Vitrificación y banco de ovocitos

VITRIFICACION Y BANCO DE OVOCITOS
Rocio Díaz, Rocío Peña y Antonio L. González-Utor
MasVida Reproducción
Avda. Reino Unido nº 1. 41012 Sevilla
Han pasado más de 75 años desde la primera vitrificación realizada en
espermatozoides de rana, a las recientes altas tasas de supervivencia de
ovocitos y embriones obtenidas con este procedimiento. Sin embargo, no ha
sido un desarrollo continuo. Hasta la década de los años noventa del siglo
pasado, no ha evolucionado la técnica hasta llegar a conseguir los resultados
que hoy día son publicados. Inicialmente, esto se observa por el enorme interés
suscitado por la vitrificación en el número de artículos publicados que genera
una curva exponencial a partir de esa década. No es hasta finales de los 90
cuando nacen los primeros niños fruto de la vitrificación (1998 procedente de
embriones vitrificados, 1999 procedente de ovocitos vitrificados y 2001
procedente de blastocistos vitrificados).
Denominamos la vitrificación al proceso de conversión de una solución
acuosa en un sólido amorfo vítreo, carente de toda estructura cristalina. En
nuestra actividad se consigue por el descenso ultrarápido de temperatura con
la ayuda de sustancias crioprotectoras hasta llegar a crioconservar los gametos
y embriones a muy bajas temperaturas, disminuyendo así las funciones
celulares y manteniendo las condiciones de “vida suspendida” por un largo
periodo de tiempo.
La vitrificación elimina efectos adversos que antes nos encontramos con
congelación a bajas temperaturas o de rampa lenta. Estos hacían que la
supervivencia no fuera la deseada por muchos centros. Entre estos daños, nos
encontramos, los producidos por el enfriamiento o efecto “shilling”, los
producidos por la formación de cristales de hielo y los producidos por
criofracturas en el sólido congelado.
Los daños por enfriamiento se producen a temperaturas altas, entre los
15ºC y -5ºC. Entre ellos encontramos la desnaturalización de los lípidos de la
membrana, por el cambio en la frecuencia de grupos radicales bivalentes CH2
que transforma la bicapa lipídica desde la fase cristalina líquida o fluida a la
fase cristalina sólida o gel (Ghetler y cols, 2005). También encontramos daños
en los microtúbulos tanto del huso meiótico de los ovocitos en metafase II como
de su citoesqueleto. La despolimerización de estos microtúbulos del huso
puede acarrear una inadecuada segregación cromosómica al finalizar la
meiosis y producir ovocitos no balanceados que darán lugar a cigotos
aneuploides. Otro de los daños del efecto “shilling” es el endurecimiento de la
zona pelúcida por causa de la reacción de granulos corticales prematura.
Los daños por la formación de cristales de hielo se produce a
temperaturas entre -5ºC y -80ºC. Estos son fundamentalmente mecánicos
debidos a roturas que producen las aristas de los cristales no solo a nivel de
membrana plasmática, sino también a diferentes organelas como las
mitocondrias.
Por último se encuentran los daños producidos por criofracturas que se
dan entre la temperatura de transición vítrea de la solución (Tg) y la
temperatura de ebullición del nitrógeno (Arav, 2014). Esta se produce por el
“efecto tijera” entre dos masas sólidas que se deslizan una sobre la otra,
fracturándose. Si la muestra se encuentra entre ellas, también esta se romperá.
Además puede producirse la desvitrificación a causa del calor que desprende
esta rotura del material solidificado.
Sin embargo, hay inconvenientes que son incrementados por este
proceso como son la exposición a altas concentraciones de crioprotectores
citotóxicos y los choques osmóticos producidos por ellos. El agua pura puede
llegar a vitrificar, pero necesita una velocidad de enfriamiento de unos 100
millones de grados centígrados por minuto, velocidad hoy día inalcanzable.
La razón de la utilización de altas concentraciones de crioprotectores es
aumentar el valor de Tg y disminuir la temperatura de nucleación homogénea
del hielo (Th). La concentración mínima (Cv) para vitrificar una solución es
aquella que se encuentra con el mismo valor Tg y Th (Fahy y cols., 2004). En el
caso de una disolución de glicerol en agua, se necesita una concentración muy
alta (aprox. 60% w/w) para llegar a coincidir estos valores. La solución es
realizar un descenso térmico ultrarápido. Hoy día, con los soportes
comercializados, podemos llegar a velocidades tan altas como 20.000 a
70.000º C/min., sumergiéndolos directamente en el refrigerante.
También
son
importantes
otros
puntos como
las
mezclas
de
crioprotectores (tanto permeables como no permeables) que determinan la
viscosidad de la solución como el volumen de esta que se deposita en el
soporte para vitrificar. Este volumen debe de ser mínimo para que sea mayor la
conducción térmica.
Por tanto, la probabilidad de la vitrificación puede definirse por (Arav,
2014):
= ((
Siendo
∗µ /
Pv la probabilidad de vitrificación
Re y Rc los ratios de enfriamiento y calentamiento.
µ la viscosidad de la solución
V el volumen de la muestra
Esta probabilidad está directamente relacionada con las velocidades de
enfriamiento y calentamiento, y con la viscosidad (a mayores valores mayor
probabilidad). Sin embargo, es inversamente proporcional al volumen (menor
valor mayor probabilidad).
Aunque velocidades de enfriamiento y calentamiento están relacionadas
con la probabilidad de vitrificación, es la segunda quien domina en la
supervivencia. Con velocidades de calentamiento que superan los 100.000º
C/min, se obtienen las mismas tasas de supervivencia con ratios de
enfriamiento de entre 95 a 69.250º C/min. (Mazur y Seki, 2011).
Otros factores a tener en cuenta, en el proceso de vitrificación son:
1.- Las características propias del ovocito por presentar una baja permeabilidad
al agua y crioprotectores, y una alta relación superficie/volumen que puede dar
lugar a un pseudoequilibrio de los crioprotectores dentro del citoplasma.
2.- La relación de la permeabilidad del agua y los crioprotectores con la
temperatura. El tiempo de equilibrio será mayor cuando menor sea la
temperatura.
3.- Las propiedades de formación vítrea de los propios crioprotectores.
Todos estos avances en el campo de la vitrificación, han dado lugar a
excelentes resultados tanto con ovocitos propios como de donante, siendo
siempre superiores a los obtenidos con anterioridad con la congelación lenta
(Fadini y cols, 2009).
En cuanto a la comparación de ovocitos propios o donados con respecto
a si son “frescos” o vitrificados no presentan diferencias en cuanto a tasas de
fecundación, desarrollo embrionario, y tasas de embarazo e implantación
(Rienzi y cols, 2010; Sole y cols, 2013). También hay estudios que determinan
que la vitrificación del ovocito no afecta a la posibilidad de revitrificar a los
embriones sobrantes, teniendo estos las mismas tasas de embarazo que
aquellos embriones que no provienen de ovocitos vitrificados (Cobo y cols,
2013).
Todas
estas
evidencias
indican
que
la
técnica
de
vitrificación/desvitrificación no debe de ser tomada ya como experimental y sea
una herramienta más en los centros de reproducción humana asistida (ASRM,
2013). Además, hoy día a expensas de estudios más amplios, los datos
disponibles acerca del seguimiento de niños nacidos después de la vitrificación
hasta el momento no muestran efectos negativos de la técnica (Chian y cols,
2008; Cobo y cols, 2013).
Todo ello, conlleva a plantear nuevas estrategias en los servicios que se
prestan a los pacientes, como es la instauración de bancos de ovocitos
donados (Cobo y cols, 2011). Por un lado, se elimina la necesidad de
sincronización donante-receptora y la lista de espera. Por otro lado, la
posibilidad de obtener unos buenos resultados con un mínimo número de
ovocitos hace que el coste-beneficio para las pacientes receptoras les sea muy
aceptable (Glujovsky y cols, 2011). El banco de ovocitos puede ser usado por
el propio centro o por otros centros que no puedan tener donantes de ovocitos
por diferentes motivos (ciudades pequeñas, falta de fenotipos específicos, etc.).
El fundamento del banco de ovocitos como servicio de donación a otros
centros, no radica en más que la distribución. En nuestra experiencia, tras estar
colaborando con ocho centros nacionales e internacionales, la distribución se
ha garantizado con un buen servicio de transporte y la confianza en la
recepción en condiciones óptimas de las muestras. Aunque hay autores que
indican que por debajo de entre -120 y -130º C, Tg del citoplasma, este puede
entrar en transición líquida, promoviendo la desvitrificación y subsecuente
recristalización. Por tanto, los ovocitos llegarían a destino sin posibilidad de
sobrevivir a la desvitrificación.
Sin embargo, esto no es así pues los estudios fueron realizados con
azucares como crioprotectores, y no con las complejas soluciones que se usan
hoy día. También estudios recientes determinan que la temperatura de
desvitrificación (Td) es mucho menor a Tg (aprox. -102º C) (Sansinena , 2014)
pudiendo entonces realizar el transporte sin mayores problemas con un tiempo
de permanencia de las muestras, que en nuestra experiencia llega hasta 68h.
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