horas, luego se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante; el pelet se resuspendió
en leche descremada estéril al 20%, se alícuó en frascos de liofilización con un
volumen final de 600 μL; luego se congeló en nitrógeno líquido a -196ºC durante 5
minutos y se introdujo al equipo de liofilización por 24 horas.
33
4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1
Aislamiento de antagonistas de Fusarium spp.
El 7 de junio del año 2004, se procesaron numerosas muestras de tallos, base
de tallos, túberos, flores y raíces de plantas de calas de colores, con la finalidad de
obtener específicamente bacterias del género Bacillus (Cuadro 3). A partir de todas las
fuentes utilizadas, se aislaron 138 colonias de bacterias, con las cuales se realizaron
cultivos puros.
CUADRO 3 Origen de los 138 aislamientos bacterianos a partir de diferentes
muestras de calas de colores.
Muestra
Tallo basal
Nº de aislamiento
54, 55, 56, 57, 58, 70, 36, 37, 38, 39, 40, 109, 110,
110, 112, 113
Tallo aéreo
Total
16
123, 124, 125, 126, 127, 118, 119, 120,121, 122, 27,
28, 29, 30, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136,137,
138, 59, 60, 61, 62, 6, 7, 8, 9, 10
32
43, 44, 77, 78, 79, 80, 50, 84, 85, 86, 87, 101, 128,
17
Raíz
129, 31, 32, 33
Túbero
104, 105, 106, 107, 108, 71, 15, 16, 17, 18, 63, 64, 65,
114, 115, 116, 117, 51, 52, 53, 41, 42, 45, 46, 47, 48,
49, 34, 35
Flor
97, 98, 99, 102, 1, 2, 3, 4, 5, 74, 75, 92, 93, 94, 95
Hoja
29
81, 82, 83, 66, 67, 68, 69, 19, 20, 21, 22
72, 73, 76, 100
Total
29
11, 12, 13, 14, 103, 88, 89, 90, 91, 23, 24, 25, 26, 96,
15
138
El 23,2 % de los aislamientos de estas bacterias, se obtuvo de muestras
provenientes de la parte aérea de los tallos, un 11,6 % desde la base de los mismos.
Por otro lado, de las muestras de flores y túberos se consiguió un 21%, en tanto que un
34
12,3% de las raíces y el 10,9% restante fue desde las hojas. Lo que evidencia que se
logró la mayor presencia de los aislamientos de los tallos de plantas de cala. Asimismo,
se demuestra la ubiquidad de las bacterias de este género.
4.1.1
Primera prueba de antagonismo. Todos los aislamientos bacterianos
obtenidos fueron enfrentados a dos cepas de Fusarium, para descartar las que no
presentaban algún tipo de antagonismo in vitro. El resultado fue, que sólo 15 de estos
aislamientos, tuvieron la característica de inhibir el crecimiento de los dos agentes
fúngicos mencionados. De éstos, el 67% proviene de muestras de tallos aéreos,
mientras que el resto es de otros sectores, lo que se presenta en el Cuadro 4.
4.1.1.1Características de los aislamientos. El método utilizado en esta tesis,
para
obtener selectivamente a representantes del género Bacillus, fue bastante útil. Se
visualizó que estos cultivos obtenidos de diferentes fuentes tenían morfología tipo
bastón, son Gram positivos, formadores de endosporas y catalasa positivos.
Características que confirman a los tipos que conforman a este género. (Cuadro 4).
Además, los 15 aislamientos se destacan por crecer después de las 24 horas.
CUADRO 4 Origen de bacterias antagonistas preseleccionadas, enfrentadas a
cepas de Fusarium solani y Fusarium oxysporum.
Órgano de
Nº de aislamiento antagonista
Cantidad
Género
Flor
102
1
Bacillus
Hoja
100
1
Bacillus
Tallo aéreo
6 , 7, 8, 9, 10, 124, 130,
134, 136, 138
10
Bacillus
Tallo basal
56, 110
2
Bacillus
Raíz
44
1
Bacillus
Túberos
-
0
-
origen
Total
15
35
4.1.2 Segunda prueba de antagonismo. Se realizó una segunda prueba, en donde
los 15 aislamientos fueron enfrentados a las 60 cepas de Fusarium. El resultado de
esto fue que luego de cinco días, se observó inhibición de crecimiento de todas las
cepas fúngicas. Los resultados de esta prueba fueron evaluados a partir del día 7
(Anexos 20 y 21).
En la Figura 10, se puede advertir claramente, que la distancia (1,4 cm) entre el
aislamiento bacteriano “a” y la colonia de Fusarium “2”, es mayor que entre este mismo
aislamiento y la colonia fúngica “1” (0,5 cm). Esto se puede deber a diferentes razones;
aunque no se investigó el mecanismo de acción especifico de los aislamientos
seleccionados para inhibir el crecimiento in vitro de las cepas de Fusarium, según la
literatura consultada, estas bacterias actúan por antibiosis (BAKER, 1968; BAKER y
COOK, 1974; FRAVEL, 1988 y BERNAL et al., 2002).
a
1
b
2
FIGURA 10 Efecto de las bacterias antagonistas sobre una cepa de Fusarium.
* 1 y 2,
cepas fúngicas. a, aislamiento bacteriano antagonista. b, aislamiento bacteriano sin
características antagonistas.
De acuerdo con BERNAL et al., (2002), un tiempo prolongado de las colonias
antagonistas productoras de sustancias difusibles en el agar, posibilita una elevada
persistencia y efectividad de estos compuestos antifúngicos desprendidos; lo que a su
vez, provoca una mayor inhibición in vitro. Además, estos antibióticos producen la
muerte del hongo o reducen su tasa de crecimiento. Así, la respuesta de la cepa
fúngica “2” presenta un mayor halo de inhibición de crecimiento, provocada por la
36
colonia “a”; lo que denota (Figuras 12 al 16) una disminución del avance del micelio.
Este resultado fue recurrente en todas las placas estudiadas. Sin embargo, cabe
señalar el cambio morfológico provocado en la colonia de Fusarium “2”, al crecer por
encima de algunos aislamientos de Bacillus que la rodea, como por ejemplo la colonia
“b”, lo que causa un cambio morfológico del hongo, sin lograr inhibir su crecimiento, por
lo cual no se consideran aislamientos bacterianos antagonistas de Fusarium.
158
173
113
FIGURA 11 Pruebas de antagonismo de las cepas de Bacillus spp. frente a tres
cepas de Fusarium spp. Izquierda, 8 de julio del 2004 (una semana).
Derecha, 16 de julio del 2004 (dos semanas).
37
En la Figura 11, se observa que la inhibición no varía entre las dos semanas del
ensayo, lo que se asegura más adelante con el análisis estadístico (Subcapitulo 4.2).
Las colonias fúngicas, al comienzo de la segunda semana, cambian su morfología y
continúan con el crecimiento en el interior de la placa, pudiendo progresar por el lado o
sobre algunos aislamientos bacterianos, mostrando así, la gran capacidad que tienen
estos hongos de cambiar y adecuarse a las condiciones del medio (BOOTH, 1975). Sin
embargo, las cepas de Fusarium spp. no lograron crecer sobre las cepas bacterianas
N° 44, 10, 9, 8, 7 y 6. Inclusive, en su mayoría no pudieron crecer alrededor de las
bacterias, dejando un marcado halo de inhibición. Cabe destacar que no se pudo
determinar cual de estas últimas es mejor, ya que en las pruebas de antagonismo no
hubo una determinación cuantitativa de ellas.
FIGURA 12 Vista frontal y lateral de placa Petri con un ejemplo de la segunda
prueba de antagonismo, sobre APD.
A
B
C
FIGURA 13 Fusarium solani en APD, enfrentado a bacterias del genero Bacillus.
Microscopía electrónica de barrido.
* A, fiálide. B, micelio y macroconidias. C, micelio.
38
A
B
C
D
FIGURA 14 Fusarium solani en APD, observado en microscopio de barrido.
* A, macroconidias. B, fiálide. C, micelio y macroconidias. D, microconidias.
En las Figuras 13 y 14, se muestran las diferencias morfológicas de F. solani al
localizarse frente a un medio saturado de antagonistas y otro libre de ellos; en este
último caso, se advierte una mayor cantidad de macroconidias, micelio y fiálides bien
constituidas, lo mismo se observa en el caso de F. oxysporum, revelándose además,
macroconidias con pequeñas invaginaciones producto de la acción inhibitoria
bacteriana (Figuras 15 y 16).
39
A
B
.
C
D
FIGURA 15 Fusarium oxysporum en APD, enfrentadas a las Bacillus subtilis.
Observados en microscopio de barrido.
* A, macroconidias con invaginaciones. B, micelio y fiálides. C, fiálides. D, fiálide.
A
B
C
FIGURA 16 Fusarium oxysporum en APD, observado en microscopio de barrido.
* A y C, micelio, macroconidias y fiálides. B, macroconidias.
40
4.2
Análisis estadístico de la segunda prueba de antagonismo.
Para llevar a cabo el estudio de los resultados, se utilizaron dos métodos:
Análisis de conglomerado Cluster y Tablas de Contingencia, ya que fue necesario un
estudio descriptivo de los datos.
4.2.1
Análisis de conglomerado. Se realizaron dos análisis estadísticos utilizando
un método Cluster Vecino más Cercano con una sola unión, con la distancia métrica
Euclidiana. El primer análisis fue realizado luego de una semana de incubación de las
cepas y el segundo, a las dos semanas; el resultado del análisis muestra diferentes
grupos, entre los cuales está el de las bacterias antagonistas.
Como se observa en las Figuras 17, 18, 19 y 20, no existen diferencias
evidentes entre los dos análisis Cluster, esto se encuentra resumido en el Cuadro 5.
Sin embargo, se observa una diferencia en la distancia de los conglomerados de cada
semana, mostrando un leve alejamiento de la cepa 10 con respecto a las cepas de su
mismo conglomerado en la segunda semana, lo que confirma el hecho de que se logra
observar la inhibición bacteriana luego de dos semana de incubación.
Dendrograma
Método Vecino más Cercano,Euclidean
Distancia
8
6
4
2
14
15
12
13
10
11
4
6
3
8
9
5
7
1
2
0
Cepas
FIGURA 17 Conglomerado de las cepas antagonistas luego de una semana.
Se muestra en el Cuadro 5,
el desarrollo de un análisis con tres
conglomerados, en donde las bacterias seccionadas como antagonistas son las del
conglomerado tres, ya que se caracterizan por obtener la mayoría de los resultados
41
positivos, medida por la inhibición de las cepas fúngicas. Estas son el 40 % de las
cepas bacterianas seleccionadas por el “screening”. El resultado final, muestra que las
cepas antagonistas de las dos especies de Fusarium fueron: N° 6, 7, 8, 9, 10 y 44.
Número de casos completos: 15
Método Cluster: Vecino más cercano (Una sola Unión)
Distancia Métrica: Euclidean
Cluster
Miembros
Porcentaje
-----------------------------1
8
53,33
2
1
6,67
3
6
40,00
------------------------------
FIGURA 18 Resumen de análisis luego de una semana.
Dendrograma
Método Vecino más Cercano,Euclidean
Distancia
8
6
4
2
1
4
2
5
3
7
8
9
6
10
11
14
15
12
13
0
Cepas
FIGURA 19 Cluster de las cepas antagonistas después de la segunda semana.
Número de casos completos: 15
Método Cluster: Vecino más cercano (Una sola Unión)
Distancia Métrica: Euclidean
Cluster
Miembros
Porcentaje
-----------------------------1
8
53,33
2
1
6,67
3
6
40,00
------------------------------
FIGURA 20 Resumen de análisis para la segunda semana.
42
CUADRO 5. Resumen de análisis de conglomerado.
Nº de cepa
Nº en Dendrograma
Cluster (1ª semana)
Cluster (2ª semana)
138
1
1
1
136
2
1
1
133
3
1
1
130
4
1
1
124
5
1
1
110
6
2
2
102
7
1
1
100
8
1
1
56
9
1
1
44
10
3
3
10
11
3
3
9
12
3
3
8
13
3
3
7
14
3
3
6
15
3
3
Al observar el Cuadro 4 y relacionarlo con el análisis Cluster (Cuadro 5), se
puede señalar que cinco de las seis cepas antagonistas seleccionadas, provienen de
tallos aéreos y sólo una cepa es de raíz. Según la literatura, el hábitat de las bacterias
de este género es el suelo, pero se logran encontrar en cualquier otro lugar (CLAUS y
BERKELEY, 1984. La rizósfera se caracteriza por ser mucho más estable que el
filoplano, lo cual causa que se desarrollen mejor los microorganismos, por esto un
control biológico en este nivel sería mas exitoso, por lo cual se debería estudiar con
mayor detalle la cepa bacteriana cuyo origen es la raíz, aunque no se descarta la
posibilidad de que las otras cepas se adapten a estas condiciones (BLAKEMAN y
FOKKEMA, 1982; WELLER, 1988).
4.2.2 Tablas de Contingencia. Se realizó este estudio con el fin de observar la
relación entre la virulencia e inhibición de las cepas de Fusarium (Cuadro 6) y la
asociación entre las especies fúngicas y la inhibición de estas causada por las cepas
de Bacillus (Cuadro 7). Cada variable tiene un puntaje descriptivo que se observa en el
43
Cuadro 1 y 2, estas son, el grado de virulencia
de las cepas de Fusarium y la
inhibición provocada por las cepas de Bacillus.
Según el Cuadro 6, se visualizó que la mayor cantidad de cepas fúngicas
presentan virulencia intermedia (45 cepas), es decir, producen marchitez vascular leve
e intensa en las plantas, dentro de los síntomas más graves (enanismo y caída de
plántula) existen 13 cepas; en tanto que solo se lograron identificar dos cepas inocuas
para las plantas.
Con respecto al nivel de inhibición, solo una cepa fúngica del total de las
evaluadas (60), no es inhibida en su totalidad por el cepario antagonista. Asimismo, 26
cepas fúngicas presentan una inhibición de crecimiento intermedio, lo que significa que
no presentan el característico halo de inhibición alrededor de los antagonistas.
Además, 33 cepas de hongos muestran una alta inhibición ocasionada por los
antagonistas, esto quiere decir que existe un halo de inhibición alrededor de la mayoría
de las cepas bacterianas, al estar en contacto con estos.
CUADRO 6 Tabla de Contingencia. Relación entre la inhibición de las 6 cepas de
Bacillus y nivel de patogenicidad de las cepas de Fusarium.
Virulencia de las cepas de Fusarium
Nivel de
inhibición de
Fusarium spp
Total
Marchitez
leve
-
Marchitez
intensa
*1
Enanismo
1
Sin
síntomas
-
-
Caída de
plántula
-
1
2
1
9
8
2
6
26
3
1
16
11
2
3
33
2
25
20
4
9
60
Total
* Cantidad de cepas de Fusarium spp.
Con relación a la interacción entre virulencia de los aislamientos de Fusarium e
inhibición de estas, las cepas fúngicas más virulentas, en su mayoría son inhibidas en
un grado intermedio (67%) y el 33% restante tiene un mayor nivel de inhibición.
44
El 64% de las cepas de Fusarium causantes de marchitez vascular leve,
presentan una inhibición alta por parte de las cepas antagonistas; mientras que los
agentes que provocan marchitez vascular intensa, lo muestran un menor porcentaje
(55%).
Las cepas fúngicas que provocan enanismo en plantas de calas, son inhibidas
en nivel medio y alto con un 50 % cada una, al igual que las que no producen
síntomas.
Todo lo descrito anteriormente, demuestra que la mayoría de las cepas de
Fusarium, presentan una inhibición de crecimiento con halo y que las cepas con
virulencia de carácter intermedio son las mayormente inhibidas.
Por último, se debe relacionar a las especies de Fusarium y su efecto en el
grado de inhibición de las mismas, para ello se llevó a cavo un análisis de Tabla de
Contingencia.
Lo primero que se destaca en el Cuadro 7, es la presencia de una mayor
cantidad de cepas de la especie F. oxysporum. Cabe destacar que éstas, muestran un
mayor grado de virulencia, con respecto a la otra especie ( ver Subcapitulo 3.2.2).
CUADRO 7. Tabla de contingencia. Relación entre las especies de Fusarium y su
inhibición causada por las seis cepas de Bacillus.
Nivel
inhibición de Fusarium
spp
1
Especies de Fusarium
F. solani
F. oxysporum
Total
*1
-
1
2
6
20
26
3
Total
5
12
28
48
33
60
* Cantidad de cepas de Fusarium spp.
En el Cuadro 7, se observa que el 50% de las cepas de F. solani, presentan
una inhibición intermedia causada por las seis cepas de Bacillus, seguido con un
porcentaje menor (42%) de cepas que presentan un nivel alto de inhibición; seguido
45
por un 8%, que en promedio, no pudo ser inhibido. F. oxysporum, es inhibida en mejor
forma, ya que el 58 % de esta especie muestra el puntaje mayor de inhibición, y el 42%
muestra una inhibición intermedia causada por las seis cepas.
Según lo discutido anteriormente, se puede señalar que las cepas de Bacillus
seleccionadas, son antagonistas in vitro de la especie de Fusarium más virulenta que
ataca a las plantas de calas de colores, y en menor nivel por las cepas de la especie
de Fusarium menos virulenta.
4.3
Pruebas de patogenicidad.
Estas se llevaron a cabo para evaluar el riesgo de que las cepas antagonistas
revisten alguna posibilidad de causar daño a túberos de calas de colores. Estas
evaluaciones se desarrollaron utilizando como testigos a controles negativos y otros
positivos inoculados con Erwinia carotovora. Se utilizó este sistema puesto que
normalmente este último agente es usado comúnmente para la detección de
aislamientos que sean pectinolíticos (subcapítulo 3.7). El resultado de estas pruebas se
presenta en el Cuadro 8. Es posible apreciar que la cepa de E. carotovora pudo
degradar los tejidos. Por otra parte, los testigos secos y húmedos no causaron
pudrición o alteración de las rodajas de túberos de cala.
Asimismo, todas las cepas de Bacillus evaluadas lograron presentar un
crecimiento superficial en las rodajas de túberos de cala. Este desarrollo es mucho
menor y no implicó un avance al interior de las rodajas (Figuras 21 y 22). De hecho, el
género Bacillus no es considerado un patógeno vegetal, su relación con las plantas es
esporádico y accidental (BUDDENHAGEN, 1970).
Posteriormente, se realizó una tinción de Gram para observar las bacteria en
los túberos y eliminar la probabilidad de que tenga contaminantes. El resultado de esta
mostró la presencia de endosporas dentro de todos los órganos como se observa en la
Figura 21, esto quiere decir que las bacterias entraron en la fase estacionaria, lo que
implica una falta de nutrientes para que se logren desarrollar con éxito, y por esto es
necesario que entren a un estado de dormancia
MADIGAN et al., 1998 ).
(CLAUS y BERKELEY, 1984;
46
CUADRO 8. Resultados del análisis de patogenicidad.
Nº de cepa
Repeticiones
Resultado final
1
2
3
6
S
+
S
S
7
S
S
-
S
8
S
S
-
S
9
S
-
S
S
10
S
S
S
S
44
S
S
S
S
Testigo seco
-
-
-
-
Testigo húmedo
-
-
-
-
Erwinia spp.
+
+
+
+
* + = Pudrición húmeda. – = Sin pudrición húmeda. S = Crecimiento superficial
Endospora
Testigo húmedo
Erwinia testigo
Testigo seco
FIGURA 21 Resultado de inoculaciones realizadas con testigos y fotografía
microscópica (X1000) a túbero inoculado con Bacillus sp.
47
Cepa Nº 44
Cepa Nº 10
Cepa Nº 7
Cepa Nº 9
Cepa Nº 8
Cepa Nº 6
FIGURA 22 Prueba de patogenicidad de las cepas de Bacillus.
Se explica el comportamiento de las cepas seleccionadas, como el resultado de
la hidrólisis del almidón, que se encuentra presente en la superficie de los cortes de los
órganos, lo que deja expuestos los amiloplastos en la superficie del tejido, es decir,
estas bacterias licuan el almidón presente. Las bacterias del género Erwinia actúan de
una forma diferente, ya que estas degradan la pecctina presente en la lámela media
48
por acción de sus pectinasas, la cual es un tejido presente entre los amiloplastos. De
esta forma, logra que se pierda la estructura del tejido vegetal y licua el sustrato, por
esta razón logran avanzar a través del tejido de los túberos (CIAMPI, 2005).
4.4
Identificación de los aislamientos de Bacillus spp.
La caracterización fenotípica de las cepas se logró con dos métodos, para
obtener un análisis más acabado, los resultados son los que siguen a continuación.
4.4.1
Sistema API. Este método se caracteriza por lograr una identificación de
especies de bacterias de una forma rápida y fácil. Para cumplir con este objetivo, se
utilizó dos galerías: API 50CH y API 20E (Figura 23).
A
B
C
D
FIGURA 23 Resultados de las galerías API, luego de 48 h de incubación a 30° C,
bajo condiciones aerobias.
* A, API 50 CH, de las cepas 6,7,8,9 y 44. B, API 50 CH, de la cepa 10. C, API 20 E, de las cepas 6,7,8,9
y 44. D, API 20 E, de la cepa 10.
49
Al efectuar el estudio bioquímico con las galerías, se llego al resultado de que la
cepa Nº 10 obtuvo una respuesta diferente con respecto a las demás cepas
bacterianas, ya que al observar los Anexos 13 , 14 , 15 y 16, hay una variación de su
respuesta en dos pruebas, por lo cual se describe de manera diferente, lográndose
identificar dos grupos. El grupo 1 corresponde a las cepas 6,7,8,9 y 44, y el grupo 2
solo concierne a la cepa bacteriana N° 10.
Esta técnica no fue concluyente, ya que según el fabricante, el porcentaje de
identificación en el primer grupo (Figuras 23A y 23C) es de “débil discriminación”, en
donde se relaciona las cepas N° 6,7,8,9 y 44 con la especie Bacillus megaterium Bary
en un 53,5%, lo que no logran asegurar la veracidad del resultado (Anexos 13, 14 y
18).
En las Figuras 23B y 23D se observa la cepa N° 10 con una caracterización
más certera con un 78,6%; pero este análisis se señala como “identificación no fiable”.
Según esto, es necesario comprobar esto con un sistema complementario (Anexos 15,
16 y 19).
4.4.2 Sistema tradicional. Este es el método clásico que se utiliza para caracterizar
las especies bacterianas, según la morfología y reacciones bioquímicas que presenten.
Macroscópicamente, las colonias se caracterizaron por poseer un tamaño y
forma irregular; también tienen margen ondulada, color blanco y textura seca. En forma
microscópica, se observan endosporas centrales y ovaladas (Figuras 24).
Frente a las pruebas bioquímicas, las bacterias mostraron ser organismos
aerobios, ya que presentan la enzima oxidasa, lo cual es común en este tipo de
organismos. Además, van ligadas a la producción de catalasa, cuyo fin en esta prueba
es degradar el peróxido de hidrógeno. También hidrolizan el almidón y la caseína,
crecen a un pH de 5,7 y en un medio con 7% de NaCl; por ultimo se demostró que las
cepas producen acetoína a partir de la glucosa (Voges Proskauer). El resumen de
estas pruebas se muestra en el Cuadro 9. Con este sistema se llega a la conclusión
50
que se trata de Bacillus subtilis, las cepas presentan características similares (Cuadro
9 y Figura 24).
El sistema API identificó con un bajo porcentaje el taxón B. megaterium. La
diferencia de resultados entregados entre los dos métodos, pudo deberse a que el API
reúne a muchas más pruebas, lo que puede conducir a tener resultados confusos. Sin
embargo, según las indicaciones del fabricante, el sistema API dió como resultado la
especie B. subtilis con un 16,6 % en el primer caso y con un 2,2% en el segundo caso
(Ver Anexos 18 y 19), el test tradicional es más confiable, ya que LOGAN y
BERKELEY (1984) señalan que existe una cierta similitud entre las especies B. subtilis
y B. megaterium, por lo que se tiende a confundir en el sistema API, además, señalan
que la especie B. subtilis, presenta una gran semejanza con otras especies de carácter
intermedio, por esto se les denomina el “grupo Bacillus subtilis”. Cabe destacar la
publicación de REVA et al., (2001), que subdivide las especies del género Bacillus,
posicionando en el mismo grupo (grupo IV) las especies del grupo Bacillus subtilis y
Bacillus megaterium (entre otras especies).
CUADRO 9 Resultados de pruebas para determinar la especie.
Nº
Tinción de
bacterias
esporas
Test
Catalasa
Oxidasa
NaCl
Anaerobiosis
pH 5,7
Almidón
V. P.
Caseína
7%
6
Centrales
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
?
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
?
ovaladas
7
Centrales
ovaladas
8
Centrales
ovaladas
9
Centrales
10
Centrales
44
Centrales
ovaladas
ovaladas
ovaladas
* + = prueba positiva. - = prueba negativa. ? = dudoso.
CLAUS y BERKELEY (1984), señalan que una forma de diferenciar las dos
especies de Bacillus es observar si producen acetoína, según esto frente a la prueba
51
de Voges Proskauer (V.P.), la especie B. subtilis es positiva, lo que significa que puede
degradar la glucosa por via fermentativa, mientras que B. megaterium es negativo, lo
que se visualiza en el Cuadro 9, columna 9.
FIGURA 24 Método de Wirtz, para tinción de endosporas de cepas de Bacillus
subtilis. Cepa N° 6.
A
B
C
D
FIGURA 25 Fotos de microscopía electrónica de barrido utilizados para
determinar el tamaño de las células de las cepas de Bacillus spp.
* A, medición de bacterias. B, vista general de agrupación bacteriana. C, macroconidia de Fusarium
solani, junto a bacterias. D, división mitótica de bacterias.
52
Además, como el prefijo lo indica “mega”, B. megaterium se destaca por tener
un ancho de 1,2 –1,5 μm y un largo de 2-5 μm; mientras que el ancho de B. subtilis
varía entre 0,7 –0,8 μm y un largo de 2-3 μm (CLAUS y BERKELEY, 1984). Según
esto, se midieron las cepas bacterianas, mostrándose que el ancho promedio de cada
una no supera 0,67 μm y el largo promedio no fue mayor a 1,67 μm (ver Anexo 17).
Con esta información complementaria, se logra determina que se trata de bacterias
que pertenecen al grupo de Bacillus subtilis, como se muestra en la Figura 25.
Información adicional, es que las cepas no presentaron formación celular en cadenas,
ni se observan órganos que les proporcione motilidad, esto último se puede deber a un
mal procedimiento de fijación de las muestras, ya que la mayoría de las cepas del
género Bacillus presentan flagelos (CLAUS y BERKELEY, 1974).
Por último, LOGAN Y BERKELEY (1984), señalan que dentro del grupo de B.
subtilis, existen cuatro especies, estas son: B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis y B.
amyloliquefaciens; las que se logran diferenciar a través del sistema API, morfología de
las cepas, estudios de reasociación de ADN y por cromatografía de gases por pirolisis.
Por esto, es necesaria la realización de otras pruebas, sobre todo de carácter
genotípico, para identificar la especie en forma detallada; ya que en este estudio no se
ejecuto por falta de tiempo.
Todas las cepas de B. subtilis fueron liofilizadas con tres muestras de cada
espécimen, para su posterior estudio, como se muestra a continuación en la Figura 26.
FIGURA 26 Cepas antagonistas del grupo Bacillus subtilis liofilizadas.
53
Finalmente es interesante destacar que la especie B. subtilis en la actualidad,
se está utilizando extensivamente para fines fitoterapéuticos ( RAAIJMAKERS et
al.,2002; WESTERS et al., 2004). A pesar que los aislamientos obtenidos y estudiados
en este trabajo, pueden incluirse dentro de esta especie o acercarse a otra del mismo
género, constituyen elementos interesantes para se utilizados como agentes de
biocontrol.
54
5
CONCLUSIONES
En el filoplano y rizósfera de plantas de calas de colores, existen cepas
bacterianas silvestres del género Bacillus que son capaces de inhibir el crecimiento
fúngico in vitro de cepas patógenas de las especies Fusarium solani y Fusarium
oxysporum.
Existió una escasa presencia de cepas de Bacillus antagonistas in vitro de las
dos especies de Fusarium, presentan esta característica solo 4,3 % de los aislamientos
bacterianos totales.
El método tradicional del manual de Bergey´s, fue mas adecuado para la
identificación de las bacterias que el sistema API de galerías.
Seis cepas mostraron antagonismo a ambas especies de Fusarium, todas ellas
pertenecientes al grupo de Bacillus subtilis.
La inhibición de crecimiento fue mayor en cepas de la especie F. oxysporum,
caracterizándose estas por presentar mayor virulencia hacia las plantas de calas de
colores que F. solani.
Las pruebas de patogenicidad no mostraron un posible daño que ocasionarían
las cepas de B. subtilis sobre túberos de calas de colores.
Mediante liofilizado, se preservaron las seis cepas seleccionadas, para
continuar con estudios posteriores.
55
6 RESUMEN
Las calas de colores dentro de la floricultura, adquieren cada vez mas
importancia por sus hermosos tonos, larga duración y los altos retornos a productor. Su
producción es intensiva bajo invernadero; lo que provoca la existencia de diversas
enfermedades, entre ellas la causada por hongos del género Fusarium, lo cual esta
siendo estudiado actualmente en Chile.
El objetivo general de esta tesis fue aislar bacterias del género Bacillus que
logren controlar bajo condiciones in vitro, el crecimiento de 60 cepas de hongos
pertenecientes a las especies Fusarium solani y Fusarium oxysporum, ambas agentes
causales de la marchitez vascular, que fueron observadas en plantas de calas de
colores, que crecieron bajo condiciones de invernadero en un vivero local.
Para esto se efectuó un “screening” de bacterias del género Bacillus, aisladas
desde muestras de tallos, túberos, flores y raíces de calas de colores, que fueron
enfrentadas a dos cepas de Fusarium correspondientes a cada una de las especies; de
esta forma se logró descartar las que no provocaban inhibición de crecimiento. El
resultado de estos experimentos, fue que de un total de 138 bacterias solo 15 tuvieron
la característica antagonismo sobre los agentes fúngicos antes mencionados.
Posteriormente, se realizó una segunda prueba de antagonismo, pero con la
diferencia que se enfrentaron las 15 bacterias contra las 60 cepas aisladas de
Fusarium, el resultado de esto es que se determinó seis bacterias antagonistas. Cinco
de estas provenían de una muestra de tallos y uno de raíces.
Las bacterias antagonistas seleccionadas lograron inhibir, en distintos grados,
el crecimiento de todas las cepas de Fusarium examinadas, lo que indica que pueden
ser buenos controladores del género.
56
Luego de realizada esta etapa se hizo una prueba de patogenicidad de las
bacterias sobre los túberos de calas, el resultado mostró que no hubo daños en el
tejido de los túberos, las bacterias crecen en la superficie de las rodajas asociado a la
hidrólisis del almidón de los túberos de calas. Finalmente se determinó que las cepas
seleccionadas, pertenecen al grupo de Bacillus subtilis.
57
SUMMARY
The calla as part of floriculture is gaining much importance due to their beautiful
colors, long duration and high return for the producer. Their production is very intense
under greenhouse conditions where a large number of diseases occur, among them
Fusarium wilt a new disease actually being studied in Chile.
The general purpose of this thesis was to obtain isolates of the genus Bacillus
that could control under in vitro conditions 60 plant pathogenic strains of the species
Fusarium solani and Fusarium oxysporum. Both causal agents of vascular wilt disease,
that were observed in calla plants growing under greenhouse conditions at a local
grower.
It was performed a screening of Bacillus isolates obtained from stems, tubers,
flowers and roots samples of calla plants. All of them were challenged with one of each
Fusarium species. All isolates that did not caused inhibition of micelial growth were
discarded. From a total of 138 isolates included in the genus Bacillus only 15 showed in
vitro antagonism of the collection of Fusarium.
Subsequently, a second antagonism in vitro test was carried out but with the
difference that would be faced the 15 bacterium against the 60 isolated stumps from
Fusarium, the result of this, is that six bacteria antagonists were observed. Five of
these were isolated from a sample of stems and one from roots.
The antagonistic bacteria demonstrated different degree of inhibition to the
Fusarium collection. This was an indication that they could be good biological control
agents of this pathogen.
Finally, with the 6 antagonistic selected it was performed pathogenicity tests with
all of them. They did not damage plant tissue, however they are able to use starch.
58
Identification procedures performed with this isolates indicated, that they belong to
Bacillus subtilis groups.
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO 1 Medio de cultivo agar papa dextrosa.
Reactivo
Cantidad
Agar Papa Dextrosa Difco (APD)
39g
Agua destilada
1000 mL
Se prepara en un matraz de 2.000 mL. se agrega APD y agua destilada, se
calienta revolviendo constantemente en un agitador magnético hasta quedar
transparente, posteriormente, se esteriliza a 1 atm. por 20 min. A continuación, se
deposita el líquido en placas Petri; si es necesario se aplica 2 % de ácido láctico para
evitar el crecimiento de bacterias en la placa.
ANEXO 2 Medio de cultivo agar peptona.
Reactivo
Cantidad
Extracto de carne
3g
NaCl
5g
Peptona de Caseína
10g
Agar
20g
Agua destilada
1000 mL
Para esto se pesa en la balanza analítica extracto de carne, NaCl, peptona de
caseína y agar, los cuales se depositan en un matraz de 2000 mL junto con. agua
destilada, al igual que lo anterior, se agita calentando hasta lograr una suspensión
transparente, para luego esterilizar lo de la misma forma.
ANEXO 3 Medio de cultivo agar inclinado.
Para realizar el cepario de bacterias u hongos se requiere un medio inclinado,
en donde antes de esterilizar, se ubica el medio (1,5mL) en tubos de ensayo de 5 mL,
se tapan los tubos con algodón, y luego de esterilizar (1 atm por 20 min.), se inclinan
inmediatamente, para que se solidifique en los tubos.
67
ANEXO 4 Medio de cultivo caldo peptona.
Reactivo
Cantidad
Extracto de carne
3g
NaCl
5g
Peptona de Caseína
10g
Agua destilada
1000 mL
Este caldo requiere de los mismos elementos que en el Agar Peptona, pero con
la diferencia de que se eliminará el uso del agar, para que el medio no solidifique. La
preparación es la misma; siendo necesario ubicar el caldo (2mL) en tubos de ensayo
de 5 mL. Estos se tapados con algodón, y luego de esterilizar están listos para su
utilización.
ANEXO 5 Medio de cultivo agar almidón.
Reactivo
Cantidad
Almidón de papa
1g
Agua destilada
10 mL
Agar nutriente
100 mL
Para realizarlo se requiere suspender almidón de papa, en 10 mL de agua
destilada fría, se esteriliza y enfría a 45ºC y después se mezclan el agar nutriente y se
vacía en 5 placas Petri medianas.
ANEXO 6 Medio de cultivo caldo nutriente.
Reactivo
Cantidad
Extracto de carne
3g
Peptona de Caseína
5g
Agua destilada
1000 mL
Se mezcla en un matraz de 2.000 mL, se mezcla extracto de carne, más
peptona y agar, todo esto en agua destilada. Se calienta en un agitador magnético y se
autoclava a 121ºC por 20 min. Para hacer la prueba de cloruro de sodio es necesario
68
agregar 7 % de éste al caldo, luego se distribuye (3 mL) en tubos tapados con algodón,
para finalmente esterilizar durante 20 min a 121 ºC.
ANEXO 7 Medio de cultivo agar leche.
Reactivo
Cantidad
Leche descremada
5g
Agar
1g
Agua destilada
100 mL
Se realizan dos soluciones.
1. En un matraz de 100 mL se coloca Skim milk con 50 mL de agua destilada.
2. En un matraz de 100 mL se agrega agar y 50 mL de agua destilada.
Se esterilizan separadamente por 15 min. a 121º C, se enfrían a 45º C y luego
se mezclan, se ponen en placas Petri y se dejan a temperatura ambiente por 3 días
para que se solidifiquen.
ANEXO 8 Medio de cultivo agar Sabouraud dextrosa.
Reactivo
Cantidad
Agar Sabouraud dextrosa Difco
6,5 g
Agua destilada esteril
100mL
En matraz de 500 mL se disuelve agar Sabouraud dextrosa Difco en agua
destilada, se mezclan y se esteriliza a 121ºC por 20 min, para finalmente ponerlos en
placas Petri pequeñas.
ANEXO 9 Medio de cultivo Voges Proskauer.
Reactivo
Cantidad
Peptona
7g
Glucosa
5g
Cloruro de sodio (NaCl)
5g
Agua destilada
1000 mL
69
En un matraz de 2000 mL se agregan la peptona, glucosa y cloruro de sodio en
agua destilada, para luego depositar en tubos de ensayo y se esteriliza a 121°C por 20
min.
ANEXO 10 agar cerebro corazón.
Reactivo
Cantidad
Agar cerebro corazón Merck
37 g
Agua destilada estéril
1000mL
Se mezcla con agua destilada estéril, se calienta en un agitador magnetico y
luego de esterilizar a 121ªC por 20 minutos a 1 atm, se deposita en placas Petri
pequeñas, previamente esterilizadas.
ANEXO 11 Tinción de Gram.
Las células a observar han de ser de un cultivo joven. Con los materiales del
Laboratorio se realiza esta tinción con una serie de colorantes; pero antes de
efectuarla, es necesario fijar las muestras de cada aislamiento en un portaobjeto.
Luego de esto se aplica sobre el portaobjeto cristal violeta (60 seg), y se enjuaga
con agua estilada, el paso siguiente es poner lugol (60 seg) para que se adhiera a las
muestras de bacterias, nuevamente se enjuaga y se aplica alcohol acetona (30 seg) se
enjuaga y finalmente se agrega safranina (60 seg), el cual da el color rojo a las paredes
de las células que han sido decoloradas por el alcohol
acetona (si son Gram
negativas); se enjuaga y se seca con un papel filtro. Se observa la muestra en el
microscopio para ver el color de las bacterias. Las bacterias Gram positivas aparecen
de color violeta, mientras que las Gram negativas se tiñen de rosa.
ANEXO 12 Tinción de endosporas, método de Wirtz.
Se debe preparar un frotis bacteriano, luego se tiñe con verde malaquita. Con unas
pinzas de madera se coloca la muestra encima de la llama del mechero para que el
colorante emita vapores (5 min), pero sin que hierva. La muestra no se debe secar,
luego se lava con agua. Después se tiñe con safranina (1 min), se enjuaga y seca la
preparación con papel filtro, para luego observarlo al microscopio (X100).
70
ANEXO 13 Resultado de test APi 50CH para las cepas 6,7,8,9 y 44.
substrato
Result.
substrato
Result.
substrato
Result.
substrato
Result.
substrato
Result.
Control
-
Galactosa
+
-Metil-D-
-
Melibiosa
+
D
+
Turanosa
Mannosido
Glicerol
+
Glucosa
+
-Metil-D-
+
SAccarosa
+
D Lixosa
-
-
Trehalosa
+
D Tagatosa
-
glucosido
Eritritol
-
Fructosa
+
N-AcetilGlucosamiina
D
-
Mannosa
+
Amigdalina
+
Inulina
-
D Fucosa
-
+
Sorbosa
-
Arbutina
+
Melezitosa
-
L Fucosa
-
Arabinosa
L
Arabinosa
Ribosa
+
Rhamnosa
-
ESculina
+
Rafinosa
+
D Arabitol
-
D Xilosa
+
Dulcitol
-
Salicina
+
Almidón
+
L Arabitol
-
L Xilosa
+
Inositol
+
Celobiosa
+
Glicógeno
+
Gluconato
-
Adonitol
-
Mannitol
+
Maltosa
+
Xilitol
-
ß Metil-O-
-
Sorbitol
+
Lactosa
+
Gentiobiosa
+
2-Keto-
-
Gluconato
5-Keto-
Xilosido
Gluconato
* + = prueba positiva. - = prueba negativa.
ANEXO 14 Resultado de API 20 E para las cepas 6, 7, 8, 9 y 44.
Test
Reacción
Resultado
ONPG
Betagalactosidasa
-
ADH
Arginina dehidrolasa
-
LDC
Lisina descarboxilasa
-
ODC
Ornitina descarboxilasa
-
CIT
Utilización de citrato
-
H2S
Producción de H2 S
-
URE
Ureasa
-
TDA
Triptofano desaminasa
-
IND
Producción de indol
-
VP
Producción de acetoína
+
GEL
Gelatinasa
+
GLU
Fermentación/ oxidación
-
* + = prueba positiva. - = prueba negativa.
-
71
ANEXO 15 Resultado cepa 10 de API 50 CH.
substrato
Result.
substrato
Result.
substrato
Result.
substrato
Result.
substrato
Result.
Control
-
Galactosa
+
-Metil-D-
-
Melibiosa
+
D
-
Turanosa
Mannosido
Glicerol
+
Glucosa
+
-Metil-D-
+
SAccarosa
+
D Lixosa
-
-
Trehalosa
+
D Tagatosa
-
glucosido
Eritritol
-
Fructosa
+
N-AcetilGlucosamiina
D
-
Mannosa
+
Amigdalina
+
Inulina
-
D Fucosa
-
+
Sorbosa
-
Arbutina
+
Melezitosa
-
L Fucosa
-
Arabinosa
L
arabinosa
Ribosa
+
Rhamnosa
-
ESculina
+
Rafinosa
+
D Arabitol
-
D Xilosa
+
Dulcitol
-
Salicina
+
Almidón
+
L Arabitol
-
L Xilosa
+
Inositol
+
Celobiosa
+
Glicógeno
+
Gluconato
-
Adonitol
-
Mannitol
+
Maltosa
+
Xilitol
-
ß Metil-O-
-
Sorbitol
+
Lactosa
+
Gentiobiosa
+
2-Keto-
-
Gluconato
5-Keto-
Xilosido
Gluconato
* + = prueba positiva. - = prueba negativa.
ANEXO 16 Resultado de API 20 E, para la cepa Nº 10.
Test
Reacción
Resultado
ONPG
Betagalactosidasa
-
ADH
Arginina dehidrolasa
-
LDC
Lisina descarboxilasa
-
ODC
Ornitina descarboxilasa
-
CIT
Utilización de citrato
-
H2S
Producción de H2 S
-
URE
Ureasa
-
TDA
Triptofano desaminasa
-
IND
Producción de indol
-
VP
Producción de acetoína
-
GEL
Gelatinasa
+
GLU
Fermentación/ oxidación
-
* + = prueba positiva - = prueba negativa.
-
72
ANEXO 17 Resultados de medición de las cepas del grupo Bacillus subtilis.
Bacteria 1
Bacteria 2
Bacteria 3
Promedio total
N° de
cepa
Largo
Ancho
Largo
Ancho
Largo
Ancho
Largo
Ancho
μm
μm
μm
μm
μm
μm
μm
μm
6
7
8
9
10
44
Promedio
total
1.7
1.6
1.4
1.6
1.7
1.6
0.7
0.6
0.5
0.6
0.8
0.6
1.7
1.7
1.6
1.5
1.6
1.5
0.6
0.7
0.5
0.6
0.6
0.5
1.6
1.7
1.8
1.7
1.5
1.8
0.4
0.6
0.8
0.8
0.4
0.7
1.67
1.67
1.60
1.60
1.60
1.63
0.57
0.63
0.60
0.67
0.60
0.60
1.60
0.63
1.60
0.58
1.68
0.62
1.63
0.61
ANEXO 18 Resultados de la identificación mediante API bioMéreux, para las
cepas 6, 7, 8, 9 y 44.
Taxones significativos
Identificación de
Índice de
especie (%)
tipicidad (T)
53.5
0.66
3
Chester
17.3
0.71
3
B. subtilis Cohn
16.6
0.68
4
B. amyloliquefaciens Priest.
1.1
0.54
4
B.megaterium Bary
Test en contra
B. licheniformis (Weigmann)
ANEXO 19 Resultados de la identificación mediante API bioMéreux, para la
hhhhcepa 10.
Taxones significativos
Identificación de
Índice de
Test en
especie (%)
tipicidad (T)
contra
B. megaterium Bary
78.6
0.60
4
B. licheniformis (Weigmann)
12.3
0.63
4
B. amyloliquefaciens Priest.
2.9
0.50
5
B. subtilis Cohn
2.2
0.53
5
B. circulans Jordan
2.0
0.61
3
Chester
73
ANEXO 20 Resultados de antagonismo, primera semana.
N de cepa de
Fusarium
N de cepa de
Bacillus
172
102
103
105
106
108
111
113
114
117
3
3
1
1
1
2
2
2
2
162
2
1
1
1
1
2
2
1
2
154
3
3
1
1
1
2
2
2
2
152
3
3
1
1
1
2
2
2
2
130
2
1
1
1
1
2
2
2
2
124
3
3
2
2
3
3
2
3
2
102
2
2
2
2
2
2
2
2
2
100
2
2
2
2
2
2
2
2
2
56
1
1
1
1
2
2
2
2
2
44
3
3
3
3
3
3
3
3
3
10
3
3
3
3
3
3
3
3
3
9
3
3
3
3
3
3
3
3
3
8
3
3
3
3
3
3
3
3
3
7
3
3
3
3
3
3
3
3
3
6
3
3
3
3
3
3
3
3
3
* Datos tomados luego de una semana (8/8/04), 3= Inhibición con halo. 2 = Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
74
Continuación ANEXO 20
N de cepa
de
118
120
121
123
128
131
133
135
137
139
172
2
2
2
1
2
2
2
2
1
3
162
1
1
1
1
2
1
2
2
1
2
154
1
2
2
2
2
2
1
2
1
2
152
1
2
1
2
2
2
1
2
1
2
130
1
2
1
2
2
2
1
2
1
2
124
3
2
3
3
1
3
2
2
1
3
102
2
2
1
2
2
2
2
2
1
2
100
2
2
2
2
2
2
2
2
1
2
56
2
2
2
2
2
2
2
2
3
1
44
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
10
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
9
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
8
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
7
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
6
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de una semana (8/8/04), 3= Inhibición con halo. 2 = Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
75
Continuación ANEXO 20
N de cepa
de
142
143
144
145
149
158
159
161
162
163
172
2
2
2
1
3
2
3
2
3
2
162
2
2
2
1
2
2
1
1
2
2
154
2
3
2
1
2
2
3
3
3
2
152
2
3
2
1
2
2
3
3
3
2
130
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
124
2
3
2
3
2
3
3
2
3
3
102
2
2
2
1
1
2
2
1
2
1
100
2
2
2
1
1
2
2
1
2
1
56
2
2
2
1
1
2
2
1
1
1
44
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
10
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
9
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
8
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
7
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
6
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de una semana (8/8/04), 3= Inhibición con halo. 2 = Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
76
Continuación ANEXO 20
N de cepa
de
165
168
169
173
175
176
177
178
179
180
172
2
2
3
3
2
2
3
1
3
2
162
2
2
2
2
2
1
1
1
2
2
154
2
2
3
2
2
1
3
2
2
2
152
2
2
3
3
2
1
3
2
2
2
130
2
2
2
2
2
1
1
2
2
2
124
3
1
3
3
3
2
3
3
3
2
102
2
3
1
2
2
1
3
1
1
2
100
2
1
1
2
2
1
2
1
2
2
56
2
1
1
1
2
1
2
1
2
2
44
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
10
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
9
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
8
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
7
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
6
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de una semana (8/8/04), 3= Inhibición con halo. 2 = Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
77
Continuación ANEXO 20
N de cepa
de
181
182
184
187
189
190
191
194
197
200
172
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
162
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
154
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
152
2
2
3
2
3
2
2
2
2
2
130
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
124
2
2
3
2
3
3
2
2
3
2
102
2
2
2
1
2
2
1
2
2
2
100
2
2
2
1
2
2
1
2
2
2
56
2
2
2
1
1
2
1
1
1
1
44
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
10
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
9
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
8
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
7
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
6
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de una semana (8/8/04), 3= Inhibición con halo. 2 = Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
78
Continuación ANEXO 20
N de cepa
de
202
213
251
252
253
303
304
345
351
356
360
172
2
1
3
3
2
2
3
2
2
2
2
162
2
1
2
1
2
2
2
2
2
2
2
154
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
152
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
130
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
124
3
3
3
2
2
2
3
2
2
2
2
102
2
1
2
2
2
2
1
2
2
2
2
100
2
1
2
2
2
3
1
2
2
2
2
56
2
1
2
2
2
2
1
1
2
2
2
44
3
3
3
3
2
3
3
3
2
2
2
10
3
3
3
3
2
3
3
3
2
2
3
9
3
3
3
3
2
2
3
3
2
2
3
8
3
3
3
3
2
2
3
3
2
2
3
7
3
3
3
3
2
2
3
3
2
2
3
6
3
3
3
3
2
2
3
3
2
2
3
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de una semana (8/8/04), 3= Inhibición con halo. 2 = Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
79
ANEXO 21 Resultados de antagonismo, segunda semana.
N de cepa de
Fusarium
102
103
105
106
108
111
113
114
117
172
1
2
1
1
1
1
1
1
1
162
1
2
1
1
1
1
1
1
1
154
1
2
1
1
1
1
1
1
1
152
1
2
1
1
1
1
1
1
1
130
1
2
1
1
1
1
1
1
1
124
2
2
2
2
2
2
1
1
1
102
1
1
1
1
1
1
1
1
1
100
1
1
1
1
1
1
1
1
1
56
1
1
1
1
1
1
1
1
1
44
2
3
3
3
3
2
3
2
3
10
2
3
3
3
3
2
2
3
3
9
2
3
3
3
3
2
2
2
3
8
2
3
3
3
3
3
3
1
3
7
2
3
3
3
3
3
2
3
3
6
2
3
3
3
3
3
3
3
3
N de cepa de
Bacillus
* Datos tomados luego de dos semanas (16/8/04).
3 = Inhibición con halo. 2= Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
80
Continuación ANEXO 21
N de cepa
de
118
120
121
123
128
131
133
135
137
139
172
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
162
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
154
1
1
1
2
1
1
1
2
1
1
152
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
130
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
124
2
2
2
2
1
1
2
2
1
2
102
1
1
1
2
2
1
1
2
1
1
100
1
1
1
2
2
1
1
2
1
1
56
1
1
1
2
2
1
1
2
1
1
44
3
2
2
3
3
2
3
3
2
2
10
3
3
2
3
3
3
3
2
3
2
9
3
3
2
2
3
3
3
2
3
3
8
3
3
2
2
3
2
3
2
3
2
7
3
3
2
2
3
2
3
2
3
2
6
3
3
3
2
3
2
3
2
3
3
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de dos semanas (16/8/04).
3 = Inhibición con halo. 2= Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
81
Continuación ANEXO 21
N de cepa
de
142
143
144
145
149
158
159
161
162
163
172
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
162
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
154
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
152
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
130
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
124
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
102
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
100
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
56
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
44
2
3
3
3
2
3
3
3
3
3
10
2
3
3
3
2
3
3
3
3
3
9
2
3
3
3
2
3
3
3
3
3
8
2
3
3
3
2
3
3
3
3
3
7
2
3
3
3
2
3
3
3
3
3
6
2
3
3
3
2
3
3
3
3
3
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de dos semanas (16/8/04).
3 = Inhibición con halo. 2= Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
82
Continuación ANEXO 21
N de cepa
de
165
168
169
173
175
176
177
178
179
180
172
1
2
1
1
1
1
2
1
1
1
162
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
154
1
2
1
1
1
1
2
1
1
1
152
1
2
1
1
1
1
2
1
1
1
130
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
124
2
1
2
2
2
2
3
2
1
2
102
2
3
1
1
1
1
2
1
1
1
100
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
56
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
44
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
10
3
3
3
3
2
3
3
3
2
2
9
3
3
3
3
2
3
3
3
2
2
8
3
3
3
3
2
3
3
3
2
2
7
3
3
3
3
2
3
3
3
2
2
6
3
3
3
3
2
3
3
3
2
2
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de dos semanas (16/8/04).
3 = Inhibición con halo. 2= Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
83
Continuación ANEXO 21
N de cepa
de
181
182
184
187
189
190
191
194
197
200
172
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
162
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
154
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
152
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
130
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
124
1
2
1
2
2
2
2
2
2
2
102
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
100
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
56
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
44
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
10
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
9
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
8
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
7
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
6
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de dos semanas (16/8/04).
3 = Inhibición con halo. 2= Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.
(Continúa)
84
Continuación ANEXO 21
N de cepa
de
202
213
251
252
253
303
304
345
351
356
360
172
1
1
1
1
2
2
1
1
2
2
2
162
1
1
1
1
2
2
1
1
2
2
2
154
1
1
1
1
2
3
1
1
2
2
2
152
1
1
1
1
2
2
1
1
2
2
2
130
1
1
1
1
2
2
1
1
2
2
2
124
2
3
1
2
2
2
3
2
2
2
2
102
1
1
1
2
2
1
1
1
1
2
2
100
1
1
1
2
2
1
1
1
1
2
2
56
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
2
44
2
2
3
3
2
3
3
3
2
2
3
10
2
3
3
3
2
1
3
2
2
2
2
9
2
3
3
3
2
1
3
3
2
2
2
8
2
3
3
3
2
1
3
3
2
2
2
7
2
3
3
3
2
1
3
3
2
2
2
6
2
3
3
3
2
1
3
3
2
2
2
Fusarium
N de cepa
de Bacillus
* Datos tomados luego de dos semanas (16/8/04).
3 = Inhibición con halo. 2= Inhibición sin halo. 1 = Sin inhibición.