Tesis - Universidad de Colima

Universidad de Colima
Facultad de Medicina
“NUEVAS RUTAS DE PERMEABILIDAD FORMADAS
POR PARÁSITOS INTRACELULARES EN LA
MEMBRANA PLASMÁTICA DE CÉLULAS DE
MAMÍFERO HUÉSPED”
Tesis que para obtener el grado de:
Maestra en Ciencias Fisiológicas con Especialidad
en Farmacología
Presenta:
Q.F.B. Mayra Delgado Ramírez
Asesor: Dra. Oxana Dobrovinskaya Romanovna
Co-asesor: Dr. Igor Pottosin Zhidkova
Colima Col., junio 2009.
Este trabajo lo dedico a Aldo Sebastián por
acompañarme durante toda la realización del mismo,
te amo hijo.
AGRADECIMIENTOS
Por su amor y apoyo incondicional
A mis padres: Socorro y Vicente
A mi esposo: Aldo
A mis hermanos: Claudia, Soco y Vicente
Por los conocimientos compartidos, guía y apoyo
Dra. Oxana Dobrovinskaya Romanovna
Dr. Igor Pottosin Zhidkova
M. en C. Osval Montesinos López
Dr. Edgar Bonales Alatorre
Dra. Georgina Valencia Cruz
Proyecto apoyado por:
CONACYT
A todos
“GRACIAS”
ÍNDICE
Contenido
ÍNDICE
Pag.
i
ÍNDICE DE FIGURAS
iii
ÍNDICE DE TABLAS
iV
ÍNDICE DE ANEXOS
V
ABREVIATURAS
Vi
RESUMEN
Viii
ABSTRACT
iX
INTRODUCCIÓN
1
I. ANTECEDENTES
1.1 Malaria (Paludismo
3
1.1.1 Plasmodium y su Ciclo de vida
4
1.2 Tripanosomiasis americana ó “Enfermedad de Chagas
6
1.2.1 Trypanosoma cruzi y su ciclo de vida
7
1.3 Nuevas Rutas de Permeabilidad (NPPs)
12
1.3.1 Funciones fisiológicas de las NPPs
14
1.4 Caracterización electrofisiológica de las NPPs
16
II. JUSTIFICACION DEL PROYECTO
26
III. HIPÓTESIS
27
IV. OBJETIVOS
27
V. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Cultivo primario de cardiomiocitos
28
5.2 Infección de células para registro electrofisiológico
29
5.3 Microscopía
30
5.4 Registro electrofisiológico
30
5.5 Análisis Estadístico
31
VI. RESULTADOS
6.1 Observaciones Generales
32
6.1.1 Sobre las células de registro
32
6.1.2 Registros de patch-clamp en configuración de célula completa
sobre células controles e infectadas con Trypanosoma cruzi
6.1.3 Variación temporal de corrientes espontáneas en células control
6.2 Efecto de la infección con Tripanosoma cruzi sobre la densidad y
ocurrencia de diferentes corrientes iónicas.
6.2.2 El efecto de Mg
registrados
en
40
42
42
6.2.1 Corriente entrante y saliente espontánea
2+
33
intracelular sobre corrientes espontáneas
cardiomiocitos
no-infectados
e
infectados
con
44
Tripanosoma cruzi
VII. DISCUSIONES
47
VIII. CONCLUSIONES
53
IX. PERSPECTIVAS
54
X. ANEXOS
55
XI. BIBLIOGRAFÍA
71
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Representación esquemática de los diferentes estados de
la fase asexual intraeritrocitica del ciclo de vida del
parásito de P. falciparum
Fase de epimastigoto y tripomastigoto metacíclico de T.
cruzi
Fases de tripomastigoto sanguíneo y amastigotos de T.
cruzi.
Ciclo de vida del parásito T. cruzi
Primeras evidencias electrofisiológicas de NPPs
Registro de patch-clamp en la configuración del parche
escindido (inside-out) del canal aniónico de la rectificación
saliente en eritrocitos controles.
Registros de patch-clamp en su configuración de célula
completa de eritrocitos humanos no infección e infectados
con P. falciparum
Corrientes reportadas por Huber y col. (2002).
P. falciparum induce la activación de canales aniónicos
sensibles a volumen en eritrocitos humanos
Corriente transitoria
Tipos de corrientes iónicas registradas en miocitos
cardiacos control de rata neonatal
Determinación de selectividad de la corriente con
activación dependiente de tiempo utilizando el protocolo
del registro de “colas”.
Efecto producido por estrés hipotónico en la corriente
saliente espontánea
Efecto del estrés hipotónico sobre la corriente con
activación tiempo dependiente
La densidad de corrientes espontáneas en células control
a diferentes tiempos en cultivo
Densidad de corrientes espontáneas en células control e
infectadas con T. cruzi en dos puntos temporales
Efecto del Mg2+ intracelular sobre la ocurrencia y densidad
de corrientes espontáneas
Efecto del Mg2+ intracelular sobre ocurrencia y densidad
de la corriente con activación dependiente de tiempo
4
9
10
12
17
19
20
22
23
34
36
37
39
40
41
43
45
46
ÍNDICE DE TABLA
Tabla 1
Pruebas de normalidad para la variable respuesta
Densidad de corriente I (pA/ pF).
60
Pruebas de normalidad para la variable respuesta
Tabla 2
Densidad de corriente I (pA/ pF) bajo la influencia
62
+2
del Mg el tamaños de muestra.
Promedios (media y mediana) de las densidades
Tabla 3
de corriente entrantes en 11 y 16 días de
66
infección y significancia estadística.
Promedios (media y mediana) de las densidades
Tabla 4
de corriente saliente en 11 y 16 días de infección
67
y significancia estadística
Promedios (media y mediana) de las densidades
Tabla 5
de
corrientes
espontáneas
y
significancia
68
estadística con y sin Mg2+
Promedios (media y mediana) de la densidades
Tabla 6
de corriente Tiempo dependiente y significancia
2+
estadística con y sin Mg
69
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1
Fotografía de Miocitos cardiacos de 8 días en cultivo sin
infección con Trypanosoma cruzi. Tinción Giemsa, 40X.
55
Fotografía de Miocitos cardicos infectados con Trypanosoma
Anexo 2
cruzi, infección temprana. 16 días en cultivo, 8 días
de
56
infección.
Anexo 3.
Fotografía
de
miocitos
cardiacos
infectados
con
Trypanosoma cruzi. 16 días en cultivo, 8 días de infección.
Fotografía
de
miocitos
cardiacos
infectados
57
con
Trypanosoma cruzi muestra la liberación del parásito
Anexo 4. intracelular (infección tardía). 16 días en cultivo, 8 días de
58
infección. Liberación de tripomastigotes tripomastigotes al
espacio extracelular. Tinción Giemsa, 40 X
Anexo 5.
Anexo 6.
Anexo 7.
Anexo 8.
Trazos de las corrientes en miocitos de rata recién nacida
infectados con Tripanosoma cruzi.
Pruebas de normalidad para la comparación de las corrientes
iónicas en células control e infectadas
Pruebas de normalidad para la efecto del Mg2+ sobre las
corrientes espontáneas y tiempo dependiente
Análisis de varianza unifactorial por rangos, de KruskalWallis.
Anexo 9. Análisis de varianza bifactorial por rangos, de Friedman
Anexo
10.
Anexo
11.
Anexo
12
Comparación de la densidad de corrientes de células control
con células infectadas.
Efecto del Mg2+ sobre las corrientes espontáneas y
dependiente de Tiempo.
Corrientes transitorias (It) en miocitos cardiacos aislados de
rata neonata de diferentes días de edad.
59
60
61
62
64
66
68
70
ABREVIATURAS
9-A-C: 9 - antraceno ácido carboxílico
ATP: adenosina trifosfato
CFTR: regulador de conductancias de transmenbrana en fibrosis quística.
ClC-2: segundo miembro de la familia de canales de cloro activados por voltaje
CLC descubierto. ClC-n, Canal de cloro-2.
DIDS: 4,4ʼ, diisotiocianatostilbene-2,2ʼ-ác. disulfónico.
DMEM: medio Dulbeco modificado de Eagle, medio de cultivo celular
DTE: Di-tioeritrito
Fr: Friedman, prueba estadística
I.A.: infección aparente
I.N.A.: Infección no aparente
IRC: canal anión de rectificación entrante.
KW: Kruskal-Wallis, prueba estadística
ms: milisegundos (unidad de medida tiempo)
NMDG-Cl: cloruro de N-metil-D-glucamina.
NPPB: 5-Nitro-2-(3-fenylpropylamino) ácido benzoico.
NPPs: Nuevas Rutas de Permeabilidad
P: p- valu, significancia estadística 5%.
pA: picoamperios (unidad de medida de corriente eléctrica)
P. falciparum: Plasmodium falciparum
Pfemp1: proteina de membrana en eritrocitos de plasmodium falciparum 1.
(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1)
PKA: proteincinasa A
pS: picosimens (unidad de medida de conductancia ionica)
PSAC: canal anión de superficie plasmodial (Plasmodial Surface anion channel).
SCC: canal anión de conductancias pequeñas
SEM: promedios ± su error estándar de la media
t-BHP: Tert- butilhydroperoxido
T. cruzi.: Trypanosoma cruzy.
V/mV: Voltios/ milivoltios
Vm : Potencial de membrana
RESUMEN
Las nuevas rutas de permeabilidad (new permeation pathways, NPP)
provocadas en la membrana de la célula huésped por un parásito intracelular,
facilitan el intercambio de solutos entre la célula infectada y su exterior. Hasta la
fecha, las NPP han sido estudiadas solamente en los eritrocitos infectados con
Plasmodium falciparum. En el presente trabajo hemos aplicado la técnica de
patch-clamp
para
estudiar
las
corrientes
aniónicas
en
los
cultivos
de
cardiomiocitos intactos e infectados con Trypanasoma cruzi. En las células sanas
encontramos dos corrientes aniónicas espontáneas con rectificación entrante y
saliente, respectivamente, y una corriente saliente con activación dependiente del
tiempo. Estas corrientes son reguladas de manera diferente por el estrés
hipotónico y Mg2+ intracelular. Detectamos un aumento significativo (2 veces o
más) de las corrientes espontáneas y del porcentaje de las células que expresan
la corriente con activación dependiente del tiempo en las fases avanzadas de la
infección.
ABSTRACT
New permeation pathways (NPP) are induced by intracellular parasites in
the plasma membrane of host cells, to facilitate the exchange of solutes between
the cell and its exterior. Up to date, NPP were studied only in erythrocytes infected
with Plasmodium falciparum. In this study we have applied patch-clamp technique
to characterize anionic currents in healthy cardiomyocytes and those infected with
Trypanasoma cruzi. Two instantaneous anionic currents, an outward and an
inward one, as well as an outward time-dependent current were revealed in healthy
cardiomyocytes. These currents were differentially regulated by hypotonic stress
and intracellular Mg2+. In advanced phases of the infection a significant, 2-fold or
more, increase of instantaneous currents as well as of the relative occurrence of
the time-dependent current were detected.
Nuevas Rutas de Permeabilidad formadas por parásitos
intracelulares en la membrana plasmática de células de mamífero
huésped.
INTRODUCCIÓN
La mayoría de las enfermedades causadas en el humano son debidas a
microorganismos
patógenos.
Se
ha
estimado
que
las
enfermedades
infeccioso/parasitarias constituyen el 25% de la carga global de enfermedades
(Murray y López, 1996). Parásitos intracelulares tales como Plasmodium spp el
cual invade a eritrocitos y hepatocitos, Trypanosoma cruzi (T. cruzi) que infecta
miocitos cardiacos principalmente, Theileria spp y Babesia spp los cuales infectan
a leucocitos y eritrocitos respectivamente y Toxoplasma spp que puede sobrevivir
en cualquier célula nucleada, son ejemplos de parásitos intracelulares, los cuales,
en mayor o menor grado, dependiendo de la especie, son responsables de
determinado índice de morbimortalidad en el mundo. Se estima que anualmente
500 millones de personas sufren de malaria causada por Plasmodium falciparum
(P. falciparum), y que de estas mueren entre
2-3 millones, sobre todo niños
menores de 5 años de edad en África sub-Sahariana (Snow et al., 2005).
La tripanosomiasis americana, o enfermedad de Chagas, causada por T. cruzi, es
considerada como la tercera causa de enfermedad infecciosa/parasitaria más
frecuente en Latinoamérica. Su prevalencia es estimada en 16 a 18 millones de
casos (Teixeira et al., 2006; Sierra-Johnson et al., 2005).
La forma intracelular de estos parásitos los ha obligado a desarrollar
eficientes vías moleculares en sus células huésped que les garanticen la
sobrevivencia, diferenciación y replicación dentro de las mismas, asegurando
también la conservación de la integridad de la célula de huésped hasta el
momento de diferenciación completa de los parásitos y sus liberación.
Los patógenos o parásitos dentro de una célula mamífera tienen que
adaptarse o modificar el medio intracelular de acuerdo a sus necesidades. Se
provocan cambios del volumen de la célula huésped como resultado de la
multiplicación del parásito. Por otro lado, la nutrición del parásito y la liberación de
productos tóxicos de su metabolismo, requerirán un incremento en el transporte de
solutos a través de la membrana plasmática de la célula huésped. Si las rutas de
transporte de la célula huésped no satisfacen las necesidades de los parásitos o
patógenos, estos tiene que inducir nuevas rutas de transporte. En el caso de la
invasión de eritrocitos por P. falciparum se ha observado que la permeabilidad de
la membrana esta aumentada considerablemente para diferentes solutos e iones,
cuando el parásito se encuentra intracelularmente. A las vías responsables de
estos incrementos de permeabilidad de la membrana eritrocitaria se les ha dando
el nombre de “Nuevas Rutas de Permeabilidad” y actualmente son de gran interés
clínico por dos razones: como posibles blancos quimioterapéuticos en el
tratamiento de la malaria y como posibles rutas capaces de transportar los
fármacos al interior de la célula (Hubert et al., 2005).
La idea del presente trabajo está basado en los estudios de las Nuevas
Rutas de Permeabilidad inducidas por P. falciparum en eritrocitos cuando se
encuentra en la fase intracelular. El objetivo principal consistió en explorar si otro
parásito intracelular tal como T. cruzi causa cambios en la permeabilidad de la
membrana de células cardiacas infectadas por este.
I. ANTECEDENTES
1.1 Malaria (Paludismo)
Malaria (o Paludismo) es la enfermedad parasitaria que más afecta a los
seres humanos causada por el parásito del genero Plasmodium. Existen 4
especies de Plasmodium que son infecciosas para el humano: P. falciparum, P.
ovale, P. malariae y P. vivax. P. falciparum es el responsable de la gran mayoría
de muertes por malaria (Kirk, 2001). Se estima que anualmente 500 millones de
personas sufren de malaria causada por P. falciparum y que de estas mueren
entre 2-3 millones, sobre todo niños menores de 5 años de edad en el África subSahariana, siendo esta la región con mayor número de muertes por paludismo. La
enfermedad es endémica de la mayor parte de regiones tropicales, incluida gran
parte de Sudamérica, Centroamérica, África, Medio Oriente, India, sureste de Asia
y Oceanía (Rosenthal y Goldsmith, 2008; Snow et al., 2005).
La malaria por P. ovale es menos común y se restringe al oeste de África,
la malaria causada por P. malariae esta distribuida por todo el mundo pero es
poco frecuente y la malaria por P. vivax es la más dispersa y la infección por esta
especie es raramente fatal (Renu, 2007).
Las manifestaciones clínicas de la malaria comienzan con un pródromo de
cefalea y fatiga, seguido por fiebre. El paroxismo palúdico típico incluye
escalofríos, fiebre elevada y luego transpiración. Los episodios febriles casi
siempre son irregulares sobre todo en la enfermedad temprana, pero sin
tratamiento se tornan regulares con ciclos de 48h. Los síntomas frecuentes son la
cefalea, malestar, mialgias, artralgias, tos, dolor torácico, dolor abdominal,
anorexia, náusea, vómito y diarrea (Rosenthal y Goldsmith, 2008).
1.1.1 Plasmodium y su ciclo de vida
El humano es infectado con P. falciparum por la picadura de la hembra
infectada de un mosquito Anopheles. De aproximadamente 400 especies de
Anopheles en el mundo, sólo 60 son vectores bajo condiciones naturales y de
estas 30 son las de mayor importancia (Renu, 2007). El parásito se aloja en las
glándulas salivales del insecto en un estado de su ciclo de vida conocido como
esporozoítos y transmitido mediante la picadura del insecto al humano,
moviéndose rápidamente del sitio de inyección o permaneciendo ahí por horas y
liberándose lentamente hacia la circulación (Renu, 2007; Kirk, 2001). Mediante el
sistema circulatorio llega al hígado invadiendo los hepatocitos para su replicación
asexual y permanece en ellos de 9-16 días en un estado conocido como
esquizogonia exo-eritrocítica (Renu, 2007). Cada esporozoíto da lugar a cientos
de miles de merozoítos dentro de los hepatocitos los cuales eventualmente son
liberados hacia la circulación sanguínea en donde comienzan a invadir a los
eritrocitos. La esquizogonia eritrocítica es un proceso complejo (Fig. 1) que puede
dividirse en varias fases: a) fase de reconocimiento y
Figura 1. Representación esquemática de los diferentes estados de la fase
asexual intraeritrocítica del ciclo de vida del parásito de P. falciparum. Esta
fase comienza con la invasión del eritrocito por un merozoíto (a), el parásito engloba una porción
de citosol del eritrocito punto en el cual es referido como estado de anillo (b), de esta última fase el
parásito se desarrolla hasta convertirse en trofozoíto; el eritrocito pierde su apariencia discoide
bicóncava y comienzan a aparecer los “botones” en su superficie (c), el parásito se subdivide para
producir de 20-30 merozoítos hijos (d), después de 48 h post-invasión los parásitos se liberan del
eritrocito (e) y comienza un nuevo ciclo. (Tomado de Kirk, 2001).
adhesión a la membrana de los eritrocitos; b) reorientación y formación de uniones
entre la terminal apical del merozoíto y la liberación de sustancias que conlleven a
la formación de la vacuola parasitoforous; c) invaginación de la membrana del
eritrocito alrededor del merozoíto; d) resellado de la vacuola parasitoforous y de la
membrana del eritrocito después de haber completado su infección. El parásito es
encerrado en la vacuola y permanece en un estado aparentemente inactivo (fase
de anillo), 15 h post-invasión comienza un incremento progresivo de la actividad
metabólica y biosintética, y el parásito entra en estado de trofozoíto, durante esta
fase el eritrocito pierde su apariencia característica de liso y bicóncavo, pequeñas
protrusiones conocidas como “botones” aparecen en la superficie de la membrana.
Los “botones” son sitios de localización de proteínas derivadas del parásito, un
ejemplo de ellas es la conocida Pfemp1 (P. falciparum erythrocyte membrane
protein 1) las cuales son proteínas integrales de la membrana, que tienen
implicaciones en el fenómeno de cito-adherencia y variación antigénica (Kirk,
2001). La integración de estas proteínas a la membrana del eritrocito produce
marcadas alteraciones y reorganización de la fase lipídica de la membrana, así
también algunas modificaciones en las proteínas de la membrana del eritrocito
(Hsiao et al., 1991; Maguire et al., 1991; Simoes et al., 1990; Schwartz et al.,
1987). Aproximadamente a las 40 h post-invasión, el trofozoíto entra en estado de
esquizonte, etapa en la que el esquizonte se subdivide para formar 20-30
merozoítos hijos (Fig.1), de los cuales algunos diferenciaran a micro y
macrogametocitos (gametocitogénesis; masculino y femenino respectivamente),
mismos que trasmitirán la infección a nuevos huéspedes mediante el mosquito
Anopheles femenino. Generalmente la gametocitogénesis toma de 10-12
semanas. Los merozoítos hijos son liberados a las 48 h post- invasión y cada uno
de estos es capaz de infectar a otros eritrocitos y continuar con el ciclo. La fase
sexual del ciclo se realiza en el mosquito y es iniciada cuando este ingiere
gametocitos de individuo infectado (Renu, 2007).
Durante su ciclo de vida el parásito invade los eritrocitos del huésped vertebrado
con lo que logra evadir al sistema inmune. Sin embargo el interior del eritrocito
representa un medio ambiente altamente inusual para el parásito, el cual tiene que
confrontarse a altas concentraciones de K+ y proteínas, bajos niveles de Na+ y
trazas de Ca2+. El parásito debe tener los mecanismos necesarios para la
obtención de los nutrientes del citosol de la célula huésped, remoción de sus
residuos y lograr sobrevivir, lo que implica procesos que regulen los mecanismos
de transporte de membrana para el flujo de solutos a través de ella (Kirk, 2001).
1.2 Tripanosomiasis americana ó “Enfermedad de Chagas”
La enfermedad del Chagas es la condición clínica provocada por la
infección con el parásito T. cruzi, un protozoario flagelado, transmitido por vectores
de la subfamilia Triatominae. Se ha estimado que entre 16 y 18 millones de
personas están infectadas con este parásito en Latinoamérica y que de ellas
morirá una tercera parte a causa de la enfermedad de Chagas. Se estima que
37.5% de los pacientes infectados desarrollan la enfermedad de Chagas cardiaca
seguida de muerte, 58% desarrollan infartos al miocardio y muerte, y un 4.5% de
las muertes han sido asociadas a megacolon o megaesófago (Teixeira et al.,
2006). La enfermedad de Chagas se ha colocado como el tercer padecimiento
parasitario más frecuente en Latinoamérica (Sierra-Johnson et al., 2005). En
México según el Centro Nacional de Transfusiones sanguíneas, 8 millones de
mexicanos estarían infectados con tripanosomiasis. La cifra supera a la de los 200
mil que viven con VIH (según ONISIDA MÉXICO) y es semejante al número de
diabéticos, que va de 6.5 a 10 millones (de acuerdo con la Fundación Mexicana de
Diabetes).
Existen tres fases características de esta parasitosis: aguda, crónica e
indeterminada. La fase aguda se caracteriza por la presencia del parásito (forma
tripomastigoto) en la sangre del paciente huésped y los síntomas que pueden
presentarse son: fiebre persistente acompañada por lesiones cutáneas (chagoma),
manifestaciones
oculares
(signo
de
Romaña),
linfadenopatía,
carditis,
alteraciones en el sistema nervioso central, dolor muscular, somnolencia, diarrea,
disturbios respiratorios, cianosis y coma (Terixeira et al., 2006; Coll et al., 2004).
La enfermedad frecuentemente es confundida con otras enfermedades febriles y
el paciente sigue sin diagnóstico y un tratamiento apropiado. En esta fase mueren
el 10% de los enfermos, los niños menores de 2 años de edad y personas
inmunocomprometidas, por meningoencefalitis o miocarditis. La mayoría de las
personas infectadas curan espontáneamente (desaparecen manifestaciones
clínicas). Si no hay sospecha clínica o medios de diagnósticos accesibles, no
se reconoce la fase aguda, única susceptible de resolverse con el tratamiento
antiparasitario existente (benznidazol), que afecta la forma extracelular (SierraJohnson et al., 2005). En este periodo el parásito invade los tejidos, principalmente
el tejido cardiaco y los músculos, y se presenta en la forma intracelular
(amastigoto). En general, al terminar (“curar”) la fase aguda de la enfermedad,
empieza una forma indeterminada de ésta, en la cual están presentes anticuerpos
anti-T. cruzi, pero sin ninguna manifestación clínica (Texeira et al., 2006; SierraJohnson et al., 2005; Coll et al., 2004; Miles et al., 2003). Alrededor del 30% de
personas
infectadas con T. cruzi puede desarrollar la forma crónica de la
enfermedad, en la cual se afecta corazón, tracto digestivo con enfermedad mega
en vísceras
huecas, o el sistema nervioso periférico, generalmente con una
evolución inexorable hacia fatales complicaciones.
1.2.1Trypanosoma cruzi y su ciclo de vida.
T. cruzi, el agente etiológico de la enfermedad de Chagas pertenece a la
clase Kitnetoplastea, la familia Trypanosomatidae caracterizada por la presencia
de un solo flagelo y una sola mitocondria. Una parte de su genoma se encuentra
ordenado en una compleja y compacta red denominada cinetoplasto, que puede
contener de 10-20% del DNA total en la célula (Silber et al., 2005; Becerril y
Romero, 2004). El genero de Trypanosoma incluye a la especie T. cruzi y también
a T. brucei rhodesiense y T. brucei gambiense, causantes de la Tripanosomiasis
africana o enfermedad del sueño (Becerril y Romero, 2004; Jawetz et al., 2002).
Al menos 40 especies de Triatominos son portadoras de T. cruzi y todas son
vectores potenciales de infección (Teixeira et al., 2006), mientras que T. brucei es
transmitida por la mosca tse-tsé (Glossina).
T. cruzi posee cuatro estados básicos de desarrollo caracterizados por su
morfología y comprendidos en dos fases, una en el vector invertebrado y otra
en el huésped mamífero y son las siguientes: epimastigoto, amastigoto (ambas
formas replicativas), tripomastigoto metacíclico y tripomastigoto sanguíneo (ambas
formas infectivas). Las diferentes formas se distinguen entre sí por la posición del
cinetoplasto en relación al núcleo y por la presencia o ausencia de una membrana
ondulante.
a) Epimastigoto. Se encuentra en el intestino del vector invertebrado. Es
de aspecto
fusiforme de
20 a 40 µm de
longitud. En el epimastigoto el
cinetoplasto se encuentra localizado en la parte media del organismo justo por
delante del núcleo. El flagelo emerge de la parte media del parásito y forma una
membrana ondulante más pequeña que la observada en los tripomastigotos. En
este estado morfológico se multiplica en el intestino de los triatominos de
manera profusa para dar lugar a los tripamastigotos metacíclicos (Fig. 2A)
(Silber et al., 2005; Becerril y Romero, 2004).
b) Tripomastigoto metacíclico. (Del griego “trypo”-perforar, refiriéndose a
la propiedad de esta célula de pegarse al vidrio por un punto mientras realiza
movimientos rotatorios y “mastis”-látigo para flagelo). Tiene una forma alargada
y mide de 20 a 25 µm de longitud. Se distingue un núcleo vesiculoso y hacia
la parte posterior de éste se halla el cinetoplasto de forma casi siempre esférica.
El flagelo, con su membrana ondulante, se observa a lo largo del cuerpo del
parásito y surge libremente en el extremo posterior (Fig. 2B) (Becerril y Romero,
2004).
Figura 2. Fase de epimastigoto y tripomastigoto metacíclico de T. cruzi. A.
Fase de epimastigoto
Imagen obtenida
utilizando microscopía
de
barrido electrónico. B.
Tripomastigoto metacíclico de T. cruzi. Imagen obtenida utilizando microscopía
de
barrido
electrónico. Tomado de www.cdfound.to.it
c) Amastigoto. (Del griego “a”-sin y “mastis”-látigo para flagelo). Es la
forma replicativa intracelular en el huésped y la que lo distingue de otros
miembros
del
género. Esta
forma
proviene
de la
diferenciación de los
tripomastigotes, tanto metacíclico como sanguíneo, y tiene la capacidad de
infectar otras células. Posee una forma redondeada llamada leishmanoide,
mide de 2 a 2.5 µm, aunque algunos autores reportan de 2.4 a 6.5 µm de
diámetro (Silber et al., 2005), su flagelo está secuestrado dentro de una bolsa
visible, según lo revela el microscopio electrónico, y presenta un gran núcleo y
cinetoplasto (Becerril y Romero, 2004).
d) Tripomastigoto sanguíneo. Es la forma no replicativa e infectiva para
el insecto vector y el mamífero, y el efecto de la diferenciación del amastigoto;
puede infectar a nuevas células o pasar al vector invertebrado y cerrar así el ciclo
de vida del parásito. El cinetoplasto se encuentra localizado posterior al núcleo,
usualmente en la porción más posterior del parásito. El flagelo sale del extremo
posterior y se dobla hacia delante a lo largo del cuerpo del parásito, formando una
membrana ondulante a lo largo de todo el parásito y emerge en forma libre en su
extremo anterior (Becerril y Romero, 2004).
Figura 3. Fases de tripomastigoto sanguíneo y amastigotos de T. cruzi. A.
Tripomastigoto sanguíneo en muestra de sangre periférica de un paciente infectado en fase
aguda. Se utilizó la tinción de
Giemsa, magnificación original de 1000x. B. Amastigotos en
miocitos cardiacos de un paciente en fase crónica teñidos con Hematoxilina-eosina magnificación
original 1000x. La flecha indica el cinetoplasto. Tomado de Bern et al., 2007.
El vector (triatomino) se infecta en el momento en el que consume sangre
de algún mamífero infectado con T. cruzi. Los tripomastigotos sanguíneos, se
alojan en el intestino del triatomino y desarrollan hasta epimastigotos por fusión
binaria hasta diferenciarse en tripomastigotos metacíclicos que pasan a alojarse
en la porción distal del intestino del insecto. Cuando el triatomino se alimenta,
defeca dejando expuesta la materia fecal con los parásitos cerca del lugar de
laceración inducida por la probóscide del insecto al alimentarse. La materia fecal
puede ser arrastrada por las patas del triatomino y el parásito introducirse a través
de la laceración o bien, el mismo huésped puede infectarse a sí mismo al llevar
las deyecciones de la piel, hacia alguna mucosa o a la conjuntiva ocular (Teixeira
et al., 2006; Becerril y Romero, 2004). El humano también se puede infectar por
transfusión sanguínea y por recepción de órganos.
Los tripomastigotos metacíclicos, una vez dentro del mamífero y después
de
pasar la barrera de la piel, mucosas o conjuntiva ocular, se introducen a través
de un lisofagosoma en las
células del tejido celular cercano al sitio de
penetración, lo que les toma aproximadamente 1 h. Una vez en el espacio
intracelular, se liberan del lisofagosoma y, en aproximadamente 30 h, todos los
tripomastigotos metacíclicos se han diferenciado a la forma proliferativa
(amastigoto), los cuales se multiplican por fisión binaria. Aproximadamente 96 h
después, los amastigotos comienzan a diferenciarse a tripomastigotos, su elevado
número causa la muerte y destrucción de la célula infectada, y los parásitos se
liberan a la circulación sanguínea (Silber et al., 2005), aunque se ha sugerido su
salida de la célula sin causarle daño inmediato (Becerril y Romero, 2004).
Después de llegar al torrente sanguíneo, pueden infectar nuevas células y
diseminarse por vía hematógena por todo el organismo, en donde pueden invadir
casi cualquier célula. El ciclo
biológico se completa cuando un triatomino se
alimenta de un mamífero infectado y adquiere al parásito (Becerril y Romero,
2004).
Variables tales como los intervalos de tiempo entre la picadura del insecto y
la defecación del mismo, el número y volumen de las evacuaciones por unidad de
tiempo, el número de parásitos eliminados, el porcentaje de las formas infectivas y
su capacidad de penetración, así como la intensidad del prurito causado por la
picadura, son algunos determinantes para contraer la infección (Coura-Rodriguez,
2007). El ciclo de vida completo del T. cruzi es ilustrado en la figura 4.
Figura
4.
Ciclo
de
vida
del
parásito
T.
cruzi.
Tomado
de
http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/
1.3 Nuevas Rutas de Permeabilidad (NPPs)
La caracterización de los cambios de permeabilidad inducidos por parásitos
intracelulares comenzó en 1970, con el estudio de los cambios de permeabilidad
en eritrocitos infectados con P. falciparum usando los métodos de absorción de
solutos radiomarcados y ensayos de hemólisis (revisado en: Staines et al., 2007).
Ginsburg et al. (1983) observaron un incremento en la absorción de varios solutos
en eritrocitos infectados con P. falcipaum, sugiriendo que esto podía ser debido a
una nueva vía de transporte a la cual llamaron nuevas rutas de permeabilidad
(New Permeability Pathways or NPPs).
En la actualidad el término NPP ha evolucionado para referirse a cualquier
poro, canal o transportador, que altere (incremente) la permeabilidad de la
membrana de la célula huésped de un parásito. Hasta el momento no se han
comprobado con exactitud si las NPP son vías endógenas, derivadas o
modificadas por el parásito. Sin embargo, son utilizadas como nuevas rutas de
captura de nutrientes y eliminación de residuos producidos por el parásito,
regulación
del
volumen
de
la
célula
huésped
y
modificación
de
las
concentraciones intracelulares de iones (Staines et al., 2007; Staines et al., 2006;
Staines et al., 2003). Las NPPs se manifiestan después de 10-20 h posteriores a
la infección del eritrocito con P. falciparum, tienen una amplia especificidad y son
permeables a una amplia gama de iones monovalentes inorgánicos y orgánicos
(cationes y aniones), zwitteriones y no electrolitos (Kirk, 2001).
Las NPP pueden ser bloqueadas por una amplia gama de compuestos,
entre los más potentes furosemida y ácido benzoico 5-nitro-2-3-fenilpropilamonio y
varios derivados, los cuales tienen una grupo carboxilo como cabeza de la
molécula y una cadena (cola) hidrofóbica (Kirk y Horner, 1995).
La energía de activación de transporte de solutos vía la NNPs se estima en
10-11Kcal/mol (Staines et al., 2001), no discriminan entre formas enantioméricas
(L- y D-alanina, D- y L-glucosa, D- y L-adenosina) (Upston y Gero, 1995; Kirk et
al., 1994; Elford et al., 1990) y muestran diferente sensibilidad para los
enantiómeros R y S de algunas arilaminobenzoatos ópticamente activos (Kirk y
Horner, 1995).
La tasa de transporte a través de la membrana de eritrocitos infectados está
incrementada para monosacáridos y otros pequeños polioles, aminoácidos,
péptidos, nucleósidos, para varios monocarboxilados, pequeños compuestos de
amonio cuaternarios, aniones inorgánicos monovalentes y cationes (Huber et al.,
2005). Se ha reportado que al menos a concentraciones fisiológicas las NPPs no
son saturables para cationes orgánicos tales como: colina (Kirk, 1992; Elford et al.,
1990), adenosina y timidina (Kirk et al., 1994) y al anión monovalente pantotenato
(Saliba et al., 1998). En general presentan mayor selectividad a aniones. Mediante
técnicas no electrofisiológicas las han caracterizado como canales aniónicos
(Decherf et al., 2004), muestran preferencia por aniones y por solutos
electroneutros en comparación con los cationes. El Cl- permea algunos órdenes de
magnitud más grande que los cationes inorgánicos como Na+, K+ y Rb+, con un
amplio rango para solutos cargados y no cargados (Kirk et al., 1994). La tasa de
permeabilidad es influenciada por el tamaño y la hidrofobicidad del soluto, las
NPPs muestran preferencia a permear solutos de tamaño pequeño (Kirk, 2001).
La permeabilidad a cationes es dependiente de la naturaleza del anión presente
en el medio, incrementando en el siguiente orden: Cl-<Br-<I-<NO3-<SCN- (Staines,
1998; KirK et al., 1995), en contraste la tasa de absorción de un poliol no cargado,
sorbitol y lactato anión monovalente decrece ligeramente al remplazar el Cl- por
NO3- del medio de suspensión (Kirk et al., 1995; Staines, 1998; Staines et al.,
2001).
1.3.1 Funciones fisiológicas de las NPPs
a) Absorción de nutrientes
Se cree que una de las funciones más importantes de las NPPs es la de
hacer llegar los nutrientes necesarios al parásito intracelular. La membrana del
eritrocito en condiciones normales tiene una capacidad de trasporte limitada para
sustratos metabólicos y bio-sintéticos requeridos por el parásito intracelular
(Ginsburg et al., 1985; Elford et al., 1985) ya que el eritrocito no sintetiza
proteínas, DNA o membranas y tiene muy pocas necesidades de aminoácidos,
ácidos nucleicos o lípidos. Pero la replicación del Plasmodium necesita
extensamente de estos nutrientes y la inducción de las NPPs asegura que el
parásito se supla de estos compuestos en los cuales podemos incluir: glucosa,
utilizada de 40 a 100 veces más en los eritrocitos infectados (Huber et al., 2005),
purinas, isoleucina; metionina, glutamina, glutamato, cistina, prolina, tirosina, ácido
pantoténico (Divo et al; 1985), así como colina (Ancelin y Vial, 1989). Glutamato y
ácido pantoténico no son transportados por la membrana normal del eritrocito.
b) Eliminación de residuos
Las NPPs, además de la función de absorción de nutrientes probablemente
tienen la función de servir como vías de eliminación de residuos metabólicos del
eritrocito infectado. Se sabe que compuestos como lactato (Cranmer et al., 1995;
Kanaani y Ginsburg, 1991) y glutatión oxidado (Atamna y Ginsburg, 1997) son
eliminados por las NPPs en los eritrocitos infectados.
c) Regulación del volumen y balance iónico.
La proliferación intra-eritrocitica del parásito y la generación de productos
residuales generados por el parásito inducen cambios en el volumen del eritrocito
(Kirk, 2001).
Durante el desarrollo intracelular del parásito la permeabilidad catiónica
incrementa, mostrando una secuencia de selectividad Cs+> Rb+> K+> Na+, en
paralelo a un decremento de actividad de la bomba de Na+/K+ posterior a las 36 h
post-invasión, lo cual continúa a un progresivo reemplazo de iones de K+ por iones
de Na + en el citosol y el colapso del gradiente químico para Na+ y K+ a través de la
membrana del eritrocito. La perdida de este gradiente induce la absorción de NaCl
y agua, resultando en un hinchamiento celular (Staines et al., 2001; Tanabe et al.,
1986). Como consecuencia, los eritrocitos infectados por trofozoítos o eschizontes
están propensos a alcanzar un volumen lítico, hemolizando al eritrocito antes de
que los parásitos alcancen su estado maduro. Sin embargo, la hemólisis
prematura es prevenida por acciones parasitarias y del mismo eritrocito huésped
exportando los aminoácidos derivados de la digestión de la hemoglobina por el
parásito, al espacio extracelular (Lew et al., 2003; Lew and Hockaday, 1999). El
parásito digiere 65% de la hemoglobina de la célula huésped pero utiliza solo
cerca del 16% (Krugliak et al., 2002; Rudzinska et al., 1965), el resto de
aminoácidos derivados de la digestión de la hemoglobina son eliminados hacia el
plasma sanguíneo a través de las NPPs (Krugliak et al., 2002), y como
consecuencia la expansión del volumen y la hemólisis del eritrocito se retardan
hasta que el parásito termina su desarrollo.
1.4 Caracterización electrofisiológica de las NPPs
Se sabe desde hace algunas décadas, que la infección de los eritrocitos
humanos con P. falciparum induce cambios en la permeabilidad de la membrana
del eritrocito hospedero, mediante NPPs, las cuales han sido caracterizadas como
canales aniónicos selectivos que también pueden ser permeables a solutos
catiónicos y electro-neutros (Staines et al., 2003).
Desai et al. (2000) fueron los primeros en mostrar mediante registros
electrofisiológicos con la técnica de patch-clamp en su configuración de célula
completa, que algunas corrientes aniónicas son de 100 a 150 veces más grandes
en los eritrocitos infectados con P. falciparum que en los no infectados (Fig. 5).
Las corrientes inducidas por parásitos eran más pequeñas a potenciales de
membrana (Vm) positivos que a potenciales negativos (rectificación entrante). Su
estudio de selectividad revelo que estas corrientes tienen una fuerte preferencia
para aniones sobre cationes, mostrando una secuencia de selectividad: SCN-> I- >
Br- >Cl- > acetato- > lactato- > glutamato-. Estas corrientes se han inhibido por: 32
µM NPPB (92 ± 2%), 78 µM (87%) niflumato (87%), 100 µM glibenclamida (85 ±
8%), 100 µM furosemida (83 ± 2%), 100 µM DIDS (7%) y por 50 µM floridzin en el
interior de la pipeta (75 ± 2%). En estudios posteriores (Alkhalil et al., 2004)
usando configuración “cell-attached” (célula adherida) con alta concentración de
Cl- (1.15M Cl-) en el baño y en la pipeta, describieron un canal con la conductancia
de 20 pS, con selectividad aniónica y una probabilidad de apertura muy baja a
potenciales positivos (Vm) consistentes con la rectificación entrante de las
corrientes registradas en la configuración de célula completa. Ya que este canal
no es observado en eritrocitos no infectados, sugieren que este canal es de origen
plasmodial y lo llamaron PSAC (Plasmodial Surface Anion Channel), aunque
tampoco se excluye la posibilidad de que PSAC sea una proteína endógena
activada o modificada por P. falciparum. Para asegurar su origen plasmodial,
Alkhalil et al. (2004) estudiaron las propiedades funcionales de diferentes aislados
de parásitos genéticamente divergentes y mostraron las diferencias en las
características del canal en eritrocitos del mismo donador infectados con los
diferentes aislados del parásito, lo que los llevo a concluir que PSAC está
codificado por el genoma de Plasmodium.
Figura 5. Primeras evidencias electrofisiológicas de NPPs. Registros de patchclamp, en configuración de célula completa: a, eritrocitos no infectados, a la izquierda la respuesta
a un pulso de -70 mV, a la derecha su relación corriente voltaje; b, eritrocito infectado, el trazo de
la izquierda corresponde a la respuesta a un pulso de -70 mV, el del centro al la aplicación de
pulsos desde -80 a 80 mV con incrementos de 20 mV, el trazo de la derecha ha sido obtenido
después de la adición de 125 µM furosemida a la solución del baño; c, curva corriente-voltaje antes
(círculos cerrados) y después (círculos abiertos) de la adición de 125 µM de furosemida a la
solución del baño. Solución de baño mM: 115 NaCl, 10 MgCl2, 5 CaCl2, 20 Na-HEPES, pH 7.4).
(Modificado de Desai et al., 2000).
Entonces Desai et al. (2000) propusieron el modelo del canal único (single
channel model) responsable del cambio de la permeabilidad de la membrana de
glóbulos rojos causado por P. falciparum. En este modelo se propone, que el canal
PSAC es un derivado del parásito y es permeable para diferentes aniones,
cationes y solutos orgánicos (revisado en: Staines et al., 2007) Sin embargo, los
resultados de estudios realizados por otros grupos de investigación llevaron al
desarrollo de los modelos de canales múltiples (multi-channel models) donde, en
diferencia con el modelo de Desai et al., (2000) se propone que la infección causa
la modificación de varios canales endógenos.
Egée et al. (2002) y Bouyer et al. 2006 reportaron corrientes similares a las
registradas por Desai et al. (2000), las cuales también mostraban una rectificación
entrante y la densidad de la corriente similares. Estos investigadores utilizaron
concentraciones fisiológicas de Cl- (155 mM) y observaron una actividad
espontánea de tres diferentes tipos de canales unitarios en eritrocitos infectados:
un canal aniónico con rectificación entrante (IRC) y conductancias entre 12 y 18
pS, un segundo canal aniónico de conductancia pequeña (SCC), 4 – 5 ps
(conductancias muy cercanas a las calculadas para PSAC en condiciones
fisiológicas, 3 pS) y un tercer canal aniónico que mostraba una rectificación
saliente (Bouyer et al., 2006). Egée at al. (2002) también mostró una corriente
saliente (fig. 6), con conductancia de ~12 pS que se encontró en menos del 5 %
de los parches de células no infectadas y nunca se observó en células infectadas.
Este último canal fue inhibido de 90-100% por los bloqueadores de canales de
cloro (NPPB, DIDS, 9-A-C) puestos sobre la cara interna de la membrana. La
presencia de PKA y ATP no induce activación de este tipo de canal. Bajo las
condiciones del estudio IRC y SCC se encontraron presentes en >95% de las
células infectadas y ambos canales mostraron la misma secuencia de selectividad
(I- > Br- > Cl-) y además se obtuvieron la inhibición total de ambos canales con 100
µM NPPB, 100 µM ácido niflúmico y 10 µM tamoxifen (Egée et al., 2002).
Sin embargo, Bouyer et al. (2007), realizaron un estudio, en el cual
demostraban que el canal SCC bajo condiciones iónicas suprafisiológicas (1.115
M) tiene las mismas conductancias y tipo de activación que PSAC, por lo que este
último es señalado como la correlación suprafisiológica del SCC. Ellos también
sugirieron que bajo condiciones fisiológicas el 80% de la conductancia de la
membrana es debida al canal IRC y el 20 % a SCC, en cambio en condiciones
suprafisiológicas la conductancia es exclusivamente por SCC (PSAC) puesto que
el canal IRC funcionalmente es apagado.
Figura 6. Registro de patch-clamp en la configuración del parche escindido
(inside-out) del canal aniónico de la rectificación saliente en eritrocitos
controles. A. Ejemplo de trazos de corriente de un eritrocito no infectado mostrando rectificación
saliente. B. Relación corriente-voltaje. (Tomado de Egée et al., 2002).
Las características farmacológicas de las corrientes registradas en la
configuración de célula completa en condiciones fisiológicas (predominantemente
IRC) muestran más alta sensibilidad a NPPB y furosemida que las producidas en
condiciones suprafisiológicas (SCC-PSAC). Estas últimas son inhibidas por Zn2+,
sugiriendo que SCC-PSAC es un canal ClC-2 (Bouyer et al., 2006). ClC-2 ha sido
identificado en la membrana plasmática de eritrocitos humanos y se ha mostrado
también que este canal puede ser activado por la oxidación (1 mM tertbutilhydroperoxido, t-BHP) en eritrocitos y activado en eritrocitos que han sido
infectados con P. falciparum. La inhibición del ClC-2 promueve el incremento del
volumen celular de los eritrocitos infectados, lo que sugiere que el eflujo de Cl- a
través de estos canales aniónicos contribuye a la regulación del decremento del
volumen en los eritrocitos infectados por P. falciparum (Huber et. al., 2004).
Sin embargo se ha mostrado que el IRC puede ser activado en eritrocitos
no infectados con P. falciparum por PKA (100 µM) / ATP (10 mM) presentes en la
solución de pipeta, en la presencia de teofilina (100 µM) aumentando la
conductancia de la membrana 40 veces más que la mostrada por las células no
estimuladas (Fig. 7). En las células infectadas la adición de PKA/ATP no tiene
efectos aditivos. Estos investigadores también observaron que estas corrientes de
Cl- podían ser evocadas por la aplicación de succión a parches quiescentes
(Bouyer et al., 2006; Egée et al., 2002).
Figura 7. Registros de patch-clamp en su configuración de célula completa
de eritrocitos humanos no infectados e infectados con P. falciparum. Trazos
de corrientes en eritrocitos no infectados bajo condiciones control (A) o después de adicionarle
PKA 100 nM a la solución de la pipeta (B). C. Trazos de corriente en eritrocitos infectados en
solución de baño de NMDG-Cl (pulsos de voltaje entre -100 y 100 mV, en incrementos de 10 mV).
D Relación corriente-voltaje (promedio ± error estándar) para eritrocitos: control (círculos abiertos),
después del tratamiento con PKA (triángulos abiertos), en células infectadas con NMDG-Cl en
solución de baño (círculos cerrados) y con NaCl en la solución de baño (cuadrados cerrados)
(Tomado de Egée at al., 2002).
Otro estudio publicado en el 2002 por Huber et al. y subsecuentes estudios
(revisado en: Huber et al. 2005) mostraban resultados diferentes. Sus registros en
célula completa sugieren al menos cuatro tipos distintos de las vías conductivas
inducidas por el parásito. Tres de estas son permeables a aniones y una es
permeable a cationes. Dos de las conductancias aniónicas muestran una
rectificación entrante, la tercera muestra una rectificación saliente (Fig.8). Las
corrientes de rectificación entrante mostraron baja sensibilidad a los inhibidores:
NPPB, furosemida, DIDS, glibenclamida, con (IC50s) de >1 µM; >10 µM >100 µM;
>1 mM respectivamente, que las de rectificación saliente: (IC50s) 100 nM NPPB; 110 µM DIDS, glibenclamida, furosemida (Huber et. al., 2002). Una de las
corrientes aniónicas de rectificación entrante fue atribuida al canal de cloro
activado por hinchamiento, ClC-2 (Fig.9), y señalan que estos no son necesarios
para la sobreviviencia del parásito dentro de un eritrocito infectado (Huber at al.,
2004). Estos investigadores también han propuesto que los canales que muestran
rectificación saliente son transportadores de solutos orgánicos a través de la
membrana de células infectadas. A demás, este grupo de investigadores encontró
que conductancias similares a las de las células infectadas pueden ser activadas
en células no infectadas por el estado redox inducido por el agente reductor DTE
(di-tioeritritol, 100 µM) en la membrana de los eritrocitos.
Verloo et al. (2004) encontraron que los incrementos en las conductancias
observados en registros en patch-clamp en configuración de célula completa están
ausentes en eritrocitos infectados con P. falciparum de donadores con fibrosis
cística homocigotos para la delección en la posición ∆F508 (CFTR∆F508/∆F508)
mutación presente en el 90% de los pacientes con fibrosis cística. CFTR
(regulador de conductancias transmembranales en fibrosis cística), es un canal de
cloro y en eritrocitos es el responsable de la conductancia de cloro endógena.
CFTRs muestran una relación lineal en la curva I-V y se expresan funcionalmente
en eritrocitos de individuos sanos pero no en los eritrocitos de individuos con
fibrosis cística. Verloo et al. encontraron también que CFTR es adicionalmente
requerido para la activación de una conductancia de cloro de rectificación entrante
en células huésped infectadas con P. falciparum soportando así un modelo dual
en el cual CFTR y una conductancia aniónica de rectificación entrante tienen una
identidad molecular independiente pero con una estrecha relación funcional.
Verloo et al. demostrarón también que estas conductancias no son necesarias
para la sobrevivencia del parásito en la célula huésped ya que los parásitos se
desarrollan normalmente en eritrocitos de donadores con fibrosis cística. Por lo
tanto, para el transporte de solutos en una célula infectada debería existir un canal
o poro distinto.
Figura 8. Corrientes reportadas por Huber y col. (2002). Registros de patch-clamp
en configuración de célula completa. A. Trazos de corriente de eritrocitos humanos no infectados
con P. falciparum (izquierdo), trazos de corrientes en eritrocitos infectados mostrando una corriente
entrante (centro) y trazos de corrientes salientes (derecha). B. Relación corriente-voltaje cada uno
de los tipos de corriente mostrados control, corriente entrante y corriente saliente. Las corrientes
fueron evocadas por la aplicación de pulsos cuadrados entre -100 y 100 mV desde un potencial de
mantenimiento de -30 mV (-10mV). La solución de baño: 115 mM de NaCl, 20 mM HEPES/NaOH
pH 7.4, 5mM CaCl2, 10 mM MgCl2. Solución de pipeta: 115 mM de NaCl, 20 mM HEPES/NaOH pH
7.4, 10 mM MgCl2, 0.5 mM de EGTA. (Tomado de Huber et. al., 2002).
Adicionalmente a los estudios electrofisiológicos, Ginsburg y Stain (2004),
realizaron un análisis de todos los datos disponibles de estudios no
electrofisiológicos (ensayos de flujo de radiomarcados y ensayos de hemólisis) del
cual ellos concluyen que las NPPs consisten sólo de dos tipos de canales. De uno
de ellos se presentan cuatro copias por célula y es carga y tamaño selectivo,
mediando el transporte de solutos orgánicos y cationes. El otro tipo es cerca de
100 veces más abundante (300-400 por célula), es selectivo para aniones y
nucleósidos (timidina y adenosina). Ellos también propusieron que el canaltransportador de aniones no es indispensable para la supervivencia del parásito.
En cambio, los canales permeables a los solutos orgánicos y cationes si son
requeridos para la supervivencia del parásito.
Figura 9. P. falciparum induce la activación de canales aniónicos sensibles a
volumen en eritrocitos humanos. A y B muestran trazos de registro electrofisiológicos
(configuración “célula completa”) en no infectadas y en eritrocitos infectados con P. falciparum,
respectivamente. Izquierdo: en solución de baño isotónico (control); al centro: en solución de baño
hipertónico; derecha: solución de baño hipótonico. Las corrientes fueron evocadas por 10 pulsos
de voltaje (400 ms) desde -100 mV a 80 mV con el voltaje de mantenimiento de -10 mV. La
corriente cero es indicada por la línea gris. En C y D se muestra la inhibición de la corriente
entrante por 1 mM ZnCl2 en un eritrocito humano infectado. El continuo hinchamiento celular fue
inducido por combinación de solución hipertónica de pipeta (170 mM NMDG-Cl) con solución en
baño isotónica (140 NMDG-Cl). (Modificado de Huber et al., 2004).
En estudios electrofisiológicos en eritrocitos humanos sanos se han
caracterizado tres diferentes tipos de canales catiónicos. Uno de ellos es un canal
de K+ activado por Ca2+, conocido como canal Gardos (Grygorcezyk et al., 1983;
Hamill, 1998), el cual es independiente de voltaje, pero dependiente de la
concentración de Ca2+ libre en el medio intracelular. El canal Gardos genera
corrientes de rectificación entrante, con conductancia de ~25 pS (a 0 mV). El
segundo es el canal catiónico no selectivo, dependiente de voltaje con
conductancia de ~ 20 pS, activado por potenciales despolarizante de la membrana
(Christophersen y Bennekou, 1991); este canal es permeable para cationes
divalentes Ca2+, Ba2+ y Mg2+. El tercer canal es un canal catiónico no selectivo
(Cs+ > K+> Na+> Li+> NMDG+), dependiente de Cl- , el cual es activado cuando se
remueve los iones Cl- del medio extracelular (Duranton et al., 2002).
En eritrocitos infectados con P. falciparum
se ha demostrado que los
canales Gardos no están activados (Kirk et al., 1992), debido a una fuga
moderada de Ca2+ a través de la membrana de la célula huésped (Staines et al.,
1999), a la actividad de la ATPasa de Ca2+ (Tiffert et al., 2000) y a la absorción de
Ca2+ por el parásito (Tanabe et al., 1982; Leida et al., 1981), ya que este requiere
de los iones Ca2+ durante su fase intraeritrocitica. Al mismo tiempo la corriente
generada por el canal catiónico dependiente de Cl- es 7 a 8 veces mayor en
eritrocitos infectados que en los no infectados (Duraron et al., 2004).
En conclusión, los grupos de investigadores han llegado a los siguientes
consensos sobre las NPPs: 1) La permeabilidad alterada de los eritrocitos
infectados con P. falciparum implica el transporte de diversos solutos, son
predominantemente
anión-selectivas.
2)
La(s)
vía(s)
responsables
son
canales/poros que incrementa su actividad cuando el parásito intracelular está en
estado maduro. 3) En registros en configuración de “célula completa” sobre
eritrocitos infectados con parásitos en estado maduro o de trofozoítos bajo
condiciones isotónicas y en ausencia de suero, la conductancia es mucho más
grande que en células no infectadas y es predominantemente una corriente de
rectificación entrante y selectiva a aniones. 4) La adición de suero o albumina a
células infectadas durante registro de patch-clamp en la configuración de célula
completa en patch-clamp induce una corriente de rectificación saliente, anión-
selectiva que es inhibida por NPPB y dantrolen. 5) El registro de canal unitario en
configuración
de
célula
adherida,
a
concentración
iónica
fisiológica
y
suprafisiológica muestra un canal anión de rectificación entrante. 6) La oxidación
de células no infectadas, induce una permeabilidad a sorbitol, la cual es similar a
los cambios de permeabilidad inducidos por la infección con P. falciparum,
incluyendo su inhibición por NPPB (Revisado en: Staines et al., 2007).
II. JUSTIFICACION DEL PROYECTO
Los estudios de NPPs inducidos por la infección de eritrocitos con P.
falciparum han mostrado que cuando el parásito se encuentra en su célula
huésped, se generan o incrementan corrientes iónicas en comparación con los
eritrocitos sanos. En su mayoría las NPPs son selectivas para aniones (Staines et
al., 2007). Además se desarrolla un aumento en la permeabilidad para gran
cantidad de solutos a través de la membrana del eritrocito infectado. Se cree, que
en conjunto son solutos necesarios para el crecimiento, desarrollo y diferenciación
del parásito (Kirk, 2001). La importancia de poder determinar cuáles son estas
vías radica en que podrían servir como blancos quimioterapéuticos
en el
tratamiento de la malaria como posibles rutas capaces de transportar los fármacos
al interior de la célula y eliminar el parásito de forma intracelular (Hubert et al.,
2005).
En el caso de la enfermedad del Chagas, no se cuentan con opciones
quimioterapéuticas para eliminar al T. cruzi en su forma intracelular (amastigoto)
de las células del huésped. Los miocitos cardiacos son los principales blancos
para este parásito (Leal et al., 1999). Teniendo como referencia los estudios
realizados con P. falciparum en eritrocitos, nos lleva a pensar que la permeabilidad
aniónica de la membrana plasmática de los miocitos cardiacos infectados con T.
cruzi también se cambia durante el desarrollo de la infección y diferenciación del
parásito.
III. HIPÓTESIS
La permeabilidad de la membrana plasmática de células cardiacas de rata
recién nacida es alterada por la infección de T. cruzi, provocando un aumento en
las conductancias al ión de Cl-.
IV. OBJETIVO
Utilizando miocitos ventriculares de rata recién nacida y la técnica de patchclamp,
explorar
si
existen
diferencias
-
(específicamente para el ión Cl )
en
la
permeabilidad
aniónica
de la membrana plasmática entre células
cultivadas con y sin infección con T. cruzi.
4.1 Objetivos específicos:
1.- Establecer y estandarizar un modelo experimental que incluye: cultivo
primario de cardiomiocitos, mantenimiento y reproducción del parásito T. cruzi
(tripomastigoto), infección de cardiomiocitos con tripomastigotos y cultivo de
células
infectadas,
establecimiento
de
condiciones
para
los
registros
electrofisiológicos con células intactas e infectadas por T. cruzi.
2. Utilizar la técnica de patch-clamp en configuración de célula completa
para el registro de las corrientes iónicas y comparar su identidad y magnitud en
cardiomiocitos intactos e infectados por T. cruzi.
V. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Cultivo primario de cardiomiocitos
El presente protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de rata recién
nacida se elaboró con base al análisis y estandarización de los protocolos
descritos anteriormente por otros autores (Karwatowska-Prokopczuk et al., 1998;
Chlopčíková et al., 2001). Se utilizaron ratas de 3-5 días de edad de la cepa
Spragüe Dawley, las ratas fueron anestesiadas por inhalación de cloroformo, una
vez anestesiadas, el cuerpo de la ratas se limpió con alcohol a 70% y se procedió
a realizar la disección (en condiciones estériles) de la parte media hacia el ápex
del corazón el cual fue cortado y colocado rápidamente en una solución de
disección HBSS que contenía en mM: 116 NaCl, 5.4 KCl, 0.8 MgSO4, 1.0
NaH2PO4, 20 HEPES, 5.5 glucosa (todos reactivos de SIGMA) y suplementado
con 100 U/ml penicilina, 100 µg/ ml streptomicina y 25 µg/ml anfotericina
(Invitrogen), pH 7.3, osmolaridad 263 mOsmoles/kg H2O). Los trozos de corazón
fueron adicionalmente cortados a tamaños de 1-2 mm de grosor con la ayuda de
unas pinzas y de un bisturí, los trozos se lavaron nuevamente en solución de
HBSS y fueron colocados en 5 ml de solución de digestión (tripsina 0.25% con
deoxirribunucleasa 0.1 mg/ml) y puestas en agitación continua por 5 minutos a 37°
C, al termino de los 5 minutos se les adicionó 5 ml de medio de cultivo completo
(5% suero fetal bobino, 10% suero de caballo, suplementado con antibiótico
antimicótico, 4:1 DMEM:199). Se realizó disgregación mecánica con la ayuda de
una pipeta de 10 ml aspirando y expulsando los trozos de tejido por 15 veces, el
tejido se colocó en una nueva porción (5 ml) en solución de digestión y se puso en
agitación continua a 37° C por 10 minutos, al termi no de los diez minutos se le
adicionaron 10 ml de medio de cultivo y el procedimiento de disgregación
mecánica se repitió nuevamente. El tejido se colocó en nueva porción de solución
de digestión, en agitación a 37° C por 10 minutos l as veces necesarias hasta la
disgregación completa. Los sobrenadantes, producto de cada etapa de
disgregación se centrifugaron a 1000 rpm durante 6 minutos a 28° C, las células
sedimentadas fueron resuspendidas en 100 µl de HBSS y puestas en 5 ml de
medio de cultivo en cajas petri para cultivo de tejidos e incubadas a 37° C y 5%
CO2, una vez que el tejido fue disgregado completamente el contenido de todas
las cajas petri reunidas, se centrífugaron nuevamente a 1000 rpm por 6 min y se
resuspendieron en 10 ml de HBSS y fueron centrifugadas nuevamente, las células
fueron resuspendidas en 100 µl de HBSS y colocadas en 10 ml de medio de
cultivo en caja petri de 10 ml para cultivo de tejido e incubadas por 3 h a 37° C y
5% CO2. Posteriormente a las 3 h, las células para experimentos de
electrofisiología se sembraron en un placa de 24 pozos, 2 ml/pozo, en
concentración 1x105 células por ml sobre coverslip de 12 mm de diámetro
previamente tratados con poly-L-lisina. Para inhibir el crecimiento de fibroblastos,
los cultivos fueron incubados con 5µg/ml D-arabinofuronidasa por 3 días. En caso
de cultivo de mantenimiento y reproducción de parásito, las células se sembraron
en cajas de 6 pozos, 3 ml/pozo.
5.2 Infección de células para registro electrofisiológico.
Se utilizó la cepa CH4 de T. cruzi, los parásitos se recolectaron de los
cultivos primarios de mantenimiento y reproducción de parásitos (apartado 5.1), el
medio de cultivo que contenía los parásitos se centrífugo por 15 minutos a 4° C a
14,000 rpm, los parásitos se resuspendieron en 1 ml de medio de cultivo y se
contabilizaron en cámara de Neubawer. La infección de las células para registro
electrofisiológico se realizó en proporción parásito-célula: 20:1 y en algunos
cultivos 30:1. Los cultivos se infectaron con un mínimo de 5 días de edad y se
mantuvieron con cambios de medio cada tercer día hasta el día de registro
electrofisiológico.
5.3 Microscopía
Se realizó microscopía de una muestra de células no-infectadas de 8 días
de cultivo y otra de células infectadas (8 días de cultivo más 8 días de infección).
Las células fueron fijadas con metanol por 10 minutos, posteriormente la tinción se
realizó con solución Giemsa (10% Giemsa solución madre y 6% metanol, disueltos
en agua) por 40 minutos, finalmente las muestras fueron lavadas con solución
HBSS. Las muestras fueron fijadas sobre porta objetos para corte histológico y
fueron observadas en un microscopio ZEISS, Axioplan 2 imaging, con la
combinación de filtros Nº 25 y 100 gris, objetivos CP- ACHROMAT 40 X / 0.65 y A
PLAN 20 X /.45 Ph 2. Se utilizó una cámara Axio Cam MRc5 para la captura de
imágenes.
5.4 Registro electrofisiológico
Los registros electrofisiológicos se realizaron a temperatura ambiente. Las
micropipetas para el registro y diálisis intracelular se fabricaron a partir de
capilares de borosilicato Kwik-Fil 1B150F-4 (Wolrd Precision Instrumens, Inc), en
un estirador de microelectrodos Brown/Flamming modelo P-97 (Sutter Instruments
Co, Novato, CA) y una microforja tipo LPZ 101 (List Medical, Germany). Se
utilizaron micropipetas
con resistencias entre 1-3 MΩ. La composición de la
solución de la pipeta fue en mM: 112 NMDG, 112 HCl, 10 glucosa, 5 EGTA, 10
HEPES, ajustando el pH a 7.4 y la osmolaridad de solución a 290 mOsmoles/kg
H2O con sorbitol; en algunos experimentos se adiciono 3 mM de Mg+2 a la solución
de la pipeta o 4 mM de ATP. La composición de la solución de baño en mM: 1
MgCl2, 2 CaCl2, 34 NMDG, 34 HCl, 3.4 Glucosa, 10 HEPES (pH 7.4) con
osmolaridades de 230 (hipotónica) y 290 (isotónica) mOsmoles/kg H2O. En
algunos experimentos se emplearon soluciones de baño conteniendo 5 ó 118
NMDG-Cl. Los registros electrofisiológicos se realizaron mediante la técnica de
patch-clamp en su configuración de célula completa. El protocolo de registro
utilizado consistió de tres pulsos a partir de un potencial de mantenimiento de -40
mV se aplicó un pulso a -80 mV, seguido de pulsos en un rango entre -150 y 110
mV en intervalos de 20 mV y un pulso final de -80 mV. La duración de los pulsos
varió según las características de las corrientes (véase escalas en figuras). Se
utilizó un amplificador de patch-clamp AXOPATCH 200A (Axon Instruments,
Foster City; CA), las corrientes se filtraron con un filtro de Bessel pasabajos a 5
KHz. La generación de pulsos, la adquisición y procesamiento de datos se realizó
en computadora personal, con un convertidor A/D (DigiData 1200, Axon
Instruments Co., CA, U.S.A.) y el programa de adquisición y procesamiento de
datos pClamp (versión 6.0, Axon Instruments Co. U.S.A.). Los datos fueron
analizados con los programas en ClampFit (Axon Instruments) v. 9 y Grafit 3.01
(Erythacus Software, Ltd).
5.5 Análisis Estadístico
Para el análisis estadístico se utilizó el programa Statististical Analysis
System (SAS), se utilizaron las pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk,
Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises y Anderson-Darling a un nivel de
significancia de 5%, en base a estas se optó por pruebas no paramétricas para la
comparación de tratamientos (anexo 6 y 7, tablas 1 y 2), se emplearon la prueba
de Kruskal-Wallis (KW) (anexo 8) para la comparación de corrientes espontáneas
en condiciones control e infectadas y para comparar las densidades de corriente
evocadas en presencia y ausencia de 4 mM ATP en solución interna.
La prueba
de Friedman (Fr) (anexo 9) para el análisis de corrientes espontáneas y
dependientes de tiempo en condiciones control e infectadas con o sin Mg+2 en la
pipeta. Las comparaciones de medias se realizaron con el procedimiento de Dunn,
usando el macro % Dunn para SAS propuesto por Juneau 2004. Para la
comparación de porcentajes de ocurrencia de corrientes se aplico la prueba Q’. La
variable respuesta estudiada fue la densidad de corriente (I, pA/ pF). Los datos de
densidades de corriente se mostraron como promedios ± su error estándar de la
media (SEM, al 95% I.C.)
VI. RESULTADOS
6.1
Observaciones Generales.
6.1.1 Sobre las células de registro
Para registro electrofisiológico, las células no infectadas (controles) fueron
utilizadas a partir de 4 días de cultivo, las células infectadas con T. cruzi, fueron
analizadas a partir de 5 días posinfección. El análisis morfológico y control de
infección se realizó en los cultivos fijados y teñidos con Giemsa. En anexo 1 se
muestra una fotografía de las células cultivadas no-infectadas. Las cuales son
grandes (se muestra escala en figura) y tienden a mostrar forma poligonal, planas
y extendidas, con numerosas extensiones. En condiciones de cultivo mostraban la
diferenciación y un aumento del tamaño. En las células teñidas con Giemsa al
microscopio óptico se alcanza a distinguir la organización del citoesqueleto, el
núcleo y los nucléolos, a demás los puntos de fijación al sustrato y las membranas
citoplasmáticas y nucleares (anexo1). En preparaciones de células infectadas las
células muestran mayor tamaño y tienden a ser ligeramente más tridimensionales
aquella con parásitos intracelulares. En el Anexo 2 se muestra una célula con
infección temprana donde el grado de replicación del parásito intracelular aun es
bajo y las formas intracelulares son amastigotos. En nuestras condiciones de
trabajo vista al microscopio esta célula (anexo 2) durante un registro
electrofisiológico difícilmente se podría apreciar la infección intracelular. Hay que
señalar que en una preparación infectada podemos encontrar todos los estadios
del parásito y células infectadas en fases tempranas y fases más avanzadas,
puesto que los parásitos que salen de una célula van a infectar a otras células y
así continuan con su ciclo de vida in vitro. En anexo 3, se muestra otra célula con
infección más avanzada donde la mayoría de los amastigotos han evolucionado a
tripomastigotos, en esta fotografía se muestra también el daño celular
característico producido por el parásito (señalado con flechas) el cual es debido a
la disrupción del citoesqueleto y al rompimiento de las miofibrillas en las regiones
donde el parásito se localiza (Pereira et al., 1993; Pereira et al., 2000).
En
nuestras condiciones de registro, una célula registrada electrofisiológicamente con
infección de este grado puede ser fácilmente identificada al destruir la célula o
incluso aún sin necesidad de destrucción. En anexo 4 se muestra la liberación de
los tripomastigotos al espacio extracelular.
En
este
trabajo
las
células
infectadas
empleadas
para
registro
electrofisiológico han sido clasificadas como células con infección no aparente
(I.N.A.) e infección aparente (I.A.): aquellas en las que los parásitos intracelulares
no son visibles al microscopio durante el registro electrofisiológicos, ni al romper
las células inmediatamente después de haber sido registradas fueron clasificadas
como I.N.A., y aquellas en donde los parásitos se observaron intracelularmente
vistas al microscopio o bien al destruir la célula inmediatamente después de haber
sido registrada como I.A.
6.1.2 Registros de patch-clamp en configuración de célula completa
sobre células controles e infectadas con T. cruzi.
Para registro de corrientes aniónicas, usamos la técnica de patch-clamp
en su configuración de célula completa. Para prevenir corrientes catiónicas, las
soluciones de la pipeta y del baño se prepararon con NMDG, un catión
monovalente impermeable. Se observó de manera general en células control una
corriente saliente transitoria, que solo se observaba durante los primeros
momentos al obtener la configuración de célula completa. En la figura 10 A se
ilustra un ejemplo de esta corriente transitoria, la cual presenta un potencial de
inversión cercano a los -76 mV (Fig. 10 B) mostrando así selectividad a K+. El
potencial de inversión obtenido es más positivo del esperado teóricamente, sin
embargo nosotros asumimos este hecho a la sumatoria de todas las corrientes
registradas bajo la configuración de pacht-clamp en célula completa. La magnitud
máxima de esta corriente es alcanzada entre los 64 y los 84 mV (los valores están
corregidos por potencial de unión líquido) y se disminuye gradualmente en el lapso
de algunos minutos con el tiempo de perfusión por la solución de pipeta (Fig. 10
C). Lo que refleja que los iones K+ son sustituidos del espacio intracelular por
NMDG+.
Figura 10. Corriente transitoria. A. Corriente observada durante inicio de la perfusión
entre soluciones internas (pipeta y célula). B. Curva I-V correspondiente. C. Curso temporal, (I pA a
+70 mV).
Después de la perfusión de la corriente transitoria se pudieron observar alguno de
los siguientes tres tipos de corrientes en células control, las cuales son ilustradas
en la figura 11. La primera de ellas corresponde a una corriente saliente
espontánea que en condiciones control muestra una densidad de corriente
promedio de aproximadamente 0.5 pA/ pF (a +110 mV) y un potencial de inversión
(Er) cercano a los 0 mV (Fig. 11, A y B). Un segundo tipo de corriente espontánea
obtenida correspondió a una corriente entrante, la cual muestra una densidad de
corriente promedio de aproximadamente -0.6 pA/ pF (a -150 mV) y Er cercano a 0
mV, (Fig. 11, C y D). Los dos anteriores tipos de corrientes fueron observados de
manera simultánea en la mayoría de los registros obtenidos y la clasificación de
ellas se realizó por visualización del trazo y curva I-V. El tercer tipo de corriente
identificado fue una corriente con activación dependiente de tiempo cuyo umbral
de activación fue de alrededor de los +24 mV y la cual muestra una densidad de
corriente promedio de 9 pA/ pF y Er cercano a +14 mV en condiciones de registro
control (40 mM NMDG-Cl baño, 118 mM NMDG-CL pipeta) pero cuando
aumentamos este gradiente iónico sustituyendo la solución 40 NMDG-Cl por
solución 5 NMDG-Cl el potencial de inversión se hace más positivo (cercano a
+28 mV) con lo que podemos decir que esta corriente es una corriente
preferentemente de tipo aniónico (Fig. 12).
Figura 11. Tipos de corrientes iónicas registradas en miocitos cardiacos
control de rata neonatal. A, C y E representan trazos de corriente saliente espontánea,
corriente entrante espontánea y de corriente saliente
con activación dependiente de tiempo,
respectivamente. B, D y F muestran las relaciones I-V correspondientes. Se utilizó la técnica de
patch-clamp en configuración de célula completa. Solución de baño, en mM: 1 MgCl2, 2 CaCl2, 34
NMDG, 34 HCl, 3.4 glucosa, 10 HEPES, pH 7.4, 290 mOsmoles/kg H2O; solución interna, en mM:
112 NMDG, 112 HCl, 10 glucosa 5 EGTA, 10 HEPES, pH 7.4, 290 mOsmoles/kg H2O. * Indica la
capacitancia de la membrana celular registrada.
Figura 12. Determinación de selectividad de la corriente con activación
dependiente de tiempo utilizando el protocolo del registro de “colas”. A.
Registro de patch-clamp en condiciones control (solución de baño: 40 mM NMDG-Cl, y solución de
pipeta: 118 mM NMDG-Cl) y con el cambio de la solución del baño a 5 mM NMDG-Cl, en
configuración de célula completa, aplicando el protocolo de registro mostrado en la parte superior).
B. Curvas corriente-voltaje para las corrientes de cola, cuadrados abiertos y cerrados con 40 y 5
mM NMDG-Cl en el baño, respectivamente.
Al igual que P. falciparum, T. cruzi es un parásito intracelular cuya
proliferación y generación de residuos imponen cambios en el volumen celular.
Por lo que nos dimos a la tarea de buscar si alguna de las corrientes
anteriormente ilustradas poseía
regulación por cambios de volumen en
condiciones control.
Las corrientes espontáneas resultaron sensibles a cambios de volumen
celular inducidos por la sustitución de la solución de baño isotónica (390
mOsmol/kg de H2O) por una solución de baño hipotónica (230 mOsmol/kg de
H2O). En la figura 13 se muestra un ejemplo de aumento de la corriente saliente
espontánea en respuesta a cambio de solución de baño isotónica por una
hipotónica. La corriente saliente aumenta progresivamente hasta 28 veces más en
solución de baño hipotónica que en solución isotónica (Fig. 13, A, B y C), su pico
máximo es alcanzado a los 25 minutos sobre exposición continua a solución
hipotónica, después de exposición a solución de baño hipotónica esta fue
remplazada por solución isotónica (118 mM NMDG-Cl) mostrando un efecto
reversible sobre la corriente pero no por completo (Fig. 13 D).
Cuando sustituimos la solución de baño 118 mM NMDG-Cl por una isotónica pero
con un gradiente aniónico mayor, 40 mM NMDG-Cl el potencial de inversión se
hace más positivo (+25 mV) cercano al potencial de equilibrio estimado para el Cl(+28 mV), sugiriendo su preferencia aniónica (Fig. 13 E).
Por el contrario, en la figura 14 A se muestra un trazo típico de la corriente con
activación tiempo dependiente registrado en condiciones isotónicas, sin embargo
en la misma célula después de 5 minutos de haber cambiado la perfusión del baño
Isotónico por hipotónico, se registró el trazo mostrado en la fig.14 B. El estrés
hipotónico cambio el patrón de la corriente inicialmente registrada, pudiendo haber
inhibido, enmascarado o modificado la cinética de la corriente y mostrar entonces
una corriente con componente entrante mayor y potencial de inversión más
positivo (Fig. 14 C).
Figura 13. Efecto producido por estrés hipotónico en la corriente saliente
espontánea. El estrés hipotónico fue producido por el remplazamiento de la solución de baño
isotónica (290 mOsmoles/kg de H2O) por una solución hipotónica (230 mOsmoles/kg de H2O) de la
misma composición iónica (118 mM NMDG-Cl). A. Corrientes de la célula completa en solución de
baño isotónico. B. Corrientes de la misma célula en solución de baño hipotónico. C. Relación I-V
para condiciones iso- e hipotónicas. D. Variación de la corriente en función del tiempo en
condiciones hipotónicas y su reversibilidad. E. Relación I-V en solución de baño 118 mM NMDG-Cl
y 40 mM NMDG-Cl.
Figura 14. Efecto del estrés hipotónico sobre la corriente con activación
tiempo dependiente. A. La corriente con activación tiempo dependiente en célula completa en
condiciones control (40 NMDG-Cl Isotónica). B. La corriente con activación tiempo dependiente se
desaparece en condiciones hipotónicas, mientras se activa la corriente instantánea. C. curva I-V
correspondiente a la condición isotónica (círculos negros) e hipotónica (círculos blancos).
Los tipos de corrientes registrados en miocitos cardiacos infectados con T.
cruzi, fueron las mismas que en las células control, dos corrientes espontáneas
(entrante y saliente) y la misma corriente con activación dependiente de tiempo,
las cuales solo difieren en magnitud con respecto del control (Ver más adelante
6.2 y trazos en anexo 5). La corriente saliente transitoria también fue observada en
células infectadas.
6.1.3 Variación temporal de corrientes espontáneas en células
control.
Con el fin de conocer como se desarrollaba la expresión de las corrientes
espontáneas en células controles en función del tiempo en cultivo, procedimos a
determinar la densidad de corriente a los 4, 7, 14 y 30 días en cultivo. En la figura
15 se muestra la variación de las corrientes espontáneas a partir del cuarto día en
cultivo, ambas corrientes muestran la misma tendencia en la expresión de las
corrientes. La densidad de corriente determinada a los cuatro días muestra una
disminución hasta al séptimo día en cultivo, a partir del cual comienza aumentar
progresivamente hasta el último punto temporal registrado (30 días).
Sin embargo el cambio de la expresión de la corriente del séptimo al
catorceavo días se da relativamente más lento, esto mayormente para la corriente
entrante que para la corriente saliente.
Resultando que la magnitud de las corrientes expresadas por las células en
cultivo es pequeña (menor a los 2 pA/pF), presentan variabilidad en su magnitud
con respecto a los días en cultivo y muestran tendencia aumentar a partir de la
primera semana en cultivo.
Figura 15. La densidad de corrientes espontáneas
en células control a
diferentes tiempos en cultivo. La densidad de corriente fue registrada durante los puntos
temporales de 4, 7, 14 y 30 días en cultivo celular con la técnica de patch-clamp en configuración
de célula completa y en condiciones de registro control (baño isotónico 40 NMDG-Cl). Las
densidades de corriente corresponden a la registrada en 110 mV y -150 mV para la corriente
saliente y entrante respectivamente, en los cultivos 4 (n=9), 7 (n=10), 14 (n=9) y 30 (n=3) días.
6.2
Efecto de la infección con T. cruzi sobre la densidad y ocurrencia
de diferentes corrientes iónicas.
Como mencione anteriormente en el apartado 6.1.2 la infección con T. cruzi
no genera la aparición de nuevas corrientes. La pregunta es, ¿si se modifica la
expresión de las corrientes en células infectadas en comparación con el control?,
por lo que en este apartado presentaré las comparaciones de las densidades de
corrientes y el porcentaje de células que las expresan en condiciones control y con
infección tanto no aparente como infección aparente.
6.2.1. Corriente entrante y saliente espontánea.
La densidad de corriente iónica en células control y en células infectadas
fue determinada en dos puntos temporales; 11 y 16 días en cultivo, la elección de
los puntos temporales se basó en el análisis de los cambios en la magnitud de la
corriente evocada según los días en cultivo de las células control, del cual
consideramos que estos dos puntos podrían reflejar menos variabilidad en la
magnitud de la expresión de las corrientes de interés.
Los resultados de este análisis se muestran en la figura 16, en la cual se
compara la densidad de corriente entrante y la corriente saliente espontánea en
condiciones control y en células con diferente nivel de infección. La densidad de
ambas corrientes en condición control no varía entre 11 y 16 días en cultivo. En
cultivos infectados, estos días de cultivo corresponden a 6 y 11 días de infección,
respectivamente. Se demostró, que la densidad de la corriente entrante en células
sin infección aparente se incrementó con respeto al control solamente en 16 días
en cultivo (Fig.16 A, barras grises), con una diferencia
pequeña, aunque
estadísticamente significativa (P<0.05; Tabla 3 del anexo.10). Por el contrario, en
las células con un gran número de parásitos (infección aparente), el aumento de la
densidad de la misma corriente entrante fue más pronunciado, y se observaban
estos cambios más tempranamente, en 11 días en cultivo con subsecuente
disminución (Fig. 16 A barras negras). Con respecto a la densidad de la corriente
saliente, se aumentó solamente en células severamente infectadas por T. cruzi en
11 días de cultivo, (fig.16 B, barras negras, Tabla 4 anexo 10). En resumen, se ha
observado un aumento significativo (~2 veces) en ambas corrientes espontáneas
en cardiomiocitos severamente infectados con T. cruzi (11 días de cultivo, 6 días
de infección).
Figura 16. Densidad de corrientes espontáneas en células control e
infectadas con T. cruzi en dos puntos temporales. A. Densidad de corriente entrante
espontánea. La medición se realizó en el trazo de corriente máxima evocada por un pulso
hiperpolarizante de -136.3 mV (potencial de unión líquido ajustado). B. Densidad de corriente
saliente espontánea. La medición se realizó en el trazo de corriente máxima evocada por un pulso
despolarizante de 123.7 mV (potencial de unión líquido ajustado). Barras blancas: control; barras
grises: infección no aparente (I.N.A.); barras negras; infección aparente (I.A.). * denota diferencia
significativa P<0.05.
6.2.2 El efecto de Mg2+ intracelular sobre corrientes espontáneas
registrados en cardiomiocitos no-infectados e infectados con T. cruzi
Se sabe que el ión Mg2+ es uno de los iones intracelulares más abundantes,
el cual interactúa con aniones polivalentes mayormente con polifosfatos tales
como ATP y PIP2. Es un co-factor necesario para proteínas, cinasas, fosfatasas y
ATPasas; es un ión que ayuda a estabilizar las cargas negativas del DNA, RNA y
membranas. El contenido total de Mg2+ en una célula es comúnmente mayor de
10 mM, pero la mayoría de este se encuentra unido a nucleótidos y ácidos
nucleicos. En las células mamíferas la cantidad de Mg2+ libre oscila entre 0.5 - 1.0
mM, (Gupta et al., 1984; White and Hartzell, 1989; London, 1991; Romani and
Scarpa, 2000) y este puede afectar la actividad de canales iónicos. El Mg2+
bloquea las corrientes salientes de algunos canales de K+ dependientes de voltaje
(Vandenber, 1987; Lu and McKinnon, 1994; Voets et al., 2003; Obukhov and
Nowycky, 2005; Zhang et al., 2006) e inhibe corrientes aniónicas mediadas por el
canal de cloro de rectificación saliente tipo ClC-3 (Yamamoto-Mizuma et al., 2004).
En nuestra preparación la presencia de Mg2+ en la pipeta (3 mM) disminuyó
significativamente la ocurrencia (número de veces que ocurre una corriente de
interés, expresado en %) sólo de la corriente saliente espontánea y la densidad de
ambos tipos de corrientes espontáneas (entrante y saliente), fue disminuida con
diferencia significativa respecto a sus respectivos controles. Este efecto inhibidor
de Mg2+ se confirmó en las tres condiciones de registro: células no-infectadas, con
infección no-aparente y aparente (Fig. 17, anexo 11, tabla 4 y 5).
6.2.3 El efecto de Mg2+ intracelular sobre corrientes con activación
dependiente de tiempo.
En el caso de la corriente con activación tiempo-dependiente, el análisis se
realizó sin referencia a puntos temporales debido a su baja frecuencia en relación
con los dos tipos de corriente anterior.
En la presencia de 3 mM Mg2+ en la pipeta, se observó un incremento
significativo (4 veces) de la ocurrencia de la corriente para ambos niveles de
infección (Fig. 18 A). Por el contrario la densidad de corriente no difirió del control
para cada una de las condiciones de registro. (Fig. 18 B, anexo 11 tabla 6)
Figura 17. Efecto del Mg2+ intracelular sobre en la ocurrencia y densidad de
corrientes espontáneas. A y B. Ocurrencia de la corriente entrante y saliente espontáneas
sin Mg
2+
(barras grises) y con 3 mM de Mg
2+
(barras negras) en la solución interna. C y D
densidades de corriente entrante y saliente espontáneas sin Mg
Mg
2+
2+
(barras grises) y con 3 mM de
(barras negras) en solución interna. La medición de la corriente entrante se realizó en el trazo
de corriente máxima evocada por un pulso hiperpolarizante de -136.3 mV, la medición de la
corriente saliente se realizó en el trazo de corriente máxima evocada por un pulso despolarizante
de 123.7 mV (potencial de unión líquido ajustado).
Figura 18. Efecto del Mg2+ intracelular sobre ocurrencia y densidad de la
corriente con activación dependiente de tiempo. A. Ocurrencia de la corriente sin
Mg
2+
(barras grises)
2+
corriente sin Mg
2+
y con 3 mM de Mg
(barras grises)
(barras negras), respectivamente. B. Densidad de
y con 3 mM de Mg
2+
(barras negras). La corriente ha sido
evaluado a 123.7 mV (valor corregido por el potencial de unión liquido).
También se probó el efecto de 4 mM de ATP en solución interna sobre las
densidades de corriente. Se realizaron registros de patch-clamp en miocitos
cardiacos
control, infección no aparente e infección aparente bajo las mismas
condiciones experimentales. En seis células ensayadas sólo se expresaron
corrientes espontáneas y la presencia de ATP en la solución interna no produjo
ningún efecto significativo sobre las densidades de corrientes registradas
(resultado no mostrado).
VII. DISCUSIONES
En el presente estudio usando cultivo primario de cardiomiocitos de rata
recién nacida y técnica patch-clamp en su configuración “célula completa”
comparamos la presencia de corrientes aniónicas en células sanas e infectadas
con el parásito T. curzi.
En cardiomiocitos cultivados durante 4 - 30 días registramos una corriente
transitoria y 3 tipos de corriente aniónicas: corrientes espontáneas entrante y
saliente, y corriente con activación tiempo-dependiente.
Respecto a la corriente transitoria observada, Duan et al., 1992 reportaron
la presencia de una corriente transitoria de potasio en miocitos auriculares de
conejo a la cual refieren como Ito1, seguida de una corriente de cloro espontánea
de rectificación saliente bloqueada por SIT y DIDS, (Icl. basal.). Esta última, la cual se
demostró que también puede ser sensible a cambio de volumen y que las
corrientes de cloro basal (ICl. Basal) y la corriente de cloro regulada por volumen (ICl.
Vol)
(Duan et al., 1997) en miocitos auriculares de conejo pueden ser mediadas por
el mismo canal (ClC-3), sin embargo anterior a esto, en miocitos ventriculares de
rata recién nacida , Kilborn y Fedida (1990), reportan corrientes saliente transitoria
sensibles a 4-AP, tiempo y voltaje dependiente, referidas como It, selectiva para K+
y cuya selectividad y cinética de inactivación difieren dependiendo de la edad de
las ratas; la cinética de la corriente es reportada como más lenta en células de rata
de 1 día de edad y mucho más rápida en ratas de 10 días de edad (Ver figura
anexo 12) En miocitos ventriculares de rata recién nacida cultivados, se ha
mostrado que la forma y organización de las células en cultivo puede modificar la
densidad de corriente transitoria de potasio Ito, mostrando que las células en
organización lineal tienen densidad de corriente de aproximadamente el doble que
las células de forma plana y dispersas. La activación e inactivación son
ligeramente modificadas por la forma y organización celular de los miocitos
ventriculares en cultivo (Walsh and Parks, 2002). Por lo que no podemos descartar
la posibilidad de que la corriente ilustrada en la Fig. 10 pueda ser una corriente
transitoria de potasio referidas por los autores anteriores, hasta realizar las
pruebas farmacológicas correspondientes, sin embargo no es una corriente que
resulte de gran interés para los objetivos buscados en este trabajo.
Por otro lado, algunos tipos de corrientes de cloro han sido registradas en
miocitos cardiacos de diferentes regiones del corazón y en diferentes especies
(Hume et al., 2000), podemos mencionar a las corrientes de cloro activadas por
AMPc (ICl,
AMPc),
intracelular (ICl,
(Bahinski et al ., 1989; Harvey and Hume, 1989), por Ca2+
Ca),
(Zygmunt and Gibbons, 1991), por proteíncinasa C (ICl,
(Walsh, 1991), ATP (ICl,
celular (ICl,
vol.),
purinergica),
PKC)
(Matsuura and Ehara, 1992) y por volumen
la cual también es conocida como ICl
swell
(Sorota, 1992; Tseng,
1992), además de la conductancia sostenida de cloro (ICl, basal). Recientemente se
ha demostrado que ICl, AMPc es mediada por CFTR (Gadsby et al.,1995; Horowitz et
al., 1993; Levesque et al., 1992 ) y también existen evidencias que apoyan que ICl,
PKC
y ICl, purinergica también son mediados por CFTR. La corriente de cloro activada
por hinchamiento (ICl
swell)
ya ha sido caracterizada en miocitos ventriculares de
rata neonatal (Tilly et al., 1996, Walsh and Zhang, 2005), ICl swell es una corriente
de rectificación saliente con gradientes de Cl simétrico o fisiológico (Vandenberg et
al., 1994; Tseng, 1992; Sorota, 1992; Hagiwara et al., 1992), es una corriente
tiempo independiente a voltajes fisiológicos y puede presentar inactivación parcial
a voltajes muy despolarizantes (Duan et al, 1995; Shuba et al., 1996), su
secuencia de selectividad es I-≥NO->Br->Cl->Asp (Hagiwara et al., 1992;
Vandenberg at al., 1994), se ha señalado que pueden ser codificadas por ClC-3
(Duan et al., 1997, 1999) un miembro de la gran familia de canales VSOACs
(canales anión/osmolitos orgánicos, sensibles a cambios de volumen). ClC-3 es
una canal que se expresa molecularmente en tejido cardiaco de rata y los niveles
de expresión no difieren en aurícula o ventrículo (Britton et al., 2000), ClC-3
conduce corrientes de rectificación saliente activadas por hinchamiento celular
hipotónico, muestra selectividad aniónica (I-,Cl-,>>Asp-) y es sensible al bloqueo
por 0.2 mM glibenclamida, 100 µM ácido niflumico , 100 µM DIDS y 1mM ATP
extracelular (Yamamoto et al., 2004).
Decher et al. (2001) señalan que han empleado un bloqueador específico
de las corrientes evocadas por hinchamiento celular (ICl
swell)
conocido como
DCPIB (10 µM) un derivado del ácido etacrínico no diurético y también han
señalado que 10 µM tamoxifen puede bloquear este tipo de corrientes. Sin
embargo Walsh y Zhang, (2005) han señalado que la sensibilidad de las corrientes
de cloro activadas por hinchamiento (ICl
swell)
es menor en miocitos cardiacos de
rata recién nacida para tamoxifen y 9-A-C que la desarrollada por las células de
ratas adultas.
También es sabido que una baja concentración de ATP intracelular y alto
2+
Mg
libre intracelular inhiben VSOACs en una gran variedad de células (Nilius y
Droogmans, 2003; Okada, 1997; Strange et al. 1996) incluyendo a los miocitos
cardiacos (Sakaguchi et al. 1997). Yamamoto et al. 2004 por ej. Observaron en
miocitos cardiacos de ratón que 2 mM de Mg2+ libre en la solución de pipeta, sin
ATP, la actividad del canal fue completamente suprimida al exponer las células a
solución de baño hipotónica. En nuestro caso 3mM de Mg2+ libre intracelular no
suprime por completo la actividad del canal en células control e infectadas pero si
muestra efecto significativo al disminuir la densidad de corriente registrada bajo
nuestras condiciones experimentales.
Por todo lo anterior, podemos pensar que la corriente espontáneas de
rectificación saliente registrada en este trabajo la cual muestra: 1) activación por
hinchamiento celular inducido por solución hipotónica, 2) selectividad aniónica y 3)
es inhibida por alto Mg+2 libre intracelular, pudiera ser una corriente mediada por
el canal ClC-3.
Por otra parte no descartamos la posibilidad de que la corriente entrante
espontánea pudiera ser medida por ClC-2, otro de los miembros de la familia de
canales ClC, el cual también es un canal regulado por cambio de volumen pero a
diferencia de ClC-3 este muestra rectificación entrante, su expresión molecular ha
sido confirmada en rata, en la cual los niveles transcripcionales
son
significativamente mayores en ventrículo que en aurícula (Britton et al. 2000), con
secuencia de selectividad Cl->I- y puede ser bloqueado por Cd2+ (Britton et al.,
2005).
El objetivo principal del presente trabajo era determinar, si la infección de
cardiomiocitos con T. cruzi provoca expresión de nuevas corrientes, o modifica las
corrientes existentes. Cabe mencionar que hasta el momento, existen solamente
dos modelos para estudio de formación de nuevas rutas de transporte por
parásitos intracelulares en células de huésped: varios grupos están investigando
los eritrocitos infectados con P. falciparum, y nosotros somos los primeros en
estudiar los cardiomiocitos infectados con T. cruzi. Nuestros estudios muestran
que en los miocitos cardiacos infectados con T. cruzi se presentan los mismos
tipos de corrientes aniónicas que en los cardiomiocitos no-infectados. La infección
intracelular no genera la aparición de nuevas conductancias iónicas, a partir de las
fase temprana (pocos amastigotos se encuentran en la célula infectada), y fase
de infección avanzada (tripomastigotos intracelulares ocupan todo el espacio
intracelular y se encuentran a punto de romper la membrana plasmática de la
célula huésped).
Sin embargo nosotros mostramos que la infección avanzada con T. cruzi
incrementa en aproximadamente el doble de la densidad de las corrientes
espontáneas entrante y saliente comparando con las células control (Fig. 16).
También, en presencia de Mg2+, el porcentaje de células que expresan la corriente
con activación dependiente del tiempo se aumenta hasta 4 veces en las células
infectadas sin variación significativa en la densidad de la corriente (Fig. 18 A).
Los resultados obtenidos en el presente estudio nos muestran un panorama
distinto al desarrollado por P. falciparum en los eritrocitos humanos con respecto
a la generación de NPPs. En eritrocitos humanos se ha mostrado la ausencia total
de actividad espontánea de canales aniónicos (Bouyer et al., 2006; Egée et al.,
2002), sin embargo cuando los eritrocitos están infectados con P. falciparum o
bien son estimulados con PKA en la solución interna, estos muestran actividad de
canales aniónicos, entre los identificados p. ej. canal de cloro-2 (ClC-2) (Huber et
al., 2004), proteína de transmembrana reguladora de fibrosis cística (CFTR, Verloo
et al., en 2004), canal anión regulado por volumen (VRAC, Jentsch et al. 2002),
entre otros con selectividad aniónica (Ginsburg y Stain, 2004; Huber et al., 2002 y
Desai et al., 2000), a los cuales se les ha señalado por varios grupos de
investigadores como algunos de los responsables de las NPPs y aunque no se ha
llegado a un consenso sobre cuantos y cuales canales conforman las NPPs en
eritrocitos infectados con P. falciparum, las características electrofisiológicas de
estos canales, su origen (parasitario o huésped) y la relación (si es que la hay)
entre estos canales y el incremento de la permeabilidad a solutos orgánicos
incluidos nutrientes esenciales y los residuos metabólico (revisado en Staines et
al., 2007), sí es un consenso que P. falciparum incrementa la permeabilidad de la
membrana predominantemente para aniones, pudiendo llegar a incrementar las
conductancias aniónicas hasta 150 veces más en eritrocitos infectados (Desai et
al. 2000).
A diferencia de lo que sucede con los eritrocitos, hay que tener presente que en
los miocitos cardiacos las corrientes aniónicas de Cl- pueden contribuir a algunas
funciones importantes (Hiraoka et al., 1998 y Hume et al., 2000), modulando la
duración del potencial de acción cardiaco y el potencial de reposo de la membrana
de estas células (Ehara and Hasegawa 1983; Fozzard and Lee, 1976; Akiyama
and Fozzard, 1975). Estas corrientes también participan en la regulación del
volumen celular, pH y el transporte de osmolitos orgánicos (Vandenberg et al.,
1996). Además los miocitos cardiacos a diferencia de los eritrocitos son células
más ricas en contenido de nutrientes necesarios para la sobrevivencia y
diferenciación intracelular, recordemos que el eritrocito no está proveído de
núcleo, mitocondrias y por consiguiente de las fuentes de ácidos grasos,
aminoácidos y fuentes energéticas que los miocitos proporcionan, por lo que
quizás el T. cruzi no esté generando nuevas rutas de permeabilidad y solo está
modificando al menos una de las que ya están presentes en el miocito cardiaco,
(la corriente saliente espontánea), la cual probablemente corresponda a ICl swell, y
cuya activación se ha implicado en el desarrollo de cardiopatías e infartos al
miocardio (Baumgarten y Clemo, 2003) las cuales son manifestaciones clínicas
provocadas por la infección de T. cruzi en tejido cardiaco.
VIII. CONCLUSIONES
1. En cardiomiocitos aislados de rata recién nacida y cultivados durante 4 30 días se registró la presencia al menos de tres tipos de conductancias
aniónicas: corrientes espontáneas entrante y saliente, y corriente con
activación dependiente del tiempo.
2. Los cambios de volumen celular (hinchamiento por hipotonía) muestran
efecto regulatorio sobre las corrientes espontáneas y modifica la cinética
de la corriente con activación tiempo dependiente en células controles.
3. El Mg+2 libre intracelular (3mM) disminuye la densidad de las corrientes
espontáneas.
4. En nuestras condiciones de registro, la infección de miocitos cardiacos
con T. cruzi no genera la aparición de nuevas corrientes (NPPs). Las
células infectadas presentan los mismos tres tipos de conductancias
iónicas identificadas en células controles.
5. Se ha observado un aumento significativo (~2 veces) en ambas
corrientes espontáneas en cardiomiocitos con una infección avanzada
con T. cruzi.
6. El porcentaje de células que expresan la corriente con activación
dependiente del tiempo se aumenta hasta 4 veces en las células
infectadas sin variación significativa en la densidad de la corriente, un
efecto registrado solamente en la presencia de Mg2+ intracelular (3 mM).
IX. PERSPECTIVAS
Como posibles perspectivas de estudio tenemos la identificación de los
canales responsables de mediar las corrientes observadas y para ello
consideramos las siguientes perspectivas:
-
Estudiar la selectividad iónica
-
Realizar estudios farmacológicos
-
Y por último la identificación molecular de las proteínas que pudieran
resultar responsables de las corrientes observadas.
Aunque también podríamos ampliar más el panorama enfocándonos no
sólo en la búsqueda de estas conductancias aniónicas sino también en el estudio
del transporte de solutos para identificar que solutos incrementan su transporte a
través de la membrana plasmática en células infectadas con respecto de las
controles y realizar estudios electrofisiológicos con respaldo en los ensayos de
trasporte de solutos e iones.
X. ANEXOS
Anexo 1. Fotografía de miocitos cardiacos de 8 días en cultivo en
condiciones control (sin infección con T. cruzi). Tinción Giemsa, 40X.
Anexo 2. Fotografía de miocitos cardiacos infectados con T. cruzi, infección
temprana. 16 días en cultivo, 8 días de infección. Flecha señala
amastigotos. Tinción Giemsa, 40 X.
Anexo 3. Fotografía de miocitos cardiacos infectados con T. cruzi. 16 días en
cultivo, 8 días de infección. Flecha señala tripomastigotos intracelulares (a)
y daño celular causado (b) por el parásito. Tinción Giemsa, 40 X.
Anexo 4. Fotografía de miocitos cardiacos infectados con T. cruzi muestra la
liberación del parásito intracelular (infección tardia). 8 días en cultivo
más 8 días de infección. Liberación de tripomastigotos al espacio
extracelular. Tinción Giemsa, 40 X.
Anexo 5. Trazos de corrientes iónicas registradas en miocitos cardiacos de
rata recién nacida infectados con Trypanosoma cruzi.
Fig. anexo 5. Trazos de corrientes iónicas registradas en miocitos cardiacos
de rata recién nacida infectados con tripanosoma cruzi. A, C y E representan
trazos de corriente saliente espontánea, corriente entrante espontánea y de corriente saliente con
activación dependiente de tiempo, respectivamente. B, D y F muestran las relaciones I-V
correspondientes. Se utilizó la técnica de patch-clamp en configuración de célula completa.
Solución de baño, en mM: 1 MgCl2, 2 CaCl2, 34 NMDG, 34 HCl, 3.4 glucosa, 10 HEPES, pH 7.4,
290 mOsmoles/kg H2O; solución interna, en mM: 112 NMDG, 112 HCl, 10 glucosa 5 EGTA, 10
HEPES, pH 7.4, 290 mOsmoles/kg H2O. * Indica la capacitancia de la membrana celular registrada.
Anexo 6.
Pruebas de normalidad para la comparación de las corrientes
iónicas en células control e infectadas.
Para el uso de las técnicas estadísticas paramétricas es fundamental que
los datos se ajusten a una distribución normal, por ello para la variable respuesta
(Densidad de corriente; I (pA/ pF) y para el tamaño de muestra utilizado en el
experimento completo (n= 105, n1= 26, n2= 25, n3=28 y n4=26) se aplico la prueba
de normalidad de Shapiro-Wilk, Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises y
Anderson-Darling.
Es importante tener presente que en estas prueba el juego de hipótesis a probar
es:
H 0 : los datos se ajustan a una variable aleatoria normal (hipótesis nula)
H a : los datos no se ajustan a una variable aleatoria normal (hipótesis alternativa).
En la Tabla Anexo 5 se puede observar que el P<0.05 para la variable respuesta
para cada una de las pruebas de normalidad. Por lo tanto, para la variable
Densidad de corriente I (pA/ pF) se tienen elementos para rechazar la hipótesis
nula, por lo que se concluye que en efecto esta variable no se ajusta a una
distribución normal de acuerdo con las 4 pruebas de normalidad anteriormente
señaladas, a un nivel de significancia del 5%. Por ello, para la comparación de
tratamientos se optó por pruebas no paramétricas.
Los resultados de aplicar estas pruebas se presentan a continuación.
Tabla Anexo 1. Pruebas de normalidad para la variable respuesta Densidad
de corriente I (pA/ pF) bajo el tamaños de muestra (n= 105, n1=26, n2=25,
n3=28 y n4=26).
Prueba
Shapiro-Wilk,
Kolmogorov-Smirnov
Cramer-von Mises
Anderson-Darling
P (n1=26)
P (n2= 25)
P (n3=28)
P (n4=26)
Corriente
entrante 11
días
Corriente
entrante 16
días
Corriente
saliente 11
días
Corriente
saliente 16
días
0.0008
<0.0100
<0.0050
<0.0050
0.0032
>0.1500
0.0241
0.0078
<0.0001
<0.0100
<0.0050
<0.0050
0.0005
<0.0100
<0.0050
<0.0050
Anexo 7. Pruebas de normalidad para el efecto del Mg2+ sobre las corrientes
espontáneas y tiempo dependiente.
Nuevamente fueron aplicadas las pruebas de normalidad Shapiro-Wilk,
Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises y Anderson-Darling. Para determinar si
los datos se ajustaban a una distribución normal de la variable respuesta
(Densidad de corriente;
I (pA/ pF) y el tamaño de muestra utilizado
en el
experimento completo (n= 191, n1= 76, n2= 62, n3=27 y n4=26).
Es importante tener presente que en estas prueba el juego de hipótesis a probar
es:
H 0 : los datos se ajustan a una variable aleatoria normal (hipótesis nula)
H a : los datos no se ajustan a una variable aleatoria normal (hipótesis alternativa).
En la Tabla Anexo 6 se puede observar que el P<0.05 para la variable respuesta
para cada una de las pruebas de normalidad. Por lo tanto, para la variable
Densidad de corriente I (pA/ pF) se tienen elementos para rechazar la hipótesis
nula, por lo que se concluye que en efecto esta variable no se ajusta a una
distribución normal de acuerdo con las 4 pruebas de normalidad anteriormente
señaladas, a un nivel de significancia del 5%. Por ello, para la comparación de
tratamientos se optó por pruebas no paramétricas.
Los resultados de aplicar estas pruebas se presentan a continuación.
Tabla 2. Pruebas de normalidad para la variable respuesta densidad de
corriente I (pA/ pF) bajo la influencia del Mg+2 el tamaños de muestra (n= 187,
n1=76, n2=62, n3=27 y n4=26).
Prueba
Shapiro-Wilk,
Kolmogorov-Smirnov
Cramer-von Mises
Anderson-Darling
P (n1= 76)
P (n2= 62 )
P (n3= 27)
P (n4=26)
Corriente
entrante
Corriente
saliente
Corriente
T-D
Corriente
T-D con fit
<0.0001
<0.0100
<0.0050
<0.0050
<0.0001
<0.0100
<0.0050
<0.0050
0.0288
>0.1500
0.1655
0.0781
0.3037
0.1500
0.2192
0.2440
Anexo 8. Análisis de varianza unifactorial por rangos, de Kruskal-Wallis.
Es una prueba extremadamente útil para describir si κ
muestras
independientes provienen de diferentes poblaciones. Los valores de las muestras
invariablemente difieren de alguna manera, y la pregunta es si ¿Las diferencias
entre las muestras significan diferencias
genuinas en la población o si sólo
representan la clase de variaciones que pueden esperarse en muestras que se
obtienen al azar de la misma población? La prueba de Kruskal-Wallis (WK) prueba
la hipótesis nula de que las κ muestras provienen de la misma población o de
poblaciones idénticas con la misma mediana.
Esta prueba evalúa la diferencia entre los rangos promedio para determinar
si son lo suficientemente dispares, de tal suerte que no sea probable que las
muestran hayan sido extraídas de la misma población. A continuación se
presentan dos formas para la prueba Kruskal-Wallis y los términos necesarios
para calcular el estadístico:
KW =
k
k
 12

12
2
n
(
R
−
R
)
ó
KW
=
n j R 2j  − 3( N + 1)
∑

j
j
∑
N ( N + 1) j =1
 N ( N + 1) j =1

Donde:
k = número de muestras o grupos
n j = número de casos en la j-ésima muestra.
N = número de casos en la muestra combinada
R j = sumatoria de los rangos en la j-ésima muestra o grupo.
R j = promedio de los rangos en la j-ésima nuestra o grupo.
R = (N+1)/2= promedio de los rangos en la muestra combinada (la gran media)
Comparaciones múltiples entre tratamientos
Cuando el valor obtenido de KW es significativo. Indica que al menos uno
de los grupos es diferente de al menos otro de los grupos. Esto no dice al
investigador qué grupos son diferentes ni le indica cuantos de los grupos son
diferentes de cada uno. Lo que se necesita es un procedimiento que nos posibilite
determinar cuáles grupos son diferentes. Existe un procedimiento sencillo para
determinar cuáles pares de grupos son diferentes utilizando la siguiente
desigualdad:
Ru − Rv ≥ Z α / k ( k −1)
1
N ( N + 1) 1
( + )
12
nu nv
Con esto probamos la hipótesis nula H 0 : θ u = θ v en contra de la hipótesis alterna
H 1 : θ u ≠ θ v para algunos grupos u y v . Entonces si la diferencia de la suma de los
rangos o rangos promedio excede el valor crítico correspondiente dado por la
ecuación anterior podemos concluir que θ u ≠ θ v . . El valor Z α / k ( k −1) es el valor de la
abscisa de la distribución normal unitaria donde se encuentra el α / k (k − 1)% de la
distribución.
Anexo 9. Análisis de varianza bifactorial por rangos, de Friedman
Este análisis evalúa la hipótesis nula de que los k grupos igualados (los
cuales tienen que estar al menos en escala ordinal) o medidas repetidas provienen
de la misma población o de poblaciones con la misma mediana. Esta prueba
supone en la hipótesis nula que las medianas son las mismas tanto como
H o : θ1 = θ 2 = ... = θ k . Entonces la hipótesis alterna es H 1 : θ i ≠ θ j en al menos dos
condiciones o grupos i y j . Es decir si la hipótesis alterna es verdadera, al menos
un par de condiciones tiene medianas diferentes. Bajo la hipótesis nula, la prueba
supone que las variables tienen la misma distribución continua subyacente.
Los datos que emplea esta prueba son rangos. La prueba de Friedman
determina si los rangos totales (denominados R j ) para cada condición o variable,
difieren significativamente de los valores esperados. Esta prueba estadístico es
denotada como Fr
k
 12

Fr = 
R 2j  − 3 N ( k + 1)
∑
 Nk ( k + 1) j =1 
Donde:
N = Número de sujetos
k = Número de variables o condiciones
R j = Suma de los rangos para variable j-ésima
k
∑
= Sumatoria de los cuadrados de los rangos de todas las condiciones.
j =1
Comparaciones múltiples entre grupos o condiciones
Cuando el valor obtenido de Fr es significativo, este resultado refleja que al
menos una de las condiciones difiere con respecto a otra de las condiciones. Pero
esto no indica al investigador cuál grupo es el diferente, ni cuántos de los grupos
difieren entre sí. Es decir, cuando el valor obtenido de Fr es significativo,
evaluamos la hipótesis H 0 : θ u = θ v contra la hipótesis H 1 : θ u ≠ θ v para algunas
condiciones u y v . Existe un procedimiento sencillo para determinar cuál(es)
condición(es) es(son) la(s) las que difieren(n). Primero, se determinan las
diferencias Ru − Rv para todos los pares de grupos o condiciones. Supóngase que
evaluamos la hipótesis de que no existen diferencias entre las k condiciones o
grupos igualados y que la rechazamos en el nivel de significación α . Entonces
debemos probar la significación de las diferencias de los
pares individuales,
utilizando la siguiente desigualdad. Esto es si
Ru − Rv ≥ Z α / k ( k −1)
Nk (k + 1)
6
O si los datos son expresados en términos de rangos promedio dentro de cada
condición, y si
R u − R v ≥ Z α / k ( k −1)
k (k + 1)
6N
Entonces podemos rechazar la hipótesis nula y concluir que θ u ≠ θ v . Entonces, si
la diferencia entre la suma de rangos (o rangos promedio) excede el valor crítico
correspondiente dado por las ecuaciones anteriores, debemos concluir que las dos
condiciones son diferentes. El valor Z α / k ( k −1) es el valor de la abscisa de la
distribución normal unitaria donde se encuentra el α / k (k − 1)% de la distribución.
Anexo 10. Comparación de la densidad de corrientes de células control con
células infectadas.
Tabla 3. Promedios (media y mediana) de las densidades de corriente
entrantes en 11 y 16 días de infección y significancia estadística.
Condición
Control
Infección no aparente
Infección aparente
Corriente entrante
11 días en cultivo
Media
ni
(pA/pF)
Mediana
5
10
11
-0.76 A
-0.95 A
-1.63 B
-0.74 A
-0.93 A
-1.25 B
ni
10
10
5
16 días en cultivo
Media
(pA/ pF)
Mediana
-0.71 A
-1.10 B
-0.85 A
2
χ cal
8.46
9.53
P
0.0146*
0.0085*
CV
62.86
54.96
-0.55 A
-1.12 B
-0.60 A
Nota: Pruebas estadísticas utilizadas: Kruskal-Wallis y comparación de medias de Dunn.
Mismas letras indican que no existe diferencia significativa. P<0.05. P: P value, CV: coeficiente
de variación,
2
χ cal
: ji-cuadrada calculada,
ni: denota el número de repeticiones experimentales
por grupo.
Tabla 4. Promedios (media y mediana) de las densidades de corriente
saliente en 11 y 16 días de infección y significancia estadística.
Condición
Control
Infección no aparente
Infección aparente
2
χ cal
Corriente Saliente
11 días en cultivo
Promedio
ni
(pA/pF)
Mediana
8
9
11
0.48 A
0.53 A
1.40 B
0.47 A
0.51 A
1.14 B
ni
10
11
5
16 días en cultivo
Promedio
(pA/ pF)
Mediana
0.47 A
0.75 A
0.89 A
0.58 A
0.65 A
0.80 A
12.62
5.03
P
0.0018*
0.0809
CV
73.35
51.91
Nota: Pruebas estadísticas utilizadas: Kruskal-Wallis y comparación de medias de Dunn. Mismas
letras indican que no existe diferencia significativa. P<0.05. P: P value, CV: coeficiente de
variación,
grupo.
2
χ cal
:
ji-cuadrada calculada, ni: denota el número de repeticiones experimentales por
Anexo 11. Efecto del Mg2+ sobre las corrientes espontáneas y dependiente
de Tiempo.
Tabla 5. Promedios (media y mediana) de las densidades de corrientes
espontáneas y significancia estadística con y sin Mg2+
Bloque
Corriente Instantáneas
2+
Efecto de 3 mM de Mg en la pipeta
Corriente entrante
Corriente saliente
Media
Mediana
Media
Mediana
ni
ni
(pA/pF)
2+
Sin Mg
Con Mg2+
P
48
28
Condición
ni
Control
Infección no aparente
Infección aparente
32
25
19
(pA/pF)
-1.13 A
-0.98 A
-0.50 B
-0.43 B
0.0009
Corriente entrante
Media
Mediana
(pA/pF)
(pA/pF)
(pA/pF)
(pA/pF)
0.78 A
0.65 A
0.41 B
0.30 B
0.0003
Corriente saliente
Media
Mediana
ni
-0.56
-1.04
-1.26
-0.48
-0.91
-1.10
24
20
18
50
12
(pA/pF)
(pA/pF)
0.49
0.56
1.17
0.44
0.56
0.91
P
0.0002
<.0001
CV
-75.67
67.54
Nota: Pruebas estadísticas utilizadas: Friendma y comparación de medias de Dunn. Mismas letras
indican que no existe diferencia significativa. P<0.05. P: P value, CV: coeficiente de variación, ni:
denota el número de repeticiones experimentales por grupo.
Tabla 6. Promedios (media y mediana) de la densidades de corriente Tiempo
dependiente y significancia estadística con y sin Mg2+
Bloque
Corriente Dependiente de
tiempo
Media
Mediana
ni
ni
(pA/pF)
(pA/pF)
2+
8.55 A
8.86 A
Sin Mg
10
11
2+
7.90 A
8.77A
Con Mg
17
15
P
0.1429
Nota: Pruebas estadísticas utilizadas: Friendman y comparación de medias de Dunn. Mismas
letras indican que no existe diferencia significativa. P<0.05. P: P value, CV: coeficiente de
variación, ni: denota el número de repeticiones experimentales por grupo.
Anexo 12. Corrientes transitorias (It) en miocitos cardiacos aislados de rata
neonata de diferentes días de edad.
Figura anexo 11. Relación corriente-voltaje de la corriente saliente transitoria
registrada en ratas de diferentes edades. A representa la corriente registrada en
células de 10, 5 y 1 días. La capacitancia de las células 15.3 pF (10 días), 24 pF
(5 días) y 8.9 pF (1 día). Los pulsos de corriente de 400 ms desde un potencial de
mantenimiento de -90 a -20 mV (a), + 10 mV (b), + 20 mV (c) y 40 mV (d). 3x10-4
M CdCl2 están presentes en todos los casos. B relación corriente-voltaje
acumulada para 16 células de 1 día de edad círculos abiertos, 16 células de 5 días
de edad, círculos cerrados, y 18 células de 1 días de edad, triángulos. (Tomado de
Kilborn y Fedida, 1990).
XI. BIBLIOGRAFÍA
Akiyama, T., & Fozzard, H. A. (1975). Influence of potassium ions and osmolality
on the resting membrane potential of rabbit ventricular papillary muscle with
estimation of the activity and the activity coefficient of internal potassium.
Circulation Research, 37(5), 621-629.
Alkhalil, A., Cohn, J. V., Wagner, M. A., Cabrera, J. S., Rajapandi, T., & Desai, S.
A. (2004). Plasmodium falciparum likely encodes the principal anion channel
on infected human erythrocytes. Blood, 104(13), 4279-4286.
Ancelin, M. L., & Vial, H. J. (1989). Regulation of phosphatidylcholine biosynthesis
in plasmodium-infected erythrocytes. Biochimica Et Biophysica Acta, 1001(1),
82-89.
Atamna, H., & Ginsburg, H. (1997). The malaria parasite supplies glutathione to its
host cell--investigation of glutathione transport and metabolism in human
erythrocytes infected with plasmodium falciparum. European Journal of
Biochemistry / FEBS, 250(3), 670-679.
Bahinski, A., Nairn, A. C., Greengard, P., & Gadsby, D. C. (1989). Chloride
conductance regulated by cyclic AMP-dependent protein kinase in cardiac
myocytes. Nature, 340(6236), 718-721.
Baumgarten, C. M., & Clemo, H. F. (2003). Swelling-activated chloride channels in
cardiac physiology and pathophysiology. Progress in Biophysics and Molecular
Biology, 82(1-3), 25-42.
Bern, C., Montgomery, S. P., Herwaldt, B. L., Rassi, A.,Jr, Marin-Neto, J. A.,
Dantas, R. O., et al. (2007). Evaluation and treatment of chagas disease in the
united states: A systematic review. JAMA : The Journal of the American
Medical Association, 298(18), 2171-2181.
Bouyer, G., Egee, S., & Thomas, S. L. (2006). Three types of spontaneously active
anionic channels in malaria-infected human red blood cells. Blood Cells,
Molecules & Diseases, 36(2), 248-254.
Bouyer, G., Egee, S., & Thomas, S. L. (2007). Toward a unifying model of malariainduced channel activity, Proceedings of the National Academy of Science,
104 (26), 11044 -11049.
Britton, F. C., Wang, G. L., Huang, Z. M., Ye, L., Horowitz, B., Hume, J. R., et al.
(2005). Functional characterization of novel alternatively spliced ClC-2 chloride
channel variants in the heart. The Journal of Biological Chemistry, 280(27),
25871-25880.
Chlopcikova, S., Psotova, J., & Miketova, P. (2001). Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological
characteristics of the heart. Biomedical Papers of the Medical Faculty of the
University Palacky, Olomouc, Czechoslovakia, 145(2), 49-55.
Christophersen, P., & Bennekou, P. (1991). Evidence for a voltage-gated, nonselective cation channel in the human red cell membrane. Biochimica Et
Biophysica Acta, 1065(1), 103-106.
Coll-Cardenas, R., Espinoza-Gomez, F., Maldonado-Rodriguez, A., Reyes-Lopez,
P. A., Huerta-Viera, M., & Rojas-Larios, F. (2004). Active transmission of
human chagas disease in colima mexico. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz,
99(4), 363-368.
Coura, J. R. (2007). Chagas disease: What is known and what is needed--a
background article. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 102 Suppl 1, 113122.
Cranmer, S. L., Conant, A. R., Gutteridge, W. E., & Halestrap, A. P. (1995).
Characterization of the enhanced transport of L- and D-lactate into human red
blood cells infected with plasmodium falciparum suggests the presence of a
novel saturable lactate proton cotransporter. The Journal of Biological
Chemistry, 270(25), 15045-15052.
Decher, N., Lang, H. J., Nilius, B., Bruggemann, A., Busch, A. E., & Steinmeyer, K.
(2001). DCPIB is a novel selective blocker of I(cl,swell) and prevents swellinginduced shortening of guinea-pig atrial action potential duration. British Journal
of Pharmacology, 134(7), 1467-1479.
Decherf, G., Egee, S., Staines, H. M., Ellory, J. C., & Thomas, S. L. (2004). Anionic
channels in malaria-infected human red blood cells. Blood Cells, Molecules &
Diseases, 32(3), 366-371.
Desai, S. A., Bezrukov, S. M., & Zimmerberg, J. (2000). A voltage-dependent
channel involved in nutrient uptake by red blood cells infected with the malaria
parasite. Nature, 406(6799), 1001-1005.
Divo, A. A., Geary, T. G., Davis, N. L., & Jensen, J. B. (1985). Nutritional
requirements of plasmodium falciparum in culture. I. exogenously supplied
dialyzable components necessary for continuous growth. The Journal of
Protozoology, 32(1), 59-64.
Duan, D., Cowley, S., Horowitz, B., & Hume, J. R. (1999). A serine residue in ClC3 links phosphorylation-dephosphorylation to chloride channel regulation by
cell volume. The Journal of General Physiology, 113(1), 57-70.
Duan, D., Fermini, B., & Nattel, S. (1995). Alpha-adrenergic control of volumeregulated cl- currents in rabbit atrial myocytes. characterization of a novel ionic
regulatory mechanism. Circulation Research, 77(2), 379-393.
Duan, D. Y., Fermini, B., & Nattel, S. (1992). Sustained outward current observed
after I(to1) inactivation in rabbit atrial myocytes is a novel Cl- current. The
American Journal of Physiology, 263(6 Pt 2), H1967-71.
Duranton, C., Huber, S. M., & Lang, F. (2002). Oxidation induces a cl(-)-dependent
cation conductance in human red blood cells. The Journal of Physiology,
539(Pt 3), 847-855.
Egee, S., Lapaix, F., Decherf, G., Staines, H. M., Ellory, J. C., Doerig, C., et al.
(2002). A stretch-activated anion channel is up-regulated by the malaria
parasite plasmodium falciparum. The Journal of Physiology, 542(Pt 3), 795801.
Ehara, T., & Hasegawa, J. (1983). Effects of hypertonic solution on action potential
and input resistance in the guinea-pig ventricular muscle. The Japanese
Journal of Physiology, 33(2), 151-167.
Elford, B. C., Haynes, J. D., Chulay, J. D., & Wilson, R. J. (1985). Selective stagespecific changes in the permeability to small hydrophilic solutes of human
erythrocytes infected with plasmodium falciparum. Molecular and Biochemical
Parasitology, 16(1), 43-60.
Elford, B. C., Pinches, R. A., Newbold, C. I., & Ellory, J. C. (1990). Heterogeneous
and substrate-specific membrane transport pathways induced in malariainfected erythrocytes. Blood Cells, 16(2-3), 433-436.
Fozzard, H. A., & Lee, C. O. (1976). Influence of changes in external potassium
and chloride ions on membrane potential and intracellular potassium ion
activity in rabbit ventricular muscle. The Journal of Physiology, 256(3), 663689.
Gadsby, D. C., Nagel, G., & Hwang, T. C. (1995). The CFTR chloride channel of
mammalian heart. Annual Review of Physiology, 57, 387-416.
Ginsburg, H., Krugliak, M., Eidelman, O., & Cabantchik, Z. I. (1983). New
permeability pathways induced in membranes of plasmodium falciparum
infected erythrocytes. Molecular and Biochemical Parasitology, 8(2), 177-190.
Ginsburg, H., Kutner, S., Krugliak, M., & Cabantchik, Z. I. (1985). Characterization
of permeation pathways appearing in the host membrane of plasmodium
falciparum infected red blood cells. Molecular and Biochemical Parasitology,
14(3), 313-322.
Ginsburg, H., & Stein, W. D. (2004). The new permeability pathways induced by
the malaria parasite in the membrane of the infected erythrocyte: Comparison
of results using different experimental techniques. The Journal of Membrane
Biology, 197(2), 113-134.
Grygorczyk, R., & Schwarz, W. (1983). Properties of the CA2+-activated K+
conductance of human red cells as revealed by the patch-clamp technique.
Cell Calcium, 4(5-6), 499-510.
Gupta, R. K., Gupta, P., & Moore, R. D. (1984). NMR studies of intracellular metal
ions in intact cells and tissues. Annual Review of Biophysics and
Bioengineering, 13, 221-246.
Hagiwara, N., Masuda, H., Shoda, M., & Irisawa, H. (1992). Stretch-activated anion
currents of rabbit cardiac myocytes. The Journal of Physiology, 456, 285-302.
Hamill O.P. (1998). Potassium channel currents in human red blood cell. J.
Physiol. 319: 97-98.
Harvey, R. D., & Hume, J. R. (1989). Autonomic regulation of a chloride current in
heart. Science (New York, N.Y.), 244(4907), 983-985.
Hiraoka, M., Kawano, S., Hirano, Y., & Furukawa, T. (1998). Role of cardiac
chloride currents in changes in action potential characteristics and
arrhythmias. Cardiovascular Research, 40(1), 23-33.
Horowitz, B., Tsung, S. S., Hart, P., Levesque, P. C., & Hume, J. R. (1993).
Alternative splicing of CFTR cl- channels in heart. The American Journal of
Physiology, 264(6 Pt 2), H2214-20.
Hsiao, L. L., Howard, R. J., Aikawa, M., & Taraschi, T. F. (1991). Modification of
host cell membrane lipid composition by the intra-erythrocytic human malaria
parasite plasmodium falciparum. The Biochemical Journal, 274 ( Pt 1)(Pt 1),
121-132.
Huber, S. M., Duranton, C., Henke, G., Van De Sand, C., Heussler, V., Shumilina,
E., et al. (2004). Plasmodium induces swelling-activated ClC-2 anion channels
in the host erythrocyte. The Journal of Biological Chemistry, 279(40), 4144441452.
Huber, S. M., Duranton, C., Henke, G., Van De Sand, C., Heussler, V., Shumilina,
E., et al. (2004). Plasmodium induces swelling-activated ClC-2 anion channels
in the host erythrocyte. The Journal of Biological Chemistry, 279(40), 4144441452.
Huber, S. M., Duranton, C., & Lang, F. (2005). Patch-clamp analysis of the "new
permeability pathways" in malaria-infected erythrocytes. International Review
of Cytology, 246, 59-134.
Huber, S. M., Uhlemann, A. C., Gamper, N. L., Duranton, C., Kremsner, P. G., &
Lang, F. (2002). Plasmodium falciparum activates endogenous cl(-) channels
of human erythrocytes by membrane oxidation. The EMBO Journal, 21(1-2),
22-30.
Hume, J. R., Duan, D., Collier, M. L., Yamazaki, J., & Horowitz, B. (2000). Anion
transport in heart. Physiological Reviews, 80(1), 31-81.
Jawetz, E., Melnick, JL., Brooks, GF., Butel, JS., Morse, SA y Vásquez Moctezuma
I. (2002) Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adleberg (17a edición).
México: El Manual Moderno.
Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., & Zdebik, A. A. (2002). Molecular structure
and physiological function of chloride channels. Physiological Reviews, 82(2),
503-568.
Kanaani, J., & Ginsburg, H. (1991). Transport of lactate in plasmodium falciparuminfected human erythrocytes. Journal of Cellular Physiology, 149(3), 469-476.
Karwatowska-Prokopczuk, E., Nordberg, J. A., Li, H. L., Engler, R. L., & Gottlieb,
R. A. (1998). Effect of vacuolar proton ATPase on pHi, Ca2+, and apoptosis in
neonatal cardiomyocytes during metabolic inhibition/recovery. Circulation
Research, 82(11), 1139-1144.
Kilborn, M. J., & Fedida, D. (1990). A study of the developmental changes in
outward currents of rat ventricular myocytes. The Journal of Physiology, 430,
37-60.
Kirk, K. (2001). Membrane transport in the malaria-infected erythrocyte.
Physiological Reviews, 81(2), 495-537.
Kirk, K., Ellory, J. C., & Young, J. D. (1992). Transport of organic substrates via a
volume-activated channel. The Journal of Biological Chemistry, 267(33),
23475-23478.
Kirk, K., & Horner, H. A. (1995). In search of a selective inhibitor of the induced
transport of small solutes in plasmodium falciparum-infected erythrocytes:
Effects of arylaminobenzoates. The Biochemical Journal, 311 ( Pt 3)(Pt 3),
761-768.
Kirk, K., Horner, H. A., Elford, B. C., Ellory, J. C., & Newbold, C. I. (1994).
Transport of diverse substrates into malaria-infected erythrocytes via a
pathway showing functional characteristics of a chloride channel. The Journal
of Biological Chemistry, 269(5), 3339-3347.
Krugliak, M., Zhang, J., & Ginsburg, H. (2002). Intraerythrocytic plasmodium
falciparum utilizes only a fraction of the amino acids derived from the digestion
of host cell cytosol for the biosynthesis of its proteins. Molecular and
Biochemical Parasitology, 119(2), 249-256.
Leida, M. N., Mahoney, J. R., & Eaton, J. W. (1981). Intraerythrocytic plasmodial
calcium metabolism. Biochemical and Biophysical Research Communications,
103(2), 402-406.
Leida, M. N., Mahoney, J. R., & Eaton, J. W. (1981). Intraerythrocytic plasmodial
calcium metabolism. Biochemical and Biophysical Research Communications,
103(2), 402-406.
Levesque, P. C., Hart, P. J., Hume, J. R., Kenyon, J. L., & Horowitz, B. (1992).
Expression of cystic fibrosis transmembrane regulator cl- channels in heart.
Circulation Research, 71(4), 1002-1007.
Lew, V. L., & Hockaday, A. R. (1999). The effects of transport perturbations on the
homeostasis of erythrocytes. Novartis Foundation Symposium, 226, 37-50;
discussion 50-4.
Lew, V. L., Tiffert, T., & Ginsburg, H. (2003). Excess hemoglobin digestion and the
osmotic stability of plasmodium falciparum-infected red blood cells. Blood,
101(10), 4189-4194.
London, R. E. (1991). Methods for measurement of intracellular magnesium: NMR
and fluorescence. Annual Review of Physiology, 53, 241-258.
Lu, Z., & MacKinnon, R. (1994). Electrostatic tuning of Mg2+ affinity in an inwardrectifier K+ channel. Nature, 371(6494), 243-246.
Maguire, P. A., Prudhomme, J., & Sherman, I. W. (1991). Alterations in erythrocyte
membrane phospholipid organization due to the intracellular growth of the
human malaria parasite, plasmodium falciparum. Parasitology, 102 Pt 2, 179186.
Matsuura, H., & Ehara, T. (1992). Activation of chloride current by purinergic
stimulation in guinea pig heart cells. Circulation Research, 70(4), 851-855.
Meirelles, M. N., Pereira, M. C., Singer, R. H., Soeiro, M. N., Garzoni, L. R., Silva,
D. T., et al. (1999). Trypanosoma cruzi-cardiomyocytes: New contributions
regarding a better understanding of this interaction. Memorias do Instituto
Oswaldo Cruz, 94 Suppl 1, 149-152.
Miles, M. A., Feliciangeli, M. D., & de Arias, A. R. (2003). American
trypanosomiasis (chagas' disease) and the role of molecular epidemiology in
guiding control strategies. BMJ (Clinical Research Ed.), 326(7404), 1444-1448.
Murray, C. and Lopez A, editors. (1996) The global burden of disease: a
comparative assessment of mortality and disability from diseases, injuries,
and risk factors in 1990 and projected to 2020. Cambridge (MA): Harvard
University Press.
Nilius, B., & Droogmans, G. (2003). Amazing chloride channels: An overview. Acta
Physiologica Scandinavica, 177(2), 119-147.
Okada, Y. (1997). Volume expansion-sensing outward-rectifier cl- channel: Fresh
start to the molecular identity and volume sensor. The American Journal of
Physiology, 273(3 Pt 1), C755-89.
Pereira, M. C., Costa, M., Chagas Filho, C., & de Meirelles, M. N. (1993).
Myofibrillar breakdown and cytoskeletal alterations in heart muscle cells during
invasion by trypanosoma cruzi: Immunological and ultrastructural study.
Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 25(4), 559-569.
Pereira, M. C., Singer, R. H., & de Meirelles, M. N. (2000). Trypanosoma cruzi
infection affects actin mRNA regulation in heart muscle cells. The Journal of
Eukaryotic Microbiology, 47(3), 271-279.
Romani, A. M., & Scarpa, A. (2000). Regulation of cellular magnesium. Frontiers in
Bioscience : A Journal and Virtual Library, 5, D720-34.
Rosenthal, P. J. y Goldsmith Robert S. (2008). Diagnóstico Clínico y tratamiento.
47a edición Lange. McGrawHill Cap. 35: 1286-1327.
Rudzinska, M. A., Trager, W., & Bray, R. S. (1965). Pinocytotic uptake and the
digestion of hemoglobin in malaria parasites. The Journal of Protozoology,
12(4), 563-576.
Sakaguchi, M., Matsuura, H., & Ehara, T. (1997). Swelling-induced cl- current in
guinea-pig atrial myocytes: Inhibition by glibenclamide. The Journal of
Physiology, 505 ( Pt 1)(Pt 1), 41-52.
Saliba, K. J., Horner, H. A., & Kirk, K. (1998). Transport and metabolism of the
essential vitamin pantothenic acid in human erythrocytes infected with the
malaria parasite plasmodium falciparum. The Journal of Biological Chemistry,
273(17), 10190-10195.
Schwartz, R. S., Olson, J. A., Raventos-Suarez, C., Yee, M., Heath, R. H., Lubin,
B., et al. (1987). Altered plasma membrane phospholipid organization in
plasmodium falciparum-infected human erythrocytes. Blood, 69(2), 401-407.
Shuba, L. M., Ogura, T., & McDonald, T. F. (1996). Kinetic evidence distinguishing
volume-sensitive chloride current from other types in guinea-pig ventricular
myocytes. The Journal of Physiology, 491 ( Pt 1)(Pt 1), 69-80.
Sierra-Johnson, J., Olivera-Mar, A., Monteon-Padilla, V. M., Reyes, P. A., &
Vallejo, M. (2005). Epidemiological and clinical outlook of chronic chagas'
heart disease in mexico. [Panorama epidemiologico y clinico de la cardiopatia
chagasica cronica en Mexico] Revista De Saude Publica, 39(5), 754-760.
Silber, A. M., Colli, W., Ulrich, H., Alves, M. J., & Pereira, C. A. (2005). Amino acid
metabolic routes in trypanosoma cruzi: Possible therapeutic targets against
chagas' disease. Current Drug Targets.Infectious Disorders, 5(1), 53-64.
Simoes, A. P., Moll, G. N., Beaumelle, B., Vial, H. J., Roelofsen, B., & Op den
Kamp, J. A. (1990). Plasmodium knowlesi induces alterations in
phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine molecular species
composition of parasitized monkey erythrocytes. Biochimica Et Biophysica
Acta, 1022(2), 135-145.
Snow, R. W., Guerra, C. A., Noor, A. M., Myint, H. Y., & Hay, S. I. (2005). The
global distribution of clinical episodes of plasmodium falciparum malaria.
Nature, 434(7030), 214-217.
Sorota, S. (1992). Swelling-induced chloride-sensitive current in canine atrial cells
revealed by whole-cell patch-clamp method. Circulation Research, 70(4), 679687.
Staines, H. M., Alkhalil, A., Allen, R. J., De Jonge, H. R., Derbyshire, E., Egee, S.,
et al. (2007). Electrophysiological studies of malaria parasite-infected
erythrocytes: Current status. International Journal for Parasitology, 37(5), 475482.
Staines, H. M., Ashmore, S., Felgate, H., Moore, J., Powell, T., & Ellory, J. C.
(2006). Solute transport via the new permeability pathways in plasmodium
falciparum-infected human red blood cells is not consistent with a simple
single-channel model. Blood, 108(9), 3187-3194.
Staines, H. M., Chang, W., Ellory, J. C., Tiffert, T., Kirk, K., & Lew, V. L. (1999).
Passive ca(2+) transport and ca(2+)-dependent K(+) transport in plasmodium
falciparum-infected red cells. The Journal of Membrane Biology, 172(1), 13-24.
Staines H. M. (1998). Cation Transport in the Malaria-Infected Erythrocyte (DPhil
thesis). Oxford, UK: Univ. of Oxford.
Staines, H. M., Dee, B. C., Shen, M. R., & Ellory, J. C. (2004). The effect of
mefloquine and volume-regulated anion channel inhibitors on induced
transport in plasmodium falciparum-infected human red blood cells. Blood
Cells, Molecules & Diseases, 32(3), 344-348.
Staines, H. M., Ellory, J. C., & Kirk, K. (2001). Perturbation of the pump-leak
balance for na(+) and K(+) in malaria-infected erythrocytes. American Journal
of Physiology.Cell Physiology, 280(6), C1576-87.
Staines, H. M., Powell, T., Ellory, J. C., Egee, S., Lapaix, F., Decherf, G., et al.
(2003). Modulation of whole-cell currents in plasmodium falciparum-infected
human red blood cells by holding potential and serum. The Journal of
Physiology, 552(Pt 1), 177-183.
Strange, K., Emma, F., & Jackson, P. S. (1996). Cellular and molecular physiology
of volume-sensitive anion channels. The American Journal of Physiology,
270(3 Pt 1), C711-30.
Tanabe, K., Izumo, A., & Kageyama, K. (1986). Growth of plasmodium falciparum
in sodium-enriched human erythrocytes. The American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene, 35(3), 476-478.
Tanabe, K., Mikkelsen, R. B., & Wallach, D. F. (1983). Transport of ions in
erythrocytes infected by plasmodia. Ciba Foundation Symposium, 94, 64-73.
Tiffert, T., Staines, H. M., Ellory, J. C., & Lew, V. L. (2000). Functional state of the
plasma membrane Ca2+ pump in plasmodium falciparum-infected human red
blood cells. The Journal of Physiology, 525 Pt 1, 125-134.
Tilly, B. C., Bezstarosti, K., Boomaars, W. E., Marino, C. R., Lamers, J. M., & de
Jonge, H. R. (1996). Expression and regulation of chloride channels in
neonatal rat cardiomyocytes. Molecular and Cellular Biochemistry, 157(1-2),
129-135.
Tseng, G. N. (1992). Cell swelling increases membrane conductance of canine
cardiac cells: Evidence for a volume-sensitive cl channel. The American
Journal of Physiology, 262(4 Pt 1), C1056-68.
Tuteja, R. (2007). Malaria - an overview. The FEBS Journal, 274(18), 4670-4679.
Upston, J. M., & Gero, A. M. (1995). Parasite-induced permeation of nucleosides in
plasmodium falciparum malaria. Biochimica Et Biophysica Acta, 1236(2), 249258.
Vandenberg, C. A. (1987). Inward rectification of a potassium channel in cardiac
ventricular cells depends on internal magnesium ions. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 84(8), 25602564.
Vandenberg, J. I., Rees, S. A., Wright, A. R., & Powell, T. (1996). Cell swelling and
ion transport pathways in cardiac myocytes. Cardiovascular Research, 32(1),
85-97.
Vandenberg, J. I., Yoshida, A., Kirk, K., & Powell, T. (1994). Swelling-activated and
isoprenaline-activated chloride currents in guinea pig cardiac myocytes have
distinct electrophysiology and pharmacology. The Journal of General
Physiology, 104(6), 997-1017.
Verloo, P., Kocken, C. H., Van der Wel, A., Tilly, B. C., Hogema, B. M.,
Sinaasappel, M., et al. (2004). Plasmodium falciparum-activated chloride
channels are defective in erythrocytes from cystic fibrosis patients. The Journal
of Biological Chemistry, 279(11), 10316-10322.
Voets, T., Janssens, A., Prenen, J., Droogmans, G., & Nilius, B. (2003). Mg2+dependent gating and strong inward rectification of the cation channel TRPV6.
The Journal of General Physiology, 121(3), 245-260.
Walsh, K. B. (1991). Activation of a heart chloride current during stimulation of
protein kinase C. Molecular Pharmacology, 40(3), 342-346.
Walsh, K. B., & Parks, G. E. (2002). Changes in cardiac myocyte morphology alter
the properties of voltage-gated ion channels. Cardiovascular Research, 55(1),
64-75.
Walsh, K. B., & Zhang, J. (2005). Regulation of cardiac volume-sensitive chloride
channel by focal adhesion kinase and src kinase. American Journal of
Physiology.Heart and Circulatory Physiology, 289(6), H2566-74.
White, R. E., & Hartzell, H. C. (1989). Magnesium ions in cardiac function.
regulator of ion channels and second messengers. Biochemical
Pharmacology, 38(6), 859-867.
Yamamoto-Mizuma, S., Wang, G. X., Liu, L. L., Schegg, K., Hatton, W. J., Duan,
D., et al. (2004). Altered properties of volume-sensitive osmolyte and anion
channels (VSOACs) and membrane protein expression in cardiac and smooth
muscle myocytes from Clcn3-/- mice. The Journal of Physiology, 557(Pt 2),
439-456.
Zygmunt, A. C., & Gibbons, W. R. (1991). Calcium-activated chloride current in
rabbit ventricular myocytes. Circulation Research, 68(2), 424-437.