UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Instituto de Ecología y Evolución Facultad de Ciencias DETERMINACIÓN DE ESTRÉS A PARTIR DE MUESTRAS FECALES EN EL PUDÚ (PUDÚ PUDA): EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA EXTRACCIÓN DE SEMEN EN LOS ANIMALES DEL CENTRO DE REHABILITACIÓN DE FAUNA SILVESTRE (CEREFAS), UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE. Memoria de Título presentada como parte de los requisitos para optar al TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO. ANGELICA ISABEL ROMERO ROMERO VALDIVIA – CHILE 2009 PROFESOR PATROCINANTE ______ Mauricio Soto G. PROFESOR CALIFICADOR Firma ____ Roberto Schlatter V. Firma Jorge Oltra C. Firma PROFESOR CALIFICADOR FECHA DE APROBACIÓN: _ _30 de Octubre de 2009______________ Dedicado a Magdalena, en tu constante empuje y amor encontré mi frágil amparo. ÍNDICE Capítulo Página 1. RESUMEN……………………………………………… 1 2. SUMMARY…………………………………………….. 2 3. INTRODUCCIÓN……………………………………... 3 4. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………… 12 5. RESULTADOS………………………………………… 19 6. DISCUSIÓN………………………………………….... 23 7. BIBLIOGRAFÍA………………………………………. 30 8. ANEXOS……………………………………………….. 35 9. AGRADECIMIENTOS………………………………… 46 1 1. RESUMEN La cuantificación de glucocorticoides fecales es una técnica no invasiva de monitoreo hormonal que permite estimar los niveles fisiológicos de estrés de un animal. La característica de ésta técnica es que no necesita tener al animal que se está evaluando en forma directa, es decir, evita la manipulación y consecuentemente alteración de los niveles plasmáticos de glucocorticoides. Para la implementación de esta técnica se requiere de una previa validación, lo cual es especie específica, y demuestra la consistencia entre los niveles de metabolitos de glucocorticoides fecales y su relación con los niveles plasmáticos de la hormona. El objetivo de este estudio fue realizar la validación de la técnica de cuantificación de metabolitos de glucocorticoides fecales en el pudú (Pudu puda). Este se realizó en dos etapas: primero la validación fisiológica, donde se estimuló la actividad adrenal a partir de 5UI de ACTH intramuscular, mediante la determinación de los niveles de cortisol plasmático y de los metabolitos de cortisol fecales. En segundo lugar, se procedió a realizar la validación biológica, la cual consiste en estimular la secreción adrenal sin una inducción fisiológica. Para ello se trabajó con cuatro pudúes electroeyaculados en CEREFAS, y se les determinó de los niveles de cortisol plasmático y de los metabolitos de cortisol fecalesPara la obtención de las muestras de sangre los animales fueron anestesiados con Xilazina y Ketamina, se obtuvieron 12 muestras de plasma mediante un catéter endovenoso en la yugular luego de la administración de la ACTH. Las muestras de fecas se tomaron con el animal recuperado de la anestesia, cada tres horas hasta las 36 horas, y las muestras de los pudúes electroeyaculados incluyeron una muestra basal y tres muestras posteriores a la manipulación. La determinación del cortisol plasmático y fecal se realizó mediante radioinmunoensayo (RIA). La concentración del cortisol plasmático posterior a la administración de ACTH fue estadísticamente no significativa, al igual que los niveles de metabolitos de cortisol en fecas, y los metabolitos de cortisol en fecas de los pudúes electroeyaculados. Los resultados de este estudio podrían atribuirse a un error de detección del kit de RIA, o a una contaminación de las muestras durante la ejecución del radioinmunoanálisis. Debido a los resultados no significativos de este estudio, no se pudo validar la técnica no-invasiva de medición de estrés mediante metabolitos de cortisol fecales en la especie pudú. Para futuros estudio de cortisol fecal en esta especie se recomienda perfeccionar los protocolos de laboratorio en cada una de sus etapas. Palabras claves: Estrés, técnica no invasiva, metabolitos de cortisol fecal, pudú. 2 2. SUMMARY DETERMINATION OF STRESS THROUGH FECAL SAMPLES IN PUDÚ (Pudu puda): ASSESSMENT OF THE EFFECT OF REMOVAL OF SPERM IN THE ANIMALS OF THE CENTER FOR REHABILITATION OF WILDLIFE (CEREFAS), UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE The quantification of fecal glucocorticoids is a noninvasive technique made to monitor hormone levels in order to estimate the physiological stress of an animal. The characteristic of this technique is that it the animal doesn´t need being tested directly, and prevents the manipulation and consequently altered plasma levels of glucocorticoids. The implementation of this technique requires a prior validation, which is species specific, and demonstrates the consistency between the levels of fecal glucocorticoid metabolites and their relation to hormonal plasma levels. The aim of this study is to validate the technique of quantifying fecal glucocorticoid metabolites in the pudu (Southern Pudu). This is done in two stages: first a physiological validation, which stimulates the adrenal activity after intramuscular ACTH 5UI by determining the levels of plasma cortisol and fecal cortisol metabolites. Secondly, we proceeded to the biological validation, which is purposed to stimulate adrenal secretion without a physiological induction. This was achieved using four pudúes electroejaculated in CEREFAS, which determined the levels of plasma cortisol and fecal cortisol metabolites. To obtain the blood samples the animals were anesthetized with Xylazine and Ketamine. 12 plasma samples were obtained by intravenous catheter located in the jugular after ACTH administration. All faecal samples were taken with the animal recovered from anesthesia, every three hours up to 36 hours. The samples of electroejaculator animals included a baseline sample and three samples after handling. The determination of plasma and fecal cortisol was performed by radioimmunoassay (RIA). The concentration of cortisol plasma after the administration of ACTH was not statistically significant, as the levels of cortisol metabolites in faeces, and the cortisol metabolites in faeces of pudús electroeyeculate. The results of this study may be related to error detection RIA kit, or a contamination of samples during the performance of radioimmunoassay. Due to the non-significant results of this study it wasn´t posible to validate the non- invasive technique for measuring stress through fecal cortisol metabolites in the pudu. For future studies of fecal cortisol in this species its recommended to refine the laboratory protocols in each of its stage. Key words: Stress, non invasive technique, fecal cortisol metabolites, pudú. 3 3. INTRODUCCIÓN 3.1 DEFINICIÓN DE ESTRÉS Históricamente el término “estrés” ha sido utilizado para referirse a varios conceptos diferentes: incluyendo el estímulo nocivo al cual un animal se expone; la respuesta fisiológica y conductual producto de la estimulación; y la enfermedad derivada de un estímulo permanente sobre el individuo (Romero 2004). Los eventos impredecibles en la vida de un animal comúnmente son denominados “fuentes de estrés”, y la respuesta del organismo frente a dicha perturbación desencadena una cascada de reacciones a nivel fisiológico y conductual controladas por mecanismos de regulación hormonal (Wingfield y Kitasky 2002, Valdespino y col 2007). Tales “fuentes de estrés” actúan como estímulos específicos capaces de producir un desequilibrio en la homeostasis de un organismo (Becker y col 2002). La respuesta generada frente a estas fuentes de estrés, consiste en un ajuste del organismo, que involucra una cambio fisiológico acumulativo que permite reestablecer el balance homeostático, lo que se entiende como “la respuesta al estrés” (Romero 2004, Mateo y Cavigelli 2005). Dicho de otro modo, el término estrés considera dos sucesos secuenciales: la fuente de estrés y la respuesta frente a esta exposición (Becker y col 2002, Wingfield y Kitaysky 2002). Se distinguen dos formas de presentación del estrés: el estrés agudo, el cual es desencadenado por eventos impredecibles, por ejemplo: el ataque de depredadores, climas adversos inesperados, interacciones sociales agonistas, transporte, captura y sujeción física, entre otros. La respuesta fisiológica de los organismos se caracteriza por ser rápida, minutos y/u horas (Summers 2002, Keay y col 2006). Por otro lado, el estrés crónico es el resultado de una exposición prolongada a una situación estresante para el individuo, tal como condiciones de cautividad adversas, disminuciones de la disponibilidad de alimento, enfermedades, y dinámicas de jerarquías sociales, entre otros (Summers 2002, Sands y Creel 2004, Mateo y Cavigelli 2005, Keay y col 2006). En estos términos, es evidente que este tipo de situaciones de estrés puede tener efectos nocivos en la sobrevivencia de especies que no poseen los mecanismos que compensen dichas perturbaciones, afectando el metabolismo, la función vascular, el crecimiento, la reparación tisular, la respuesta inmune, y el metabolismo neuronal (Romero 2002, Summers 2002, Wingfield y Kitaysky 2002, Keay y col 2006). McEwen y Wingfield (2003), definieron la homeostasis (pH, temperatura corporal, niveles de glucosa y tensión de oxígeno) como la estabilidad de los sistemas fisiológicos que mantienen la vida. De este modo propusieron un nuevo concepto llamado “alostasis”, que se entiende como un proceso auxiliar que compensa los desajustes dados por una fuente de estrés hasta volver a un estado de homeostasis (Goymann y Wingfield 2004). 4 3.2 REGULACIÓN DEL EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-ADRENAL (HHA) Cuando un estímulo actúa sobre los sentidos de un animal, el sistema nervioso aferente lo recibe y conduce a las áreas sensitivas del sistema nervioso central. Entonces se genera una respuesta enfocada a disminuir el impacto del estímulo, a través del sistema nervioso autónomo y neuroendocrino (Brousset y col 2005). La estimulación de la parte simpática del sistema nervioso autónomo provoca la primera curva de secreción hormonal, ésta ocurre dentro de segundos e involucra un aumento de la secreción de catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) desde la médula adrenal; el hipotálamo inicia la respuesta al estrés mediante el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (HHA) liberando la hormona liberadora de corticotropina (CRH) que es secretada por el plexo capilar primario en la eminencia media del hipotálamo hacia la circulación porta. Esta hormona estimula las células especializadas de la glándula pituitaria anterior (corticotrofos) induciendo la liberación de adrenocorticotropina (ACTH) 10 minutos después, la que a su vez provoca la estimulación de la corteza adrenal, y la posterior liberación de glucocorticoides hacia la circulación (Sapolsky y col 2000, Becker y col 2002 Keay y col 2006). Los glucocorticoides son esteroides que tienen dos formas de presentación: el cortisol y la corticosterona; siendo el cortisol más dominante en primates, humanos, ovejas, cerdos, visón, zorro y peces, y la corticosterona en aves, reptiles y roedores (Becker y col 2002, Romero 2002, Mormède y col 2007). En la regulación de la actividad secretora del eje HHA, el cortisol ejerce un efecto directo de retroalimentación negativa sobre el hipotálamo disminuyendo la síntesis de CRH y/o directamente sobre la adenohipófisis, lo que genera una reducción de la formación de ACTH (Guyton 2001). La actividad del eje HHA es variable, puesto que el ciclo diurno esta genéticamente determinado y sincronizado por la luz, sumada a esta fuente de variabilidad, la secreción de cortisol es pulsátil, con una periodicidad de alrededor de 90 minutos. En general, el máximo de los niveles hormonales ocurre en el inicio del período de luz en animales diurnos, mientras que en las especies nocturnas éste ocurre al fin del período de luz (Brousset y col 2005). Sumado a esta variabilidad, se ha descrito que la respuesta al estrés es relativamente no específica, esto quiere decir que diferentes fuentes de estrés pueden llegar a producir similares respuestas conductuales y fisiológicas en un individuo (Nelson 2005). Wingfield y Kitaysky (2002), propusieron tres niveles en la secreción de glucocorticoides, el primero corresponde a una secreción de niveles basales, los que cumplirían un rol esencial de mantención en la regulación de sales y energía; el segundo nivel corresponde a los cambios predecibles que ocurren durante un período de tiempo que puede estar regulado por ritmos circadianos y circanuales, es decir, involucra el metabolismo, los procesos de osmorregulación, y los cambios fisiológicos y conductuales del individuo dentro de un ciclo; y el último nivel abarca las respuestas generadas ante una situación impredecible, 5 lo que consecuentemente podría registrar los aumentos transitorios más altos de secreción de glucocorticoides en un individuo. Una exposición repetida a un factor estresante o una condición de estrés crónico tiene implicancias directas en la conducta y fisiología de un animal. Tales efectos involucran cambios a nivel del eje HHA al realzar las subsecuentes respuestas frente a nuevas fuentes de estrés. Este tipo de respuestas se entiende como facilitación, y corresponde a la mantención o al realce de la actividad del eje HHA en animales previamente estresados, producido por una señal de retroalimentación negativa en respuesta a la liberación de glucocorticoides como resultado de experiencias de estrés crónico, éstos cambios parecen depender de la fuente de estrés y del circuito neuronal y su actividad (Bhatnagar y Vining 2003, Romero 2004, Mormède y col 2007). La interpretación de la respuesta al estrés como instrumento de medición debe ser cuidadosa debido a la variación de la actividad del eje HHA, determinado tanto por factores internos (genética y secreción pulsátil de cortisol) como por factores externos (ingesta de alimento, temperatura, régimen de luz) (Moberg 2000, Mormède y col 2007). 3.3 HORMONAS INVOLUCRADAS EN LA RESPUESTA DEL ESTRÉS Ante una situación de estrés, el organismo tiene una serie de reacciones fisiológicas que comprenden la activación del eje HHA y del sistema nervioso periférico. En una escala de segundos a minutos, la secuencia de la respuesta frente a un estresor es la siguiente: 1) aumento inmediato de la disponibilidad de energía (movilización de energía almacenada, inhibición del almacenamiento energético, y gluconeogénesis); 2) aumento de la irrigación hacia el músculo en ejercicio a través del realce del tono cardiovascular, y consecuentemente aumento del ingreso de oxígeno; 3) disminución del flujo sanguíneo a las áreas no involucradas en el movimiento 4) inhibición de los procesos energéticamente costosos que no están relacionados con la sobrevivencia inmediata, como digestión, crecimiento, función inmune, y reproducción; 5) disminución de la percepción del dolor; 6) incremento de la agudeza cognitiva, la memoria, la tasa de perfusión cerebral y la utilización cerebral local de glucosa (Sapolsky y col 2000, Nelson 2005). En este sentido, las hormonas principalmente involucradas en la repuesta al estrés son los glucocorticoides y las catecolaminas (Becker y col 2002). El sistema nervioso periférico esta compuesto por el sistema nervioso simpático (SNS), y el sistema nervioso parasimpático (SNPs), cuyas funciones son antagónicas. El SNPs media las funciones vegetativas, tales como el crecimiento, la digestión, el ritmo cardíaco lento y la respiración, generalmente es estimulado durante el descanso, o después de una gran ingesta de alimentos. En contraste, el SNS es estimulado al despertar, ante una situación de alarma, o en un estado de emergencia (Becker y col 2002). La respuesta cardiovascular al estrés comprende un aumento en el gasto cardíaco y la presión sanguínea mediante la acción de las catecolaminas, este tipo de acciones se ejerce a corto plazo (Sapolsky y col 2000, Guyton 2001, Nelson 2005). 6 La mayoría de las acciones de los glucocorticoides en las reacciones inflamatorias e inmunes son de carácter supresivo. La secreción de glucocorticoides en respuesta al estrés agudo modela y restringe la respuesta inmune, sin embargo, la exposición prolongada a la secreción de glucocorticoides puede contribuir al desarrollo de inmunosupresión. En caso del metabolismo incrementan las concentraciones circulantes de glucosa disponibles para su utilización por órganos esenciales para la vida, tales como el cerebro y el corazón, y estimulan la glicogenólisis y gluconeogénesis mediante el glucagón y las catecolaminas. Ante situaciones de estrés pueden suprimir la conducta de alimentación, este efecto se desencadena dentro de una hora incluso en animales con privación del alimento (Sapolsky y col 2000, Becker y col 2002). Los glucocorticoides incrementan la utilización local de glucosa dentro de segundos, mediante el transporte de glucosa hacia el cerebro, esta acción es mediada por activación simpática. La exposición prolongada a glucocorticoides atrofia los procesos neuronales del hipocampo, lo que se traduce en pérdida de neuronas (Sapolsky y col 2000, Guyton 2001). Cuando se inicia la respuesta al estrés comienza la inhibición de la conducta y la fisiología reproductiva, lo que involucra una disminución de las concentraciones de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) portales y la liberación de gonadotropinas desde la pituitaria. En los mamíferos los efectos antagónicos de los glucocorticoides en la fisiología reproductiva son manifestados más lentamente, comenzando con un decline en las concentraciones de esteroides sexuales circulantes en un curso de horas, y de manera más integrativa, como disrupción del ciclo ovulatorio, en un curso de días a semanas (Sapolsky y col 2000, Wingfield y Kitaysky 2002). Otras hormonas liberadas en la respuesta al estrés son las endorfinas, la prolactina, la vasopresina, y la secreción pancreática de glucagón. Las endorfinas son secretadas por la glándula pituitaria, y su rol en la respuesta al estrés se relaciona con la regulación de la percepción del dolor. La vasopresina, hormona secretada por la neurohipófisis, esta involucrada en la regulación del volumen de agua y la función renal. El glucagón participa en la regulación de la disponibilidad de glucosa (Becker y col 2002, Möstl y Palme 2002). 3.3.1 Cortisol El cortisol es secretado por la zona fascicular, la capa media y más ancha de la corteza suprarrenal. El cortisol al igual que todas las hormonas corticosuprarrenales es un esteroide derivado del colesterol (Guyton 2001). Debido a su naturaleza lipofílica difunde fácilmente por las membranas celulares hacia el interior de la célula, esta característica le permite interactuar con receptores intracelulares de mineralocorticoides y glucocorticoides, e incluso atravesar la barrera sanguínea del cerebro (Mormède y col 2007). Aproximadamente un 10% del cortisol que se libera a la circulación permanece en estado libre, lo que corresponde a la fracción de la hormona activa, el resto del cortisol circulante se une a proteínas transportadoras, un 70% la globulina de unión a corticosteroides (CBG) o transcortina, y un 20% la albúmina (Mormède y col 2007). Esta unión tan estable a 7 las proteínas del plasma retarda la eliminación del cortisol plasmático por lo tanto la semivida de éste es larga, alrededor de 60-90min (Guyton 2001). En altas concentraciones, tales como durante una estimulación con ACTH o estrés, los niveles plasmáticos de cortisol aumentan rápidamente incrementándose en un 20-30% (Mormède y col 2007). El cortisol al igual que el resto de los esteroides suprarrenales se descompone en el hígado donde es conjugado para formar ácido glucorónico, aproximadamente un 25% de éstos conjugados se elimina por la bilis y luego por las heces (Guyton 2001). Tiene actividad catabolítica (proteolítica y lipolítica) en tejidos periféricos y una actividad anabólica en hígado, incluyendo síntesis proteica y gluconeogénesis (Mormède y col 2007). También reduce moderadamente la utilización de glucosa por la mayoría de las células del cuerpo (Guyton 2001). Actúa en el proceso de la inflamación atenuando sus efectos, mediante la estabilización de las membranas lisosómicas, lo que permite una menor liberación de bradicinina, enzimas proteolíticas, prostaglandinas y leucotrienos. También reduce la permeabilidad de los capilares, la emigración de leucocitos al área afectada y la fagocitosis de las células dañadas. Suprime el sistema inmune y en especial los linfocitos T, lo que reduce las reacciones titulares en las zonas inflamadas, e incluso después de establecida la inflamación, bloquea casi de inmediato los factores que fomentan la inflamación, acelerando el ritmo de cicatrización (Guyton 2001). 3.4 TÉCNICAS NO INVASIVAS EN LA MEDICIÓN DE GLUCOCORTICOIDES El monitoreo hormonal del estrés es una herramienta que permite cuantificar el impacto de las fuentes de estrés potencialmente perjudiciales para las especies (Goymann y col 1999). Los métodos no-invasivos de cuantificación de glucocorticoides se han utilizado en una amplia variedad de disciplinas (ecología conductual, biología de la conservación, estudios de ecología evolutiva, ornitología, primatología, bienestar animal, etc) para examinar la actividad adrenal, el estrés social, los efectos de ambientes estresantes, la dominancia social (Buchanan y Goldsmith 2004) y el estado reproductivo de una variedad de taxas (Goymann y col 1999, Washburn y Millspaugh 2002, Möstl y Palme 2002, Palme 2005). En animales mantenidos en cautiverio se ha utilizado para evaluar procedimientos veterinarios, manejos anestésicos, el impacto de diferentes tipos de instalaciones o prácticas de enriquecimiento ambiental, e incluso técnicas de reproducción asistida (Morato y col 2004, Brousset y col 2005, Morgan y Tromborg 2007). En animales silvestres se ha propuesto como herramienta para evaluar si las condiciones de cautividad, anestesia, manipulación, procedimientos de reubicación, reintroducción, e interacciones sociales agonistas pueden afectar su estado reproductivo y/o fisiológico general (Wasser y col 2000, Morato y col 2004, Brousset y col 2005, Valdespino y col 2007). Las ventajas del uso de las técnicas no-invasivas son: en primer lugar no requiere la manipulación directa de los animales (Harper y Austad 2001, Mateo y Cavigelli 2005, Palme 8 y col 2005, Keay y col 2006); en segundo lugar, es una medida del nivel de estrés de minutos u horas antes del encuentro con el animal, eliminando el incremento transitorio en los niveles de glucocorticoides, por efecto de la manipulación del animal (Buchanan y Goldsmith 2004, Keay y col 2006). Otra ventaja es que permiten obtener muestras retrospectivas (Harper y Austad 2001), las cuales representan el promedio de la producción hormonal de acuerdo a un cierto margen temporal. Finalmente, no es necesario tener en forma directa al animal que se está estudiando (Mateo y Cavigelli 2005, Palme y col 2005). Sin embargo, este tipo de mediciones sólo reflejan un valor promedio de los niveles hormonales y no es posible detectar efectos puntuales de secreción. De esta forma, en comparación con los niveles plasmáticos, las mediciones no-invasivas pueden resultar en una pérdida de la sensibilidad en algún análisis subsiguiente que examine la relación entre los niveles hormonales y otras variables (Buchanan y Goldsmith 2004). Un requisito para estas técnicas indirectas es la validación, y esta es especie específico, debido a que la ruta de excreción y el tipo de metabolitos excretados varía entre especies, y en muchos casos entre sexos (Brousset y col 2005). De esta forma el proceso de validación pasa por la consistencia entre los niveles de metabolitos de glucocorticoides fecales y su relación con los niveles de hormona circulantes en el plasma sanguíneo (Keay y col 2006). En el caso de las muestras de orina pueden obtenerse del animal, aspirarse del piso, o mediante jaulas especialmente diseñadas para su obtención. La cantidad de orina producida a lo largo del día no es constante, y la concentración de cualquier soluto presente en ella se modifica de acuerdo a la cantidad de agua y sales inorgánicas filtradas a través del riñón (Brousset y col 2005). Muestras de orina y fecas muchas veces son difíciles de obtener en especies de vida silvestre que no pueden ser observadas continuamente, o en especies que defecan en letrinas comunitarias, en tales casos, el pelo puede ser una alternativa no invasiva, no obstante, no se recomienda para estudios que requieran un monitoreo hormonal por períodos cortos (Koren y col 2002). Los análisis de cortisol salival permiten repetir las mediciones de cortisol por cortos períodos de tiempo, el cortisol tarda menos de un minuto en pasar de la sangre a la saliva, por lo tanto, la toma de muestras debe restringirse a este margen temporal, para detectar los cambios en los niveles del cortisol (Millspaugh y col 2002, Brousset y col 2005). En saliva los glucocorticoides existen sólo en forma libre, ya que la saliva esta desprovista de proteínas de unión. El factor limitante en esta técnica es la sensibilidad y especificidad del ensayo. 3.4.1 Cuantificación de Glucocorticoides fecales Particularmente la cuantificación de glucocorticoides se ha utilizado como una medida directa de los niveles de estrés al cual se encuentra expuesto un individuo, y esta cuantificación tradicionalmente se ha realizado midiendo los niveles plasmáticos de glucocorticoides. Lamentablemente, la obtención de las muestras de sangre es un procedimiento invasivo para el animal, el cual puede alterar los niveles de glucocorticoides circulantes como respuesta a la manipulación (Möstl y Palme 2002, Romero 2002, Mateo y Cavigelli 2005, Keay y col 2006, Valdespino y col 2007). 9 Para realizar la validación de la técnica de cuantificación de glucocorticoides fecales, es necesario administrar una ACTH exógena al animal. Ésta actúa a nivel de la corteza adrenal produciendo una liberación de glucocorticoides (cortisol y corticosterona). Como consecuencia de esto, los niveles hormonales plasmáticos se incrementan, luego de un retorno a los niveles basales normales después del período de acción de la ACTH (Mateo y Cavigelli 2005, Palme y col 2005). Esta variación plasmática puede ser seguida a nivel de los metabolitos fecales, de esta forma, es de esperar que en las muestras fecales se observe un aumento de los metabolitos con un desfase temporal con respecto a los niveles plasmáticos, y un posterior retorno a los niveles basales (Goymann y col 1999, Keay y col 2006). Posterior a la validación analítica de un inmunoensayo, se recomienda realizar una validación biológica, para demostrar que la técnica establecida detecta los cambios en los niveles de metabolitos de glucocorticoides fecales, posterior a los respectivos cambios en las concentraciones plasmáticas. La validación biológica consiste en un muestreo seriado antes y después de una manipulación sobre la especie en estudio, y éste se puede realizar a través de inmovilización, transporte, captura, o electroeyaculación, entre otros (Palme 2005). La obtención de muestras provenientes de animales de vida silvestre a veces se ve obstaculizada por no tener la oportunidad de observar al animal en el momento en que la defecación ocurre, de esta forma, las condiciones ambientales también pueden influenciar las mediciones de metabolitos de glucocorticoides cuando las muestras no son inmediatamente recolectadas después de la defecación, las muestras obtenidas pueden no ser representativas debido a la metabolización de los glucocorticoides fecales por acción bacteriana (Washburn y Millspaugh 2002, Millspaugh y Washburn 2004, Palme 2005, Valdespino y col 2007). Considerando estos factores, las mediciones de metabolitos de glucocorticoides fecales también pueden alterarse por el protocolo de muestreo, la hora del día en que la muestra fue obtenida, la edad de la muestra, y las técnicas de almacenamiento por largos y cortos períodos (Bartos y col 1988, Reyes y col 1997a, Romero 2004, Millspaugh y Washburn 2004, Palme 2005). Por otra parte, factores biológicos pueden influenciar la precisión de las técnicas de medición, dentro de los que se destaca: las horas luz, las variaciones diurnas y estacionales en la excreción de glucocorticoides, estatus reproductivo, sexo, condición corporal, la dieta del animal (cambios de ésta ej: mayor contenido de fibra significa un mayor tiempo de tránsito intestinal y una menor absorción de GC) (Washburn y Millspaugh 2002, Millspaugh y Washburn 2004, Keay y col 2006), constipación, diarrea, restricción del alimento, tratamientos con antibióticos que modifiquen la flora intestinal (Brousset y col 2005) la habituación y sensibilización a un factor (Bhatnagar y Vining 2003, Palme 2005), y la variación de las especies (Keay y col 2006). 10 3.5 ASPECTOS GENERALES DEL PUDÚ El pudú es un mamífero que pertenece al Orden de los Artiodáctilos, familia Cervidae y subfamilia Odocoileinos, este género esta representado por dos especies; el pudú del sur (Pudu puda, Molina*) y el pudú del norte (Pudu mephistophiles, Winton*) (Reyes 1988). En Chile el pudú se distribuye por el norte desde la región del Maule hasta las cercanías del estrecho de Magallanes en su límite más austral (Reyes y col 1988), presentando una gran concentración en la Isla Grande de Chiloé (Cortés y col 1988). En el territorio Argentino se distribuye desde los S 39º 23´, W 71º 17´ por el límite norte, hasta los S 42º 58´, W 72º 00´ por el límite sur (Meier y Merino 2007). El pudú es el ungulado más pequeño de Sudamérica y es el único ciervo del sotobosque chileno (Reyes y col 1988), actualmente está caracterizado como Vulnerable de acuerdo al la lista roja de la World Union for Nature (UICN 2009) y a la guía Mamíferos de Chile (Iriarte 2008), también se encuentra en el apéndice I del (CITES 2009). Desde la colonización de la zona sur de Chile esta especie ha experimentado la fragmentación gradual de un 90% de su hábitat histórico, y por ende, una disminución en su población, básicamente por la incesante actividad humana como la caza, los ataques de perros, la introducción de ganado doméstico y otros cérvidos no nativos, así como también por afecciones patológicas transmitidas por especies domesticas. (Cortés 1988, ConklinBrittain y Dierenfeld 1996, Reyes y col 2002, Iriarte 2008). Esta especie actualmente es protegida por la ley 4.601 sobre caza y pesca, condición que la resguarda de la caza, comercio, transporte y posesión, salvo casos calificados de interés científico (CODEFF 1991). Además CONAF protege a la especie y su hábitat en 25 Parques Nacionales, Monumentos Naturales y Reservas Forestales que abarcan casi 3 millones de ha. (Cortés y col 1988). En base a los antecedentes ya mencionados, es preciso conocer los aspectos atingentes a la ecología y conservación de la especie, con el fin de generar estudios que permitan un manejo adecuado de los individuos en cautiverio, y el diseño de metodologías que evalúen el impacto de la actividad antrópica sobre las poblaciones silvestres (Reyes y col 1988). La contribución de la cuantificación de metabolitos de glucocorticoides fecales en esta especie, permitirá evaluar los niveles de estrés de los individuos en cautiverio, con proyecciones de incorporar metodologías que permitan el monitoreo hormonal de las poblaciones silvestres en el futuro. 11 3.6 HIPÓTESIS Debido a que el estrés desencadena una serie de cambios fisiológicos en el organismo, y los glucocorticoides reflejan una parte de estos cambios, es posible medir el nivel de estrés en una especie silvestre en condiciones de cautividad mediante una técnica no-invasiva que correlaciona los niveles circulantes de cortisol con los metabolitos de cortisol aislados en fecas. 3.7 OBJETIVOS 3.7.1 General Evaluar una técnica de medición de metabolitos de glucocorticoides fecales, a través del seguimiento de los cambios en las concentraciones sanguíneas y fecales de cortisol y metabolitos de cortisol, respectivamente, en ejemplares de pudúes silvestres mantenidos en cautiverio. 3.7.2 Específicos a) Determinar si los niveles de metabolitos de glucocorticoides fecales se encuentran correlacionados con los niveles de la hormona circulante en la sangre. b) Evaluar los cambios cuantitativos de los metabolitos de glucocorticoides fecales a través del tiempo, posterior a la elevación de los niveles sanguíneos. c) Efectuar un seguimiento de las variaciones temporales de los niveles de glucocorticoides en pudúes en cautiverio sometidos a procedimientos de extracción de semen bajo anestesia, en un centro de rehabilitación de fauna silvestre. 12 4. MATERIALES Y MÉTODOS El presente estudio se llevó a cabo entre marzo y diciembre del año 2007, y entre enero y diciembre del año 2008 en las dependencias del Centro de Rehabilitación de Rescate de la Universidad Austral de Chile, bajo las normas de utilización de animales en investigación de la UACh. 4.1 MATERIAL 4.1.1. Animales experimentales El grupo consistió en 7 pudúes adultos mantenidos en cautiverio (2 machos y 5 hembras) pertenecientes al “Sendero del pudú” (vivero Los Castaños - Forestal Valdivia S.A.), situado en Cayumapu a 25km al norte de Valdivia (Fig. 1). También se muestrearon fecas de 4 pudúes adultos provenientes de la senda Rumahue, X región, que fueron sometidos a electroeyaculación en el CEREFAS. 4.2. MÉTODO 4.2.1 Manejo de los animales Los animales provenientes del criadero sendero del pudú de la Forestal Valdivia eran mantenidos en condiciones de cautividad en una superficie de 2ha, su alimentación se basaba en concentrado de alfalfa y ramoneo de las especies vegetales presentes en el sitio. La captura de los ejemplares se realizó mediante un sistema de arreo con mallas rachel que desembocaba en un corral de 16m². Una vez capturados los individuos fueron ingresados a una jaula de transporte individual, y se trasladaron al Centro de Rehabilitación de Fauna Silvestre (CEREFAS) de la Universidad Austral de Chile, donde se mantuvieron en corrales individuales. A cada individuo se realizó un examen clínico general y luego se mantuvieron por un período de aclimatación de 48 horas antes de cada experimento. La alimentación se basó en 200-300 gr/día de concentrado de alfalfa, agua ad libitum, y ramas de especies vegetales, tales como Chilco (Fucsia magellanica), murra (Humus ulmifolius) y maqui (Aristotelia chilensis). 13 Figura 1. Visión parcial del “Sendero del pudú”, Cayumapu, Valdivia. 4.3 DESAFÍO CON ACTH Para realizar la validación de la técnica, se midieron los cambios cuantitativos en las concentraciones plasmáticas de cortisol, y en las concentraciones de metabolitos de glucocorticoides fecales luego de la administración de 5 UI intramuscular de ACTH porcina (SIGMA ® ACTH porcine pituitary powder, 250 UI). Una primera muestra de sangre denominada basal, se tomó previa a la administración de la ACTH para medir los niveles basales circulantes de cortisol. Luego se tomaron consecutivamente 11 muestras de sangre desde el momento de la administración de la ACTH hasta los 130 minutos subsiguientes, con intervalos de tiempo de 5, 10, 20, 30, 40, 55, 70, 85, 100, 115, y 130 minutos, este protocolo fue descrito anteriormente por Bubenik y Reyes (1994). El muestreo de fecas, se inició con una muestra basal paralela a la primera muestra de sangre, y se continuó con intervalos de 3 horas después de la administración de ACTH, hasta alcanzar las 36 horas, para luego continuar a las 48 y 72 horas posteriores a la inyección de ACTH, con el objeto de detectar los cambios cuantitativos de metabolitos cortisol en fecas (Mateo y Cavigelli 2005) (Fig. 2). 14 Figura 2. Muestreo de sangre y fecas en el desafío de ACTH en Pudú puda, CEREFAS. 4.3.1 Muestras de Sangre Los animales fueron anestesiados con Xilazina 2% (0.5mg/kg) y Ketamina 10% (8mg/kg) intramuscular, para la extracción de muestras sanguíneas de 2.5ml (Fig. 3). Éstas se obtuvieron a través de un catéter 22G fijado con sutura desde la vena yugular, para mantener permeable la vía se administró 0.3ml de heparina después de tomar cada muestra, las muestras se almacenaron en tubos con EDTA de 3ml. Esta metodología de toma de muestras y los tiempos especificados fueron descritos anteriormente por Bubenik y Reyes (1994). Durante el procedimiento de anestesia se monitoreó cada 10 minutos la temperatura rectal con un termómetro digital, la frecuencia cardíaca (pulsos/minuto) y la frecuencia respiratoria (ciclos/minuto) mediante auscultación directa. Luego de la toma de muestras de sangre se administró 0.5ml de Bipencil L.A. intramuscular, 0.5ml de Vitamina E + selenio como medida preventiva, y se revirtió la anestesia con Yohimbina 1% (0.15mg/kg) vía endovenosa. 15 Figura 3. Toma de muestras de sangre de Pudú puda en CEREFAS. 4.3.2 Muestras de Fecas La primera muestra de fecas (basal) fue tomada con el animal anestesiado directamente desde el recto con guantes lubricados con vaselina líquida. Las muestras subsiguientes se tomaron después del procedimiento de toma de muestras de sangre con el animal recuperado de la anestesia, con una frecuencia de 3 horas y se almacenaron en frascos individuales de 40cc (Fig. 4), se fijaron con etanol al 95% y se refrigeraron a 4°C hasta su análisis en el laboratorio. Este protocolo de almacenamiento de muestras fue descrito por Soto-Gamboa (2009). 16 Figura 4. Muestra de fecas de Pudú puda, CEREFAS. 4.4 MUESTRAS DE ELECTROEYACULACIÓN FECAS DE PUDÚES SOMETIDOS A Se incluyó en el estudio muestras de fecas de 4 pudúes adultos sometidos a electroeyaculación en el CEREFAS, con el objeto de realizar la validación biológica de la técnica. Los animales muestreados fueron anestesiados, previo ayuno de 24 hrs, se realizó inmovilización química a distancia mediante cerbatana y dardos de inyección intramuscular con una combinación de Xilazina al 2% (0,6 mg/kg) y Ketamina al 10% (8mg/kg). La electroeyaculación se efectuó con un estimulador eléctrico GRASS S44 Stimulator con una sonda de 12 cm de largo y 1 cm de diámetro con electrodos longitudinales. La sonda rectal fue lubricada con vaselina líquida y se introdujo 7 a 9 cm en el recto del animal con los electrodos dirigidos centralmente. Posteriormente se realizó la electroeyaculación mediante un protocolo compuesto por pulsos eléctricos de diferente intensidad y duración. Al término del procedimiento la anestesia se revirtió con Yohimbina 1% endovenosa. En este caso el muestreo de fecas incluyó una muestra basal tomada antes de cada procedimiento, y tres muestras posteriores al procedimiento de electroeyaculación que correspondientes a las 18, 24 y 48 horas. Al igual que las muestras de fecas de los animales utilizados para la validación con ACTH, fueron fijadas con etanol al 95% en frascos individuales de 40cc, y se refrigeraron a 4°C hasta su análisis en el laboratorio. 17 4.5 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS 4.5.1 Muestras de Sangre Posterior a la toma de muestras de sangre, los tubos fueron centrifugados durante 10min a 2800 rpm, se extrajo el plasma y se almacenó en tubos Ependorf de 1.7ml en duplicado y se congeló a -20°C hasta el análisis de radioimnumoensayo. 4.5.2 Muestras de Fecas Luego de ser almacenadas, las muestras de fecas fueron secadas en una estufa a 95ºC durante 4-5 horas. Posteriormente se molieron en un mortero y se pesaron entre 0.1 y 0.2 gr que se trasladaron a un tubo de Ependorf de 1.7 ml, y se agregó 1ml de etanol al 80%. Luego esta mezcla se homogenizó en el vórtex por 5 segundos, y se centrifugó a 3000 rpm por 20 minutos. Se recuperaron 0.5ml de sobrenadante en un tubo Ependorf de 0.5ml en duplicado, y se congeló a -20°C hasta la determinación de los metabolitos de los glucocorticoides (ver anexo 1). Este protocolo fue descrito por Mateo y Cavigelli (2005), y validado en degu (Octodon degus) por Soto-Gamboa y col (2009). 4.5.3 Radio Inmuno Análisis El procedimiento se radioinmunoensayo se realizó en el laboratorio de Ecología Terrestre del Instituto de Ecología y Evolución de la Universidad Austral de Chile. En este lugar se pipeteó el reactivo del inmunoensayo y se incubaron las muestras de acuerdo a las instructivo del kit comercial 125I Cortisol radio immunoassay Coat-A-Count® (SIEMENS Medical Solutions Diagnostic, Los Ángeles, California). En este procedimiento se utilizaron tubos recubiertos de anticuerpo para la curva de calibración, y para las muestras de plasma y fecas. Se pipetearon 25 µl de las muestras de plasma y fecas de los animales correspondientes a la validación con ACTH y también las fecas de los animales electroeyaculados (en duplicado) dentro de los tubos que contenían el anticuerpo, a los cuales se les agregó 1 ml de 125 I Cortisol junto a los tubos de la curva de calibración, y se mezclaron en el vortex por 5 segundos. Se incubaron durante 45min a 37°C en un baño termorregulado. Posteriormente se dejaron escurrir para eliminar el reactivo de los tubos durante 2 a 3 minutos. Una vez finalizado este paso, para obtener las cuentas por minuto de las muestras, los tubos fueron trasladados a un contador gama automático Packard Cobra II modelo 5002 perteneciente al Instituto de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Austral de Chile. Todas las muestras fueron analizadas en duplicado y reanalizadas siempre y cuando el resultado del coeficiente de variación excedió el 20%. 18 4.6 DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se realizó una regresión lineal simple entre los niveles basales de cortisol plasmático y metabolitos de cortisol fecal. Posteriormente se analizaron los datos con el programa STATISTICA 7.0 para las concentraciones plasmáticas y fecales producto del desafío con ACTH, se aplicó un análisis paramétrico ANOVA de medidas repetidas de una vía, para determinar diferencias dentro y entre tratamientos. Se utilizó como covariado el tiempo para determinar si existió secreción pulsátil del cortisol. Se consideró significativo el valor de p<0,05. 19 5. RESULTADOS 5.1 DESAFÍO CON ACTH 5.1.1 Cortisol plasmático Para esta medición se consideraron las muestras correspondientes al tiempo basal, 30, 55, 70, 85, y 115 minutos debido a que estos tiempos cumplían con la totalidad de las muestras de sangre. Al analizar la concentración del cortisol plasmático como resultado de la administración de ACTH, no se encontraron diferencias significativas entre los diferentes intervalos de muestreo (ANOVA de medidas repetidas, F (5,25) = 1,47, p = 0,24). En general los datos no muestran una tendencia marcada al aumento o disminución (Fig. 5), el promedio del cortisol plasmático fue de 17,5±2,25 ng/ml, siendo los registros más bajos los correspondientes a la muestra basal (17,18±5,54 ng/ml), y los valores más altos se alcanzaron a los 30min (20,63 ±6,96 ng/ml). Figura 5. Niveles de cortisol plasmático en 7 pudúes mantenidos en CEREFAS, Valdivia. Corresponden a la muestra basal y los tiempos 30, 55, 70, 85, 115 min. Promedio 17,5±2,25 ng/ml. Los gráficos se elaboraron con los promedios y el error estándar de los niveles hormonales. 20 5.1.2 Cortisol fecal Para esta medición se consideraron las muestras correspondientes al tiempo basal, 24, 30, 36, 48 y 72 horas debido a que estos tiempos concentraron la mayor cantidad de muestras de fecas del estudio. En el análisis de la concentración de metabolitos de cortisol en fecas producto de la administración de ACTH, no se encontraron variaciones significativas (ANOVA de medidas repetidas, F (5,20) = 0,10, p = 0,99). La figura 6 representa la tendencia de los datos, en la que no se muestra una propensión al aumento o disminución, el promedio del cortisol fecal fue de 116,63±37,27 ng/gr de fecas. Se aprecia una amplia desviación estándar en las muestras de las 36hrs, las que promediaron 123,36±59,21 ng/gr de fecas, estos valores correspondieron a los registros más altos, seguidos de los registros de las muestras de las 24hrs (123,28±47,03). Los valores más bajos se registraron en las muestras basales 113,36±21,18 ng/gr de fecas, seguido de las 48 hrs con 113,97±36,41 ng/gr de fecas. Figura 6. Niveles de metabolitos de cortisol fecal posterior al desafío de ACTH en 7 pudúes mantenidos en CEREFAS, Valdivia. Corresponden a la muestra basal y los tiempos 24, 30, 36, 48 y 72 hrs. Los gráficos se elaboraron con los promedios y el error estándar de los niveles hormonales 21 5.1.3 Correlación plasma v/s fecas La concentración de metabolitos de cortisol analizado en las muestras de fecas y correspondientes al desafío con ACTH no fue significativo como predictor de la concentración de cortisol plasmático (r² = 0.28, F (1,5) = 1.95, p = 0.22). En la figura 7 se aprecia la dispersión de los datos en relación a la recta, lo que demuestra la inconsistencia de la técnica para estimar la concentración plasmática de cortisol basándose en los registros de los metabolitos de cortisol en fecas. Figura 7. Valores obtenidos en la regresión lineal de las muestras basales de sangre y fecas de 7 pudúes mantenidos en CEREFAS, Valdivia. 22 5.2 FECAS DE ANIMALES SOMETIDOS A ELECTROEYACULACIÓN Los animales sometidos a electroeyaculación no presentaron diferencias significativas entre el valor basal y las mediciones posteriores al procedimiento (F (3,9) = 3,42, p = 0,06), sin embargo, se observó una tendencia a la disminución en las concentraciones de metabolitos de glucocorticoides fecales registradas después de la manipulación, siendo el valor basal superior a los diferentes intervalos de muestreo (Fig. 8). El promedio para los metabolitos de cortisol registrados en fecas fue de 117,9±12,85 ng/gr fecas, los valores basales alcanzaron los registros más altos en la medición (130,54±10,46 ng/gr fecas). Los valores mínimos se registraron en las 48 horas posteriores al procedimiento de electroeyaculación (110,23±13,96 ng/gr fecas). Figura 8. Niveles de metabolitos de cortisol en fecas de 4 pudúes sometidos a electroyaculación en CEREFAS, Valdivia. Los gráficos se elaboraron con los promedios y el error estándar de los niveles hormonales 23 6. DISCUSIÓN 6.1 DESAFÍO CON ACTH 6.1.1 Cortisol plasmático Los niveles plasmáticos registrados en respuesta al desafío con ACTH fluctuaron en promedio, entre 17,18±5,54 ng/ml en la muestra basal y 27,37±3,61 ng/ml a los 130 min. Una de las características de este tipo de estimulación es que la respuesta es prácticamente inmediata, las concentraciones del cortisol aumentan entre los 30 y los 60min posterior a la administración de la ACTH (Jiménez y col 1998), llegando a alcanzar valores tres a cuatro veces por sobre los niveles basales. Sin embargo, en este estudio no se cumplió este supuesto, ya que sólo se produjo un aumento de 10 puntos sobre el nivel basal. Esto no concuerda con lo reportado por Bubenik y Reyes (1994), ya que las concentraciones plasmáticas registradas en pudúes machos posterior a la administración de ACTH varió de 0.5µg/dl a 2.5 µg/dl, utilizando el mismo protocolo de muestreo, con diferencias significativas desde los 40min de administración, manteniéndose estos niveles altos hasta los 130min. Los niveles de cortisol plasmáticos no concuerdan con los anteriormente descritos para la especie, ya que al hacer la conversión de unidades para comparar ambos estudios, los resultados de este estudio superan ampliamente el registro de Bubenik y Reyes (0.5µg/dl a 2.5 µg/dl) más de 100 veces (171,8 µg/dl). Según Reyes y col 1997b, los niveles anuales de cortisol plasmático registraron una variación de 0.6 a 1.7 µg/100 ml en un grupo de pudúes en condiciones de cautividad pertenecientes a la Universidad de Concepción. Una característica del máximo estacional de cortisol descrito en la temporada reproductiva, es que presenta bajos niveles en comparación con otras especies de cérvidos, asociado a las características de su comportamiento y estilo de vida solitario de la especie. A su vez se señala que la activación del eje pituitario-adrenal en el pudú es rápida y transitoria, por lo que los niveles de cortisol disminuyen rápidamente a niveles basales, y se mantienen relativamente bajos, incluso posterior a la administración de ACTH (Bubenik y Reyes 1994). En algunas especies de cérvidos se han reportado cambios estacionales en la secreción del cortisol. Se describen descensos de los niveles plasmáticos de cortisol durante la época reproductiva (ej. el ciervo cola blanca Odocoileus virginianus, Bubenik y col 1983 y el reno, Rangifer tarandus, Nilssen y col 1985). En el caso del pudú se han descrito dos aumentos anuales en la secreción de cortisol plasmático, siendo uno de ellos en el mes de marzo, asociado con la época reproductiva, y el segundo entre los meses de julio y agosto, asociado al estrés del invierno debido a las bajas temperaturas y a la disminución de la diponibilidad de alimento (Reyes y col 1997b). Particularmente la toma de muestras de este estudio se realizó durante la temporada reproductiva (desde la última semana de febrero hasta fines de abril), 24 meses que concentran la mayor interacción agonística de esta especie, y por lo tanto las concentraciones plasmáticas de cortisol registran sus niveles anuales más altos. El desafío con ACTH se ha utilizado en el sambar (Cervus unicolor) (van Mourik y Stelmasiak 1984), ciervo cola blanca (Smith y Bubenik 1990), chital Axis axis (Bubenik y col 1991), ciervo rojo (Cervus elaphus), gamo (Dama dama) (Bubenik y Bartos 1993), y reno (Säkkinen y col 2005). En estas especies hubo una respuesta adrenal a la ACTH, produciéndose una elevación significativa de los niveles plasmáticos de cortisol. A difrencia de estas publicaciones, en este trabajo no se detectó un cambio en los niveles plasmáticos de cortisol por efecto de la administración de la ACTH. Esto puede deberse a una posible contaminación de las muestras de sangre y fecas en la ejecución del radioinmunoensayo, durante las diferentes etapas de manipulación de las muestras, aún cuando se haya actuado con prolijidad en el protocolo descrito en el manual (ver anexo 2), y se hayan tomado las medidas precautorias necesarias en cada etapa del radioinmunoensayo. Se desconoce si el espacio utilizado en la ejecución del RIA podría haber tenido algún tipo de contaminación previa al trabajo práctico, lo que no deja de ser una posible fuente de variación en la obtención de resultados, si se considera que el lugar no era un laboratorio de radioinmunoanálisis. Por otra parte, también cabe la posibilidad de que haya fallado del kit de RIA en el análisis de las muestras, ya que es probable que los anticuerpos del kit no hayan reaccionado sólo con el cortisol plasmático, sino que pueden haber reaccionado con determinantes antigénicos de otros compuestos presentes en la muestra de plasma, con similar especificidad hacia los anticuerpos. Cabe destacar que el kit comercial 125I Cortisol radio immunoassay Coat-A-Count® utilizado en este estudio, esta fabricado en base a suero humano, por lo tanto existe la posibilidad de que se produzca una variación en la unión de los determinantes antigénicos del pudú con los anticuerpos del radioinmunoensayo. El kit de RIA utilizado por Bubenik y Reyes (1994) corresponde a un kit comercial (Joldan Bioclinical Inc., Scarborough, Ontario), que no especifica el origen del anticuerpo utilizado. Bubenik y Reyes (1994) administraron 5UI de una ACTH porcina (ACTHAR gel, Armour Pharmaceutical, Kankakee, IL) y observaron un aumento significativo en los niveles plasmáticos de cortisol en el pudú, ésta es la misma dosis que se administró en este estudio, sin embargo, la ACTH porcina administrada pertenecía a otro laboratorio (SIGMA ® ACTH porcine pituitary powder), y los resultados obtenidos fueron no significativos. Con una pequeña cantidad de 6UI de ACTH se alcanzó una respuesta adrenal significativa el sambar (Cervus rusa timorensis) (Van Mourik y Stelmasiak 1984), en cambio, con 20UI ACTH se produjo una respuesta máxima en cortisol y corticosterona en el ciervo cola blanca (Smith y Bubenik 1990). No es común que la administración de ACTH exógena no genere una respuesta hormonal significativa, sin embargo, casos aislados de insensibilidad adrenal a la ACTH se han reportado en la literatura, en 1990 Smith y Bubenik reportaron un caso en ciervo cola blanca. Estos antecedentes refuerzan la idea de que el kit de radioinmunoanálisis pudo no haber tenido una buena afinidad con el cortisol plasmático del pudú. 25 Otro factor que pudo influenciar la respuesta de los individuos es la alta variabilidad interindividual. Al analizar la respuesta individual de los animales (anexos 4 y 5), se encontró irregularidad en el patrón de la curva de secreción hormonal. Dentro del estudio, un grupo de cuatro animales compuesto por tres hembras y un macho, alcanzaron su máxima secreción de cortisol en el minuto 30, con un rápido descenso alrededor de los 55 minutos, y una estabilización de la curva posterior a los 70 minutos, manteniéndose bajos hasta los 130 minutos. En este grupo de animales se observó una respuesta más homogénea en la secreción de cortisol, sin embargo, esta evidencia no es concluyente para atribuir el leve aumento del cortisol plasmático al desafío de ACTH. Por otra parte, hubo dos hembras que registraron niveles elevados de cortisol en la muestra basal, y rápidamente estos niveles descendieron hasta sus registros más bajos en los minutos 30 y 55, respaldando el patrón irregular de secreción. Ambos sexos exhibieron patrones irregulares en la secreción de cortisol plasmático, por lo tanto, no se presentó una respuesta diferencial entre machos y hembras. Esto concuerda con lo encontrado por Bubenik y Reyes (1994), donde la respuesta de las hembras también fue similar a la de los machos, sin embargo, los datos de las hembras no se publicaron por no completar la totalidad del muestreo sanguíneo. En algunas especies se ha descrito la respuesta del cortisol plasmático en ambos sexos posterior al desafío de ACTH, sin encontrar diferencias substanciales entre hembras y machos como es el caso del ciervo cola blanca (Smith y Bubenik, 1990) y ciervo rojo (Millspaugh y col 2001). 6.1.2 Cortisol fecal El análisis de la concentración de metabolitos de cortisol en fecas posterior a la administración de ACTH, fue estadísticamente no significativo, al igual que los niveles plasmáticos anteriormente descritos. Se registró en promedio 137,92±49,25 ng/gr de fecas de metabolitos de cortisol, con una amplia variación en la totalidad del muestreo. Estos resultados no son concordantes con otros estudios que describen que la administración de ACTH exógena conduce a un incremento en los metabolitos de glucocorticoides fecales (Goymann y col 1999). En grandes mamíferos este incremento generalmente ocurre 24-48 horas posterior al desafío con ACTH (Morato y col 2004, Mateo y Cavigelli 2005). La variación de la respuesta de los glucocorticoides en un individuo puede deberse a diferentes factores, entre los mencionados se incluye: variación estacional de las tasas de conjugación del hígado, variaciones estacionales de la acción de las colonias de bacterias del intestino, el tiempo de pasaje por el tracto digestivo (Millspaugh y col 2002), variabilidad en el número de receptores de glucocorticoides, diferencias en la afinidad de estos receptores por los glucocorticoides, y diferentes capacidades y/o afinidades por las proteínas que se unen a los glucocorticoides (Romero 2004). En el análisis individual de las respuestas al desafío de ACTH (anexos 4 y 5), se aprecia un patrón irregular en la excreción de metabolitos de cortisol fecal. Un grupo de 5 individuos registró niveles bajos en el inicio del muestreo, y un subsecuente aumento que varió entre las muestras de las 24 y 36hrs, con marcadas diferencias en la mantención de los niveles hasta las 72 hrs. Los dos animales restantes iniciaron el muestreo con niveles de 26 metabolitos de cortisol fecal elevados, seguido de un descenso entre las 30 y 36hrs, y finalmente una elevación a las 72 hrs. No se presentó una respuesta diferencial entre ambos sexos, presentando patrones irregulares. La respuesta hormonal de este grupo de individuos no es óptima para validar la técnica no invasiva que evalúa metabolitos de cortisol fecal. Esta técnica se ha validado en otras especies de cérvidos. Según lo reportado por Millspaugh (2002), los niveles de metabolitos de cortisol fecal en ciervo cola blanca aumentaron de 90 ng/gr de fecas en la muestra basal, hasta 225 ng/gr de fecas 20-24hrs después de la administración de dos inyecciones intramusculares de ACTH de 25UI cada una. Esto concuerda con lo descrito por Huber y col (2003), donde se describió un aumento significativo para los niveles de metabolitos de cortisol fecal en el ciervo rojo al superar los niveles basales en más del doble aproximadamente 18hrs después de la administración de la ACTH. En este trabajo no se obtuvieron valores significativos en la concentración de metabolitos de cortisol fecal a diferencia de los trabajos descritos en otras especies de cérvidos. Diferentes reportes de niveles estacionales de cortisol fecal se han descrito en una misma especie. Millspaugh y col (2001), describieron los niveles de metabolitos de cortisol fecal para el ciervo rojo, obteniendo un patrón de estacionalidad en los meses de verano, por otra parte, Huber y col (2003), al evaluar estacionalidad en esta especie obtuvo un marcado patrón en los meses de invierno, con diferencias en los niveles hormonales 10 veces superior al estudio anteriormente descrito. Las diferencias de los resultados de ambos estudios fueron atribuidas al kit de ensayo, ya que en el segundo estudio se aplicó un HPLC para detectar los metabolitos fecales de cortisol específicos para la especie, y como resultado obtuvieron 3a-11one. A raíz de esta observación, se trabajó con un kit de análisis en base a este grupo específico de metabolitos (Huber y col 2003). Días y col (2008) describió diferencias en la comparación de 2 kits comerciales de radioinmunoanálisis en ocelote (Leopardus pardalis), el kit de RIA para 125I corticosterona de ICN Biomedicals obtuvo una mejor respuesta a los antígenos del ocelote en comparación con el kit de RIA para 125I cortisol Coat-a-Count de DPC, los resultados concordaron con Wasser y col (2000) y Möstl y Palme (2002) quienes utilizaron el kit ICN Biomedicals con anticuerpos para corticosterona y obtuvieron mejores resultados en la medición de glucocorticoides en comparación con otros kits comerciales. La selección y comparación de los anticuerpos del ensayo es un punto relevante, debido a que cada ensayo difiere en los métodos de preparación de las muestras, y además utilizan anticuerpos diferentes con variaciones en la afinidad hacia los metabolitos de glucocorticoides fecales (Millspaugh y Washburn 2004). Con estos antecedentes de variabilidad en los niveles de metabolitos de cortisol fecal, como resultado de la aplicación de diferentes inmunoensayos comerciales, se respalda la idea de que el kit de RIA podría haber influenciado los resultados obtenidos en esta especie. Existen importantes diferencias entre especies en la medición de los metabolitos de cortisol en fecas, la proporción de estos metabolitos excretados en fecas alcanza un 28% en ovejas, 41% en ponis, y sólo un 7% en cerdos. La medición de un grupo de metabolitos específico de cortisol 11,17-dioxiandrostano (11,17-DOA), se ha evaluado exitosamente para 27 cuantificar la actividad adrenocortical en una variedad de especies, siendo aprobado por varios autores como el principal metabolito excretado en fecas de rumiantes (Mormède y col 2007; Möstl y col 1999; Palme y col 2000). Möstl y col (2002) ha descrito un mínimo de 21 metabolitos de cortisol fecal en rumiantes, utilizando cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos químicos, esta separación depende del tamaño de la molécula, por lo que es considerada una técnica muy sensible y precisa a la hora de aislar los metabolitos de cortisol fecales de una especie. Goymann (1999) describió que los anticuerpos de corticosterona reaccionaron con metabolitos conjugados y no conjugados en fecas de hiena (Crocuta crocuta). El kit ICNcorticosterona obtuvo la respuesta de anticuerpos más apropiada para medir la variación de los niveles hormonales posterior al desafío con ACTH en hienas, en este mismo estudio los metabolitos de cortisol mostraron una clara respuesta a ACTH, sin embargo, sus valores basales fueron cercanos e incluso inferiores al límite de detección (Goymann y col 1999). Wasser y col (2000) evaluó 4 kits comerciales para la detección de metabolitos de cortisol en fecas, en base a los resultados de la comparación concluyó que el kit ICN corticosterona de RIA obtuvo la mejor respuesta al presentar una elevada reactividad en la mayoría de los metabolitos de cortisol presentes en fecas posterior a la administración de ACTH en el elefante africano (Loxodota africana), rinoceronte negro (Diceros bicornis), wapiti (Cervus canadensis roosevelti), gacela de Waller (Litocranius walleri), orix blanco (Oryx dammah), nutria marina (Enhydra lutris), oso malayo (Helarctos malayanus), cheetah (Acinonyx jubatus), leopardo longibando (Neofelis nebulosa), macao cola larga (macaca fascicularis) y búho manchado del norte (Strix occidentalis caurina) (Wasser y col 2000). Las altas variaciones en las concentraciones de cortisol en animales de una misma especie, ocurren tanto en sangre como en fecas (Möstl y Palme 2002). A su vez, los animales silvestres en cautividad pueden exhibir niveles de metabolitos de glucocorticoides fecales más altos o más bajos que sus conespecíficos de vida libre, y de esta forma, responden diferencialmente a los tratamientos de un estudio (Millspaugh y Washburn 2004). Diferencias similares en las concentraciones fecales, en lo referente a los valores peak y basales, también han sido descritos en la literatura, lo que ha sido atribuido a la compleja interacción entre genética y experiencias previas que componen la respuesta de un animal (Palme y col 2000). Otros autores señalan que la ausencia de respuesta podría indicar una historia de estrés crónico, o una alteración de los receptores a los glucocorticoides (Mateo y Cavigelli 2005). En todo estudio donde se estime la concentración de hormonas mediante muestreo noinvasivo, se recomienda validar el protocolo en varios niveles. Esto específicamente considera: demostrar la recuperación del ligando agregado al medio, para confirmar que el ensayo cuantitativamente detecta el total de hormona presente. Efectuar paralelismo con el estándar del kit de análisis, el cual demuestra que existe una relación lineal entre la concentración de la hormona blanco y el valor del ensayo obtenido, dentro de los límites de la curva estándar. Demostrar sensibilidad y precisión: unión no específica, ensayos de detección, límites y precisión son características que ilustran las limitaciones del ensayo. Y finalmente, 28 determinar la variabilidad entre muestras, y el promedio de la eficiencia (Buchanan y Goldsmith 2004, Keay y col 2006, Teixeira y col 2007). Lamentablemente, en este estudio no se realizaron estas pruebas que evalúan el protocolo de extracción de hormonas. Por lo cual, en este estudio no es posible asegurar que la extracción en fecas haya sido la apropiada debido a la falta de un protocolo inicial que incorporara esta evaluación. La validación de la técnica de cuantificación de metabolitos de cortisol fecales no resultó en Pudú puda. Las posibles causas de los resultados obtenidos pueden deberse a problemas de manipulación de las muestras en las etapas iniciales de obtención; en la cuantificación de las muestras ya sea por contaminación y/o por un error de reactividad del kit de radioinmunoensayo utilizado; o por carecer de un protocolo que confirme la eficiencia de extracción de los metabolitos de cortisol fecal. Esta última observación queda abierta, por lo que es necesario profundizar esta alternativa a futuro al incluir un análisis con HPLC. 6.1.3 Correlación plasma v/s fecas El análisis de las concentraciones basales de cortisol plasmático y de los metabolitos de cortisol en fecas posterior al desafío con ACTH no fue significativo. Asimismo, el valor de los metabolitos de cortisol fecal como predictor de la concentración de cortisol plasmático, es insuficiente para validar la determinación de estrés a partir de muestras fecales para la especie pudú. Los resultados de este análisis, respaldan el argumento del error de detección del kit de radioinmunoanálisis. Puesto que la regresión lineal se realizó a partir de las muestras basales para sangre y fecas, las que corresponden a los niveles hormonales previos al desafío con ACTH, y que reflejaron una amplia variabilidad en los niveles basales del grupo de animales. 6.2 FECAS DE ANIMALES SOMETIDOS A ELECTROEYACULACIÓN Con el objeto de respaldar la validación farmacológica en este estudio, el procedimiento de electroeyaculación fue equivalente a la manipulación recomendada en la validación biológica. La concentración de los metabolitos de cortisol fecales de los pudúes electroeyaculados fue estadísticamente no significativa. La variación temporal de los niveles de glucocorticoides fecales, evidenció una tendencia a la disminución a partir de los niveles basales, manteniéndose estables posterior a la administración de la ACTH Es de esperar que la respuesta hormonal de la manipulación biológica no arrojara resultados significativos, a raíz de la inconsistencia de los resultados anteriormente expuestos en la regresión lineal de los niveles sanguíneos y fecales, y la imposibilidad de utilizar los niveles hormonales encontrados en fecas como predictor de los niveles sanguíneos. La validación biológica se ha utilizado para evaluar técnicas de reproducción asistida, como es el caso del estudio de Morato y col (2004), que monitoreó la actividad adrenal y los cambios en las concentraciones de los metabolitos de andrógeno en el jaguar (Panhtera onca), posterior a un procedimiento de inmovilización química y electroeyaculación. Por otra parte, 29 Goymann y col (1999), describió los niveles de glucocorticoides fecales en hiena (Crocuta crocuta) después de dos situaciones socialmente estresantes: durante una pelea de dos hienas, y en la translocación de un macho de la especie, en ambas situaciones hubo un aumento de los metabolitos de glucocorticoides fecales. Huber y col (2003), expuso al ciervo rojo a diferentes tipos de disturbios de origen humano, y como resultado obtuvo una respuesta adrenal con diferencias entre individuos. Presumiblemente la obtención de una respuesta adrenal no uniforme, es el resultado de diferencias individuales de temperamento, experiencias tempranas, y percepción del estrés. 6.3 Conclusiones Debido a los resultados no significativos en la correlación de los niveles de cortisol plasmático y los niveles de metabolitos de cortisol en fecas, no se pudo validar la técnica noinvasiva de medición de estrés mediante metabolitos de cortisol fecales en la especie pudú. No fue posible evaluar los cambios cuantitativos de los metabolitos de glucocorticoides fecales, posterior a la elevación de los niveles sanguíneos en el pudú, ni evaluar las variaciones temporales de los metabolitos de glucocorticoides fecales en los animales sometidos al procedimiento de electroeyaculación, debido a los resultados de la correlación de los niveles basales de cortisol plasmático y los metabolitos de cortisol en fecas. Los resultados obtenidos en este estudio no descartan la posibilidad de validar la técnica de cuantificación de glucocorticoides fecales en pudú en el futuro, más bien se sugiere perfeccionar los protocolos de laboratorio tomando en cuenta las siguientes recomendaciones: i) trabajar en un laboratorio certificado para radioinmunoanálisis; ii) realizar un análisis de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), a fin de escoger el inmunoensayo más apropiado para la especie; y iii) evaluar el procedimiento de extracción del cortisol en fecas, mediante las pruebas de paralelismo, precisión y eficiencia de recuperación. Una vez consideradas las recomendaciones de este estudio en futuras investigaciones, e incorporando la ejecución de un HPLC en la detección de los metabolitos específicos de cortisol fecal en la especie Pudú puda, se podrán aprovechar las ventajas de esta técnica como método no invasivo de monitoreo de estrés en pudúes, y se podrá aplicar esta herramienta como indicador de la respuesta adrenal de la especie en programas de conservación. 30 7. BIBLIOGRAFÍA Bartos L; Reyes E; Schams D; Bubenik G; Lobos A. 1998. Rank dependent seasonal levels of IGF-1, cortisol and reproductive hormones in male pudu (Pudu puda). Comp Biochem Physiol Part A 12, 373-378. Becker J, S Breedlove, D Crews, M McCarthy. 2002. Behavioral Endocrinology. Second edition. En: Endocrinology of the Stress-Response. Sapolsky R. The MIT Press. Cambridge, Massachusetts. London, England. Pp.409-450. Bhatnagar S, C Vining. 2003. Facilitation of hypothalamic-pituitary-adrenal responses to novel stress following repeated social stress using the resident/intruder paradigm. Homr and behav. 43, 158-165. Brousset D, F Galindo, R Valdez, M Romano, A Schuneman. 2005. Cortisol en saliva, orina y heces: evaluación no invasiva en mamíferos silvestres. Vet Mex 36 (3): 325-337. Bubenik G, A Bubenik, D Schams, J Leatherland. 1983. Circadian and circannual rhythms of LH, FSH, testosterone (T), prolactin, cortisol, T3 and T4 in plasma of mature, male white-tailed deer. Comp biochem and physiol. A. 76(1):37-45. Bubenik G, R Brown, D Schams. 1991. Antler cycle and endocrine parameters in male axis deer (Axis axis): seasonal levels of LH, FSH, testosterone, and prolactin and results of GnRH and ACTH challenge tests. Comp biochem Physiol A Comp Physiol. 99(4):64550. Bubenik G, L Bartos. 1993. Cortisol levels in red deer (Cervus elaphus) and fallow deer (Damma damma) after an acute ACTH administration. Can J Zool 71, 2258-2261. Bubenik G, E Reyes. 1994. Plasma levels of cortisol, testosterone and growth hormone in pudu (Pudu puda Molina) after ACTH administration. Comp Biochem Physiol 107 A, 523-527. Bubenik G, E Reyes, D Schams, A Lobos, L Bartos. 2000. Pudu, the smallest deer of the World: 10 years of endocrine Studies of Southern pudu (Pudu puda) in Chile. Z Jagdwiss. 46, 129-138. Buchanan K, A Goldsmith. 2004. Noninvasive endocrine data for behavioural studies: the importance of validation. Anim Behav. 67, 183-185. CITES. 2009. Apéndices I, II y III (en vigor a partir del 22 de mayo de 2009). 31 CODEFF. 1991. Informe sobre la captura, comercio y tenencia en cautividad de pudú (Pudu puda) en Chile. Comité Nacional Pro Defensa de la Fauna y Flora. Conklin-Brittain N, E Dierenfeld. 1996. Small rumiants: digestive capacity differences among tour species weighing less than 20 kg. Zoo Biology 15, 481-490. Cortés R, A Angulo, R Guzmán, E Reyes. 1988. Comportamiento del pudú (Pudu puda (Molina)) en cautiverio (mammalia, cervidae). Gayana zool. 52 (1-2): 3-14. Días E, Nichi M, Guimaräes M. 2008. Comparison of two commercial kits and two methods for fecal glucocorticoid analysis in ocelots (Leopardus pardalis) submitted to ACTH challenge. Pesq vet bras 28 (7): 329-334. Goymann W, E Möstl, T Van`t Hof, M East. 1999. Noninvasive fecal monitoring of glucocorticoides in spoted hyenas, Crocuta crocuta. Gen and comp endocr.114, 340348. Goymann W, J Wingfield. 2004. Allostatic load, social status and stress hormones: the costs of social status matter. Anim behav. 67, 591-602. Guyton. 2001. Tratado de Fisiología médica, 10ª Ed. En: Hormonas de la corteza suprarrenal. Editorial Mcgraw-hill/ Interamericana. Madrid, España. Pp 1045-1061. Harper J, S Austad. 2001. Effect of capture and season on fecal glucocorticoid levels in deer mice (Peromyscus maiculatus) and red-backed voles (Clethrionomys gapperi). Gen and comp endocr. 123, 337-334. Huber S, R Palme, W Arnold. 2003. Effects of season, sex, and sample collection on concentrations of fecal cortisol matabolites in red deer (Cervus elaphus). Gen and comp. Endocr. 130:48-54. Iriarte A. 2008. Mamíferos de Chile. Lynx Edicions. Barcelona, España. Pp 220-221. Jiménez C, P Basrur, C Gartley, R Liptrap. 1998. A comparison of the adrenal cortical response to ACTH stimulation in angora and non-angora goats. Veterinary research communications. 22,119-129. Keay M., J Singh, M Gaunt, T Kaur. 2006. Fecal glucocorticoids and their metabolites as indicators of stress in various mammalian species: a literature review. J Zoo Wildl Med. 37(3): 234–244. Koren L, O Mokady, T Karaskov, J Klein, G Koren & E Geffen. 2002. A novel method using hair for determining hormonal levels in wildlife. Anim behav. 63, 403–406. 32 Mateo J, S Cavigelli. 2005. A validation of extraction methods for noninvasive sampling of glucocorticoides in free-living ground squirrels. Physiol Biochem Zool. 78(6):10691084. McEwen B, J Wingfield. 2003. The concept of allostasis in biology and biomedicine. Horm and behav. 43, 2-15 Meier D, M Merino. 2007. Distribution and habitat features of southern pudu (Pudu puda Molina, 1782) in Argentina. Mamm biol. Zeitschrift fur Saugetierkunde. 72 (4)204-212. Millspaugh J, R Woods, K Hunt, K Raedeke, G Brundige, B Washburn, S Wasser. 2001. Fecal glucocorticoid assays and the physiological stress response in elk. Wildlife society bulletin 29(3): 899-907. Millspaugh J, B Washburn, M Milanick, J Beringer, L Hansen, T Meyer. 2002. Non-invasive techniques for stress assessment in White-tailed deer. Wildlife society bulletin. 30(3): 899-907. Millspaugh J, B Washburn. 2004. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. Gen and Comp Endrocr. 138, 189-199. Moberg G, 2000. Biological response to stress: implication for animal welfare. En Moberg G, Ed Mench, JA. The biology of animal stress. CABI Publishing, New York, USA. Pp121. Morato R, M Bueno, P Malmheister, I Verreschi, R Barnabe. 2004. Changes in the fecal concentrations of cortisol and androgen metabolites in captive male jaguars (Panthera onca) in response to stress. Short communication. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 37, 1903-1907. Morgan K, C Tromborg. 2007. Sources of stress in captivity. Appl Anim.Behav Sci. 102(3-4): 262-302. Mormède P, S Andanson, B Aupérin, B Beerda, D Guémené, J Malmkvist, X Manteca, G Manteuffel, P Prunet, C Reenen, S Richard, I Veissier. 2007. Exploration of the hipotalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology & behavior. 92(3):317-39. Möstl E, R Palme. 2002. Hormones as indicators of stress. Domest Anim Endocr 23, 67–74. Möstl E, S Messmann, E Bagu, C Robia, R Palme. 1999. Measurement of glucocorticoid metabolite concentrations in faeces of domestic livestock. J Vet Med.A 46, 621-631. 33 Möstl E, L Maggs, G Schrötter, U Besenfelder, R Palme. 2002. Measurement of cortisol metabolites in faeces of ruminants. Vet res commun. 26,127-139. Nelson R. 2005 An Introduction to behavioral endocrinology, third edition. Chapter 11 Stress. Sinauer Associates, Inc. 23 Plumtree Road Sunderland, MA 01375. USA. Nilssen K, K Bye, J Sunsford, A Blix. 1985. Seasonal changes in T3, FT and cortisol in freeranging Svalvard reindeer (Rangifer tarandus platyrihynchus). Gen and comp endocr. 59, 210-213. Palme R, C Robia, W Baumgartner, E Möstl. 2000. Transport stress in cattle as reflected by increase in faecal cortisol metabolite concentrations. Veterinary record. 146, 108-109. Palme R, S Rettenbacher, C Touma, S El-Bahr, E Möstl. 2005 Stress hormones in mammals and birds: comparative aspects regarding metabolism, excretion, and noninvasive measurement in fecal samples. Ann N Y Acad Sci. 1040, 162-171. Palme 2005. Measuring fecal steroids. Guidelines for practical aplication. Ann N Y Acad Sci. 1046, 75-80. Reyes E., A Angulo, I Hermosilla, S Conejeros. 1988. Ciclo de vida y madurez sexual de Pudu puda (Molina) (Mammalia, Cervidae). Bol Soc Biol Concepción Chile. 59, 143150. Reyes E, G Bubenik, D Schams, A Lobos, R Enriquez.1997a. Seasonal changes of testicular parameters in southern pudu (Pudu pudu) in relationship to circannual variation of its reproductive hormones. Acta Theriol. 42, 25-35. Reyes E, G Bubenik, A Lobos, D Schams, L Bartos.1997b. Seasonal levels of cortisol, IGF-1 and triiodothyronine in adult male pudu (Pudu puda). Folia zoológica. 46(2): 109-116. Reyes E, A Lobos, C Carrasco, R Cortes, G Bubenik, D Schams, L Bartos, Acuña. (2002): Programa Conservación de la Especie Nativa Pudu pudu, MOLINA (MAMMALIA, CERVIDAE). Cría en Cautividad de Fauna Chilena. Pp 363-370. Romero L. 2002. Seasonal changes in plasma glucocorticoid concentrations in free-living vertebrates. Gen Comp Endocr. 128, 1-24. Romero M. 2004. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. TRENDS in Ecology and Evolution. 19(5): 249-255. Säkkinen H, J Tonberg, P Goddard, E Eloranta, E Dahl, E Ropstad, S Saarela. 2005. Adrenal responsiveness of reindeer (Rangifer tarandus tarandus) to intravenously adminestered ACTH. Anim Science 81,399-402. 34 Sands J, S Creel. 2004. Social dominance, aggression and faecal glucocorticoid levels a wild population of wolves, Canis lupus. Anim. Behav. 67, 387-396. Sapolsky R, M Romero, A Munck. 2000. How do glucocorticoids influence stress responses? Integrating permissive, suppressive, stimulatory, and preparative actions. Endocrine reviews. 21, 55-89. Smith J, G Bubenik. 1990. Plasma concentrations of glucocorticoids in white-tailed deer: the effect of acute ACTH and dexametasone administration. Can J Zool 68(10): 2123-2129. Soto-Gamboa M, S González, L Hayes, L Ebensperger. 2009. Validation of a radioimmunoassay for measuring fecal cortisol metabolites in the hystricomorph rodent, Octodon degus. J Exp zool. Part A, Ecological genetics and physiology. 311(7): 496503. Summers C. 2002. Social interaction over time, implications for stress responsiveness. Integ Comp Biol. 42, 591-599. Teixeira C, C Schetini, M Mendl, C Cipreste, R Young. 2007. Revising translocation and reintroduction programmes: the importance of considering stress. Anim behav 73,1-13. UICN. 2009. IUCN Lista Roja de Especies Amenazadas. Versión 2009.1. Descargado el 26 de septiembre de 2009. Valdespino C, R Martínez-Mota, L García-Feria, E Martínez-Romero. 2007. Evaluación de eventos reproductivos y estrés fisiológico en vertebrados silvestres a partir de sus excretas: evolución de una metodología no invasiva. Acta zoológica mexicana. 23 (3): 151-180. Van Mourik S, T Stelmasiak 1984. Adrenal response to ACTH stimulation in Rusa deer (Cervus rusa timorensis). Comp biochem Physiol A Comp Physiol. 79(4): 581-4. Washburn B, J Millspaugh. 2002. Effects of simulated environmental conditions on glucocorticoid metabolite measurements in white-tailed deer feces. Gen and Comp Endocr. 127, 217-222. Wasser S, K Hunt, J Brown, K Cooper, C Crockett, U Bechert. 2000. A generalized fecal glucocorticoid assay for use in a diverse array of nondomestic mammalian and avian species. Gen Comp Endocrinol 120, 260-275. Wingfield J, A Kitaysky. 2002. Endocrine responses to unpredictable environmental events: stress or anti-stress hormones? Integ Comp Biol 42, 600-609. 35 8. ANEXOS ANEXO 1. Esquema de toma de muestras de sangre y almacenamiento en el desafío de ACTH en Pudú puda. 36 ANEXO 2. Esquema de toma de muestras de fecas, almacenamiento y extracción de cortisol fecal en en desafío de ACTH en Pudú puda. 37 ANEXO 3. Esquema de radioinmunoanálisis en desafío de ACTH en Pudú puda. 38 ANEXO 4. Tabla resumen del peso, sexo, edad, promedio y niveles basales de cortisol fecal y plasmáticos por individuo, en el desafío de ACTH en Pudú puda. Animal Sexo Edad Peso Cort. plasmático (basal) Metab. Cort. Fecal (basal) Prom. Cort. plasmático Prom. Met. Cort. fecal 1 08-007 macho 5 años 8kg 16,45 ng/ml 118,68 ng/gr de fecas 15,65 ng/ml 138,52 ng/gr de fecas 2 08-011 macho 3,5 años 10,8kg 19,24 ng/ml 90,15 ng/gr de fecas 19,68 ng/ml 116,96 ng/gr de fecas 3 08-009 hembra 5,5 años 9kg 13,02 ng/ml 126,99 ng/gr de fecas 24,25 ng/ml 116,71 ng/gr de fecas 4 08-010 hembra 3 años 8,8kg 28,37 ng/ml 151,20 ng/gr de fecas 18,27 ng/ml 132,77 ng/gr de fecas 5 08-008 hembra 4,5 años 8,8 kg 11,41 ng/ml 90,13 ng/gr de fecas 11,64 ng/ml 153,47 ng/gr de fecas 6 08-016 hembra 1,5 años 6,1kg 16,04 ng/ml 125,79 ng/gr de fecas 17,9 ng/ml 111,74 ng/gr de fecas 7 08-019 hembra 2 años 6,7kg 15,7 ng/ml 102,95 ng/gr de fecas 15,1 ng/ml 108,59 ng/gr de fecas 39 ANEXO 5. Niveles de cortisol plasmático y fecal en el desafío de ACTH en Pudú puda. 08-007 22 Cortisol plasmático (ng/ml) 20 18 16 14 12 10 basal 30 55 70 85 115 Tiempo (minutos) Col 1 08-007F Cortisol fecal (ng/ml fecas) 160 150 140 130 120 110 basal 24 30 36 48 72 Tiempo (horas) Col 1 Animal 08-007 Sexo macho Edad 5 años Peso 8kg Cort. plasmático (basal) 16,45 ng/ml Metab. Cort. Fecal (basal) 118,68 ng/gr de fecas Prom. Cort. plasmático 15,65 ng/ml Prom. Met. Cort. fecal 138,52 ng/gr de fecas 40 08-008 18 Cortisol plasmático (ng/ml) 16 14 12 10 8 basal 30 55 70 85 115 Tiempo (minutos) Col 1 08-008F 150 Cortisolfecal (ng/gr fecas) 140 130 120 110 100 90 80 basal 24 30 36 48 72 Tiempo (horas) Col 1 Animal Sexo Edad Peso Cort. plasmático (basal) Metab. Cort. Fecal (basal) Prom. Cort. plasmático 08-008 hembra 4,5 años 8,8 kg 11,41 ng/ml 90,13 ng/gr de fecas 11,64 ng/ml Prom. Met. Cort. fecal 153,47 ng/gr de fecas 41 08-009 35 Cortisol plasmático (ng/ml) 30 25 20 15 10 basal 30 55 70 85 115 Tiempo(minutos) Col 1 08-009F 240 Cortisol fecal (ng/gr fecas) 220 200 180 160 140 120 100 basal 24 30 36 48 72 Tiempo (horas) Col 1 Animal Sexo Edad Peso Cort. plasmático (basal) Metab. Cort. Fecal (basal) Prom. Cort. plasmático 08-009 hembra 5,5 años 9kg 13,02 ng/ml 126,99 ng/gr de fecas 24,25 ng/ml Prom. Met. Cort. fecal 116,71 ng/gr de fecas 42 08-010 30 Cortisol plasmático (ng/ml) 28 26 24 22 20 18 16 14 12 basal 30 55 70 85 115 48 72 Tiempo(minutos) Col 1 08-010F 160 Cortisol fecal (ng/gr fecas) 150 140 130 120 110 basal 24 30 36 Tiempo (horas) Col 1 Animal Sexo Edad Peso Cort. plasmático (basal) Metab. Cort. Fecal (basal) Prom. Cort. plasmático 08-010 hembra 3 años 8,8kg 28,37 ng/ml 151,20 ng/gr de fecas 18,27 ng/ml Prom. Met. Cort. fecal 132,77 ng/gr de fecas 43 08-011 28 Cortisol plasmático (ng/ml) 26 24 22 20 18 16 14 12 basal 30 55 70 85 115 Tiempo(minutos) Col 1 08-011F 180 Cortisol fecal (ng/gr fecas) 160 140 120 100 80 basal 24 30 36 48 72 Tiempo(horas) Col 1 Animal Sexo Edad Peso Cort. plasmático (basal) Metab. Cort. Fecal (basal) Prom. Cort. plasmático 08-011 macho 3,5 años 10,8kg 19,24 ng/ml 90,15 ng/gr de fecas 19,68 ng/ml Prom. Met. Cort. fecal 116,96 ng/gr de fecas 44 08-016 28 Cortisol plasmático (ng/ml) 26 24 22 20 18 16 14 12 basal 30 55 70 85 115 48 72 Tiempo(minutos) Col 1 08-016F 150 Cortisol fecal (ng/gr fecas) 140 130 120 110 100 90 80 basal 24 30 36 Tiempo (horas) Col 1 Animal Sexo Edad Peso Cort. plasmático (basal) Metab. Cort. Fecal (basal) Prom. Cort. plasmático 08-016 hembra 1,5 años 6,1kg 16,04 ng/ml 125,79 ng/gr de fecas 17,9 ng/ml Prom. Met. Cort. fecal 111,74 ng/gr de fecas 45 08-019 17 Cortisol plasmático (ng/ml) 16 15 14 13 12 11 basal 30 55 70 85 115 Tiempo (minutos) Col 1 08-019 130 Cortisol fecal (ng/gr fecas) 125 120 115 110 105 100 95 90 basal 24 30 36 48 72 Tiempo(horas) Col 1 Animal 08-008 Sexo hembra Edad 4,5 años Peso 8,8 kg Cort. plasmático (basal) 11,41 ng/ml Metab. Cort. Fecal (basal) 90,13 ng/gr de fecas Prom. Cort. plasmático 11,64 ng/ml Prom. Met. Cort. fecal 153,47 ng/gr de fecas 46 9. AGRADECIMIENTOS Iniciar este manifiesto no es menos complejo que concretar una tesis. Podría agradecer íntimamente a ciertos momentos y recuerdos insignificantes dentro de algún contexto en particular, sin embargo, infinitamente claves en mi constitución como persona y profesional. Precisamente doy gracias a las palabras que improntaron efímeros soplos de dicha y desamparo en mis exploradores pasos a lo largo de mis años universitarios en esta imprecedible ciudad. Y para ser más concreta en mi reconocimiento, ¿Cómo no incluir a la fiel lluvia?, que en cada desaire me hizo sentir más viva. Asimismo retribuyo a la enigmática madera que tanto contiene y glorifica en sus vetas y formas. Es difícil olvidar en este personal homenaje al incondicional plato de comida, adobado de amor por añosas manos de sacrificio, que me brindó los placeres culinarios más entrañables. Gracias a mis desmoronamientos, a las ausencias, a cada anochecer de estrellas esperanzadas en que retomé mis harapientas fuerzas, a las miradas ajenas y fulminantes que me hicieron renacer, sin ni siquiera sospecharlo…Y por supuesto, al sinsentido que reaparece donde menos sospecho. Sin duda este proceso no se podría haber concretado sin la participación de numerosos y reconocidos colaboradores, entre los que quiero destacar: Alejandro Aleuy, Mauricio Soto, Claudio Verdugo, Eugenia Reyes, George Bubenik, María Isabel Astorquiza, Eduardo Silva, Gabriel Ortega, Guillermo Santibañez, Carlos Rodríguez, Sandra González, Carolina Tapia, Alejandro Cordero, Roberto Freraut y Antonio Muñoz, Jose Morales, Roberto Leal, Natalia Ciudad, Sergio Medel, Susana Muñoz, Ariana Cabrera, Angelo Espinoza, Annie, Mark y Sara, Ricardo y Felipe Valenzuela, Oscar Alocilla, Carlos Lara, y a las tías del comedor San Antonio de la Iglesia San Francisco. A todos ustedes mis infinitos agradecimientos y mis mejores pretensiones para vuestros proyectos de vida.