AGENDA Curso Micro_A4
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ula ientífica CURSO TEÓRICO – PRÁCTICO DE VALIDACIÓN ula DE MÉTODOS ientífica MICROBIOLOGICOS Dra. Estefania Escartin [email protected] Directora Técnica SPM Controler Jordina Faurat [email protected] Responsable de la Unidad de Garantía de Calidad. Laboratorios de Sanidad Animal del DAAM PROGRAMA PROGRAMA PRIMER DÍA 09:00-09:30 09:00 09:30 Bienvenida ula ientífica 09:30-10:30 Concepto de validación. Planificación y diseño experimental: métodos microbiológicos de aguas (NMP+ FM), requisitos normativos (7/2006/CEE, RD 140/2003, ISO 17025) medios de cultivo (tradicionales y cromogénicos), cepas y materiales de referencia (cualitativas y cuantitativas: crioviales, lentículas, bioball). 10:30-11:00 Pausa 11:00 14:30 Práctica: Explicación práctica del ensayo: 11:00-14:30 •Preparación del MRC: explicación mediante video con crioviales y lentículas. • Explicación siembra muestra agua potable por NMP (Colilert y enterolert) •Explicación siembra con muestra de agua de mar FM •Desarrollo del ensayo en el laboratorio: •Práctica de preparación e inoculación de la muestra y del MRC. Desarrollo del método (NMP y filtración por membrana). Incubación. 1 ula ientífica PROGRAMA PROGRAMA SEGUNDO DÍA 09:0009:00 10:30 Expresión y evaluación de los resultados en análisis microbiológicos. 10:30-11:00 Pausa ula ientífica 11:00- 13:00 Validación de métodos cuantitativos (exactitud, precisión, sensibilidad y especificidad) 13:00-14:00 Práctica de lectura de placas y confirmación bioquímica. De los parámetros de lectura a las 24± 2 horas de los dos métodos. PROGRAMA PROGRAMA TERCER DÍA 09:00-10:30 Cálculo incertidumbres (concepto y estimación de incertidumbre, expresión de resultados en el informe de análisis). Aseguramiento de la calidad de los resultados (actividades de control, evaluación de resultados y gráficos de control). 10:30-11:00 Pausa ula ientífica 11:00-13:30 Práctica de recuento y confirmación bioquímica de parámetros de lectura a las 48± 2 horas de los dos métodos. Acabar con la confirmación bioquímica del día anterior. 13:30- 14:00 Exposición de resultados por grupos. 14:00 -14:30 Clausura y entrega de certificados 2 ula ientífica CONCEPTOS GENERALES ula MICROBIOLOGÍA ientífica 5 INTRODUCCIÓN La realización de análisis de control microbiológico es una herramienta que tiene una repercusión decisiva en el ámbito de la salud pública, la tecnología alimentaria y el Medio Ambiente. ula ientífica Los laboratorios que realizan análisis de control microbiológico deben utilizar métodos de ensayo que aseguren la fiabilidad de los resultados. Los métodos de ensayo utilizados: Han H de d reunir i los l criterios it i técnicos té i que aseguren su validez lid Han de poder ser reproducibles Han de ser realizados con una serie de garantías que permitan obtener resultados comparables con independencia del laboratorio que los ejecute. 6 3 ula ientífica CONCEPTO DE VALIDACIÓN ISO 17025 punto 5.4.5.1 La validación es la confirmación mediante examen y la aportación de evidencias objetivas que demuestren el cumplimiento de ciertos requisitos para el uso específico previsto ISO/TR 13843:2000 ula ientífica Proceso que nos proporciona la evidencia de que un método es capaz de servir al propósito para el que ha sido diseñado, diseñado es decir, en el caso de los métodos microbiológicos, para detectar o cuantificar un determinado microorganismo o grupo de microorganismos con unas adecuadas sensibilidad y especificidad o precisión y exactitud. 7 REQUISITOS NORMATIVOS g Existe la obligación de validar métodos. ula ientífica ISO 17025 5.4.5.2. “El laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos diseñados/desarrollados internamente, los métodos normalizados utilizados fuera de su campo de aplicación previsto, y las ampliaciones y modificaciones de métodos normalizados, con el fin de comprobar que son apropiados para el uso previsto. previsto ” ISO 17025 5.4.2 “El laboratorio debe confirmar que puede realizar correctamente los métodos normalizados antes de efectuar los ensayos.” 8 4 ula ientífica REQUISITOS NORMATIVOS G-ENAC-04 Rev.3 “Los laboratorios deben mantener los datos sobre de b validación lid ió de d los l sistemas i t d ensayo comerciales i l (Kits) (Kit ) que utilicen. Si no se dispone de datos sobre validación o si estos no son plenamente aplicables, el laboratorio será responsable de completar la validación del método”. ula ientífica Verificación periódica – Aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo Incluso cuando se haya realizado la validación, el laboratorio tendrá que verificar periódicamente que se cumplan los parámetros documentados (comprobar que siguen satisfaciendo los requisitos establecidos). El aseguramiento de la calidad debe ser tanto interno como externo (intercomparaciones) 9 REQUISITOS NORMATIVOS G-ENAC-04 Rev.3 La validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo. ensayo NT 32 Rev.1 y Rev.2 – Actividades de Validación ula ientífica El laboratorio debe justificar la selección del número y tipo de matrices en función del alcance de acreditación. Las actividades de validación deben realizarse sobre muestras naturales o, en su defecto, con muestras inoculadas, preferiblemente no esterilizadas para que exista microbiota interferente. Si se considera necesario investigar la influencia de la microbiota acompañante interferente a concentraciones superiores o muy superiores al microrganismo diana, se deberá inocular la muestra con diversas cepas de especies distintas a la diana a esas concentraciones. Para demostrar que una versión modificada de un método cumple las mismas especificaciones que el método original, deben realizarse comparaciones utilizando replicados. El diseño experimental y el análisis de los resultados tienen que ser estadísticamente válidos. 10 5 ula ientífica SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO ISO 17025:2005 Apartado 5.4.2 “El laboratorio debe utilizar métodos de ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y sean apropiados para el uso previsto” ula ientífica debe tenerse en cuenta el ámbito de aplicación Requisitos RD 140/2003 y Directiva 2006/7/CE “ cuando el cliente no especifique p q el método a utilizar,, el laboratorio debe seleccionar los métodos apropiados que hayan sido publicados en normas internacionales, regionales o nacionales, por organizaciones técnicas reconocidas o en libros o revistas científicas especializadas o especificados por el fabricante de equipos” En caso de elegir un procedimiento de ensayo interno, se aconseja que se parta de métodos de referencia que sean ampliamente aceptados, conocidos y 11 aplicados en el sector SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO Requisitos RD/140/2003 ula ientífica 12 6 ula ientífica SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO Requisitos RD/140/2003 ula ientífica 13 SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO Requisitos RD/140/2003 ula ientífica 14 7 ula ientífica SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO ula ientífica Sin perjuicio de lo dispuesto en el Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero, por el que se establecen los criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano, y como alternativos al método descrito en la parte A de su anexo IV, se podrán utilizar, asimismo, los métodos incluidos en el anexo de esta orden, para el análisis microbiológico de los parámetros: «bacterias coliformes» y «Escherichia coli». 15 SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO Parte B. Método de detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli en aguas de consumo por filtración de membrana utilizando agar cromogénico para coliformes (ACC). ula ientífica En el estudio de equivalencia se empleó el medio Chromocult Coliform Agar, fabricado por la casa comercial Merck. Parte C. C Método de detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli en aguas de consumo por el NMP (número más probable) en medio líquido utilizando la tecnología del sustrato definido® (DST). En el estudio de equivalencia se empleó la placa Quanti-Tray® de 51 pocillos y el sustrato definido Colilert 18®. 8 ula ientífica SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO ula ientífica 17 SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO ula ientífica 18 9 ula ientífica PROCESO DE VALIDACIÓN Planificación ula ientífica Diseño experimental Desarrollo práctico Evaluación de los resultados Informe de validación 19 PLANIFICACIÓN DE LA VALIDACIÓN Definir las responsabilidades: Relación de las personas que llevaran a cabo la validación y del responsable de su evaluación y aprobación. aprobación Éstos deberán tener una cualificación adecuada. Definir el método a validar; analito, técnica, matrices.... Ha de existir un documento (PNT) que describa con el suficiente grado de detalle el procedimiento a seguir para asegurar su correcta realización y su repetibilidad Definir el procedimiento de validación a seguir y los registros que sean necesarios. Todos los datos primarios han de poder ser auditables. Definir los objetivos y los requisitos que solicitamos al método, identificar los parámetros de validación a estudiar y definir sus criterios de aceptación. Identificar las cepas y materiales de referencia, que se utilizaran. ula ientífica 20 10 ula ientífica DISEÑO EXPERIMENTAL Una vez definidos los parámetros a estudiar es necesario detallar como se llevará a cabo este estudio; que muestras se utilizaran, ula ientífica como se prepararan las muestras contaminadas artificialmente, que microorganismos que puedan interferir se estudiarán cuantas muestras se utilizaran cuantas repeticiones se realizaran a partir de que dilución se sembrara muestra,........ 21 EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS Una vez realizadas las pruebas y experimentos establecidos (desarrollo practico) se realizaran los cálculos pertinentes para determinar los parámetros de validación y se evaluaran los resultados obtenidos. ula ientífica Se comprobará que los resultados cumplen los criterios de aceptación establecidos previamente, en caso contrario cuando los resultados difieren de lo esperado se estudiara la posibilidad de realizar una modificación (del método o de los requisitos establecidos) y se indicaran las razones que la justifican. 22 11 ula ientífica INFORME DE VALIDACIÓN Finalmente, una vez concluido todo el proceso de validación se emitirá un informe o p por las p personas responsables. certificado de validación firmado p El contenido del informe de validación puede ser: ula ientífica Declaración formal sobre la idoneidad del método para el uso que se pretende hacer del mismo. Planificación: Responsabilidades, objetivos y requisitos del método. Resultados obtenidos y su evaluación. Fechas de inicio y final de la validación. Id tifi Identificación ió de d los l patrones t y/o / materiales t i l de d referencia f i utilizados tili d Identificación de todos los registros relacionados con el proceso de validación, todo el proceso ha de poder ser auditable, incluido el procedimiento de validación utilizado. Todos los registros relacionados con el proceso de validación deben incluir fechas, personal, patrones y/o materiales de referencia y equipos utilizados de manera que puedan ser reproducibles. CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA Cepas de referencia: Microorganismos definidos por lo menos al nivel del genero y especie, catalogados y descritos según sus características y preferiblemente de origen conocido. conocido [ISO:11133-1:2000] Material de referencia: Material o sustancia uno o más de cuyas propiedades tienen valores suficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder ser utilizados en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medida o la asignación de valores a materiales. (Guía ISO 30:1992) Material de referencia certificado: Material de referencia, acompañado de un certificado, en el cual uno o más valores de sus propiedades han sido certificados mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en que se expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente. (Guía ISO 30:1992). ula ientífica 12 ula ientífica CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA Cepas de referencia: cultivo procedente de una colección nacional o internacional reconocida. Garantizan identidad del microorganismo pero no cantidad. id d ula ientífica CECT: Colección Española de Cultivos Tipo. ECCO: European Culture Collection Organization. ATCC: American Type Culture Collection. WDCM (World Data Centre for Microbiology) Control de calidad de los medios de cultivo. cultivo Utilizadas para Validar métodos Evaluar la calidad de los resultados CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA Cepas de referencia: ula ientífica 13 ula ientífica CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA Material de referencia certificado: muestras que tienen un valor conocido y certificado de un numero concreto de microorganismos de un determinado tipo, obtenido mediante la aplicación de un determinado método. ula ientífica Validar métodos. Utilizados para Evaluar la calidad de los resultados CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA Material de referencia: ula ientífica 14 ula ientífica CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA Material de referencia certificado ula ientífica CEPAS Y MATERIALES DE REFERENCIA Material de referencia certificado ula ientífica 15 ula ientífica CEPAS DE REFERENCIA G-ENAC-04 (rev.3) Para demostrar la trazabilidad, el laboratorio debe utilizar cepas de referencia de microorganismos obtenidos de una colección nacional o internacional reconocida. ula ientífica ... se reconstruirían y someterán a los controles de pureza y ensayos bioquímicos que sean necesarios. Serán subcultivadas una sola vez para obtener las cepas de reserva, de las que se obtendrán las cepas de trabajo …las cepas de reserva deben conservarse utilizando una técnica que mantenga t l características las t í ti d deseadas d .... (ultracongeladas ( lt l d o liofilizadas). li fili d ) Si las cepas de reserva se han descongelado, no deben volver a congelarse y reutilizarse Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas para sustituir las cepas de reserva. Se conservaran en refrigeración CEPAS DE REFERENCIA CEPA DE REFERENCIA “cultivo de microorganismo obtenido de una colección nacional o internacional reconocida” Control de pureza y ensayos bioquímicos Reconstitución (subcultivada una sola vez) CEPA DE RESERVA ula ientífica NO tienen determinada ninguna carga de microorganismos: se considera un carga inicial de 108 CEPA DE RESERVA CEPA DE RESERVA “cultivos de referencia mantenidos por un laboratorio” Descongelación/Reconstitución (subcultivada una sola vez) CEPA DE TRABAJO CEPA DE TRABAJO Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento Control de pureza y ensayos bioquímicos CEPA DE TRABAJO CEPA DE TRABAJO “subcultivos de microorganismos derivados de las cepas de reserva para ser utilizados en las operaciones del día a día” Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento Es obligatorio su uso para el control de calidad de medios de cultivo Se pueden usar para la: Validación de métodos y la evaluación de la calidad de los ensayos 16 ula ientífica CEPAS DE REFERENCIA Anexo B de la norma ISO 11133-1: Conservación y mantenimiento de cepas Conservación CEPA DE REFERENCIA ula ientífica Liofilización (asegurar su viabilidad y evitar que cambien) CEPA DE RESERVA CULTIVO DE RESERVA Controles Liofilización, Congelación –24ºC, 2-3 años Congelación a –70ºC , 5 años Nitrógeno g líquido q A temperatura adecuada (de 18ºC a 25ºC o de 2ºC a 8ºC), 1 mes Control de pureza Ensayos bioquímicos Control de pureza Ensayos bioquímicos Control de pureza CULTIVO DE TRABAJO ESTANDARIZACIÓN DE SUSPENSIONES BACTERIANAS Para el control de calidad de los medios de cultivo, y para la validación de métodos ((muestras contaminadas artificialmente)) es necesario disponer p de cepas estandarizadas de microorganismos. ula ientífica La manera mas fácil de estandarizar una suspensión de microorganismos es por determinación de la turbidez en un espectrofotómetro o por comparación con la escala Mc Farland. Siempre que se prepare la Si l suspensión ió de d un mismo i microorganismo i i en un mismo medio y a la misma turbidez medida a una longitud de onda aproximada, se obtendrá aproximadamente el mismo número de microorganismos. 17 ula ientífica ESTANDARIZACIÓN DE SUSPENSIONES BACTERIANAS Encontrar la relación entre la transmitancia y el número del recuento de microorganismos. microorganismos ula ientífica PREPARACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN ESTANDARIZADA Sembrar el microorganismo en un tubo de agar de triptona-soja inclinado y incubar entre 30-35 ºC durante 24 horas. Realizaremos 10 suspensiones de Staphylococcus aureus en agua de peptona 0.1%. La ajustamos al 70% de transmisión en un espectrofotómetro regulado a una longitud de onda de 580nm. Si la lectura es superior al 70%, recoger más crecimiento y si es inferior, diluir la suspensión con agua de peptona. La suspensión así preparada contiene aproximadamente 108 ufc/mL. Diluimos hasta obtener la dilución 10-6 y realizamos el recuento de viables (por duplicado) de cada suspensión. ula ientífica EXPRESIÓN Y EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS DE RESULTADOS 18 ula ientífica EXPRESIÓN DE RESULTADOS ISO 7218:2008 MÉTODOS DE DETECCIÓN Y RECUENTO Recuento en placa Recuento en medio líquido ula ientífica Método de cálculo Método general Método posterior a la identificación Método NMP Nº de microorganismos N por (mililitro o gramo) 2 dos cifras significativas Criterio C it i de d redondeo: d d Si la ultima cifra es < 5 redondear a la baja Si es > 5 redondear a la alta NMP de microorganismos por gramo o mililitro Preferiblemente se expresará como: a x 10b ufc/g o ml a = numero entre 1,0 y 9,9 b= potencia de 10 adecuada EXPRESIÓN DE RESULTADOS Métodos de investigación g Detección ula ientífica Presencia o ausencia en volumen de muestra ensayada 19 ula ientífica CÁLCULO DE RESULTADOS ISO 81992:2008 Condiciones generales: ula ientífica número total de colonias entre 10 y 200 por filtro número de colonias típicas entre 10 y 100 por filtro Número de colonias sospechosas inoculadas pera su identificación o confirmación de cada filtro: 5 CÁLCULO DE RESULTADOS ISO 81992:2008, apdo. 8.4.2. Cálculo de resultados. Caso general Una de las p placas debe contener un mínimo de 10 colonias ((totales,, típicas p oq que cumplan p los criterios de identificación, según proceda) Cs = ula ientífica Z × Vs Vtot Cs es el número estimado de ufc en el volumen de referencia de la muestras Vs Z es la suma de todas las colonias contadas sobre las placas o membranas derivadas de las diluciones d1 d1, d2 d2, …, di o derivadas de volúmenes independientes de la porción de ensayo (muestra o dilución) Vs es el volumen de referencia seleccionado para expresar la concentración de microorganismos de la muestra 20 ula ientífica CÁLCULO DE RESULTADOS Vtot es el volumen total calculado de la muestra de origen inoculado en las p membranas contadas. Es la suma de los volúmenes separados de la p porción de ensayo (muestra o dilución) o bien, se calcula a partir de la ecuación: ula ientífica Vtot = (n1·V1·d1) + (n2·V2·d2) + ... + (ni·Vi·di) donde n1, n2, ... , ni es el número de placas contadas para las diluciones d1, d2, …, di V1, V2, …,, Vi es el volumen de ensayo y utilizado en las diluciones d1, d2, …,, di d1, d2, …, di es la dilución utilizada para el volumen de ensayo V1, V2, …, Vi (d=1 para la muestra inicial, d=0.1 para la dilución 1/10, etc …) 41 CÁLCULO DE RESULTADOS Ejercicio 1: Filtramos 100 y 10 ml de muestra por duplicado y obtenemos los siguientes resultados: • • 100 ml: 66 y 80 ufc/placa 10 ml: 4 y 7 ufc/placa ula ientífica Calcular y expresar los resultados de la muestra ensayada. 21 ula ientífica CÁLCULO DE RESULTADOS ISO 81992:2008. Método de cálculo: después de la identificación Se identifica un número determinado n de colonias sospechosas (mínimo 5) Tras la confirmación, se calcula para cada una de las placas la proporción de colonias presuntivas que cumplen los criterios de confirmación x= x ula ientífica k ×z n es el número estimado de colonias confirmadas por placa k es ell número ú d de colonias l i que cumplen l llos criterios it i d de confirmación fi ió entre t llas colonias l i sembradas n n es el número de colonias positivas presuntivas sembradas para confirmar z es el número total de colonias positivas presuntivas contadas en la placa. No se deben redondear los resultados confirmados x. En la fórmula del método general remplazar Z por X =∑ x. CÁLCULO DE RESULTADOS Ejercicio 2 : Filtramos 100 y 10 ml de muestra por duplicado y obtenemos los siguientes resultados: 100 ml: 66 y 80 ufc/placa 10 ml: 4 y 7 ufc/placa ula ientífica De las 66 colonias, se confirman 5, de las cuales 4 cumplieron los criterios. De las 80 colonias, se confirman 5, de las cuales 3 cumplieron los criterios. De las 7 colonias, se confirman 5, de las cuales 4 cumplieron los criterios. De las 4 colonias colonias, se confirman 4 4, de las cuales 4 cumplieron los criterios criterios. Calcular y expresar los resultados de la muestra ensayada. 22 ula ientífica CÁLCULO DE RESULTADOS ISO 81992:2008. Método de cálculo: casos especiales Todas las placas contienen menos de 10 colonias ula ientífica Para recuentos inferiores a 10 colonias la precisión disminuye ISO/TR 13843: Límite de determinación: concentración media más baja de partículas ,“x” ,por porción analítica para la que la incertidumbre estándar relativa (RSD) esperada sea igual a un valor especificado. Para una distribución de Poisson, x se calcula mediante la siguiente ecuación: x= 1 (w)2 donde W = RSD Se considera un límite de precisión relativa aceptable cuando la RSD=0.5 El límite inferior de determinación corresponde a 4 colonias (x = 4, cuando w=0.5) CÁLCULO DE RESULTADOS ISO 81992:2008. Método de cálculo: casos especiales ula ientífica A) Si todas las placas contienen menos de 10 colonias, pero el número total de colonias en todas las placas disponibles es mayor o igual a 4, el resultado se calcula como en el caso general. N número estimado de microorganismos por V filtrado. B) Si el resultado total está entre 1 y 3, la precisión es tan baja que se informa del resultado lt d como detectado d t t d en ell volumen l analizado. li d Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a (4 x d ) por V filtrado. 23 ula ientífica CÁLCULO DE RESULTADOS ISO 81992:2008. Método de cálculo: casos especiales p ula ientífica Ninguna placa contenga colonias < 1/Vtot ufc por volumen de muestra o “cero” en el volumen de muestra analizado. Más de 100 colonias típicas > 100/di ufc por volumen de muestra analizado, siendo di la mayor de las diluciones realizadas. CÁLCULO DE RESULTADOS Ejemplo 3: Si hemos filtrado 100 ml de la muestra inicial y contamos 2 ula ientífica Ejemplo 4: Si hemos filtrado 100 ml de la muestra inicial y contamos >100 colonias típica y menos de 200 en total ¿Como se expresaran los resultados del ensayo? 24 ula ientífica CONCEPTOS ula ESTADÍSTICOS BÁSICOS ientífica VARIABLES ESTADISTICAS Los resultados de los experimentos analíticos son variables aleatorias. Cualitativas Variables aleatorias Cuantitativas ula ientífica Continuas; puede tomar cualquier valor dentro de un intervalo Discretas; solo puede tomar valores enteros Los resultados de los recuentos microbiológicos son variables aleatorias discreta, es decir, números enteros. 50 25 ula ientífica DISTRIBUCIONES DE PROBABILIDAD Distribución binomial; se cumple cuando la concentración de g y elevada microorganismos es muy Variables discretas Distribución binomial negativa; se describe como una distribución de agrupamiento o sobredispersión. La distribución de los microorganismos en la naturaleza se ajusta a este tipo de distribución. ula ientífica Distribución de Poisson; se describe como una distribución espacial totalmente aleatoria de los elementos que la forman, no existe ningún tipo de interferencia entre ellos. Este modelo se cumple cuando se consigue una homogeneización perfecta. Distribución normal; se conoce la varianza de la población Variables continuas Distribución t de Student; cuando se estima la varianza de la población. Cuando el número de valores es superior a 30 esta distribución se aproxima a la normal. 51 TRANSFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS La estimación del valor medio y de la varianza de la población a partir de la media aritmética y la desviación estándar respectivamente, respectivamente es propio de variables aleatorias continuas que siguen una distribución normal. ula ientífica El objetivo de la utilización de la estadística en la validación de métodos es poder hacer comparaciones de los datos obtenidos, para poder evaluar si las diferencias entre los resultados obtenidos y los resultados de referencia son significativas o si se pueden justificar sólo por variaciones aleatorias. Para ello se utilizaran las pruebas de significación o test de hipótesis, los cuales requieren para su aplicación que dichos datos sigan una distribución normal. 26 ula ientífica TRANSFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS Para poder utilizar toda la teoría relacionada con la ley normal es necesario realizar las siguientes transformaciones de los resultados de los recuentos (X). ula ientífica log x cuando no existan resultados nulos log (x+1) cuando existan resultados nulos Una vez aplicados los cálculos estadísticos es necesario volver a transformar el resultado final para llegar a las conclusiones, y que éstas se expresen en el mismo tipo de variable que los datos iniciales. VALIDACIÓN MÉTODOS ula CUANTITATIVOS ientífica 27 ula ientífica COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO MÉTODOS CUANTITATIVOS NT-32 Rev.2 Métodos normalizados (métodos de referencia). Tipo I ula ientífica Métodos alternativos (métodos que han sido validados). Tipo II (disponer de evidencias de su validación) Métodos basados en métodos de referencia. Tipo III ISO17025 “el laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos” 55 COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO MÉTODOS CUANTITATIVOS Métodos Mét d Tipo Ti I, I Tipo Ti II y Tipo Ti III ula ientífica Se han de determinar las características de funcionamiento del método en el propio laboratorio y verificar que cumplan los criterios establecidos. Recuperación (exactitud- veracidad) Reproducibilidad (precisión) 56 28 ula ientífica PRECISIÓN Precisión proximidad entre resultados de mediciones independientes del mismo mesurando. (ISO 5725) ula ientífica 57 PRECISIÓN Y EXACTITUD Veracidad g grado de concordancia entre el p promedio de una serie de mediciones y el valor del mesurando. (ISO 5725) ula ientífica SESGO % RECUPERACIÓN 58 29 ula ientífica EXACTITUD Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado de d una medición di ió y ell valor l de d referencia f i aceptado. t d PRECISIÓN ula ientífica + VERICIDAD 59 EXACTITUD ula ientífica 60 30 ula ientífica COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO MÉTODOS CUANTITATIVOS Tipo y nº de matrices ti Nivel de contaminación ula ientífica Muestras naturales contaminadas Muestras naturales contaminadas artificialmente Intervalo de trabajo 61 CLASIFICACIÓN DE MATRICES i) ii) iii) iv) v) Aguas A tratadas t t d (consumo, ( piscina, i i …)) Aguas no tratadas (río, pozo, …) Aguas de mar Aguas residuales o reutilizadas … ula ientífica 62 31 ula ientífica COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO MÉTODOS CUANTITATIVOS El intervalo de trabajo de un método es el intervalo de concentración e e se u a e act tud y p ec s ó adecuadas a en e el que puede obte obtenerse una exactitud precisión al objetivo del método. ula ientífica NT 32 rev.1: En los métodos microbiológicos se tiene que tener en cuenta que independientemente del nivel de contaminación de la muestra, mediante diluciones seriadas siempre se realiza un recuento en placa dentro de un intervalo de medida establecido (por ejemplo de 10 a 200 ufc/placa f / l o de d 10 a 100 ufc/placa, f / l según ú ISO 81992:2008). 81992 2008) El estudio se considera adecuado realizarlo en el intervalo de medida en el que se lleva a cabo el recuento en placa. 63 COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado de una medición y el valor de referencia aceptado. (ISO3534-1) ula ientífica El valor de referencia se puede obtener a partir de: Materiales microbiológicos de referencia certificados Muestras de referencia (muestras procedentes de ejercicios interlaboratorio con un valor asignado para los microorganismos analizados). Muestras analizadas con métodos de referencia. referencia Cepas de referencia procedentes de colecciones de cultivo tipo, con las que se pueden preparar muestras contaminadas artificialmente Es necesario disponer de un número mínimo de valores de referencia que asegure la exactitud en todo el rango de medida. 64 32 ula ientífica COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD Método de cálculo: puede expresarse matemáticamente a partir de la recuperación. ula ientífica Recuperación = Valor de ensayo / Valor de referencia Recuperación p = 10 (X-Xref) ((siendo X valores en unidades logarítmicas) g ) 65 COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD Inocular una muestra natural que no contenga el microorganismo a ensayar Ensayar la muestra inoculada según el procedimiento de ensayo (óptimo 10 resultados) ula ientífica Simultáneamente determinar la cantidad de inóculo mediante siembra en PCA e incubación a 37ºC durante 24 horas (óptimo 10 replicados) Transformar los resultados en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) Calcular el valor medio de cada conjunto de resultados x = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidos con el método a controlar xref = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidos con PCA Calcular el % de recuperación =100 x 10(x-xref) 33 ula ientífica Ejercicio 1: Inoculación de muestras Para calcular y evaluar la recuperación del método de coliformes es p necesario inocular una muestra de leche,, a p partir de una suspensión de E.coli (ATCC 25922). ula ientífica El nivel de inoculación requerido es de 150 ufc/ml. • ¿Como prepararíamos el inoculo? •¿Como ¿Como obtendríamos el valor del inoculo? •¿Cómo calcularíamos la recuperación? • Si el fabricante establece una productividad superior al 80 %, ¿Qué valor de recuperación podríamos esperar? COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD Preparación de inóculos 108 1ufc/ml ml 1 ml 9 ml 1 ml 9 ml 103 ufc/ml 1 ml 9 ml 10-1 ula ientífica 1 ml 9 ml 10-2 9 ml 10-3 10-4 Resultados placa 122 140 Resultado suspensión 10-5 100 µl 110 ufc/100 µl 1240 ufc/ml 34 ula ientífica Ejercicio 1: Inoculación de muestras p p q Si la suspensión 10-5 es del orden de 1240 ufc/ml. Suponemos que la suspensión 10-4 es del orden de 12400 ufc/ml . ula ientífica • Para contaminar 10 ml de leche a un nivel de 150 ufc/ml necesitamos 1240 1 150 X = 1,20 ml de la suspensión x 10-5 o 120 µl de la suspensión 10-4 COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO EXACTITUD Inoculación de muestras 120 µl 9 ml 120 µ µl 104 ufc/ml ula ientífica 10 ml 120 µl 10 ml PCA Medio selectivo 35 ula ientífica Ejercicio 2: Estudio de la recuperación de un método de recuento Determinar la recuperación del procedimiento de ensayo PNT-E-24 analizando 10 veces una muestra inoculada con una cepa de referencia. referencia El valor del inoculo se determina a partir de la siembra en PCA. ula ientífica PCA PNT-E-24 1 40 42 2 36 42 3 39 40 4 42 36 5 36 39 6 36 34 7 39 36 8 44 41 9 39 39 10 36 38 COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN Grado de concordancia entre ensayos independientes obtenidos bajo unas condiciones establecidas. establecidas (ISO 3534-1) 3534 1) ula ientífica NOTA: La precisión depende sólo de la distribución de errores aleatorios y no tienen ninguna relación con el valor verdadero o el valor especificado.(ISO 5725-1, 3.12:94) (ISO 35341,3.14:83) Repetibilidad. Reproducibilidad. Precisión intermedia. 72 36 ula ientífica COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN Condiciones de repetibilidad: No se varia ningún factor, mismo día, mismo instrumento, mismo analista. ula ientífica Condiciones de reproducibilidad: Se varían todos los factores, diferente día, diferente analista, diferente laboratorio, etc. Condiciones de precisión intermedia (reproducibilidad intralaboratorio): Dentro del mismo laboratorio se varia uno o varios factores, por ejemplo distinto día, distinto analista. 73 COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN La precisión suele expresarse como imprecisión y calcularse como desviación d i ió estándar tá d de d los l resultados lt d de d los l ensayos. Cuanto C t mayores la desviación estándar menor es la precisión. ula ientífica Sr (desviación estándar de repetibilidad) SR( desviación estándar de reproducibilidad) 74 37 ula ientífica COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN Se realizará el estudio de precisión intermedia del laboratorio en el intervalo de medida en el que se lleva a cabo el recuento en placa y preferiblemente sobre muestras naturales o, en su defecto con muestras inoculadas. ula ientífica La reproducibilidad se expresará a partir de la desviación estándar de reproducibilidad y ésta se determinará para clase de matriz y especie de microorganismo (o grupo de microorganismo) objeto del ensayo. El laboratorio debe justificar la selección del número y tipo de matrices en función del alcance de la acreditación. (Anexo B UNE-EN ISO16140). 75 COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN Procedimiento 19036:2006) para cada clase de matriz a validar: (ISO/TS ula ientífica • 10 muestras contaminadas naturalmente o inoculadas • Ensayar cada muestra por duplicado incluyendo entre ellas la máxima variación posible dentro del laboratorio; distinta submuestra, b t di ti t analista, distinto li t distinto di ti t lote l t de d medio, di distinto di ti t pH H metro, y/o los equipos utilizados según la forma de trabajo del laboratorio. 76 38 ula ientífica COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN Muestra ula ientífica Analista 1 (condición A) Suspensión inicial Analista 2 (condición B) Contaminación artificial (si es necesario) Suspensión inicial Análisis Análisis 77 COMPROBACIÓN DE FUNCIONAMIENTO PRECISIÓN Cálculo de la desviación estándar de reproducibilidad: Transformar los resultados a (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml)) Calcular la desviación estándar según la siguiente fórmula: SR = ula ientífica 2 1 n ( yiA − YiB ) ∑ n i =1 2 ij el resultado transformado en (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml)) i el índice de la muestra i=1 hasta 10 j el índice de las condiciones de reproducibilidad j= A o B Por ejemplo; y1A resultado de la muestra 1 bajo las condiciones A La desviación estándar se expresará en unidades de (log10(ufg/g)) o (log10(ufg/ml)) Evaluación del resultado: comparar el resultado obtenido con el criterio de aceptación / rechazo establecido para el método según la legislación, norma, requisito 78 del cliente,… 39 ula ientífica Ejercicio 3: Determinación de la reproducibilidad Se analizan 10 muestras de rutina por duplicado introduciendo la máxima variación posible; distinta submuestra, distinto analista, distinto lote de medio, distinto incubador, incubador etc. etc y se obtienen los siguientes resultados. resultados ula ientífica X1 (ufc/g) X2(ufc/g) M1 78 85 M2 68 M3 48 M4 65 M5 72 M6 58 M7 72 68 M8 65 72 M9 56 61 M10 68 74 59 52 62 69 64 Calcular la reproducibilidad de laboratorio y verificar que cumple con el criterio de aceptación/rechazo (límite de reproducibilidad R=0.45 en unidades de log 10) 79 VALIDACIÓN DE MODIFICACIONES Validación de una modificación al método por comparación con el método de referencia ula ientífica Objetivo; demostrar estadísticamente que el resultado obtenido con el modificación no difieren significativamente del resultado del método de referencia. Dos opciones: A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método de referencia y con el método modificado. B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método de referencia y simultáneamente con el método modificado 80 40 ula ientífica VALIDACIÓN DE MODIFICACIONES Opción A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método de referencia y con el método alternativo. Método de la diferencia media ula ientífica Ensayar distintas muestras (mínimo 10 de cada tipo de matriz) simultáneamente con el método de referencia y con el método alternativo. Transformar los resultados de recuento a validar a logaritmo (log10(ufc/g o ml) Calcular la diferencia para cada par de valores correspondientes. Calcular el valor medio (d) y la desviación típica (Sd) del conjunto de diferencias. Recuperación relativa= (10d) Prueba de Hipótesis; Ho : d= 0 t cal = d Sd n Si tcal < t n-1,α=0,05 no hay diferencias significativas 81 Ejercicio 4: Validación de una modificación Se utiliza un método de rutina PNT-E-010 basado en norma al cual se han modificado las condiciones de incubación; verificar que no hay diferencias significativas. ula ientífica Opción A) A partir de distintas muestras analizadas simultáneamente con el método de referencia y con el método modificado. Ref. muestra M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 PNT-E-10 5,20E+02 1,85E+02 6,50E+03 2,39E+03 2,43E+04 1,89E+05 3,80E+01 2,11E+03 1,50E+05 2,28E+03 Norma 4,50E+02 1,52E+02 7,00E+03 2,29E+03 2,50E+04 1,88E+05 2,90E+01 2,10E+03 1,38E+05 2,10E+03 82 41 ula ientífica VALIDACIÓN DE MODIFICACIONES B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método de referencia y simultáneamente con el método alternativo. Ensayar la muestra 10 veces con el método de referencia y simultáneamente 10 veces con el método alternativo. Transformar los resultados de recuento obtenidos a logaritmo (log10(ufc/g) (log10(ufc/ml) Calcular el valor medio X y la desviación estándar S de los valores obtenidos con el método a validar. Calcular el valor medio Xref y la desviación estándar Sref de los valores obtenidos con el método de referencia. referencia Prueba de Hipótesis de varianzas: Ho: S2=S2ref ula ientífica Fcal = S12 S 22 Si Fcal < Fν1=n1-1, ν2=n2-1 ,α=0,05 no hay diferencias significativas en las varianzas. 83 VALIDAR MODIFICACIONES Prueba de Hipótesis Ho: X = X ref Varianzas iguales Varianzas distintas x − x ref tcal = S x − x ref tcal = 1 1 + n1 n2 (n1 −1)× S + (n2 −1)× S S= n1 + n2 − 2 2 ula ientífica 2 ref 2 S 2 S ref + n n2 1 ( ν eff = S n 2 1 S 2 n1 S + 4 × (n 1 − 1 ) 2 ref n2 + )2 S n 2 2 4 ref × (n 2 − 1 ) ν = n 2 + n1 − 2 Si tcal < t ν, α=0,05 no hay diferencias significativas 84 42 ula ientífica Ejercicio 5: Validación de una modificación al método Se utiliza un método de rutina PNT-E-010 basado en norma al cual se han modificado las condiciones de incubación; verificar que no hay diferencias significativas. Opción B) A partir de ensayar una muestra repetidamente con el método sin modificar de referencia y simultáneamente con el método modificado ula ientífica Referencia Muestra Método Normalizado PNT-E-010 M1 182 187 M2 193 161 M3 147 152 M4 184 175 M5 203 172 M6 161 204 M7 197 201 M8 172 163 M9 198 170 M10 194 204 Verificar que no hay diferencias significativas y calcular la exactitud relativa del método considerando como criterio de aceptación que la recuperación este comprendida dentro del intervalo 90-100%. 85 ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN ula ENSAYOS ientífica MICROBIOLÓGICOS 86 43 ula ientífica INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS El resultado del número de microorganismos presentes en la muestra tiene que poder expresarse de manera general como: ula ientífica Valor 1 ± Valor 2 Valor 1; es la mejor estimación que podemos proporcionar de la cantidad de microorganismos presentes en la muestra. Valor 2; es la incertidumbre del resultado final, final relacionado con la dispersión de resultados que se obtendrían al repetir el análisis un número determinado de veces. Incertidumbre de medida: parámetro, asociado al resultado de una medida, que caracteriza la dispersión de los valores que se podrían atribuir razonablemente al mesurando ( ISO/TS 19036:2003). 87 INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS Factores que afectan al resultado del análisis Muestreo Equipos, medios de cultivo y reactivos Muestra para el laboratorio Matriz ula ientífica Submuestreo / primera dilución Errores aleatorios Sesgo Resultado Analista ISO/TS 19036:2003: Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations 88 44 ula ientífica INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS ISO/TS 19036:2006: Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations Incertidumbre expandida ula ientífica U = K SR2 + 0.18861 ∑C K: Factor de cobertura=2 (nivel de confianza del 95%) SR : Desviación Des iación estándar de reprod reproducibilidad cibilidad 0.18861/∑C : es la componente de la varianza debida a la distribución de Poisson ∑C : es la suma de las colonias contadas en todas las placas. 89 INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS La ecuación se puede simplificar para recuentos elevados: Incertidumbre expandida ula ientífica U = K × SR El valor limite de la suma de la suma de colonias contadas viene dado por la siguiente ecuación: C lim = 1.75 SR2 Si ∑ C> C lim se puede usar la ecuación simplificada 90 45 ula ientífica INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS Posibilidades de estimación de la desviación estándar de reproducibilidad (SR): 1ª opción: intralaboratorio ula ientífica 2ª opción: estudio interlaboratorio de validación del método 3ª opción: p ejercicio j interlaboratorio de aptitud p 91 EXPRESIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN EL INFORME DE ANALISIS La desviación estándar de reproducibilidad se expresa en unidades de log10 ula ientífica Existen diferentes posibilidades de expresión de los resultados en el informe de análisis : y ± U (log) y log [ y – U , y + U] x ufc/ g o ufc/ml [ 10 y – U , 10 y + U] x ufc/ g o ufc/ml [ -(1-10-u ) x100%, +(-1+10 u ) x 100%] Siendo y el resultado en unidades de log 10 92 46 ula ientífica INCERTIDUMBRE DE LOS RESULTADOS Report on the relationship between analytical results, measurement uncertainty, recovery factors and the provisions of eu food and feed legislation, with particular reference to community legislation concerning. 2004 http://europa.eu.int/comm/food/food/chemicalsafety/contaminants/report-sampling_analysis_2004_en.pdf Recuento (valor absoluto) Recuento (log10) 10 000 000 7 1 000 000 6 100 000 5 10 000 ula ientífica Incertidumbre expandida U (log10) Rango aceptable de recuentos en valor absoluto ± 0.5 3 162 000 a 31 620 000 ± 0.5 316 200 a 3 162 000 ± 0.5 31 620 a 316 200 4 ± 0.5 3 162 a 31 620 1 000 3 ± 0.5 316 a 3 162 100 2 ± 0.5 32 a 316 10 1 ± 0.5 3 a 32 Para métodos que requieren previa confirmación, se aceptan valores de ± 1 log 10 93 Ejercicio 6 : Estimación de la incertidumbre Estimar la incertidumbre de los siguientes resultados e indicar como se expresaría el resultado con la incertidumbre en el informe de ensayo. Incluir todas las posibilidades. Ejemplo 1: Ejemplo 2: Ejemplo 3: Dilución Recuento 10-3 102 10-4 8 SR = 0.15 K=2 ula ientífica SR = 0.25 K=2 Dilución Recuento 10-1 3 placas = 9 ,9, 9 10—22 4 Dilución Recuento 10-1 9 10—2 2 SR = 0.11 K=2 94 47 ula ientífica ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEula LOS RESULTADOS ientífica 95 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS UNE EN ISO/IEC 17025 “El El laboratorio debe establecer un control de calidad para UNE-EN realizar el seguimiento de la validez de los ensayo” ula ientífica G-ENAC-04 Rev.3 El laboratorio debe disponer de un programa de controles periódicos … uso de muestras inoculadas, recuentos cruzados entre analistas, análisis duplicados, uso de materiales de referencia... Los laboratorios deben participar regularmente en ensayos de aptitud....para detectar desviaciones y verificar la validez de todo el sistema de calidad. 96 48 ula ientífica ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS NT 32 Rev.2 Las actividades de control de la calidad deben realizarse en la medida de lo posible con muestras naturales tanto positivas (contaminadas naturalmente o inoculadas) como negativas. CONTROL INTERNO ula ientífica CONTROL EXTERNO Control de las condiciones de trabajo Control de la precisión Control de la recuperación Control del límite de detección Participación en intercomparaciónes Conjunto de acciones de evaluación de la calidad Siembra por duplicado de placas Control de medios de cultivo Control ambiental Cualificación del personal Calibración/verificación de equipos 97 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS NT 32 Rev.2 Todas las actividades de aseguramiento de la calidad deberán planificarse de forma que se incluya i l una adecuada d d representación t ió de d la l variedad i d d de d matrices ti con las l que trabaja t b j el laboratorio. ula ientífica PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DE LOS RESULTADOS La periodicidad de las actividades de control de calidad deberá establecerse considerando diversos factores como pueden ser: La robustez del método utilizado en función de los controles específicos incluidos en el mismo. La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos análisis Los resultados históricos de control de calidad y la evaluación de los mismos El conjunto de acciones de evaluación de la calidad utilizados en el laboratorio. 98 49 ula ientífica PROGRAMA DE CONTROL DE LA CALIDAD Método analítico Investigación de salmonela Tipo de control Periodicidad Criterios de aceptación/rechazo Esterilidad: Blanco En cada serie No crecimiento Trimestral Crecimiento característico Trimestral No crecimiento ula ientífica Control eficacia positivo Productividad Control eficacia negativo – Selectividad Control del límite de detección Trimestral Mismo LD que en la validación Participación ejercicio interlaboratorio Anual No estar excluido Esterilidad: Blanco En cada serie No crecimiento Control eficacia positivo Productividad Control eficacia negativo – Selectividad Recuento S.aureus Trimestral Pr > 90% Trimestral No crecimiento Control de duplicados de placa En cada serie ISO 14461-2 Control de duplicados de muestra En cada serie r= 2,8 Sr Control de la recuperación Trimestral R > 90 % Participación ejercicio interlaboratorio Anual -2<Z<2 99 ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD Control de la precisión (repetibilidad); muestras naturales contaminadas naturalmente o naturales sin contaminar inoculadas con materiales de referencia ula ientífica Ensayar por duplicado muestras de rutina en condiciones de repetibilidad Transformar los resultados logaritmo (log10(ufc/g o ml) Calcular la diferencia de logaritmos Evaluación: verificar que la diferencia de logaritmos se encuentra dentro de los límites establecidos como criterio de aceptación/rechazo. Límite de repetibilidad (r)= 2.8 Sr diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo obtenidos en condiciones de repetibilidad que se espera que esté con una probabilidad máxima del 95 % Los resultados obtenidos pueden utilizarse en la validación del método (ej. verificación de nuevas matrices). 100 50 ula ientífica Ejercicio 7: Control de la precisión. Los resultados obtenidos al analizar por duplicado una muestra son: Muestra A: 195 ufc/g y 160 ufc/g ula ientífica Si disponemos de la información de R=0,10, ¿ cual es la conclusión? ¿Que resultado indicaremos en el informe de ensayo? 101 ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD Control de la recuperación; muestras inoculadas con materiales de referencia o cepas p de referencia Inocular una muestra natural que no contenga el microorganismo a ensayar ula ientífica Ensayar la muestra inoculada según el procedimiento de ensayo Simultáneamente determinar la cantidad de inóculo mediante siembra en PCA e incubación a 37ºC durante 24 horas Transformar los resultados en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) Calcular el valor medio de cada conjunto de resultados x = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidos con el método a controlar xref = valor medio en logaritmo (log10 en ufc/g o ml) de los resultados obtenidos con PCA Calcular el % de recuperación =100 x 10(x-xref) Evaluación: verificar que el % de recuperación se encuentra dentro de los 102 límites establecidos como criterio de aceptación/rechazo. 51 ula ientífica ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD Control del límite de detección; con muestras inoculadas con cepas de referencia ula ientífica Inocular una muestra que no contenga el microorganismo diana, a una concentración próxima al límite de detección Ensayar la muestra inoculada según el procedimiento de ensayo (óptimo 10 replicados) Simultáneamente determinar la cantidad de inóculo mediante siembra en PCA e incubación a 37ºC durante 24 horas (óptimo 10 replicados) Evaluación: verificar que se ha detectado la presencia del microorganismo en la muestra, siempre y cuando la concentración inoculada esté por encima del límite de detección 103 ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD Control de las condiciones de trabajo; proporciona información sobre la esterilidad de los medios y materiales auxiliares utilizados y, en general, sobre la buena práctica en la realización de los ensayos. ensayos Dos opciones: ula ientífica Ensayar una muestra problema estéril (muestra blanco) Ensayar una suspensión que no contenga muestra pero que haya seguido los mismas etapas que las suspensiones de las muestras (control de esterilidad) Evaluación: verificar que no exista crecimiento o, si procede, establecer criterios para la desviación permitida (dependiendo del fin de la determinación puede permitirse una contaminación reducida). 104 52 ula ientífica ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD Control ambiental; Controlar los niveles de biocontaminación del aire y de las p j superficies de trabajo ula ientífica Control ambiental: exposición de placas con medio de cultivo abiertas en distintas áreas del laboratorio durante un tiempo determinado. Control de superficies: control con laminocultivos en distintas superficies del laboratorio. Evaluación: Establecer los recuentos máximos aceptables y las medidas a tomar en caso de sobrepasar los límites. 105 ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD Control de los medios de cultivo; En el laboratorio de microbiología, muchos análisis y procedimientos dependen de que el medio de cultivo sea constante y proporcione resultados reproducibles. ula ientífica Control del medio de cultivo para: 1. aceptabilidad de cada lote de medio 2. que el medio es “adecuado al objetivo” 3. que el medio puede dar resultados constantes Evaluación: en función de las características del medio (líquido o sólido) y la finalidad del método (cuantitativo, cualitativo o semicuantitativo) se establecerán criterios de productividad y selectividad con criterios predeterminados de aceptación/rechazo. 106 53 ula ientífica ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD Participación en intercomparaciones; permite una evaluación del sesgo. ula ientífica Se recomienda participar en intercomparaciones de reconocido prestigio y que permitan cubrir todo el rango de matrices con las que trabaja el laboratorio. Los resultados pueden ser utilizados para la validación del método. Evaluación: No estar excluido por el organizador, generalmente el valor de Z-score ha de estar incluido dentro del intervalo de (+2 y -2) 107 ACTIVIDADES DE CONTROL DE LA CALIDAD Guía sobre la participación en intercomparaciones (G-ENAC-14 Rev.1) Evaluación del proveedor: Aspectos técnicos a considerar item suministrado (garantía de homogeneidad y estabilidad para el fin previsto) condiciones de transporte instrucciones para la realización del ensayo metodología estadística utilizada informe final ula ientífica Evaluación de la participación en el ejercicio de intercomparación: Calidad del ítem (nivel de concentración, presencia de interferencias, límites de detección declarados, datos del estudio de homogeneidad/estabilidad) Contenido del informe (datos de los participantes, valor asignado, dispersión de los resultados, incertidumbre, evaluación del rendimiento (Z-score o Número E), evaluación realizada, gráficos, incidencias) 108 54
