Guión en formato pdf - Universidad Autónoma de Madrid
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LABORATORIO AVANZADO DE FISIOLOGÍA FIJACIÓN SIMBIÓTICA DE NITRÓGENO Y ESTRÉS SALINO. Profesores: Rafael Rivilla Palma, Luis Bolaños Rosa, Marta Martín Basanta INTRODUCCIÓN: La fijación biológica del nitrógeno atmosférico, consistente en la reducción de N2 a NH4+ por la enzima nitrogenasa, es, después de la fotosíntesis, la ruta metabólica más importante para el mantenimiento de la vida en la Biosfera. Este proceso crucial tiene al oxígeno como mayor inhibidor y sólo puede ser llevado a cabo por unos pocos grupos de seres vivos, todos ellos procariotas, que pueden generar un ambiente microaerobio donde realizar la fijación biológica de nitrógeno en forma libre o estableciendo relaciones simbióticas con otros organismos. Dentro de esta última opción, el sistema rizobiáceas–leguminosas es el que ha sido estudiado ampliamente y en mayor profundidad. A diferencia de otros fijadores de N2, las rizobiáceas sólo pueden realizar este proceso tras una serie de interacciones con leguminosas, que originan el desarrollo de un órgano mixto, normalmente en la raíz, el nódulo simbiótico, en el que se proporciona un entorno de oxígeno controlado, así como los nutrientes necesarios para que la bacteria pueda efectuar el proceso de fijación. El objeto de este módulo es la utilización de diversas técnicas bioquímicas y de biología molecular para estudiar el proceso de fijación de N2 en la simbiosis Rhizobium-guisante (Pisum sativum L.). Asimismo, puesto que las leguminosas, como el guisante, son plantas sensibles a la salinidad, especialmente cuando dependen de la simbiosis para la obtención del nitrógeno, el empleo de dichas técnicas permitirá analizar los efectos del estrés salino sobre la fijación de N2. El desarrollo de esta práctica consiste en el estudio de la enzima nitrogenasa encargada de fijar nitrógeno dentro del nódulo formado en la simbiosis Rhizobium-guisante. Se llevará a cabo a nivel de la transcripción, síntesis de proteínas y actividad enzimática, en dos situaciones fisiológicas: cultivo control y estrés salino. SISTEMA BIOLÓGICO. El sistema biológico que vamos a utilizar es la simbiosis guisante (Pisum sativum L. cv. Argona)Rhizobium leguminosarum. La cepa de Rhizobium es la 3841-GFP, que contiene un plásmido que expresa constitutivamente el gen que codifica la Proteína Verde Fluorescente, permitiendo su visualización mediante microscopía de fluorescencia. Tres semanas antes de comenzar la práctica, se esterilizan superficialmente semillas de guisante, que son germinadas después de una noche de vernalización. Tres días después, las plántulas se trasplantan a macetas tipo Riviera, utilizando perlita como soporte sólido y FP como solución nutritiva. Las plantas son inoculadas con la cepa bacteriana y crecidas en una cámara con fotoperiodo y temperatura controlada. Se establecen dos tratamientos, un tratamiento control y otro en el que al medio FP se le añade NaCl a una concentración final de 75 mM. Semanalmente se riegan las plantas por capilaridad con el medio correspondiente. MATERIALES Y MÉTODOS: CULTIVO DE LEGUMINOSAS E INOCULACIÓN CON Rhizobium MATERIAL BIOLÓGICO Leguminosas: Pisum sativum L. cv. Argona. Variedad de guisante cedida por el Departamento de Química Agrícola de la Universidad Autónoma de Madrid. Cepas bacterianas: Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841GFP. Cepa construida a partir de 3841, a la que se le introdujo pHC60 (TetR) , un plásmido estable en la rizosfera que expresa constitutivamente la proteína fluorescente verde (GFP, “green fluorescent protein) (Cheng y Walker, 1998). Para la adquisición del plásmido por 3841, se realizó una conjugación triparental, con dos cepas de E. coli, que contenían el plásmido pHC60 y el plásmido “helper” pRK2013, respectivamente. MEDIOS DE CULTIVO Medios para leguminosas Se utilizará, como base para los experimentos, el medio FP para leguminosas noduladas Componentes g.L-1 CaCl2.2H2O 0.10 MgSO4.7H2O 0.12 KH2PO4 0.10 Na2HPO4.12H2O 0.15 Citrato Férrico 0.005 Gibson's (micronutrientes) 1mL.L-1 FP pH 6.5 Solución de micronutrientes Gibson's Componentes g.L-1 Gibson’s MnSO4.7H2O 2.03 ZnSO4.7H2O 0.22 CuSO4.5H2O 0.08 H2MoO4.H2O 0.08 H3BO3 0.57 Medios para bacterias Para el crecimiento de Rhizobium se utilizará el medio TY (medio completo para Rhizobium) g.L-1 Triptona 5.0 Extracto de levadura 3.0 CaCl2 1.0 Agar 10.0 Este medio de cultivo se suplementa con antibióticos: Antibiótico Solución madre Disolvente mg/mL Concentración final µg/mL Estreptomicina 200 H2O 200 Tetraciclina 10 H2O 10 CONDICIONES DE CULTIVO Cultivo de Rhizobium Previo a la inoculación de las plantas, las bacterias se cultivan en medio líquido a 28oC durante 48 horas y se airean en un incubador con agitación orbital a 150 r.p.m. Cultivo e inoculación de leguminosas Esterilización y germinación de semillas Las semillas de guisante se lavan durante 1 minuto en etanol al 70% y se esterilizan en lejía durante 15 minutos, después se lavan con aproximadamente 500 mL de agua bidestilada y estéril. Para los experimentos de desarrollo de plantas y nodulación, se siembran las semillas estériles en tiestos de plástico tipo Riviera, previamente esterilizados mediante lavado con etanol, usando perlita autoclavada como soporte sólido y medio FP. Los tiestos se mantienen en oscuridad y, una semana después, las plántulas se pasan a una cámara de cultivo con un ciclo luz-oscuridad de 168 horas y una temperatura de 25-18oC. Preparación de inóculos e inoculación Dos días antes de la inoculación, se crece Rhizobium en medio TY líquido a 28oC y en agitación. Una vez en fase exponencial, cada planta se inocula con 1 mL (aproximadamente 108 células.mL-1) de la suspensión bacteriana. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS INTRODUCCIÓN La mayoría de los polímeros biológicos poseen carga eléctrica y, por lo tanto, son capaces de migrar bajo la influencia de un campo eléctrico. El transporte de partículas a través de un disolvente mediante un campo eléctrico recibe el nombre de electroforesis. Una forma usual de caracterizar una macromolécula es la determinación de la velocidad con que se mueve al someterla a un campo eléctrico. Esta propiedad puede ser utilizada para calcular el peso molecular de una proteína, para distinguir moléculas por su carga neta o su forma, para detectar cambios de aminoácidos, de restos polares o no polares y viceversa, y para separar cuantitativamente distintas especies moleculares. La muestra a tratar se aplica como una mancha o como una banda sobre un soporte inerte y homogéneo, y las partículas migran hacia uno u otro polo del campo eléctrico a través de un disolvente, en función de su carga, de su peso y de su estructura fundamentalmente. En función del soporte, la electroforesis puede ser de distintos tipos: de papel, de acetato o, fundamentalmente, de gel. Los primeros geles desarrollados eran de almidón, pero actualmente se han reemplazado por los de poliacrilamida (mezcla, acrilamida/biacrilamida al 30%) por ser más fácil controlar el tamaño del poro del gel utilizando distintas concentraciones de los monómeros que lo forman. 1. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DESNATURALIZANTES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-PAGE) El peso molecular de la mayoría de las proteínas puede ser determinado midiendo la movilidad en geles de poliacrilamida con el detergente dodecilsulfato sódico (SDS, “sodium dodecyl sulfate”). El detergente provoca la pérdida de la estructura nativa de las proteínas. Además el SDS se fija a las mismas de modo constante, confiriéndoles carga negativa (en una proporción en la que 1.4 g de SDS se unen a 1 g de proteína). Así, la relación carga/masa se mantiene constante y la separación de los péptidos se produce en función exclusivamente del peso molecular. Las proteínas, cargadas negativamente, migran todas hacia el ánodo y conforme atraviesan la red formada por la poliacrilamida, se van separando de mayor a menor peso molecular, al presentar distintos coeficientes de fricción. Existe una relación inversamente proporcional entre la distancia recorrida y el logaritmo decimal del peso molecular de la proteína. La electroforesis permite obtener el patrón de polipéptidos de una muestra, así como los diferentes pesos moleculares de los péptidos, por la comparación con marcadores que son proteínas de peso molecular conocido, que se utilizan a la vez que las muestras. Preparación de las muestras Las proteínas a separar se extraen en un tampón de rotura y solubilización (tampón Laemmli), que contiene: Agua destilada 3.55 mL Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 1.25 mL Glicerol 2.5 mL SDS al 10% 2 mL 2-β-Mercaptoetanol 0.5 mL Azul de Bromofenol al 0.5% (p/v) 0.2 mL Se pesan 50 mg de nódulos y las proteínas de los mismos se extraen con 150 μL de tampón de rotura. Las muestras se homogenizan con un "mini-mortero". A continuación se hierven durante 10 min en un baño a ebullición. Finalmente se centrifugan 5 min a 14000 rpm. Con este tratamiento las proteínas quedan solubilizadas en el sobrenadante, del cual, con una micropipeta, se tomará el volumen adecuad (dependiendo de la concentración de proteínas) para introducir en los pocillos del gel. Preparación de geles de poliacrilamida-SDS Los geles se polimerizan entre dos placas de vidrio separadas por espaciadores de plástico. En los geles se diferencian dos partes con distinta concentración de poliacrilamida: una superior o gel de concentración y una inferior o gel de separación. En el protocolo que se detalla a continuación, las cantidades indicadas se refieren a la preparación de 2 minigeles con unas dimensiones de aproximadamente 80 x 70 x 1 mm. Primero se prepara y polimeriza el gel de separación, en tampón Tris-HCL 0.375 M, pH 8.8. Los reactivos y volúmenes para 2 minigeles y para dos concentraciones distintas de poliacrilamida (aunque en la práctica sólo se realizarán geles al 12 %) son: 12 % de poliacrilamida 7.5 % de poliacrilamida Agua destilada 3.35 mL 4.85 mL 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 2.5 mL 2.5 mL SDS al 10% 100 μL 100 μL Acrilamida/bis (30%) 4.0 mL 2.5 mL Persulfato amónico (APS) al 10% 50 μL 50 μL N-N’-tetrametilenetilén-diamida 5 μL 5 μL 10 mL 10 mL (TEMED) TOTAL Para que la polimerización sea correcta, el gel se cubre con agua destilada, que se retirará una vez gelifique la poliacrilamida. A continuación se prepara y vierte sobre el gel separador, el gel de concentración, en Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8. Para 2 minigeles: 4 % de poliacrilamida Agua destilada 6.1 mL 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 2.5 mL SDS al 10% 100 μL Acrilamida/bis (30%) 1.3 mL Persulfato amónico (APS) al 10% 100 μL N-N’-tetrametilenetilén-diamida (TEMED) 5 μL TOTAL 10 mL Una vez vertido el gel de concentración sobre el espaciador, se coloca el peine que forma los pocillos. Terminada la polimerización, se retira el peine y se lavan los pocillos con agua destilada. Yo lo haría ya con el tampón de electroforesis, justo antes de cargar la muestra. Electroforesis de las muestras Las placas de electroforesis donde se encuentran los geles polimerizados, se montan sobre la cubeta de elctroforesis, y esta se llena del electrolito (Tris-Glicina pH 8.3). Su composición para 1 litro es: Trizma base 15 g Glicina 72 g SDS 5g Tras añadir las muestras en los pocillos, incluyendo los marcadores de peso molecular, se cierra la cubeta y se aplica una corriente eléctrica de 100 V, que se mantiene hasta que el frente alcanza la parte inferior del gel. Las muestras a utilizar serán extracto de proteínas de raíces noduladas de ambos tratamientos. Tinción de los geles Las bandas de proteínas, una vez terminada la electroforesis, se visualizan tiñendo los geles con una solución de Coomasie cuya composición para 1 litro es Azul de Coomasie 2g Ácido acético (10%) 100 mL Metanol (40%) 400 mL La tinción se realiza con agitación suave durante 30 min. Para eliminar el exceso de coloración, el gel se introduce en una solución de metanol (40%) y ácido acético (10%) en H2O, que se renueva varias veces hasta distinguir nítidamente las bandas. 2.-TRANSFERENCIA ELÉCTRICA DE LAS PROTEÍNAS A MEMBRANAS (ELECTROBLOTTING) Alternativamente a la tinción con Coomasie, para estudiar las proteínas separadas, los geles se pueden transferir eléctricamente a membranas de distinta naturaleza (nitrocelulosa, nylon, etc.). El fundamento es similar al de la electroforesis, pero, en este caso, se aplica un campo eléctrico horizontal, que hace “despegarse” del gel a las proteínas previamente separadas, las cuales se adhieren a la membrana. En este caso, el electrolito a utilizar puede ser un tampón fosfato o, más comúnmente Tris-glicina en metanol, pH 8.3 Tris 25 mM 3.03 g L-1 Glicina 192 mM 14.4 g L-1 Metanol 20% 200 mL L-1 Con esta composición, el pH será el deseado y no es necesario ajustarlo. Ensamblaje del cassette de transferencia La preparación de la transferencia implica el montaje de un “sándwich” con el gel cuyas bandas se van a transferir y la membrana. Ambos deben de encontrarse permanentemente saturados con el electrolito de transferencia, para ello se utiliza papel de filtro empapado en él y las almohadillas del cassette, según el siguiente protocolo: 1. Cortar la membrana según las dimensiones del gel y bañarla en el electrolito durante 15 min. 2. Cortar 6 trozos de papel de filtro y saturarlos de electrolito. 3. Extraer el gel de las placas de vidrio y lavarlo en el electrolito. 4. Montar el “sándwich” de transferencia en una bandeja con electrolito con el siguiente orden: - 3 trozos de papel de filtro - el gel a transferir - la membrana - 3 trozos de papel de filtro 5. Eliminar las burbujas de aire que puedan haber quedado en el “sándwich”. 6. Cerrar a ambos lados con una almohadilla. 7. Colocar el “sándwich en el cassette con la siguiente orientación: - cara gris: lado del gel - cara blanca: lado de la membrana Transferencia electroforética Una vez preparado el gel para su transferencia a la membrana, se monta la cubeta de transferencia, teniendo en cuenta que el lado rojo es el ánodo, hacia donde migrarán las proteínas. La transferencia se puede realizar de forma rápida en frío o de forma lenta, a temperatura ambiente. Para realizarla en frío es conveniente atemperar previamente tanto el electrolito como la membrana y distintos compenentes del “sandwich”, además, se coloca junto a la cubeta, un bloque de hielo para mantener la temperatura durante la transferencia. Se añaden aproximadamente 650 mL de electrolito al tanque y se aplica la corriente. El tiempo de transferencia dependerá del voltaje y la intensidad de corriente aplicados. Para membranas de nitrocelulosa, usando como electrolito Tris-glicina-metanol, pH 8.3, y para minigeles como los descritos anteriormente, las condiciones de tansferencia aproximadas son: Voltaje e intensidad iniciales Voltaje e intensidad finales Rápida (1 hora aprox.) 100 V / aprox. 250 mA 100 V / aprox. 350 mA Lenta (12 horas) 30 V / aprox. 40 mA 30 V / aprox. 90 mA Una vez finalizada la transferencia, la membrana se puede procesar para su tinción (ej. con Rojo de Ponceau), para localizar e identificar immunológicamente alguna banda, etc.; o guardar en oscuridad y en sitio seco indefinidamente, lo cual otorga muchas ventajas respecto al gel. Inmunodetección de la nitrogenasa Se utilizará un antisuero (anticuerpo policlonal) obtenido en conejo al que se le inyectó el componente II (nitrogenasa reductasa) de la nitrogenasa. Este suero reconocerá la proteína previamente inmovilizada en las membranas de nitrocelulosa y reaccionará con ella. La reacción antígeno-anticuerpo se puede revelar con un anticuerpo (secundario) que reconoce al anterior (primario), y que lleva conjugada una actividad enzimática, en este caso peroxidasa, cuya actividad coloreará a un reactivo determinado (cloronaftol), apareciendo una banda azulada allí donde esté el componente II de la nitrogenasa. Se procede siguiendo el siguiente protocolo: 1) Lavar la membrana de nitrocelulosa en tampón TBS (Tris–HCl, 50 mM pH 7.4, NaCl 200 mM) durante 30 minutos. 2) Bloquear la membrana en lactoalbúmina (leche desnatada en polvo) al 5% (p/v) en TBS durante 1 hora, para saturarla de proteína no reconocible por el anticuerpo, y provocar que este sólo se una allá donde esté su antígeno. 3) Incubar con el anticuerpo primario a una dilución 1:2000 en leche en polvo al 1% (p/v) en TBS durante 1hora a temperatura ambiente (o 12 horas a 4ºC). 4) Lavar dos veces durante 5 minutos en TBS. 5) Incubar con el anticuerpo secundario (anti–IgG de conejo, obtenido en cabra, conjugado con actividad peroxidasa de BioRad) diluido 1:2000 en leche en polvo al 5% (p/v) en TBS durante 1 hora a temperatura ambiente. 6) Lavar 5 veces durante cinco minutos en TBS. Para revelar se añade sobre la nitrocelulosa una solución de 4–cloro–1–naftol en metanol (a 4oC) a una concentración de 3 mg mL–1 a la cual se le añaden 5 volúmenes de TBS y H2O2 al 0.01% (v/v) (normalmente se preparan 30 mg de cloronaftol en 10 mL de metanol frío, se añaden 50 mL de TBS y 16.7 μL de H2O2 de 30 volúmenes). Se deja incubando a temperatura ambiente hasta que aparecen bandas de color azul, momento en el que se para la reacción añadiendo y lavando la membrana con agua. Posteriormente se secan las membranas y se guardan en oscuridad. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA POR RT-PCR. Introducción: La RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) en la actualidad es la técnica más sensible que se utiliza para detectar y en su caso cuantificar ARN mensajero. En esta práctica vamos a analizar la expresión del gen nifH de Rhizobium leguminosarum que codifica la proteína nitrogenasa reductasa, la misma que detectamos en el ensayo de western-blot. El primer paso consiste en la conversión del ARN mensajero en ADN complementario mediante la acción de una retrotranscriptasa (RT). Una vez obtenidos los ADNs complementarios se someterán a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permite la síntesis "in vitro" de secuencias específicas de ADN. Es una forma simple y muy rápida de multiplicar el ADN presente en diferentes muestras biológicas, obteniéndose millones de copias de una determinada secuencia de ADN. Se basa en la replicación del ADN de los organismos eucariotas realizada por la ADN polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región de doble cadena se usan los denominados cebadores (primers) que son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de ADN que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: 1ª Desnaturalización del ADN de doble cadena 2ª Hibridación de los cebadores a la zona 3´específica de cada una de las hebras 3ª Extensión del cebador por actuación de la ADN polimerasa En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (94ºC). En el segundo paso (hibridación) los cebadores se unen a las zonas complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (en nuestro caso 56ºC), a esta temperatura los cebadores presentan mayor estabilidad y facilita la hibridación con el ADN complementario. En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los deoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos se pueden apreciar gráficamente en la siguiente figura. Desnaturalización Hibridación Elongación PROTOCOLO Extracción de ARN: 1.- Tomar la raíz de la planta correspondiente y envolver en papel de aluminio (hacer un pequeño paquetito previamente marcado con rotulador indeleble), posteriormente se mete en nitrógeno líquido con el objeto de congelar el tejido instantáneamente. Sacar el paquete del contenedor de nitrógeno líquido y machacar con un martillo (congelar en nitrógeno líquido y machacar sucesivamente tres veces). 2.- Recoger el polvo de raíz machacada en un eppendorf y añadir 100 μl de Tris-EDTA (TE) que contiene 3mg/ml de lisozima. Incubar 5 min a temperatura ambiente 3.- Añadir: 75 μl de tampón de lisis (SV RNA lysis buffer) 350 μl de tampón para diluir ARN (RNA dilution buffer) Mezclar invirtiendo el tubo varias veces y Añadir 200 μl de Etanol al 95% Mezclar pipeteando con la micropipeta P-1000 (de punta azul) 3 ó 4 veces 4.- Transferir esta mezcla a una columna de extracción de ARN Centrifugar a tope en una centrífuga eppendorf durante 1 minuto 5.- Vaciar el tubo colector Añadir a la columna 600 μl de solución de lavado (SV RNA wash solution) Centrifugar a tope en una centrífuga eppendorf durante 1 minuto 6.- Vaciar el tubo colector Añadir a la columna 50 μl de solución con DNasa. Incubar 15 minutos a 20ºC en el termobloque Añadir 200 μl de solución de parada de la digestión con DNasa (SV Dnase stop solution). Centrigugar a tope en centrífuga eppendorf durante 1 minuto 7.- Vaciar el tubo colector Añadir 600 μl de solución de lavado (SV RNA wash solution) Centrifugar a tope en centrífuga eppendorf durante 1 minuto 8.- Vaciar el tubo colector Añadir 250 μl de solución de lavado (SV RNA wash solution) Centrífugar a tope en centrífuga eppendorf durante 2 minutos. 9.- Transferir la columna a otro tubo colector de 2 ml (marcar todos los tubos y columnas) Añadir a la columna 100 μl de agua tratada con DEPC (Dietil pirocarbonato) Centrifugar a tope en centrífuga eppendorf durante 1 minuto. CONSERVAR EL TUBO COLECTOR QUE CONTIENE EL ARN EN HIELO. Determinación espectrofotométrica de la concentración de ARN: Se toman 5 μl del extracto de ARN y se añaden 95 μl de agua destilada. Se mide la densidad óptica a una longitud de onda de 260 nm y se calcula la concentración de ARN teniendo en cuenta que una D.O=1 equivale a 40 μg de ARN. Electroforesis de ARN: Preparación del gel: Pesar 3 gr de Agarosa, introducirla en un erlenmeyer y añadir 150 ml de agua destilada, calentar en el microondas. Dejar enfriar un poco y añadir 20 ml de tampón de electroforesis (10x MEN) y 32 ml de Formaldehído. Mezclar bien y añadir la mezcla a la bandeja que previamente ha sido sellada con cinta adhesiva. Dejar solidificar. Posteriormente se pone el gel en la cubeta y añadir tampón de electroforesis (1x MEN) hasta el borde del gel (no debe cubrir el gel). Preparación de las muestras: En un eppendorf poner 20 μl del ARN extraido y añadir: - 20 μl de Formamida 5 μl de 10xMEN 6 μl de Formaldehído 2 μl de Bromuro de Etidio Calentar la mezcla a 60 ºC durante 10 minutos, en el termobloque. Centrifugar durante unos segundos. Cargar las muestras en el gel, poner en un extremo del gel tampón de carga con color para poder observar por dónde va la carrera. Una vez terminada la carrera observar el gel con luz ultravioleta. RT-PCR. Tomar un eppendorf que contiene liofilizados la Retrotranscriptasa, la ADN polimerasa. los dNTPs, el MgSO4 y los tampones necesarios. Hidratar el liofilizado con agua tratada con DEPC (Dietil pirocarbonato) (el volumen total de reacción será de 50 μl, por lo que la cantidad de agua, dependerá de la cantidad de ARN extraído). Añadir: • 50 ng del ARN extraído • 5 μl de primer nifHF (50 pmoles) • 5 μl de primer nifHR (50 pmoles) Una vez preparada la mezcla, introducir el eppendorf en la máquina de PCR. Condiciones de RT-PCR: - 42ºC durante 30 minutos. En este periodo se lleva a cabo la retrotranscripción. 95ºC durante 5 minutos. En este periodo se lleva a cabo la inactivación de la retrotranscriptasa y se desnaturaliza el ADN formado, para que quede preparado para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 40 ciclos de PCR en las siguientes condiciones: - 94ºC durante 30 segundos (desnaturalización) - 56 ºC durante 1 minuto (hibridación) - 72ºC durante 2 minutos (elongación) Elongación final: - 72ºC durante 7 minutos. En este periodo se lleva a cabo la elongación final. - Conservación a 4ºC. Dejamos proceder la RT-PCR a lo largo de la noche. Gel de ADN para analizar el resultado de la RT-PCR. Preparación del gel: Pesar 2 gramos de Agarosa, introducirla en un erlenmeyer y añadir 100 ml de tampón de electroforesis (1xTAE). Calentar en el microondas. Dejar enfriar y echar sobre la bandeja que está previamente sellada con cinta adhesiva. Una vez gelificado poner en la cubeta y añadir tampón de electroforesis (1xTAE) de manera que cubra totalmente el gel. Preparación de las muestras: Tomar 20 μl del tubo eppendorf donde se ha llevado a cabo la reacción de RT-PCR y añadir 5 μl de tampón de carga (que da densidad a la muestra para que no se salga del pocillo), centrifugar unos segundos a tope y cargar en el gel. En dicho gel también hay que cargar en un pocillo 6 μl de marcador de ADN (que nos servirá para analizar el tamaño de las bandas obtenidas) y en otro pocillo tampón de carga con color (para poder saber por dónde van corriendo las muestras). Una vez terminada la carrera, se tiñe con Bromuro de etidio y se observa con luz ultravioleta. SOLUCIONES: TE: 10 mM tris 50xTAE: 2M Tris-acetato 25 mM EDTA 10xMEN: 200 mM MOPS 50 mM Acetato sódico 20 mM EDTA (Ajustar a pH 7.0 con NaOH) 0.05M EDTA (Ajustar a pH 8.3 con ac. acético) CROMATOGRAFÍA DE GASES: MEDIDA DE LA ACTIVIDAD NITROGENÁSICA El complejo enzimático encargado de la reducción de nitrógeno molecular a amonio se denomina nitrogenasa. La nitrogenasa no es por completo específica para el N2, ya que también puede reducir cianuro, acetileno y otros compuestos con triples enlaces. La reducción del acetileno por la nitrogenasa es un proceso en el que intervienen dos electrones y se produce etileno. Probablemente la producción de etileno no tiene utilidad ninguna para la planta pero suministra al experimentador un medio sencillo y rápido para ensayar la actividad de sistemas fijadores de N2, porque es relativamente fácil medir la reducción de acetileno a etileno por cromatografía de gases. 1. PROTOCOLO DETALLADO DE LA ESTIMACIÓN DE LA NITROGENÁSICA POR EL MÉTODO DE REDUCCIÓN DEL ACETILENO. ACTIVIDAD 1.a. Preparación del acetileno El acetileno se genera a partir de carburo cálcico, añadiéndole agua destilada en un recipiente diseñado al efecto del que se pueden tomar alícuotas del gas con una jeringuilla. 1.b. Determinación de la actividad Nitrogenásica Se toman, por duplicado, raíces noduladas en viales con un volumen total de 40 ml. Se cierran herméticamente con tapones de goma y se preincuban durante 10 minutos, con agitación continua a 28ºC. A continuación se reemplazan 4 ml (10% v/v del volumen total del vial) de la atmósfera interna de los viales por 4 ml de acetileno preparado a partir de carburo cálcico. Se incuban los viales durante 30 minutos (durante los cuales se consigue una respuesta lineal). Terminada la incubación, se toman muestras de 0.5 ml de gas de cada vial por triplicado. La cantidad de etileno producida se determina por cromatografía de gases empleando un cromatógrafo Shimadzu GC-8A con detector de ionización de llama acoplado a un integrador Spectraphysic SP4290 con las siguientes condiciones: TºC inyector/detector TºC columna Presión gas portador 150ºC 50ºC 1.2 kg/cm2 Columna Porapak N 80/100 int 1/8’’55 Además, se prepara una jeringuilla con una cantidad conocida de etileno (10 nmol), que llamaremos muestra patrón. El cromatógrafo detecta una serie de gases que serán registrados en forma de picos, con un tiempo de retención constante (el pico del etileno aparece a un tiempo de aproximadamente 0.60 minutos) y una altura determinada que vendrá medida en cuentas (en nuestro cromatógrafo, el pico del patrón es de 15000 cuentas, por lo que no es preciso prepararlo). Para los cálculos se aplica el siguiente razonamiento, resumido finalmente en la fórmula de abajo: -Si 0.5 mL de patrón (10 nmol de etileno) miden 15000 cuentas, 0,5 mL de la muestra, que darán una altura CM, tendrán una contenido de etileno de 10 x CM/15000 nmol. -Teniendo en cuenta que el volumen total del vial de ensayo es de 40 mL, y cada muestra de 0.5 mL, el contenido total de etileno en el ensayo será el calculado anteriormente por muestra multiplicado por el número de muestras (es decir 40 mL /0.5 mL muestra), por tanto x 80. - La actividad nitrogenásica por hora y planta finalmente hay que calcularla en función del tiempo de incubación (0.5 horas), y, si se requiere, se puede calcular en relación con el peso o con el número de nódulos. La ecuación resultante final sería por tanto: CM × 10nmol × Vvial (40mL) CP × VM × g nódulos(o nº denódulos). × t(0.5h) = nmolC 2 H 4 /gnódulos (o nº nódulos). × h donde: - CM es el valor integrado correspondiente al pico de etileno de la muestra. Cuentas de la muestra CP es el valor integrado correspondiente al pico de etileno patrón (con una concentración de etileno de 10 nmoles). Cuentas del patrón. En nuestro cromatógrafo equivale a 15000, por lo que no es preciso prepararla. 10 nmol es la concentración de etileno del patrón inyectado (a partir de carburo disuelto en agua). - Vvial es el volumen del vial utilizado, 40 ml. - VM es el volumen de la muestra inyectada en el cromatógrafo, 0.5 ml. - t es el tiempo de incubación expresado en horas (0.5 horas). Instrucciones para el encendido y apagado del cromatógrafo de gases Shimadzu: 2. ENCENDIDO DEL CROMATÓGRAFO: - Cerrar la puerta - Abrir la botella de gas portador (N2). La presión debe estar en 1.5 bares. - Ajustar las temperaturas del detector a 150ºC y de la columna a 50ºC. Poner el mando para temperatura de columna. - Encender POWER ON - Encender el INTEGRADOR - Comprobar que las temperaturas suben y las luces indicadoras se encienden. Dejar estabilizar 15 minutos. - Abrir las botellas de H2 (1 bar) y de aire (1 bar) y ajustar los flujos del cromatógrafo a 0.9 y 0.1 kg/cm2, respectivamente. - Encender la llama. Comprobar con un portaobjetos (verificar que se empaña). - Poner los flujos de H2 y aire a 0.5 y 0.5 kg/cm2, respectivamente. 3. INSTRUCCIONES PARA EL INTEGRADOR ACOPLADO AL CROMATÓGRAFO: - Encender apretando el interruptor situado en la parte de atrás del aparato. Poner fecha y hora. - Inspeccionar LEVEL y ajustarlo a 1000 ± 2. - Presionar PT EVAL. El valor aparece tras 50 segundos. Un valor de 12 es el óptimo. Conviene que esté por debajo de 100. - Presionar PLOT OFF para que no se imprima el cromatograma. - Marcar PH = 1 para obtener los datos de altura (amplitud) de los picos y no de áreas. - Inyectar la muestra y presionar INJ A. - después de aprox. 2 minutos, presionar de nuevo INJ A y aparecerán los datos como porcentaje en altura de los picos y el tiempo de retención de cada pico ( el etileno tiene un tiempo de retención de aprox. 0.65) NOTA: En el integrador hay tres tipos de caracteres (EDIT A): - Azules (funciones): Luz roja continua. Se accede pulsando ENTER, que además hace avanzar el papel. - Negras izquierda (números, signos): luz roja con parpadeo regular. Se accede pulsando SHIFT. - Negras derecha (letras): luz roja con parpadeo irregular. Se accede pulsando SHIFT. 4. APAGADO DEL CROMATÓGRAFO: - Seleccionar la temperatura de la columna a 20ºC, apretar RESET y abrir la puerta del cromatógrafo. - Apagar el INTEGRADOR. - Cerrar el paso del H2 y del aire. - Bajar la temperatura del INJ/DET a 0ºC. - Confirmar que las temperaturas (INJ/DET) han bajado por debajo de los 100ºC. - Apagar el POWER. - Pasados de 5 a 10 minutos, cerrar la bala de N2.
