La Fotosíntesis

La Fotosíntesis
Comencemos por definir a la fotosíntesis como "síntesis
(formación) con la ayuda de la luz". En realidad cuando
hablamos de fotosíntesis nos estamos refiriendo al proceso
que llevan a cabo las plantas y otros microorganismos y que
consiste, en términos generales, en la formación de materia
orgánica mediante la luz. Como la materia orgánica contiene
fundamentalmente
carbono,
hidrógeno
y
oxígeno,
la
fotosíntesis se refiere mayoritariamente a la incorporación
de estos elementos, que proceden del CO2 y el agua, en
materia orgánica. No debemos olvidar que la fotosíntesis
también se refiere a la reducción de compuestos inorgánicos
diferentes del CO2 como son el nitrato y el sulfato y su
incorporación, en aminoácidos.
Interacción de la luz con los organismos vivos.
Los organismos fotosintéticos sólo aprovechan una parte muy
pequeña de la energía que llega a la superficie terrestre,
del orden del 0,1 %, es decir, un fotón de cada 1000 que
caen sobre la superficie de la Tierra.
A pesar de que sólo una parte muy pequeña de la energía es
la que se absorbe por la planta, es tal el volumen de
materia orgánica que se produce en toda la Tierra mediante
la fotosíntesis que, si fuera caña de azúcar lo que se
formara, se produciría al año una pila de más de unos 3 km
de altura y de 10 km de lado. Aproximadamente la mitad de
la biomasa vegetal que se produce por fotosíntesis lo hace
en el ecosistema terrestre, mientras que la otra mitad lo
hacen los océanos.
En términos energéticos, la producción anual de biomasa es
sólo un orden de magnitud menor a las reservas de biomasa
en forma de bosques, y combustibles fósiles demostradas,
tales como el carbón, gas natural y petróleo, aunque
posiblemente exista otro orden de magnitud mayor de
reservas probables.
Desde otro punto de vista podemos decir que la energía
fijada por el reino vegetal es equivalente a unas diez
veces el consumo industrial, a nivel mundial y unas 200
veces superior a los requerimientos energéticos de la
humanidad en forma de alimentos. Debe tenerse en cuenta, no
obstante, que aunque el consumo individual de energía en
forma de alimentos por un hombre es del orden de 100 W, el
consumo de una bombilla eléctrica, el hombre del mundo
occidental necesita mucha más energía para satisfacer su
alto nivel de vida y confort, que es del orden de 10 kW.
Podemos, por tanto, considerar que la vida en nuestro
planeta se mantiene porque nos llega una energía de origen
nuclear. De manera que, a pesar de la mala fama que la
energía nuclear tiene en nuestra sociedad, nosotros
dependemos y debemos nuestra existencia a ella. Bien es
verdad que tenemos la salvaguarda de que tenemos a la
central nuclear a una buena distancia de nosotros, unos 150
millones de Km de distancia y, además, en un territorio
donde nadie ha protestado.
Historia del conocimiento de la fotosíntesis
Uno de los primeros pensamientos recogidos acerca de la
función de hojas en las plantas se debe a Aristóteles que
dijo que éstas tienen como misión dar sombra y proteger a
las partes tiernas y débiles de la planta, como son los
brotes. Esa era una observación sagaz pero errónea aunque
compresible por nosotros si pensamos fue elaborada en un
caluroso día de verano en Grecia. No podía imaginar
Aristóteles que las hojas eran una activa factoría en la
que se produce un activo intercambio de gases y fabricación
de material para la planta.
Si nos referimos a la historia de la fotosíntesis podemos
decir que empieza poco después de que se descubriera la
composición del aire. En 1648, es decir, cuando en España
andábamos luchando con los turcos, aproximadamente cuando
vivía el tatarabuelo de nuestro tatarabuelo. En esa época
el holandés van Helmont cultivó una planta en un recipiente
y comprobó que la tierra perdía mucho menos peso que lo que
se incorporaba en la planta que, en caso de ser un árbol,
era muy grande. Pensó que el aumento de peso se debía al
agua que había que añadirle a la tierra durante todo el
crecimiento de la planta y dedujo, por lo tanto, que la
masa de la planta procedía solamente del agua.
Fue casi un siglo más tarde cuando el clérigo inglés
Stephan Hales reconoció que una parte del aire contribuía a
alimentar a la planta diciendo que el Creador había puesto
al aire para que respiraran los animales así como también
las plantas. Se rompía así con la tesis de Aristóteles que
proponía que las plantas se alimentaban exclusivamente del
humus que contiene la tierra. En realidad los tres tenían
razón porque la planta asimila agua, humus y una parte del
aire. Hales también intuyó que la luz tenía un papel
importante en el proceso, aunque no llegó a probarlo.
Fue el pastor inglés inconformista y simpatizante con la
Revolución francesa Priestley, al que por este motivo, le
saquearon su casa emigrando a Pensilvania, quien demostrará
que en el aire había un elemento, que llamaría aire
deflogisticado
y
posteriormente
Lavoisier
oxígeno.
Priestley pudo demostrar que una planta restauraba el aire
empobrecido por arder una vela en él. De esta manera se
pudo explicar racionalmente por qué el aire de nuestro
planeta se mantiene puro a pesar de que los hombres y
animales lo consuman constantemente mediante la combustión
y no se haga irrespirable. De acuerdo con sus observaciones
ya dijo que ello hace que cualquier planta, por minúscula y
olvidada que se encuentre en un rincón de nuestro planeta
contribuye a limpiar y purificar nuestra atmósfera.
Un médico de la corte de la emperatriz de Austria María
Teresa, el holandés Jan Higenhousz, impresionado por los
descubrimientos de Priestley, al que había oído en una
conferencia que se dio en Londres, alquiló en la primera
ocasión que tuvo, que fue unos seis años después, una
casita en Londres para hacer experimentos sobre el efecto
de la luz en la acción limpiadora del aire que llevan a
cabo las plantas. En un libro publicado en 1796 y titulado
“Experimentos con vegetales, descubrimiento del poder
purificador del aire en la luz y de su envenenamiento en la
oscuridad”. Se decía que las plantas, a través de las hojas
y tallos verdes, purifican el aire tanto más cuanto más
expuestas están a la luz y que en la oscuridad se
desprenden gases muy nocivos.
Por ese mismo tiempo el pastor suizo Jean Senebier publicó
en Ginebra un tratado sobre la influencia de la luz solar
para modificar los seres de tres reinos, sobre todo del
vegetal. Hizo esencialmente la misma observación que
Hignehousz, pero añadió que la actividad de restauración
del aire por las plantas dependía de la presencia de "aire
fijado" que es como se denominaba entonces al dióxido de
carbono.
Quedaba por descubrir el otro reactivo implicado en la
fotosíntesis, que había sido descrito cualitativamente por
van Helmont, pero no medido: el agua. Nicolas de Saussure,
también de Ginebra, midió cuidadosamente el peso de la
planta y descubrió que el peso de ésta, junto con el del
oxígeno desprendido, pesaban mucho más que el "aire fijado"
por la planta y que la diferencia era el agua que se añadía
a la tierra. Propuso la siguiente ecuación:
luz
aire fijado
+ agua
--Æ aire vital
+ materia orgánica
planta verde
En esta ecuación el aire fijado y la materia orgánica se
deben a Senebier
la inclusión del agua a Saussure
La implicación de luz y la planta verde, que se refiere, en
realidad, a los cloroplastos, a Ingenhousz
y el aire vital, el oxígeno, a Priestley.
Queda un nombre que añadir al nacimiento de la fotosíntesis
y es el del médico alemán Julius Robert Mayer que propuso
que la energía luminosa se transforma en energía química.
Las plantas no sólo son creadoras de materia orgánica sino
que son también los almacenadores de la energía que pasa a
ser energía química. Se podría entonces escribir la
ecuación
CO2 + H2O + luz --Æ O2 + materia orgánica + energía química
Él llamó a la energía "poder" y a la energía química
"diferencia química", pero ahora se puede considerar como
correcto el planteamiento de la fotosíntesis.
Estos son los padres de la fotosíntesis porque ellos
plantearon todos los elementos que intervienen en dicho
proceso. Son un ejemplo de interacción entre los pueblos,
puesto que hay un holandés, un francés, un inglés, un suizo
y un alemán. No se puede decir, sin embargo, que hubiera
armonía entre ellos, ya que el carácter y la situación
social de alguno de ellos, como Hingenhousz, un médico
imperial, era muy diferente de la de un discreto pastor
protestante provinciano y paleto, como Senebier. Ha pasado
mucho tiempo y la situación, aunque sigue igual, algo ha
mejorado.
Una vez que se demostró que el dióxido de carbono asimilado
por las plantas se transformaba en almidón y que ello
ocurría en los cuerpos cloróficos o cloroplastos, ya estaba
formulada la fotosíntesis en sus términos actuales, de
acuerdo con la ecuación:
CO2
+
H 2O
-----Æ
(CH2O)n
+
O2
No obstante, se creyó erróneamente que el oxígeno que se
desprendía procedía del CO2 y no del agua, como ocurre
realmente.
De
hecho
Otto
Warburg,
uno
de
los
mayores
científicos en el estudio de la bioenergética de todos los
tiempos defendió esta tesis hasta su muerte, que fue en
1970. Debido a su gran prestigio científico y a su notable
arrogancia sus opiniones equivocadas, como consecuencia, en
gran medida a la ignorancia que profesó respecto del
trabajo de otros, hizo que se retrasara considerablemente
el avance de este campo científico.
Warburg había introducido el alga unicelular Chlorella en
los estudios de Fisiología Vegetal debido a que es muy
fácil de cultivar y a que se pueden producir grandes
cantidades de material fotosintético en relativamente poco
tiempo.
A
Warburg
se
deben,
además,
las
técnicas
manométricas para la medida de procesos fisiológicos. El
aparato de Warburg ha estado presente en todos los
laboratorios de bioquímica hasta hace unos 10 o 15 años. En
ellos se medían los cambios de volumen de los gases que se
generaban en reacciones de respiración o de fotosíntesis ya
que en dichos aparatos se podían iluminar las vasijas. Hoy
día las medidas de oxígeno se hacen polarográficamente
mediante un sencillo aparato que se llama el electrodo de
oxígeno y que no necesita la limpieza de las vasijas y su
cuidadoso
calibrado,
que
exigía
mucho
tiempo
de
manipulación.
Warburg midió el rendimiento cuántico de la fotosíntesis en
Chlorella y dijo que la reducción de 1 mol de CO2 requería
4 quanta de luz. Es decir, que la rotura de 2 moléculas de
agua y la liberación de 4 electrones del H que eran
recuperados como poder reductor, requerían 4 fotones.
Teniendo en cuenta la energía de los quanta a 680 nm y la
energía química que se aprovechaba en el CO2 reducido
resultaba un rendimiento del 70 %. Eso significaría que la
fotosíntesis era un proceso que tiene lugar con un
rendimiento mucho mayor que las mayoría de las máquinas
conocidas así como de otros procesos biológicos. Eso
levantó mucha polémica y muchos se lanzaron a comprobar sus
datos, pero él los ignoró. Proponía que en un mundo
perfecto la fotosíntesis debe ser perfecta y que podría
llegar a un rendimiento cuántico de 3, es decir, cercano al
100 %. Ignoró a su vez a los demás científicos que, usando
las técnicas manométricas que él había desarrollado,
obtenían rendimientos menores. Hoy día se acepta que el
rendimiento cuántico de la fotosíntesis es de 8 fotones por
mol de CO2 fijado estando el rendimiento próximo al 30 %.
Ello se debe, como se verá más adelante, a que por cada
electrón, o átomo de hidrógeno que se promueve son
necesarios dos fotones de luz.
También se debe a Warburg el empleo de ciertos colorantes,
como las quinonas, que eran utilizados como aceptores de
electrones en reacciones de óxido-reducción y que han
facilitado la medida de tales reacciones debido al cambio
de color que sufre dichos compuestos al cambiar de estado
redox.
Reacciones básicas de la Fotosíntesis.
La fotosíntesis puede formularse, en sus términos actuales
como la reacción mediante la cual el dióxido de carbono es
asimilado por las plantas transformándolo en almidón y
desprendiendo oxígeno molecular. Dicha reacción tiene lugar
en las plantas en los orgánulos cuerpos cloróficos o
cloroplastos, de acuerdo con la ecuación:
CO2
+
H 2O
-----Æ
(CH2O)n
+
O2
Dicha reacción implica que se asimila el anhídrido
carbónico, que procede del aire, además de agua y, todo
ello en presencia de la luz, que es un elemento
indispensable para la fotosíntesis.
Otros
organismos
llevan
a
cabo
el
proceso
de
la
fotosíntesis, aunque no esté formulada exactamente como se
ha escrito más arriba. Algunos organismos procariotas, como
son las bacterias fotosintéticas, no utilizan el agua como
donador de electrones y, por tanto, no desprenden oxígeno.
Otros procariotas, como son las cianobacterias, llevan a
cabo una fotosíntesis análoga a la de las plantas, es decir
oxigénica.
Se puede dividir la fotosíntesis en dos tipos de procesos:
los que implican el aprovechamiento de la luz y su
transformación en energía química, lo que se denomina la
fase luminosa de la fotosíntesis, y aquella mediante la
cual el anhídrido carbónico se fija mediante el consumo de
ATP y NADPH, un proceso típicamente bioquímico, y que se
denomina fase oscura, no porque requiera la oscuridad, sino
porque no se necesita la luz.
No cabe duda que la medida del proceso completo de la
fotosíntesis resulta complejo ya que son muchos los
requisitos exigidos. Por ello resulta esencial, para el
estudio de dicho proceso, disponer de un ensayo más
sencillo. Un ensayo que permita medir la fase luminosa
independientemente de la oscura.
Un paso transcendental en el desarrollo de la fotosíntesis
fue la formulación que hizo van Niel en 1929 que
consideraba que se trataba de un proceso redox en el que se
produce la reducción de CO2 y la oxidación de H2O. Esta
propuesta permite escribir la ecuación de la fotosíntesis
en los términos reales, tal como se acepta hoy día, es
decir, que consiste en la reducción del CO2, en realidad
también del nitrato y nitrito, además del sulfato, mediante
donadores de hidrógeno o de electrones:
CO2
+
2 H 2O
+
h•
------
[CH2O]
+
O2
+
H 2O
Hay diferencias, como veremos, en lo que se refiere a la
naturaleza de los donadores de electrones, pues, si bien en
las plantas y cianobacterias se utiliza el agua, en las
bacterias fotosintéticas se utilizan otros compuestos tales
como el SH2 o un compuesto orgánico:
CO2
+
2 H 2S
+
h• -----
[CH2O]n
o bien:
CO2
+
2 H 2A
+
h• -----
[CH2O]n
+
2 S
+
H 2O
+ 2 A
+
H 2O
Hasta este momento, y son sólo unos cincuenta años atrás,
para estudiar la fotosíntesis había que usar células
enteras. Si se intentaba fraccionarlas, se perdía su
capacidad
para
realizar
reacciones
fotoquímicas.
La
elección era sencilla: o células enteras con actividad
fotosintética o fracciones muertas. Esto cambió en los años
entre 1937 y 39 cuando Robin Hill recogió una antigua
observación de que las hojas secas y hechas polvo
desprendían oxígeno al exponerlas a la luz. Este efecto
duraba poco y podía ser prolongado si se añadía a las hojas
sales de hierro tales como el oxalato férrico. En realidad
lo que estaba ocurriendo es que la sal de hierro se estaba
reduciendo en la luz y se desprendía oxígeno. En lugar del
oxalato de hierro se empezaron a usar las quinonas que
había descrito Warburg o, el mejor de todos y que desde
entonces se usa en todos los estudios de fotosíntesis como
el reactivo de Hill por excelencia, el ferricianuro, un
compuesto con un potencial redox muy oxidante, estable,
barato muy soluble y con propiedades cinéticas muy
apropiadas para reaccionar con los centros fotosintéticos.
Esta observación es semejante a la que efectuaron los
hermanos Buchner cuando rompieron las células de levaduras
y observaron que el extracto producía la fermentación de la
glucosa que se consumía en el proceso al mismo tiempo que
se desprendía CO2.
Mediante la reacción de Hill se podían separar los
distintos procesos de la fotosíntesis, al mismo tiempo que
se podía iniciar una búsqueda del material más adecuado
para llevar a cabo el estudio de dichas reacciones. Se
consiguió aislar los cloroplastos del resto de la célula y
demostrar que éstos siguen produciendo la reacción de Hill.
Se escogió la espinaca porque era fácilmente asequible y
porque presenta muchas ventajas adicionales, como es que se
rompen con facilidad así como que no liberan fenoles y
polifenoles que inactivan a los enzimas que se obtienen al
romper las células. En este caso se podían estudiar las
reacciones luminosas aisladas de las otras reacciones
enzimáticas acopladas a ellas. También se podía evaluar y
cuantificar el proceso puesto que se podían llevar a cabo
estudios cinéticos. En realidad lo que se produce es, ni
más ni menos, que la foto-oxidación del agua. Más adelante
se comprobó que también se podía sustituir el donador de
electrones, que en el caso de los cloroplatos es el agua,
por otros reactivos químicos, tales como el DCPIP y el
ascorbato. Se puede así medir flujo de electrones desde el
ascorbato hasta el ferricianuro. Por otra parte, esta
reacción permitió resolver el problema de si lo que se
rompe para dar oxígeno era el CO2 o el agua. Claramente se
comprueba
que,
en
ausencia
de
CO2,
hay
todavía
desprendimiento de oxígeno y que, por lo tanto, procede del
agua.
Se propone un esquema para la fotosíntesis como un proceso
que tiene lugar a través de reacciones fotoquímicas que
llevan consigo procesos de óxido-reducción, junto con otros
procesos enzimáticos mediante los cuales se produce la
reducción del anhídrido carbónico y la oxidación del agua.
Es un paso adelante aunque, como veremos dentro de muy
poco, está equivocado.
Un experimento muy indicativo de lo que ocurre en la
fotosíntesis y que fue realizado y analizado con detalle
proporcionando mucha información es el espectro de acción
de la fotosíntesis. Es sabido que la fotosíntesis requiere
luz, pero, ¿de qué longitud de onda? es decir, ¿cuál es la
actividad fotosintética de una preparación iluminada con
una luz monocromática de una determinada longitud de onda?
Emerson describió que al iluminar las preparaciones con luz
del orden de 680 nm para arriba se producía una bajada en
la actividad de la fotosíntesis. Esa bajada se compensaba
al iluminar simultáneamente con luz de baja longitud de
onda y de alta longitud de onda. El efecto era superior a
la suma de las actividades a las dos longitudes de onda.
Ello llevó directamente a proponer que en la fotosíntesis
participan dos fotosistemas que se excitan a dos longitudes
de onda diferentes y que actúan en paralelo.
Por entonces se describió la espectroscopia diferencial
como una técnica muy poderosa. La razón es que en
fotosíntesis se trabaja con un material coloreado que
cambia su espectro al actuar, es decir, al iluminarlo. Por
ello, si se dispone de una técnica que permita observar los
cambios a una determinada longitud de onda mientras que se
activa al iluminarlo con otra luz diferente y más intensa,
se pueden analizar los componentes de la reacción. En
realidad se esperaba detectar cambios en las clorofilas,
cosa
que
no
ocurrió,
pero
permitió
descubrir
los
citocromos, componentes fundamentales de los tejidos
fotosintéticos.
En la época de los años 60 Hill y Bendall propusieron el
expresivo esquema en Z de la fotosíntesis que tanto éxito
ha tenido y en el que se aceptaba la existencia de dos
fotosistemas además de que justifica la energética para la
formación de ATP como consecuencia de la liberación de
energía en reacciones de transferencia de electrones entre
los componentes de una cadena de transporte. De los dos
citocromos presentes en las células de plantas el b6 podía
ser utilizado en su forma oxidada como aceptor de
electrones de lo que ahora llamamos el fotosistema II en la
luz; mientras tanto, el citocromo f, en su forma reducida
podía ser utilizado como donador de electrones por el que
hoy se conoce como fotosistema I. El esquema en Z es, pues
la consecuencia de unir las dos reacciones correspondientes
a los dos fotosistemas.
No obstante, en estas primeras etapas del estudio de la
reacción de Hill parecía que los cloroplastos eran
incapaces de llevar a cabo la fotosíntesis real. Parecía
que sólo podían reducir compuestos relativamente oxidantes,
en concreto de potencial mayor de 0,00 V. No obstante se
comprobó después que, si la reacción se lleva a cabo con
cuidado para que se eviten reacciones en la dirección
opuesta, se pueden reducir compuestos muy reductores. En
concreto se puede reducir el NADP+ cuyo potencial es - 0,34
V. En este caso deben estar presentes algunos componentes
adicionales de la preparación de cloroplastos, tales como
una proteína de hierro que se denomina ferredoxina así como
una flavoproteína denominada ferredoxina-NADP+ reductasa y
que en un primer momento se llamó TNPN reductasa.
Curiosamente estos hechos fueron descubiertos por Vishniac
y Ochoa en 1951 en Nueva York y luego por Anthony San
Pietro en la John Hopkins y Daniel Arnon en Berkeley. Se
acepta
por
fin,
que
la
fotosíntesis
consiste
en
la
reducción del NADP+ a NADPH.
En muchas células en las que se lleva a cabo síntesis de
compuestos de carbono, como es el caso de las células
fotosintéticas, se sabía que eran necesarias tanto el NADPH
como el ATP, un compuesto bien conocido como moneda
energética. Ya hemos visto que se puede producir NADPH como
consecuencia
del
transporte
de
electrones
en
la
fotosíntesis,
pero
¿qué
ocurre
con
el
ATP?
Otros
investigadores habían indicado que los cloroplastos no
producen ATP quedando dicha función restringida a las
mitocondrias. Sin embargo los tejidos fotosintéticamente
más activos tenían pocas mitocondrias y debían producir
mucho ATP para llevar a cabo su acción sintetizadora. Para
investigarlo Daniel Arnon decide trabajar con cloroplastos
aislados por el procedimiento que todavía se usa y
comprueba que se produce incorporación de CO2 y que los
productos formados son los productos conocidos de la
fotosíntesis. Esto quiere decir que los cloroplastos llevan
también a cabo las reacciones enzimáticas que consumen ATP
y conducen a fijar el CO2. Entonces le añadieron a
preparaciones de cloroplastos los precursores del ATP, el
ADP y P y, en la luz y en presencia de CO2 tuvieron
síntesis de carbohidratos. Se probó que había síntesis de
ATP en lo que se llamó fosforilación fotosintética o
fotofosforilación. En este proceso no había síntesis de
NADPH. Más adelante se probó que también podía haber
síntesis de NADPH y de ATP en el mismo proceso, en cuyo
caso debía haber ferredoxina y el enzima que entonces se
llamó TPN reductasa, en lo que se llamó fotofosforilación
no cíclica para distinguirla de la anterior que se denominó
fotofosforilación cíclica.
Quedaba por debatir, no obstante, que el rendimiento de la
reacción en las condiciones de laboratorio era siempre una
fracción pequeña respecto de la que tiene lugar en las
células de Chlorella intactas y responder a la pregunta de
si estaba faltando algo en este sistema.
Más tarde Calvin utilizó el isótopo radiactivo del carbono,
el
14C
para marcar el CO2 y poder así establecer la ruta de
incorporación de este compuesto en material orgánico,
aunque más tarde se comprobó que hay plantas, las C4, que
siguen otra ruta. No obstante, la diferencia radica sólo en
las primeras fases porque, en realidad las plantas C4 luego
se comportan como las C3, como se sabe bien.
Entramos ahora en un período, que se podría situar
alrededor del 70, que se puede denominar como el del
conocimiento a nivel molecular de la fotosíntesis. Se va
desvelando la naturaleza de los componentes de los aparatos
fotosintéticos. Se han aislado los componentes de los
cloroplastos y de las bacterias fotosintéticas y se han
manipulado las preparaciones de membranas fotosintéticas
para hacerlas cada vez más simples, con menos componentes,
de manera que den respuestas más concretas a preguntas de
cómo funcionan. Se podría considerar que es la época de la
espectroscopia rápida. Se quieren conocer los mecanismos de
las reacciones luminosas. Es decir, los sucesos que ocurren
una vez que el pigmento que lleva a cabo el proceso
fotoquímico es excitado por la luz. Eso significa conocer
la naturaleza de lo que se llamó el aceptor primario de
electrones. Es decir, cuando se excita la clorofila para
dar su electrón a quién se lo da de los muchos componentes
que hay en las membranas con las que se trabaja. De aquí la
importancia de la composición de la muestra. Se emplean
detergentes que actúan selectivamente sobre las membranas
eliminando unos componentes u otros y afectando a la
función de la membrana. Pero se quiere saber cuál es el
aceptor primario de electrones de cada uno de los
fotosistemas
que
hay
en
los
cloroplastos
y
las
cianobacterias. Para ello se desarrollan métodos que
exciten a la clorofila de manera muy rápida e intensa,
aparatos de láser, así como sistemas que permitan medir la
transferencia de electrones que ha tenido lugar. Para ello
se utilizan técnicas espectrofotométricas, que miden
cambios de color de pigmentos o proteínas coloreadas que
hay en las membranas, o bien de EPR, que permiten medir
aparición de especies paramagnéticas mediante una reacción
redox
que
afecta
a
un
componente
de
la
membrana
fotosintética. En otros apartados veremos la aplicación de
ambas técnicas al estudio de la fotosíntesis. En cualquier
caso, ello llevó consigo el descubrimiento de los
diferentes componentes que intervienen en la fotosíntesis,
tales como los pigmentos P680 y P700, el P430 así como de
los citocromos y centros sulfoférricos que participan en
estas reacciones. Se planteaba, no obstante, un problema
que hizo que se llegara a ralentizar el desarrollo en este
campo debido a que siempre quedaba la duda de si el cambio
que se observaba después de la iluminación de la muestra
correspondía a la reducción del aceptor primario o de otro
compuesto de la cadena que se encontraba después, es decir,
que el instrumento no era suficientemente rápido para
captar el primero de los componentes de la cadena. Ello
llevó a desarrollar técnicas más y más rápidas. Del
milisegundo se pasó al microsegundo, de ahí al picosegundo
y ahora estoamos en el fentosegundo y ello a base de
resolver problemas cada vez más complejos. Todos eso cambió
de aspecto cuando en 1983 Deisenhoffer, Huber y Michel
cristalizaron
la
molécula
del
centro
fotosintético
de
Rhodopseudomonas viridis una bacteria púrpura cuyo centro
es semejante al PS II de plantas y determinaron su
estructura. EN los años siguientes se ha ido determinado la
estructura de los centros de reacción PS I y PS II a
niveles de resolución suficiente para poder identificar a
todos y cada uno de los pigmentos que intervienen en el
proceso de fotosíntesis.
La información obtenida a partir de las estructuras de los
complejos ha servido para confirmar los datos obtenidos a
partir de las técnicas espectroscópicas y que se refieren a
la organización de los centros fotosintéticos así como de
los pigmentos que intervienen. Es de desatacar que
prácticamente todas la información conocida anteriormente
se ha visto confirmada por los datos de estructura.
No es el final del camino. No se sabe cómo se lleva a cabo
la fotosíntesis, sino que ahora se pueden interpretar los
resultados sobre una base real, de acuerdo a la naturaleza
de los compuestos presentes en las estructuras de los
centros fotosintéticos.
BIBLIOGRAFIA
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The vital force
F.M. Harold
W.H. Freeman, New York, 1986
Composición
y
organización
de
las
membranas
fotosintéticas
Entre los organismos que llevan a cabo fotosíntesis están
las bacterias fotosintéticas, los organismos fotosintéticos
más primitivos que tienen un aparato fotosintético más
simple y que, como característica interesante, utilizan
otros materiales diferentes al agua como donadores de
electrones.
La fotosíntesis se realiza mediante proteínas y otros
componentes que se encuentran en las membranas. Dichas
membranas se denominan tilacoides y se extienden hacia el
interior de las células procariotas donde se hace la
fotosíntesis. Las células fotosintéticas eucariotas han
adquirido un orgánulo especializado para esta función: el
cloroplasto
que,
en
realidad,
es
una
cianobacteria
englobada dentro de la propia célula habiéndose logrado una
simbiosis muy provechosa para ambos entes vivos. De ese
origen habla el hecho de que los cloroplastos mantienen
todavía una dotación génica en forma de DNA que han
mantenido, reducido en parte, a través de todos los
millones de años que ha durado dicha simbiosis. Parte de la
dotación génica del cloroplasto se ha ido perdiendo a lo
largo de los años, por lo que muchas de las proteínas de
los cloroplastos deben incorporarse desde la propia célula
porque han sido sintetizadas con la información génica del
núcleo. Los cloroplastos, que son orgánulos de gran tamaño
(unas 5 µm de diámetro), poseen una membrana externa
fácilmente
permeable
a
los
diferentes
solutos
que
intervienen en la fotosíntesis, un espacio intermembrana y
una membrana interna mucho más selectiva que la externa que
se extiende hacia el interior del cloroplasto formando una
compleja red de membrana que se denominan tilacoides. La
función principal de las membranas de la envoltura del
cloroplasto es controlar el flujo de metabolitos, lípidos y
proteínas dentro y fuera del CP. Además, en ellas están
localizados los sistemas responsables de la síntesis,
procesamiento y ensamblaje de los lípidos, pigmentos y
proteínas de la membrana.
La membrana interna sirve de
barrera al paso de moléculas grandes tales como las
proteínas del citoplasma al espacio entre membranas.
Los tilacoides pueden formar unos saquitos, unos espacios
cerrados que se apilan dando lugar a lo que se denominan
los grana. El espacio del interior de los tilacoides es el
lumen.
Los
tilacoides
que
no
están
formando
esas
estructuras sino que están uniendo unos grana con otros son
lo que se denomina lamelas. Por último, el espacio de la
célula o el cloroplasto que está relleno por una solución
acuosa en donde se encuentran los enzimas que realizan la
fase oscura de la fotosíntesis se llama estroma y es el
equivalente de la matriz mitocondrial. Los principales
componentes del estroma son:
- muchas
(300) copias de DNA, ribosomas 70S, mRNA y
otros
elementos
necesarios
para
la
síntesis
de
proteínas;
- enzimas implicadas en la reducción del carbono y
nitrógeno
- enzimas implicadas en la síntesis de los lípidos,
porfirinas,
terpenoides,
quinonas
y
compuestos
aromáticos.
- gránulos de almidón
En organismos más simples la fotosíntesis tiene lugar en
estructuras membranosas que no forman orgánulos cerrados,
sino que están integrados en la propia célula. Tal es el
caso de las cianobacterias en donde las membranas del
tilacoide están repartidas en la célula.
En el caso de bacterias fotosintéticas la fotosíntesis lo
lleva a cabo la membrana que rodea a la célula. Las
membranas de las bacterias fotosintéticas se pueden romper
mediante sonicación liberando el contenido interior y
volviéndose a cerrar formándose lo que se conoce como
cromatóforos que son elementos muy útiles para el estudio
de la fotosíntesis.
Constituyentes de las membranas del tilacoide
Como todas las membranas celulares están compuestas por
lípidos proteínas y pigmentos. Los lípidos de la membrana
fotosíntesis difieren mucho de los del resto de la planta
apoyando el origen procariótico de estos orgánulos.
Los lípidos son de varias clases, aunque hay muy pocos
fosfolípidos (5-10 % de fosfatidil-colina y fosfatidilglicerol), la mayoría son mono y di-glactosil-diacil
gliceroles sin carga (80 % repartidos en una 50 % de MGDG y
25
%
de
DGDG)
y
el
resto
son
los
sulfolípidos
sulfoquinovosil-diacil gliceroles (5 %) y diglicil-trimetil
homoserina DGTS. Las cadenas laterales de los lípidos
contienen ácidos grasos muy insaturados como el linoleíco.
Las proteínas de la membrana son casi en su totalidad los
componentes de los centros de reacción fotosintéticos y los
componentes de las cadenas de transporte fotosintético. Hay
cinco complejos proteicos que atraviesan la membrana del
tilacoide y que intervienen en la fotosíntesis. Hay tres
complejos que contienen clorofila: el PS I (que tiene
asociado un complejo antena que capta la luz, el LHC I), el
PS II, que lleva también asociadas algunas moléculas de
clorofila en lo que se conoce como la antena interna y el
complejo LHC II, que está separado del PS II, aunque
funciona generalmente acoplado con él. Los otros dos
complejos no llevan clorofila y son el complejo citocromo
b6f y la ATP sintasa.
Hay un estudio interesante referente al papel de un lípido
en
una
membrana
en
fotosíntesis.
El
funcionamiento
eficiente del LHC II requiere la formación de trímeros y
ello depende de la presencia de un fosfatidil-glicerol que
contiene un ácido graso de 16 átomos de carbono con una
insaturación en la posición 11. La disminución en el
contenido de este ácido graso provoca la disociación de los
trímeros y la menor capacidad de captar luz. Esta facultad
la explotan algunas plantas de arroz que se aclimatan al
frío disminuyendo la síntesis de este ácido graso y
evitando así el daño producido por la luz en estas
condiciones de bajo rendimiento fotosintético.
Los pigmentos fotosintéticos: absorción de la luz
En las membranas es donde se realiza la fotosíntesis. Por
ello es necesario que existan en ese espacio pigmentos que
recojan la luz, la primera fase para que se pueda llevar a
cabo su transformación en energía química. Un pigmento es
cualquier sustancia capaz de absorber luz visible. El hecho
de que las plantas utilicen la luz visible se debe no a que
es la que tiene una mayor cantidad de energía, que
corresponde la UV, sino que es aquella de la que mayor
cantidad cae sobre la superficie de la Tierra. Es decir,
aquella que produce una gran intensidad aunque de poca
energía. Por otra parte, el hecho de que se utilice una
energía de poca intensidad produce un menor daño en las
estructuras biológicas que lo soportan. La luz activa en
la fotosíntesis es la comprendida entre longitudes de onda
entre 400 y 700 nm.
Hay dos tipos de pigmentos en cuanto a su función, no a su
composición: antena y centros de reacción que se refiere a
que sean los encargados simplemente de captar la luz o los
responsables de llevar a cabo la reacción fotoquímica.
Dichos pigmentos son fundamentalmente las clorofilas, de
las cuales hay dos especies que difieren en la naturaleza
de los sustituyentes del anillo de la porfirina, la a y la
b.
La
clorofila,
como
pigmento
de
las
plantas
es
la
sustancia más importante del mundo. Gracias a ella se
produce la entrada de los alimentos en la cadena de
alimentación de todos los animales, incluyendo al hombre.
Los pigmentos absorben la luz y se excitan. Luego pueden
perder esa energía de tres maneras: calor, emisión de
fluorescencia y fotoquímica.
Existen también carotenos que tienen un espectro de
absorción complementario al de las clorofilas. En las
cianobacterias
y
algas
rojas
existen
también
otros
pigmentos accesorios que están constituidos por una serie
de pirroles lineales, son la ficobilinas, que poseen un
color
azulado-violeta.
Las
ficobilinas
se
unen
covalentemente
a
proteínas
que
se
denominan
ficobiliproteínas, muy abundantes y llamativas por su
intenso color durante la preparación de proteínas de
cianobacterias. El conjunto de pigmentos que incluye a las
clorofilas, los carotenos y las ficobilinas da lugar a un
espectro de absorción que es prácticamente el mismo del
espectro solar que se recibe sobre la superficie de la
tierra.
Centros de reacción fotosintéticos
Los centros de reacción de la membranas púrpura son las
mejor conocidas y, de hecho son los complejos de membranas
biológicos mejor caracterizados. H. Michel en 1982 obtuvo
los primeros cristales tridimensionales de los CR de la
bacteria púrpura no sulfurosa Rhodopseudomonas viridis, lo
que permitió determinar la estructura de este complejo, que
fue el primero en ser resuelto a escala atómica. y que les
valió a Deisenhofer, Michel y Huber el premio Nóbel de
Química el año 1988.
La estructura está compuesta por cuatro polipéptidos y
catorce (14) cofactores. Las proteínas son la L, M, H y C.
Los
cofactores
son:
4
citocromos
c,
cuatro
bacterioclorofilas b, 2 feofitinas, 1 hierro no hemínico,
un carotenoide y dos quinonas.
Los cuatro hemos están covalentemente unidos a la subunidad
C, todos los demás están unidos no covalentemente a las
subunidades L y M.
La subunidad C es un lipoproteína que está anclada a la
membrana por un diacil-glicerol que está covalentemente
unido a una cisteína del extremo amino terminal. El
complejo tiene 11 hélices transmembrana, 5 en la L, 5 en la
M y una en la H. Una gran parte de las Subunidades L y M
están asociadas por una simetría binaria con un eje
perpendicular al plano de la membrana.
Años más tarde se determinó la estructura del CR de
Rhodobacter spheroides. Las dos estructuras son muy
semejantes excepto que la Subunidad C está ausente en
spheroides.
No
se
tienen
cristales
de
Rhodobacter
capsulatus, de la que se tiene mucha información genética y
bioquímica. Lo mismo ocurre con el PS II de plantas o
cianobacterias. No obstante, utilizando la información
obtenida de las bacterias se puede extrapolar al caso del
PS II y se pueden construir modelos sobre los que trabajar
acerca de los mecanismos.
Función de los pigmentos
Los
pigmentos
forman
dos
ramas,
cada
una
con
2
bacterioclorofilas, una bacteriofeofitina y una quinona.
Cada una de la ramas va de lado a lado de la membrana
comenzando por el 'par especial' que son dos moléculas de
clorofila que están formando un par y que se encuentran en
el lado del periplasma (la parte externa de la célula). A
continuación
está
la
bacterioclofila
accesoria,
una
bacteriofeofitina y una quinona. Solamente la rama asociada
a la Subunidad L se utiliza para el transporte de
electrones. En esta rama se encuentra la quinona QA,
mientras que la QB está en la rama inactiva. Entre las dos
quinonas se encuentra un hierro no hemínico.
La luz es absorbida por los pigmentos de la LH antena o
bien por el propio par especial. En el primer caso se
transfiere la energía al par especial (D) en donde hay una
molécula DL asociada a la Subunidad L y la otra DM asociada
a la Subunidad M. Ambas están relacionadas por un eje de
simetría. La excitación de las moléculas D se traduce en la
transferencia de un electrón a la clorofila accesoria B.
Este fenómeno es lo que se conoce como separación de carga
y está estabilizada por la rápida transferencia del
electrón a la feofitina ΦA que se encuentra en la rama
activa. El siguiente paso es la transferencia de un
electrón perpendicular al plano de la membrana al aceptor
primario de electrones, la quinona QA, que está unida a la
Subunidad M. A continuación se produce la transferencia de
un electrón paralelo al plano de la membrana hasta la
quinona QB, que está en la Subunidad L.
Mientras que QA sólo puede aceptar un electrón, QB puede
acomodar dos que, después de captar dos protones da lugar a
un quinol que migra para ser reoxidado por otro complejo de
membrana que será estudiado en otro momento y que es el
citocromo bc1, lo que lleva consigo la liberación de
protones en el espacio periplásmico. La creación del
gradiente de membrana es lo que permite la síntesis de ATP
por la ATPasa integrada en la membrana. Los electrones que
han llegado al complejo cit bc1 vuelven al CR a través de
un citocromo pequeño y muy móvil que es el cit c2, que
interacciona con la Subunidad C y que permite que se vuelva
a reducir el par especial que había sido oxidado en el
proceso fotoquímico.
El papel del carotenoide presente en este CR es proteger al
CR de la fotooxidación mediante el quenching del estado de
triplete del donador primario de electrones, el par
especial. Su proximidad a BB sugiere que la transferencia
de energía desde el estado triplete del donador de
electrones tiene lugar vía BB.
El sitio QB está profundamente embebido en el complejo del
centro de reacción. A pesar de ello deben llegar dos
protones cuando se reduce para dar un quinol, por lo que le
deben llegar los protones desde el citoplasma a través de
la proteína. Es probable que implique residuos ionizables
así como moléculas de agua. Los protones se moverían a lo
largo de una cadena de donadores de protones y aceptores
conectados por puentes de hidrógeno. De hecho, en las
estructuras descritas se pueden observar cadenas de
moléculas de agua que se encuentran a distancias de puentes
de hidrógeno unas de otras.
Las preparaciones de PS II.
El aislamiento de membranas de PS II que fueran capaces de
desprender oxígeno fue el inicio de una corriente de
trabajos que han ayudado a aclarar su estructura y el
mecanismo. Las actividades del PS II debían estudiarse
hasta
entonces
con
preparaciones
muy
inestables
de
tilacoides con una relación señal/ruido muy baja. Estas
preparaciones están limpias de PS I y casi libres de
complejo citb6/f.
Mas adelante, la manipulación de las preparaciones de PS II
condujo al aislamiento de complejos de submembrana capaces
de desprender oxígeno, que se denominan PS II cores o
centros
de
reacción.
El
aislamiento
de
nuevas
preparaciones de PS II, así como de PS I u otras
subfracciones da lugar, en muchos casos a que se avance un
paso
más
en
el
conocimiento
del
mecanismo
de
la
fotosíntesis. En otras palabras, podemos decir que la
fotosíntesis está muy ligada a la descripción de nuevos
métodos de aislamiento de preparaciones más limpias y aún
capaces de llevar a cabo las funciones de la fotosíntesis.
En todos los casos se trata de aislar un conjunto de
proteínas y cofactores que sean capaces de llevar a cabo
una función, pero que, al mismo tiempo, estén libres de
otras moléculas de proteína y pigmentos que no son
necesarios para esa unción. Para ello se emplean diferentes
estrategias en las que se utilizan técnicas cromatográficas
y tratamientos con detergentes, que producen la separación
de los proteínas y pigmentos accesorios y la obtención de
una preparación más activa en una determinada función.
La estructura del PS II
La estructura del PS II se presenta en estos momentos de
manera muy detallada debido en gran medida, al gran
esfuerzo que se ha realizado en los últimos años para poder
desvelar la estructura cristalina de este importante y
complejo sistema. La última estructura disponible de un PS
II corresponde a la publicada en Science en Marzo de 2004
(Science 303, 1831-1838 (2004) por un grupo de japoneses
junto con Jim Barber, del King College en Londres, que han
resuleto
el
centro
PS
II
de
la
cianobacteria
Thermosynechococcus elongatus, a 3,5 Å de resolución en
donde se ha dado información detallada de la estructura del
OEC así como del posible mecanismo de funcionamiento de
dicho centro. Como hemos mencionado más arriba, el PS II
tiene una gran similitud con el centro de reacción
fotosintético de bacterias, aunque en las bacterias no hay
desprendimiento de oxígeno y, por tanto, no existe el
centro que lleva a cabo dicha función en el PS II.
El PS II que se observa en los cristales contiene un dímero
en el que los dos monómeros son casi idénticos. El monómero
contiene 19 proteínas, que se nombran como D1 D2,
codificadas por los genes psbA y psbD. Son similares a las
proteínas L y M del centro de reacción de bacterias. Las
dos proteínas son muy similares y parecen un heterodímero
con una simetría dimérica. Ambas proteínas tienen cinco (5)
hélices transmembrana. En ellas es donde están localizados
los cofactores donde se lleva a cabo la reacción
fotoquímica. Se han comparado las secuencias de muchas de
estas proteínas y se encuentran muchos puntos en común. El
80-85 % de la secuencia es homóloga entre unas proteínas y
otras. En ambas D1 y D2 hay el máximo de conservación en
las regiones correspondientes a las hélices D y las CD. A
estas proteínas se unen varios cofactores, tales como las
clorofilas del P680, el aceptor primario, la feofitina, un
hierro no hemínico y las QA y QB así como los radicales
TyrZ+ y TyrD+. Se considera que son importantes porque
proporcionan los sitios para que se lleve a cabo la
fotoquímica del PS II al coordinar dichos aminoácidos los
cofactores que intervienen en esas reacciones. Por ejemplo,
las His que ligan los Mg del P680, así como los que ligan
al Fe. También el W254 en D2 y F255 en D1 que se propone
que interaccionan con QA y QB están conservados en todas
las especies. Otro residuo conservado es la Tyr 161 de D1
que da el radical al reducir el P680+
Las proteínas CD47 y CP43, también llamadas CAa-1 y CPa-2
son proteínas integrales de la membrana del PS II. Están
codificadas por los genes psbB y psbC. Tienen varias
moléculas de clorofila y se pueden considerar como
intermediarios en la transferencia de energía entre las
proteínas que captan la luz (LHC en las plantas, los
ficobilisomas en cianobacterias y algas rojas y el centro
de reacción fotosintético. También hay mucha conservación
en las secuencias de las proteínas entre especies
distintas. Se deduce que hay seis (6) hélices transmembrana
y un gran bucle que queda fuera de ella. Este bucle pudiera
estar implicado en la unión al centro de evolución de
oxígeno porque al introducir algunos cambios en los bucles
se observa un drástica disminución de la capacidad de
desprender oxígeno de estas preparaciones.
La estructura
de la CP 47 y la CP 43 son muy similares.
El citocromo b-559
El cit b0-559 es uno de los componentes del PS II más
enigmáticos. Es un centro redox al que no se le conoce un
papel funcional. Se propone que sirve para darle la
estructura correcta al centro de reacción ya que cuando se
elimina el gen no se obtiene actividad ni se puede aislar
el PS II. Además, la cantidad de las proteínas D1 y D2 es
muy pequeña. Lo mismo ocurre si se eliminan los residuos de
His a los que se une el Fe. Hay dos subunidades que
conforman al cit b y esto es poco frecuente para un
citocromo. Presenta dos potenciales redox, el potencial
alto es de + 370 mV, lo que es raro porque los citocromos
tienen potenciales entre 0 y 100 mV. El potencial bajo es
de 60-80 mV. La forma de bajo potencial está a veces
asociada a formas dañadas durante la preparación. Se
propone
también
que
pueda
tener
un
papel
en
la
fotoprotección del PS II.
Mecanismo de transferencia de electrones en el PS II.
Las reacciones del PS II están promovidas por la luz y
consisten en una serie de reacciones que llevan los
electrones desde el agua hasta una molécula de quinona que
abandona el PS II para contactar con el siguiente complejo
en la cadena que es el complejo citocromo b6/f.
Cuando se ilumina, se libera un electrón del P680, que es
una molécula del par especial que se encuentra en el lado
del lumen de la membrana. Dicho electrón salta en muy corto
espacio de tiempo (2-20 ps) hasta la feofitina, a través de
una molécula de clorofila. La feofitina sería, pues, el
aceptor primario de electrones del PS II. A continuación el
electrón pasa a una molécula de quinona que se encuentra
firmemente unida a la membrana, la QA (aprox. 400 ps). Por
último, la quinona QA cede el electrón a QB (aprox. 100 µs)
pasando a través de un átomo de hierro que está colocado
entre las dos proteínas D1 y D2 con las cuales está unido
mediante cuatro His, mientras que la quinta valencia es un
grupo de bicarbonato en el caso de PS II, mientras que en
el centro de bacterias era un resto de Glu. La llegada del
segundo electrón a la QB dispara la captación de dos
protones, su salida del sitio donde se encuentra unida y su
reposición por una quinona procedente del pool de la
membrana.
La salida de un electrón desde el P680 genera un radical
catiónico, el p680+ que debe ser devuelto a su situación
original y eso ocurre mediante la cesión de un electrón por
un grupo que no tiene características redox, como es la Tyr
161 de D1 a la que se ha denominado TyrZ. Ésta pasaría a su
·
vez a convertirse en un radical TyrZ . El radical tiene un
potencial redox muy oxidante, que se ha estimado del orden
de 1,3-1.4 V, lo que hace posible que sea capaz de extraer
un electrón del oxígeno del agua. Simplemente, la reacción
fotoquímica ha generado un compuesto que es más oxidante
que el oxígeno para que se realice la reacción de rotura de
la molécula de agua. Contrasta este hecho con lo que se ha
encontrado en bacterias, ya que en este organismo dicho
radical el para especial genera un radical de tan sólo 0,4
V que se reduce con un citocromo c.
La estructura del OEC
Hace unos dos o tres millones de años se produjo a través
de la evolución un centro de reacción fotosintético que
desprendía oxígeno al extraerlo del agua. De esta manera
los organismos capaces de llevar a cabo esta reacción
disponían de una fuente inagotable de electrones y protones
activados
biológicamente.
Como
consecuencia
de
esta
reacción de rotura de la molécula de agua el oxígeno se fue
acumulando en la atmósfera y pudieron aparecer los
organismos que respiran. Los primeros experimentos que
abrieron una puerta en la investigación acerca del
mecanismo de la rotura de la molécula de agua fueron
realizados por Joliot en 1969 utilizando flashes de corta
duración para iluminar cloroplastos de espinaca o células
de Clorella que estaban adaptadas a la oscuridad. El
resultado fue una prueba evidente de que el oxigeno se
emite de una manera que evidencia un cierto ritmo. De
hecho, el máximo de oxígeno desprendido aparece después del
tercer flash, y a partir del máximo se produce a los cuatro
flashes y así hasta que se rompe el ritmo y se alcanza un
estado estacionario. La interpretación que se hace de este
experimento es que el complejo pasa por cuatro estados
siendo cada uno propiciado por un fotón. Así pasarían desde
el estado S0 hasta el S4, cada uno después de absorber un
fotón.
Otro experimento que permitió un avance se produjo al
observar la señal de EPR correspondiente al Mn en las
preparaciones de OEC, lo que asociaba este metal a dicha
reacción. Se ha utilizado la técnica de EXAF (Extended Xray absorption fine structure) en donde la modulación de la
absorción de rayos X se puede interpretar como densidad
electrónica alrededor de un átomo. Con estas técnicas se
proponen una serie de estructuras, de entre las cuales hay
una denominada dímero de dímeros que es la que tiene más
adeptos. En este modelo hay 4 Mn unidos por dos puentes
dioxo en donde hay otros carboxilatos que unen los Mn. Hay
una His de la proteína que interviene uniendo el cluster.
También está posicionada muy cerca la Tyr 161 que es la que
se convierte en el radical TyrZ+. Se observan las moléculas
de agua unidas a los Mn que reaccionarán en el proceso
fotoquímico.
La estructura del PS II desvelada en Marzo de 2004 muestra
las densidades electrónicas que permiten identificar no
sólo los residuos de la proteína implicados, sino también
la naturaleza y posición de los metales que intervienen.
Indican que hay cuatro metales en un dominio mayor que
podría ser un tetrahedro, mientras que hay un quinto metal
en una región extendida que se encuentra cercana. Mediante
el examen de los mapas diferenciales de rayos X anómalos,
que indican mucha diferencia entre el Ca y el Mn se propone
que uno de los vértices del cubo está ocupado por un Ca,
mientras que el cuarto Mn está en la región extendida
cercana. Los restantes vértices del cubo Mn3CaO4 están
ocupados por grupos oxo que conectan con los Mn.
Los datos de cristalografía de rayos X indican que el Mn
localizado en la región extendida une una molécula de agua
que sería la que sufre la oxidación. El enlace 0=0 se
formaría mediante un ataque nucleofílico desde una segunda
molécula de agua que está ligada al átomo de Ca del cubo
que puede actuar como un ácido débil del Lewis.
La cadena de agua al sitio QB.
El sitio QB está profundamente embebido en el complejo del
centro de reacción. Como debe protonarse durante el ciclo
catalítico para dar una hidroquinona, debe captar dos
protones y lo hace del lado del estroma, en este caso el
citoplasma, por lo que se encuentra con una gran porción de
la proteína que está en el camino. Por ese motivo se piensa
que la protonación se lleva a cabo a través de residuos
protonables de la proteína así como con moléculas de agua.
Los protones podrían así desplazarse a través de una cadena
de elementos que actúan como aceptores y donadores de
puentes de hidrógeno. En las estructuras cristalinas
disponibles se pueden observar verdaderas cadenas de
moléculas de agua alineadas a lo largo de un canal que une
el medio externo con el centro donde se encuentra en QB.
Cada una de las moléculas de agua se encuentra a una
distancia que está más o menos a la distancia de los
puentes de hidrógeno. De esta manera llegarían los protones
a la QB desde el citoplasnma y luego los perdería en el
lumen, con lo que se establecería un flujo de protones
desde el citoplasma o estroma al lumen, con la consiguiente
bajada del pH en este espacio.
EL PS I
El PS I, o centro de reacción fotosintética I, es un
complejo multienzimático asociado a membrana que se puede
denominar, de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC como
una Plastocianina-ferredoxina oxidorreductasa en el sentido
de que lleva a cabo una reacción de transferencia de un
electrón desde la plastocianina, cuyo potencial es de E'o =
+380 mV, hasta la ferredoxina, cuyo potencial es de E'o = 420 mV. Eso significa que debe vencer una gran barrera
termodinámica que es para lo que se utiliza la energía de la
radiación luminosa. Este proceso es muy eficiente puesto que
se puede decir que prácticamente el 43 % de la energía de
del fotón rojo, de acuerdo con la luz absorbida, se
transforma en energía química.
En los últimos años se ha avanzado mucho en el conocimiento
de la estructura y función del PS I así como de otros
componentes de la fotosíntesis. Se conoce la estructura de
la plastocianina así como de la del citocromo c6 que la
sustituye en aquellos organismos que se cultivan en ausencia
de Cu y en presencia de Fe. Se conoce la estructura de la
ferredoxina y flavodoxina, así como de la FNR de Anabaena y
de otras cianobacterias. Es más, recientemente, en el año
2001 se ha publicado la estructura, a una resolución de 2,5
Å, del PSI de una cianobacteria. Por otra parte en los
últimos años se ha avanzado mucho en el conocimiento de la
estructura y la función de muchos de los componentes del PS
I, al mismo tiempo que se han clonado y se han llevado a
cabo experimentos de mutagénesis en algunos de ellos, con lo
que se empieza a comprender cómo interaccionan entre ellos y
cómo participan en el transporte de electrones.
Respecto a la nomenclatura de los genes que codifican las
proteínas del PS I es necesario aclarar que se ha
estandarizado su nomenclatura, que consiste en utilizar las
letras en cursiva psa y luego una letra que va desde la A a
la M con mayúsculas. Las proteínas se nombran siguiendo el
mismo sistema, pero con letra normal y la primera en
mayúscula PsaA hasta la PsaM, pero también se nombran como
PsIA.
Arquitectura del centro PS I
La organización de las diferentes subunidades del complejo
así como de sus cofactores, ha sido determinada por
cristalografía de rayos X a una resolución de 2,5 A.
El centro de PS I de cianobacterias aparece como un trímero
de peso molecular 3 x 356.000. Esta forma está presente
también in vivo. Cada monómero contiene 11 subunidades de
proteínas diferentes que coordinan más de 100 cofactores.
Las subunidades PsaA (en azul en la Figura) y el PsaB (en
rojo en la Figura) comparten muchas similitudes en la
secuencia de proteínas así como en su estructura. Contienen
11 hélices transmembrana cada una.
En la estructura por rayos X correspondiente al PS I de la
cianobacteria Synechococcuss elongatus, se observan dos
dominios diferentes, el llamado dominio de conexión, que no
sobresale ni por enzima ni por debajo de la membrana, y que
sirve, aparentemente, para unir los monómeros en trímeros.
El dominio mayor es el catalítico, que tiene salientes de
unos 35 Å hacia el estroma o de unos 15 hacia el lumen y que
contiene los componentes de la reacción fotoquímica de
separación de cargas. Se supone también en este caso que la
parte que sobresale hacia el estroma corresponde a los
polipéptidos hidrofílicos, PsaC, D y E, que son las partes
por las que interacciona el PS I con la Ferredoxina (ver
Figura). También hay una cavidad en el lado del lumen que
podría corresponder al sitio de unión de la plastocianina o
el citocromo c6. Se observan tres regiones ricas en densidad
electrónica, que podrían corresponder al centro sulfoférrico
Fx, que forma parte del núcleo del PS I, y que sería el más
interno, mientras que los otros dos, los FA y FB, son parte
de la subunidad PsaC.
Hay un eje de simetría que comprende 22 de las hélices
transmembrana, 8 hélices de superficie, los cofactores del
sistema de transporte de electrones (excepto (FA y FB) y un
par de moléculas de clorofila de la antena de conexión. Este
eje comprende a las subunidades PsaA y PsaB y pasa por el
centro de hierro FX. 11 de las hélices transmembrana y 4 de
la superficie son de las subunidades PsaA y PsaB. Todas
tienen su pareja. No se puede saber cuál es de A y cuál es
de B. En la Figura aparece la subunidad PsaF (en amarillo),
una subunidad importante en plantas porque es el sitio de
unión de la plastocianina. En cianobacterias no tiene esa
función porque la interacción con el PS I es diferente.
Con respecto a los cofactores del PS I se puede decir que se
han identificado más de 100 moléculas de clorofila que
forman parte del PS I. A pesar de que se está lejos de
conocer la función de todas ellas las que juegan un papel
catalítico están localizadas. Así, hay un par de clorofilas
cerca del eje de rotación, próximas a la depresión del lado
del lumen, lo que indica que puede recibir electrones de la
plastocianina o del citocromo c6. Serían dos planos de
porfirina
separados
por
unos
3,6
Å
y
que
están
perpendiculares a la membrana. En la Figura se indica su
localización así como los residuos que las rodean. Hay otras
dos moléculas de clorofila próximas, semejantes en posición
a otras que se han encontrado en la estructura del centro de
reacción de las membranas púrpura por Deisenhoffer, Michel y
Huber, que harían de puente de los electrones en su camino
hacia el aceptor primario de electrones que se supone que es
una molécula de clorofila que se encuentra como un monómero
y relativamente cerca de las clorofilas accesorias. Forman
dos ramas por las que podrían pasar los electrones hacia el
aceptor de electrones. No obstante, aún no se ha resuelto
cuál es el papel de cada una de las ramas en este proceso de
transferencia de electrones. Por analogía con las clorofilas
del centro de reacción de bacterias se propone que estos
pigmentos
accesorios
participan
en
la
reacción
de
transferencia de electrones.
El heterodímero PsaA/PsaB
Las proteínas PsaA y PsaB son las mayores del PS I. De
hecho, se expanden de un lado a otro de la membrana y
contienen un alto número de centros redox así como de
pigmentos. Se conocen las secuencias de diferentes genes de
dichas proteínas, tanto de plantas como de cianobacterias.
Llama la atención el hecho de que son de un gran tamaño:
unos 740 y 734 Aa en Synechococcus, la A y B, lo que
significa tamaños del orden de 81 kDa.
Entre las dos
proteínas existe un 45 % de identidad. Otro hecho destacable
es que la homología entre las proteínas A de eucariotas y
cianobacterias es del 95 % y lo mismo ocurre con la PsaB que
también es idéntica en un 95 % entre diferentes especies.
Eso significa que juegan una función análoga y muy
especializada, lo que deja muy poco margen de variabilidad.
Presentan también una gran semejanza en su estructura
terciaria y cuaternaria.
Ambas proteínas son transmembrana, como se había determinado
anteriormente con anticuerpos específicos que permiten
determinar si un proteína está expuesta al espacio luminal o
estromal o a ambos, como sería este caso.
Se detectan también dos cisteínas en cada una de las
proteínas, lo que significa que el centro Fe/S, que se
denomina Fx, el único en el heterodímero, está soportado por
ambas cadenas polipeptídicas, un hecho que resulta bastante
insólito.
Como consecuencia de la transferencia de la energía captada
por las moléculas de clorofila de las antenas, y mediante el
mecanismo de transferencia de energía de Foster ya descrito,
la energía llega a un pigmento donde queda atrapada al
encontrarse en un nivel energético ligeramente inferior.
Este pigmento de propiedades diferentes, es un dímero de
clorofila a que cambia su espectro alrededor de 698-700 al
oxidarse, se pierde absorbancia a esta longitud de onda.
Debido a ello se le denomina P700 y al excitarse puede
perder un electrón quedando como una especie cargada P700+.
La pregunta ahora sería ¿a qué le da su electrón el P700?
cuál es el aceptor primario de electrones en el PS I, ese
compuesto que fue buscado con tanta insistencia durante la
década de los 70, como se ha citado ya varias veces.
Hay acuerdo general acerca de que el aceptor es el llamado
Ao, que consiste en una molécula de clorofila aislada y
separada unos 12 A del par de clorofilas del centro de
reacción. Este proceso tiene lugar en tiempos muy cortos,
del orden de 3 ps. De nuevo tiene lugar un proceso muy
rápido como es la reoxidación del Ao-. Al transferirle su
electrón al siguiente componente de la cadena, una molécula
de filoquinona (vitamina K1), que se denomina A1. También
este proceso transcurre en unos 30 ps. Este pigmento absorbe
a 430 nm por lo que antes de identificarlo se le llamó P430
y se propuso como aceptor primario de electrones del PS I.
Ahora se denomina A1 y en su forma reducida sería A1-. En
este punto se podría preguntar uno por qué no se produce la
reacción inversa, es decir reoxidación del P700+ con el
electrón de A1. Dicha reacción no se observa a menos que se
cumpla
alguna
de
las
dos
siguientes
condiciones
artificiales: o bien que se haya extraído el centro Fx, o
bien que se hayan reducido previamente los centros Fx, FA y
F B.
Parece lógico, por tanto, que el siguiente componente
de la cadena sea el centro Fe/S
denominado Fx, que se
encuentra a sólo 12 Å de distancia del A1. Una razón que
apoya la propuesta de que el centro Fx participa en la
cadena de transporte de electrones es que si se cambia
mediante mutagéseis dirigida una de las cisteínas que
mantienen la agrupación Fe/S por Ser, se forma un centro que
contiene sólo 3Fe/4S, que se puede reducir con ditionito
aunque la transferencia hasta los centros FA y FB se ve
alterada en parte.
El PsaF
La secuencia de diferentes genes que codifican a este
polipéptido indica que tiene una secuencia correspondiente
a un péptido señal que justificaría la localización que se
le adscribe en el lado del lumen, a donde tiene que ser
transportado una vez que se sintetiza en el estroma del
cloroplasto.
También se observa una región con una alta
concentración de cargas positivas. Por otra parte, los
estudios de hidropatía indican que hay una región con fuerte
contenido en aminoácidos hidrofóbicos que indicaría que
existe una hélice que atraviesa la membrana que serviría
para anclar la proteína al heterodímero PsaA/PsaB. Esa
hélice se cree que es la i de la estructura cristalina (en
amarillo en la Figura).
Respecto a la función del PsaF en el PS I se acepta como
probado que sirve para fijar al donador de electrones la
plastocianina o el citocromo c6 para que
puedan ceder
electrones al P700+. En cualquier caso esto plantea una
interesante pregunta, que también se da en otros puntos del
PS I, y es que si la PC y el Cit c6 juegan el mismo papel
uniéndose a la misma cadena PsaF, cómo es que lo hacen
teniendo unas estructuras tan diferentes. Apoyan esta
propuesta experimentos cinéticos y el hecho de que se ha
unido covalentemente la PC a la PsaF en plantas superiores,
lo mismo que más recientemente, se ha hecho entre el cit c6
y la PsaF de cianobacterias. De todas formas existen
algunos puntos de controversia acerca de esta propuesta que
habrá que aclarar antes de que se dé por definitivamente
establecido el papel de la psaF en el Ps I.
La proteína PsaC
Tiene 81 aminoácidos en la mayoría de los organismos de los
que se conoce la secuencia. Entre ellas hay una muy alta
analogía de secuencia existiendo pequeñas variaciones entre
las plantas monocotiledóneas, las dicotiledóneas y las
cianobacterias. La eliminación del gen da lugar a un
fenotipo que es letal en cultivos fotoautotróficos,
indicando que es un gen esencial para el aprovechamiento de
la luz.
La proteína es ligeramente acídica con un pI de 5,5 y
contiene 9 Cys ocho de las cuales se encuentran en dos
agrupaciones del tipo CxxCxxCxxxCP, que son típicas de
proteínas que tienen grupos sulfoférricos del tipo 4Fe/4S.
La secuencia de la PsaC es muy similar a la de otras
ferredoxinas o trozos de ellas. Tal es el caso de la de
Azotobacter y otras bacterias y sulfobacterias. En aquellos
casos en que se conoce la secuencia se comprueba que ésta
es
muy
similar
en
todas
ellas.
Una
característica
estructural de estas proteínas es que muestran dos dominios
simétricos que tienen una estructura semejante y contienen
cada uno a un centro Fe/S. En cada uno de los agrupamientos
de cuatro Cys las tres primeras están uniendo átomos de Fe
mientras que el tercero lo hace con el Fe del otro centro.
Debido a este hecho los dos dominios no se muestran como
independientes sino que cooperan entre sí para dar lugar a
un eje binario.
Esencialmente se puede decir que esta estructura es la
mínima
requerida
para
englobar
a
los
dos
centros
sulfoférricos dado el pequeño tamaño de la proteína. En
cualquier caso es de destacar el hecho de que, incluso en
secuencias que fueran más largas, por tener inserciones en
algunas regiones, no se afectaría la disposición de los
centros Fe/S debido al hecho de que la cuarta Cys, que
enlaza al segundo centro, está situada necesariamente
próxima al primer centro por estar en una agrupación de
secuencia concreta.
Con respecto a la función del PsaC está claro que tiene dos
centros redox que participan en el transporte de electrones
entre el Fx del PS I y la ferredoxina o la flavodoxina. Se
podría considerar que su función es conseguir que los
electrones salgan del núcleo hidrofóbico del centro de
reacción y pasen a la región del estroma, que es
hidrofílica.
Ello se demuestra cuando se interrumpe la
fotorreducción del NADP+ al eliminar del PS I las
subunidades PsaC, PsaD y PsaE. El transporte de electrones
se restablecía al añadir las proteínas PsaC y PsaD al
núcleo PS I-Fx. Ello indica, a su vez, que el Fx no puede
dar electrones a la ferredoxina. Por otra parte en la
proteína de plantas se destruye el FB mediante tratamiento
con HgCl2 y en ese caso no hay fotoreducción de NADP+.
Se propone que la secuencia de transferencia de electrones
es Fx ---> FA ----> FB. La localización del FA más cercano
al Fx indica que ésta es la secuencia, aunque los
potenciales redox indicaría la dirección opuesta. Para
probar el orden de intervención sería necesario alterar el
potencial de uno de los centros y ver qué pasa con el
transporte de electrones. Cuando se ha hecho la mutación
C14D se obtiene una proteína con un centro FB de potencial
-90, mientras que el del FA se mantiene en -520 mV.
Por
otro lado al hacer la mutación C51D el potencial del FA
pasa a ser -98 mV mientras que el del centro FB es de -580
mV. Ello indica, en primer lugar, que lo que determina el
potencial del centro redox es la secuencia de la proteína y
concretamente en el entorno del centro redox. En segundo
lugar que el cambio en uno de los centros no afecta al
otro, lo mismo que no está determinado por el hecho de que
al titular el segundo centro, el FB, ya se ha reducido el
FA, que estará como FA-.
Desgraciadamente no se han estudiado las proteínas con
centros 3Fe/4S en experimentos de reconstitución del núcleo
del PS I. El ideal sería ver si en aquellos sistemas en
donde tenemos un sumidero en el centro FA o bien en el
centro FB por haberles cambiado su potencial haciéndolo más
positivo se detiene el transporte de electrones cuando está
el otro centro reducido, en cuyo caso se concluiría que el
centro alterado está después del otro centro que se reduce.
Si no está reducido el centro intacto querrá decir que el
centro alterado está antes del otro.
Este tipo de experimentos también se están intentando
llevar a cabo utilizando centros en donde se integra un
metal diferente al hierro, en cuyo caso se obtienen centros
con potenciales diferentes.
PsaD
La secuencia del gen del PsaD muestra que corresponde a una
proteína de unos 135-150 aminoácidos entre los cuales hay
un enorme cantidad de Lys y Arg. La secuencia se encuentra
bastante conservada entre las cianobacterias (del orden del
65 %) mientras que lo está algo menos con relación a
plantas superiores (55 %). El punto isoeléctrico es muy
alto, del orden de 9-9,5 aunque hay algunas que lo tienen
más bajo. Los perfiles de hidropatía y experimentos de
extracción indican que la PsaD está fuera de la membrana
del tilacoide y es muy soluble. La mayor abundancia de
residuos básicos en el extremo carboxilo hace pensar que
esa porción de la proteína es la que establece el contacto
con la ferredoxina (o flavodoxina) que son negativas. Al
mismo tiempo se piensa que estará próxima a la PsaC
formando una especie de capuchón.
La función de la PsaD se ha adelantado al hablar de su
estructura. Se propone que es el sitio de unión de la
ferredoxina (o flavodoxina) al PS I. Esta propuesta, que se
hacía sobre la base de la abundancia de cargas positivas en
la proteína, se apoya en el hecho de que la ferredoxina se
une covalentemente a la PsaD cuando se incuban con EDC. Se
apoya también en el hecho de que cuando se utilizan
+
mutantes PsaD no tiene lugar la fotoreducción del NADP y
se recuperaba dicha capacidad al añadir PsaD pura.
Curiosamente dicho requerimiento es menos estricto si se
utiliza flavodoxina, lo que indica que esta proteína no
requiere a la subunidad PsaD para unirse al PS I. Una
segunda
función
de
la
PsaD
consiste
en
orientar
adecuadamente a la subunidad PsaC para su unión al PS I.
Experimentos
de
eliminación
del
gen
aportan
poca
información adicional acerca de la función del PsaD. Dichos
mutantes son incapaces de crecer en la luz. Cuando se aísla
el PS I de estos mutantes les faltan algunas subunidades,
pero esto puede indicar que no las tengan in vivo o que la
hayan perdido al aislar el PS I. Experimentos más recientes
indican que están presentes las otras subunidades.
PsaE
La secuencia de aminoácidos deducida a partir de la
secuencia del gen de diferentes organismos muestra que la
PsaE es una proteína de 70-75 aminoácidos con una masa
molecular de 7-8 kDa y un alto grado de homología entre
ellas (unos 75 %). Se tiene una estructura de NMR para esta
proteína. Tiene un alto contenido en hoja β ya que contiene
cinco
láminas
β.
Es
interesante
señalar
que
en
la
estructura se observa que la parte superior no contiene
prácticamente aminoácidos cargados sino que son polares o
apolares, mientras que en la parte inferior existe un
elevado número de residuos cargados.
Esta diferente
distribución de los aminoácidos según el tipo a que
pertenezcan podría deberse a su papel en la unión a PsaC,
al heterodímero PsaA/PsaB o a proteínas transportadoras de
electrones solubles.
Con respecto a la función de esta proteína existen varias
pruebas de que aumenta la velocidad de intercambio de
electrones entre la ferrredoxina (o la flavodoxina) y el PS
I. De nuevo son experimentos en los que se elimina el
componente PsaE de la preparación y se observan cinéticas
que suelen ser la mitad o la cuarta parte de la original.
La adición de la subunidad restaura parte de la actividad
perdida.
Sin embargo ésta no puede ser la principal función de la
subunidad ya que la ausencia del gen no causa un fenotipo
letal.
La
discrepancia
entre
los
datos
bioquímicos
(obtenidos
con
preparaciones
de
membranas)
y
los
fisiológicos (medidos con organismos enteros) sugiere que
no es necesaria una eficacia del 100 % en la reacción (en
este caso de transporte de electrones) para que un
organismo crezca mejor.
Una segunda función de la subunidad PsaE fue descubierta
después de que
un mutante PsaE se observara que era más
sensible a la temperatura que la silvestre.
Todos estos datos nos han proporcionado una visión de la
estructura del PS I así como de su función en el transporte
de electrones en la fotosíntesis. Hemos visto que en este
momento se puede presentar una visión bastante coherente de
este centro, de sus componentes así como de la función de
cada uno de ellos. Se ha recorrido un largo camino y ya se
puede prácticamente tener un idea de cómo funciona. No se
esperan novedades en este campo.
No obstante, son muchas
las lagunas que aún quedan por rellenar hasta que se pueda
tener un cuadro completo de cómo funciona la fotosíntesis.
El complejo citocromo b6/f
Las moléculas de quinona reducidas en el PS II deben
reoxidarse para generar los equivalentes de reducción al
mismo tiempo que se genera el ATP, los dos productos de la
fotosíntesis. Hemos visto en temas anteriores que los
electrones que se extraían del agua en las reacciones
dependientes del PS II debían llegar al PS I para terminar
en el NADPH. La conexión entre los dos se realiza a través
del complejo cit b6/f. Se puede decir, por tanto, que el
citocromo
b6/f
es
una
plastoquinona-plastocianina
oxidoreductasa ya que transfiere electrones desde la
plastoquinona hasta la plastocianina generando un gradiente
de protones que sirve para la síntesis de ATP. En algunas
algas la plastocianina se sustituye por citocromo tipo c,
el citocromo c6 cuya síntesis depende de la presencia de
hierro o cobre en el medio de cultivo.
Ocurre igual en el otro proceso en el que se produce
transformación de energía biológica, la respiración. En la
mitocondria hay otro complejo que se denomina el citocromo
b/c1 que transfiere electrones desde la ubiquinona hasta el
citocromo c. Vemos, por tanto, la similitud de ambos
sistemas, que está reflejada en una Figura. Complejos de
este tipo se han encontrado, de hecho, en todas las
mitocondrias y en muchas especies bacterianas. Se pensaba
que sólo estarían en la fotosintéticas, pero se han
encontrado en muchas más.
El complejo citocromo b6/f se requiere también para llevar
a cabo la fotofosforilación cíclica. En este caso se
transforma la energía captada por el PS I en un gradiente
transmembrana que puede servir para la síntesis de ATP.
La localización del complejo citocromo b6/f incluye la
membrana de los grana y los tilacoides estromales, a
diferencia de los PS I y PS II que están distribuidos de
manera irregular en estas membranas. De hecho encontramos
una mayor cantidad de complejo en la parte final de los
sacos de grana, justamente entre los PS I y PS II indicando
su función de comunicación entre ellos.
Se he resuelto la estructura del complejo citocromo b6/f de
la cianobacteria termófila Mastigocaldus laminosus a 3,0 Å
de resolución por el grupo de Bill Çramer, de Purdue
University Science, 302, 1009-1014 (2003). Se obtiene como
un dímero, tal como se observa en la Figura, en donde cada
monómero contiene cuatro subunidades proteicas grandes, que
son el citocromo b6, con dos grupos hemo, el hemo bn y el
hemo bp, cada uno coordinado a dos His; la Sid IV,
relacionada con el citocromo b6, la proteína Rieske, que
contiene un centro sulfoférrico del tipo [2Fe-2S]; y el
citocromo f, un citocromo del tipo c. Hay también otras
cuatro subunidades altamente hidrofóbicas, que son la PetG,
PetL, PetM y PetN, así como una molécula de clorofila a, un
β-caroteno y una plastoquinona, lo que da lugar a un
complejo de un peso molecular de 217 kD. Por otra parte,
anteriormente, se habían determinado las estructuras de una
forma trucada del citocromo f así como de la de la proteína
Rieske.
Cada monómero presenta 13 hélices transmembrana que son 4
del citocromo b6, tres de la subunidad IV, y una en cada
una de las proteínas citocromo f, proteína Rieske y las
subunidades PetG, -L, -M y –N. Los dominios extrínsecos del
citocromo f están situados en el lado “luminal” de la
membrana (lado p).
Los dos monómeros forman una cavidad que se encuentra vacía
en la interfase transmembrana y que está colocada en el
lado “estromal” de la membrana y que se propone que sirve
para el intercambio de quinonas en el complejo.
El citocromo b6
El citocromo b6 y la subunidad IV son homólogas a las
porciones N- y C- terminales del citocromo b del complejo
citocromo bc1, de la misma manera que lo es la parte
central que corresponde a la proteína Rieske. Sin embargo,
el citocromo f, que es un citocromo tipo c no es homóloga
al citocromo c1 del complejo bc1. Los dos hemos del
citocromo b6 tienen un potencial que resulta peculiar para
una proteína de este tipo, ya que se les han asignado los
valores de -50 y -150 mV para cada uno de ellos. No es
casualidad que en mitocondrias ocurra prácticamente lo
mismo donde los hemos del citocromo b tienen potenciales
muy próximos a éstos.
Una sorpresa que ha resultado al resolver la estructura de
este complejo consiste en que ha aparecido un nuevo grupo
hemo que se encuentra asociado al hemo bn del citocromo b6.
Dicho grupo hemo parece que no pertenece a ninguna familia
de hemos, por lo que se propuesto, por el momento, el
nombre de hemo x. El hemo x se encuentra unido
covalentemente a la proteína por una Cys del citocromo b6.
El Fe del hemo no está coordinado a un residuo de la
proteína sino a una molécula pequeña que se propone que es
de agua. Dicha molécula de agua está unida por puentes de
hidrógeno a un propionato del hemo bn así como a otro
residuo del citocromo b6. La sexta valencia está vacía. Los
planos casi perpendiculares de los hemos x y bn están en
contacto a través de la unión por el puente propionatoagua, lo que implica que exista una transferencia de
electrones eficiente entre los dos grupos hemo. Sobre la
función del grupo hemo x se hablará más adelante.
El citocromo f
El citocromo f del complejo b6/f es un citocromo tipo c y,
por lo tanto, tiene el grupo hemo unido covalentemente a
dos cisteínas de la proteína, de acuerdo con el motivo
CXXCH en la porción amino terminal, que es común a los
citocromos f y c1. En los dos casos el extremo carboxilo
de la proteína está precedido por un trozo de unos 20
aminoácidos hidrofóbicos que se piensa que puedan ser el
sitio de anclaje a la membrana. Para conseguir cristales de
la proteína de membrana se ha aprovechado el hecho de que
en algunas especies la porción de la hélice hidrofóbica que
produce el anclaje del citocromo a la membrana se elimina
durante la purificación de la proteína siendo ésta soluble
en agua. Se da también le circunstancia muy favorable de
que este fragmento contiene el grupo hemo y éste mantiene
el mismo potencial redox que en la proteína intacta, por lo
que se puede asumir que la estructura es muy semejante a la
de la proteína nativa.
Dicha estructura es muy diferente de las de otros
citocromos en los que hay preferentemente hélices α,
mientras que en el citocromo f hay mayoría de hojas β. La
proteína está constituida por dos dominios de plegamiento
diferentes. Uno que se encuentra en la parte superior de la
molécula y que está constituido por los residuos 169 al
231, que está constituido casi exclusivamente por hojas β y
otro, constituido por los residuos 1 al 168 y del 232 al
246, que es el más grande y donde se encuentra el hemo. En
este dominio hay mayoría de cargas positivas y es donde se
encuentra la Lys 187 que ha sido descrita que se une
covalentemente al Asp44 de la plastocianina, motivo por el
cual se propone que es uno de los residuos que
interacciona con la plastocianina. El grupo hemo se
encuentra en la región entre los dos dominios, aislado de
la fase acuosa por un escudo muy amplio formado por una
serie de aminoácidos hidrofóbicos y muchas Pro.
La principal característica del citocromo f es el sexto
ligando del Fe, lo que lo diferencia también del citocromo
c1 ya que en éste es una His, mientras que en el citocromo
f es el grupo α-amino de la Tyr en la primera posición. Se
comprueba, al conocer esta estructura, que existe una gran
variedad en lo que se refiere al sexto ligando de los hemos
en los diferentes citocromos. En algunos de ellos, como es
el caso del citocromo
b5, es otra His (como el quinto
ligando). Como se ha dicho antes en los citocromo
c el
sexto es una Met. Por último, en una bacterioferritina el
quinto y sexto ligando son Met.
Parece que no hay relación entre el tipo de hemo y el
ligando. El extraño ligando que tiene esta proteína implica
otro hecho interesante y es que el centro redox de la
proteína no puede integrarse en ésta hasta que no se haya
eliminado el péptido señal para que se libere así el grupo
NH2 de la Tyr1 y esto no ocurre hasta que la proteína no es
translocada hasta el lumen. Si, como parece, el hemo es una
señal importante para que la proteína se pliegue y esto no
ocurre hasta que se le elimina el péptido señal, puede que
sea la forma de regular el plegamiento para que la proteína
esté desplegada antes de pasar la membrana. Se puede decir,
por tanto, que el citocromo c y el f representan otros dos
ejemplos de evolución convergente, de los que ya hay varios
en diferentes sistemas.
Una vez determinada la estructura de este citocromo y
conocido la naturaleza de los residuos que forman parte de
él se puede proponer la forma en la que se produce el
acoplamiento entre dicha proteína y la plastocianina, tal
como se propone en la Figura.
El potencial redox del citocromo f está en la zona
positiva, como es normal en los citocromos tipo c (E'o = +
0,37 V). De acuerdo con este valor el citocromo f se puede
reducir con ascorbato, lo mismo que la proteína Rieske, Por
el contrario, el citocromo b sólo puede reducirse con
ditionito, lo que indica un potencial de reducción mucho
más negativo.
La proteína Rieske.
Es una proteína sulfoférrica con un centro 2Fe-2S que tiene
un potencial inusualmente positivo por lo que puede
reducirse con ascorbato. De hecho el alto potencial de
estos grupos, que fueron ya descubiertos en mitocondrias,
se debe a que el hierro tiene coordinado el N de una His,
además del S. Su unión a la membrana se hace por la porción
C-terminal, aunque el centro metálico se queda fuera.
Mecanismo de transferencia de electrones y transporte de
protones del complejo citocromo b6/f
La función del complejo citocromo b6/f es hacer posible el
paso de los electrones desde el fotosistema PS II, donde se
produce la rotura de la molécula de agua, hasta el PS I,
donde se produce la reducción del NADPH. Así mismo, el
citocromo b6/f es el responsable de llevar a cabo el
aprovechamiento de la energía que se libera en dicho
proceso. Dicha energía se aprovecha para sintetizar una o
varias moléculas de ATP. Una vez que se conoce la
estructura del complejo así como muchos otros aspectos
relativos a la energética de los procesos biológicos es
obligado intentar proponer un mecanismo que explique cómo
se produce el proceso molecular de transformación de la
energía de la fotosíntesis.
Los cuatro centros del complejo funcionan en dos parejas,
dos de ellos de potencial alto y dos de potencial
relativamente bajo. La de potencial más próximo a la
quinona es la proteína Rieske (+ 300 mV) y es la que recibe
un electrón de la quinona, que después pasa al citocromo f
(+340 mV).
La hipótesis quimiosmótica de Michel propone que la energía
que se desprende en el proceso de transporte de electrones
en el cloroplasto, lo mismo que en la mitocondria, se
conserva mediante la formación de un gradiente de protones
consistente en la acumulación de éstos en un lado de la
membrana. Los protones se acumularían en un lado de la
membrana debido a que el paso de los electrones a través
del complejo citocromo b6/f provoca el paso de un cierto
número de protones, aún por determinar, de un lado al otro
de la membrana (del estroma, lado n al lumen, lado p). Hace
muchos años el propio P. Michel propuso un mecanismo que
explicaría cómo se produce transporte de protones al pasar
los electrones por el complejo. Dicho mecanismo se conoce
como el ciclo Q y sigue siendo válido, a pesar del paso de
los años y de que en este tiempo se han conocido muchos
detalles concernientes a los componentes de dicho complejo.
El ciclo que se resume en los siguientes términos: en el
citocromo b6/f hay dos sitios diferentes con afinidad para
las quinonas, cada uno con afinidad diferente por una
especie redox de la quinona. Así hay uno, que es el Qo por
oxidado o outside (también llamado Qp por positivo) que
está en un sitio de la membrana próximo al espacio intratilacoidal. A él se une preferentemente la quinona
reducida. Hay otro denominado Qi que es por interior o
sitio de reducción de la quinona (también llamado Qn por
negativo), que está en la porción más externa de la
membrana.
De acuerdo con este modelo una quinona reducida se une al
Qo desde donde se transfiere un electrón a la proteína
Rieske para pasar a continuación al citocromo f y luego a
la plastocianina. Como consecuencia de esa reducción se
genera una semiquinona que es capaz de reducir al citocromo
bp y éste rápidamente reduce al citocromo
bn que está
situado muy próximo y en el otro lado de la membrana (están
perpendiculares los planos a la membrana). El hemo bn
reducido es capaz ahora de reducir una molécula de quinona
hasta dar la semiquinona, lo que tiene lugar en el sitio
Qi. Ahora tiene lugar otro ciclo catalítico mediante el
cual llega de nuevo un electrón a través del hemo bp y el
hemo bn hasta la semiquinona que estaba en la posición Qi
quedando ahora reducida completamente y que se disocia ya
que este sitio tiene afinidad por la quinona oxidada.
Como consecuencia de los dos ciclos de oxidación de las
quinonas se produce el paso de dos electrones desde la
quinona hasta la plastocianina, al mismo tiempo que cuatro
protones pasan desde el estroma al interior del lumen. El
primer par lo hace al reducirse la quinona con los
electrones de proceden del PS II y que son liberados al
ceder la quinona los electrones al complejo bf siendo los
protones impulsados hacia el lumen. El otro par de protones
se transfiere al reducirse la quinona en el sitio Qi con
los electrones procedentes del citocromo bn.
La reacción es
QH2 + PCox
QH2 +
QH2
+
PCox
+
2 PCox
Q
+
--Æ
QH·
---Æ
Q
+
--Æ
Q
PCrd
Q
+
+
QH·
+
PCrd
2 PCrd
+
+
QH2
H+
+
+
H+
2 H+
Los protones que se utilizan para reducir una quinona en el
PS II proceden del lado del estroma, mientras que se
pierden por el lado del lumen. Por otro lado, los protones
que se utilizan para reducir quinona oxidada así como la
semiquinona, tal como se indica en las reacciones
detalladas más arriba, proceden también del lado del
estroma.
Regulación
Puesto que la transferencia de electrones desde la quinona
al complejo b6/f es lenta constituye en muchos casos el
paso limitante en la Fotosíntesis. Por eso puede ser un
sitio a propósito para establecer un mecanismo de
regulación pudiendo actuar como un sensor del estado redox
del cloroplasto o la célula fotosintética. El mecanismo
sería el siguiente: un nivel alto de quinona reducida
indica que el PS II está funcionando muy eficientemente y
que se está acumulando poder reductor. Entonces se activa
una quinasa que fosforila a una proteína del LHC II
asociado normalmente al PS II, lo que hace que pierda
afinidad por este fotosistema y lo gane por el PS I. De
esta manera la acumulación de poder reductor reduce el
número de antenas del PS II y aumenta el del PS I, con lo
que se produce un tirón de los electrones hacia el NADPH.
Plastocianina
La conexión entre el complejo citocromo b6/f y el PS I se
realiza a trabes de la proteína de pequeño tamaño conocida
como plastocianina. Es interesante señalar que, mientras
que las plantas sólo tienen plastocianina para esta
función, los organismos más antiguos, como son las
cianobacterias, tienen otra proteína que puede cumplir el
mismo papel: el citocromo c6. Eso sugiere algún tipo de
evolución convergente en la cual dos proteínas de
estructura muy diferente se han seleccionado para cumplir
la misma función. Es decir, que la proteína de hierro pudo
ser sustituida por otra de cobre de forma que los
organismos más evolucionados la han adoptado como la única
necesaria para la función que realizan.
La plastocianina es una proteína de cobre que tiene un
átomo metálico por un Mr de 10,5 kDa. Las proteínas de Cu
suelen ser de color azul y así es la plastocianina en el
estado oxidado siendo el máximo a 600 nm como corresponde a
una transición de transferencia de carga del tipo Cys(S)Cu. Hay otras proteínas de Cu con espectros similares,
tales como la azurina y la estelacianina.
La plastocianina de plantas y algas eucariotas está
codificada por el gen petE en el núcleo, por lo que una vez
sintetizada
en
el
citoplasma
debe
transferirse
al
cloroplasto, lo que implica ser transportada a través de
las
membranas
de
dicho
orgánulo.
La
secuencia
de
aminoácidos de las plastocianinas conocidas muestran una
alta conservación de residuos, especialmente los implicados
en la unión del Cu que son dos His, una Cys y una Met así
como una Tyr. Los residuos básicos cambian mucho de una a
otra especie cambiando también el pI de la proteína que es
casi de 4 en plantas y algas verdes, es casi neutra (6) en
algunas cianobacterias y muy básica en otras tal como
Anabaena (9).
La estructura cristalina de algunas plastocianinas se han
determinado así como por RMN. En todos los casos es una
especie de cilindro con el Cu en la parte norte metido en
un bolsillo formado por residuos conservados e hidrofóbicos
que están próximos a la superficie pero no expuestos. Este
bolsillo hidrofóbico se ha propuesto, mediante experimentos
de mutagénesis dirigida, que es el sitio de interacción con
el PS I.
Se ha encontrado otro agrupamiento de residuos ácidos que
se encuentran en la región este de la proteína. Se propone
que este parche negativo es el sitio de interacción con el
citocromo f y también que en Anabaena y otros organismos
en los que la plastocianina tiene un pI básico estos
aminoácidos ácidos se han reemplazado por otros neutros.
Citocromo c6 (antes denominado c553)
Tiene un Mr de 10 kDa y un potencial redox de + 350 mV.
Cumple la misma función que la plastocianina. Ambas tienen
tamaños y potencial redox que son similares en las dos
proteínas. Las estructuras de la proteína de varias
especies se ha determinado recientemente y presenta muchas
similitudes entre sí. Basándose en la comparación de las
estructuras de la plastocianina y citocromo
c6 de
organismos diferentes se puede establecer una relación
evolutiva entre ellas que se han confirmado por datos de
cinética en los que en el caso de los organismos más
primitivos se produce la reacción por colisión simple,
mientras que los más evolucionados se hace mediante un
reconocimiento y posterior reorganización para que se
produzca la reacción.
Aspectos evolutivos de la fotosíntesis
Hace setenta años se realizaron los experimentos que
demostraban que en las plantas había dos centros de
reacción implicados en la fotosíntesis. Se denominaron PS I
y PS II. Más adelante se descubrió que había otros
organismos procariotas que realizaban la fotosíntesis. Se
denominaron bacterias púrpura y bacterias verdes y en ellas
se produce la transformación de la energía luminosa
mediante centros de reacción de otro tipo. Las diferencias
principales con las plantas y cianobacterias es que en
estas bacterias el proceso transcurre sin desprendimiento
de oxígeno; sólo tienen un centro de reacción; finalmente,
el
pigmento
principal
de
la
fotosíntesis
es
la
bacterioclorofila, (BChlo). Durante los años 60 y 70 se
produjeron muchos avances en el conocimiento de la
fotosíntesis de las bacterias púrpura cuyas preparaciones
eran relativamente fáciles de obtener y se obtenían casi
libres de otros pigmentos diferentes de los que se
requieren para producir el proceso a estudiar. En estos
momentos se puede afirmar que los hechos más significativos
a
destacar
del
estudio
comparativo
acerca
de
la
fotosíntesis que llevan a cabo los diferentes organismos
son los siguientes: 1) el centro de reacción PS II de las
plantas se parece en muchos aspectos al de las bacterias
púrpura. EN concreto las subunidades D1 y D2 son análogas a
las L y M de estas últimas; 2) el centro de reacción de las
bacterias
verdes
así
como
de
las
descubiertas
posteriormente de nominadas heliobacterias, es más simple y
homodimérico pareciéndose más al centro de reacción PS I de
las plantas y cianobacterias.
Hoy día se toda la comunidad científica acepta que los
cloroplastos de las plantas que realizan fotosíntesis
surgió del atrapamiento de una cianobacteria por parte de
una célula eucariota, lo que explica la gran similitud
entre el PSI de cianobacterias y de plantas. Las
subunidades PsaA, PsaB, la PsaC que tiene los centros
sulfoférricos, así como la PsaD fueron heredados por los
cloroplastos
directamente
de
sus
ancestros
las
cianobacterias. Posteriormente a la existencia de una
simbiosis entre los cloroplastos y la célula eucariota se
le añadieron a éste otras subunidades que son específicas
del PS I. De hecho, las últimas adquisiciones son las PsaG,
PsaN y Psa H.
Las heliobacterias y bacterias verdes sulfurosas poseen,
por su parte, una versión “económica” del centro de
reacción fotosintético.