Determinación de la bacteria Helicobacter pylori en abastecimientos

UNED
Documento de tesis para optar por el grado de doctora en
Ciencias Naturales para el Desarrollo
Énfasis de Gestión y Cultura Ambiental
“Determinación de la bacteria Helicobacter pylori
en abastecimientos de agua para consumo
humano y su implicación en el manejo del agua en
Costa Rica”.
Virginia Montero Campos
Octubre 2010
“Determinación de la bacteria Helicobacter pylori en
abastecimientos de agua para consumo humano, y su implicación
en el manejo del agua en Costa Rica”.
Documento presentado al Programa de Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo
para optar por el grado académico de Doctora en Ciencias Naturales. Ph.D
Miembros del Tribunal
______________________
Fernando García Santamaría, Ph.D
Tutor
____________________
Floria Roa Gutiérrez, Ph.D
_________________________
Freddy Araya Rodríguez, Ph.D
_________________________
Jesús Mora Molina, Ph.D
___________________
Willy Soto Acosta, Ph.D
____________________
Sayra Munguía Ulloa, Ph.D
_____________________
Tomás Guzmán Hernández, Ph.D
RESUMEN
Helicobacter pylori es una bacteria que se estima, está presente en la mitad de la
población y es un problema de salud pública a nivel mundial; la colonización
ocurre mayormente en países en vías de desarrollo y se considera estrechamente
relacionada con factores socioeconómicos. Bajo condiciones no bien establecidas,
esta relación es frecuente que provoque diferentes patologías: gastritis, úlceras,
linfoma MALT de células B y cáncer gástrico. Con respecto al origen, las
investigaciones sobre Helicobacter pylori generalmente se han realizado a partir
de muestras directas o indirectas de pacientes humanos y muy pocos trabajos dan
cuenta de su hallazgo en agua y menos en agua de consumo de una población.
En este trabajo se analizaron un total de 122 muestras de agua de consumo
poblacional de 20 cantones elegidos de zonas con alta y baja incidencia de
cáncer gástrico en Costa Rica según la información estadística del Registro
Nacional de Tumores. Se logró el cultivo e identificación molecular con el
marcador glmM de Helicobacter pylori en el 39 % de las muestras de agua de las
zonas de alta incidencia de cáncer gástrico y en el 7,5 % de las muestras de las
zonas de baja incidencia. Dos productos de PCR del gen glmM de dos muestras
aisladas de las zonas de alta incidencia fueron secuenciados y corroborados como
verdaderos aislamientos de H. pylori. Se recolectó información sobre la naturaleza
del agua que manejan los Entes Operadores de los Acueductos de las zonas en
estudio y se encontró un coeficiente de correlación de Pearson entre incidencia de
cáncer gástrico y altitud de 0,867, entre incidencia de cáncer gástrico y
temperatura ambiental de - 0,853, entre incidencia de cáncer gástrico y origen del
agua como naciente de 0,651, un coeficiente de regresión lineal entre incidencia y
temperatura de 0,728; y en la prueba exacta de Fisher se evalúo la independencia
entre nivel de incidencia (baja y alta) con Ente Operador del Acueducto al 2005, se
determinó un valor de p < 0,05, concluyéndose que existe relación entre las
variables y que esta relación no se debe al azar con un 95% de confianza, así se
puede concluir que existe relación entre quien opera el acueducto y la incidencia
de cáncer gástrico para ambas zonas de estudio y que el Ente Operador puede
ser entonces una variable muy importante en el problema. Este trabajo aportó
nuevo conocimiento científico en: técnicas optimizadas de cultivo para H. pylori de
origen ambiental en medio líquido con soporte de nitrocelulosa y como agar
inclinado bifásico; la optimización de técnicas moleculares para cepas ambientales
de los marcadores glmM (no determinado en cepas ambientales) y de la proteína
inductora del factor de necrosis tumoral alfa (Tipalpha FNT-α); la obtención de
cepas de H. pylori a partir de muestras de agua de consumo humano de fuentes
oficiales con y sin cloro residual. Se describieron por primera vez para Costa Rica
correlaciones importantes y significativas entre incidencia de cáncer gástrico y
factores geomorfológicos lo que propuso relacionar de forma diferenciada
presencia de H. pylori de origen hídrico y alta incidencia de cáncer gástrico.
DEDICATORIA
“El hombre encuentra a Dios detrás de cada puerta que la ciencia logra
abrir”, Albert Einstein.
A mi madre, a quien un cáncer gástrico
se la llevó en el mejor momento de su vida.
A mi familia quienes en esta ardua etapa ,
se matricularon conmigo.
AGRADECIMIENTOS
A l Instituto Tecnológico de Costa Rica por su gran apoyo y financiamiento cuando
fue presentado a la Institución como proyecto de investigación. Así mismo al
Instituto Nacional de Acueductos y Alcantarillados por apoyar este proyecto, en
especial al Dr. Darner Mora por su gran respaldo y confianza.
A todas las municipalidades marco de esta investigación las cuales sin reparos
abrieron sus puertas y fueron totalmente transparentes en mostrar su manejo del
agua.
A mis compañeros, profesionales e investigadores quienes me brindaron desde
consejos, colaboración o apoyo en los muestreos y pude contar siempre con ellos
a lo largo del proceso investigativo: Alejandro Hernández, Federico Masis, Jorge
Camacho, Eric Romero, Jaime Quesada, José Sandoval, Kenneth Madriz, Sergio
Con, Johnny Peraza, Edgar Ortiz.
A mi tutor Dr. Fernando García por sus valiosos consejos y por su disposición
para asumir la labor, a los lectores Dra. Floria Roa, Dr. Jesús Mora y el Dr. Tomás
Guzmán, así como al resto del tribunal: Dra. Zayra Müngía, Dr. Freddy Araya y el
Dr. Willy Soto.
A los estudiantes que colaboraron como asistentes de proyecto en diferentes
etapas a lo largo de estos años: Karina Barboza, Gustavo López, Jimena Orozco,
Diana Chinchilla.
A los asistentes muestreadores por su vital compañía en las tomas de las
muestras: Roberto Fonseca y Marlen Avendaño (AyA), Alejandro Córdoba y Sofía
Vargas del TEC.
INDICE GENERAL
Tema
página
Resumen……………………………………………………………………………………………………………………
i
Dedicatoria………………………………………………………………………………………………………………..
ii
Agradecimientos………………………………………………………………………………………………………..
iii
Índice general……………………………………………………………………………………………………………
iv
Índice de figuras………………………………………………………………………………………………………..
vi
Índice de cuadros………………………………………………………………………………………………………
x
Índice de anexos………………………………………………………………………………………………………..
xiii
Introducción……………………………………………………………………………………………………………….
1
1.Marco teórico…………………………………………………………………………………………………………
3
1.1 Epidemiología de la infección…………………………………………………………………………
3
1.2 Mecanismos de acción y variaciones genéticas……………………………………………..
5
1.3 H. pylori y su necesidad fisiológica de cationes……………………………………………..
13
1.4 Patologías extra gástricas relacionadas…………………………………………………………
14
1.5 Prevalencia de la infección por H pylori y su distribución geográfica
mundial…………………………………………………… ………………………………………………………….
15
1.6 Cáncer gástrico y factores predisponentes.…………………………………………………..
18
1.7 Helicobacter pylori y cáncer gástrico…………………………………………………………….
29
1.7.1 Infección por H. pylori y la carga mundial de cáncer gástrico…………………..
32
1.8 Investigaciones en Costa Rica………………………………………………………………………
33
1.9 El papel del agua de consumo humano en la transmisión de H. pylori………….
35
1.10 Calidad actual del agua en Costa Rica………………………………………………………….
38
1.10.1 Fuentes de agua disponibles………………………………………………………………….
39
1.11 Planes de seguridad del agua (PSA) ……………………………………………………….
46
2. Objetivos ……………………………………………………………………………………………………………….
49
3. Hipótesis………………………….…………………………………………………………………………………….
49
4. Materiales y Métodos……………………………………………………………………………………………
49
4.1 Materiales ………………………………………………………………………………………………………
49
4.2 Metodología …………………………………………………………………………………………………..
50
4.2.1 Estandarización de la técnica de cultivo con cepas de referencia…………..
50
4.2.2 Análisis de las muestras por cultivo microbiológico……………………………….
50
4.2.3 Análisis para la identificación y caracterización de las cepas por PCR….
51
4.2.3.1 Protocolos específicos………………………………………………………………….
52
4.2.4 Caracterización de las muestras por secuenciación molecular……………..
58
4.2.5 Elección de los sitios y toma de las muestras………………………………………….
58
5. Resultados…………………………………………………………………………………………………………..
62
5.1 Estandarización de la técnica de cultivo con cepas de referencia………………….
62
5.2 Análisis de las muestras por cultivo y PCR……………………………..
67
5.2.1 Primer muestreo. Análisis de las zonas de alta incidencia……………………..
68
5.2.2 Segundo muestreo. Análisis de las zonas de alta incidencia…………………..
73
5.2.3 Segundo muestreo. Análisis de las zonas de baja incidencia…………………..
78
5.2.4 Tercer muestreo. Análisis de zonas de alta y baja incidencia de cáncer
gástrico …………………………………………………………………………………………………………….
80
5.3 Situación de los acueductos marco de la investigación…………………………………..
90
6. Discusión……………………………………………………………………………………………………………….
108
7. Conclusiones………………………………………………………………………………………………………….
122
8. Recomendaciones…………………………………………………………………………………………………
128
Bibliografía……………………………………………………………………………………………………………….
129
Anexos. …………………………………………………………………………………………………………………….
143
INDICE DE FIGURAS
Número
1
Título
Vías de transmisión propuestas para H pylori…………………………..
Página
5
2
Acción de la ureasa………………………………………………………………….
6
3
Isla de patogenicidad cag-PAI…………………………………………………..
8
4
Reclutamiento de neutrófilos y linfocitos T y B…………………………
9
5
Fisiopatogenia de la enfermedad úlcero péptica asociada a la
infección por H. pylori………………………………………………………………
9
9
6
Células que intervienen en el reclutamiento celular en
infecciones crónicas por H pylori……………………………………………..
11
7
Interacción celular de linfocitos T e interleucinas……………………..
12
8
Prevalencia de la infección por Helicobacter pylori………………….
16
9
Descenso en la incidencia de cáncer de estómago y
colonización por H pylori en Estados Unidos…………………………….
16
16
10
Distribución geográfica mundial de cepas de H pylori………………
18
11
Proceso de formación de compuestos nitrosos en el jugo
gástrico…………………………………………………………………………………….
19
Casos de incidencia y mortalidad de cáncer gástrico en
hombres en países desarrollados y en vías de desarrollo………….
21
Tasa de incidencia de cáncer gástrico por sexo-edad
estandarizada por 100.000 habitantes…………………………………….
22
Variación internacional de incidencia para cáncer de estómago
en hombres y mujeres. …………………………………………………………….
23
Tasas de incidencia y mortalidad de cáncer de estómago, por
100,000 hombres, ajustadas por edad, según país en 1990…….
24
12
13
14
15
16
Tendencia de las tasas de incidencia del cáncer de estómago,
según sexo, Costa Rica, 1992-1996. …………………………………………
24
Tasa de incidencia de cáncer de estómago, por 100,000
habitantes, según provincia, Costa Rica, 1994-1996...................
25
Mortalidad por tumores malignos más frecuentes en hombres.
Tasa ajustada por 100 000 hombres. Costa Rica. 1990-2003…….
26
Incidencia por tumores malignos más frecuentes en hombres.
Tasa ajustada por 100 000 hombres. Costa Rica. 1990-2000.....
26
Tendencia de la incidencia y mortalidad por cáncer gástrico
según sexo Costa Rica, 1995-2005* tasas ajustadas por
100.000 hab……………………………………………………………………………..
27
Distribución de las tasa de incidencia de cáncer gástrico en
Costa Rica según Sierra et al 1983. …………………………………………..
27
Distribución de las tasas de incidencia por cantón ajustadas
por 100 000 habitantes, según estadísticas del Registro
Nacional de Tumores para el periodo 1990-1999…………………..
28
Distribución de las tasas de incidencia por cantón ajustadas
por 100 000 habitantes según estadísticas del Registro
Nacional de Tumores para el periodo 1995-2003……………........
28
Desarrollo del adenocarcinoma gástrico como proceso
secuencial por H. pylori…………………………………………………………….
29
25
Porcentaje de acueductos por Ente operador al 2002………………
42
26
Coberturas con agua de calidad potable y no potable por
provincias en Costa Rica, en el período 2008, según el
Laboratorio Nacional de Agua…………………………………………………..
44
Valores porcentuales de habitantes abastecidos con agua
potable y no potable en los acueductos operados por
municipalidades 1996-2008. ……………………………………………………
44
Valores porcentuales de habitantes abastecidos con agua
potable y no potable en acueductos operados rurales 19992008. ……………………………………………………………………………………….
45
17
18
19
20
21
22
23
24
27
28
29
Valores absolutos en conexiones y técnicas para la disposición
segura de excretas. ………………………………………………………………….
45
Disposición segura de excretas. Encuesta de Hogares, 2006
INEC…………………………………………………………………………………………..
46
Comparación de crecimiento con y sin filtro, ambos medios
están inoculados con H pylori………………………….………………………..
63
Fotografía con microscopio de luz de cepa ATCC de H pylori con
tinción de Gram, con fucsina fenicada. …………………………………….
63
33
Vista de las colonias de H pylori en 10X. ……………………………………
64
34
Colonias de H. pylori en agar Columbia. ……………………………………
64
35
Microscopia en contraste de fases de formas cocoides de H.
pylori de cultivo en placa…………………………………………………………..
65
Cultivo en agar inclinado de 3 días, agregado de células
inmóviles dispuestas en cuerda. ……………………………………………..
66
30
31
32
36
37
38
Bacterias de cultivo bifásico inclinado por microscopia de
contraste de fases.
…………………………………………………………………….
66
Cultivo de agar inclinado fijado con formaldehído por 24 horas
para microscopia electrónica. ………………………………………………….
67
Visualización de productos de PCR para glmM (294 pb).
muestras #17 a #22. …………………………………………………………………
69
Visualización de productos de PCR para glmM para muestra
#20. ………………………………………………………………………………………….
69
41
Visualización de productos de PCR para 16S ARNr……………………
70
42
Visualización de productos de PCR para cagA …………………………..
70
43
Visualización de productos de PCR para vacA……………………………
71
44
Colonias sospechosas de H. pylori de muestra de agua…………….
76
45
Visualización de productos de PCR para glmM …………………………
78
39
40
46
Visualización de productos reamplificados de PCR para glmM
83
47
Visualización de productos de PCR para FNT-α (273 pb) en las
muestras positivas con el marcador glmM. ……………………………….
84
Árbol de mínima evolución con el parentesco filogenético de las
cepas secuenciadas en estudio (rojo), según gen glmM…………….
87
Correlación entre altura y tasa de incidencia de cáncer
gástrico para los cantones marco de estudio…………………………..
97
Comparación de las tasas por 100 000 habitantes de alta
incidencia para cáncer gástrico por cantón, para las
estadísticas de los periodos 1990-1999 y 1995-2005………………..
102
Comparación de las tasas por 100 000 habitantes de baja
incidencia para cáncer gástrico por cantón, para las
estadísticas de los periodos 1990-1999 y 1995-2005………………..
103
Mapa de suelos de Costa Rica. Ministerio de Agricultura y
Ganadería. MAG……………………………………………………………………….
105
Tipo de suelos de los lugares de alta y baja incidencia de
cáncer gástrico. ……………………………………………………………………….
105
Positividad bacteriológica en coliformes fecales del agua de las
redes de la Municipalidad del cantón Central de Cartago, de
1996 a 2000. ……………………………………………………………………………
114
Propuesta de la interrelación de variables que influyen en la
alta incidencia de cáncer gástrico, caso Costa Rica……………………
122
56
Curva Dosis-Respuesta. ……………………………………………………………
124
57
Evolución celular hacia la formación de tumores y los factores
que intervienen. ………………………………………………………………………
125
48
49
50
51
52
53
54
55
INDICE DE CUADROS
Número
Título
Página
1
Agua para consumo humano: estimación general de cobertura y
calidad en Costa Rica - Período 2008………………………………………………..
42
Tratamiento, desinfección y calidad del agua en los acueductos de
Costa Rica por número de sistemas según ente operador 2008………
43
Secuencias nucleotídicas y tamaños de amplificación esperados
para la detección H. pylori……………………………………………………………….
54
Secuencias y tamaños de amplificación esperados para los
imprimadores utilizados para las regiones de vacA (Lu, 2002)…………
55
5
Perfil térmico para PCR de región glmM de H. pylori………………………
55
6
Perfil térmico para PCR de región cagA de H. pylori…………………………
56
7
Perfil térmico para PCR de polimorfismos vacA en H. pylori……………
56
8
Perfil térmico para PCR de región ARNr 16S específica para H.
pylori…………………….………………………………………………………………………….
57
9
Diseño de primers para el marcador de TNF- α………………………………..
57
10
Perfil térmico para PCR de las regiones glmM (reamplificado) y FNTα de H. pylori……………………………………………………………………………………
58
11
Cantones elegidos en los quintiles 1 y 5 de alta y baja incidencia de
cáncer gástrico para el muestreo.……………………………………………………
59
Resultados de PCR 16S ARNr y glmM, coliformes totales y
coliformes fecales para las muestras evaluadas de Cartago y San
José en el primer muestreo. ……………………………………………………………
72
2
3
4
12
13
Descripción de las muestras por lugar de procedencia (cantón),
análisis de las colonias y diferenciación por pruebas bioquímicas……
14
Resultados de los análisis del marcador glmM con respecto a
coliformes totales (CT) y coliformes fecales (CF) correspondientes
al segundo muestreo. ……………………………………………………………………..
74
77
15
Información recolectada y cultivo de las muestras de agua de
los cantones de baja incidencia dispensada por Ente Operador.
79
Cuadro comparativo de las zonas de alta y baja incidencia de
cáncer gástrico sobre la naturaleza del agua y el Ente
Operador del acueducto. …………………………………………………………
80
17
Resultado de los cultivos de las zonas de alta incidencia………….
81
18
Resultado de los cultivos de las zonas de baja incidencia………….
82
19
Resultados del análisis de los marcadores glmM y FNT-α por
muestra para el tercer muestreo..……………………………………………
85
Resumen de los resultados por muestreo en las zonas de
alta y baja incidencia….………………………………………………………….
88
Naturaleza del agua por Ente Operador para cantones de baja
incidencia en cáncer gástrico. …………………………………………………
95
Naturaleza del agua por Ente Operador para cantones de
alta incidencia en cáncer gástrico. ……………………………………………
95
Temperatura, altura y precipitación media anual para cantones
de alta incidencia de cáncer gástrico, Costa Rica……………………..
96
Temperatura y altura para cantones de baja incidencia de
cáncer gástrico, Costa Rica………………………………………………………
96
25
Correlaciones estadísticas entre las variables ambientales……..
98
26
Análisis de regresión lineal entre incidencia y altura e
incidencia y temperatura. ………………………………………………………..
99
Prueba exacta de Fisher para independencia entre nivel de
incidencia de cáncer gástrico y Ente Operador…………………………
101
Tasa de los cantones marco del estudio correspondiente al
quintil 1 de alta incidencia de cáncer gástrico para los periodos
1999 y 2005. ……………………………………………………………………………
102
16
20
21
22
23
24
27
28
29
Tasa de cantones marco del estudio correspondiente al
quintil 5 de baja incidencia de cáncer gástrico para los períodos
1999 y 2005………………………………………………………………………………
30
Descripción geomorfológica y físico química de los suelos de
las áreas de alta y baja incidencia para cáncer gástrico, marco
del estudio. ……………………………………………………………………………..
31
32
103
107
Trabajos publicados sobre recuperación e identificación de H.
pylori en el mundo, en matriz agua…………………………………………
109
Población actual en términos relativos cuyo Ente Operador
dispensa agua potable actualmente en Costa Rica…………………..
120
Introducción
El agua es vida, un elemento clave del desarrollo sostenible, indispensable en sus
aspectos sociales, económicos y ambientales, esencial para la salud humana. El
agua es un bien económico y un bien social que debe distribuirse en primer lugar
para satisfacer necesidades humanas básicas.
En este contexto la salud, el medio ambiente y el desarrollo sostenible están
íntimamente ligados; un ambiente no contaminado ni degradado, ecológicamente
favorable a la salud física y mental, no es solo una necesidad, sino un derecho de
cada individuo que abarca no solo los medios que permitan la adquisición de los
recursos, sino una participación compartida en las acciones para su protección.
Se puede afirmar que en la actualidad existe consenso sobre el enfoque sectorial
y fragmentado con respecto al manejo del recurso hídrico del país, lo cual ha
conducido a conflictos por el uso ineficiente y desmedido, con el consecuente
deterioro del recurso. Sobre la gestión del agua se ejercen con frecuencia
presiones políticas, económicas y sociales.
El estudio del impacto de las modificaciones o alteraciones de nuestro entorno ya
sea de origen natural o antrópico sobre la salud, es un trabajo multidisciplinario y
transdisciplinario que necesita considerarse desde muy diferentes perspectivas.
Es importante entonces tener en cuenta el impacto que las condiciones
ambientales ejercen sobre la salud de la población y los aspectos sociales y
económicos que intervienen en ello.
Por consiguiente, cuando se trata de estudiar los peligros ambientales modernos
para la salud humana, resulta especialmente valioso comprender las vías que
siguen. Se tienen los peligros tradicionales, los asociados a la pobreza y al
desarrollo insuficiente, ligados a la falta de acceso al agua potable y a las
deficientes condiciones higiénicas y los modernos asociados a un desarrollo
rápido e insostenible como las enfermedades emergentes y re-emergentes,
incluidos los trastornos de fondo inmunológico y el cáncer. La investigación para
la resolución de estos problemas con impacto en la salud pública del país que
puedan provenir del medio ambiente, deben ser prioritarios.
En este contexto la infección de personas con la bacteria Helicobacter pylori se
considera un problema de salud pública muy importante porque:

La prevalencia de infección del microorganismo en el mundo es alta, y más
en los países de origen tropical, asociados a un ingreso per capita bajo.

Se ha considerado su erradicación bastante difícil, la re-infección es alta, el
tratamiento costoso y de amplios efectos secundarios, la vacuna todavía no
está disponible.

En el mundo se le relaciona como la principal causa de gastritis crónica,
úlceras pépticas y el principal factor de riesgo para el desarrollo de cáncer
gástrico, incluyendo atrofia gástrica, metaplasia intestinal, cáncer gástrico
como linfoma MALT de células B, y otras patologías extra gástricas
directamente relacionadas

En Costa Rica se le relaciona con gastritis, úlcera duodenal, gastritis
atrófica con probabilidades de transformarse en cáncer gástrico
especialmente en adenocarcinoma de tipo intestinal (Sierra, 2002); con
mayor incidencia en las personas si viven en la parte central, en las
provincias de Cartago y San José.

A la fecha no se ha dado a conocer de forma definitiva el mecanismo
epidemiológico de adquisición poblacional de la bacteria. Al no tenerse
claridad al respecto, no se han establecido medidas adecuadas de
prevención, ni en las personas ni en la salud pública en general, mucho
menos
acciones necesarias que conlleven el abordaje integral del
problema.
1- Marco teórico
Filogenéticamente Helicobacter pylori pertenece a las Proteobacterias, es de
forma espiralar, Gram negativa, con un diámetro celular de 0,5 µm a 1 µm y con
penacho de flagelos polares.
H. pylori se descubrió en 1982, hace casi 25 años. Los médicos Barry Marshall y
Robin Warren de Perth, Australia, observaron por primera vez la bacteria en
biopsias de estómago proveniente de un paciente con gastritis crónica activa. En
reconocimiento a su descubrimiento fueron galardonados con el Premio Nobel
2005 en Medicina y Fisiología.
En 1994 se efectuó una “Conferencia Consensus” por los Institutos Nacionales de
Salud del mundo, donde H. pylori fue declarado la principal causa de úlcera
péptica y en este mismo año la Agencia Internacional para la Investigación del
Cáncer (IARC) de la Organización Mundial de la Salud, declara a H. pylori como
un cancerígeno en humanos, ubicado en el grupo I (se cuenta con pruebas
suficientes que confirman que puede causar cáncer a los humanos).
1.1 Epidemiología de la infección
La presencia de la bacteria, por lo general, puede pasar inadvertida en toda la vida
del hospedero y los primeros síntomas generalmente tardan mucho tiempo en
evidenciarse (Brown, 2000), lo que implica que los episodios de transmisión
pueden pasan inadvertidos. Otro aspecto que dificulta el seguimiento de la
adquisición y su abordaje epidemiológico es que el aislamiento y el cultivo de H.
pylori es relativamente difícil comparado con otras bacterias de importancia
clínica.
La bacteria puede ser adquirida en la infancia, y por la edad de 10 años, más del
50% de los niños en todo el mundo han estado en contacto con el
microorganismo (Pounder, 1995), sin embargo, algunas investigaciones han
sugerido que las infecciones transitorias pueden producirse e incluso ser muy
comunes (Goodman, 2005; Haggerty, 2005), pero la importancia de estos
resultados es todavía objeto de controversia debido a la especificidad y
sensibilidad de las pruebas utilizadas (Perry, 2005; Nugalieva, 2006).
Evidencia reciente prueba también que múltiples cepas de H. pylori y de otras
especies de Helicobacter son capaces de infectar simultáneamente el tracto
gastrointestinal de un individuo (Van den Bulk, 2005; Fritz, 2006; Ghose, 2005;
Azevedo, 2007). Ahora se acepta que hay constantes exposiciones a la infección,
pero ha sido considerado que el equilibrio entre el hospedero y la bacteria tiende a
favorecer al hospedero.
Basado en evidencia epidemiológica y microbiológica varias vías de transmisión
han sido propuestas. La transmisión de persona a persona de la bacteria es la vía
que se ha contemplado como la ruta más probable de infección, principalmente a
causa de la deficiencia de aislar la bacteria de otros sitios, como por ejemplo el
medio ambiente y del tracto gastrointestinal de los seres humanos .
Varios estudios epidemiológicos han identificado el hacinamiento de los miembros
de la familia como un factor de riesgo para la transmisión de H. pylori; así mismo
se ha encontrado entre aislamientos obtenidos de miembros infectados de la
misma familia una alta homología del genoma bacteriano (Ma, 1998).
Se ha observado diferencias significativas en la incidencia entre niños de una
misma familia donde todos sus miembros se encuentran infectados, con respecto
a niños cuyos miembros familiares no están infectados (Miyaji, 2000;
Rothenbacher, 1999). El riesgo relativo es de aproximadamente ocho veces
mayor si la madre está infectada y cuatro veces mayor si es el padre el infectado
(Rothenbacher, 1999). Aunque estos estudios apoyan la hipótesis de transmisión
de persona a persona, la exposición de una familia a una fuente común alternativa
sigue siendo una posibilidad.
La mayoría de las vías de transmisión entre personas abarcan las rutas gastrooral, oral-oral y fecal-oral (Azevedo, 2007).
En años recientes han sido sugeridas otras vías para transmitir la bacteria en
forma viable: el agua, los alimentos, y los animales. Numerosos autores coinciden
en que la importancia relativa de estas rutas en la transmisión de la bacteria varía
en importancia entre países desarrollados y en vías de desarrollo (Perez, 2004;
Megraud, 2003).
El género Helicobacter incluye al menos 26 especies. El tropismo del género varía desde el
estómago, el ciego y el colon hasta el hígado o el tracto genital de los mamíferos y aves (Dewhirst,
2005). Helicobacter comprende un grupo diverso de agentes patógenos potencialmente
emergentes en múltiples especies incluyendo humanos, primates, gatos, perros, hurones, cerdos,
ovejas, vacas, aves silvestres, pollos, ratones, ratas, hámsteres, jerbos, y una variedad de
se dice que casi todo animal es
colonizado por su propia especie endógena de Helicobacter (Dewhirst, 2005). Según
los aportes de Azevedo, con los criterios emergentes y la aparición de cepas
múltiples infectando a un mismo hospedero, debería tomar más importancia el
poder considerar a H. pylori como un agente zoonótico (Azevedo, 2007).
animales salvajes, incluyendo delfines, ballenas y focas
No obstante varios estudios epidemiológicos muestran resultados controversiales
en lo que respecta al riesgo de la presencia de animales domésticos en el hogar
(Bode, 1998; Kearney, 2002). H. pylori no se ha encontrado en perros y muy
raramente en estómagos de gatos (El Zaatari, 1997; Neiger, 2000), y se ha
sugerido que la presencia de la especie H. pylori en los animales es de origen
humano (El Zaatari, 1997; Cittelly, 2002).
Desde un punto de vista integral las vías de transmisión propuestas a la fecha se
resumen bajo la figura 1.
Figura 1 Vías de transmisión propuestas para H pylori (Montero, 2009).
1.2 Mecanismos de acción y variaciones genéticas
H. pylori se ha encontrado en el estómago de más de la mitad de la población
humana en el mundo, y representa la principal causa biológica de la patología
gastroduodenal (Mitchell, 2001). Sin embargo, a lo largo de su vida, sólo entre el
10% y el 20% de los pacientes infectados desarrollan enfermedades graves, como
úlcera péptica, cáncer gástrico y linfoma. Este hecho sugiere que el tipo de
inmunidad innata y adquirida como respuesta a H. pylori puede representar un
importante
factor
que
puede
influir
en
el
resultado
de
la
la infección hacia la protección o la patología (Milco, 2007).
La mucosa gástrica está protegida contra infecciones bacterianas y H. pylori está
muy bien adaptado a este nicho ecológico, con una gama única de características
que le permiten la entrada en el moco gástrico, la movilidad y la orientación
espacial, la adherencia a las células epiteliales, la evasión de la respuesta inmune
y como consecuencia persistencia en la colonización y la transmisión (Suerbaum,
2002).
Después de ser ingerida la bacteria debe eludir la actividad bactericida del
contenido gástrico y penetrar en la capa mucosa. La producción de la enzima
ureasa y la movilidad son esenciales para este primer paso de la infección. La
ureasa hidroliza la urea existente en dióxido de carbono y amoníaco, permitiendo
así a H. pylori sobrevivir en un medio ácido (figura 2). La actividad enzimática de la
ureasa está regulada por la afluencia de urea a través de un canal, el UreI, el cual
está abierto a pH bajo y cerrado en condiciones de pH neutro (Weeks, 2000).
Figura 2. Acción de la ureasa. H. pylori degrada la urea a amoniaco
y dióxido de carbono mecanismo que le permite mantener un medio
alcalino a su alrededor. Tomada de Programa, 2002.
Entre los hallazgos más notables de la infección por H. pylori, producto de
proyectos de secuenciación del genoma, se encuentra el descubrimiento de varios
genes que pueden ser activados y desactivados provocando deslizamiento y
desapareamiento de las bases complementarias mediando mutagénesis
(Suerbaum, 2002). Las proteínas codificadas por esos genes de fase variable
incluyen enzimas que modifican la estructura antigénica de las moléculas de
superficie, el control de la entrada de ADN extraño en las bacterias, y la influencia
de la movilidad bacteriana.
El genoma de H. pylori cambia continuamente durante la colonización crónica de
una persona acogiendo la importación de pequeños trozos de ADN exógeno de
otras cepas durante infecciones mixtas, en colonizaciones persistentes o
transitorias (Falush, 2001; Suerbaum, 2002).
La mayoría de las cepas de Helicobacter pylori se encuentran en la capa mucosa
que recubre el epitelio gástrico, sin embargo se ha informado que puede
interactuar con las células epiteliales gástricas e incluso las puede invadir
(Graham, 2007). Se ha reportado recientemente la capacidad para formar
biofilmes maduros en biopsias de mucosa gástrica humana, cubriendo casi toda la
superficie de la mucosa en pacientes ureasa-positivos (Coticchia, 2006).
A finales de la década de 1980 se descubrió que algunas cepas de H pylori
provocaban la formación de enormes vacuolas en células epiteliales de cultivo,
encontrándose que el agente activo era una toxina llamada VacA codificada por
un gen VacA, que además desactiva los glóbulos blancos que luchan contra las
infecciones estomacales aplacando así la respuesta inmunitaria del hospedero. La
mayoría de las cepas la expresan, ella se inserta dentro de la membrana de las
células epiteliales y forma un canal anión selectivo, a través del cual libera
bicarbonato y aniones orgánicos, tiene como blanco la membrana mitocondrial,
donde se produce la liberación de citocromo c, e induce la apoptosis (Galmiche,
2000).
Se han descrito cuatro variantes principales de VacA: dos de ellas (m1 y m2)
localizadas en la región central del gen, y otras dos (s1 y s2) en la región que
codifica la secuencia de la señal de la proteína que le permite ser secretada por la
bacteria. Estudios posteriores demostraron que la variante s1 se divide a su vez
en al menos los subtipos s1a, s1b y s1c (Suerbaum, 2002).
Las cepas de H pylori portadoras de las variantes m1 y s1 sintetizan la versión
más tóxica de VacA y guardan relación con un mayor riesgo de contraer cáncer de
estómago (Miehlke, 2000).
La mayoría de cepas de H. pylori que causan enfermedad (las llamadas cepas de
tipo I) contienen la isla de patogenicidad Cag, (Cag-PAI), una región cromosómica
con cerca de 37.000 pares de bases y 29 genes (figura 3). La mayoría de los
genes cag están probablemente implicados en el montaje de la maquinaria de
secreción tipo IV que traslada la proteína CagA al citoplasma de las células
epiteliales gástricas del hospedero, una vez en el interior de la célula,
determinadas enzimas del hospedero modifican la estructura química del CagA,
facilitando su interacción con proteínas humanas (Blazer, 2005).
Figura 3 Isla de patogenicidad cag-PAI (Suerbaum, 2002).
A diferencia de cagA, vacA está presente en todas las cepas de H pylori, sin
embargo puesto que la secuencia del gen varía de forma notable, solo algunas
cepas producen una toxina totalmente activa. Por lo tanto las cepas que incluyen
vacA (m1 y s1) y cagA en su genotipo están implicadas en un mayor riesgo de
producción de cáncer gástrico (Blazer, 2005).
H. pylori causa inflamación gástrica continua con diferente severidad en casi todas
las personas infectadas. Esta respuesta inflamatoria inicial consiste en el
reclutamiento de neutrófilos, seguidos por los linfocitos T y B, células plasmáticas
y macrófagos, lo que provoca daño a las células epiteliales (figura 4). Una vez que
H. pylori invade la mucosa gástrica, la respuesta del hospedero se desencadena
principalmente por la adhesión de las bacterias a las células epiteliales. El
patógeno puede obligar al Complejo Mayor de Histocompatibilidad tipo II (MHC)
que son moléculas en la superficie del epitelio gástrico a inducir su apoptosis.
Entonces nuevos cambios en las células epiteliales dependen de las proteínas
codificadas en el cag-PAI y de la translocación de CagA en las células, la
producción de ureasa también puede contribuir a la extravasación y la quimiotaxis
de neutrófilos.
Figura 4 Reclutamiento de neutrófilos y linfocitos T y B (modificado de Blazer, 2005).
La infección por H. pylori cursa en todos los casos con un abundante infiltrado
inflamatorio, en el que predominan los neutrófilos; estas células liberan grandes
cantidades de mediadores, como el leucotrieno B4. Por su parte, los monocitos
activados producen interleucina-1, factores de crecimiento celular y radicales libres
de oxígeno (ROS), moléculas que ocasionan daño tisular, el cual viene a sumarse
al inducido por la toxina vacuolizante secretada (figura 5).
Figura 5 Fisiopatogenia de la enfermedad úlcero péptica asociada
a la infección por H. pylori. Tomada de Programa, 2002.
Otros componentes bacterianos hacen más severo el daño a la mucosa y debilitan
los mecanismos protectores; la lipasa y la fosfolipasa A producidas por H. pylori no
sólo degradan los lípidos del moco, haciéndolo menos viscoso, sino que lesionan
las membranas celulares. A medida que el proceso avanza, la inflamación es más
significativa y como resultado del daño tisular, disminuye la producción de moco y
bicarbonato, con lo que la mucosa se vuelve más susceptible a la acción del ácido
y la pepsina. De esta forma se establece una gastritis crónica activa superficial y
como resultado de la agresión ácida y la acción catalítica de la pepsina, sumadas
a los efectos citotóxicos de los mediadores inflamatorios y las sustancias
bacterianas ya mencionadas, ocurre la ulceración de la mucosa (Programa, 2002)
Además de los factores antes mencionados que le proporcionan patogenicidad a
cepas específicas de H. pyori como cagA y vacA (m1 y s1) se pueden citar el
lipopolisacárido de superficie (LPS), la producción de ureasa, los flagelos y las
adhesinas de superficie. A la vez, la presencia de ciertos factores demuestran un
aumento en la agresividad de ciertas cepas como por ejemplo el gen asociado a
la adhesina de superficie babA2 (que codifica una proteína de membrana que se
une al grupo antigénico sanguíneo de Lewis B de la célula epitelial o del
eritrocito, el cual es relevante para la infección); el gen iceA con sus dos variantes
alélicas iceA1 e iceA2 (inducido por contacto con el epitelio, se relaciona con
incidencia de úlcera péptica e infiltración neutrofílica aguda) (Kidd, 2001)
especialmente la variante iceA1. En este sentido personas infectadas por cepas
que co-expresan los genes cagA, vacA, y babA2, presentan un riesgo mayor que
las personas infectadas por cepas que expresan solamente uno de estos genes
(Zambon, 2003).
El factor sanguíneo de Lewis B, según estudios de León, Marín y Morales está
presente en un 72.4% de la población costarricense (León, 1999). Se sugiere
también que la respuesta inflamatoria del paciente puede estar influenciada por el
factor ABO, asociado con úlcera péptica e infiltración inflamatoria (Henegha,
2000).
A H. pylori se le relaciona también con la inhibición de la proteína protectora de
membranas HSP 70, la cual se produce en respuesta al estrés por cambios
ambientales agresores como calor, isquemia, presencia de metales pesados,
etanol, toxinas, agentes oxidantes y diversas infecciones por bacterias y virus
(Targosz, 2006).
Con respecto a los factores que influencian la relación hospedero-parásito y la
predisposición genética de las personas, se sabe que cuando H. pylori invade la
mucosa gástrica, la respuesta del anfitrión es accionada sobre todo por el acceso
de bacterias a las células epiteliales. La infección induce a una gran respuesta
humoral sistémica en la mucosa, donde esta producción de anticuerpos no solo no
conduce a la eliminación de la infección, sino que además contribuye al daño del
tejido gástrico, y por lo tanto tiene un papel integral en la patogenia, resultando en
una gran producción de interleucinas y otras quimosinas que producen efectos en
cascada. Solamente a manera de cita: interleuquina-8, el péptido 78 activador
derivado de neutrófilos en células epiteliales (ENA-78) y el oncogene (GRO- ),
el factor nuclear - B (NF- B), un factor activador de transcripción de proteína de
respuesta temprana 1 (AP-1), adresinas vasculares tales como la célula de
adhesión vascular (VCAM-1) y la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1)
que son requeridas para la extravasación del linfocito.
La citotoxina VacA y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) conducen a la
ruptura de la barrera epitelial, lo que facilita la translocación de los antígenos
bacterianos y conduce a la activación de más macrófagos. Las citoquinas
producidas por los macrófagos también pueden alterar la secreción de moco, lo
que contribuye a la interrupción de la capa mucosa por H. pylori. La figura 6
contempla el despliegue celular que provoca la bacteria en el hospedero
(Sueberbaum, 2002).
Figura 6 Células que intervienen en el reclutamiento celular en infecciones
crónicas por H pylori (Suerbaum, 2002).
Las células T cooperadoras (Th0, Th1, Th2), responden con una respuesta parcial
a H pylori (figura 7), además las citoquinas tipo Th1 tal como interferon- (INF- )
promueven la gastritis, y pueden favorecer la persistencia de H. pylori (Suerbaum,
2002, Bergman, 2006). En términos generales las citoquinas cuando atraen a los
neutrófilos median el daño al tejido gástrico por medio de la dispersión de
compuestos de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS) muy reactivos; estos
superóxidos y los radicales del oxidrilo dañan los lípidos, las proteínas y el DNA
por oxidación.
Figura 7 Interacción celular de linfocitos T e interleucinas. (Bergman, 2006)
Con respecto a la variación y al intercambio genético H. pylori exhibe una
diversidad genética apreciable, característica que ya ha sido evidenciada en
muchos trabajos donde se demuestra la variación en el orden genético entre
cepas, diferencias en el contenido genético entre cepas, la naturaleza de algunos
genes, y la diversidad de secuencias dentro de algunos genes conservados. H.
pylori posee una estructura poblacional recombinante o panmítica, lo que indica el
intercambio genético frecuente (Israel, 2001).
Existe evidencia que la recombinación en H. pylori puede ocurrir in vivo durante la
infección. Se sugiere que el intercambio genético horizontal en H. pylori ocurre
mediante los tres mecanismos clásicos: transformación natural, conjugación y
transducción (Israel, 2001).
1.3 H. pylori y su necesidad fisiológica de cationes.
El citoplasma de las bacterias Gram negativas está rodeado por dos membranas,
una interna que es la membrana citoplasmática y otra externa, los metales
transportados al citoplasma deben cruzar ambas membranas, ellos participan en
una gran variedad de procesos celulares y son esenciales para el crecimiento de
las bacterias.
El hierro es necesario para el crecimiento de casi todos los patógenos, pero H
pylori contiene relativamente pocos sistemas de transporte de iones (con respecto
a otras bacterias), excepto para el níquel y el hierro. Estos dos metales pueden ser
transportados por dos o más sistemas, indicando su importancia fisiológica (NCBI,
2001).
Los iones de hierro soluble (Fe2+) deben ser disponibles para que la bacteria los
ingiera, pero estos iones solo son estables bajo condiciones anaeróbicas y ácidas,
porque la presencia de oxígeno causa una rápida conversión al estado férrico
(Fe3+), el cual es casi completamente insoluble a pH 7.
En los tejidos humanos la concentración de hierro libre es muy baja para soportar
el crecimiento; ya que la mayor parte del hierro es acomplejado en la hemoglobina
o quelado por la transferrina en el suero o por la lactoferrina en la superficie de la
mucosa. Como el hierro acomplejado es una molécula muy grande para ser
transportada por las porinas de la membrana externa, este transporte requiere en
H pylori de receptores de sistemas altamente afines y específicos (Braun, 1998;
Braun, 1999).
En una infección activa H. pylori adquiere el hierro necesario de su anfitrión y
puede activamente contribuir a la anemia en algunos pacientes (Byung, 2004;
Cardenas, 2006), incluso se ha visto la baja respuesta de niños infectados con H
pylori a la terapia de suplementación con hierro (Mahalanabis, 2006) y la
predisposición materna a la anemia (Yang, 2005).
Otro de los metales importantes en la fisiología de H pylori es el zinc, el cual lo
utiliza como coenzima de la metaloenzima alcohol deshidrogenasa con expresión
en la membrana externa de la bacteria, la cual está involucrada en proteólisis de
células del hospedero y de esta forma contribuir a la severidad de la patología
gástrica (Windle, 2007).
Una evidencia más a favor del zinc constituye el estudio efectuado por
Sempértegui y colaboradores (Sempértegui, 2007) quienes concluyen que luego
de estudiar concentraciones de zinc de la mucosa gástrica de pacientes con
gastritis crónica no atrófica, se determinó que las personas con alta concentración
de infiltración de polimorfonucleares tenían menores concentraciones del metal en
la mucosa y viceversa, sugiriendo el hecho del papel de la bacteria de obtener el
zinc del paciente para la inducción de proteólisis celular, la inflamación y la
patología gástrica que induce (Sempértegui, 2007).
También H. pylori tiene una alta demanda de níquel como cofactor para su enzima
ureasa, de hecho lo tiene en su núcleo central, esto representa alrededor del 10%
del total de proteínas celulares (Wolfram, 2009). El primer transportador de níquel
identificado en H. pylori fue la proteína NixA, sin embargo se ha demostrado que la
bacteria tiene sistemas transportadores alternos de este metal indicando su
importancia bioquímica (Fulkerson, 2000).
El níquel es reconocido en el cuerpo humano como uno de los elementos ultra
traza (la concentración de este catión en el suero humano es muy baja de 2 a 11
nM). La función del níquel como oligoelemento no se ha definido claramente; sin
embargo la mayor parte del níquel ingerido procedente de la dieta permanece libre
en la luz del aparato gastrointestinal. Los mecanismos involucrados en el
transporte del níquel a través de la pared intestinal no son claros, pero se supone
que el paso a través del epitelio mucoso requiere de energía y no se lleva a cabo
por simple difusión ya que los iones de níquel utilizan el sistema de transporte de
hierro ubicado en la región proximal del intestino delgado (Melo, 2007). Puede ser
por esta razón que la libre oferta del níquel en el aparato gastrointestinal,
determine a éste como un órgano blanco para que H. pylori se establezca aquí
una vez que es ingerida.
La necesidad de elementos químicos específicos en el crecimiento y desarrollo de
H. pylori podría explicar la preferencia de este microorganismo en el ambiente,
como se expondrá más adelante.
1.4 Patologías extra gástricas relacionadas.
Recientemente a H. pylori se le ha involucrado en diversas patologías extragástricas. Se sugiere en términos generales que estas patologías están
relacionadas con la patogénesis de enfermedades cardiovasculares (Kanbay,
2005-Peter, 2006), hipertensión (Migneco, 2003) y desórdenes hematológicos
(Kaptan, 2006).
También se ha descrito su posible papel en la génesis de enfermedades de origen
autoinmune tales como anemia perniciosa (Tsang, 1999, Presotto, 2003) y pólipos
del colon (Taiji, 2004).
Se cuenta con hallazgos preliminares en púrpura trombocitopénica idiopática (PTI)
(Takechi, 2006, Franchini, 2006), se ha aislado de la mucosa intestinal en
pacientes con enfermedad de Crohn con respecto al grupo control (Oliveira, 2006),
y en tiroiditis de Hashimoto (Letter, 2004).
Además se ha visto asociación entre infección crónica por H. pylori y resistencia a
la insulina (Aydemir,2005; Ojetti, 2005), se ha advertido su presencia como
posible cofactor de riesgo en carcinoma hepatocelular (Ojetti, 2006), y se cuenta
con asociación entre la infección por H. pylori y cirrosis en pacientes con virus de
hepatitis C (Queiroz, 2006).
Durante investigaciones de la flora bacteriana intestinal relacionada con cáncer de
colon en un modelo de ratón APC / Mim mouse, Rao y colaboradores
encontraron que la administración orogástrica de especies murinas intestinales de
Helicobacter hepaticus, no sólo aumentaron el número de tumores intestinales,
sino también los cánceres de mama en cepas sensibles de ratones hembras (Rao,
2006). Demostraron que era dependiente de TNF-α y la ausencia de un subgrupo
específico de células T reguladoras. Estos experimentos intrigantes llevaron a los
autores a postular que la infección microbiana gastrointestinal por especies de
Helicobacter y organismos afines podría alterar la regulación sistémica de la
respuesta inmune, dando lugar a casos de cáncer en sitios no anatómicamente
relacionados, como la mama.
1.5 Prevalencia de la infección por H pylori y su distribución geográfica
mundial
La presencia de H. pylori en las personas ocurre en todo el mundo, pero se han
encontrado diferencias significativas en la prevalencia tanto entre países como
dentro de un país (Mitchell, 2001). La prevalencia global es superior en los países
de las regiones económicamente subdesarrolladas, como África y Asia, que en los
países más desarrollados como los del oeste de Europa y América del Norte
(figura 8).
Figura 8. Prevalencia de la infección por Helicobacter pylori.
La infección correlaciona con el status socioeconómico
(Efstrom,1997)
Además según los epidemiólogos H. pylori ha ido desapareciendo de los países
desarrollados a lo largo de los últimos 100 años merced a una mayor higiene que
bloquea la transmisión de la bacteria ( Blazer 2005).
Figura 9. Descenso en la incidencia de cáncer de estómago y colonización
por H pylori en Estados Unidos. Tomada de Blazer, 2005.
Entonces la situación socioeconómica se considera claramente como uno de los
factores determinantes más importante para el desarrollo de la infección. Estos
factores incluyen condiciones tales como higiene, densidad de población,
saneamiento ambiental y oportunidades educativas, los cuales han sido
identificados individualmente como marcadores de presencia de la bacteria en una
población dada (Azevedo, 2007).
En cuanto a estas variaciones geográficas en la prevalencia de la infección dentro
de un país, no queda claro si son el resultado de factores genéticos de las
diferentes poblaciones o el resultado de los diferentes factores ambientales y
socioeconómicos que interactúan en estas poblaciones y grupos étnicos
diferentes. Se encuentran trabajos que sugieren que los factores ambientales, más
que los factores genéticos, tienen un papel significativo en la prevalencia de la
infección (Bani-Hani, 2005).
El conocimiento sobre la diversidad génica de H. pylori se ha aplicado al estudio
de variación geográfica de las distintas cepas, las variantes del gen VacA tendían
a agruparse en determinadas regiones geográficas: las cepas s1c predominaban
en el este de Asia, s1a en Europa septentrional y s1b en el área mediterránea
(Blazer, 2005).
Los estudios en Ibero América describen que la cepa s1b es la más común, lo
que sugiere que fue introducida en América por colonos españoles o portugueses
o por esclavos africanos. Sin embargo, estudios posteriores efectuados en
poblaciones indígenas de la Amazonia revelaron que el genotipo s1c predominaba
al este de Asia sugiriendo que H pylori fue introducida en América a través del
estrecho de Bering
por los antepasados de los amerindios actuales,
considerándose que la bacteria ha estado presente entre los humanos durante al
menos 11.000 años (Blazer, 2005).
Investigaciones del Instituto Max Planck de Biología de las Infecciones de Berlín
demuestran asocio con cepas modernas de H. pylori y que pueden proceder de
cinco poblaciones ancestrales: se sugiere dos surgidas en Africa, dos en Eurasia
Central u Occidental y una en el este de Asia ( Blazer, 2005), tal y como se
muestra en la figura 10.
Figura10. Distribución geográfica mundial de cepas de H pylori (Blazer, 2005)
Lo anterior implica que en la colonización por H pylori en el mundo convergen
varios factores que determinan, además de la presencia u origen natural,
condiciones ambientales y condiciones socioeconómicas que podrían intervenir en
la severidad de una infección para una población dada.
En un estudio conducido por Naylor y colaboradores (Naylor, 2006) comparando
la histología gástrica de pacientes en Japón y el Reino Unido, se encontró que los
estómagos de japoneses tenían gastritis más severas y extensivas, con un
número mayor de células inflamatorias y un mayor riesgo de progresión hacia la
atrofia y metaplasia intestinal. Alrededor del 90% de los casos de gastritis de
ambos países fueron relacionados con infección por H. pylori; pero cepas cagA
positivas fueron más comunes en japoneses que en pacientes del Reino Unido.
1.6 Cáncer gástrico y factores predisponentes.
Actualmente en el mundo no son muchos los factores reconocidos asociados
directamente al aumento en el riesgo de cáncer de estómago.
Según la Sociedad Americana de Cáncer (Cancer, 2006-2008) son reconocidos:
Las dietas ricas en alimentos ahumados, pescado o carne salada: la alta
ingesta de sal aumenta la efectividad de carcinógenos como la N-metil-Nnitrosoguanidina y se estimula la replicación celular; así como la ingesta a largo
plazo de elevadas concentraciones de nitratos en alimentos secos, ahumados y
salados; por acción de las bacterias los nitratos se convierten en nitritos y estos
en nitrosaminas/ nitrosamidas de reconocida capacidad mutagénica y
carcinogénica (esto se da de acuerdo con el mecanismo presentado en la
figura 11).
El bajo consumo de frutas y hortalizas: por el contenido en betacarotenos,
tocoferoles y vitaminas C y E porque contribuyen a la neutralización de nitritos
y la reducción de la concentración de N-nitrosaminas y radicales libres.
La infección de largo plazo por H. pylori.
Estos factores interaccionan directamente con el hábito del fumado (Hamajima,
2006) . Estos carcinógenos disminuyen los niveles de carotenoides y vitamina C
en plasma, además el tabaco presenta carcinógenos de tipo promotor o
carcinógenos completos tales como la nitrosopirrolidina, las nitrosaminas y las
nitrosamidas, entre otros, cuya formación tiene lugar en el jugo gástrico, (ver figura
11).
Figura 11. Proceso de formación de compuestos nitrosos en el jugo gástrico
(Curso 2007).
Estos factores han sido asociados además de biológica y toxicológicamente, por
medio de estudios de largo plazo y en poblaciones de alta incidencia.
Desde el punto de vista epidemiológico el desarrollo del cáncer con relación a la
infección por H. pylori se relaciona en las personas con:
Infección desde edades tempranas
Infección con cepas agresivas de alto riesgo
Historia familiar de cáncer gástrico,
Susceptibilidad genética de la población (polimofismos de interleucinas)
Bajo nivel socioeconómico.
En diferentes partes del mundo las poblaciones migrantes de alto riesgo muestran
una marcada disminución de este riesgo, cuando se trasladan a una zona
reconocida de riesgo menor, aunque esto es muy gradual, parece depender de la
edad a la cual se migra.
Se ha visto que las partes centrales de un país tienen diferencias significativas con
respecto a las costas como sucede por ejemplo en Colombia, Costa Rica y Chile
(Curso Toxicología, 2007). También se da que en un país dado, la incidencia es
menor en las grandes ciudades que en las áreas rurales, y más frecuente entre
personas de nivel socioeconómico bajo, que en personas de clase profesional
(Curso Toxicología, 2007), lo que sugiere que podría deberse fundamentalmente a
diferentes exposiciones a factores ambientales determinados.
Hasta hace poco, en el mundo el cáncer de estómago ocupaba el segundo lugar
en incidencia; para el año 2002 ocupa el cuarto lugar, detrás del cáncer de
pulmón, mama y colon. No obstante es la segunda causa de muerte por cáncer
en el mundo 700.000 muertes al año (Ortiz, 2005).
Entonces de acuerdo con el nivel de desarrollo, los valores de incidencia y
mortalidad de cáncer gástrico en distintas partes del mundo evidencian un
problema sumamente heterogéneo. En la figura 12 se muestran los casos en
hombres pertenecientes a países en vías de desarrollo y los países desarrollados.
Fuente: Global Cancer Statistics, 2002
Figura 12 Casos de incidencia y mortalidad de cáncer en
hombres en países desarrollados y en vías de desarrollo
Una característica notable del cáncer gástrico en el mundo es que resulta
significativamente más alta en hombres que en mujeres (aproximadamente 2:1),
en la mayoría de los países en los que esto no sucede la incidencia de cáncer de
estómago es baja (figura 13).
Fuente: Global Cancer Statistics, 2002
Figura 13. Tasa de incidencia de cáncer gástrico por
sexo-edad estandarizada por 100.000 habitantes.
La sobrevivencia para el cáncer de estómago es moderadamente buena sólo en
Japón (52%). La sobrevivencia es también relativamente alta en América del Norte
(21% sobre la base de los datos). En el resto de los países sigue siendo un
problema (Global, 2007). La figura 14 muestra el panorama mundial.
Fuente: Globocan, 2002
Figura 14.Variación internacional de incidencia para cáncer de estómago en hombres
(arriba) y mujeres (abajo).
Costa Rica de 1983 a 1997 registró uno de los mayores grados de mortalidad por
cáncer gástrico en el mundo de 30 países, incluidos Japón y China (Kuroishi,
2004), como se muestra en la figura 15. Esto también se observó desde que el
Registro Nacional de Tumores inicia la recolección de datos en la década de 1990
(figura 16 y 17).
Fuente: Globocan IARC, Lyon, Francia, 1998.
Figura 15 Tasas de incidencia y mortalidad de cáncer de estómago, por 100,000
hombres, ajustadas por edad, según país en 1990. Datos Globocan 1998.
Figura 16 Tendencia de las tasas de incidencia del cáncer de estómago, según
sexo, Costa Rica, 1992-1996.
Fuente: Unidad de estadística del Registro Nacional de Tumores.
Figura 17 Tasa de incidencia de cáncer de estómago, por 100,000 habitantes,
según provincia, Costa Rica, 1994-1996.
En las figuras 18, 19 y 20 se muestra como solo la mortalidad ha bajado de
manera franca. No obstante se sigue considerando a Costa Rica como uno de
los países con mayor incidencia y mortalidad por cáncer gástrico en el mundo
(Global, 2007).
En la incidencia nacional el cáncer gástrico ocupa el tercer lugar detrás de
próstata y piel según lo mostrado en la figura 19 (Ortiz, 2005). Nótese que del año
1990 al año 2000 no se nota un descenso en la incidencia, no obstante para el
año 2003, que son las últimas estadísticas actualmente disponibles, se observa un
repunte de las tasas lo que podría sugerir que los factores implícitos aun se
mantienen, o están empeorando, según lo mostrado en la figura 20.
Fuente: Unidad de estadística del Registro Nacional de Tumores.
Figura 18 Mortalidad por tumores malignos más frecuentes en hombres.
Tasa ajustada por 100 000 hombres. Costa Rica. 1990-2003 (Ortiz, 2005).
Fuente: Unidad de estadística del Registro Nacional de Tumores.
Figura 19 Incidencia por tumores malignos más frecuentes en hombres,
tasas ajustada por 100 000 hab Costa Rica. 1990-2000 (Ortiz, 2005).
Fuente: Unidad de estadística del Registro Nacional de Tumores.
Figura 20 Tendencia de la incidencia y mortalidad por cáncer gástrico
según sexo Costa Rica, 1995-2005* tasas ajustadas por 100.000 hab
(Vargas, 2007).
Desde los inicios de la investigación del cáncer de estómago en Costa Rica por el
Dr. Salas del Hospital San Juan de Dios por la década de 1970 y luego por la
MSc Rafaela Sierra en los años ochenta (Sierra, 1983), se ha mantenido la misma
tendencia de distribución geográfica con respecto a alta y baja incidencia, según
se puede comparar en las figuras 21, 22 y 23.
Figura 21. Distribución de las tasa de incidencia de
cáncer gástrico en Costa Rica según Sierra et al
1983.
Figura 22. Distribución de las tasas de incidencia por
cantón ajustadas por 100 000 habitantes, según
estadísticas del Registro Nacional de Tumores para el
período 1990-1999.
En la figura 23 se presenta la tasa de incidencia para cáncer gástrico con las
estadísticas más recientes disponibles al periodo 1995- 2003 (Ortiz, 2005).
Figura 23. Distribución de las tasas de incidencia por cantón
ajustadas por 100 000 habitantes según estadísticas del
Registro Nacional de Tumores para el periodo 1995-2003.
El presente trabajo abordará esta tendencia y tratará basado en el conocimiento
científico disponible, de proponer un abordaje integral al problema y probables
soluciones de acuerdo con lo investigado.
1.7 Helicobacter pylori y cáncer gástrico
La asociación entre la infección por Helicobacter pylori y el riesgo elevado de
desarrollar cáncer gástrico está bien establecida en la actualidad (Bartchewsky,
2009; Cancer, 2006-2008; Cañas, 2009; Graham, 2007), aun así, en el mundo
sólo una pequeña proporción de las personas infectadas lo desarrolla.
En principio, la asociación entre H. pylori y cáncer gástrico puede ser explicada de
forma general de acuerdo con un modelo de múltiples eventos de carcinogénesis
gástrica como se muestra en la figura 24.
Figura 24. Desarrollo del adenocarcinoma gástrico
como proceso secuencial por H. pylori (Curso, 2007).
La progresión hacia la atrofia depende, además de la presencia de la bacteria, de
otros factores concomitantes, ambientales, y genéticos, considerándose un
proceso multifactorial (Talley, 2008).
El cáncer aparece a partir de la acumulación gradual de cambios genéticos
resultantes de la pérdida de mecanismos de control celular como los que regulan
la proliferación y la estabilidad del genoma. Durante la persistencia de largo plazo
en el hospedero, la infección por Helicobacter pylori promueve estos eventos; por
esta razón es que está considerado actualmente como el principal factor de riesgo
para el desarrollo de cáncer gástrico; sin embargo los mecanismos por los cuales
la infección aumenta el riesgo aún se investigan (Bartchewsky, 2009).
La infección por H. pylori induce una inflamación activa y provoca la inflamación
crónica que persiste en la mucosa gástrica. Los productos bacterianos y las
especies reactivas de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS), liberados en el sitio de
la inflamación pueden dañar el ADN y esto ha sido considerado como un posible
mecanismo por el cual la infección puede llevar finalmente a la neoplasia
(Hamajima, 2006; Siomek, 2006; Tunca, 2007; Olczak, 2005; Ohara, 2006; Peek,
2002; Wang, 2005). La extensión y la gravedad de la inflamación de la mucosa
gástrica, así como la evolución clínica de la infección, dependerá de una serie de
factores, incluyendo la susceptibilidad genética del hospedero y factores de
virulencia de la bacteria (Matysiak, 2006).
Los principales mecanismos moleculares que subyacen el desarrollo del cáncer
gástrico en las personas inducido por H. pylori incluyen como resultado de
mutaciones la sobre-regulación de varios genes como las citocinas,
los
oncogenes y los factores de crecimiento, y la des-regulación de genes supresores
de tumores.
Recientemente se ha propuesto que estas bacterias causan un deterioro de la
reparación del ADN en el tejido gástrico, dando lugar a la acumulación de
mutaciones y un desequilibrio genómico aumentando el riesgo de carcinoma
gástrico (Park, 2005; Bartchewsky, 2009).
El deterioro del sistema de reparación del ADN “DNA Mismatch Repair” (MMR) es
conocido como una causa de carcinogénesis y progresión a tumor en ambos tipos
de cáncer esporádicos y hereditarios. El sistema DNA MMR es importante para
mantener la fidelidad genómica a través del reconocimiento y la reparación de
nucleótidos emparejados incorrectamente, los cuales pueden originarse de
nucleótidos de ADN dañado físicamente o errores de la ADN polimerasa
(Bartchewsky, 2009).
Deficiencias en este sistema resultan en tasas de mutación que son cien veces
mayores que las observadas en células normales, lo que permite la acumulación
de mutaciones en genes críticos reguladores. El sistema DNA MMR se compone
de cinco genes principales MLH1, MSH2, PMS1, MSH3 y MSH6 donde todos son
expresados en el ciclo celular. Algunos autores han demostrado que la expresión
de MLH1 es esencial para la DNA MMR competente y el mantenimiento de la
estabilidad de microsatélites (secuencias cortas y repetidas de ADN en diferente
número que tenía el ADN cuando se heredó) (Bartchewsky, 2009).
La 6-metilguanina ADN metiltransferasa (MGMT) es una enzima de reparación
que elimina aductos mutagénicos y citotóxicos de 6-guanina en el ADN. La
alquilación del ADN en la posición 6 de la guanina es un paso importante en la
formación de las mutaciones en el cáncer. Así, la capacidad de una célula para
resistir el daño está directamente relacionado con el número de moléculas que
contiene MGMT y la velocidad de síntesis de novo de MGMT. La pérdida de
expresión de MGMT puede aumentar la mutación del gen y podría conducir al
desarrollo de cáncer gástrico (Bartchewsky, 2009), o sea lo que se reconoce
actualmente como cambios epigenéticos.
Touati y colaboradores (Touati, 2009), en trabajos similares también han
demostrado la inducción de eventos genotóxicos como una propiedad común en
cepas de H pylori derivadas de linfoma MALT en ensayos con ratones
transgénicos (Big blue) dejando claro el rol de inestabilidad genética en la
promoción a neoplasia gástrica durante la infección con la bacteria.
En investigaciones conducidas por Bartchewsky y colaboradores (Bartchewsky,
2009), no encontraron ninguna asociación entre infección con las cepas más
virulentas (cagA y vacA s1 m1) y los niveles de expresión de MLH1 ni MGMT.
Estos hallazgos concuerdan con lo publicado ya por Kim y colaboradores (Kim,
2002), el cual demostraba que el status de CagA no está asociado con la
alteración de la expresión MLH1 in vitro.
La infección por H. pylori aumenta significativamente los niveles de MGMT y
MLH1. La reducción en MLH1 y la pérdida de la expresión de MGMT en pacientes
con cáncer gástrico podría ser explicada por la habilidad de H. pylori para
promover metilación de genes por liberación de ROS y oxido nítrico y por la
activación de DNA metilransferasas, esto sugiere que lo anterior no es un evento
temprano en la asociación de H. pylori con carcinogénesis gástrica.
Recientemente se ha encontrado la Proteína Inductora de Factor de Necrosis
Tumoral- Alfa (Tipalpha), que se considera, es el único factor cancerígeno liberado
por H. pylori, es alrededor de un 5-10% distinta entre distintas cepas de H. pylori.
Tipalpha se une específicamente a las células y es incorporado al citosol y al
núcleo e induce una fuerte expresión del TNF-α y genes de quimosinas: la IL-1β,
e IL-8, aumenta la proliferación celular, la expresión del gen Bcl-2 y desregula el
gen P53 mediante la activación del sistema NF-kappaB resultando en el
desarrollo de un tumor (Zhonghua, 2008),
El sistema NF-kappaB se encuentra en casi todos los tipos de células animales y
está involucrada en la respuesta celular a estímulos como estrés, citoquinas,
radicales libres, radiación ultravioleta y antígenos bacterianos y virales,
desempeña un papel clave en la regulación de la respuesta inmunitaria a la
infección. Por el contrario la desregulación se ha relacionado con cáncer,
inflamación y enfermedades autoinmunes.
Recientemente se le ha descrito una proteína receptora, la nucleolina en la
superficie celular (Watanabe, 2010), que se ha considerado como un marcador de
riesgo de la severidad de dosis- respuesta de lesiones pre-neoplásicas a cáncer
gástrico (Cinghu, 2010).
Las enfermedades gástricas asociadas con la infección por H. pylori se deben
también a una inapropiada regulación de la respuesta inmune de las personas,
donde la respuesta pro inflamatoria contribuye a la patogénesis del cáncer. Dentro
del grupo de personas infectadas por H. pylori, las que presentan determinados
polimorfismos del gen IL-1B, que codifica la citoquina inflamatoria interleucina-1β,
tienen mayor riesgo de padecer lesiones precancerosas y cáncer gástrico. Estos
polimorfismos en presencia de H. pylori causan sobreexpresión de la proteína IL1β, lo que produce una disminución significativa de las secreciones ácidas del
estómago, que junto con la hipoclorhidria, crean un ambiente de riesgo de cáncer
gástrico, permitiendo la acumulación de bacterias, sus toxinas y mediadores
proinflamatorios incrementando el daño.
En Costa Rica estudios de Wagner Alpízar dan cuenta de un grupo de una
población de alto riesgo, donde se reportó por primera vez, la asociación
significativa del polimorfismo IL-1β +3954 con el riesgo de desarrollar cáncer
gástrico (Alpízar, 2005, 2009).
1.7.1 Infección por H. pylori y la carga mundial de cáncer gástrico
La medida en la cual la infección crónica por Helicobacter pylori es responsable
de la carga mundial de cáncer gástrico y linfoma no Hodgkin se revisó sobre la
base de nuevos casos de cáncer registrados en 2002 (Parkin, 2002). En ese año
casi el 20% de los cánceres se consideraron atribuibles a enfermedades
infecciosas, con H. pylori como la causa principal (5,5% de todos los cánceres),
seguido por los virus del papiloma humano, hepatitis viral B y C, virus de EpsteinBarr, el VIH y el virus herpes humano 8 (Graham, 2007).
En el 2007, el Grupo de Estudio Europeo de Helicobacter confirmó que es el
factor de riesgo más importante para adenocarcinomas gástricos no cardiales y
linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica (MALT) (Graham, 2007).
Por su parte la Asociación Americana de Cáncer estima que se le puede atribuir a
H. pylori un 59% de los casos de cáncer en países en vías de desarrollo y un 63%
de los casos en países desarrollados, la diferencia estriba en que se presenta
mayor número de casos en países en vías de desarrollo (Global Cancer, 2007).
Entonces H. pylori ha sido estimado ser el responsable de alrededor del 75% de
cánceres gástricos no cardíales y linfomas gástricos no-Hodgkin, y el 65% de
todos los cánceres de estómago en el mundo ( Graham, 2007).
En cuanto a la erradicación de H. pylori y la prevención del cáncer gástrico se
considera que a pesar de la acumulación de evidencia y aunque la erradicación de
H. pylori podría ser relativamente fácil de lograr, el impacto de la carga global de
cáncer gástrico será un reto mucho más difícil de alcanzar (Graham, 2007). La
terapia de erradicación ha demostrado ser beneficiosa cuando se administra antes
del desarrollo de la metaplasia intestinal, y es menos eficaz cuando se administra
después.
1.8 Investigaciones en Costa Rica.
Estudios de Darner Mora y colaboradores no encontraron correlación
estadísticamente significativa entre niveles de nitratos en el agua de consumo de
poblaciones y tasas de mortalidad por cáncer gástrico (Mora, 2006), no obstante la
investigación careció de la demostración del vínculo indirecto con el consumo de
nitratos (grupos 2A de IARC). Otras investigaciones de Rafaela Sierra y
colaboradores mostraron que variaciones en las tasas de incidencia para cáncer
gástrico poseían asociaciones estadísticamente significativas entre pH, potasio,
zinc y hierro en el suelo (Sierra, 1983).
Con respecto a Helicobacter pylori y cáncer gástrico en pacientes costarricenses,
se cuenta con las investigaciones realizadas por Rafaela Sierra y colaboradores,
Sergio Con y colaboradores y Alessandra Occhialini y colaboradores (Occhialini,
2000). Para efecto de abordar la temática propia de este trabajo se presenta lo
estudiado por Sierra y Con.
En el caso de Rafaela Sierra y colaboradores (Sierra, 1994), descubrieron que los
niños y jóvenes de 7 a 20 años de edad, tanto de las regiones de alto como de
bajo riesgo de cáncer gástrico se encontraban positivos en más del 60 %, así
mismo, en una población dispéptica de un área de alto riesgo de la provincia de
Cartago, se hallaron anticuerpos positivos contra la bacteria entre el 88% y el 92
% de pacientes adultos.
Así mismo Con y colaboradores encontraron en pacientes que marcadores de
virulencia séricos anti-CagA y factores como, VacA s1, VacA m1, grupo
sanguíneo y polimorfismos en interleuquinas 1β, fueron significativamente más
altos en regiones con alta incidencia de cáncer gástrico, con respecto a pacientes
de zonas de baja incidencia, a pesar de que no existió diferencia significativa en la
prevalencia de anticuerpos en los pacientes entre las regiones (Con, 2006).
En otro estudio en población costarricense Con y colaboradores reportaron
también que la presencia del gen cagA pareció asociarse al desarrollo de atrofia
gástrica y tanto vacA s1 como vacA m1 presentaron asociación significativa con el
desarrollo de cáncer gástrico en pacientes, reportando una prevalencia de CagA,
VacA s1 y VacA m1 de 75,3%, 75,3% y 74,2% respectivamente (Con, 2007).
En otra investigación Con y colaboradores (Con, 2009), mostraron que en
pacientes con polimorfismos en interleucinas no presentaron asociación con la
variabilidad en la incidencia de cáncer gástrico. Sin embargo, la atrofia gástrica, la
metaplasia intestinal y las cepas con genotipos diferentes de vacA en el mismo
estómago (infección por cepas mixtas) fueron más frecuentes en pacientes de
zonas de alta incidencia de cáncer gástrico que en pacientes de zonas de baja
incidencia y cagA, vacA
s1b, estuvieron asociados en forma altamente
significativa con alta incidencia de cáncer gástrico (P = 0,026 y 0,041,
respectivamente), además fueron individualmente asociados con cáncer gástrico
las interleucinas IL-1β+3954_T/C, IL-1RN*2/L
y IL-10-592_C/A, y una
combinación de estos polimorfismos de citocinas con H pylori vacA s1b y m1
incrementaron aun más el riesgo. Aunque un perfil genético de citoquinas
proinflamatorias muestran un mayor riesgo para el desarrollo de GC, las
características de la infección por H. pylori, en particular la situación de la
distribución de los genotipos cagA y vacA parece jugar un papel más importante
en la variabilidad de la alta incidencia del cáncer en Costa Rica.
1.9 El papel del agua de consumo humano en la transmisión de H. pylori.
Se considera que el medio ambiente juega un rol preponderante en la adquisición
de la infección. En el escenario de múltiples rutas, se estima que los seres
humanos se ven inmersos en una serie de intentos de H. pylori del ambiente por
colonizar la mucosa gástrica, reconociendo que se pueden conjugar tres factores:
bajo número de la bacteria, baja actividad fisiológica y posiblemente reacción y
resistencia humana a la mayoría de las cepas. De forma contraria, el éxito de la
bacteria en la colonización y la infección de un individuo corresponderían a la
susceptibilidad natural del hospedero con cepas que co-expresan factores de
virulencia.
Con el creciente control de parámetros del agua observados principalmente en los
países desarrollados, la hipótesis de la transmisión hídrica explica la disminución
de la colonización de las personas por H. pylori en estos países.
Al reconocer la posibilidad de que H. pylori sea transmitida por el agua de
consumo en la población, toma especial importancia la cobertura de agua potable
en Costa Rica, la cual si bien es cierto ha ido en franca mejora en los últimos
años, a 2008 aproximadamente el 20% de la población costarricense consume
agua no potable constituyéndose como un riesgo potencial (Mora, 2009). Sin
embargo las consecuencias actuales con respecto a las patologías de largo plazo
como el cáncer, fueron gestadas bajo las condiciones del país desde hace
aproximadamente 25 años.
Actualmente se cuenta con evidencia para el reconocimiento del agua de
consumo humano en el rol epidemiológico de H. pylori (Mazari, 2001; Kowolick,
2005), advirtiéndose directamente que el consumo del agua no tratada debería
considerarse un factor de riesgo para la infección en una población dada
(Kowolick, 2005, Reavis, 2005; Bragança, 2007; Baker, 2001, Gião, 2006). Se ha
mencionado incluso que en Japón la mayor parte de los casos de transmisión de
H. pylori puede ser de origen hídrico y que la transmisión está fuertemente
asociada con la duración de la ingesta en la vida de las personas con respecto al
consumo de agua de pozo (Karita, 2003).
Una variedad de métodos moleculares y la determinación de marcadores
genéticos por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR directo) y ensayos con
anticuerpos han sido utilizados para detectar la presencia de H. pylori en agua de
pozos, ríos, en biofilmes asociados a tanques de almacenamiento de agua y en
tuberías de redes de distribución (Braganca, 2005; Piqueres, 2006; Fujimura,
2004; Adams, 2003; Benson, 2004). Sin embargo a la fecha no se ha reportado el
cultivo directo a partir del agua de consumo humano, a lo sumo lo realizado por Lu
y colaboradores, fue el cultivo con la ayuda de anticuerpos inmunomagnéticos a
partir de agua residual (Lu, 2005).
Lo que sí ha sido publicado es la sensibilidad diagnóstica y el grado de
recuperación de H. pylori en matriz de agua potable sugiriéndose que esta matriz
no presenta interferencia real (McDaniels, 2005). Además se ha demostrado su
sobrevivencia a la cloración sin encontrarse correlación con niveles de cloro en
agua tratada con respecto a la prevalencia de la infección en población de riesgo
(Ramírez, 2004). No obstante, se ha determinado que H. pylori suspendido en el
agua tiene muy bajo poder de cultivo comparado con otros patógenos de origen
hídrico (Azevedo, 2007).
Mientras algunos autores han mencionado que la capacidad de cultivo de H.
pylori generalmente termina algún tiempo después de su inoculación artificial en el
agua (Azevedo, 2006), Oliver demostró la viabilidad y la capacidad de cultivo de H.
pylori en agua hasta por 75 horas a 10 °C (Oliver, 2005). Así mismo Shahamat
(Shahamat, 1993) determinó que el total de células no disminuía por períodos
mucho más largos (2 años a 4 °C) en agua artificialmente inoculada.
Algunos estudios muestran la capacidad de cultivo in vitro de al menos 10 horas a
temperaturas mayores de 20 °C (Adams, 2003; Azevedo,2004) en los cuales se
puede comparar con la capacidad de cultivo de más de 40 días para Escherichia
coli y Salmonella entérica a la misma temperatura.
En términos generales la adherencia de los microorganismos a las superficies
(como biofilmes o biopelículas) es un importante factor de sobrevivencia que
puede influir en la patogenicidad de cepas específicas, y esto es crucial en la
epidemiología y la transmisión de H. pylori (Azevedo y Pacheco, 2006; Azevedo y
Pinto, 2006; Azevedo, 2003; Simoes, 2006). Se ha estudiado su adhesión en
tanques de almacenamiento para agua de acero inoxidable y de polipropileno,
encontrándose que en estas superficies retiene su morfología espirilar (Azevedo y
Pinto, 2006). Esto es muy importante por cuanto se puede considerar reservorio
en sistemas de distribución de agua.
Los microorganismos así organizados, tal y como se ha estudiado en E. coli
aumentan su capacidad para soportar y neutralizar monocloraminas, estimular la
producción de catalasa, o inducir la expresión de betalactamasas cromosómicas
(Boaretti, 2003). De esta forma se defienden del medio ambiente que les rodea,
pueden activar genes de respuesta a estrés y cambiar entonces a fenotipos de
estrés ambiental. Con un mismo genotipo, la bacteria expresa un distinto patrón de
genes y presenta un distinto fenotipo, como por ejemplo alteraciones en el patrón
nutricional, densidad celular, temperatura, pH o la osmolaridad. La inanición
prolongada induce a la pérdida de capacidad de cultivo en condiciones normales,
en estos casos
las células permanecerían metabólicamente activas y
estructuralmente intactas (Fux, 2005).
En estos biofilmes, dependiendo de las condiciones ambientales, una misma
bacteria puede crecer, sésil adherida a la superficie, o desarrollarse de forma
planctónica nadando libremente en el medio líquido. En los biofilmes planctónicos
las bacterias se pueden encontrar en estado reversible de "viables pero no
cultivables" (VPNC) y se considera la principal razón de la baja tasa de detección
de microorganismos en biopelículas por métodos rutinarios de cultivo (Fux, 2005).
Esta habilidad de agregarse en biofilmes es expresada por H. pylori, para lo cual
se ha demostrado que las bacterias sésiles conservan generalmente la capacidad
de retener su forma espiralar por más tiempo, comparado con las formas
planctónicas las cuales empiezan a ser cocoides más rápidamente (VPNC)
(Azevedo, 2006).
Por mucho tiempo se consideró que muchos de los problemas que se han
encontrado en la recuperación de formas viables de H. pylori en el agua, se deben
a que las formas espiralares pasan a formas cocoides o VPNC. Desde un punto
de vista más amplio, ahora se acepta que lo que ocurre es que estas bacterias no
se logran cultivar bajo métodos rutinarios y convencionales de laboratorio. Más
aún, se ha demostrado que formas cocoides de H. pylori son capaces de
colonizar la mucosa gástrica y causar gastritis en ratones (Touati, 2003; She,
2003).
Actualmente se presenta evidencia sobre la mayor resistencia de H. pylori con
respecto a E. coli al cloro y al ozono, por lo que, este microorganismo es capaz
de tolerar desinfección (probablemente deficiente) en sistemas de distribución de
agua (Baker, 2002). Esto contrasta con lo publicado por Johnson y colaboradores
(Johnson, 1997), quienes reportaban inactivación de la bacteria, determinándose
posteriormente errores en sus procedimientos de laboratorio. También se ha
reportado de la resistencia de H. pylori al glutaraldehído, desinfectante
comúnmente usado en la desinfección de equipo médico en condiciones de alta
carga bacteriana (Chiu, 2007).
Investigaciones recientes dan cuenta de que un aumento en la temperatura es un
factor importante para reducir la contaminación por H. pylori en sistemas de
abastecimiento de agua, y es probable que esto se observe también para otros
microambientes (Azevedo, 2007).
Según ha mencionado Azevedo, H. pylori es cultivable a temperaturas bajas (no
menciona cuan bajas), se ha visto que zonas frías en el mundo presentan
mayores tasas de infección y que posiblemente la transmisión ocurra
principalmente durante época lluviosa (Azevedo, 2007). Dicha aseveración será
fundamental en los resultados y conclusiones de este trabajo.
Como se ha demostrado que la bacteria es capaz de retener la integridad celular
durante al menos dos años en el agua a bajas temperaturas, es evidente entonces
que el medio ambiente sirve como reservorio para la diversidad de cepas de H.
pylori (Azevedo, 2007; Montero, 2009)
La propuesta de modelos a través de la tolerancia en el agua, le puede conferir
características importantes en el ciclo de transmisión, siendo trascendental para
una población dada, pues tiene fuertes implicaciones en la salud pública.
1.10 Calidad actual del agua en Costa Rica
La prestación de los servicios de agua potable y alcantarillado sanitario en Costa
Rica, le corresponde al Instituto Costarricense de Acueductos y Alcantarillados
(AyA), como ente operador encargado de brindar servicios de distribución de agua
a la población, así como de canalizar las aguas domésticas, negras e industriales,
mediante el sistema de alcantarillado sanitario. No obstante, los altos índices de
cobertura con los que cuentan los servicios de agua y saneamiento, demuestran
una compleja estructura institucional en el aparato gubernamental, que conlleva
por una parte, a la duplicación de responsabilidades entre varias instituciones y
por otra parte, la ausencia de un sistema de planificación y desarrollo del sector
salud, dentro del subsector agua potable y saneamiento (SAPS) (Evolución ,
2009).
El SAPS no está formalmente constituido, pero en la práctica está integrado por el
AyA en su carácter de rector del agua potable y del alcantarillado sanitario y a su
vez operador de sistemas; y por los otros operadores de sistemas: la Empresa de
Servicios Públicos de Heredia (ESPH S.A.), las municipalidades, los comités
administradores de acueductos rurales (CAARs) y las asociaciones
administradoras de acueductos y alcantarillados rurales (ASADAS) y algunas
organizaciones privadas menores que operan acueductos o sistemas individuales
(en general pozos excavados o nacientes).
La función primordial del AyA consiste en dirigir y fijar políticas, establecer y
aplicar normas, realizar y promover el planeamiento, financiamiento y desarrollo y
en general resolver todo lo relacionado con el suministro de agua potable,
recolección y evacuación de aguas negras y residuos industriales líquidos, y los
aspectos normativos de los sistemas de alcantarillado pluvial en áreas urbanas y
en todo el territorio nacional.
El AyA está obligado además a asesorar a otros organismos del Estado y
coordinar las actividades públicas y privadas en todos los asuntos relacionados
con el establecimiento de acueductos y alcantarillado, y el control de la
contaminación de los recursos de agua, siendo obligatoria en todo caso, su
consulta e inexcusable el cumplimiento de sus recomendaciones.
El AyA funge además como institución descentralizada prestadora de servicios,
según lo señala su Ley Constitutiva, por lo que le corresponde administrar y operar
directamente los sistemas de acueductos y alcantarillados sanitarios de todo el
país. El Instituto es el ente encargado de garantizar la continuidad del servicio de
agua potable en el ámbito nacional, debiendo asumir la gestión para garantizar la
continuidad cuando el operador no pueda seguir prestándolo.
Debido a la presencia de varios entes operadores, se presentan conflictos de
responsabilidad en cuanto a la planificación y prestación de los servicios; tal es el
caso de la Gran Área Metropolitana (GAM), que concentra aproximadamente el
50% de la población del país, donde actúan el AyA, la ESPH S. A. y algunas
municipalidades.
1.10.1 Fuentes de agua disponibles
Aproximadamente un volumen de 170 km 3 ingresa al país anualmente por
concepto de lluvias, de los cuales unos 75 km3 escurren superficialmente y forman
parte del caudal de los ríos, mientras que 37 km3 recargan los acuíferos. Una
tercera parte de agua que se precipita vuelve a la atmósfera mediante los
procesos de evaporación y transpiración.
La abundante precipitación ha hecho que durante siglos, el costarricense no haya
sentido preocupación por la disponibilidad de agua para realizar sus actividades,
como tampoco ninguna necesidad de planificar las actividades relacionadas con el
manejo de los recursos hídricos (OPS, 2004).
Los acuíferos constituyen un patrimonio para el desarrollo futuro de Costa Rica, la
calidad y cantidad de agua que surten para consumo doméstico depende del
grado de deterioro de las zonas de recarga. Cuatro zonas concentran la mayor
parte de la demanda: la Gran Área Metropolitana GAM, Guanacaste, Puntarenas y
Limón. El 50% de los suministros de agua para consumo humano de estas zonas
proviene de fuentes subterráneas. En particular, los acuíferos más explotados del
país – Colima Inferior, Colima Superior y Barva – abastecen al 65% de la
población de la GAM. Los principales factores de presión sobre los acuíferos
incluyen, por un lado, los procesos de cambio en el uso de la tierra (deforestación,
drenaje de humedales e impermeabilización por desarrollo urbano y descarga de
desechos que potencialmente pueden alcanzar los niveles freáticos) y por otro, los
patrones de consumo y las tasas de extracción de aguas subterráneas. Sin
embargo, el conocimiento actual sobre las zonas de recarga y la hidrología de los
acuíferos resulta insuficiente (OPS, 2004).
Las municipalidades tienen a su cargo la administración plena de los sistemas de
abastecimiento de agua potable que tradicionalmente han tenido. Por disposición
de la Ley Constitutiva de AyA, las municipalidades que estuvieran administrando y
operando sistemas en el momento de crearse el AyA, podían continuar a cargo de
estos sistemas siempre y cuando mantuvieran un servicio eficiente, con excepción
de los acueductos ubicados en el Área Metropolitana que deberán ser
administrados en forma exclusiva por el AyA.
AyA está autorizado por el ordenamiento jurídico para asumir la administración,
operación y mantenimiento de los acueductos y sistemas de alcantarillado
sanitario que están bajo control de las municipalidades, cuando éstas
voluntariamente así lo acuerden con el AyA o cuando la prestación del servicio sea
deficiente.
En términos generales en Costa Rica los cantones (y por ende las
municipalidades) que poseen fuentes de agua propias sea nacientes, pozos o
fuentes superficiales (ríos), ellos mismos administran este recurso.
Comités Administradores de Acueductos Rurales (CAAR´s) y Asociaciones
Administradoras de Acueductos y Alcantarillados (ASADAS): Los comités
administradores de acueductos rurales (CAAR´s) han sido las organizaciones
locales que se iniciaron en la administración comunitaria de acueductos rurales
amparados y tutelados por el AyA. A partir de la década de los noventa se
institucionaliza la figura de las asociaciones administradoras de acueductos y
alcantarillados (ASADAS) con personería jurídica y con su respectivo reglamento
de operación y administración supervisado por el AyA, momento desde el cual
muchos CAAR´s se han venido transformando en ASADAS.
Las ASADAS tienen como fin administrar, operar y mantener en buenas
condiciones el acueducto y el alcantarillado sanitario (cuando exista), de acuerdo
con las normas y políticas que al respecto emita el AyA. Tienen una relación de
subordinación bastante clara frente al AyA. Ante una mala prestación del servicio o
un incumplimiento grave de las ASADAS, el AyA tiene la potestad para terminar
con el convenio a través del cual delegó la prestación del servicio, además debe
ejercer absoluto control y fiscalización sobre la labor de estas asociaciones.
Costa Rica se ha distinguido por gozar de altas coberturas en los servicios de
agua potable y saneamiento, sin embargo se identifican deficiencias en la calidad
de la prestación de los servicios, organización, ausencia de planificación e
insuficiente inversión que puedan garantizar en el mediano y largo plazo el
sostenimiento de las coberturas (OPS, 2004).
Como parte de las debilidades del sector en el área de la gestión de los servicios,
se consignó en el Análisis Sectorial la ausencia de un sistema constante e integral
de control y vigilancia de la calidad del agua potable en el ámbito nacional. La falta
de fiscalización y control de parte del AyA a las organizaciones comunitarias
administradoras de acueductos rurales (CAAR´s y ASADAS), donde se identifican
los mayores índices de suministro de agua “no potable” y la ausencia de un
sistema de financiamiento permanente a los acueductos rurales, se plantean como
retos importantes por resolver para mejorar la calidad del agua en el sector rural.
A continuación se presentan gráficas y cuadros sobre la situación de la calidad
actual del agua de consumo en Costa Rica.
En el primer semestre del 2003, el Laboratorio Nacional de Agua (LNA/AyA)
consignó en un documento los resultados de la situación de la cobertura y calidad
del agua para consumo humano en el país al año 2002 ( ver figura 25). En el
cuadro 1 se presentan los acueductos estudiados con tratamiento y desinfección o
sólo desinfección y la evaluación de la calidad del agua, según ente operador, al
año 2008.
Figura 25. Porcentaje de acueductos por Ente Operador al 2002
Cuadro 1. Agua para consumo humano: estimación general de cobertura y calidad en
Costa Rica - Período 2008
Entidad
administradora
N°
Población
cubierta
Población con
agua potable
Población con
agua no potable
Acueductos
No
Acueductos Población
%
Población
%
Población
%
Potab. Potab.
AyA
173
2.243.011
49,3
2.202.473
98,2
40.538
1,8
147
26
Municipalidades
evaluadas
244
705.147
15,5
555.395
78,8
149.752
21,2
175
69
E.S.P.H.
12
164.626
3,6
164.043
99,6
583
0,4
11
1
1.033
901.006
19,8
528.791
58,7
372.215
41,3
523
510
812
338.305
7,4
198.585
58,7
139.720
41,3
414
398
2.274
4.352.095
95,6
3.649.287
83,9
702.808
16,1 1.270
Fácil acceso,
urbanizaciones
y privados ***
¿?
172.896
3,8
145.060
83,9
27.836
16,1
¿?
¿?
Sin información
¿?
24.912
¿?
¿?
¿?
¿?
¿?
¿?
¿?
2.274
4.549.903
100
3.794.347
83,4
730.644
CAAR´s/ASADAS *
(Evaluadas)
CAAR´s/ASADAS ** (Sin
evaluar)
Sub-Total
Totales
16,0 1.270
1.004
1.004
* Estimación fundamentada en el Programa de Vigilancia 2006-2008.
** El porcentaje de población abastecida con agua de calidad potable se calcula manteniendo el porcentaje obtenido en los acueductos evaluados y
extrapolando el resultado a los que faltan de avaluar.
*** El porcentaje de población abastecida con agua de calidad potable se calcula manteniendo el 83.9% obtenido en todos los acueductos.
Los acueductos con tratamiento por métodos convencionales (floculación y
coagulación química, decantación y filtración), que incluyen desinfección, se
abastecen de fuentes superficiales y aquellos acueductos en los que se practica la
desinfección como único tratamiento, se surten de fuentes subterráneas
generalmente de muy buena calidad. La potabilidad y no potabilidad de los
acueductos, de acuerdo con el estudio del LNA/AyA, se basó en el cumplimiento o
no
de las normativas del “Reglamento de Calidad del Agua Potable” y los criterios
propios del LNA, medidas a través de muestreos y análisis microbiológicos y
físico-químicos en las fuentes de agua, tanques de almacenamiento y redes de
distribución de cada acueducto del territorio nacional, realizadas en campañas
distribuidas por regiones. Las campañas de muestreo consisten en un número de
muestras puntuales, de acuerdo con el tamaño de la población abastecida por
cada acueducto, tomadas a la salida de las plantas de tratamiento y en varios
puntos del sistema de distribución de agua a la comunidad.
En el cuadro 2 se resume el total de acueductos por entidad operadora según su
calidad, tratamiento y/o desinfección.
Cuadro 2. Tratamiento, desinfección y calidad del agua en los acueductos de Costa Rica
por número de sistemas según ente operador. 2008.
Ente operador
Acueductos
Total
Tratamiento
Desinfección
Potables
No.
%
No.
%
No.
%
No.
%
CAAR's*
173
244
12
1845
7,6
10,7
0,5
81,1
18
3
0
21
0,8
0,1
0,0
0,9
153
139
12
281
6,7
6,1
0,5
12,4
147
175
11
523
6,5
7,7
0,5
23,0
Totales
2274
100,0
42
1,8
585
25,7
856
37,6
AyA
Municipalidades
ESPH
* período 2006-2008.
Fuente: Área de Microbiología, Laboratorio Nacional de Aguas, AyA
Con respecto a la cobertura y calidad del agua por provincias se presentan los
gráficos elaborados por el Laboratorio Nacional de Aguas bajo la figura 26.
Figura 26. Coberturas con agua de calidad potable (azul), no potable (verde) y sin evaluar
(rojo) por provincias en Costa Rica, en el período 2008, según el Laboratorio Nacional de
Agua.
Un aspecto importante a ser tomado en cuenta en la valoración del riesgo es la
evolución que ha tenido en los últimos años la calidad del agua dispensada a la
población, tal y como se aprecia en las figuras 27 y 28.
Fuente: Informes anualees de calidad del agua. Laboratorio Nacional de Aguas
Figura 27. Valores porcentuales de habitantes abastecidos con agua potable y no potable
en los acueductos operados por Municipalidades 1996-2008.
Fuente: Informes anuales de calidad del agua. Laboratorio Nacional de Aguas
Figura 28 Valores porcentuales de habitantes abastecidos con agua potable y no potable
en acueductos operados rurales 1999-2008.
Finalmente se desea mostrar para efectos de discusión posterior de los resultados
del presente trabajo, la cobertura en la disposición segura de excretas, la cual se
presenta bajo las figuras 29 y 30 cobertura que se ha mantenido así por muchos
años.
Fuente: Estado del Saneamiento. Caso Costa Rica. Setiembre de 2007.
Figura 29. Valores absolutos en conexiones y técnicas para la disposición segura de
excretas
Fuente: Estado del Saneamiento. Caso Costa Rica. Setiembre de 2007.
Figura 30. Disposición segura de excretas. Encuesta de Hogares, 2006 INEC
Como se pudo apreciar en las figuras 25 y 26 en el país se maneja una excelente
disposición de excretas, y esto es muy importante desde el punto de vista de salud
pública, enfermedades transmisibles y la circulación de microorganismos
patógenos entéricos en el ambiente. Este hecho se abordará en la discusión de
los resultados.
1.11 Planes de seguridad del agua (PSA)
Al considerar la carga de enfermedades y la preocupación que involucra a todos
los responsables del abastecimiento de agua para consumo humano, la
Organización Mundial de la Salud (OMS) ha planteado un manejo para el agua de
bebida segura, el cual desde hace algunos años se está tratando de implementar
en Costa Rica.
Marco para el agua de bebida segura
La OMS, en la tercera edición de sus Guías de Calidad del Agua de Bebida
(GDWQ por sus siglas en inglés), expresa que la calidad del agua puede ser
controlada por medio de la protección de las fuentes, el control de los procesos de
tratamiento, la gestión de la distribución y el manejo a nivel intradomiciliario.
El manejo preventivo considera cinco componentes principales:
- Objetivos basados en salud y establecidos en función de la evaluación de los
aspectos de salud;
- Evaluación del sistema para determinar si el agua suministrada satisface los
objetivos de salud;
- Monitoreo operacional de las medidas de control;
- Gestión de los planes de seguridad del agua, la que documenta la evaluación del
sistema, los planes de monitoreo y las acciones emprendidas en condiciones
normales u ocasionales;
- Vigilancia que verifica que todo lo anterior opera apropiadamente
Los objetivos basados en salud están asociados con decisiones políticas y son
establecidos por la más alta autoridad de salud en consulta con los abastecedores
y consumidores, reflejándose en leyes, reglamentos y normas técnicas. La
evaluación del sistema, el monitoreo operacional y la gestión, forman parte del
Plan de Seguridad del Agua (PSA) y son elaborados y aplicados por los
prestadores del servicio de abastecimiento de agua, revisados y aprobados por la
autoridad sanitaria.
Finalmente se propone que la vigilancia es responsabilidad de una agencia
independiente, normalmente representada por el Ministerio de Salud que
periódicamente revisa todos los aspectos de seguridad aplicados por el prestador
del servicio y quien todo el tiempo es responsable del control de calidad, del
monitoreo operacional y de asegurar la aplicación de buenas prácticas operativas.
Objetivos del PSA
El objetivo principal del PSA es el aseguramiento de las buenas prácticas de
abastecimiento de agua de bebida a través de la minimización de la contaminación
de las fuentes de agua, la reducción o el retiro de la contaminación por medio de
procesos de tratamiento (barreras); y la prevención de la contaminación durante el
almacenamiento, la distribución y la manipulación del agua a nivel intradomiciliario.
Estos objetivos son aplicables a los grandes y pequeños sistemas de
abastecimientos de agua, así como a pequeñas instalaciones (hoteles y
hospitales) e incluso a nivel casero; los cuales se alcanzan a través de:
• Adecuado conocimiento del sistema de abastecimiento de agua y de su
capacidad para suministrar el agua que satisfaga el objetivo basado en la salud.
• Identificación de fuentes potenciales de contaminación y la manera de
controlarlos.
• Validación de las medidas de control empleadas en el control de peligros.
• Implementación de sistemas de monitoreo de las medidas de control.
• Aplicación de medidas correctivas oportunas para asegurar el abastecimiento de
agua segura de manera permanente.
• Verificación de la calidad del agua de bebida para asegurar que el PSA está
aplicado correctamente, alcanzando el rendimiento requerido para satisfacer los
estándares de calidad del agua.
2. Objetivos:
Objetivo general:
Valorar el impacto de la presencia de H. pylori en agua de consumo humano
de fuentes seleccionadas en cantones de alta y baja incidencia de cáncer
gástrico en Costa Rica por medio de técnicas moleculares y técnicas de cultivo
modificadas.
Objetivos específicos
1.
Determinar la presencia de Helicobacter pylori mediante técnicas de cultivo y
técnicas moleculares en muestras de agua en zonas de alta y baja incidencia
de cáncer gástrico.
2.
Confirmar la identidad de las cepas encontradas
moleculares de identificación y de patogenicidad.
3.
Valorar el manejo del agua potable en Costa Rica y contrastarlo con el
manejo en países desarrollados con el fin de proponer pautas para su
mejoramiento.
mediante marcadores
3. Hipótesis:
"Si Helicobacter pylori se cultiva a partir de agua de consumo humano de las
poblaciones, entonces será un mecanismo de transmisión de la enfermedad
gástrica”.
4. Materiales y métodos
4.1 Materiales
Medios de cultivo y reactivos.
-
Caldo tripticase y soya (CTS).
-
Suplemento Selectivo Dent ®: antibióticos Vancomicina, Trimetoprin,
Cefsulodina y Anfotericina B.
-
Campygen® Dispositivo para lograr atmósfera microaerofílica (6% de
oxígeno y 10% de dióxido de carbono).
-
Agar Columbia con sangre de caballo al 5% Lake Horse® de OXOID.
-
Tiras de oxidasa OXOID® y reactivo de Urea OXOID®
La extracción del ADN de las cepas se realizó con el Kit Comercial para
Purificación de ADN Genómico Wizard® de Promega.
Para cada protocolo de PCR se realizó la evaluación preliminar del mismo y de la
pareja de oligonucleótidos empleada, tanto estos como todos los reactivos fueron
adquiridos en la empresa Biocientífica y se detallan en la metodología.
4.2 Metodología
4.2.1 Estandarización de la técnica de cultivo con cepas de referencia.
Para la adecuada estandarización de la técnica se adquirieron cepas de
referencia de la colección ATCC (American Type Culture Collection) de Estados
Unidos, y se llevaron a cabo las siguientes actividades:
a- Inoculación de las cepas en CTS, en agua destilada estéril, y en medios
específicos selectivos para utilizarlos en la determinación posterior.
b- Filtración por membrana en filtros de nitrocelulosa 0,45µm y determinación
de las colonias de interés, agregándole al agar TTC (cloruro de trifenil
tetrazolium), con el fin de evidenciarlas pues son incoloras y los filtros son
blancos.
c- Cultivo de los filtros en CTS
d- Valoración del comportamiento de las cepas por microscopia de luz y por
microscopia de contraste de fases.
4.2.2
Análisis de las muestras por cultivo microbiológico
a. Para el cultivo de las muestras se utilizó como base el protocolo de
Lu y colaboradores de la Universidad de Texas (Lu et al, 2002), el
cual se muestra en anexos.
b. Como una modificación importante se usó la
necesidad de adherencia de la bacteria a
induciéndola a la formación de biofilmes, pero
pegarse a filtros de nitrocelulosa en medio líquido,
estrategia de la
una superficie,
en este caso a
esta modificación
se realizó pues el protocolo de Lu parte de agua residual municipal y
en este caso es agua de muy baja carga bacteriana.
c. Inicialmente se trabajó con anticuerpos inmunomagnéticos (la
metodología se describe en el anexo 2), tal y como lo hizo Lu, sin
embargo rápidamente se determinó que la estrategia de adhesión al
filtro es mucho más eficiente, barata y rápida, por lo tanto sólo se
probó la técnica con las primeras muestras.
d. Se recolectó una muestra de 500 mL de nacientes o de pozos,
clorada o sin clorar. Si la muestra está clorada se le realizó la
determinación de cloro residual por medio de un comparador de
cloro marca HATCH.
e. Las muestras se procesaron tan pronto llegaron al laboratorio de
microbiología del Centro de Investigación y de Servicios Químicos y
Microbiológicos-CEQIATEC, se concentraron por filtración, en filtros
de nitrocelulosa de 0,45 µm, y con bomba de vacío.
f.
Luego los filtros que se utilizaron como medio de sostén, se retiraron
con pinzas y se introducieron en tubos de ensayo de 20 x 150 mm,
que contenían 20 mL de CTS con el Suplemento Selectivo Dent.
g. Se incubó a 35 °C con atmósfera microaerofílica en jarra con
Campygen® .
h. A las 48 horas el caldo se rayó en agar Columbia con 5% de sangre
de caballo y se volvió a cultivar en atmósfera microaerofílica en jarra.
i.
Luego de 48 horas se observó el crecimiento de las colonias, y se
buscó las similares a Helicobacter, las cuales corresponden a
colonias muy pequeñas, incoloras.
j.
A las colonias seleccionadas se les realizó tinción de Gram con
fucsina fenicada, prueba de oxidasa y prueba de ureasa.
k. A las muestras del primer y segundo muestreo se les determinó
coliformes totales y fecales por técnica de Número más Probable
(NMP), según la metodología 9221 del Standard Methods Ed 21.
4.2.3 Análisis para la identificación y caracterización de las cepas por PCR
Muestreos. La investigación se llevó a cabo mediante 3 muestreos.
Para las muestras del primer muestreo se evaluaron protocolos de PCR, para la
identificación en las cepas mediante la determinación de los marcadores de: el
gen de la ureasa C (ureC o glmM fosfoglucosamin mutasa), la fracción ARNr 16S.
Además se aplicó a una muestra el protocolo para la evaluación de las variantes
alélicas de la región vacA y la presencia del gen cag A.
En las muestras del segundo muestreo se analizó el marcador glmM y se le realizó
una determinación de coliformes totales y fecales a las muestras de agua.
En las muestras correspondientes al tercer muestreo se utilizaron los marcadores
glmM, y el marcador de “Proteína Inductora de Factor de Necrosis Tumoral- α
(Tipalpha TNF- α). Se escogieron dos muestras positivas que se enviaron para
secuenciación a Macrogen Corporation de Marylan, Estados Unidos.
4.2.3.1 Protocolos específicos
Extracción de ADN
La extracción del ADN de las muestras se hizo mediante el Kit Comercial para la
Purificación de ADN Genómico Wizard® de Promega. Este método está basado
en un proceso de cuatro pasos: lisis celular, digestión con ARNasa, precipitación
salina de las proteínas celulares y finalmente la concentración y precipitación del
ADN genómico mediante la adición de isopropanol (Millar et al, 1988; Promega
Corporation, 2005).
La extracción de ADN se realizó según instrucciones recomendadas de la casa
fabricante para bacterias Gram negativas, la cual se describe a continuación:
En cámara de flujo laminar, las colonias bacterianas o el cultivo en caldo se resuspende en 100 μl de solución rehidratante de ADN en tubos eppendorf de 1.5
mL:
1. Las suspensiones bacterianas en buffer TE 1X o solución rehidratante de ADN
se centrifugan a 13200 rpm para obtener un “pellet” de células. Se remueve el
sobrenadante y se deja el “pellet” en el tubo eppendorf.
2. Se adicionan 600 μl de la Solución de Lisis Nuclear. Se pipetea levemente
hasta que las células sean resuspendidas. Se agita en vortex para completar la
re-suspensión.
3. Se incuba a 80° C en baño maría por 5 minutos para lisar las células; luego se
enfrió a temperatura ambiente.
4. Se adiciona 3 μL de la solución de ARNasa al lisado celular. Se invirtieron los
tubos 2-5 veces para mezclar.
5. Se incuba a 37° C en baño maría durante 60 minutos. Las muestras son
enfriadas a temperatura ambiente.
6. Se adiciona 200 μL de la solución de precipitación de proteínas a cada lisado
tratado con ARNasa. Se mezcla en vortex vigorosamente a máxima velocidad
durante 20 segundos para mezclar la solución de precipitación con el lisado
celular.
7. Se incuban las muestras en hielo por 5 minutos.
8. Se centrifugaron a 13200 rpm por 3 minutos.
9. Se transfiere el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo limpio de 1.5 mL
por muestra, cada tubo contiene 600 μL de isopropanol a temperatura
ambiente.
10. Se mezcla ligeramente por inversión cada tubo hasta observar “hebras” del
ADN; se sigue mezclando hasta que se forme una masa visible.
11. Las muestras se centrifugan a 13200 rpm por 2 minutos.
12. Con cuidado se remueve completamente el sobrenadante, dejando el “pellet”
de ADN. Se adicionan 600 μL de etanol 70 % (temperatura ambiente) y
ligeramente se invierten los tubos varias veces para lavar el “pellet” de ADN.
13. Se centrifuga a 13200 rpm por 2 minutos. Se remueve completamente el
etanol.
14. Se deja secar el sedimento (pellet) de ADN de cada muestra en cámara de
flujo laminar durante 15 minutos.
15. El sedimento de ADN se resuspende en 100 μL de la solución de
rehidratación de ADN (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) y luego se incuban las
muestras a 65° C durante 1 hora en baño maría, mezclando las muestras por
inversión de los tubos en forma periódica.
16. Finalmente las muestras de ADN se conservan a -15 °C.
Valoración del ADN extraído
El ADN obtenido se visualizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%
(p/v), en buffer de corrida TAE 1X (40 mM Tris–acetato, pH 8.0 y 1 mM EDTA) a
100 V durante 40 min, con GeneRulerTM 1kb DNA ladder Fermentas®, como
marcador de peso molecular. El gel fue teñido con bromuro de etidio 0.5 mg/mL
Sigma® y fotografiado para evaluar la concentración y pureza del ADN
genómico.
Para cada protocolo de PCR se efectuó la evaluación preliminar del mismo y de la
pareja de oligonucleótidos empleada, para luego utilizarlo en la evaluación de las
muestras.
Protocolos de PCR para los marcadores empleados.
En el primer muestreo se emplearon siete parejas de oligonucleótidos para la
detección y caracterización de cepas de H. pylori de las muestras. En los cuadros
3 y 4 se detalla la información para cada pareja de iniciadores.
Cuadro 3. Secuencias nucleotídicas y tamaños de amplificación esperados para la
detección de H. pylori
Región a
amplificar
Tamaño del
producto de
PCR (pb)
ARNr 16S
992- 1500
glmM
cagA
Secuencias de los iniciadores
5’ – 3’
Referencia
GGCGTTATCAACAGAATGGC
CTCAGTTCGGATTGTAGGCTGC
Shahamat et
al (2004)
294
AAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGTTT
AAGCTTACTTTCTAACACTAACGC
Lage et al
(1995)
128
ATAATGCTAAATTAGACAACTTGAGCGA
AGAAACAAAAGCAATACGATCATTC
Tomasini et al
(2003)
Cuadro 4. Secuencias y tamaños de amplificación esperados para los
imprimadores utilizados para las regiones de vacA (Lu, 2002).
IMPRIMADOR
SECUENCIA
TAMAÑO
ESPERADO (pb)
190
vacA s1a
GTCAGCATCACACCGCAAC
CTGCTGGAATGCGCCAAAC
vacA s1b
AGCGCCATACCGCAAGAG
CTGCTGGAATGCGCCAAAC
187
vacA m1
GGTCAAAATGCGGTCATGG
CCATTGGTACCTGTAGAAAC
290
vacA m2
GGAGCCCCAGGAAACATTG
CATAACTAGCGCCTTGCAC
352
Para evaluar el glmM se utilizó el método descrito por Lage et al (1995), también
empleado por Lu et al (1999) y Smith et al (2004), con las siguientes
modificaciones: para un volumen de reacción de 25 μl, se adicionaron los
siguientes componentes: Buffer para PCR (1x); MgCl2 (1.5 mM); dNTPs (0.2 mM);
oligonucleótidos (0.4 μM, cada uno); y Taq polimerasa (0.05 U/μl). Se emplearon 5
μl de muestra de ADN. En el cuadro 5 se describe el perfil térmico empleado para
la amplificación de la región glmM de H. pylori.
Cuadro 5. Perfil térmico para PCR de región glmM de H. pylori
Programa
Pasos
1
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
Extensión final
Almacenamiento
2(1)
2(2)
2(3)
3
4
Temperatura
(°C)
94
Tiempo
Ciclos
5 min
1
94
55
72
72
4
1 min
1 min
1 min
5 min
Lo necesario
35
1
1
Para la evaluación de cagA se usó el método descrito por Tomasini et al (2003)
con las siguientes modificaciones: para un volumen de reacción de 25 μl, se
adicionaron los siguientes componentes: Buffer para PCR (1x); MgCl2 (2.5 mM);
dNTPs (0.2 mM); oligonucleótidos (0.5 μM, cada uno); y Taq polimerasa (0.03
U/μl). Se empleó 1 μl de muestra de ADN. En el cuadro 6 se describe el perfil
térmico aplicado.
Cuadro 6. Perfil térmico para PCR de región cagA de H. pylori
Programa
Pasos
1
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
Extensión final
Almacenamiento
2(1)
2(2)
2(3)
3
4
Temperatura
(°C)
95
Tiempo
Ciclos
3 min
1
95
48
72
72
4
1 min
45 s
45 s
5 min
Lo necesario
35
1
1
Para la detección de cada una de las variantes alélicas de la región vacA, se
utilizó el método de Lu et al (2002) con las siguientes modificaciones: En un
volumen de 25 μl se adicionaron los siguientes componentes: Buffer para PCR
(1x); MgCl2 (1.5 mM); dNTPs (0.2 mM); oligonucleótidos (0.5 μM, cada uno); y Taq
polimerasa (0.03 U/μl). Se empleó 1 μL de muestra de ADN.
En el cuadro 7 se describe el perfil térmico empleado para la amplificación de cada
una de las variantes alélicas de vacA para H. pylori. La amplificación de cada
variante alélica se diferencia solamente en la temperatura de apareamiento,
siendo 55 °C para s1a, s1b y s2, 50 °C para m1 y 47 °C para m2.
Cuadro 7. Perfil térmico para PCR de polimorfismos vacA en H. pylori.
Programa
Pasos
1
2(1)
2(2)
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización
Alineamiento
2(3)
3
4
Extensión
Extensión final
Almacenamiento
Temperatura
(°C)
94
Tiempo
Ciclos
2 min
1
94
45 s
45 s
35
1 min
7 min
Lo necesario
1
1
55 (s1a, s1b y s2)
50 (m1)
47 (m2)
72
72
4
Para la evaluación de los oligonucleótidos y de las condiciones de reacción, se
aplicó el método descrito por Shahamat et al (2004) con las siguientes
modificaciones: para un volumen de reacción de 25 μl, se adicionaron los
siguientes componentes: Buffer para PCR (1x); MgCl2 (2.5 mM); dNTPs (0.2 mM);
oligonucleótidos (0.4 μM, cada uno); y Taq polimerasa (0.04 U/μl). Se empleó 1 μL
de muestra de ADN.
En el cuadro 8 se describe el perfil térmico empleado para la amplificación de la
región ARNr 16S, específica de H. pylori.
Cuadro 8 Perfil térmico para PCR de región ARNr 16S específica para H. pylori
Programa
Pasos
1
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
Extensión final
Almacenamiento
2(1)
2(2)
2(3)
3
4
Temperatura
(°C)
95
Tiempo
Ciclos
2 minutos
1
95
60
72
72
4
30 s
30 s
1 minuto
5 minutos
Lo necesario
30
1
1
Para el tercer muestreo se eligieron dos marcadores: el glmM de identificación y
el marcador de la Proteína inductora de factor de necrosis tumoral alfa (Tipalpha
TNF-α) como marcador de patogenicidad de las cepas identificadas como H pylori.
En el cuadro 9 se presenta la secuencia y el tamaño del producto de amplificación
esperado para el imprimador utilizado como marcador TNF- α.
Cuadro 9. Diseño de primers para el marcador de
Gen
Primers
Proteina
inductora de
factor de
necrosis
tumoral
(Tipalpha)
TNF- α
Producto
PCR
sFd 5’CACGCAAGGGGTGGATAGC 3’
273pb
sFr- 5’ CGCACYAACGCAAACACTTC 3’
Para la evaluación de los oligonucleótidos se llevaron a cabo las siguientes
condiciones de reacción que se estandarizaron.
1- glmM (reamplificado) se utilizaron 28 µL de PCR Master Mix (2X)
(Fermentas) que contiene 0,05 u/µl Taq ADN polimerasa, buffer de
reacción, 4 mM MgCl2, 0,4 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Además, 2.5 µl de cada cebador (40 ng/µl), 1 µl de Taq Polimerasa (Dream
Taq TM DNA Polymerase, Fermentas 5u/µL) y 5 µl del ADN extraído por
reacción de 50 μl finales.
2- FNT- α: para un volumen de reacción de 50 μl finales, se adicionaron los
siguientes componentes: Buffer para PCR Master Mix (2X) (Fermentas) (28
μL); oligonucleótidos 40 ng/µL (8 μL cada uno) y Taq polimerasa (1μl). Se
emplearon 5 μL de muestra de ADN.
En el cuadro 10 se describe el perfil térmico que se usó para la amplificación de
las regiones glmM y el FNT-α específico de H. pylori.
Cuadro 10. Perfil térmico para PCR de las regiones glmM (reamplificado) y FNT-α de H.
pylori
Programa
Pasos
1
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización
Alineamiento
glmM
FNT-α
Extensión
Extensión final
Almacenamiento
2(1)
2(2)
2(3)
3
4
Temperatura
(°C)
94
Tiempo
Ciclos
2 min
1
94
45 s
56
60
72
72
4
30 s
20 s
1 min
7 min
Lo necesario
40
40
1
1
4.2.4 Caracterización de las muestras por secuenciación molecular
Se eligió la empresa Macrogen Corporation de Rockville, Maryland Estados Unidos.
Las muestras se enviaron tal y como lo establece la corporación: para productos
de PCR, no menos de 50 ng/µL, no degradadas, un solo producto. Para la
limpieza del producto de PCR se empleó el kit de limpieza por columna “PCR
clean-up Gel extracion NucleoSpin® Extract II” de la casa comercial MachereyNagel.
4.2.5 Elección de los sitios y toma de las muestras
Para la búsqueda de la bacteria en abastecimientos de agua de la población se
esperaba que por su estrecha relación con cáncer gástrico sean los cantones de
alta incidencia los elegidos como sitios de mayor probabilidad de éxito en el
hallazgo.
Se llevó a cabo un primer muestreo en los años 2006-2007 que correspondió a las
nacientes que utiliza la Municipalidad del Cantón Central de Cartago y la
Municipalidad de Santa María de Dota.
Basándose en la apreciación del entorno geofísico y de manejo del agua de los
lugares se decidió entonces estructurar la investigación completamente y se
preparó el segundo muestreo.
El segundo muestreo se llevó a cabo en los años 2007-2008, basado en la
información estadística del Registro Nacional de Tumores donde aparece la
incidencia de cáncer gástrico en cantones por quintiles, cuya información
corresponde a la figura 22.
Se escogieron 10 cantones de alta y baja incidencia correspondientes a los
quintiles 1 y 5 según las estadísticas del Registro Nacional de Tumores, bajo los
colores amarillo y celeste presentados en el cuadro 11. La información en este
cuadro es presentada en orden descendente de acuerdo con las tasas de
incidencia.
Cuadro 11. Cantones elegidos en los quintiles 1 y 5 de alta y baja
incidencia de cáncer gástrico para el muestreo.
Fuente: Unidad de Estadística Registro Nacional de Tumores 1990-1999.
Este segundo muestreo se efectuó, con los siguientes objetivos específicos:
•
•
•
Determinar la presencia de H. pylori en las muestras.
Investigar con los encargados el manejo del agua que consume la
población, para determinar cómo puede incidir en ambos lugares el Ente
Operador encargado del Acueducto.
Recolectar información sobre la naturaleza del agua que se utiliza, fuentes
de abastecimiento, características ambientales de los diferentes lugares,
información de cloración y cantidad de cloro residual.
•
Parámetros de coliformes totales y fecales de las muestras para su
posterior comparación.
El muestreo se ejecutó de la siguiente manera:
1. Se realizó puntual y se escogieron cantones aledaños, por el alto costo y
por la facilidad para realizar muestreos por medio de giras. Estas giras se
pactan con el Ente Operador Oficial de cada Acueducto: AyA y/o
municipalidades, según correspondía.
2. Se recolectaron en cada cantón de alta incidencia 3 muestras, las cuales
podían ser de: naciente, tanque de almacenamiento o de usuario clorada y
sin clorar. En los lugares de baja incidencia se recolectó 1 muestra debido a
que se conocía previamente que son operados por AyA en su mayoría, y
por ende se esperaba que todas las muestras estuvieran cloradas y con
alta cantidad de cloro residual en sus redes de distribución.
3. Se recolectó medio litro de agua para filtración y concentración de muestra
para cultivo y 100 mL de muestra para análisis de coliformes.
4. Se recogió la información necesaria para establecer la incidencia del punto
del muestreo sobre el consumo de agua de la población:
a. Ente operador del acueducto
b. Tipos de agua que consume el cantón (superficial, pozos, nacientes)
y estado general
c. Población abastecida por tipo de agua
d. Cloración ( si tienen o no), tipo, cantidad de cloro residual y el tiempo
que tienen las fuentes de estarse clorando.
El tercer muestreo se llevó a cabo en el año 2009 y se trabajó con los siguientes
objetivos específicos:

Determinar la presencia de H. pylori en las muestras a partir de cultivos
líquidos y posterior identificación molecular con el marcador glmM y a las
cepas positivas el marcador de patogenicidad del gen TNF-α.

Disminuir el impacto que AyA tenga específicamente como Ente Operador
en los acueductos de las zonas de baja incidencia, así como los Entes
Operadores de Municipalidades que cloran sus acueductos en las zonas de
alta incidencia. Para esto se escogen nuevos sitios de muestreo, en lo
posible de fuentes no cloradas, pero utilizadas directamente por la
población.

Recolectar 3 muestras por cantón de ambas zonas.

Secuenciar al menos 2 productos de PCR reconocidos como positivos para
H. pylori.
El muestreo se hizo de la siguiente manera:
1- Se visitó nuevamente a los 20 cantones marco de la investigación.
2- El muestreo se realizó puntual, medio litro de agua para filtración.
3- Se tomaron 3 muestras por cantón, que podían ser de pozo, naciente o red.
De las muestras positivas para ambos marcadores se escogieron 2 cepas y el
control positivo la cepa J99 de H. pylori y se enviaron a secuenciación molecular.
5. Resultados
5.1 Estandarización de la técnica de cultivo con cepas de referencia.
Se procedió a la estandarización de la técnica de cultivo y la recuperación de la
bacteria en la matriz agua, para esto se trabajó con las cepas Hp 51932 y Hp
700392 adquiridas de la colección American Type Culture Collection (ATCC) de
Estados Unidos.
También se contó con ADN de la cepa de H. pylori 12455 de la National
Collection of Type Cultures NCTC y la cepa J99 (Occhialini, 2000), las que
sirvieron como controles en los ensayos de biología molecular.
De acuerdo a los ensayos en las cepas de colección ATCC de H pylori se
determinó que el crecimiento se va haciendo evidente en cultivo bifásico de agar
Columbia inclinado con 5% de sangre prácticamente a las 24 horas, de abajo del
inclinado hacia arriba, siendo esta la mejor forma de cultivar Helicobacter pylori.
Con respecto a su crecimiento en placa de Petri, el cultivo se hace evidente a las
48 horas, siempre y cuando se trabaje con condiciones controladas de cultivo e
insumos, esto es: agua destilada controlada, temperatura y humedad de la
incubadora bajo control, tiempo y mantenimiento de las condiciones de
almacenamiento de los medios de cultivo preparados (el agar sangre sólo se debe
utilizar fresco).
Se observó preliminarmente la deficiencia casi total de crecimiento de cepas
ATCC de H pylori en medios líquidos por inoculación directa, solamente se pudo
evidenciar su presencia utilizando medios líquidos con filtro como sostén. Este
hallazgo explica entonces la imposibilidad que se ha reportado de recuperar la
bacteria por cultivo de agua directamente sobre el medio (Oliver, 2005; Adams,
2003), según se puede observar en la figura 31.
A
B
C
Figura 31. A: Comparación de crecimiento con y sin filtro, ambos medios están
inoculados con H. pylori. B: Crecimiento del microorganismo en cultivo de filtro.
C: Comparación de crecimiento con respecto al control.
Bajo la figura 32 se presenta una tinción de Gram de una de las cepas cultivadas,
la flecha señala una bacteria con flagelos.
Fuente: Laboratorio CEQIATEC.
Figura 32 Fotografía por microscopia de luz de cepa
ATCC de H pylori con tinción de Gram, con fucsina
fenicada.
Luego por microscopia de contraste de fases se pudo determinar que sí crece en
el caldo, pero no se puede apreciar ese crecimiento pues no se observa turbidez
en el medio de cultivo, la bacteria se desarrolla bajo formas intermedias hacia
cocoides.
Luego de su recuperación en caldo y su rayado en el medio de cultivo, las colonias
son muy pequeñas, la figura 33 las presenta bajo un aumento de 10X, la figura 34
presenta una fotografía con un rayado de cultivo en Agar Columbia de 48 horas
con sangre de caballo al 5%.
Fuente: Laboratorio CEQIATEC.
Figura 33. Vista de las colonias de H pylori en 10X.
Fuente: Laboratorio CEQIATEC.
Figura 34. Colonias de H. pylori en agar Columbia.
En cuanto al análisis de cepas tipo, por técnicas de microscopia de contraste de
fases, la actividad se llevó a cabo en el Laboratorio del Dr. Francisco Torrella en la
pasantía efectuada en la Facultad de Microbiología y Genética de la Universidad
de Murcia, España.
En este laboratorio se trabajo en microscopia de contraste de fases y de campo,
claro con lentes de alta resolución de cepas de la Universidad de Barcelona,
cultivadas bajo las mismas técnicas que las cepas de Costa Rica.
Con el seguimiento de los cultivos de H pylori por microscopia de contraste de
fases se pudo obtener información de la viabilidad de la bacteria con el tiempo.
Los cultivos de 5 días en placa de petri se pueden considerar “viejos”, con una
gran cantidad (alrededor de 90%) de formas cocoides (o formas involucionadas),
según se muestra en la figura 35 (la flecha señala una forma cocoide viable). Esto
es importante por cuanto diversas publicaciones toman este tiempo como óptimo
para el desarrollo de H. pylori, para congelar y preservar cepas o para pruebas
moleculares, evidencian este hallazgo un problema posterior para su manejo
adecuado. Estas formas cocoides involucionadas no se diferencian con
microscopia de luz.
Figura 35 Microscopia en contraste de fases de
formas cocoides de H. pylori de cultivo en placa
.
También se determinó que la mejor forma de cultivar H. pylori o sea la obtención
de cultivos estables para su adecuada manipulación, es bajo cultivo bifásico, el
crecimiento es óptimo en la interfase inclinada del agar donde se acumula el agua
de condensación. En la figura 36 se aprecian formas bacilares con dos diferentes
técnicas de microcopía y con diferente tinción.
Figura 36 Cultivo en agar inclinado de 3 días, agregado de células inmóviles
dispuestas en cuerda. A la izquierda y al centro microscopia de contraste
de fases, a la derecha tinción de Gram en microscopia de luz.
La disposición en cuerda es característica de algunos tipos de bacterias tal y
como se le puede observar a Helicobacter. La colocación de las bacterias tal y
como se aprecia en la figura 37 es como si se dirigieran en un mismo sentido, esta
misma disposición se ha apreciado también en tinciones de biopsias de pacientes
con infecciones activas.
Figura 37 Bacterias de cultivo bifásico inclinado por micros-
copia de contraste de fases. Obsérvese la disposición de
las bacterias, con esta técnica se puede apreciar movilidad.
Uno de los hallazgos en el trabajo de estandarización con cepas de H. pylori fue la
disposición que presentaba cuando se trabajó para preparaciones de microscopia
electrónica, y es la fuerte adherencia al medio cuando se fija con formalina; (a
criterio del experto de mayor cohesión comparado con otras bacterias),
probablemente esta disposición obedece a su tendencia de agruparse bajo
biofilmes tal y como se puede apreciar en la figura 38, las bacterias se observan
pegadas densamente a la superficie del inclinado, el material tuvo que ser
raspado.
Figura 38 Cultivo de agar inclinado fijado con formaldehído
por 24 horas para microscopia electrónica.
5.2 Análisis de las muestras por cultivo y PCR.
Las muestras para cultivo microbiológico fueron procesadas en el Laboratorio de
Microbiología del Centro de Investigación y de Servicios Químicos y
Microbiológicos- CEQIATEC.
Los análisis para la identificación molecular del microorganismo se realizaron en:
-Laboratorio de Biología Molecular del Centro de Investigación en Biotecnología
CIB del ITCR, primero, segundo y tercer muestreo.
- Laboratorio de Bacteriología Médica de la Facultad de Microbiología de la UCR
segundo y ensayos preliminares del tercer muestreo.
En las muestras del primer muestreo se evaluaron protocolos de PCR, para la
identificación en las cepas para el gen glmM, el gen que codifica a la fracción
ARNr 16S, y la presencia del gen cagA. Además se aplicó a la primera muestra
positiva el protocolo para la evaluación de las variantes alélicas de la región vacA
de H. pylori. Además se procesaron conteos de coliformes totales y fecales a las
muestras de agua.
Para las muestras del segundo muestreo se analizó el marcador glmM y se
realizaron pruebas de coliformes totales y fecales.
A las muestras correspondientes al tercer muestreo se les determinó la presencia
del gen glmM y a las muestras positivas se les determinó el marcador de la
Proteína inductora del factor de necrosis tumoral alfa (Tipalpha FNT-α). Dos
muestras positivas y el control se enviaron para secuenciación a la empresa
Macrogen de Maryland, Estados Unidos.
5.2.1 Primer muestreo. Análisis de las zonas de alta incidencia.
En el primer muestreo se obtienen resultados de 12 muestras de los cantones
Central de Cartago y Santa María de Dota de San José. De estas muestras, 9
pertenecen a nacientes y 1 pozo del Cantón Central y del Cantón de Dota 2
muestras pertenecen a nacientes y 1 tanque. Estas muestras fueron tomadas de
fuentes oficiales de agua manejadas por la Municipalidades respectivas.
Para efectos de resultados se presenta a partir de la muestra # 10 en el cuadro
12; además a cada muestra se le practicó una determinación de coliformes totales
y fecales por técnica de Número Más Probable (NMP), para determinar su
potabilidad de acuerdo con los parámetros reglamentarios nacionales.
Luego del cultivo se hicieron determinaciones de PCR para los marcadores glmM,
16S ARNr, y a la muestra # 20 la determinación de la región vacA, para valorar la
presencia de las variantes alélicas s1a, s1b, m1 y m2 y la presencia del gen cagA.
A continuación se muestra bajo las figuras 39 y 40 la fotografía de la
electroforesis efectuada a productos de visualización de PCR para el marcador
glmM, para las muestras: #17, #18, # 19, #20, #21 y #22. En la figura 41 el
marcador para el gen 16S ARNr para las muestras #10, #11, #15, #16, #19, #20,
#21 y #22, las muestras 12, 14, 17 y 18 están negativas no aparecen en la figura,
la muestra 13 no se procesó. El cuadro 12 presenta el resumen con los resultados
de los marcadores y los análisis de coliformes totales y fecales.
Figura 39 Visualización de productos de PCR para glmM
(294 pb). muestras #17 a #22. M: Marcador Fast Ruler Low Range
1: H. pylori ATCC 700392; 2: H. pylori ATCC 51932; 3: E. coli,
4: #17; 5: #18; 6: #19; 7: #21; 8: #22; 9: Control: agua
Figura 40. Visualización de productos de PCR para glmM para
muestra #20. M: Marcador Fast Ruler Low Range; 1: cepa 12455
2: cepa J99; 3:H. pylori ATCC 51932; 4: H. pylori ATCC 700392;
5: #20; 6: Blanco.
Figura 41 Visualización de productos de PCR para 16S ARNr
(992-1500 pb). M: Marcador Fast Ruler Low Range; 1: Blanco
2: cepa J99 (control); 3: H. pylori ATCC 700392; 4: H. pylori
ATCC 51932; 5: #10; 6: #11; 7; #15; 8: #16; 9: H. pylori ATCC
51932; 10: #19; 11: #20, 12: #21; 13: Blanco.
Como se puede notar en la figura 42 de la muestra #20, se visualizan dos geles
que muestran productos de PCR para el gen cagA, se observa que para las cepas
de colección se presentan productos de tamaño aproximado al esperado, mientras
que para esta muestra aislada del agua, el tamaño del producto obtenido es
mayor al esperado.
Figura 42. Visualización de productos de PCR para cagA (128pb). A la izquierda: (M)
Marcador Fast Ruler Low Range; (1) H. pylori 12455; (2) H. pylori, J99; (3) H. pylori ATCC
700392; (4) H. pylori ATCC 51932; (5) Muestra 20; (6) E. coli; (7) S. typhi; (8) Blanco. A la
derecha M: Marcador Fast Ruler Low Range; 1 y 2: H. pylori ATCC 700392; 3: cepa J99;
4: cepa 12455; 5-7: #20; 8: Control (Agua).
En la figura 43, se presenta la muestra # 20 que indica la amplificación esperada
para vacA s1a (190 pb), no obstante hubo productos inespecíficos de más de 400
pb, los cuales no influyeron en el rendimiento del producto esperado, esto se
consideró así pues esta muestra proviene de cultivo en caldo con probable
presencia de ADN de otras cepas. Para esta muestra no se determina la presencia
de vacA s1b, vacA m1, ni vacA m2.
1
3
2
4
Figura 43: Productos de PCR para vac A. Imagen1: vac A s1a (190 pb), los controles de H. pylori
con s1a se encuentran en las posiciones 1 y 3, en 4 la muestra # 20. Imagen 2: Productos de PCR
para vac A s1b (187 pb), en 1 y 2 controles con H. pylori en 5 la muestra # 20. Imagen 3: Productos
de PCR para vac A m1 (290 pb), en 1: cepa J99, en 4: muestra # 20; 5: Control (Agua). Imagen 4:
Productos de PCR para vac A m2 (352 pb), los controles se encuentran en las posiciones 1 y 3, en
5 la muestra # 20. Controles de H. pylori: ATCC 700392 y H. pylori ATCC 51932
A continuación se presenta el cuadro 12 como resumen, con los resultados de las
muestras correspondientes al primer muestreo.
Resultados de PCR 16S ARNr y glmM, Coliformes totales (CT) y Coliformes
fecales (CF) para las muestras evaluadas de Cartago y San José en el primer muestreo.
# de
Muestras
PCR
PCR
CT/CF
muestra
16S ARNr
glmM
(NMP/100 mL)
Cantón Central
de Cartago
10
Naciente Río
negativo
N.R.
neg / neg
Loro
11
Naciente
Producto de tamaño
N.R.
4,5/neg
Ladrillera
mayor al esperado*
12
Naciente
negativo
N.R.
neg / neg
Banderilla
13
Naciente Padre
N.R
N.R
N.R
Méndez
14
Naciente Río
negativo
N.R.
11/neg
Claro
15
Naciente La
negativo
N.R.
23/neg
Misión
16
Naciente La
negativo
N.R.
1,8/neg
Ortiga
17
Naciente Paso
negativo
positivo
13/neg
Ancho
18
Naciente San
negativo
positivo
23/neg
Blas
19
Pozo del TEC
positivo
positivo
neg/neg
Cuadro 12
20
21
22
Cantón Santa
María de Dota
Naciente El
Cedro
Naciente La
Viejita
Tanque El
Centro
positivo
positivo
900 / neg
positivo
positivo
22 / neg
positivo
positivo
N.R
* Tamaño esperado entre 992-1500pb; Negativo = neg; N.M.P: Número más probable; N.R: no se
proceso.
Según estos resultados las muestras 19 a 22 tienen los tamaños esperados del
marcador de identificación 16S ARNr para H. pylori, además estas muestras son
glmM positivas.
Las muestras 17 y 18 presentan también el marcador glmM positivo, pero el 16S
ARNr negativo; Shahamat (Shahamat, 2004) manifiesta que esta relación de
marcadores se puede establecer como Helicobacter sp o como H. pylori “atípica”,
(panmítica) no obstante se puede establecer como un problema de diseño del
primer ARNr 16S que no reconoce estas cepas.
Ninguna muestra con resultados positivos por H. pylori presenta coliformes
fecales, parámetro de potabilidad aceptado internacionalmente y expresado en
nuestro Reglamento de Calidad de agua para determinar que una muestra de
agua es de calidad potable.
Luego de obtener estos resultados se estableció la necesidad de ampliar la
búsqueda de la bacteria y relacionar su hallazgo con agua de consumo humano
en lugares que poseen alta y baja incidencia de cáncer gástrico, con el objetivo de
determinar el tipo de agua que la población realmente está consumiendo, o sea
muestrear agua con cloro residual, si así es expendida por el Ente Operador
oficial del cantón.
Así mismo se determinó la necesidad de visualizar las colonias presentes en los
cultivos en medios líquidos, por cuanto se decide ampliar el muestreo a 10
cantones de alta incidencia y a 10 cantones de baja incidencia, según la
información que se mostró en el cuadro 11.
5.2.2 Segundo muestreo. Análisis de las zonas de alta incidencia.
A continuación se indican los resultados del segundo proceso de las muestras
correspondientes a los cantones de alta incidencia de cáncer gástrico de Cartago
y San José.
Para la búsqueda de cepas que correlacionen con H. pylori, a las muestras se les
practicó filtración por membrana al agua de la fuente, cultivo del filtro en medio
líquido y rayado posterior en placa, selección y diferenciación bioquímica de
colonias, además de la determinación de coliformes totales y fecales como
parámetro de calidad sanitaria en estas muestras. Estos resultados aparecen bajo
el cuadro 13.
Cuadro 13. Descripción de las muestras por lugar de procedencia (cantón), análisis de las
colonias y diferenciación por pruebas bioquímicas.
Código
Origen de la
muestra
01-07
Cepa biopsia KS
02-07
03-07
Pozo TEC
Pozo TEC luego de
botar agua por dos
horas
Cantón de
Oreamuno
Naciente Carlos
Gómez,
Naciente Mario
Ivancovich, Toño
Meneses
De un hidrante de la
calle, convergen 6
nacientes
Tejar del Guarco
Naciente Tablón
Tanque Palo Blanco
Toma de Hacienda
Vieja,
captación las Cabras.
Cantón de Paraíso
Naciente. La Capira
04-07
05-07
06-07
07-07
08-07
09-07
10-07
11-07
12-07
13-07
14-07
15-07
16-07
17-07
18-07
Naciente El Bosque
Naciente Boquerón
Cantón de León
Cortes
Naciente Zetillal
Tanque de captación:
naciente Zetillal y
Gemelo Gamboa
Naciente Gemelo
Gamboa # 2
Cantón de Tarrazú
Naciente San
Guillermo
Tanque San
Guillermo
Naciente El Rodeo
Morfología
/oxidasa
/ureasa
Pasa a
PCR
Bp / + / +
√
Bg / + / nr
C / - /
dudosa
√
√
Colonia pequeña diminuta y en gran
cantidad
Colonia pequeña diminuta
Bpd / + / nr
√
Bpd / + / nr
√
Solo colonias grandes
B g / - / nr
√
Colonias pequeñas blancas
Colonia pequeña
Se aísla Bacillus sp
Bp / + / +
Bp / + / N.R
√
√
--
Clorada 0,4 ppm Sin crecimiento
positivo en el caldo solo hasta las 48
horas. Se aíslan solo unas 20
colonias puntiformes.
Clorada Sin crecimiento
Se aíslan colonias pequeñas
Bp / + / -
√
N.R
Bp / + / -
---
Se aislam colonias puntiformes
Cloro residual 0.2 p.p.m
+++ de crec. Colonias puntiformes
pero muy pocas
En caldo crec ++ a las 48 horas
En agar colonias pequeñas
Bp / + / Bp / + / +
leve
√
√
Bp / + / +
leve
√
Bp / + / +
√
N. R
---
Bp / +débil /+
√
Apariencia de la colonia elegida
Colonias pequeñas puntiformes
típicas, con el tiempo presenta
hemólisis α con precipitado negro.
Colonias mediana
Colonias rosadas
Caldo + a las 24 horas
En caldo crec ++ a las 48 horas
Colonias pequeñas.
Cloro residual 0.3 ppm
En caldo ± a las 48 horas
Sin crecimiento en el agar
En caldo crec + a las 48 horas
√
Código
19-07
Origen de la
muestra
Cantón de Santa
María de Dota:
Naciente El Copey
20-07
Tanque Rubén (3
nacientes)
21-07
Tanque el Centro
22-07
25-07
Biopsia paciente
WM
Cantón Central
Cartago
Planta de
Tratamiento, agua
cruda
Planta de
Tratamiento, agua
clorada
Cantón de Alvarado
Tanque Santa Teresa
26-07
Naciente El Callejón
27-07
Naciente José Castro
Cantón de Aserrí:
Casa Sr José
Sandoval
Naciente Juan Carlos
#2
23-07
24-07
28-07
29-07
30-07
31-07
32-07
Tanque Ojo de Agua
Cantón de Acosta:
Planta de tratamiento
El Cedral de AyA
Agua cruda para
potabilizar ( agua de
río)
Morfología
/oxidasa
/ureasa
Pasa a
PCR
Bp / - / +
√
Bp / + / +
√
Bp / + / -
√
N.R
---
Crecimiento de colonias, no típicas
N.R
---
Cloro residual: 1.1 ppm
Sin crecimiento.
N.R
---
Bp / - / -
---
Bp / - / -
---
N.R
---
Bp / + / +
√
Bp / + / +
√
Bp / + / +
√
N.R
---
Bp / + / +
---
Apariencia de la colonia elegida
En caldo crec + +a las 48 horas
Colonias pequeñas
Cloro residual 0.3 ppm
En caldo crec + 48 horas. Colonias
puntiformes
Cloro residual 0.3 ppm
Colonias puntiformes.
No crecimiento
Colonias puntiformes.Caldo +/2 a 48
horas
Caldo +/2 a 48 horas
Colonias pequeñas y blancas
Caldo a 48 horas negativo
Caldo ++ a 24 horas
Se ven colonias puntiformes
Caldo ++ a 24 horas
Se ven colonias puntiformes típicas
mezcladas
Caldo + a 24 horas. Colonias
puntiformes
Cloro residual 0.6 ppm. Caldo a 48 h
negativo
Caldo a 24 h +++
Se aíslan colonias puntiformes luego
de varios pasajes
* No se indica resultado de tinción de Gram (+ o -) pues la bacteria se tiñe con fucsina fenicada, solo se indica
la forma. N.R, nr: No realizado.
Bpd = Bacilos pequeños delgados; Bg = bacilos grandes; Bp= bacilos pequeños; CB coco bacilos;
C= cocos
Como se aprecia en el cuadro 13, se realizó una comparación detallada de la
morfología colonial compatible con género Helicobacter correlacionándola con
pruebas bioquímicas específicas como procedimiento presuntivo de elección.
Se logra determinar con el trabajo continuo con las cepas, que estas colonias que
se aíslan, su primera apariencia es como colonias puntiformes incoloras, con el
tiempo de trabajo y al segundo pasaje, se supone con la exposición al aire, estas
aumentan un poco de tamaño se vuelven grises; esto también fue advertido por
Lu y colaboradores en su trabajo ( Lu, 2002). A continuación se muestra una foto
de estas colonias, bajo la figura 44.
Figura 44. Colonias sospechosas de H. pylori de muestra
de agua.
Bajo el cuadro 14 se presentan los resultados de identificación molecular de las
muestras de este segundo muestreo de la zona de alta incidencia, para el
marcador glmM, así mismo se ofrecen los resultados de coliformes totales y
fecales.
Cuadro 14. Resultados de los análisis del marcador glmM con respecto a coliformes
totales (CT) y coliformes fecales (CF) correspondientes al segundo muestreo.
Código de
muestra
01-07
02-07
03-07
04-07
05-07
06-07
07-07
08-07
10-07
12-07
13-07
14-07
15-07
16-07
18-07
19-07
20-07
21-07
28-07
29-07
30-07
Marcador
CT/CF
glmM
(NMP/ 100 mL)
+
+
NR
+
+
+
N.R
+
+
+
+
NR
+
+
+
+
NR
23 / neg
1,8 / neg
50 / neg
23 / 23
13 / 3,6
23 / neg
900 / 50
neg / neg
N.R
50 /neg
neg / neg
13 / neg
70/ neg
1,8 / neg
3,6 / neg
NR
1,8 / neg
23 / neg
1,8 /neg
11 / neg
N.R No se proceso.
En la figura 45 se presenta la fotografía que muestra el gel correspondiente a la
reacción de PCR de las muestras del cuadro 15 para la región glmM.
Figura 45 Visualización de productos de PCR para glmM (294 pb). M: Marcador Fast
Ruler Low Range; 1: H. pylori ATCC 700392; 2: H. pylori ATCC 51932; 3: E. coli; 4:
01, 5:02, 6:03, 7:04, 8:06, 9:07, 10:08, 11:10, 12:12, 13:14,14:15, 15:16, 16:18, 17:19
18:21, 19:28, 20:29, 21:30, 22: Control (Agua).
5.2.3 Segundo muestreo. Análisis de las zonas de baja incidencia.
A continuación se presentan los resultados del muestreo realizado en los cantones
de baja incidencia correspondientes a las provincias de Guanacaste y Alajuela de
acuerdo con los lugares establecidos en el cuadro 11. Según la información
recolectada previamente se sabía que la mayoría de estas aguas eran
administradas por AyA, por lo tanto fue con los personeros del Laboratorio
Nacional de Agua que se llevó a cabo este muestreo. Con la información
recopilada en el muestreo se confecciona el cuadro 15.
Cuadro 15 Información recolectada y cultivo de las muestras de agua de los cantones de
baja incidencia dispensada por Ente Operador.
Cantón
Tilarán
La Cruz
Los Chiles
Nicoya
Carrillo
Santa Cruz
Liberia
San Mateo
Nandayure
Abangares
Tipo de muestra
Cloro
residual
(mg/L)
Turbiedad
Cultivo
Oficina de AyA
Planta de tratamiento AyA
Planta de tratamiento AyA
Planta de tratamiento AyA
Planta de tratamiento
Planta de tratamiento AyA
Planta de tratamiento AyA
Planta de tratamiento AyA
El acueducto lo maneja la
Municipalidad. Agua es de
la Oficina de la Municipalidad
El acueducto lo maneja la
Municipalidad (antes de AyA) La
muestra se tomo del agua cruda
de la planta de tratamiento (río)
0,76
0,57
0,5
1,06
1,9
1,3
0,98
0,97
negativo
N.D
N.D
NP
1,85
1,01
0,47
N.D
N.D
NP
neg**
positivo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Crec. Positivo (++), pero
no se aísla colonias
semejantes a Hp
Crec. positivo, pero no
se aísla colonias
semejantes a Hp por la
alta carga acompañante
** En el momento del muestreo no se estaba clorando el agua, pero manifiestan que sí se clora.
NP Se manifiesta no tener problemas de turbiedad. N.D no detectado.
De acuerdo con los resultados mostrados en el cuadro 15 se observa que el 90%
de estos cantones son manejados por AyA desde los años de 1960 y principio de
los años 1970, esto implica que el cloro residual que se maneja en estos lugares
es muy alto. Según estimaciones teóricas la probabilidad de encontrar bacterias
viables en aguas que usualmente manejan un cloro residual alto es de
aproximadamente 5% (Montero, 2004).
En casi todos los cantones de las zonas de baja incidencia se manejan calidades
similares de agua para la población. No se realizan análisis de coliformes totales y
fecales por cuanto los cultivos de bacterias aparecen negativos.
Como resultado de este segundo muestreo se encontró entonces un manejo
característico y diferenciado del agua entre las zonas de alta y baja incidencia de
cáncer gástrico.
Como parte de la información recolectada en los acueductos de los lugares de
alta y baja incidencia de cáncer gástrico con los Entes Operadores se muestra la
información comparativa bajo el cuadro 16.
Cuadro 16. Cuadro comparativo de las zonas de alta y baja incidencia de cáncer gástrico
(C.G) sobre la naturaleza del agua y el Ente Operador del acueducto.
Característica
Cantones con alta incidencia de
Cantones con baja incidencia de
C.G
C.G
Oferta hídrica
ALTA
BAJA
Ente operador
(como fuente oficial)
Municipalidades
90%
AyA (muchos años)
90%
Naturaleza del agua
100% de nacientes
2 lugares con agua de quebrada
80% de los lugares con pozos.
30% superficial tratada
10% nacientes
Temperatura
ambiental
(como zonas frias o
cálidas em C.R)
Baja (~ 16 °C – 22 °C)
Alta (~ 25 °C – 35 °C)
5.2.4 Tercer muestreo. Análisis de zonas de alta y baja incidencia de cáncer
gástrico.
En el año 2009 se hizó un tercer muestreo con el objetivo de poder dilucidar la
diferencia del efecto “Ente Operador AyA”, en las zonas de baja incidencia; y en
las zonas de alta incidencia sobre la calidad del agua que directamente consume
la población.
En el caso del Cantón Central de Cartago el efecto de cloraciones reconocidas de
alta eficiencia se obvió, muestreando las nacientes sin clorar. En este tercer
muestreo se tomó agua sin tratar (naciente) y agua de consumo de las
poblaciones.
Se procesaron muestras provenientes de cultivos líquidos. Para identificar la
bacteria se utilizó el marcador glmM y a las muestras positivas se les practicó una
identificación de patogenicidad con el marcador de la Proteína Inductora del Factor
de Necrosis Tumoral α (FNT- α), para luego enviar a secuenciar los productos de
PCR del marcador glmM de dos muestras.
A la técnica de cultivo se le practica una variante y es la de incubar el filtro de las
muestras en el medio de cultivo a 25 ºC, dado que se menciona ya en la literatura
la preferencia de las cepas de H. pylori en ambientes fríos. A continuación se
presentan los cuadros 17 y 18 con la información de las muestras recolectadas.
Cuadro 17. Resultado de los cultivos de las zonas de alta incidencia
Nombre
Cloro residual
Resultado crec.
(48h a 25 °C)
Cantón Central Cartago
01-09
Naciente Rio Loro
------+++
02-09
Naciente Lankaster
------+++
03-09
Naciente Paso Ancho
------+++
Aserrí
04-09
Naciente Río Jorco
-----+++
05-09
Tanque Intermedio de Rio
√
Negativo
Jorco
06-09
Casa Familia Sandoval M
√
Negativo
Paraíso
07-09
Naciente Luis Guzmán
------+
08-09
Naciente El Guayabal
------+++
09-09
Naciente El Bosque
------+++
Santa María de Dota
10-09
Naciente El Cedro
------+++
11-09
Casa Sr Julio Calvo
(clorada) sin c.r
+++
12-09
Naciente El Higueronal
------+++
San Pablo de León Cortes
13-09
Naciente Fulvio Gamboa
------+++
14-09
Naciente Evangelino Mora
------+++
15-09
Naciente El Zetillal
------+++
Tarrazú
16-09
Naciente El vapor
------+++
17-09
Tanque El vapor 1era casa
(clorada) sin c.r
+++
18-09
Naciente El Guillermo
------+++
Muestras de tierra
19-09
Dota (negra)
------+++
20-09
León Cortes (amarilla)
------+++
21-09
Tarrazú (roja)
------+++
Tejar, El Guarco. Barrio
Corazón de Jesús
22-09
Fam Loaiza Leiva
------+++
23-09
Fam Robles Loaiza
------+++
24-09
Fam Hernández Loaiza
------+++
Alvarado. Cervantes
25-09
Fam Araya Umaña
------+++
26-09
Fam Umaña Araya
------+++
27-09
Fam Leitón Araya
------+++
Oreamuno
28-09
Fam Mata Loaiza
√
Negativo
29-09
Super Irazú
√
negativo
30-09
Fam Rivera Gómez
-----+++
Fuente: Datos Laboratorio CEQIATEC
Pasa a PCR
√
√
-------√
------------√
---√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
-------------------√
Cuadro 18. Resultado de los cultivos de las zonas de baja incidencia
Nombre
Cloro residual
Resultado crec en
tubo
(48h a 25 °C)
Nicoya
31-09
Casa frente al parque
------32-09
Casa entrada a Nicoya
------33-09
Casa 200 mts sur del parque
------Santa Cruz
34-09
Casa frente al parque
35-09
Casa carretera principal
------36-09
Casa fam Cubillo M. Matapalo
------Los Chiles
37-09
Pozo Hotel Caño Negro *
------+++
38-09
Pozo Asada Super Caño Negro*
------+++
39-09
Pozo Asada Cabinas Oasis*
------+++
La Cruz
40-09
Pozo # 3 AyA
------+/41-09
Pozo # 4 AyA
-----+/42-09
Pozo # 2 AyA
------Liberia
43-09
Pozo Capulín AyA
------++ (película)
44-09
Pozo Hotel Los Boyeros
------++
45-09
Pozo Moracia # 3 AyA
------Tilarán
46-09
Casa Sr John Jemilguey
------+ (película)
47-09
Vivero del ICE Tronadora
+/- (película)
48-09
Finca Sr Ramírez Tronadora
------++
Nandayure
49-09
Casa Fam Monge. Centro
------+
50-09
Soda Frente al Parque
------+++
51-09
Cabinas “Mas allá del Puente”
------+
San Mateo
52-09
Restaurante Cactus
------+/53-09
Restaurante Rancho Orotina
------+++
54-09
Finca fam Solís A Centro
------Carrillo
55-09
Salón El Jordán. Río Cañas
------+/56-09
Fam Belén, Palestina
------++
57-09
Fam Belén Centro
------+
Abangares
58-09
Barrio La Gloria Salida P de Trat
(clorada) sin c.r
59-09
Restaurante El Fogón
(clorada) sin c.r
60-09
Cruz Roja
(clorada) sin c.r
Fuente: Datos Laboratorio CEQIATEC
*Aislamientos que presentan colonias típicas
Pasa a
PCR
------------------------------------------√ (38)
√
√ (38)
----------------------------√
---------------------√
-------√
--------------√
-------√
√
-----------------------------
Luego del cultivo de las muestras y la determinación del marcador molecular glmM
no se obtienen bandas del tamaño esperado, por lo que se solicita criterio al Ing.
en Biotecnología y Bioinformático Alejandro Hernández y se optó por la
reamplificación de los productos porque podría haber una cantidad muy baja de
ADN específico de H. pylori, pese a determinar previamente que había una buena
cantidad de ADN en todas las muestras procesadas en laboratorio.
Una vez reamplificados los productos del marcador glmM se presenta los
resultados bajo la figura 46 correspondientes a las muestras expuestas en los
cuadros 17 y 18.
:Visualización de productos reamplificados de PCR para glmM (294 pb).
Imagen 1: M: Marcador Fast Ruler Low Range; 1: Control +, solo la muestra 25 se
encuentra positiva. Imagen 2: Muestras positivas: 01, 04, 18, 19, 24 y 38. Imagen 3:
Muestras positivas: 02, 10, 12. Imagen 4: Ninguna muestra positiva.
Figura 46
En la figura 47 se ofrece el producto de amplificación del gen de la Proteína
Inductora del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (Tiphalfa, FNT-α) de las muestras
positivas con el marcador glmM.
Figura 47. Visualización de productos de PCR para FNT-α (273 pb) en las
muestras positivas con el marcador glmM.
En el cuadro 19 aparece el resumen de los resultados de los marcadores glmM y
FNT-α (Tiphalfa) para el tercer muestreo.
Cuadro 19. Resultados del análisis de los marcadores glmM y FNT-α por muestra para el
tercer muestreo.
Muestra Tamaño del producto de PCR
reamplificado (294 pb).
1
Producto del tamaño esperado
2
Producto del tamaño esperado
4
Producto del tamaño esperado
7
Negativo
9
Negativo
10
Producto del tamaño esperado
11
Negativo
12
Producto del tamaño esperado
13
Negativo
14
Negativo
15
Negativo
16
Producto del tamaño esperado
17
Negativo
18
Producto del tamaño esperado
19
Productos de mayor tamaño al
esperado de 350 pb, y 450 pb.
20
Negativo
21
Negativo
22
Negativo
23
Negativo
24
Una banda de mayor tamaño
al esperado (325 pb) y una de
menor tamaño al esperado
(200 pb)
25
Producto del tamaño esperado
26
Negativo
30
Negativo
38
Un producto del tamaño
esperado y otro producto de
mayor tamaño al esperado
(400 pb).
44
Negativo
48
Negativo
50
Negativo
53
Negativo
55
Negativo
56
Negativo
N.R no se realizó
Presencia del
FNT-α (Tiphalfa)
N.R
Origen de la muestra
+ (muy leve)
-
Naciente no se usa directo
Naciente no se usa directo
Naciente no se usa directo
------------Naciente de uso directo
-------Naciente de uso directo
------------------Naciente de uso directo
------Naciente de uso directo
Suelo
+
------------------------Casa de familia
+
+
+
+
-
+
-
Casa de familia
------------Pozo después de fuerte
lluvia
-------------------------------------
Con respecto a la secuenciación, se procedió a escoger dos productos de
amplificación para el gen glmM correspondientes a los códigos de muestra 25 y 12,
y junto con el control positivo la cepa J99 de Helicobacter pylori.
Macrogen reporta que el control enviado de la cepa J99 tiene como secuencia
nucleotídica un 100% de homología con el gen glmM reconocido de la cepa de H.
pylori J99.
El aislamiento marcado como muestra 25 se reporta como secuencia nucleotídica
con un 98% de homología con la cepa J99, además se determina un 97% de
homología con el gen ureC de la cepa H. pylori 224A UreC y una homología de
97% con el gen ureC de la cepa H. pylori 170A UreC.
El aislamiento marcado como muestra 12 se reporta como secuencia nucleotídica
de 97% de homología con respecto a la cepa J99, y al estudiar las cepas
reportadas se determina un 96% de homología con la cepa H. pylori PP01A1 y un
95% de homología con la cepa H. pylori PP03A1. Lo anterior confirma que las
cepas fueron verdaderos aislamientos de H. pylori.
En el anexo 5 se indican para ambas muestras las secuencias que se tomaron en
cuenta para el análisis, así como datos de origen de las mismas.
A continuación se explica en un dendograma el parentesco filogenético de las
cepas secuenciadas en un árbol de máxima parsimonia 35/209 sitios
parsimoniosos (construcción a partir de sitios informativos). Los números expresan
porcentajes y el tamaño de las rayas señala las distancias o diferencias en el
ADN. En todos los árboles el grupo se mantiene conservado, lo que refleja que el
subgrupo es verdadero y no producto del azar. Se seleccionaron todas las cepas
reportadas bajo el gen glmM. Se tomaron en cuenta secuencias de 208 pares de
bases del gen, esto se aprecia en la figura 48.
s2
50 25
100
J99
Cepas en Estudio
12
50 214AUreC
161AUreC
100
PP23A1
51
PP3A1
182AUreC
100
PP01A1
100
Sub Grupo
224AUreC
146A
Helicobacter pylori
029AUreC
50 170AUreC
51
168AUreC
100
146AUreC
216AUreC
98 215AUreC
156AUreC
GENOME.HPAG1
50
Cepas Shi
51
pp44a1
100 H.acinonychis.Lion-Tiger
H.acinonychis.Tiger
H.acinonychis.Lion
100
Helicobacter acinonychis
H.acinonychis.Mac.Lion
100
H.acinonychis.Sheeba
10
8
6
4
2
0
Figura 48. Árbol de máxima parsimonia con el parentesco filogenético de las cepas
secuenciadas en estudio (rojo), según gen glmM.
En el cuadro 20 se enseña un resumen final del porcentaje de positividad de las
muestras de agua por zonas de estudio para los 3 muestreos de la investigación.
Cuadro 20 Resumen de los resultados por muestreo en las zonas de
alta y baja incidencia.
Muestras de agua
por muestreo
ero
1
(12)
2do (40)
3ero (60)
Total 112
muestras
% Total positividad
Lugares de alta
incidencia
Lugares de baja
incidencia
+/total
+/total
6/12
12/30
10/30
29/72
N.R
0/10
3/30
3/40
39
7,5
N.R: no realizado.
Del análisis de los resultados de las muestras
hallazgos:
se lograron los siguientes
-
En el primer muestreo (2006-2007), se analizaron 9 muestras de agua de
nacientes pertenecientes al cantón Central de Cartago y 2 al cantón de
Dota en San José, de estas nacientes 2 de Cartago se encontraron
positivas y las 2 de Santa María de Dota, con el marcador de identificación
glmM. En el caso de las nacientes de Dota estas se dispensaban como tal
(sin tratamiento) directamente a la población y se juntaban en un tanque
que también se encontró positivo.
-
Para el segundo muestreo (2007-2008), se pudo determinar que de las 24
muestras correspondientes a tanques y nacientes de las zonas de alta
incidencia se hallaron en 12 de ellas cepas positivas con el marcador
glmM, que concuerdan con el tamaño esperado, según las cepas de
referencia de Helicobacter pylori utilizadas como control positivo en agua
manejada por las municipalidades, o sea de uso oficial.
-
De los aislamientos mostrados en la zona de alta incidencia, se encontró
que en 8 muestras de agua que contenían cloro residual se aisló e identificó
molecularmente la bacteria en 2 de ellas que contenían respectivamente
0,3 mg/L y 0,4 mg/L; en otras dos muestras, aunque se aislaron colonias
similares
con
características
bioquímicas
similares
también
correspondientes a H pylori, no se pudo corroborar molecularmente.
-
Con respecto a las zonas de baja incidencia se determina según lo indicado
en el cuadro 15 que el 80% de las muestras contienen cloro residual en alta
cantidad, pertenecientes a los acueductos de AyA. El otro acueducto
clorado el de Abangares, también fue un acueducto de AyA al cual se le
da tratamiento regular. En el otro cantón Nandayure, en este análisis
puntual, no se aislaron colonias semejantes a H. pylori.
-
En el tercer muestreo realizado en el año 2009, se tomaron 27 muestras de
agua cruda y 3 muestras de suelo de la zona de alta incidencia, y de la
zona de baja incidencia se tomaron 27 muestras de agua cruda y 3
muestras de agua tratada sin cloro residual del acueducto de Abangares.
De éstas, se obtienen 11 muestras positivas de la zona de alta incidencia y
3 de la zona de baja incidencia, alcanzando porcentajes similares en la
zona de alta incidencia a los logrados en el segundo muestreo.
-
Para este muestreo también se indaga un nuevo marcador, el gen de la
Proteína Inductora del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (Tiphalfa, FNT-α), el
cual se encontró en el 63% de las cepas glmM positivas. Este se considera
un hallazgo muy importante por cuanto es un marcador de patogenicidad
que apenas se empieza a conocer y nunca ha sido probado en cepas
ambientales.
Una vez finalizado el segundo muestreo se advierten las diferencias entre
ambas zonas de alta y baja incidencia y se decide recolectar información
ambiental geofísica y de manejo del agua que pueda marcar diferencias
significativas, con el fin de relacionar el hallazgo de la bacteria con la incidencia de
cáncer gástrico para las zonas marco de estudio de nuestro país, y proponer
posibles relaciones entre la presencia de H. pylori y la patología específica de
cáncer gástrico, con el fin de abordar el tercer objetivo de este trabajo con
respecto a la valoración del manejo del agua potable en Costa Rica .
A continuación se presenta
la situación encontrada en cada acueducto
muestreado, con respecto al manejo de su recurso hídrico.
5.3 Situación de los acueductos marco de la investigación
Acueductos en las zonas de alta incidencia:
Cantón Oreamuno:




Sólo se maneja agua municipal.
No hay áreas protegidas.
Cuentan con 7 ASADAS que no se sabe si las cloran o no.
Al momento del muestreo (2008) se manifiesta que cloran solo los días
lunes, actualmente el sistema de cloración ha mejorado.
Cantón Tejar del Guarco:



Sólo se maneja agua municipal. De 15% a 20% de las tuberías son de
hierro fundido que es con plomo, no tienen asbesto.
Una vez, hace mucho tiempo, cloraron, pero no se volvió a realizar.
Tienen 8 pozos y 8 nacientes que incluyen 6 nacientes pequeñas que se
reúnen en un solo tanque. Tienen 3 captaciones que son realmente
quebradas, así tal y como se capta le llega el agua al usuario, realmente de
color café.
Cantón Paraíso:



La principal fuente de abastecimiento de agua es de origen municipal, sólo
una pequeña porción del agua dispensada proviene de AyA del proyecto
Orosí.
Las 3 muestras que se tomaron para la investigación son las que abastecen
todo el centro de Paraíso. Las 3 nacientes se encuentran en zonas
protegidas. Las 3 nacientes están cloradas, pero solo en una de ellas se
tomó el cloro residual.
La cloración de la red de agua para la población ha ido mejorando en los
últimos años, aproximadamente desde hace unos 4 años.
Cantón Alvarado:




Administrada por la municipalidad. Tienen 24 nacientes, no cloran al
momento del estudio. Hace 10 años cloraban, pero el clorador se
descompuso.
Tienen 10 tanques de almacenamiento.
No tienen ASADAS.
Es una zona agrícola, llega hasta el volcán Irazú a 2400 mts
Cantón León Cortés.



Hay varias ASADAS y 2 acueductos administrados por vecinos.
La municipalidad tiene 3 nacientes, no tiene pozo, ni quebradas para el
abastecimiento de agua.
Se toma muestra de un tanque de captación donde llegan las nacientes de
Zetillal y Gemelo Gamboa #1; el cloro residual es de 0,2 ppm ( muy bajo).
Cantón Tarrazú:






Poseen BANDERA AZUL.
No tienen quebradas ni pozos, se cuenta con 3 ASADAS.
Disponen de 6 nacientes y tienen 2 nacientes que en este momento están
cloradas.
Una fuente de agua la deben tratar con piedra caliza pues es sumamente
ácida a pH 4.5, ya tratada neutralizada.
Implementaron el cloro hace 10 y 15 años, no obstante el tanque San
Guillermo tiene un cloro residual de 0,3 ppm.
Las nacientes están en áreas protegidas y comprenden alrededor de 3
hectáreas.
Cantón Santa María de Dota:




Al momento del tercer muestreo tienen 11 tanques todos clorados, 3
nacientes, 1 quebrada. No hay pozos, y ponen 3 pastillas por tanque.
Al tanque Rubén llegan 3 nacientes con 0,3 ppm
El tanque El Centro presenta 0,3 ppm de cloro residual y es el que tiene
precipitación negra
La municipalidad se visitó en el primer muestreo en el 2006, y en ese
momento se comentó que nunca se había clorado el agua. A partir de este
primer muestreo ellos empiezan a clorar el agua.
Cantón Aserrí:




Manejan solo en Vuelta de Jorco un acueducto rural, es una ASADA muy
grande, hay 2 fontaneros además tienen sus medidores.
Tienen 7 nacientes que van a un quiebragradiente y de allí a un tanque
Se tomaron muestras de la naciente, el tanque y una casa.
Nunca han clorado el agua, luego de la primera visita empiezan a clorar el
agua.
Cantón Acosta:


Planta de tratamiento manejada por AyA, El Cidral sale con cloro residual
de 0,6 mg/L.
El agua cruda proviene del río y se trata con gas cloro.

No tienen claro desde cuando inicia AyA en esta zona, pero se puede
observar que la planta de tratamiento es bastante nueva.
Cartago Cantón Central
•
•
•
Poseen 11 nacientes todas cloradas, algunas de ellas con cloro gas
(generalmente no se trabaja con menos de 0,5 mg/L). Aproximadamente un
tercio de la población recibe agua del sistema Orosí-Cachí,
Con cloración permanente y eficiente desde aproximadamente 12 años por
empresa externa.
Es el único cantón que le hace al agua análisis físico-químicos completos.
Situación de los acueductos en las zonas de baja incidencia
Cantón de Los Chiles:






AyA existe en la zona desde 1961, ellos abastecen el casco central, o sea
solo el distrito primero, pero este cubre el 50% de la población del cantón.
El segundo y tercer distrito El Amparo y Caño Negro tienen sello de calidad,
el cuarto distrito San Jorge no.
Dejan el cloro residual en 0,5 ppm, no se mide la turbiedad.
Utilizan agua de pozos entre 48 y 50 mts y no tienen problemas de color, no
hace falta filtrarla. Se menciona que las aguas de pozo no se filtran porque
nunca se enturbian, aunque llueva.
La gente abre sus propios pozos y hay muchos.
En la parte de la perforación de los pozos los suelos son oscuros, pero
camino al lugar se pueden ver muchas zonas de suelos arcillosos.
Cantón Santa Cruz:



Trabaja sólo con agua de pozo, utilizan 4 pozos, con un residual promedio
de 1,3 ppm y una turbiedad de 0,47 ntu.
El AyA cubre aproximadamente el 50% de la población.
Tienen 54 ASADAS.
Cantón Carrillo




Sistema se abastece con 2 pozos
Hay 21 ASADAS
AyA abastece al 40% de la población del cantón
Cloro residual del sistema 1.93 ppm

Turbiedad aproximada de 1,01 ntu.
Cantón Nicoya




AyA trabaja con agua superficial tratada y con pozos, el agua cruda es
captada en el río Potrero, población a la que asiste AyA aproximadamente
el 35%.
Existen en el cantón 75 ASADAS
Con un cloro residual de 1,06 ppm.
Una turbiedad de 1.85 ntu
Cantón Tilarán








El acueducto lo inauguró AyA en 1958, lo tomó unos años después.
Manifiestan no presentar problemas de turbiedad, sólo si hay mucha lluvia.
Tiene 8 nacientes y 1 pozo, divididos en 4 sistemas, que manejan el agua
del 66% de la población del cantón.
El resto de los servicios los manejan las ASADAS que son 27, algunas de
ellas dispensan agua clorada.
El centro se clora con cloro gas, las otras con hipoclorito de calcio.
Tiene sello de calidad sanitaria “Bandera Blanca”.
Se considera un acueducto de excelente calidad
Se tomó una muestra en la red con un cloro residual en 0,76 ppm.
Cantón La Cruz






AyA entró a La Cruz en los años 70.
Se abastecen de 4 pozos que se cloran
No tienen problemas de turbiedad.
3 años consecutivos de sello de calidad “Bandera Blanca”.
Aproximadamente llegan al 80% de la población del cantón, el otro 20% lo
constituyen 12 ASADAS.
Cloro residual 0,57 ppm
Cantón Liberia




Manejan aproximadamente 11 pozos.
Tienen ASADAS, pero no saben cuántas.
Llegan aproximadamente al 40 % de la población del cantón
Cloro residual 0,98 ppm.
Cantón Nandayure

La administra la Municipalidad.


Nunca han tenido agua de AyA, pero les hacen los análisis y se les
manifiesta que sus nacientes son excelentes, la captación está muy cerca
de la zona de recarga, no tienen problemas con químicos, con olores o con
turbiedad.
En sólo una ocasión la cloraron, pero esto le disgustó a la población
Cantón Abangares
•
•
•
•
Este lo tiene la municipalidad desde hace 10 años. Anteriormente lo tenía
AyA.
Se abastece del río Abangares con HTH y cloro gas, en el momento del
primer muestreo no se le estaba dando tratamiento, el agua pasaba directo
del río. En el segundo muestreo la población manifiesta que el agua sabe
demasiado a cloro (probablemente porque no se le da tratamiento completo
al agua del río).
No se sabe cuántas ASADAS tienen y cuántas se cloran.El sistema puede
llegarle a un 35% de la población.
Tienen tratamiento completo con filtros lentos. En las visitas no quedó claro
si el sistema si está trabajando o no.
Cantón San Mateo




Tratan una quebrada en el invierno y en el verano un río El Machuca
Han tenido el sistema por 17 años.
Llegan al 75% de la población
Muestra con cloro residual 0,97 ppm
En los cuadros 21 y 22 se muestra información recolectada sobre la naturaleza del
agua que manejan los Entes Operadores de los acueductos de las zonas de alta
y baja incidencia de las zonas de estudio.
Cuadro 21. Naturaleza del agua por Ente Operador para cantones de
baja incidencia de cáncer gástrico.
1
Información suministrada por cada Ente Operador Oficial sea el Instituto Nacional de Acueductos
y Alcantarillados, o la Municipalidad. En ninguno de los casos el Ente Operador abastece a menos
del 50% de la población del cantón.
Cuadro 22. Naturaleza del agua por Ente Operador para cantones de
alta incidencia de cáncer gástrico.
1
Información proporcionada por cada Municipalidad. y la Municipalidad de Acosta
En los cuadros 23 y 24 se presenta la información recolectada para comparar
estadísticamente ambas zonas, según las variables: altura, temperatura media
anual y precipitación, con el fin de establecer correlaciones con respecto a las
tasas de incidencia y determinar cuáles variables pueden estar realmente
relacionadas.
Cuadro 23. Temperatura, altura y precipitación media anual para
cantones de alta incidencia de cáncer gástrico, Costa Rica
Fuente: 1 Ministerio de Salud, Unidad Estadística, Registro Nacional de Tumores.
Instituto Geográfico Nacional, altura correspondiente al distrito primero del cantón.
3
Instituto Meteorológico Nacional. * Medida directamente de las estaciones meteorológicas a 2008.
ND: no se dispone de datos
2
Cuadro 24. Temperatura y altura para cantones de baja incidencia
de cáncer gástrico, Costa Rica.
Fuente: 1 Ministerio de Salud, Unidad Estadística, Registro Nacional de Tumores.
Instituto Geográfico Nacional, altura correspondiente al distrito primero del cantón.
3
Instituto Meteorológico Nacional. * Medida directamente de las estaciones meteorológicas a 2008
ND: no se dispone de datos
2
En la figura 49 al graficar la información con altura y tasa de incidencia para
cáncer gástrico se observa una marcada diferencia, que corresponde a un
coeficiente de correlación entre ambas variables de 0,86.
Figura 49 Correlación entre altura y tasa de incidencia de cáncer
gástrico para los cantones marco de estudio.
La correlación entre altura y tasa se realizó con el objetivo específico de
establecer correlaciones estadísticas de acuerdo con lo observado en las zonas
entre tasas de alta y baja incidencia de cáncer gástrico con factores geofísicos
ambientales, relacionados con la sobrevivencia en el ambiente y adquisición de
Helicobacter pylori en el agua de consumo por la población.
Luego se comparó la incidencia de cáncer gástrico de los cantones marco del
estudio con altitud, temperatura ambiental, tipo de suelo, naturaleza del agua
utilizada y Ente operador del acueducto. Se analizaron todas las variables
estadísticamente utilizando el software SPSS.
Cuadro 25 Correlaciones estadísticas entre las variables ambientales
Incidencia1
Pearson Correlation
Incidencia1
Altura
1
.867
Sig. (2-tailed)
N
Altura
.867
Sig. (2-tailed)
.000
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Nacientes
**
Pearson Correlation
N
Temperatura
20
20
**
**
**
**
.002
20
20
20
1
-.980
-.980
**
.000
20
20
.774
**
**
.000
20
20
1
-.773
**
.000
20
**
.774
.000
-.773
20
**
Pearson Correlation
.651
Sig. (2-tailed)
.002
.000
.000
20
20
20
N
.651
.000
.000
**
-.853
Nacientes
.000
20
-.853
Temperatura
1
20
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).
Se hicieron regresiones lineales de incidencia con altura y temperatura, si se
incluyen de forma conjunta se producen problemas de multicolinearidad debido a
que ambas están correlacionadas muy fuertemente y aportan la misma
información con respecto a incidencia. Si se consideran por separado ambas
tienen coeficientes de regresión significativos de acuerdo con lo expuesto en el
cuadro 26, se nota que las incidencias no son aleatorias.
Cuadro 26 Análisis de Regresión lineal entre incidencia y altura e incidencia y
temperatura.
Model Summary
Change Statistics
Adjusted R
Model
R
R Square
1
.867
a
Std. Error of
Square
.752
Sig. F
the Estimate R Square Change
.738
8.32488
F Change
.752
df1
df2
54.507
1
Change
18
.000
a. Predictors: (Constant), Altura
b
ANOVA
Model
1
Sum of Squares
df
Mean Square
Regression
3777.537
1
3777.537
Residual
1247.466
18
69.304
Total
5025.003
19
F
54.507
Sig.
.000
a
a. Predictors: (Constant), Altura. b. Dependent Variable: incidencia1
Coefficients
a
Standardized
Unstandardized Coefficients
Model
1
(Constant)
B
Std. Error
12.736
2.950
.021
.003
Altura
a. Dependent Variable: incidencia1
Coefficients
Beta
Collinearity Statistics
t
.867
Sig.
Tolerance
4.318
.000
7.383
.000
1.000
VIF
1.000
Model Summary
Change Statistics
Adjusted R
Model
R
R Square
1
.853
a
Square
.728
Std. Error of
Sig. F
the Estimate R Square Change
.713
8.71674
F Change
.728
df1
48.134
df2
1
Change
18
.000
a. Predictors: (Constant), Temperatura
b
ANOVA
Model
1
Sum of Squares
df
Mean Square
Regression
3657.334
1
3657.334
Residual
1367.669
18
75.982
Total
5025.003
19
F
Sig.
48.134
.000
a
a. Predictors: (Constant), Temperatura. b. Dependent Variable: incidencia1
Coefficients
a
Standardized
Unstandardized Coefficients
Model
1 (Constant)
Temperatura
B
Std. Error
92.242
9.233
-2.743
.395
Coefficients
Beta
Collinearity Statistics
t
-.853
Sig.
9.991
.000
-6.938
.000
Tolerance
1.000
VIF
1.000
a. Dependent Variable: incidencia1
Analizando ambas variables se tiene que arrojan prácticamente la misma
información. Se decide tomar en cuenta sólo la regresión entre incidencia y
temperatura como variable predictiva. En términos generales para el análisis de
los datos de regresión se debe de tener cuidado por cuanto el problema es
realmente multifactorial y no tanto de causa efecto cuando se maneja una sola
variable.
Se realizó una prueba exacta de Fisher con el fin de conocer si las dos variables
cualitativas de incidencia y Ente Operador del Acueducto están relacionadas, esto
se aprecia en el cuadro 27.
Cuadro 27 Prueba exacta de Fisher para independencia
entre nivel de incidencia de cáncer gástrico y Ente Operador.
Alto
Bajo
Todo
AyA
1
8
9
Municipalidad
9
2
11
Todo
10
10
20
Prueba exacta de Fisher: Valor P = 0.0054775
Filas: incidencia, columnas: Ente operador,
contenido de la celda: conteo
Del análisis anterior se determinó que existen correlaciones importantes y
significativas, según:
Coeficiente de Correlación de Pearson entre:
- Incidencia de cáncer gástrico y altitud: 0,867
- Incidencia de cáncer gástrico y temperatura ambiental: - 0,853
- Incidencia de cáncer gástrico y origen del agua como naciente: 0,651.
- Coeficiente de Regresión Lineal entre incidencia y temperatura: R2 = 0,728.
En la prueba exacta de Fisher al evaluar la independencia entre nivel de
incidencia (baja y alta) con Ente Operador del Acueducto al 2005, se encontró
evidencia para rechazar la hipótesis nula de independencia entre las 2 variables,
con un valor de p < 0,05, se concluye que existe relación entre las variables y
que esta relación no se debe al azar con un 95% de confianza, es decir, se infiere
que existe relación entre quién opera el acueducto y la incidencia de cáncer
gástrico para las 2 zonas de estudio en Costa Rica, y que el Ente Operador puede
ser entonces una variable muy importante en el problema.
Todos estos son factores que se pueden relacionar con sobreviviencia de H. pylori
en el ambiente.
Una vez analizadas las variables anteriores surgió entonces la pregunta: ¿ cómo
se comportanen el marco de las zonas de estudio las tasas de incidencia de
cáncer gástrico actuales y si éste realmente está disminuyendo en el país.
Se investigaron los datos de las estadísticas de los lugares de alta y baja
incidencia, con respecto a las tasas de cáncer gástrico mostradas por quintiles del
cuadro 11, las tasas de incidencia aparecidas bajo las figuras 22 y 23 de los
períodos 1990- 1999 y las tasas de los períodos 1995 - 2003 para cáncer gástrico
y se muestra este análisis bajo las figuras 49 y 50 y los cuadros 28 y 29. No se
presenta el análisis de estadísticas anteriores a 1990, pues el Registro Nacional
de Tumores no lo llevaba por cantones, sino por provincias.
Cuadro 28. Tasa de los cantones marco del estudio correspondiente
al quintil 1 de alta incidencia de cáncer gástrico para los periodos
1999 y 2005.
Quintil
León Cortes
Tasas periodo
1990-1999
68,57
Tarrazú
El Guarco
Paraíso
Alvarado
Aserrí
Cartago
Acosta
Oreamuno
Dota
55,12
48,48
43,12
39,59
36,97
36,91
36,68
35,22
34,58
Cantón
Quintil
1
Tasas periodo
1995-2005
51,4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
39,32
40,3
39,42
42,77
43,46
33,92
39,95
39,23
39,14
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
Fuente: Datos de las tasas de incidencia del Registro Nacional de Tumores
Fuente: Datos de las tasas de incidencia del Registro Nacional de Tumores
Figura 50 Comparación de las tasas por 100 000 habitantes de alta incidencia de cáncer
gástrico por cantón, para las estadísticas de los periodos 1990-1999 y 1995-2005.
Cuadro 29. Tasa de cantones marco del estudio correspondiente al
quintil 5 de baja incidencia de cáncer gástrico para los períodos 1999 y
2005.
Cantón
Nicoya
Los Chiles
Abangares
La Cruz
Liberia
Santa Cruz
Tilarán
Nandayure
San Mateo
Carrillo
Tasas periodo
1990-1999
18,97
18,16
17,95
17,88
17,01
15,9
15,49
14,25
11,94
9,8
Quintil
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
Tasas periodo
1995-2005
22,62
21,21
11,97
13,74
17,95
20,61
23,23
17,26
18,62
12,17
Quintil
3
4
5
5
5
4
3
5
4
5
Fuente: Datos de las tasas de incidencia del registro Nacional de Tumores
Fuente: Datos de las tasas de incidencia del Registro Nacional de Tumores
Figura 51. Comparación de las tasas por 100 000 habitantes de baja incidencia de cáncer
gástrico por cantón, para las estadísticas de los periodos 1990-1999 y 1995-2005.
De la presentación de los datos anteriores se deduce que en Costa Rica la
incidencia de cáncer gástrico no tiene una franca tendencia a la disminución ni
en mujeres ni en hombres, tal y como se aprecia también en la figura 20, en la
cual se puede ver disminución hasta el año 2002. Para 2003 ésta aumentó y luego
de esto el Registro Nacional de Tumores no ha presentado más datos.
En las estadísticas de 1995-2003 se aprecia que la incidencia ha disminuido
porque bajaron las tasas en los tres cantones de más alta incidencia, sin embargo
en los otros cantones marco de este estudio en el país, esta disminución es poco
clara. Según las estadísticas de mortalidad en hombres esta si ha disminuido a
partir del año 1995, no así la de las mujeres, la cual se muestra según la figura 20
“estancada”. Cabe aclarar que para demostrar una tendencia de aumento como
en este, se necesita de tres puntos consecutivos, o sea se requieren los próximos
datos estadísticos, para valorar realmente la tendencia en la incidencia de las
zonas marco de la investigación.
Entonces, no se puede afirmar definitivamente que en Costa Rica, como país, la
incidencia de cáncer gástrico esté disminuyendo, lo que hace pensar que la
influencia intrínseca que aumenta selectivamente la tasa, aún permanece en el
ambiente y por ende en la población.
Se decidió valorar entonces la diferencia de las fuentes de abastecimiento de
zonas de alta y baja incidencia, o sea entre pozos que son los que predominan en
las zonas de baja incidencia (además clorados porque los maneja AyA en su
mayoría) y nacientes, que son las que predominan en las zonas de alta incidencia
y son manejadas por municipalidades.
Dicha diferencia se propone que puede corresponder a la influencia de suelo en el
momento de la captación del agua por el Ente Operador y al que se le proporciona
de diferente manera, directamente, la materia orgánica que contiene. La influencia
del suelo es mayor cuando el agua es dispensada de nacientes que cuando es
dispensada por medio de pozos.
Al buscar y analizar información sobre el suelo del país se tiene que por la
naturaleza y el clima tropical de Costa Rica existen muchos tipos de suelos y de
gran variedad, resultando difícil el análisis de la información por tipo de suelo, tal y
como se puede apreciar en la figura 52.
Figura 52 Mapa de suelos de Costa Rica. Ministerio de Agricultura y Ganadería MAG.
También se trató de hacer esta correlación por tipo específico y tasa de incidencia
de cáncer gástrico, según le fue solicitado al Dr. Edgar Ortiz del CIBI, en el ITCR
arrojando la información que aparece en la figura 53.
Fuente: Datos Dr Edgar Ortiz y Sebastián Weber, CIBI, ITCR
Figura 53 Tipo de suelos de los lugares de alta y baja incidencia de cáncer gástrico.
Entonces de acuerdo con el análisis de los suelos de las áreas en estudio,
encontró que en éstas no se observa claramente una distribución específica
tipo de suelo, lo que se consulta al Máster Federico Masis del Centro
Investigación y de Servicios Químicos y Microbiológicos- CEQIATEC, experto
química del suelo.
se
de
de
en
Se presenta en tal caso, entonces un análisis no por tipo de suelo sino por
características geomorfológicas y físico-químicas importantes y diferenciales, que
explican un supuesto desarrollo de H. pylori en el suelo como posible habitante,
pues como parte de la investigación se determinó que una de las características
de fertilidad del suelo es la presencia de las bacterias ureasa positivas, lo cual a la
fecha no se ha relacionado.
Se buscó un análisis específico de las zonas de alta y baja incidencia de cáncer
gástrico estudiando el acceso del hierro y del níquel, la humedad y la acidez,
mostrando los resultados que aparecen en el cuadro 30.
Cuadro 30. Descripción geomorfológica y físico química de los suelos de las áreas de alta
y baja incidencia de cáncer gástrico, marco del estudio.
Condición del
Zonas de alta
Zonas de baja
suelo
incidencia
incidencia
(A.I)
(B.I)
Geomofología,
(Denyer y Kussmaul
2000).
Predominan materiales
volcánicos
de
composición andesítica:
SiO2
(54,5%),
Fe2O3
(3,2%), FeO (3,5%)
Predominan formaciones
de composición riolítica
SiO2
(70,7%),
Fe2O3
(1,9%) FeO (0,3%)
Observaciones
Implica la presencia de
rocas
que
contienen
mayores porcentajes de
hierro sobre el área de alta
incidencia.
Sobre
la
formación
andesítica, los procesos de
meteorización que actúan
en las rocas pueden liberar
mayores concentraciones
de hierro en el suelo.
Relieve y elevación
La mayor elevación y
bajas
temperaturas
favorecen
mayores
contenidos de materia
orgánica en el suelo
(MOS)
Mayores temperaturas
y
un
relieve
ligeramente ondulado
La actividad microbiana
depende de la humedad y la
temperatura del suelo, y
más
aún
de
la
disponibilidad de carbono
fácilmente accesible que es
utilizado como fuente de
energía
por
los
microorganismos.
(Bernal 2003).
Predominan
mayores
concentraciones de MOS,
la
materia
orgánica
experimenta un proceso
natural de mineralización
que
permanentemente
acidifica el suelo (Bertsch
1998),
a
su
vez
incrementa la solubilidad
del hierro en sus formas
2+
3+
Fe y Fe condicionados
por los cambios del
“potencial
oxidación/reducción” en
el suelo
Relación entre la A una
precipitación
precipitación anual y media anual comparable
la tasa de infiltración entre las dos zonas, la
de agua en el suelo.
evapotranspiración
es
menor, este fenómeno
también
puede
ser
apoyado por una menor
temperatura mensual, lo
que
puede
implicar
mayores
tasas
de
infiltración de sustancias
solubles hasta el suelo
profundo
Fuente: Análisis bibliográfico MSc Federico Masís.
Los
suelos
en
promedio
pueden
exhibir mayores pH que
los suelos de las
regiones
de
alta
incidencia.
A mayor basicidad en los
suelos o sea a un pH mayor,
se presenta una menor
disponibilidad del hierro
(Barber 1984)
Comparativamente
la
evapotranspiración es
mayor,
por
una
temperatura
comparativamente
mayor.
Normalmente
metales
pesados que puedan estar
presentes en el suelo, tales
como el
níquel, pueden
experimentar
una
alta
movilidad.
Ni>Cd>Zn>Pb>Cu
Proceso
acidificación
suelo
de
del
6. Discusión
En el presente trabajo se logró la detección de Helicobacter pylori a partir de
muestras de agua por cultivo, y posterior verificación por análisis molecular. La
importancia de estos hallazgos, su origen, la interpretación de los resultados y la
integración de información adicional como el sitio de origen del muestreo y su
relación con la lluvia y el tipo de suelo serán parte de la discusión que se presenta
a continuación.
Con respecto a la fuente, los trabajos de Helicobacter pylori generalmente se han
realizado a partir de muestras directas o indirectas de pacientes humanos. Sin
embargo, pocos trabajos dan cuenta de su hallazgo en agua y menos en agua de
consumo de la población. En el cuadro 31 se muestra una revisión de trabajos
publicados en los últimos 10 años, se excluyen los estudios en los cuales la matriz
se inoculó de forma artificial.
Cuadro 31. Trabajos publicados sobre recuperación e identificación de H. pylori en el
mundo en matriz agua
Investigación
Tipo de agua
Baker, et al. “Presence of
Helicobacter pylori in
Drinking Water is
Associated with Clinical
Infection”.
Lu, et al. “Isolation and
Genotyping of
Helicobacter pylori from
Untreated Municipal
Wastewater”.
Horiuchi T, et al.
“Helicobacter pylori DNA
in drinking water in
Japan”.
Hulten K, et al.
“Helicobacter pylori in the
drinking water in Peru”.
Hulten K, et al. “Presence
of Helicobacter species
DNA in Swedish water”.
Hegarty J, et al.
“Occurrence of
Helicobacter pylori in
surface water in the United
States”
Krumbiegel P, et al.
“Helicobacter pylori
determination in nonmunicipal drinking water
and epidemiological
findings”.
Kowolick, et al. Water and
Biofilm Transmission of
Helicobacter Pylori (Hp) in
Rural Guatemalan
Households: 199
Marcador
Observación
Pozo
-ureA
Comparan presencia de E coli con H pylori. Hubo una
muestra que no coincidió de E coli con H pylori
Agua residual
-16S ARNr alelos
de vacA
Rio, agua de
pozo
-16S ARNr
23 aislamientos de 37 fueron confirmados Hp, con uso
de anticuerpos inmunomagnéticos y luego cultivo
Solo un 62% de los aislamientos específicos pudieron
ser confirmados
2 cepas fueron secuenciadas
Solo 2 muestras de pozo fueron positivas
Agua de uso de
la comunidad
-Adhesinas
-16S ARNr
Pozos, tanques,
Municipal y en
agua de
desecho
En agua
superficial y
agua de
naciente
-Adhesinas
-16S ARNr
-Microscopia
inmunofluorescente
No hubo correlación significativa entre coliformes
totales y E coli, sugiriendo que el indicador falla para la
protección del usuario para H pylori
Agua de pozo
-RT-PCR (16S
ARNr)
Se analizaron 157 pozos . De estos se encontró la
bacteria en un 10%, con un límite de detección de 125
bact/L. Secuenciaron cepas pero a partir de secuencias
de NCBI similares obtuvieron secuencias cercanas
relacionadas
Hisopados
internos de
tubería y agua
de casas
PCR-anidada
Se analizó agua de las casas de una zona indígena de
Guatemala (agua de lago de forma directa), el 29% de
las muestras fueron positivas
Uso de anticuerpos inmunomagnéticos
24 muestras amplificaron el marcador de la adhesina, y
de esas 11 amplificaron con 16S (46%)
Solo pudieron llegar hasta género, hubo bacterias que
no pudieron identificar
Es pertinente denotar que Hegarty tiene el único trabajo en nacientes y fue el
primero en reportar la no correlación entre H. pylori y E. coli; asimismo Lu y
colaboradores son los únicos que han secuenciado cepas provenientes de agua
residual.
Cuando H. pylori se adhiere a una superficie empieza la activación de genes
relacionados con quorum sensing y de esta forma se activan mecanismos de
formación de biofilmes. Especialmente Azevedo y colaboradores (Azevedo 2003,
2004, 2006) han trabajado en biofilmes de tuberías y tanques de almacenamiento
y consideran que ésta es la forma como ella puede mantenerse viable en el agua.
Esta forma de mantenerse la protege de un ambiente que “percibe” agresivo, esto
sugiere que en el agua de origen natural la bacteria no se encuentra libremente,
sino adherida (sésil). De la experiencia de esta investigación se puede afirmar que
H.pylori fue recuperada del agua bajo su forma bacilar con la estrategia de cultivo
utilizada.
La estrategia que se utilizó para cultivarla del agua de consumo humano y
demostrar que ésta es una probable vía de transmisión de la bacteria, indujo a la
formación de biofilmes en filtros de nitrocelulosa y cultivo en medio líquido,
estrategia que proporcionó excelentes resultados; consecuentemente no fue
necesario el empleo de anticuerpos inmunomagnéticos como los utilizados en el
trabajo de Lu y colaboradores. Sin embargo se considera que para el cultivo de la
bacteria a partir de agua residual el uso de los anticuerpos es indispensable por la
cantidad de flora acompañante.
El lograr el cultivo de H. pylori siempre se consideró importante, pues se tendría
además de sus características coloniales hallazgos fenotípicos y comportamiento
bioquímico además un ADN completo para cualquier otra determinación
molecular; por el contrario lo presentado por algunos autores, con excepción de
Lu y colaboradores (Lu, 2005), es la demostración de la presencia en agua de
pozo o superficial de solo 1 o 2 marcadores moleculares generalmente 16S ARNr,
o ureA ( ver cuadro 31).
Se consideró que la búsqueda de la bacteria por medio de marcadores
moleculares directos en el agua podría presentar resultados falsos positivos o
negativos por unión no específica de primers o la presencia de sustancias
inhibidoras. Es importante destacar que en la zona marco de estudio existe una
alta incidencia de ácidos húmicos y fúlvicos que normalmente se denominan
humus (el agua presenta color de manera importante especialmente cuando
llueve) los cuales interfieren o son inhibidores de la ADN polimerasa (Inhibidores,
2010). En este trabajo estos potenciales problemas fueron evitados con el cultivo
de la muestra, el aislamiento de su ADN de las células cultivadas y realizar de
seguido la PCR.
En algunos de los resultados obtenidos, se advierten de productos de mayor
tamaño al esperado, que se trata de explicar con el hecho de que la muestra
proviene de cultivo en caldo con muy probable presencia de otros ADN de
distintas clones de Helicobacter pylori o de otros Helicobacter, especialmente esto
es notorio al caracterizar la muestra #20 del primer muestreo. En este caso
específico para cagA como para los alelos de vacA, se obtienen productos de
mayor tamaño al esperado, lo que concuerda también con lo encontrado por Lu en
su trabajo pues reportan cepas con los alelos s1 y s2 de mayor tamaño al
esperado y cepas que contienen m1 y m2, esto también ha sido reportado por De
Gusmao y colaboradores (De Gusmao, 2000).
En este mismo sentido algunos autores como Jang-Jih Lu y colaboradores (JangJih Lu, 1999), consideran que el gen glmM es el marcador más sensible y
especifico para la determinación de H. pylori, ellos encontraron que en biopsias
gástricas había falsos positivos para el gen 16S ARNr, en este mismo sentido hay
concordancia también con lo expresado por Shahamat y colaboradores
(Shahamat, 2004), no obstante se consideran también estos inconvenientes como
problemas en el diseño de primers.
Tomasini y colaboradores (Tomasini, 2003), han encontrado que una sola cepa
de H. pylori puede incluir varias proporciones de subtipos con diferente fenotipo de
cagA en un solo aislamiento; así mismo colonizaciones gástricas de cepas
múltiples también han sido advertidas por Con y colaboradores en pacientes
costarricenses (Con, 2009). Estos hallazgos concuerdan con los resultados de
esta investigación.
Según Shahamat en H. pylori, secuencias 16S son físicamente removidas y
posicionadas en otros puntos del genoma, lo que genera un operón ARNr de
estructura atípica; esta situación dificulta el estudio de esta región ribosomal y
genera una alta variabilidad genética (Shahamat et al, 2004). Asimismo se ha
descrito que discrepancias en las secuencias genéticas del ARNr 16S son
consistentes con la transferencia horizontal de fragmentos y la creación de
moléculas mosaico con la pérdida de información filogénica (Dewhirst, 2005). En
este trabajo solamente se empleó en el primer muestreo.
Otro factor que se pudo determinar de gran importancia en el hallazgo de la
bacteria en muestras de agua de origen natural, es que su presencia en las
muestras está fuertemente influenciada por las condiciones ambientales previas al
muestreo. Esto ha sido mencionado por algunos autores como Azevedo (Azevedo
et al, 2007), y Benson (Benson et al, 2004). Este hallazgo refleja la naturaleza
transitoria de la contaminación de las fuentes de agua y en particular, el impacto
de precipitaciones recientes, sin discutir estos autores en estos trabajos el por
qué de esta situación.
De la experiencia generada en esta investigación se propone que H. pylori no
necesariamente tiene que encontrarse cuando se busca en el agua, es más, se
puede considerar como buscar “una aguja en un pajar”, muy influenciado el
proceso por condiciones ambientales específicas, como la lluvia, el mantenimiento
húmedo del suelo y de aquí probablemente al agua.
Para las muestras tomadas al pozo del TEC, solo una vez se pudo obtener un
aislamiento y las dos siguientes veces no se obtuvo una muestra positiva. Esta
diferencia correspondió, a que en la primera ocasión el pozo no se usaba desde
hacía mucho tiempo, mientras que en las siguientes dos oportunidades su uso era
continuo reflejando quizás que en la primera vez podría haber, la presencia de
biofilmes. Este resultado es similar a lo reportado por Kowolick y colaboradores
(Kowolick, 2005) en abastecimientos de agua de tubería en hogares indígenas
guatemaltecos, quienes encontraron que en muestras de hisopados de secciones
de tubería de profundidad había más marcadores positivos para H. pylori que en
el chorro de agua de los tubos denotando la presencia de la bacteria en biofilmes.
Con respecto a la lluvia en ambos lugares marco de la investigación, zonas de alta
y baja incidencia, no se determinó la utilidad de compararlas, pues para el
momento en que se estudió esta variable que fue el 2008, no fue
comparativamente diferente para ambas zonas los milímetros de lluvia al año.
Según se mencionó en el Instituto Meteorológico Nacional, la zona de Guanacaste
es seca y solo llueve en época lluviosa, pero cuando llueve, ésta se da en gran
cantidad; mientras que para las zonas de alta incidencia se presenta lluvia
prácticamente todos los días, esto puede desprenderse de la información
mostrada en los cuadros 23 y 24 sobre la precipitación anual media para el 2008.
Algunos autores han advertido un aumento en la viabilidad celular cuando H. pylori
permanece en cultivos a bajas temperaturas, de allí que para esta investigación
eso fue fundamental y finalmente se relacionó estadísticamente según los
resultados presentados. Bani Hani y colaboradores
(Bani Hani, 2005),
relacionaron factores ambientales, como la presión barométrica y la temperatura
ambiental con diferencias de infección en las personas por H. pylori, hallaron al
igual que en este trabajo, mayor prevalencia en las zonas altas, lo cual según los
resultados indicados en este trabajo se explica en términos de menor temperatura
ambiental y suelo más frío.
Ahora bien cabe la pregunta, ¿cuán contaminada aparece
el agua por
Helicobacter pylori?. Krumbiegel y colaboradores (Krumbiegel, 2004) encontraron
que en una zona rural de Alemania
la cantidad de copias de ADN
correspondiendo a bacterias en agua de pozo, correspondía a 125 bacterias/L
mediante la técnica de RT-PCR.
De la experiencia de esta investigación se encontró en algunos casos, que los
cultivos de agua de nacientes, se podían considerar casi como “cultivos
exclusivos”, (tomando en cuenta los antibióticos empleados en el medio inicial,
que eran 4), especialmente nacientes de la zona de los Santos y del Cantón
Central de Cartago.
En cuanto a la calidad del agua se encontró que no existe relación entre
coliformes fecales y presencia de H. pylori. En este mismo sentido Braganca y
colaboradores (Braganca, 2005) han reportado en sus trabajos con biofilmes, que
H. pylori es más resistente a la cloración que E coli, al igual que lo reportado por
Baker y Hegarty (Baker, 2002). Además Hegarty expresó que al no haber
encontrado correlación entre la presencia de ADN de H. pylori en el agua de
consumo y la presencia de E coli este indicador falla para la protección y criterios
de potabilidad del agua (Hegarty, 1999). En este mismo sentido Mazari y
colaboradores (Mazari, 2001) han advertido que el agua residual tratada no
necesariamente elimina a la bacteria, constituyéndose en un serio riesgo para la
salud pública por contaminación cruzada.
Como resultado de este trabajo se encontró que la situación de manejo del agua
en Costa Rica en términos generales no es óptima, como también ya ha sido
advertido en diversas ocasiones por el Dr. Darner Mora del Laboratorio Nacional
de Agua; pues aún hoy, el 80% de las municipalidades que manejan el agua de
las zonas de alta incidencia de cáncer gástrico la manejan de forma deficiente,
inclusive la Municipalidad de Tarrazú que posee Bandera Azul, mantiene valores
más bajos de cloro residual ( 0,2 mg/L) e incluso negativos, con respecto a lo
estipulado por el Reglamento Nacional.
No obstante para algunos cantones, con los años la calidad relativa del agua ha
mejorado. Un ejemplo concreto de esto es el Cantón Central de Cartago, tal y
como se puede observar en la figura 54, donde se muestra la mejoría del año
1996 al año 2000, y a la fecha esta calidad ha mejorado de forma total, pues
actualmente no se consume agua con cloro residual menor de 0,5 mg/L.
Fuente: CEQIATEC, 2002
Figura 54. Positividad bacteriológica en coliformes fecales del
agua de las redes de la Municipalidad del cantón Central de
Cartago, de 1996 a 2000.
En este caso específico la municipalidad mantiene un convenio de control de
calidad del agua potable con CEQIATEC desde hace 25 años, específicamente la
mejora se ha visto desde hace 15 años. Podría proponerse que hay concordancia
en la tendencia de mejora de la calidad del agua y una disminución discreta de la
tasa de incidencia de cáncer gástrico de 36,9 a 33, 9 (figura 50), según lo
mostrado en las estadísticas hasta el año 2003. Habrá que esperar la próxima
estadística para corroborar esta tendencia a la disminución; no obstante se
considera que para notar la baja en la incidencia de cáncer gástrico, esta deberá
de manifestarse en la siguiente generación, o sea a los 20 años.
Las zonas de baja incidencia de cáncer gástrico marco del estudio manejan agua
clorada en un 90% desde hace muchos años, (desde las décadas de los años de
1960 y 1970) aunado a esto se encontró desde el punto de vista geomorfológico y
físico-químico del suelo condiciones para el probable desarrollo ambiental de H.
pylori menos favorables y proporcionalmente más secas todo el año.
La infección por H. pylori es el factor de riesgo más reconocido y aceptado en la
etiología del cáncer gástrico en el mundo. Del análisis de los datos de las figuras
20, 49 y 50 no se puede afirmar que en Costa Rica la incidencia del cáncer
gástrico ha disminuido de forma global, según se aprecia en la figura 20. En
hombres solo hay disminución neta del año 2000 al 2002 con respecto a las
estadísticas desde 1990 por el Registro Nacional de Tumores; a partir del año
2002 y al 2003 se observa una pequeña tendencia a la alza de nuevo.
De acuerdo con el análisis de las figuras 49 y 50 han disminuido las tasas en los
tres cantones de más alta incidencia, León Cortes, Tarrazú y El Guarco. En los
otros cantones marco de la investigación esta disminución es poco clara; podría
pensarse que la influencia intrínseca aún permanece en el ambiente. Incluso en
los cantones de baja incidencia se observa que 8 de los 10 estudiados tienden al
alza; no obstante como para analizar tendencias estadísticas se necesitan mínimo
3 puntos se deberá esperar la próxima publicación de estadísticas de incidencia
de cáncer gástrico por cantón para valorar las tendencias relativas reales como
país.
En cuanto a lo investigado sobre la relación y la influencia del suelo en el
problema de cáncer gástrico en el país, se tiene que Sierra y colaboradores en
1983 habían advertido que había correlaciones estadísticamente significativas
entre la tasa de incidencia y la acidez o pH bajo, el hierro, el potasio y el zinc en el
suelo. El efecto del pH del suelo ya había sido notado por Hirayama en 1971, la
posibilidad de una influencia multifactorial en el suelo fue insinuada con
anterioridad por Tromp en 1981 (Sierra, 1983), sin aclarar en ese momento la
razón. Podría ahora explicarse o proponerse en términos del contenido de materia
orgánica soluble del suelo (MOS) que llega directamente al agua subterránea y
tiene influencia más en el agua de naciente que en la de pozo.
En el caso específico de esta investigación las muestras de agua prácticamente
no presentan contaminación fecal, o sea se podría proponer que las cepas de H.
pylori encontradas en esta matriz, pueden considerarse como “propias del suelo”.
Por esta razón es que en el tercer muestreo se buscó la bacteria en 3 muestras de
tierra asociada a nacientes de agua y que presentaran alta humedad en los tres
cantones de la zona de Los Santos, obteniéndose en una muestra, dos productos
de mayor tamaño al esperado, uno de 350 pb y otro de 450 pb del marcador
correspondiente al gen glmM (294 pb). Este hallazgo se podría proponer como
“positivo” por cuanto el poder encontrar ADN de un género relativo, en medio del
ADN total de una matriz que puede poseer, según consideran los ecólogos, hasta
108 bacterias/g es realmente difícil. No obstante la seguridad del aislamiento
eventualmente la daría la secuenciación de las cepas.
La interacción entre materia orgánica y sustancias químicas presentes, se cree
que está ligada con la necesidad de Helicobacter pylori de metales,
específicamente por el acceso al níquel, los cationes de hierro y al medio ácido. H.
pylori contiene relativamente un bajo número de sistemas de transporte de iones,
excepto para níquel y hierro (NCBI, 2001), estos dos iones pueden ser
transportados por dos o más sistemas, lo que indica su importancia en la fisiología
de la bacteria.
La forma en que el hierro permanece en el medio es muy importante para H.
pylori, el Fe +3 es insoluble a pH neutro, un suelo ácido incrementa la solubilidad
del hierro, se supone que se pueden encontrar mayores cantidades de la bacteria
en suelos ácidos donde el hierro presenta mayor disponibilidad, siempre y cuando
el mismo permanezca húmedo según se presentó en el cuadro 30.
Ahora bien en Costa Rica es común hallar suelos con hierro, pero es importante
destacar que en las zonas de alta incidencia estudiadas, los suelos tienen mayor
cantidad de MOS, de acuerdo con las razones expresadas en el cuadro 30, en el
cual también se mostró que una disminución del pH aumenta la disponibilidad del
hierro en el suelo, esto se propone que lo podría aprovechar directamente la
bacteria.
En cuanto a la necesidad de níquel por la bacteria, ella debe de tener este metal
a disposición, por cuanto la ureasa contiene 12 átomos de níquel por molécula, y
necesita la enzima para mantenerse en el ambiente ácido del estómago, la
literatura menciona que los niveles pueden alcanzar hasta el 10% del total de
proteínas celulares. Por otro lado según lo expresa la literatura en las personas la
mayor parte del níquel ingerido procedente de la dieta permanece libre en la luz
del aparato gastrointestinal (Melo, 2007), lo que podría explicar, porque H. pylori
podría eventualmente adaptarse y permanecer en dos sitios tan disímiles como el
agua (suelo) y el estómago, aclarado esto mediante la presencia de bacterias
ureasa positivas del suelo.
En suelos forestales con bosques templados, la principal fuente de nitrógeno para
las plantas se aloja en el MOS y su liberación depende del pH del suelo y desde
luego de la actividad bacteriana. Desde el punto de vista químico del suelo la
ureasa es una de las diferentes enzimas que existen en él y pertenece al grupo de
las amidohidrolasas, la actividad de esta enzima es el resultado de la proliferación
de microorganismos con la capacidad de sintetizarla. Su función principal es
actuar sobre enlaces C-N de la urea, su actividad es extracelular y puede formar
complejos muy estables (ureasa-humus) con los coloides del suelo (Pascual,
2002).
El contenido de MOS en el suelo aumenta con la humedad y la disminución de
temperatura (Méndez, 2010) relacionado con ésto, Azevedo menciona que zonas
frías en el mundo presentan mayores tasas de infección y que posiblemente la
transmisión ocurra principalmente durante época lluviosa (Azevedo, 2007), ésto se
menciona con respecto a la relación que se hace en esta investigación de la
correlación entre las zonas de alta incidencia de cáncer gástrico, presencia de H.
pylori y características geomorfológicas del suelo.
Como ya se ha expresado, no se encontró correlación entre fuentes de agua
limpia (nacientes) presencia de E coli y H. pylori, esto implica que muchas de las
fuentes de agua que se están manejando actualmente para las poblaciones por
las municipalidades ( y con mucha más razón por las ASADAS) no se cloran
porque se consideran como “agua de calidad potable”, pues los análisis muestran
que E coli está ausente. Esto tiene serias implicaciones en la epidemiología de la
transmisión de H. pylori a la población costarricense.
De hecho, de los cantones investigados de alta incidencia, (y actualmente en el
entendido que el problema de cáncer gástrico se gestó en los pacientes desde
hace 20 años atrás, pero reflejados en las estadísticas actuales), se puede afirmar
que de todas las Municipalidades en estudio solo las redes de abastecimiento de
la Municipalidad del Cantón Central de Cartago presentan un control completo del
agua con análisis físico-químicos y bacteriológicos regulares, las cuales desde
hace varios años se encuentran permanentemente cloradas y en los niveles
adecuados.
La Municipalidad de Paraíso actualmente lleva a cabo análisis ocasionales
bacteriológicos en sus redes de distribución y hasta hace relativamente poco, unos
3 años, se clora el agua de manera permanente por una empresa externa. En el
Guarco, León Cortes, Dota, Alvarado y Aserrí el control y la cloración son
prácticamente nulos o intermitentes (incluso un balde de cloro los días lunes). En
Oreamuno hasta hace aproximadamente 3 o 4 años se ha implementado la
cloración de algunas de sus redes.
En general en estas zonas de alta incidencia (con excepción de la Municipalidad
del Cantón Central de Cartago), existe ausencia de control físico-químico de la
calidad del agua para consumo humano. En el mejor de los casos, de forma
ocasional, se limitan a la determinación del parámetro de coliforme fecal, y
corrientemente no existe la determinación de parámetros cuyos contaminantes
nitrogenados, puedan ser de toxicidad para el estómago como lo serían los
nitratos, nitritos y/o plaguicidas nitrogenados; y en términos generales no hay
aplicación o hay desconocimiento del Reglamento de Calidad del Agua de Costa
Rica.
El caso de Tarrazú es especial, pues cuenta con Bandera Azul por el manejo del
agua y el cuidado a las fuentes de abastecimiento; no obstante las muestras
tomadas de nacientes salen todas positivas para H. pylori y las muestras a los
tanques de almacenamiento de agua contienen muy poco cloro residual. En el
primer muestreo se determina 0,3 mg/L y en el segundo las muestras no
presentan cloro residual, lo cual a pesar del manejo deja a la población totalmente
vulnerable. En este mismo sentido en esta zona de alta incidencia manifiestan los
encargados del acueducto que si bien es cierto que ellos pueden agregar más
cantidad de cloro tal y como se los ha recomendado AyA, no lo hacen, pues de
todas maneras según se les ha dicho, las nacientes son de “muy buena calidad”.
No obstante para el tercer muestreo en los cantones de Dota y León Cortés el
agua para la población se había empezado a clorar, aunque de una forma
bastante artesanal e insuficiente, pero es un buen inicio.
Aunado a lo anterior en los cantones de la zona de los Santos, El Guarco, Paraíso,
Aserrí y Acosta el agua posee problemas de turbiedad especialmente cuando
llueve. En estos casos no se contaba con un sistema de filtración, el cual es
totalmente indispensable, algunas ASADAS de estas zonas sí los poseen.
Todo lo anterior ayudado por una buena oferta hídrica de esta zona, que conlleva
a que sean los gobiernos locales quiénes decidan manejarlos, junto con las
ASADAS, estas de calidad no siempre adecuada (algunas funcionan muy bien,
mas la mayoría no) ocasionan que el mantenimiento de la calidad adecuada del
agua puede ser intermitente.
Ésto es una diferencia substancial con el manejo del agua de acueductos rurales
de países desarrollados, aunque en estos países existen en mucha menor
proporción, los mismos están completamente regulados. Por ejemplo el
Reglamento de Calidad de Agua de la Unión Europea (ver anexo 1), estipula la
presentación de varios análisis físico químicos y bacteriológicos que deben ser
entregados periódicamente a las autoridades sanitarias para que puedan operar.
En el caso de Costa Rica, este control es prácticamente nulo, se deja el manejo
más que todo a la buena voluntad de los Entes Operadores. Nuestras autoridades
sanitarias sólo intervienen en los acueductos como Ente Rector y sólo lo hacen en
caso de brotes o emergencias hídricas.
Con el creciente control de parámetros del agua observados principalmente en los
países desarrollados, la hipótesis de la transmisión hídrica podría explicar al
menos en parte, la disminución de la colonización de las personas por H. pylori en
estos países desarrollados.
Como parte de las debilidades de este sector en el área de la gestión de los
servicios, se considera, la ausencia de un sistema constante e integral de control y
vigilancia de la calidad del agua potable, así como la fiscalización y control a las
organizaciones comunitarias administradoras de acueductos rurales (CAAR´s y
ASADAS), donde se identifican los mayores índices de suministro de agua “no
potable” y la ausencia de un sistema de financiamiento permanente para los
acueductos rurales.
La abundante precipitación en Costa Rica ha hecho que el costarricense no haya
sentido preocupación por la disponibilidad de agua para realizar sus actividades,
como tampoco ninguna necesidad de planificar las actividades relacionadas con el
manejo de los recursos hídricos.
De forma generalizada se encontró un desaliento ante el proceso de cloración en
estas zonas de alta incidencia por cuanto en las visitas del personal del AyA se
les ha mencionado que su agua es de excelente calidad, según algunos de ellos lo
manifestaron en la entrevista, entonces no se ve la necesidad de clorarla o el
proceso se lleva a cabo de forma insuficiente. Lo que sí se pudo determinar de
forma general en las visitas a las áreas es la preocupación por mantener la zona
de recarga de las nacientes, con excepción del Cantón del Guarco, donde no
existe ningún criterio de protección, control o voluntad por suministrar agua de
calidad potable, como realmente es de conocimiento nacional.
Se requiere primero educación para el manejo correcto del agua destinada a la
población, luego conocimiento de la reglamentación que se les aplica y de último
amplia fiscalización por parte de AyA y Ministerio de Salud como Ente Rector del
país para proteger la salud de esta población de riesgo.
Los resultados de las investigaciones se publican y los trabajos se presentan en
congresos, sin embargo, también es necesario que esos estudios lleguen a los
políticos, a los administradores de la salud pública y a la población en general. A
veces los resultados de las investigaciones no se utilizan como insumo en las
decisiones políticas, quizás porque no hay canales efectivos de comunicación o
por falta de capacidad para trabajar en equipo. Este es un problema para el que
habrá que buscar solución, no obstante la meta sería encontrar la forma de
prevenir el desarrollo del cáncer gástrico en nuestra población.
En el anexo 1 y 2 se muestran los Reglamentos de Calidad de Agua de la Unión
Europea y de otro país en vías de desarrollo como República Dominicana, en
ambos se puede apreciar cómo se maneja el agua de calidad. En el caso de
República Dominicana llama la atención, por cuanto la población cuenta con dos
tipos de agua una llamada de “uso doméstico” que es de uso general, y otra que
consume la población envasada solamente por empresas externas”.
Con base en los datos presentados en el cuadro 1 se presenta bajo el cuadro 32
la población actual en términos relativos cuyo Ente Operador dispensa agua
potable actualmente en Costa Rica.
Cuadro 32 Población actual en términos relativos cuyo Ente Operador
dispensa agua potable actualmente en Costa Rica.
Ente Operador
% de la
Población
población
con agua
cubierta
potable
AyA
Municipalidades
evaluadas
E.S.P.H.
CAAR´s/ASADAS *
(Evaluadas)
TOTAL
% de la
población
relativa
cubierta
49,3
15,5
98,2
78,8
48,41
12,21
3,6
19,8
99,6
58,7
3,6
11,6
75,8
Según esta información en teoría actualmente sólo un 75% de la población
costarricense recibe agua de calidad potable por su Ente Operador, no obstante
no queda claro si la determinación de esta potabilidad se hace en estas
estadísticas bajo la determinación de la no presencia solo de coliformes fecales
determinados en las nacientes y tanques de almacenamiento, de cloro residual en
el agua, o si se toman en cuenta otros parámetros físico químicos en el agua
dispensada. La información que se recolectó en el muestreo de algunas
municipalidades es que AyA solamente les hace un análisis de coliformes en
nacientes o en tanques de almacenamiento.
Sin embargo a la luz de esta investigación se determina que los criterios actuales
para aceptar la calidad de agua, considerada como potable con la sola ausencia
de coliformes fecales, deben ser revisados. Esto tiene especial significado para las
zonas de alta incidencia de cáncer gástrico.
La calidad del agua que abastece las municipalidades y ASADAS debe ser
adecuadamente valorada en términos de cantidad de cloro residual, no menor a
0,5 mg/L, este valor se encuentra en el Reglamento de Calidad de Agua, no
obstante no se conoce, ni se respeta, ni se valora a los Entes Operadores en su
cumplimiento. Por las características de la alta cantidad de carbono orgánico
disuelto (medida de la cantidad de materia orgánica del agua) que poseen
principalmente las zonas de alta incidencia se hace necesario que este nivel
mínimo de cloro sea dispensado a la población.
7. Conclusiones
Al reconocer que el medio ambiente juega un rol preponderante en la adquisición
de la infección y que la asociación entre la infección por Helicobacter pylori de
forma crónica y el riesgo elevado de desarrollar cáncer gástrico está bien
establecido en la actualidad (Bartchewsky, 2009; Cancer, 2006-2008; Cañas,
2009; Graham, 2007), es necesario proponer un mecanismo que explique la alta
incidencia de cáncer gástrico en las zonas de estudio.
Población con predisposición:
citoquinas proinflamatorias +
Le B
+
Bani Hani,2006
-Dietas ( comp. nitrosos)
- ↓ consumo frutas y vegetales
- Infección de largo plazo con H
pylori (SAC, 2008)
-Bartchewsky, 2009 (MMR)
↑
-Saneamiento ambiental (acceso al agua
potable, condiciones higiénicas).
-Educación a la población (Hábitos
saludables, prevención de riesgo,
quimio prevención)
-Nivel socioeconómico
Figura 55 Propuesta de la interrelación de variables que influyen en la alta incidencia de
cáncer gástrico, caso Costa Rica.
Con el planteamiento la sucesión de múltiples eventos para explicar un probable
mecanismo de carcinogénesis ambiental en la alta incidencia de cáncer gástrico
en Costa Rica se muestran las interrelaciones de la figura 55. En éste se
demuestra como la presencia de la bacteria en el mundo se relaciona con
condiciones de saneamiento ambiental y nivel socioeconómico general, tales
como acceso al agua potable, condiciones higiénicas, educación de la población
hábitos saludables, conocimiento y prevención del riesgo, tal como la quimio
prevención.
Desde los años cincuenta en Estados Unidos se reconoce la situación y en
términos generales los epidemiólogos han dicho que H. pylori ha ido
desapareciendo de los países desarrollados a lo largo de los últimos 100 años
merced a una mayor higiene que bloquea la transmisión de la bacteria (Blazer
2005).
En el problema se reconocen factores propios de la bacteria, lo anterior implica
que en la colonización por H. pylori en el mundo convergen varios factores, entre
ellos una distribución geográfica mundial de cepas de H. pylori que determinan de
cierta manera que la presencia de ciertas cepas de mayor patogenicidad en
distintas partes del mundo podrían intervenir en la severidad de una infección
para una población dada.
Esto es especialmente claro en los aportes de las investigaciones de Naylor,
(Naylor, 2006), donde comparó en pacientes con gastritis (japoneses y del Reino
Unido) su histología gástrica y encontró que los estómagos de japoneses tenían
gastritis más severas y extensivas, con un número mayor de células inflamatorias
y un mayor riesgo de progresión hacia la atrofia y la metaplasia intestinal;
alrededor del 90% de esos casos de gastritis en ambos países fueron
relacionados con infección por H. pylori; pero cepas CagA positivas fueron más
comunes en japoneses que en pacientes del Reino Unido. Esto explica entonces
el segundo factor que es la naturaleza de las cepas de H. pylori en poblaciones
determinadas.
Según se abordó en el marco teórico la población costarricense cuenta con una
susceptibilidad genética o polimofismos proinflamatorios de interleucinas donde la
respuesta contribuye a la patogénesis del cáncer, dentro del grupo de personas
infectadas por H. pylori, específicamente las que presentan determinados
polimorfismos del gen IL-1β +3954.
Aunado a esto Bani Hani (Bani Hani, 2006), ha mencionado que para una
población dada, los factores ambientales tienen más peso que los factores
genéticos, y desde el punto de vista de la toxicología ambiental esto es así.
Bartchewsky ha propuesto (Bartchewsky 2009), que la desregulación que provoca
H pylori en el hospedero
(MMR), podría considerarse el principal factor
desencadenante de cáncer para una población específica, en especial como en
nuestro caso si la población es crónicamente agredida y probablemente en alta
concentración.
En análisis de riesgo ambiental en toxicología uno de los factores más importantes
para valorar el riesgo de una población es la dosis del tóxico en el ambiente, pues
la correspondencia entre la cantidad de tóxico y la magnitud del efecto es lo que
se conoce como la relación dosis-efecto, donde la relación entre ambos es una
curva sigmoidea, no una recta lineal, según se muestra en la figura 56
(Toxicología, 2001).
Esto quiere decir que a pesar de que se encuentre un tóxico en una población
puede que el nivel de respuesta de la población (enfermedad) a una dosis baja
sea imperceptible desde el punto de vista clínico, o sea, la población puede ser
tolerante en consonancia con sus propios mecanismos de respuesta celular, esto
es lo que pertenece a la zona de homeostasis dentro del umbral de seguridad de
acuerdo con la figura 56.
Figura 56. Curva Dosis-Respuesta.
Lo anterior implica que si el tóxico está en una alta cantidad para la población (el
cuerpo no podrá eliminar el tóxico con la rapidez que lo ingiere), la población
entonces enfermará de manera exponencial, o sea cuando la dosis supere el
umbral de seguridad se dispara el efecto y es cuando se ven poblaciones o zonas
con diferencias estadísticas de incidencia, en el caso que se analiza, cáncer
gástrico. La respuesta celular que se menciona es lo que se resume en la figura
57, en la que se muestran los mecanismos de protección que posee la célula ante
agresores genotóxicos como podría ser el caso de H. pylori.
Figura 57. Evolución celular hacia la formación de tumores malignos y los factores que
intervienen.
El fácil acceso y el tipo de H. pylori al que está sometido la población de las zonas
estudiadas de alta incidencia de cáncer gástrico en Costa Rica se considera
realmente alto, por las características geoquímicas del suelo y las condiciones
climáticas que imperan en la zona y que podrían promover la sobrevivencia de la
bacteria. Pero lo más importante que aporta este trabajo es el grado de
inconveniencia con que es manejada el agua de consumo humano en estas
poblaciones, que por ende la hace de directo acceso a la población.
Se menciona la palabra inconveniencia porque surgen varios factores que
tampoco podrían denominarse negligencia, pues a pesar de que el Ente Operador
conoce que no se maneja del todo bien, no está consciente de la implicación “de
ese mal manejo”, y esto se reflejó en el apoyo que dieron siempre los encargados
de los acueductos a este proyecto.
A continuación se propone una expresión en forma de ecuación sobre la
propuesta de factores que pueden favorecer la alta incidencia de cáncer gástrico
de las zonas estudiadas en el país.
A + B + C + D + E + F – G
=>
Dispara la evolución a la
incidencia C.G (adenocarcinoma intestinal), gastritis, ulceras
Donde:
A: Factores asociados a la población (polimorfismos proinflamatorios, Lewis B)
B: Presencia de cepas patógenas de H pylori en el ambiente (por los pacientes).
carcinógeno tipo I de IARC.
C: Condiciones socioeconómicas de la población (no tan marcado entre las zonas)
D: Presencia de H. pylori en el agua de consumo de la población como dosis de
ingestión diaria
E: Manejo deficiente del agua en las zonas de alta incidencia
F: otro (s)
G: Factor protector
*en amarillo los factores específicos que podrían aumentar la incidencia.
Según la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA), una forma
común de expresar la exposición a cancerígenos y otros compuestos de incidencia
crónica es mediante el cálculo de la Dosis Diaria Promedio Vitalicia (DDPV), según
la Guía para la Evaluación de Riesgos “Superfund” de la EPA (on line), la cual se
expresa de la siguiente manera y se ilustra con un ejemplo:
Finalmente se muestra como este trabajo contribuye a la sociedad
costarricense con los siguientes nuevos hallazgos:
Técnicas optimizadas de cultivo para H. pylori de origen ambiental en medio
líquido con soporte de nitrocelulosa y como agar inclinado bifásico.
Optimización de técnicas moleculares para cepas ambientales de los
marcadores glmM (no determinado en cepas ambientales) y de la proteína
inductora del factor de necrosis tumoral alfa (Tipalpha FNT-α).
La obtención de cepas de H. pylori (2 secuenciadas) a partir de muestras
de agua de consumo humano de fuentes oficiales con y sin cloro residual,
lo que demostró la vulnerabilidad y el riesgo en el manejo de los
acueductos para las poblaciones de las zonas de mayor incidencia de
cáncer gástrico de Costa Rica.
Se comprobó la no correlación entre presencia de H. pylori y contaminación
fecal en las nacientes que abastecen los cantones de las zonas de alta
incidencia.
Se describieron por primera vez correlaciones importantes y significativas
entre incidencia de cáncer gástrico y altura, temperatura, origen del agua
como naciente y Ente Operador del Acueducto, lo que propone relacionar
de forma diferenciada, presencia de H. pylori de origen ambiental y alta
incidencia de cáncer gástrico.
8. Recomendaciones
La determinación en el agua de H. pylori es difícil, sin embargo si la misma
es requerida en agua potable, se sugiere la técnica de identificación
molecular por RT-PCR (PCR en tiempo real), con previa concentración de
la carga microbiana por filtración por membranas y posterior elusión para la
extracción del ADN; y en agua residual se hace imprescindible el uso de
anticuerpos inmunomagnéticos.
La población costarricense por la naturaleza de la alta carga orgánica de
sus aguas no debe de consumir agua (para considerarla como potable) con
menos de 0,5 mg/L de cloro residual, ésto debe ser adecuadamente
vigilado por las autoridades sanitarias para asegurarle la debida protección
a la población.
Lo anterior podría implicar que las municipalidades por la cantidad de
usuarios que manejan deben contratar este servicio de cloración a un ente
externo (se ha visto que la actividad es más eficiente, con respecto a que
sea la misma municipalidad quien se encargue de ésta).
Si son ASADAS son imprescindibles las políticas claras en cuanto al
manejo de su propio abastecimiento a la luz de sus necesidades
específicas, esto es, si tienen problemas de turbiedad deben tratarlos antes
del proceso de cloración, así como procedimientos adecuados de filtración
(tecnología FIME).
Se requiere la implementación de los Planes de Seguridad del Agua que
persiguen estrategias específicas de manejo llevadas a cabo por el Ente
Operador; que involucran la gestión completa del recurso hídrico y deben
prevalecer los parámetros de salud pública en torno al manejo del agua.
En una segunda parte de la investigación sería conveniente abordar el
aislamiento e identificación de cepas de H pylori en el suelo, y ampliar la
identificación y secuenciación de cepas aisladas del agua.
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Anexo 1|
Reglamento de Calidad de Agua de la Unión Europea.
Anexo 2
Reglamento de Calidad de Agua de República Dominicana- NORDOM
ANEXO 3
Protocolo de Lu y colaboradores para el cultivo de H. pylori a partir de
muestras de agua residual (Lu, et al, 2002).
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 2002, p. 1436–1439 Vol. 68, No. 3
Isolation and Genotyping of Helicobacter pylori from
Untreated Municipal Wastewater
Yingzhi Lu,1 Thomas E. Redlinger,1* Raquel Avitia,1 Adriana Galindo,1
and Karen Goodman2
The final protocol developed involved starting with an11-ml aliquot of the water
sample, which was analyzed for total fecal coliforms and Escherichia coli by the
U.S. Environmental Protection Agency-approved membrane filtration method (2).
The H. pylori isolation protocol developed utilized a 1-ml wastewater sample, which
was diluted 1:100 with sterile water and concentrated by vacuum filtration on a 2_m-pore-size nitrocellulose filter, eluted into tryptic soy broth containing
antibiotics (8 _g of vancomycin per ml, 0.2 _g of polymyxin per ml, 4 _g of
trimethoprim per ml; EM Science, Gibbstown, N.J.), and incubated at 37°C for 24 h
in a microaerophilic atmosphere using Bio-Bags (type Cfj; Becton Dickinson).
These enriched cultures were harvested and resuspended in phosphate-buffered
saline, pH 7.2 (PBS), for IMS. H. pylori control strains 26695, 60190, NCTC 11639,
and Tx30a (American Type Culture Collection, Manassas, Va.) were cultured on
Columbia agar plates containing 15% defibrinated sheep blood in the
microaerophilic atmosphere described above at 37°C for 3 to 5 days.
IMS. An important initial step was a concentration procedure by IMS of untreated
wastewater. This step not only selected for H. pylori based on immunological
properties but also eliminated contaminating substances that may interfere with
culturing. H. pylori immunomagnetic beads were prepared according to the
manufacturer’s instructions. Monoclonal mouse anti-H. pylori immunoglobulin G
(Fitzgerald Corp., Concord, Mass.) was gently agitated on a rotating tube inverter
(Dynal Corp., Oslo, Norway) with 5 ml of magnetic beads precoated with sheep
anti-rabbit immunoglobulin G (Dynabeads M-280; Dynal Corp.) for 24 h at 4°C.
After being washed, the beads were resuspended in 5 ml of PBS containing 0.1%
bovine serum albumin and stored at 4°C (6). Wastewater samples were mixed with
the prepared beads in the proportion of 1 ml to 20 _l and gently agitated as
described above for 1 h at 4°C. After being separated and washed in PBS, the
bead-H. pylori conjugates were streaked onto Columbia agar-blood agar plates
and incubated for 3 to 5 days under microaerophilic conditions at 37°C. Small, gray
colonies were selected and stained with Gram stain to verify morphology.
Colonies with gram-negative rods or coccoid forms were tested by three diagnostic
techniques: a rapid urease test (Christensen’s urea test; Remel Inc., Lenexa,
Kans.), cytochrome oxidase test (SpotTest Oxidase kit; Difco, Detroit, Mich.), and
catalase test (SpotTest Catalase kit; Difco). H. pylori must be gram negative and
positive for all three tests.
ANEXO 4
Preparación de anticuerpos inmunomagnéticos
Los beads de Dynal biotech son esferas de poliestireno uniformes, que miden 2.8 µm y
usando un concentrador magnético los beads permiten un aislamiento y subsecuente
manejo de las moléculas blanco de manera altamente específica.
Los beads son esferas superparamagnéticas con afinidad purificada unidos
covalentemente a la superficie de la esfera, estas esferas se suplen como una suspensión
conteniendo 6-7 x 10 8 esferas/ml (aprox 10 mg/ml), en PBS con 0.1 % de BSA y 0.02 de
azida de sodio. Estas deben precubrirse con anticuerpos inmunomagnéticos (Dynabeads
M 280® anticuerpos IgG de oveja anti conejo), en PBS con 0.1 % de BSA, todo esto se
lleva a cabo con la ayuda de un magneto o concentrador magnético. Los beads así
preparados se cubren con 3 µL de anti H pylori IgG policlonal de conejo que son los
anticuerpos de H pylori comprados a la casa Sygnet®.
Los beads son añadidos directamente a la muestra conteniendo el antigeno o anticuerpo,
después de un periodo corto de incubación permitiendo su captura por afinidad, los
beads son tirados a un lado por el uso del magneto permitiendo la aspiración del material
no pegado, se pueden usar también cuando la concentración del anticuerpo es baja o la
afinidad antigeno anticuerpo es débil o su cinética es lenta. La separación magnética
facilita los lavados fácilmente y la concentración de la molécula blanco puede ser eluida
de los beads con métodos de elusión convencionales.
Procedimiento de lavado:
-Los Beads M 280 deben ser lavados antes de su uso para remover el preservante. El
procedimiento del lavado es facilitado por el uso del magneto. Asegurarse de que los
beads están totalmente resuspendidos en una solución homogénea antes de su uso.
1- Resuspender los beads en el vial por vortex.
2- Transferir la cantidad requerida de los beads resuspendidos a un tubo.
3- Se pone el tubo en el magneto por 2 minutos y se pipetea el sobrenadante, evite tocar
las paredes del tubo donde los beads son atraídos al magneto con la pipeta.
4- Remover el tubo del magneto y resuspender el pellet en un volumen excesivo de buffer
de lavado.
5- Repetir el paso 3 de nuevo resuspenda los beads en buffer de lavado.
Recubrimiento de beads con Helicobacter:
-
Poner 3 µL de anti H pylori IgG policlonal de conejo con esferas de beads
magnéticos precubiertos con anti conejo IgG (Dynabeads M-280 Dynal) por 24
horas a 4 °C con agitación moderada.
-
Con ayuda del magneto los beads se dejan a un lado del vial.
-
Se enjuaga 3 veces con 1 ml de PBS conteniendo 0.1% de ( suero de albúmina
bovina BSA), por 30 minutos con buena agitación a 4 °C.
Después del tercer lavado los beads fueron resuspendidos en 0.5 ml de PBS
conteniendo 0.1 % de BSA y 0.02% de azida de sodio luego se almacenan a 4 °C.
Separación de la IgG blanco:
-
1- Resuspender los beads lavados por vortex .
2- Añadir la muestra conteniendo su blanco Ig a los beads lavados, aprox 0.1-1 µg Ig/107
beads pueden ser suficientes para el cruce.
3- Incubar con rotación inclinada lenta mezclando por 30 minutos o más hasta 24 horas
a 2- 8 °C.
4- Poner el tubo de prueba en el magneto por 2 minutos y pipetee afuera el sobrenadante.
5. Remover el tubo de prueba del magneto, añada el buffer de lavado y resuspenda.
6. Repetir los pasos 4 y 5 dos veces ponga el tubo en el magneto y remueva el
sobrenadante.
El IgG unido y purificado esta ahora listo para ser eluido fuera de los beads
Elusión del IgG aislado:
La elusión de la IgG fuera de los beads es en este ejemplo ejecutada bajando el pH
usando citrato 0.1 M ( pH de 2-3) como buffer de elusión. El grado de acidez necesaria
dependerá de la Ig especifica, pero a un pH dee 3.1 la mayoría serán eluidas.
1- Añadir citrato 0.1 M a los beads M-280 con la Ig inmobilizada.
2- Mezclar bien por rotación e inclinación por 2 minutos.
3- Poner el tubo de prueba en el magneto y transfiera el sobrenadante conteniendo el Ig
purificado a un tubo limpio.
4- De nuevo añadir citrato 0.1M a los beads para eluir cualquier remanente de Ig.
5- Mezclar bien por rotación e inclinación pro dos minutos.
6- Poner el tubo de prueba en el magneto pipete fuera el eluado y recoja el sobrenadante
conteniendo el Ig puro.
Los Dynabeads M-280 donde las Ig han sido eluidas pueden ser reusados al menos 5
veces. Para reusarlos después de eluidos los beads deberían ser inmediatamente
llevados a pH neutro usando un buffer de fosfato de sodio. Para almacenarlos los beads
deberían ser resuspendidos en una solución salina de PBS/BSA.
Una vez que los anticuerpos están preparados se mantienen en refrigeración hasta su
uso.
ANEXO 5
Alineamiento múltiple de cepas de H. pylori marcador glmM
MUESTRA 12
CLUSTAL 2.0.12 multiple sequence alignment
Shi248
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi1
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi62
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi329
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi170
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi417
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi46
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi73
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi193
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi439
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi117
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi30
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 246
Shi399
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAATTTTTCAATTCTTATGGGTATAAGCTCAAAGAA 246
GENOMA.51
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 360
JF32
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAACTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
JS01
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
JF79
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAACTTAAAGAA 282
JS12
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
JC5
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
JC1
AACCCTTTTGAAGATAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
JF50
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
JS05
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
PP5A1
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
PP08C2
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
GENOMA.v225d
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTCTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 360
PS224A1
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
PP25A1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTCAAAGAA 282
H.acinonychis.Sheeba
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 360
H.acinonychis.Mac
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 323
H.acinonychis.India
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTTAAAGAA 323
S29
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAGCTTAAAGAA 282
S3
AACCCTTTTGAAGATAATGGTATCAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
S19
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAGCTTAAAGAA 282
PP39A1
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATCAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
PP2B4
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATCAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
S57
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 281
PS55A1
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTCAAAGAA 282
S25
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATCAAGTTTTTCAATTCCTATGGTTATAAACTCAAAGAA 246
PS188A1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATCAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
PS118A1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATCAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
PP29B1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATCAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
PP46B1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATCAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
PS148C1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
PS56C
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
PP27B1
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
PP35B1
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
PS149A1
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
PS219A2
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
S14
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
S46
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 246
S31
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCCTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
PS234A
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
PP9B1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATCA-GTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 245
S5
AACCCTTTTGAAGATAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
S49
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTCAAAGAA 282
PS158A1
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
S22
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTCAAAGAA 282
PS184A1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAACTTAAAGAA 246
PS184A
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAACTTAAAGAA 282
PS56C1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAACTTAAAGAA 246
PS148C
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAACTTAAAGAA 282
JF80
AATCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAACTCAAAGAA 282
PP34B2
AATCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAACTCAAAGAA 282
PP3A1
AACCCTTTTGAAGATAATGGTATCAAGTTTTTCAATTCTTATGGTTATAAACTCAAAGAA 246
PP23A1
AACCCTTTTGAAGACAATGGCATTAAATTTTTCAATTCTTATGGTTATAAGCTTAAAGAA 282
PP01A1
AACCCTTTTGAAGACAATGGTATTAAGTTTTTCAATTCTTATGGCTATAAACTCAAAGAA 282
12
----------------------------------------TGGNTTATAAACTCAGATAN 20
216A
---------------------------------------------------------GAA 3
215A
---------------------------------------------------------GAA 3
224AUreC
---------------------------------------------------------GAA 3
029AUreC
---------------------------------------------------------GAA 3
168AUreC
---------------------------------------------------------GAA 3
045A.UreC
038A.UreC
046A.UreC
170AUreC
158A.UreC
227A26.UreC
163A.UreC
210AUreC
031A.UreC
035A.UreC
231A.UreC
030A.UreC
180A.UreC
188A.UreC
232AUreC
146A.UreC
148A.UreC
157A.UreC
156A.UreC
203A17.UreC
099A.UreC
161A.UreC
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215A
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MUESTRA 25
CLUSTAL 2.0.12 multiple sequence alignment
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