utilidad de las muestras de sangre total desecada

Rev. ínst. Med. trop. São Paulo
31 {2): 100-102, março-abril, 1989
UTILIDAD DE LAS MUESTRAS DE SANGRE TOTAL DESECADA EN PAPEL DE FILTRO EN LA
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTITOXOPLASMA
J o a q u i m G A S C O N ( 1 ) , J o s e p M . T O R R E S - R O D R I G U E Z (2) & C a r m e n G O N Z A L E Z
(2)
RESUMEN
S e c o m p a r a l a técnica de A g l u t i n a c i ó n D i r e c t a ( A D ) utilizando muestras de
sangre total desecada en papel de filtro, con l a técnica de E L I S A y la m i s m a A D
utilizando muestras de suero de los mismos pacientes, p a r a l a detección de anticuerpos antitoxoplasma.
L o s resultados muestran la validez del método de la sangre desecada en papel
de filtro p a r a l a detección de anticuerpos a n t i t o x o p l a s m a con l a técnica de A D ,
y se considera su utilidad en los estúdios epidemiológicos de campo.
U N I T E R M O S : T o x o p l a s m o s i s ; R e a c c i ó n de A g l u t i n a c i ó n directa; S a n g r e total en
papel de filtro.
INTRODUCCION
E l estúdio de l a prevalência de los anticuerpos a n t i t o x o p l a s m a en muestras representativas de u n a problación constituye un requisito
indispensable para reconocer la extension de l a
toxoplasmosis en l a c o m u n i d a d .
D i v e r s o s autores h a n demostrado l a utilidad dei método de l a sangre desecada en papel
de filtro p a r a la detección de anticuerpos en enfermedades como el p a l u d i s m o , l a hepatitis ,
o l a tripanosomiasis y h a n evidenciado Ias ventajas de este método que no requiere personal
especializado ni utillaje sofisticado y facilita además los envios de Ias muestras h a s t a los centros
de procesamiento de Ias m i s m a s .
2
antitoxoplasma mediante la reacción de A g l u t i nación D i r e c t a ( A D ) . E s t a técnica h a sido utilizada por otros autores
demostrando que tiene u n a alta sensibilidad y especificidad. S e h a
c o m p a r a d o con los resultados obtenidos con
sueros de los mismos pacientes con l a técnica
de A D y la E L I S A técnica esta ú l t i m a que se
h a tomado como patrón de referencia.
4
5
5
1
MATERIAL Y MÉTODOS
10
8
E n nuestro estúdio hemos e n s a y a d o e s t a
técnica, a p l i c a d a a la detección de anticuerpos
Se h a n estudiado muestras de suero y sangre
total desecada en papel de filtro de 32 personas,
escogidas al azar, provenientes dei dispensario
dei H o s p i t a l dei Mar (Barcelona), a los que se
h a b i a pedido l a detección de anticuerpos antitox o p l a s m a ante l a sospecha de enfermedad o sim
plemente como ''screening" en embarazadas.
(1) H ó p i t a l N e m b a , R w a n d a .
(2) S e r v e i M i c r o b i o l o g i a C l í n i c a , H o s p i t a l d e i M a r , B a r c e l o n a , E s p a ñ a .
D i r e c c i ó n p a r a l a c o r r e s p o n d ê n c i a : D r . J o s e p M. T o r r e s - R o d r í g u e z . S e r v e i M i c r o b i o l o g i a C l í n i c a — H o s p i t a l del M a r . P a s s e i g
M a r i t i m , 25-27. 08003 B a r c e l o n a , E s p a ñ a .
G A S C O N , J.; T O R R E S
R O D R I G U E Z ,
J . M. &
GONZALEZ,
C. — Utilidad
en p a p e l de filtro en la d e t e c c i ó n de a n t i c u e r p o s a n t i t o x o p l a s m a .
de l a s m u e s t r a s de s a n g r e total d e s e c a d a
R e v . I n s t . M e d . t r o p . S ã o P a u l o , 31 ( 2 ) :
100 1 0 2 ,
1989.
L a s muestras se obtuvieron por punción venosa. D e cada paciente se separaron tres gotas
de sangre que se depositaron en papel de filtro.
C a d a gota de sangre ocupaba un área de 15mm.
de diâmetro. L o s papeles de filtro se dejaron se
car a la temperatura ambiente y luego guardados a 4 C hasta el momento de su utilización.
E l resto de la sangre se centrifugo p a r a l a obtención de suero que se guardo a - 2 0 C hasta el
momento de ser procesadas.
P a r a la elución de los papeles de filtro se
empleó 0,5 m l de tampón fosfato ( P B S ) durante
24 horas a 4 C .
P a r a la técnica de A D se utilizaron los kits
de Toxo-screen D A (Biomérieux, L y o n ) . D e cada muestra se emplearon dos diluciones en P B S ,
a 1/20 y 1/80, que después dei proceso seguido
con l a técnica se encontraron a diluciones de
1/40 y 1/160 respectivamente. E l título de 1/40
es el valor discriminativo entre u n a reacción po
sitiva y u n a de negativa.
4
de sangre total desecada en papel de filtro como
en las muestras de suero. E x c e p t o en una paciente que dió positivo en el test de E L I S A (valor
de 21 U I ) y negativo en los tests de A D , la concor
dancia de resultados fue total en el resto de las
muestras.
Se observaron dos fenômenos de prozona en
dos muestras en las que se utilizo suero con la
técnica de A D (negativo a 1/40 y positivo a 1/160).
E n ambos casos los resultados fueron positivos
con las muestras de sangre total desecada, sin
que se observara el fenômeno de prozona.
T o m a n d o como técnica de referencia el test
de E L I S A , la sensibilidad dei método fue dei 94%
y la especificidad dei 100%. A l observar los resul
tados con la técnica de E L I S A entre los sueros
positivos, se encontraron diferentes grados de
reactividad (tabla 1). A l comparar Ias tres técnicas entre si, los resultados obtenidos no mues
tran diferencias estadisticamente significativas
( X - 0.08).
2
L a lectura se hace a Ias cinco horas después
de la dilución de la sangre o suero problema tratados con el 2-mercaptoetanol (2-ME) y la suspension de antigeno, dejando reposar los pocillos a l a temperatura ambiente, al resguardo
de la desecación y Ias vibraciones.
TABLA 1
R e a c t i v i d a d d e I a s m u e s t r a s e n e l t e s t de E L I S A .
UI
n
L a lectura, que es macroscópica, puede repe
tirse a Ias 18 horas siendo esta m u y fácil: reacción positiva cuando la aglutinación de los toxoplasmas en forma de velo tapiza como m i n i m o
la m i t a d del fondo dei pocillo, pudiendo estar
retraido en los bordes; reacción negativa cuando
los toxoplasmas sedimentan en botón o anillo.
sueros
< 10
10 15
16-20
21 25
26 30
31 35
15
2
5
2
6
2
U I : Unidades Internacionales.
DISCUSION
L a técnica de A D , fue descrita por F U L T O N
& T U R K y a m p l i a d a por los trabajos de C O U ZINEAU & BAUFINE-DUCROQ y DESM O N T S , que incluyeron en ella el 2-ME y un
antigeno de mayor calidad que mejoraban tanto
la sensibilidad como la especificidad.
6
4
Como técnica de referencia se empleó un enz i m a immuno-ensayo en fase sólida, determinando I g G contra T o x o p l a s m a gondii ( L a b s y s t e m s ,
Helsinki ). Conforme con los fabricantes, un v a
lor de 10 U I (equivalentes a 1.0 de densidad optica) o superior se consideran positivos.
5
1
RESULTADOS
Mediante el test de E L I S A , 17 de los sueros
dieron resultado positivo y 15 negativo.
C o n la técnica de A D , los resultados fueron
16 positivos y 16 negativos tanto en las muestras
E n nuestro estúdio no hubo diferencias entre
los resultados de Ias muestras de sangre y pias
m a procesados por A D , y tomando como técnica
de referencia el test de E L I S A , la especificidad
y la sensibilidad fueron similares a Ias de esta
última.
L a técnica de A D h a sido y a evaluada como
técnica de " s c r e e n i n g " en estúdios epidemioló
gicos aunque siempre se habian utilizado sue
4
5
ros. Otros autores h a n valorado la utilidad de
la sangre total desecada en papel de filtro con
técnicas distintas de la A D . L o s resultados
obtenidos en este estúdio muestran que la técnica de desecación de sangre total en papel de
filtro es útil para la obtención de muestras válidas para su procesamiento con la técnica de A D .
3
9
T h e results show the validity of the dry blood
samples in filter paper for detecting antitoxo¬
p l a s m a antibodies with a D A test. Our results
would confirm their usefulness in field epidemio
logical surveys.
REFERENCIAS
L a posibilidad de obtener la sangre a través
de u n a simple punción d i g i t a l facilita aún mas
la obtención de muestras en estúdios epidemiológicos de masas.
1.
2
c i f i c I g G a n d I g M a n t i b o d i e s to T o x o p l a s m a g o n d i i w i t h
a commercially available enzyme i m m u n o a s s a y kit system.
J . c l i n . P a t h . , 38: 679-689, 1985.
2.
Otra ventaja para detectar anticuerpos I g G ,
es que en la sangre desecada, se h a descrito la
desnaturalización de las I g M lo que favoreceria
la acción dei 2-ME de l a A D , en el aumento de
especificidad de la prueba.
7
B A L F O U R . A . H . & H A R F O R D . J . P. — D e t e c t i o n of s p e ¬
B R U C E C H W A T T , L . J . — D i a g n o s t i c m e t h o d s in m a l a r i a .
I n : B R U C E C H W A T T , L . J . — E s s e n t i a l m a l a r i o l o g y . 2nd
e d . L o n d o n , H e i n e m a n n , 1985. p. 101 126.
3.
C O U T I N H O , S . G . — A p l i c a ç ã o d a t é c n i c a d e c o l e t a de
s a n g u e total em disco de p a p e l p a r a o d i a g n ó s t i c o d a toxo
p l a s m o s e p e l a s r e a ç õ e s de i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a e
S a b i n - F e l d m a n . R e v . S o c . b r a s . M e d . t r o p . , 4 ( s u p l . ) : 21-22,
1970.
L o s fenômenos de prozona h a n sido descri
tos con esta técnica . E n estúdios epidemioló
gicos este fenômeno pierde s u importância, aunque si se quiere u n a buena precision, pueden
procesarse dos diluciones de u n a m i s m a muestra.
4.
C O U Z I N E A U , P. & B A U F I N E D U C R O Q . H. — Aggluti
5
n a t i o n directe des t o x o p l a s m e s . P r e p a r a t i o n de l'antigène
et e x a m e n d e 400 s é r u m s . A n n . B i o l , c l i n . , 28: 4 1 1 - 4 1 5 ,
1970.
5.
D E S M O N T S , G . —- D é p i s t a g e d e l a t o x o p l a s m o s e p a r ag¬
g l u t i n a t i o n des p a r a s i t e s . I n t è r ê t d ' u n a n t i g è n e três sensi¬
ble p o u r l a r e c h e r c h e des i m m u n o g l o b u l i n e s
G spécifi¬
q u e s . A n n . B i o l , c l i n . , 41: 139-143, 1983.
E n conclusion, l a técnica de la gota de sangre desecada en papel de filtro y procesada mediante la técnica de A D , que es de u n a gran sen
cillez y fácil lectura, puede ser de gran utilidad
para los estúdios epidemiológicos sobre la prevalência de la toxoplasmosis, así como en estúdios
en pequenos animales.
6.
F U L T O N , J . D. & T U R K . J . L. — Direct
agglutination
for T o x o p l a s m a g o n d i i . L a n c e t , 2: 1068-1069, 1959.
7.
S E R O L O G I C A L testing in malaria. B u l l . Wld. H l t h . Org.,
50: 527-535, 1974.
8.
S O U Z A . S . L . & C A M A R G O . M. E . — T h e u s e o f f i l t e r
p a p e r b l o o d s m e a r s i n a p r a c t i c a l f l u o r e s c e n t t e s t for A m e ¬
r i c a n T r y p a n o s o m i a s i s sero d i a g n o s i s . R e v . Inst.
Med.
t r o p . S . P a u l o , 8: 255-258. 1966.
SUMMARY
9.
Usefulness of dry blood samples on filter paper
in the detection of antitoxoplasma antibodies.
W A L L A C E , G . D . — S a b i n F e l d m a n d y e t e s t for t o x o p l a s
m o s i s . T h e u s e of s o d i u m c i t r a t e i n a c c e s s o r y factor
and
a m e t h o d for c o l l e c t i n g a n d s t o r i n g b l o o d o n p a p e r d i s c .
A m e r . J . t r o p . M e d . H y g . , 18: 395-398. 1969.
Direct Agglutination ( D A ) techniques, both,
using dry blood samples in filter paper and serum samples, were compared with the E L I S A
test in order to detect antibodies against T o x o plasma gondii.
10.
Z H U A N G , H.; C O U L E P I S , A. G . ; L O C A R N I N I , S . A. &
G U S T , I . D . — D e t e c t i o n of m a r k e r s of h e p a t i t i s B i n f e c ¬
t i o n i n s e r u m d r i e d o n to f i l t e r p a p e r : a n a p p l i c a t i o n
f i e l d s t u d i e s . B u l l . W l d . H l t h . O r g . , 60: 783-787, 1982.
R e c e b i d o p a r a p u b l i c a ç ã o e m 30/8/1988
to