molecular tools for identification of wine yeasts

RESOLUCIÓN OIV-OENO 449-2012
MÉTODOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA DETECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS
PRODUCTORAS DE AMINAS BIÓGENAS EN EL VINO
LA ASAMBLEA GENERAL
Considerando el artículo 2, párrafo 2, n.º iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001,
por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino,
Por propuesta del grupo de expertos “Microbiología”
DECIDE adoptar los siguientes Métodos moleculares para la detección de bacterias
lácticas productoras de aminas biógenas en el vino
MÉTODO MOLECULAR PARA LA DETECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS
PRODUCTORAS DE AMINAS BIÓGENAS EN EL VINO
1-OBJETIVO:
Detección de cepas específicas de bacterias lácticas que contienen los genes que
codifican las enzimas involucradas en la producción de aminas biógenas en el vino. Al
concentrarse en el gen adecuado, puede realizarse PCR ya sea para detectar la presencia
de cepas (PCR convencional) o para cuantificar su población (PCR cuantitativa, qPCR).
Una PCR multiplex puede usarse para detectar la presencia de varios genes.
2-FUNDAMENTO
La mayor parte de la contaminación del vino por aminas biógenas (AB) tiene lugar
durante la fermentación maloláctica (FML) debida a la presencia de cepas de bacterias
lácticas cuyas actividades decarboxilasas convierten los aminoácidos
en aminas
biógenas. Además, la agmatina (producida por la decarboxilación de arginina) es
desaminada en putrescina. Muchas cepas de bacterias lácticas no producen AB. Evaluar
el riesgo potencial de una acumulación de AB en el vino en una etapa temprana de la
producción, ayudará a controlar mejor el proceso de fermentación con el fin de disminuir
la contaminación. El método consiste en detectar los microorganismos que poseen las
enzimas decarboxilasas de aminoácidos y la desaminasa de la agmatina. El resultado no
puede indicar las concentraciones finales de AB, pero el riesgo de contaminación por AB
está relacionado con la presencia de genes y con el nivel de la población de bacterias.
(Lucas et al., 2008).
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3. DETECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE AB:
3.1 Extracción de ADN
3.1.1. Extracción a partir de un cultivo bacteriano:
Se prepara el ADN a partir del cultivo puro. Se recogen células de 2 mL de cultivo (de
preferencia en fase exponencial) mediante centrifugación a 13 000 g durante 15 minutos.
El precipitado se pone en suspensión en un tampón TE de 600 µL (Tris-HCl 10mM, EDTA
1mM) con lisozima (10mg/mL) y se incuba a 37 °C durante 30 min. Después se continúa
la extracción usando kits disponibles según las instrucciones del fabricante. Pero la
extracción puede realizarse también con el protocolo usual como sigue: se agrega un
volumen de fenol cloroformo isoamilalcohol (25:24:1) y la mezcla se centrifuga a 13 000
g durante 15 min. Se recoge la fase superior y se precipita con etanol a 99%. Se seca el
precipitado y se vuelve a suspender en el tampón TE.
3.1.2. Extracción de ADN a partir de bacterias de muestras de vino para PCR y qPCR:
Se extrae el ADN de las muestras de vino según Lucas et al. (2008). Las células de
levaduras liofilizadas se agregan a una población final de 107 células/mL a las muestras
de vino para facilitar la recuperación de microorganismos endógenos y de su ADN. Se
recogen los microorganismos de una muestra de vino de 10-ml mediante centrifugación a
5300 x g durante 15 min. Una vez lavado el precipitado con 1 ml de tampón Tris-EDTA
(10 mM de Tris clorhidrato [pH 8.0], 1 mM EDTA) se pone en suspensión en 300 µl del
mismo tampón y se le añade 200 µl de perlas de vidrio de 0.1 mm de diámetro. Las
células se rompen con una agitación vigorosa teniendo cuidado de enfriar el tubo. El
lisado de células se mezcla con 300 µl de solución de lisis y 200 µl de solución para la
precipitación proteica, luego se deja en hielo durante 5 minutos. Los restos de célula y
las proteínas se precipitan por centrifugación durante 3 minutos a 10000 x g. Un
volumen de 600 µl de sobrenadante se mezcla con 100 µl de una solución de
polivinilpirrolidona a 10% y se centrifuga durante 10 min a 10000 x g. Se recoge el
sobrenadante y los ácidos nucleicos se precipitan con isopropanol. El precipitado celular
lavado una vez con etanol 70% se seca y se disuelve en 20 µl de agua estéril.
3.2 Detección de cepas específicas productoras de AB
3.2.1 Condiciones de la PCR:
La amplificación mediante PCR se realiza en una mezcla de reacción de 25 l que
contenga 12.5 ng de ADN patrón, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM KCl, 2.5 mM Mg Cl 2,
200 M de cada dNTP, 1 M de cada primer, y 1 U de ADN polimerasa. Las secuencias de
primers oligonucleótido para la amplificación mediante PCR de fragmentos internos de los
genes que codifican las enzimas histidina, tirosina y ornitina decarboxilasas, así como la
agmatina deiminasa , han sido diseñadas por varios grupos de investigación (véase Tabla
1).
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Las reacciones se llevan a cabo en un sistema PCR siguiendo los parámetros de ciclo que
se indican en la Tabla 2.
Los productos amplificados son analizados mediante electroforesis en un gel de agarosa
de 1.5% y se revelan con UV después de la tinción con bromuro de etidio.
3.2.2 Aplicaciones:
3.2.2.1 Cepas productoras de histamina
El gen hdcA que codifica la enzima histidina decarboxilasa (HDC; EC 4.1.1.22) se detecta
por amplificación. Entre las cepas productoras de histamina se han aislado algunas de
Pediococcus (Landete et al., 2005) y Oenococcus oeni (Coton et al., 1998a). No es una
característica general de estas especies, lo que explica porqué en otros estudios no se
han encontrado cepas de O. oeni productoras de aminas biógenas (Constantini et al.,
2006; Moreno-Arribas y Polo, 2008).
3.2.2.2 Detección de cepas productoras de tiramina
La tirosina decarboxilasa (TDC, EC 4.1.1.25) está más presente en lactobacilos
heterofermentativos (principalmente Lactobacillus hilgardii y Lactobacillus brevis)
(Moreno-Arribas et al., 2000). Lucas y Lonvaud-Funel (2002) diseñaron una serie de
primers degenerados para la detección de fragmentos de gen tdc en cepas L. brevis. Más
recientemente, se diseñaron nuevos primers (Marcobal et al., 2005; Constantini et al.,
2006; Lucas et al., 2003).
3.2.2.3 Cepas productoras de putrescina
La ornitina decarboxilasa (ODC, EC 4.1.1.17) cataliza la conversión de ornitina en
putrescina. Marcobal et al., (2004) describieron la identificación de un gen de ornitina
decarboxilasa (odc) en una cepa de O. oeni productora de putrescina. Varias series de
primers que detectan específicamente cepas de O. oeni productoras de putrescina han
sido propuestos por Marcobal et al., (2005) y Granchi et al., (2006). Pero la putrescina
también se puede formar por desaminación de la agmatina. Lucas et al., (2007)
describieron las secuencias de los primers que amplifican el gen correspondiente.
3.3 Detección simultánea de varias bacterias productoras de aminas biógenas
mediante PCR multiplex
3.3.1 Condiciones de la PCR:
Para la PCR multiplex las condiciones son las mismas que las descritas previamente,
pero la concentración adecuada de primers necesarios debe optimizarse. Las reacciones
se llevan a cabo en un sistema PCR utilizando los parámetros de ciclo descritos en la
Tabla 2. Los productos amplificados son analizados mediante electroforesis de gel como
se ha descrito anteriormente
3.3.2. Aplicaciones:
Los métodos de amplificación multiplex permiten disminuir la cantidad de reactivo, los
costes, el trabajo y el tiempo, porque se detectan varios genes simultáneamente. Esto es
apropiado para el rastreo rutinario de bacterias lácticas productoras de AB en el vino. Los
ensayos de PCR multiplex para la detección de decarboxilasas en alimentos y bebidas
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fermentados, incluyendo el vino, han sido descritos por Constantini et al. (2006), Coton y
Coton (2005), De las Rivas et al. (2006) y Marcobal et al. (2005). Por ejemplo, Marcobal
et al. (2005) seleccionaron tres pares de primers para un ensayo de PCR multilplex para
la detección simultánea de cepas de bacterias lácticas que producen potencialmente
histamina, tiramina y putrescina.
4-CUANTIFICACIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE AMINAS BIÓGENAS EN EL
VINO MEDIANTE Q-PCR (PCR CUANTITATIVA)
Un método qRT-PCR para detectar y cuantificar las bacterias productoras de histamina,
tiramina y putrescina en los vinos se describe en Lucas et al. (2008) y Nannelli et al.
(2008).
4.1. Extracción de ADN:
El ADN se extrae de las muestras de vino como se ha descrito en 3.1.2.
4.2 Condiciones para la amplificación por PCR cuantitativa
Los primers aparecen en la tabla 3.
Las reacciones de 20 μl se realizan en la mezcla de reacción que contiene 10 pmol
de cada primer, un décimo del ADN purificado de una muestra de vino (2 μl de una
preparación de ADN de 20-μl) y 10 μl 2 × SyBr Green Mix. La amplificación se efectúa
con el programa de ciclos siguiente: 5 min a 95 °C, 40 ciclos (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C
y 30 s a 72 °C), seguidos por análisis de la curva de fusión. La temperatura de fusión de
los productos de amplificación y el ciclo umbral (CT) se calculan automáticamente.
Figura 1: Curvas estándar de PCR cuantitativa
para la detección de BAL productoras de tiramina
y putrescina. Los patrones son ADN purificado de
muestras de vino inoculadas con bacterias lácticas
1–106 UFC/ml que poseen el gen para TDC
(diamantes, punteado), AgDI (círculos, línea
sencilla) u ODC (triángulos, línea punteada). Los
valores de umbral de ciclo (CT) son promedios de
tres réplicas. Las ecuaciones de curva estándar y
los coeficientes de correlación fueron,
Log10 UFC.mL-1
.
para
TDC:
y = −1·3141
Ln(x) + 35·612,
R2 = 0·997,
para
AgDI:
y = −1·3837
Ln(x) + 35·374,
R2 = 0·995,
para ODC: y = −1·444 Ln(x) + 33·745, R2 = 0·999
TDC: Tirosina-descarboxilasa
AgDI: Agmatina-deiminasa
ODC: Ornitina-descarboxilasa
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Figura 2: Curva estándar de PCR
cuantitativa obtenida con ADN de
células de bacterias lácticas HDC+
diluidas en serie en vino estéril con
levaduras añadidas. Los valores CT
son promedios de los resultados de
tres réplicas. El coeficiente de
correlación (R2) fue 0.996.
Log10 UFC.mL-1
Tabla 1 Primers de oligonucleótido para la detección de bacterias lácticas productoras de
aminas biógenas en el vino
Nombre del primer Secuencia 5′→3′ de primer
Referencia
Primers diseñados para la detección de BAL productoras de histamina en el vino
HDC3
GATGGTATTGTTTCKTATGA
Coton y Coton (2005)
HDC4
CAAACACCAGCATCTTC
Coton y Coton (2005)
Primers diseñados para la detección de BAL productoras de tiramina en el vino
41
CAYGTNGAYGCNGCNTAYGGNGG
Marcobal et al. (2005)
42
AYRTANCCCATYTTRTGNGGRTC
Marcobal et al. (2005)
TD5
CAAATGGAAGAAGAAGTAGG
Coton et al. (2004)
TD2
ACATAGTCAACCATRTTGAA
Coton et al. (2004)
Primers diseñados para la detección de BAL productoras de putrescina en el vino
4
ATNGARTTNAGTTCRCAYTTYTCNGG
Marcobal et al. (2005)
15
GGTAYTGTTYGAYCGGAAWAAWCAYAA
Marcobal et al. (2005)
OdF
CATCAAGGTGGACAATATTTCCG
Granchi et al. (2006)
OdR
CCGTTCAACAACTTGTTTGGCA
Granchi et al. (2006)
AGDIfor
AGDIrev
GAACGACTAGCAGCTAGTTAT
Lucas et al. (2007)
CCAATAGCCGATACTACCTTG
Lucas et al. (2007)
K=G o T; R=A o G; W=A o T; Y=C o T; S=C o G; M=A o C; D=A, G, o T; N=A, G, C, o T.
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Tabla 2 Condiciones PCR usadas para detectar las bacterias lácticas productoras de aminas biógenas en el vino
Gen
Serie de primers
hdc
tdc
odc
agdI
Paso 1 PCR
Paso 2
PCR
Paso 3 PCR
Número
de
ciclo
Referencia
HDC3/HDC4
Tamaño
del
amplímero
(pb)
440
95 ºC, 30s
52 ºC, 30s
72 ºC, 2 min
35
Coton y Coton (2005)
41/42
213
95 ºC, 30s
52 ºC, 30s
72 ºC, 2 min
30
Marcobal et al., (2005)
TD5/TD2
1133
95 ºC, 30s
52 ºC, 30s
72 ºC, 2 min
35
Coton et al. (2004)
4/15
972
95 ºC, 30 s
52 ºC, 30s
72 ºC, 2 min
30
Marcobal et al., (2005)
OdF/OdR
500
95 °C, 30s
54°C,30s
72°C, 2min
27
Granchi et al., (2006)
AGDIfor/AGDIrev
542
95 ºC, 30s
55 ºC, 30s
72 ºC, 2 min
35
Lucas et al. (2007)
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Tabla 3: Secuencias de primers utilizadas en qPCR para la cuantificación de bacterias
productoras de histamina, tiramina y putrescina en los vinos. (Lucas et al., 2008;
Nannelli et al., 2008)
Nombre del
primer
hdcAf
Secuencia 5’3’
hdcAr
5'-AATTGAGCCACCTGGAATTG
Tirosina
decarboxilasa
tdcf
5'-CAAATGGAAGAAGAAGTTGG
tdcr
5'-GAACCATCAGCA ACAATGTG
Deiminasa de
agmatina
agdif
5'-ATGCCCGGTGAATTTGAA
agdir
5'-TTGCGC TGGTTTAGCACC
Ornitina
decarboxilasa
odcf
5'-TGCA CTTCCATATCCTCCAG
odcr
5'-GAATTTCTGGAGCAAATC CA
Gen
Histidina
decarboxilasa
5'-ATGAAGCCAGGACAAGTTGG
Longitud del
amplímero
84 bp
103bp
90bp
127bp
Referencias
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