UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
Instituto de Ecología y Evolución
Facultad de Ciencias
DETERMINACIÓN DE ESTRÉS A PARTIR DE MUESTRAS FECALES EN EL
PUDÚ (PUDÚ PUDA): EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA EXTRACCIÓN DE
SEMEN EN LOS ANIMALES DEL CENTRO DE REHABILITACIÓN DE
FAUNA SILVESTRE (CEREFAS), UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE.
Memoria de Título presentada como parte
de los requisitos para optar al TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO.
ANGELICA ISABEL ROMERO ROMERO
VALDIVIA – CHILE
2009
PROFESOR PATROCINANTE
______
Mauricio Soto G.
PROFESOR CALIFICADOR
Firma
____
Roberto Schlatter V.
Firma
Jorge Oltra C.
Firma
PROFESOR CALIFICADOR
FECHA DE APROBACIÓN: _
_30 de Octubre de 2009______________
Dedicado a
Magdalena, en tu
constante empuje y
amor encontré mi
frágil amparo.
ÍNDICE
Capítulo
Página
1. RESUMEN……………………………………………… 1
2. SUMMARY…………………………………………….. 2
3. INTRODUCCIÓN……………………………………... 3
4. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………… 12
5. RESULTADOS………………………………………… 19
6. DISCUSIÓN………………………………………….... 23
7. BIBLIOGRAFÍA………………………………………. 30
8. ANEXOS……………………………………………….. 35
9. AGRADECIMIENTOS………………………………… 46
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1. RESUMEN
La cuantificación de glucocorticoides fecales es una técnica no invasiva de monitoreo
hormonal que permite estimar los niveles fisiológicos de estrés de un animal. La característica
de ésta técnica es que no necesita tener al animal que se está evaluando en forma directa, es
decir, evita la manipulación y consecuentemente alteración de los niveles plasmáticos de
glucocorticoides. Para la implementación de esta técnica se requiere de una previa validación,
lo cual es especie específica, y demuestra la consistencia entre los niveles de metabolitos de
glucocorticoides fecales y su relación con los niveles plasmáticos de la hormona. El objetivo
de este estudio fue realizar la validación de la técnica de cuantificación de metabolitos de
glucocorticoides fecales en el pudú (Pudu puda). Este se realizó en dos etapas: primero la
validación fisiológica, donde se estimuló la actividad adrenal a partir de 5UI de ACTH
intramuscular, mediante la determinación de los niveles de cortisol plasmático y de los
metabolitos de cortisol fecales. En segundo lugar, se procedió a realizar la validación
biológica, la cual consiste en estimular la secreción adrenal sin una inducción fisiológica. Para
ello se trabajó con cuatro pudúes electroeyaculados en CEREFAS, y se les determinó de los
niveles de cortisol plasmático y de los metabolitos de cortisol fecalesPara la obtención de las
muestras de sangre los animales fueron anestesiados con Xilazina y Ketamina, se obtuvieron
12 muestras de plasma mediante un catéter endovenoso en la yugular luego de la
administración de la ACTH. Las muestras de fecas se tomaron con el animal recuperado de la
anestesia, cada tres horas hasta las 36 horas, y las muestras de los pudúes electroeyaculados
incluyeron una muestra basal y tres muestras posteriores a la manipulación. La determinación
del cortisol plasmático y fecal se realizó mediante radioinmunoensayo (RIA). La
concentración del cortisol plasmático posterior a la administración de ACTH fue
estadísticamente no significativa, al igual que los niveles de metabolitos de cortisol en fecas, y
los metabolitos de cortisol en fecas de los pudúes electroeyaculados. Los resultados de este
estudio podrían atribuirse a un error de detección del kit de RIA, o a una contaminación de las
muestras durante la ejecución del radioinmunoanálisis. Debido a los resultados no
significativos de este estudio, no se pudo validar la técnica no-invasiva de medición de estrés
mediante metabolitos de cortisol fecales en la especie pudú. Para futuros estudio de cortisol
fecal en esta especie se recomienda perfeccionar los protocolos de laboratorio en cada una de
sus etapas.
Palabras claves: Estrés, técnica no invasiva, metabolitos de cortisol fecal, pudú.
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2. SUMMARY
DETERMINATION OF STRESS THROUGH FECAL SAMPLES IN PUDÚ (Pudu
puda): ASSESSMENT OF THE EFFECT OF REMOVAL OF SPERM IN THE
ANIMALS OF THE CENTER FOR REHABILITATION OF WILDLIFE
(CEREFAS), UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
The quantification of fecal glucocorticoids is a noninvasive technique made to monitor
hormone levels in order to estimate the physiological stress of an animal. The characteristic of
this technique is that it the animal doesn´t need being tested directly, and prevents the
manipulation and consequently altered plasma levels of glucocorticoids. The implementation
of this technique requires a prior validation, which is species specific, and demonstrates the
consistency between the levels of fecal glucocorticoid metabolites and their relation to
hormonal plasma levels. The aim of this study is to validate the technique of quantifying fecal
glucocorticoid metabolites in the pudu (Southern Pudu). This is done in two stages: first a
physiological validation, which stimulates the adrenal activity after intramuscular ACTH 5UI
by determining the levels of plasma cortisol and fecal cortisol metabolites. Secondly, we
proceeded to the biological validation, which is purposed to stimulate adrenal secretion
without a physiological induction. This was achieved using four pudúes electroejaculated
in CEREFAS, which determined the levels of plasma cortisol and fecal cortisol metabolites.
To obtain the blood samples the animals were anesthetized with Xylazine and Ketamine. 12
plasma samples were obtained by intravenous catheter located in the jugular after ACTH
administration. All faecal samples were taken with the animal recovered from anesthesia,
every three hours up to 36 hours. The samples of electroejaculator animals included a baseline
sample and three samples after handling. The determination of plasma and fecal cortisol was
performed by radioimmunoassay (RIA). The concentration of cortisol plasma after the
administration of ACTH was not statistically significant, as the levels of cortisol metabolites
in faeces, and the cortisol metabolites in faeces of pudús electroeyeculate. The results of this
study may be related to error detection RIA kit, or a contamination of samples during the
performance of radioimmunoassay. Due to the non-significant results of this study it wasn´t
posible to validate the non- invasive technique for measuring stress through fecal cortisol
metabolites in the pudu. For future studies of fecal cortisol in this species its recommended to
refine the laboratory protocols in each of its stage.
Key words: Stress, non invasive technique, fecal cortisol metabolites, pudú.
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3. INTRODUCCIÓN
3.1 DEFINICIÓN DE ESTRÉS
Históricamente el término “estrés” ha sido utilizado para referirse a varios conceptos
diferentes: incluyendo el estímulo nocivo al cual un animal se expone; la respuesta fisiológica
y conductual producto de la estimulación; y la enfermedad derivada de un estímulo
permanente sobre el individuo (Romero 2004). Los eventos impredecibles en la vida de un
animal comúnmente son denominados “fuentes de estrés”, y la respuesta del organismo frente
a dicha perturbación desencadena una cascada de reacciones a nivel fisiológico y conductual
controladas por mecanismos de regulación hormonal (Wingfield y Kitasky 2002, Valdespino
y col 2007). Tales “fuentes de estrés” actúan como estímulos específicos capaces de producir
un desequilibrio en la homeostasis de un organismo (Becker y col 2002). La respuesta
generada frente a estas fuentes de estrés, consiste en un ajuste del organismo, que involucra
una cambio fisiológico acumulativo que permite reestablecer el balance homeostático, lo que
se entiende como “la respuesta al estrés” (Romero 2004, Mateo y Cavigelli 2005). Dicho de
otro modo, el término estrés considera dos sucesos secuenciales: la fuente de estrés y la
respuesta frente a esta exposición (Becker y col 2002, Wingfield y Kitaysky 2002).
Se distinguen dos formas de presentación del estrés: el estrés agudo, el cual es desencadenado
por eventos impredecibles, por ejemplo: el ataque de depredadores, climas adversos
inesperados, interacciones sociales agonistas, transporte, captura y sujeción física, entre otros.
La respuesta fisiológica de los organismos se caracteriza por ser rápida, minutos y/u horas
(Summers 2002, Keay y col 2006). Por otro lado, el estrés crónico es el resultado de una
exposición prolongada a una situación estresante para el individuo, tal como condiciones de
cautividad adversas, disminuciones de la disponibilidad de alimento, enfermedades, y
dinámicas de jerarquías sociales, entre otros (Summers 2002, Sands y Creel 2004, Mateo y
Cavigelli 2005, Keay y col 2006). En estos términos, es evidente que este tipo de situaciones
de estrés puede tener efectos nocivos en la sobrevivencia de especies que no poseen los
mecanismos que compensen dichas perturbaciones, afectando el metabolismo, la función
vascular, el crecimiento, la reparación tisular, la respuesta inmune, y el metabolismo neuronal
(Romero 2002, Summers 2002, Wingfield y Kitaysky 2002, Keay y col 2006).
McEwen y Wingfield (2003), definieron la homeostasis (pH, temperatura corporal,
niveles de glucosa y tensión de oxígeno) como la estabilidad de los sistemas fisiológicos que
mantienen la vida. De este modo propusieron un nuevo concepto llamado “alostasis”, que se
entiende como un proceso auxiliar que compensa los desajustes dados por una fuente de estrés
hasta volver a un estado de homeostasis (Goymann y Wingfield 2004).
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3.2 REGULACIÓN DEL EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-ADRENAL (HHA)
Cuando un estímulo actúa sobre los sentidos de un animal, el sistema nervioso aferente
lo recibe y conduce a las áreas sensitivas del sistema nervioso central. Entonces se genera una
respuesta enfocada a disminuir el impacto del estímulo, a través del sistema nervioso
autónomo y neuroendocrino (Brousset y col 2005).
La estimulación de la parte simpática del sistema nervioso autónomo provoca la
primera curva de secreción hormonal, ésta ocurre dentro de segundos e involucra un aumento
de la secreción de catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) desde la médula adrenal; el
hipotálamo inicia la respuesta al estrés mediante el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (HHA)
liberando la hormona liberadora de corticotropina (CRH) que es secretada por el plexo capilar
primario en la eminencia media del hipotálamo hacia la circulación porta. Esta hormona
estimula las células especializadas de la glándula pituitaria anterior (corticotrofos) induciendo
la liberación de adrenocorticotropina (ACTH) 10 minutos después, la que a su vez provoca la
estimulación de la corteza adrenal, y la posterior liberación de glucocorticoides hacia la
circulación (Sapolsky y col 2000, Becker y col 2002 Keay y col 2006).
Los glucocorticoides son esteroides que tienen dos formas de presentación: el cortisol
y la corticosterona; siendo el cortisol más dominante en primates, humanos, ovejas, cerdos,
visón, zorro y peces, y la corticosterona en aves, reptiles y roedores (Becker y col 2002,
Romero 2002, Mormède y col 2007). En la regulación de la actividad secretora del eje HHA,
el cortisol ejerce un efecto directo de retroalimentación negativa sobre el hipotálamo
disminuyendo la síntesis de CRH y/o directamente sobre la adenohipófisis, lo que genera una
reducción de la formación de ACTH (Guyton 2001).
La actividad del eje HHA es variable, puesto que el ciclo diurno esta genéticamente
determinado y sincronizado por la luz, sumada a esta fuente de variabilidad, la secreción de
cortisol es pulsátil, con una periodicidad de alrededor de 90 minutos. En general, el máximo
de los niveles hormonales ocurre en el inicio del período de luz en animales diurnos, mientras
que en las especies nocturnas éste ocurre al fin del período de luz (Brousset y col 2005).
Sumado a esta variabilidad, se ha descrito que la respuesta al estrés es relativamente no
específica, esto quiere decir que diferentes fuentes de estrés pueden llegar a producir similares
respuestas conductuales y fisiológicas en un individuo (Nelson 2005).
Wingfield y Kitaysky (2002), propusieron tres niveles en la secreción de
glucocorticoides, el primero corresponde a una secreción de niveles basales, los que
cumplirían un rol esencial de mantención en la regulación de sales y energía; el segundo nivel
corresponde a los cambios predecibles que ocurren durante un período de tiempo que puede
estar regulado por ritmos circadianos y circanuales, es decir, involucra el metabolismo, los
procesos de osmorregulación, y los cambios fisiológicos y conductuales del individuo dentro
de un ciclo; y el último nivel abarca las respuestas generadas ante una situación impredecible,
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lo que consecuentemente podría registrar los aumentos transitorios más altos de secreción de
glucocorticoides en un individuo.
Una exposición repetida a un factor estresante o una condición de estrés crónico tiene
implicancias directas en la conducta y fisiología de un animal. Tales efectos involucran
cambios a nivel del eje HHA al realzar las subsecuentes respuestas frente a nuevas fuentes de
estrés. Este tipo de respuestas se entiende como facilitación, y corresponde a la mantención o
al realce de la actividad del eje HHA en animales previamente estresados, producido por una
señal de retroalimentación negativa en respuesta a la liberación de glucocorticoides como
resultado de experiencias de estrés crónico, éstos cambios parecen depender de la fuente de
estrés y del circuito neuronal y su actividad (Bhatnagar y Vining 2003, Romero 2004,
Mormède y col 2007). La interpretación de la respuesta al estrés como instrumento de
medición debe ser cuidadosa debido a la variación de la actividad del eje HHA, determinado
tanto por factores internos (genética y secreción pulsátil de cortisol) como por factores
externos (ingesta de alimento, temperatura, régimen de luz) (Moberg 2000, Mormède y col
2007).
3.3 HORMONAS INVOLUCRADAS EN LA RESPUESTA DEL ESTRÉS
Ante una situación de estrés, el organismo tiene una serie de reacciones fisiológicas
que comprenden la activación del eje HHA y del sistema nervioso periférico. En una escala de
segundos a minutos, la secuencia de la respuesta frente a un estresor es la siguiente: 1)
aumento inmediato de la disponibilidad de energía (movilización de energía almacenada,
inhibición del almacenamiento energético, y gluconeogénesis); 2) aumento de la irrigación
hacia el músculo en ejercicio a través del realce del tono cardiovascular, y consecuentemente
aumento del ingreso de oxígeno; 3) disminución del flujo sanguíneo a las áreas no
involucradas en el movimiento 4) inhibición de los procesos energéticamente costosos que no
están relacionados con la sobrevivencia inmediata, como digestión, crecimiento, función
inmune, y reproducción; 5) disminución de la percepción del dolor; 6) incremento de la
agudeza cognitiva, la memoria, la tasa de perfusión cerebral y la utilización cerebral local de
glucosa (Sapolsky y col 2000, Nelson 2005).
En este sentido, las hormonas principalmente involucradas en la repuesta al estrés son
los glucocorticoides y las catecolaminas (Becker y col 2002). El sistema nervioso periférico
esta compuesto por el sistema nervioso simpático (SNS), y el sistema nervioso parasimpático
(SNPs), cuyas funciones son antagónicas. El SNPs media las funciones vegetativas, tales
como el crecimiento, la digestión, el ritmo cardíaco lento y la respiración, generalmente es
estimulado durante el descanso, o después de una gran ingesta de alimentos. En contraste, el
SNS es estimulado al despertar, ante una situación de alarma, o en un estado de emergencia
(Becker y col 2002). La respuesta cardiovascular al estrés comprende un aumento en el gasto
cardíaco y la presión sanguínea mediante la acción de las catecolaminas, este tipo de acciones
se ejerce a corto plazo (Sapolsky y col 2000, Guyton 2001, Nelson 2005).
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La mayoría de las acciones de los glucocorticoides en las reacciones inflamatorias e
inmunes son de carácter supresivo. La secreción de glucocorticoides en respuesta al estrés
agudo modela y restringe la respuesta inmune, sin embargo, la exposición prolongada a la
secreción de glucocorticoides puede contribuir al desarrollo de inmunosupresión. En caso del
metabolismo incrementan las concentraciones circulantes de glucosa disponibles para su
utilización por órganos esenciales para la vida, tales como el cerebro y el corazón, y estimulan
la glicogenólisis y gluconeogénesis mediante el glucagón y las catecolaminas. Ante
situaciones de estrés pueden suprimir la conducta de alimentación, este efecto se desencadena
dentro de una hora incluso en animales con privación del alimento (Sapolsky y col 2000,
Becker y col 2002).
Los glucocorticoides incrementan la utilización local de glucosa dentro de segundos,
mediante el transporte de glucosa hacia el cerebro, esta acción es mediada por activación
simpática. La exposición prolongada a glucocorticoides atrofia los procesos neuronales del
hipocampo, lo que se traduce en pérdida de neuronas (Sapolsky y col 2000, Guyton 2001).
Cuando se inicia la respuesta al estrés comienza la inhibición de la conducta y la
fisiología reproductiva, lo que involucra una disminución de las concentraciones de la
hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) portales y la liberación de gonadotropinas
desde la pituitaria. En los mamíferos los efectos antagónicos de los glucocorticoides en la
fisiología reproductiva son manifestados más lentamente, comenzando con un decline en las
concentraciones de esteroides sexuales circulantes en un curso de horas, y de manera más
integrativa, como disrupción del ciclo ovulatorio, en un curso de días a semanas (Sapolsky y
col 2000, Wingfield y Kitaysky 2002).
Otras hormonas liberadas en la respuesta al estrés son las endorfinas, la prolactina, la
vasopresina, y la secreción pancreática de glucagón. Las endorfinas son secretadas por la
glándula pituitaria, y su rol en la respuesta al estrés se relaciona con la regulación de la
percepción del dolor. La vasopresina, hormona secretada por la neurohipófisis, esta
involucrada en la regulación del volumen de agua y la función renal. El glucagón participa en
la regulación de la disponibilidad de glucosa (Becker y col 2002, Möstl y Palme 2002).
3.3.1 Cortisol
El cortisol es secretado por la zona fascicular, la capa media y más ancha de la corteza
suprarrenal. El cortisol al igual que todas las hormonas corticosuprarrenales es un esteroide
derivado del colesterol (Guyton 2001). Debido a su naturaleza lipofílica difunde fácilmente
por las membranas celulares hacia el interior de la célula, esta característica le permite
interactuar con receptores intracelulares de mineralocorticoides y glucocorticoides, e incluso
atravesar la barrera sanguínea del cerebro (Mormède y col 2007).
Aproximadamente un 10% del cortisol que se libera a la circulación permanece en
estado libre, lo que corresponde a la fracción de la hormona activa, el resto del cortisol
circulante se une a proteínas transportadoras, un 70% la globulina de unión a corticosteroides
(CBG) o transcortina, y un 20% la albúmina (Mormède y col 2007). Esta unión tan estable a
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las proteínas del plasma retarda la eliminación del cortisol plasmático por lo tanto la semivida
de éste es larga, alrededor de 60-90min (Guyton 2001). En altas concentraciones, tales como
durante una estimulación con ACTH o estrés, los niveles plasmáticos de cortisol aumentan
rápidamente incrementándose en un 20-30% (Mormède y col 2007).
El cortisol al igual que el resto de los esteroides suprarrenales se descompone en el
hígado donde es conjugado para formar ácido glucorónico, aproximadamente un 25% de éstos
conjugados se elimina por la bilis y luego por las heces (Guyton 2001). Tiene actividad
catabolítica (proteolítica y lipolítica) en tejidos periféricos y una actividad anabólica en
hígado, incluyendo síntesis proteica y gluconeogénesis (Mormède y col 2007). También
reduce moderadamente la utilización de glucosa por la mayoría de las células del cuerpo
(Guyton 2001). Actúa en el proceso de la inflamación atenuando sus efectos, mediante la
estabilización de las membranas lisosómicas, lo que permite una menor liberación de
bradicinina, enzimas proteolíticas, prostaglandinas y leucotrienos. También reduce la
permeabilidad de los capilares, la emigración de leucocitos al área afectada y la fagocitosis de
las células dañadas. Suprime el sistema inmune y en especial los linfocitos T, lo que reduce
las reacciones titulares en las zonas inflamadas, e incluso después de establecida la
inflamación, bloquea casi de inmediato los factores que fomentan la inflamación, acelerando
el ritmo de cicatrización (Guyton 2001).
3.4 TÉCNICAS NO INVASIVAS EN LA MEDICIÓN DE GLUCOCORTICOIDES
El monitoreo hormonal del estrés es una herramienta que permite cuantificar el
impacto de las fuentes de estrés potencialmente perjudiciales para las especies (Goymann y
col 1999). Los métodos no-invasivos de cuantificación de glucocorticoides se han utilizado en
una amplia variedad de disciplinas (ecología conductual, biología de la conservación, estudios
de ecología evolutiva, ornitología, primatología, bienestar animal, etc) para examinar la
actividad adrenal, el estrés social, los efectos de ambientes estresantes, la dominancia social
(Buchanan y Goldsmith 2004) y el estado reproductivo de una variedad de taxas (Goymann y
col 1999, Washburn y Millspaugh 2002, Möstl y Palme 2002, Palme 2005).
En animales mantenidos en cautiverio se ha utilizado para evaluar procedimientos
veterinarios, manejos anestésicos, el impacto de diferentes tipos de instalaciones o prácticas
de enriquecimiento ambiental, e incluso técnicas de reproducción asistida (Morato y col 2004,
Brousset y col 2005, Morgan y Tromborg 2007). En animales silvestres se ha propuesto como
herramienta para evaluar si las condiciones de cautividad, anestesia, manipulación,
procedimientos de reubicación, reintroducción, e interacciones sociales agonistas pueden
afectar su estado reproductivo y/o fisiológico general (Wasser y col 2000, Morato y col 2004,
Brousset y col 2005, Valdespino y col 2007).
Las ventajas del uso de las técnicas no-invasivas son: en primer lugar no requiere la
manipulación directa de los animales (Harper y Austad 2001, Mateo y Cavigelli 2005, Palme
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y col 2005, Keay y col 2006); en segundo lugar, es una medida del nivel de estrés de minutos
u horas antes del encuentro con el animal, eliminando el incremento transitorio en los niveles
de glucocorticoides, por efecto de la manipulación del animal (Buchanan y Goldsmith 2004,
Keay y col 2006). Otra ventaja es que permiten obtener muestras retrospectivas (Harper y
Austad 2001), las cuales representan el promedio de la producción hormonal de acuerdo a un
cierto margen temporal. Finalmente, no es necesario tener en forma directa al animal que se
está estudiando (Mateo y Cavigelli 2005, Palme y col 2005). Sin embargo, este tipo de
mediciones sólo reflejan un valor promedio de los niveles hormonales y no es posible detectar
efectos puntuales de secreción. De esta forma, en comparación con los niveles plasmáticos,
las mediciones no-invasivas pueden resultar en una pérdida de la sensibilidad en algún
análisis subsiguiente que examine la relación entre los niveles hormonales y otras variables
(Buchanan y Goldsmith 2004).
Un requisito para estas técnicas indirectas es la validación, y esta es especie específico,
debido a que la ruta de excreción y el tipo de metabolitos excretados varía entre especies, y en
muchos casos entre sexos (Brousset y col 2005). De esta forma el proceso de validación pasa
por la consistencia entre los niveles de metabolitos de glucocorticoides fecales y su relación
con los niveles de hormona circulantes en el plasma sanguíneo (Keay y col 2006). En el caso
de las muestras de orina pueden obtenerse del animal, aspirarse del piso, o mediante jaulas
especialmente diseñadas para su obtención. La cantidad de orina producida a lo largo del día
no es constante, y la concentración de cualquier soluto presente en ella se modifica de acuerdo
a la cantidad de agua y sales inorgánicas filtradas a través del riñón (Brousset y col 2005).
Muestras de orina y fecas muchas veces son difíciles de obtener en especies de vida silvestre
que no pueden ser observadas continuamente, o en especies que defecan en letrinas
comunitarias, en tales casos, el pelo puede ser una alternativa no invasiva, no obstante, no se
recomienda para estudios que requieran un monitoreo hormonal por períodos cortos (Koren y
col 2002).
Los análisis de cortisol salival permiten repetir las mediciones de cortisol por cortos
períodos de tiempo, el cortisol tarda menos de un minuto en pasar de la sangre a la saliva, por
lo tanto, la toma de muestras debe restringirse a este margen temporal, para detectar los
cambios en los niveles del cortisol (Millspaugh y col 2002, Brousset y col 2005). En saliva los
glucocorticoides existen sólo en forma libre, ya que la saliva esta desprovista de proteínas de
unión. El factor limitante en esta técnica es la sensibilidad y especificidad del ensayo.
3.4.1 Cuantificación de Glucocorticoides fecales
Particularmente la cuantificación de glucocorticoides se ha utilizado como una medida
directa de los niveles de estrés al cual se encuentra expuesto un individuo, y esta
cuantificación tradicionalmente se ha realizado midiendo los niveles plasmáticos de
glucocorticoides. Lamentablemente, la obtención de las muestras de sangre es un
procedimiento invasivo para el animal, el cual puede alterar los niveles de glucocorticoides
circulantes como respuesta a la manipulación (Möstl y Palme 2002, Romero 2002, Mateo y
Cavigelli 2005, Keay y col 2006, Valdespino y col 2007).
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Para realizar la validación de la técnica de cuantificación de glucocorticoides fecales,
es necesario administrar una ACTH exógena al animal. Ésta actúa a nivel de la corteza
adrenal produciendo una liberación de glucocorticoides (cortisol y corticosterona).
Como consecuencia de esto, los niveles hormonales plasmáticos se incrementan, luego
de un retorno a los niveles basales normales después del período de acción de la ACTH
(Mateo y Cavigelli 2005, Palme y col 2005). Esta variación plasmática puede ser seguida a
nivel de los metabolitos fecales, de esta forma, es de esperar que en las muestras fecales se
observe un aumento de los metabolitos con un desfase temporal con respecto a los niveles
plasmáticos, y un posterior retorno a los niveles basales (Goymann y col 1999, Keay y col
2006). Posterior a la validación analítica de un inmunoensayo, se recomienda realizar una
validación biológica, para demostrar que la técnica establecida detecta los cambios en los
niveles de metabolitos de glucocorticoides fecales, posterior a los respectivos cambios en las
concentraciones plasmáticas. La validación biológica consiste en un muestreo seriado antes y
después de una manipulación sobre la especie en estudio, y éste se puede realizar a través de
inmovilización, transporte, captura, o electroeyaculación, entre otros (Palme 2005).
La obtención de muestras provenientes de animales de vida silvestre a veces se ve
obstaculizada por no tener la oportunidad de observar al animal en el momento en que la
defecación ocurre, de esta forma, las condiciones ambientales también pueden influenciar las
mediciones de metabolitos de glucocorticoides cuando las muestras no son inmediatamente
recolectadas después de la defecación, las muestras obtenidas pueden no ser representativas
debido a la metabolización de los glucocorticoides fecales por acción bacteriana (Washburn y
Millspaugh 2002, Millspaugh y Washburn 2004, Palme 2005, Valdespino y col 2007).
Considerando estos factores, las mediciones de metabolitos de glucocorticoides fecales
también pueden alterarse por el protocolo de muestreo, la hora del día en que la muestra fue
obtenida, la edad de la muestra, y las técnicas de almacenamiento por largos y cortos períodos
(Bartos y col 1988, Reyes y col 1997a, Romero 2004, Millspaugh y Washburn 2004, Palme
2005).
Por otra parte, factores biológicos pueden influenciar la precisión de las técnicas de
medición, dentro de los que se destaca: las horas luz, las variaciones diurnas y estacionales en
la excreción de glucocorticoides, estatus reproductivo, sexo, condición corporal, la dieta del
animal (cambios de ésta ej: mayor contenido de fibra significa un mayor tiempo de tránsito
intestinal y una menor absorción de GC) (Washburn y Millspaugh 2002, Millspaugh y
Washburn 2004, Keay y col 2006), constipación, diarrea, restricción del alimento,
tratamientos con antibióticos que modifiquen la flora intestinal (Brousset y col 2005) la
habituación y sensibilización a un factor (Bhatnagar y Vining 2003, Palme 2005), y la
variación de las especies (Keay y col 2006).
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3.5 ASPECTOS GENERALES DEL PUDÚ
El pudú es un mamífero que pertenece al Orden de los Artiodáctilos, familia Cervidae
y subfamilia Odocoileinos, este género esta representado por dos especies; el pudú del sur
(Pudu puda, Molina*) y el pudú del norte (Pudu mephistophiles, Winton*) (Reyes 1988). En
Chile el pudú se distribuye por el norte desde la región del Maule hasta las cercanías del
estrecho de Magallanes en su límite más austral (Reyes y col 1988), presentando una gran
concentración en la Isla Grande de Chiloé (Cortés y col 1988). En el territorio Argentino se
distribuye desde los S 39º 23´, W 71º 17´ por el límite norte, hasta los S 42º 58´, W 72º 00´
por el límite sur (Meier y Merino 2007). El pudú es el ungulado más pequeño de Sudamérica
y es el único ciervo del sotobosque chileno (Reyes y col 1988), actualmente está caracterizado
como Vulnerable de acuerdo al la lista roja de la World Union for Nature (UICN 2009) y a la
guía Mamíferos de Chile (Iriarte 2008), también se encuentra en el apéndice I del (CITES
2009).
Desde la colonización de la zona sur de Chile esta especie ha experimentado la
fragmentación gradual de un 90% de su hábitat histórico, y por ende, una disminución en su
población, básicamente por la incesante actividad humana como la caza, los ataques de
perros, la introducción de ganado doméstico y otros cérvidos no nativos, así como también
por afecciones patológicas transmitidas por especies domesticas. (Cortés 1988, ConklinBrittain y Dierenfeld 1996, Reyes y col 2002, Iriarte 2008).
Esta especie actualmente es protegida por la ley 4.601 sobre caza y pesca, condición
que la resguarda de la caza, comercio, transporte y posesión, salvo casos calificados de interés
científico (CODEFF 1991). Además CONAF protege a la especie y su hábitat en 25 Parques
Nacionales, Monumentos Naturales y Reservas Forestales que abarcan casi 3 millones de ha.
(Cortés y col 1988).
En base a los antecedentes ya mencionados, es preciso conocer los aspectos atingentes
a la ecología y conservación de la especie, con el fin de generar estudios que permitan un
manejo adecuado de los individuos en cautiverio, y el diseño de metodologías que evalúen el
impacto de la actividad antrópica sobre las poblaciones silvestres (Reyes y col 1988). La
contribución de la cuantificación de metabolitos de glucocorticoides fecales en esta especie,
permitirá evaluar los niveles de estrés de los individuos en cautiverio, con proyecciones de
incorporar metodologías que permitan el monitoreo hormonal de las poblaciones silvestres en
el futuro.
11
3.6 HIPÓTESIS
Debido a que el estrés desencadena una serie de cambios fisiológicos en el organismo,
y los glucocorticoides reflejan una parte de estos cambios, es posible medir el nivel de estrés
en una especie silvestre en condiciones de cautividad mediante una técnica no-invasiva que
correlaciona los niveles circulantes de cortisol con los metabolitos de cortisol aislados en
fecas.
3.7 OBJETIVOS
3.7.1 General
Evaluar una técnica de medición de metabolitos de glucocorticoides fecales, a través
del seguimiento de los cambios en las concentraciones sanguíneas y fecales de cortisol y
metabolitos de cortisol, respectivamente, en ejemplares de pudúes silvestres mantenidos en
cautiverio.
3.7.2 Específicos
a) Determinar si los niveles de metabolitos de glucocorticoides fecales se encuentran
correlacionados con los niveles de la hormona circulante en la sangre.
b) Evaluar los cambios cuantitativos de los metabolitos de glucocorticoides fecales a través
del tiempo, posterior a la elevación de los niveles sanguíneos.
c) Efectuar un seguimiento de las variaciones temporales de los niveles de glucocorticoides en
pudúes en cautiverio sometidos a procedimientos de extracción de semen bajo anestesia, en
un centro de rehabilitación de fauna silvestre.
12
4. MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio se llevó a cabo entre marzo y diciembre del año 2007, y entre enero y
diciembre del año 2008 en las dependencias del Centro de Rehabilitación de Rescate de la
Universidad Austral de Chile, bajo las normas de utilización de animales en investigación de la
UACh.
4.1 MATERIAL
4.1.1. Animales experimentales
El grupo consistió en 7 pudúes adultos mantenidos en cautiverio (2 machos y 5
hembras) pertenecientes al “Sendero del pudú” (vivero Los Castaños - Forestal Valdivia
S.A.), situado en Cayumapu a 25km al norte de Valdivia (Fig. 1). También se muestrearon
fecas de 4 pudúes adultos provenientes de la senda Rumahue, X región, que fueron sometidos
a electroeyaculación en el CEREFAS.
4.2. MÉTODO
4.2.1 Manejo de los animales
Los animales provenientes del criadero sendero del pudú de la Forestal Valdivia eran
mantenidos en condiciones de cautividad en una superficie de 2ha, su alimentación se basaba
en concentrado de alfalfa y ramoneo de las especies vegetales presentes en el sitio. La captura
de los ejemplares se realizó mediante un sistema de arreo con mallas rachel que desembocaba
en un corral de 16m². Una vez capturados los individuos fueron ingresados a una jaula de
transporte individual, y se trasladaron al Centro de Rehabilitación de Fauna Silvestre
(CEREFAS) de la Universidad Austral de Chile, donde se mantuvieron en corrales
individuales. A cada individuo se realizó un examen clínico general y luego se mantuvieron
por un período de aclimatación de 48 horas antes de cada experimento. La alimentación se
basó en 200-300 gr/día de concentrado de alfalfa, agua ad libitum, y ramas de especies
vegetales, tales como Chilco (Fucsia magellanica), murra (Humus ulmifolius) y maqui
(Aristotelia chilensis).
13
Figura 1. Visión parcial del “Sendero del pudú”, Cayumapu, Valdivia.
4.3 DESAFÍO CON ACTH
Para realizar la validación de la técnica, se midieron los cambios cuantitativos en las
concentraciones plasmáticas de cortisol, y en las concentraciones de metabolitos de
glucocorticoides fecales luego de la administración de 5 UI intramuscular de ACTH porcina
(SIGMA ® ACTH porcine pituitary powder, 250 UI). Una primera muestra de sangre
denominada basal, se tomó previa a la administración de la ACTH para medir los niveles
basales circulantes de cortisol. Luego se tomaron consecutivamente 11 muestras de sangre
desde el momento de la administración de la ACTH hasta los 130 minutos subsiguientes, con
intervalos de tiempo de 5, 10, 20, 30, 40, 55, 70, 85, 100, 115, y 130 minutos, este protocolo
fue descrito anteriormente por Bubenik y Reyes (1994). El muestreo de fecas, se inició con
una muestra basal paralela a la primera muestra de sangre, y se continuó con intervalos de 3
horas después de la administración de ACTH, hasta alcanzar las 36 horas, para luego
continuar a las 48 y 72 horas posteriores a la inyección de ACTH, con el objeto de detectar los
cambios cuantitativos de metabolitos cortisol en fecas (Mateo y Cavigelli 2005) (Fig. 2).
14
Figura 2. Muestreo de sangre y fecas en el desafío de ACTH en Pudú puda, CEREFAS.
4.3.1 Muestras de Sangre
Los animales fueron anestesiados con Xilazina 2% (0.5mg/kg) y Ketamina 10%
(8mg/kg) intramuscular, para la extracción de muestras sanguíneas de 2.5ml (Fig. 3). Éstas se
obtuvieron a través de un catéter 22G fijado con sutura desde la vena yugular, para mantener
permeable la vía se administró 0.3ml de heparina después de tomar cada muestra, las muestras
se almacenaron en tubos con EDTA de 3ml. Esta metodología de toma de muestras y los
tiempos especificados fueron descritos anteriormente por Bubenik y Reyes (1994). Durante el
procedimiento de anestesia se monitoreó cada 10 minutos la temperatura rectal con un
termómetro digital, la frecuencia cardíaca (pulsos/minuto) y la frecuencia respiratoria
(ciclos/minuto) mediante auscultación directa. Luego de la toma de muestras de sangre se
administró 0.5ml de Bipencil L.A. intramuscular, 0.5ml de Vitamina E + selenio como
medida preventiva, y se revirtió la anestesia con Yohimbina 1% (0.15mg/kg) vía endovenosa.
15
Figura 3. Toma de muestras de sangre de Pudú puda en CEREFAS.
4.3.2 Muestras de Fecas
La primera muestra de fecas (basal) fue tomada con el animal anestesiado
directamente desde el recto con guantes lubricados con vaselina líquida. Las muestras
subsiguientes se tomaron después del procedimiento de toma de muestras de sangre con el
animal recuperado de la anestesia, con una frecuencia de 3 horas y se almacenaron en frascos
individuales de 40cc (Fig. 4), se fijaron con etanol al 95% y se refrigeraron a 4°C hasta su
análisis en el laboratorio. Este protocolo de almacenamiento de muestras fue descrito por
Soto-Gamboa (2009).
16
Figura 4. Muestra de fecas de Pudú puda, CEREFAS.
4.4
MUESTRAS
DE
ELECTROEYACULACIÓN
FECAS
DE
PUDÚES
SOMETIDOS
A
Se incluyó en el estudio muestras de fecas de 4 pudúes adultos sometidos a
electroeyaculación en el CEREFAS, con el objeto de realizar la validación biológica de la
técnica. Los animales muestreados fueron anestesiados, previo ayuno de 24 hrs, se realizó
inmovilización química a distancia mediante cerbatana y dardos de inyección
intramuscular con una combinación de Xilazina al 2% (0,6 mg/kg) y Ketamina al 10%
(8mg/kg). La electroeyaculación se efectuó con un estimulador eléctrico GRASS S44
Stimulator con una sonda de 12 cm de largo y 1 cm de diámetro con electrodos
longitudinales. La sonda rectal fue lubricada con vaselina líquida y se introdujo 7 a 9 cm
en el recto del animal con los electrodos dirigidos centralmente. Posteriormente se realizó
la electroeyaculación mediante un protocolo compuesto por pulsos eléctricos de diferente
intensidad y duración. Al término del procedimiento la anestesia se revirtió con
Yohimbina 1% endovenosa.
En este caso el muestreo de fecas incluyó una muestra basal tomada antes de cada
procedimiento, y tres muestras posteriores al procedimiento de electroeyaculación que
correspondientes a las 18, 24 y 48 horas. Al igual que las muestras de fecas de los animales
utilizados para la validación con ACTH, fueron fijadas con etanol al 95% en frascos
individuales de 40cc, y se refrigeraron a 4°C hasta su análisis en el laboratorio.
17
4.5 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS
4.5.1 Muestras de Sangre
Posterior a la toma de muestras de sangre, los tubos fueron centrifugados durante
10min a 2800 rpm, se extrajo el plasma y se almacenó en tubos Ependorf de 1.7ml en
duplicado y se congeló a -20°C hasta el análisis de radioimnumoensayo.
4.5.2 Muestras de Fecas
Luego de ser almacenadas, las muestras de fecas fueron secadas en una estufa a 95ºC
durante 4-5 horas. Posteriormente se molieron en un mortero y se pesaron entre 0.1 y 0.2 gr
que se trasladaron a un tubo de Ependorf de 1.7 ml, y se agregó 1ml de etanol al 80%. Luego
esta mezcla se homogenizó en el vórtex por 5 segundos, y se centrifugó a 3000 rpm por 20
minutos. Se recuperaron 0.5ml de sobrenadante en un tubo Ependorf de 0.5ml en duplicado, y
se congeló a -20°C hasta la determinación de los metabolitos de los glucocorticoides (ver
anexo 1). Este protocolo fue descrito por Mateo y Cavigelli (2005), y validado en degu
(Octodon degus) por Soto-Gamboa y col (2009).
4.5.3 Radio Inmuno Análisis
El procedimiento se radioinmunoensayo se realizó en el laboratorio de Ecología
Terrestre del Instituto de Ecología y Evolución de la Universidad Austral de Chile. En este
lugar se pipeteó el reactivo del inmunoensayo y se incubaron las muestras de acuerdo a las
instructivo del kit comercial 125I Cortisol radio immunoassay Coat-A-Count® (SIEMENS
Medical Solutions Diagnostic, Los Ángeles, California). En este procedimiento se utilizaron
tubos recubiertos de anticuerpo para la curva de calibración, y para las muestras de plasma y
fecas. Se pipetearon 25 µl de las muestras de plasma y fecas de los animales correspondientes
a la validación con ACTH y también las fecas de los animales electroeyaculados (en
duplicado) dentro de los tubos que contenían el anticuerpo, a los cuales se les agregó 1 ml de
125
I Cortisol junto a los tubos de la curva de calibración, y se mezclaron en el vortex por 5
segundos. Se incubaron durante 45min a 37°C en un baño termorregulado. Posteriormente se
dejaron escurrir para eliminar el reactivo de los tubos durante 2 a 3 minutos. Una vez
finalizado este paso, para obtener las cuentas por minuto de las muestras, los tubos fueron
trasladados a un contador gama automático Packard Cobra II modelo 5002 perteneciente al
Instituto de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Austral de Chile. Todas
las muestras fueron analizadas en duplicado y reanalizadas siempre y cuando el resultado del
coeficiente de variación excedió el 20%.
18
4.6 DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se realizó una regresión lineal simple entre los niveles basales de cortisol plasmático y
metabolitos de cortisol fecal. Posteriormente se analizaron los datos con el programa
STATISTICA 7.0 para las concentraciones plasmáticas y fecales producto del desafío con
ACTH, se aplicó un análisis paramétrico ANOVA de medidas repetidas de una vía, para
determinar diferencias dentro y entre tratamientos. Se utilizó como covariado el tiempo para
determinar si existió secreción pulsátil del cortisol. Se consideró significativo el valor de p<0,05.
19
5. RESULTADOS
5.1 DESAFÍO CON ACTH
5.1.1 Cortisol plasmático
Para esta medición se consideraron las muestras correspondientes al tiempo basal, 30,
55, 70, 85, y 115 minutos debido a que estos tiempos cumplían con la totalidad de las
muestras de sangre. Al analizar la concentración del cortisol plasmático como resultado de la
administración de ACTH, no se encontraron diferencias significativas entre los diferentes
intervalos de muestreo (ANOVA de medidas repetidas, F (5,25) = 1,47, p = 0,24).
En general los datos no muestran una tendencia marcada al aumento o disminución
(Fig. 5), el promedio del cortisol plasmático fue de 17,5±2,25 ng/ml, siendo los registros más
bajos los correspondientes a la muestra basal (17,18±5,54 ng/ml), y los valores más altos se
alcanzaron a los 30min (20,63 ±6,96 ng/ml).
Figura 5. Niveles de cortisol plasmático en 7 pudúes mantenidos en CEREFAS, Valdivia.
Corresponden a la muestra basal y los tiempos 30, 55, 70, 85, 115 min. Promedio 17,5±2,25
ng/ml. Los gráficos se elaboraron con los promedios y el error estándar de los niveles
hormonales.
20
5.1.2 Cortisol fecal
Para esta medición se consideraron las muestras correspondientes al tiempo basal, 24,
30, 36, 48 y 72 horas debido a que estos tiempos concentraron la mayor cantidad de muestras
de fecas del estudio. En el análisis de la concentración de metabolitos de cortisol en fecas
producto de la administración de ACTH, no se encontraron variaciones significativas
(ANOVA de medidas repetidas, F (5,20) = 0,10, p = 0,99).
La figura 6 representa la tendencia de los datos, en la que no se muestra una
propensión al aumento o disminución, el promedio del cortisol fecal fue de 116,63±37,27
ng/gr de fecas. Se aprecia una amplia desviación estándar en las muestras de las 36hrs, las que
promediaron 123,36±59,21 ng/gr de fecas, estos valores correspondieron a los registros más
altos, seguidos de los registros de las muestras de las 24hrs (123,28±47,03). Los valores más
bajos se registraron en las muestras basales 113,36±21,18 ng/gr de fecas, seguido de las 48
hrs con 113,97±36,41 ng/gr de fecas.
Figura 6. Niveles de metabolitos de cortisol fecal posterior al desafío de ACTH en 7 pudúes
mantenidos en CEREFAS, Valdivia. Corresponden a la muestra basal y los tiempos 24, 30,
36, 48 y 72 hrs. Los gráficos se elaboraron con los promedios y el error estándar de los
niveles hormonales
21
5.1.3 Correlación plasma v/s fecas
La concentración de metabolitos de cortisol analizado en las muestras de fecas y
correspondientes al desafío con ACTH no fue significativo como predictor de la
concentración de cortisol plasmático (r² = 0.28, F (1,5) = 1.95, p = 0.22). En la figura 7 se
aprecia la dispersión de los datos en relación a la recta, lo que demuestra la inconsistencia de
la técnica para estimar la concentración plasmática de cortisol basándose en los registros de
los metabolitos de cortisol en fecas.
Figura 7. Valores obtenidos en la regresión lineal de las muestras basales de sangre y fecas de
7 pudúes mantenidos en CEREFAS, Valdivia.
22
5.2 FECAS DE ANIMALES SOMETIDOS A ELECTROEYACULACIÓN
Los animales sometidos a electroeyaculación no presentaron diferencias significativas
entre el valor basal y las mediciones posteriores al procedimiento (F (3,9) = 3,42, p = 0,06),
sin embargo, se observó una tendencia a la disminución en las concentraciones de metabolitos
de glucocorticoides fecales registradas después de la manipulación, siendo el valor basal
superior a los diferentes intervalos de muestreo (Fig. 8). El promedio para los metabolitos de
cortisol registrados en fecas fue de 117,9±12,85 ng/gr fecas, los valores basales alcanzaron los
registros más altos en la medición (130,54±10,46 ng/gr fecas). Los valores mínimos se
registraron en las 48 horas posteriores al procedimiento de electroeyaculación (110,23±13,96
ng/gr fecas).
Figura 8. Niveles de metabolitos de cortisol en fecas de 4 pudúes sometidos a
electroyaculación en CEREFAS, Valdivia. Los gráficos se elaboraron con los promedios y el
error estándar de los niveles hormonales
23
6. DISCUSIÓN
6.1 DESAFÍO CON ACTH
6.1.1 Cortisol plasmático
Los niveles plasmáticos registrados en respuesta al desafío con ACTH fluctuaron en
promedio, entre 17,18±5,54 ng/ml en la muestra basal y 27,37±3,61 ng/ml a los 130 min. Una
de las características de este tipo de estimulación es que la respuesta es prácticamente
inmediata, las concentraciones del cortisol aumentan entre los 30 y los 60min posterior a la
administración de la ACTH (Jiménez y col 1998), llegando a alcanzar valores tres a cuatro
veces por sobre los niveles basales. Sin embargo, en este estudio no se cumplió este supuesto,
ya que sólo se produjo un aumento de 10 puntos sobre el nivel basal.
Esto no concuerda con lo reportado por Bubenik y Reyes (1994), ya que las
concentraciones plasmáticas registradas en pudúes machos posterior a la administración de
ACTH varió de 0.5µg/dl a 2.5 µg/dl, utilizando el mismo protocolo de muestreo, con
diferencias significativas desde los 40min de administración, manteniéndose estos niveles
altos hasta los 130min. Los niveles de cortisol plasmáticos no concuerdan con los
anteriormente descritos para la especie, ya que al hacer la conversión de unidades para
comparar ambos estudios, los resultados de este estudio superan ampliamente el registro de
Bubenik y Reyes (0.5µg/dl a 2.5 µg/dl) más de 100 veces (171,8 µg/dl).
Según Reyes y col 1997b, los niveles anuales de cortisol plasmático registraron una
variación de 0.6 a 1.7 µg/100 ml en un grupo de pudúes en condiciones de cautividad
pertenecientes a la Universidad de Concepción. Una característica del máximo estacional de
cortisol descrito en la temporada reproductiva, es que presenta bajos niveles en comparación
con otras especies de cérvidos, asociado a las características de su comportamiento y estilo de
vida solitario de la especie. A su vez se señala que la activación del eje pituitario-adrenal en el
pudú es rápida y transitoria, por lo que los niveles de cortisol disminuyen rápidamente a
niveles basales, y se mantienen relativamente bajos, incluso posterior a la administración de
ACTH (Bubenik y Reyes 1994).
En algunas especies de cérvidos se han reportado cambios estacionales en la secreción
del cortisol. Se describen descensos de los niveles plasmáticos de cortisol durante la época
reproductiva (ej. el ciervo cola blanca Odocoileus virginianus, Bubenik y col 1983 y el reno,
Rangifer tarandus, Nilssen y col 1985). En el caso del pudú se han descrito dos aumentos
anuales en la secreción de cortisol plasmático, siendo uno de ellos en el mes de marzo,
asociado con la época reproductiva, y el segundo entre los meses de julio y agosto, asociado
al estrés del invierno debido a las bajas temperaturas y a la disminución de la diponibilidad de
alimento (Reyes y col 1997b). Particularmente la toma de muestras de este estudio se realizó
durante la temporada reproductiva (desde la última semana de febrero hasta fines de abril),
24
meses que concentran la mayor interacción agonística de esta especie, y por lo tanto las
concentraciones plasmáticas de cortisol registran sus niveles anuales más altos.
El desafío con ACTH se ha utilizado en el sambar (Cervus unicolor) (van Mourik y
Stelmasiak 1984), ciervo cola blanca (Smith y Bubenik 1990), chital Axis axis (Bubenik y col
1991), ciervo rojo (Cervus elaphus), gamo (Dama dama) (Bubenik y Bartos 1993), y reno
(Säkkinen y col 2005). En estas especies hubo una respuesta adrenal a la ACTH,
produciéndose una elevación significativa de los niveles plasmáticos de cortisol. A difrencia
de estas publicaciones, en este trabajo no se detectó un cambio en los niveles plasmáticos de
cortisol por efecto de la administración de la ACTH. Esto puede deberse a
una posible contaminación de las muestras de sangre y fecas en la ejecución del
radioinmunoensayo, durante las diferentes etapas de manipulación de las muestras, aún
cuando se haya actuado con prolijidad en el protocolo descrito en el manual (ver anexo 2), y
se hayan tomado las medidas precautorias necesarias en cada etapa del radioinmunoensayo.
Se desconoce si el espacio utilizado en la ejecución del RIA podría haber tenido algún tipo de
contaminación previa al trabajo práctico, lo que no deja de ser una posible fuente de variación
en la obtención de resultados, si se considera que el lugar no era un laboratorio de
radioinmunoanálisis.
Por otra parte, también cabe la posibilidad de que haya fallado del kit de RIA en el
análisis de las muestras, ya que es probable que los anticuerpos del kit no hayan reaccionado
sólo con el cortisol plasmático, sino que pueden haber reaccionado con determinantes
antigénicos de otros compuestos presentes en la muestra de plasma, con similar especificidad
hacia los anticuerpos. Cabe destacar que el kit comercial 125I Cortisol radio immunoassay
Coat-A-Count® utilizado en este estudio, esta fabricado en base a suero humano, por lo tanto
existe la posibilidad de que se produzca una variación en la unión de los determinantes
antigénicos del pudú con los anticuerpos del radioinmunoensayo. El kit de RIA utilizado por
Bubenik y Reyes (1994) corresponde a un kit comercial (Joldan Bioclinical Inc., Scarborough,
Ontario), que no especifica el origen del anticuerpo utilizado.
Bubenik y Reyes (1994) administraron 5UI de una ACTH porcina (ACTHAR gel,
Armour Pharmaceutical, Kankakee, IL) y observaron un aumento significativo en los niveles
plasmáticos de cortisol en el pudú, ésta es la misma dosis que se administró en este estudio,
sin embargo, la ACTH porcina administrada pertenecía a otro laboratorio (SIGMA ® ACTH
porcine pituitary powder), y los resultados obtenidos fueron no significativos. Con una
pequeña cantidad de 6UI de ACTH se alcanzó una respuesta adrenal significativa el sambar
(Cervus rusa timorensis) (Van Mourik y Stelmasiak 1984), en cambio, con 20UI ACTH se
produjo una respuesta máxima en cortisol y corticosterona en el ciervo cola blanca (Smith y
Bubenik 1990). No es común que la administración de ACTH exógena no genere una
respuesta hormonal significativa, sin embargo, casos aislados de insensibilidad adrenal a la
ACTH se han reportado en la literatura, en 1990 Smith y Bubenik reportaron un caso en
ciervo cola blanca. Estos antecedentes refuerzan la idea de que el kit de radioinmunoanálisis
pudo no haber tenido una buena afinidad con el cortisol plasmático del pudú.
25
Otro factor que pudo influenciar la respuesta de los individuos es la alta variabilidad
interindividual. Al analizar la respuesta individual de los animales (anexos 4 y 5), se encontró
irregularidad en el patrón de la curva de secreción hormonal. Dentro del estudio, un grupo de
cuatro animales compuesto por tres hembras y un macho, alcanzaron su máxima secreción de
cortisol en el minuto 30, con un rápido descenso alrededor de los 55 minutos, y una
estabilización de la curva posterior a los 70 minutos, manteniéndose bajos hasta los 130
minutos. En este grupo de animales se observó una respuesta más homogénea en la secreción
de cortisol, sin embargo, esta evidencia no es concluyente para atribuir el leve aumento del
cortisol plasmático al desafío de ACTH. Por otra parte, hubo dos hembras que registraron
niveles elevados de cortisol en la muestra basal, y rápidamente estos niveles descendieron
hasta sus registros más bajos en los minutos 30 y 55, respaldando el patrón irregular de
secreción.
Ambos sexos exhibieron patrones irregulares en la secreción de cortisol plasmático,
por lo tanto, no se presentó una respuesta diferencial entre machos y hembras. Esto concuerda
con lo encontrado por Bubenik y Reyes (1994), donde la respuesta de las hembras también
fue similar a la de los machos, sin embargo, los datos de las hembras no se publicaron por no
completar la totalidad del muestreo sanguíneo. En algunas especies se ha descrito la respuesta
del cortisol plasmático en ambos sexos posterior al desafío de ACTH, sin encontrar
diferencias substanciales entre hembras y machos como es el caso del ciervo cola blanca
(Smith y Bubenik, 1990) y ciervo rojo (Millspaugh y col 2001).
6.1.2 Cortisol fecal
El análisis de la concentración de metabolitos de cortisol en fecas posterior a la
administración de ACTH, fue estadísticamente no significativo, al igual que los niveles
plasmáticos anteriormente descritos. Se registró en promedio 137,92±49,25 ng/gr de fecas de
metabolitos de cortisol, con una amplia variación en la totalidad del muestreo. Estos
resultados no son concordantes con otros estudios que describen que la administración de
ACTH exógena conduce a un incremento en los metabolitos de glucocorticoides fecales
(Goymann y col 1999). En grandes mamíferos este incremento generalmente ocurre 24-48
horas posterior al desafío con ACTH (Morato y col 2004, Mateo y Cavigelli 2005). La
variación de la respuesta de los glucocorticoides en un individuo puede deberse a diferentes
factores, entre los mencionados se incluye: variación estacional de las tasas de conjugación
del hígado, variaciones estacionales de la acción de las colonias de bacterias del intestino, el
tiempo de pasaje por el tracto digestivo (Millspaugh y col 2002), variabilidad en el número
de receptores de glucocorticoides, diferencias en la afinidad de estos receptores por los
glucocorticoides, y diferentes capacidades y/o afinidades por las proteínas que se unen a los
glucocorticoides (Romero 2004).
En el análisis individual de las respuestas al desafío de ACTH (anexos 4 y 5), se
aprecia un patrón irregular en la excreción de metabolitos de cortisol fecal. Un grupo de 5
individuos registró niveles bajos en el inicio del muestreo, y un subsecuente aumento que
varió entre las muestras de las 24 y 36hrs, con marcadas diferencias en la mantención de los
niveles hasta las 72 hrs. Los dos animales restantes iniciaron el muestreo con niveles de
26
metabolitos de cortisol fecal elevados, seguido de un descenso entre las 30 y 36hrs, y
finalmente una elevación a las 72 hrs. No se presentó una respuesta diferencial entre ambos
sexos, presentando patrones irregulares. La respuesta hormonal de este grupo de individuos
no es óptima para validar la técnica no invasiva que evalúa metabolitos de cortisol fecal.
Esta técnica se ha validado en otras especies de cérvidos. Según lo reportado por
Millspaugh (2002), los niveles de metabolitos de cortisol fecal en ciervo cola blanca
aumentaron de 90 ng/gr de fecas en la muestra basal, hasta 225 ng/gr de fecas 20-24hrs
después de la administración de dos inyecciones intramusculares de ACTH de 25UI cada una.
Esto concuerda con lo descrito por Huber y col (2003), donde se describió un aumento
significativo para los niveles de metabolitos de cortisol fecal en el ciervo rojo al superar los
niveles basales en más del doble aproximadamente 18hrs después de la administración de la
ACTH. En este trabajo no se obtuvieron valores significativos en la concentración de
metabolitos de cortisol fecal a diferencia de los trabajos descritos en otras especies de
cérvidos.
Diferentes reportes de niveles estacionales de cortisol fecal se han descrito en una
misma especie. Millspaugh y col (2001), describieron los niveles de metabolitos de cortisol
fecal para el ciervo rojo, obteniendo un patrón de estacionalidad en los meses de verano, por
otra parte, Huber y col (2003), al evaluar estacionalidad en esta especie obtuvo un marcado
patrón en los meses de invierno, con diferencias en los niveles hormonales 10 veces superior
al estudio anteriormente descrito. Las diferencias de los resultados de ambos estudios fueron
atribuidas al kit de ensayo, ya que en el segundo estudio se aplicó un HPLC para detectar los
metabolitos fecales de cortisol específicos para la especie, y como resultado obtuvieron 3a-11one. A raíz de esta observación, se trabajó con un kit de análisis en base a este grupo
específico de metabolitos (Huber y col 2003). Días y col (2008) describió diferencias en la
comparación de 2 kits comerciales de radioinmunoanálisis en ocelote (Leopardus pardalis),
el kit de RIA para 125I corticosterona de ICN Biomedicals obtuvo una mejor respuesta a los
antígenos del ocelote en comparación con el kit de RIA para 125I cortisol Coat-a-Count de
DPC, los resultados concordaron con Wasser y col (2000) y Möstl y Palme (2002) quienes
utilizaron el kit ICN Biomedicals con anticuerpos para corticosterona y obtuvieron mejores
resultados en la medición de glucocorticoides en comparación con otros kits comerciales. La
selección y comparación de los anticuerpos del ensayo es un punto relevante, debido a que
cada ensayo difiere en los métodos de preparación de las muestras, y además utilizan
anticuerpos diferentes con variaciones en la afinidad hacia los metabolitos de glucocorticoides
fecales (Millspaugh y Washburn 2004). Con estos antecedentes de variabilidad en los niveles
de metabolitos de cortisol fecal, como resultado de la aplicación de diferentes inmunoensayos
comerciales, se respalda la idea de que el kit de RIA podría haber influenciado los resultados
obtenidos en esta especie.
Existen importantes diferencias entre especies en la medición de los metabolitos de
cortisol en fecas, la proporción de estos metabolitos excretados en fecas alcanza un 28% en
ovejas, 41% en ponis, y sólo un 7% en cerdos. La medición de un grupo de metabolitos
específico de cortisol 11,17-dioxiandrostano (11,17-DOA), se ha evaluado exitosamente para
27
cuantificar la actividad adrenocortical en una variedad de especies, siendo aprobado por
varios autores como el principal metabolito excretado en fecas de rumiantes (Mormède y col
2007; Möstl y col 1999; Palme y col 2000). Möstl y col (2002) ha descrito un mínimo de 21
metabolitos de cortisol fecal en rumiantes, utilizando cromatografía líquida de alta eficacia
(HPLC). La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar los
componentes de una mezcla de compuestos químicos, esta separación depende del tamaño de
la molécula, por lo que es considerada una técnica muy sensible y precisa a la hora de aislar
los metabolitos de cortisol fecales de una especie.
Goymann (1999) describió que los anticuerpos de corticosterona reaccionaron con
metabolitos conjugados y no conjugados en fecas de hiena (Crocuta crocuta). El kit ICNcorticosterona obtuvo la respuesta de anticuerpos más apropiada para medir la variación de
los niveles hormonales posterior al desafío con ACTH en hienas, en este mismo estudio los
metabolitos de cortisol mostraron una clara respuesta a ACTH, sin embargo, sus valores
basales fueron cercanos e incluso inferiores al límite de detección (Goymann y col 1999).
Wasser y col (2000) evaluó 4 kits comerciales para la detección de metabolitos de cortisol en
fecas, en base a los resultados de la comparación concluyó que el kit ICN corticosterona de
RIA obtuvo la mejor respuesta al presentar una elevada reactividad en la mayoría de los
metabolitos de cortisol presentes en fecas posterior a la administración de ACTH en el
elefante africano (Loxodota africana), rinoceronte negro (Diceros bicornis), wapiti (Cervus
canadensis roosevelti), gacela de Waller (Litocranius walleri), orix blanco (Oryx dammah),
nutria marina (Enhydra lutris), oso malayo (Helarctos malayanus), cheetah (Acinonyx
jubatus), leopardo longibando (Neofelis nebulosa), macao cola larga (macaca fascicularis) y
búho manchado del norte (Strix occidentalis caurina) (Wasser y col 2000).
Las altas variaciones en las concentraciones de cortisol en animales de una misma
especie, ocurren tanto en sangre como en fecas (Möstl y Palme 2002). A su vez, los animales
silvestres en cautividad pueden exhibir niveles de metabolitos de glucocorticoides fecales más
altos o más bajos que sus conespecíficos de vida libre, y de esta forma, responden
diferencialmente a los tratamientos de un estudio (Millspaugh y Washburn 2004). Diferencias
similares en las concentraciones fecales, en lo referente a los valores peak y basales, también
han sido descritos en la literatura, lo que ha sido atribuido a la compleja interacción entre
genética y experiencias previas que componen la respuesta de un animal (Palme y col 2000).
Otros autores señalan que la ausencia de respuesta podría indicar una historia de estrés
crónico, o una alteración de los receptores a los glucocorticoides (Mateo y Cavigelli 2005).
En todo estudio donde se estime la concentración de hormonas mediante muestreo noinvasivo, se recomienda validar el protocolo en varios niveles. Esto específicamente
considera: demostrar la recuperación del ligando agregado al medio, para confirmar que el
ensayo cuantitativamente detecta el total de hormona presente. Efectuar paralelismo con el
estándar del kit de análisis, el cual demuestra que existe una relación lineal entre la
concentración de la hormona blanco y el valor del ensayo obtenido, dentro de los límites de la
curva estándar. Demostrar sensibilidad y precisión: unión no específica, ensayos de detección,
límites y precisión son características que ilustran las limitaciones del ensayo. Y finalmente,
28
determinar la variabilidad entre muestras, y el promedio de la eficiencia (Buchanan y
Goldsmith 2004, Keay y col 2006, Teixeira y col 2007). Lamentablemente, en este estudio no
se realizaron estas pruebas que evalúan el protocolo de extracción de hormonas. Por lo cual,
en este estudio no es posible asegurar que la extracción en fecas haya sido la apropiada debido
a la falta de un protocolo inicial que incorporara esta evaluación.
La validación de la técnica de cuantificación de metabolitos de cortisol fecales no
resultó en Pudú puda. Las posibles causas de los resultados obtenidos pueden deberse a
problemas de manipulación de las muestras en las etapas iniciales de obtención; en la
cuantificación de las muestras ya sea por contaminación y/o por un error de reactividad del kit
de radioinmunoensayo utilizado; o por carecer de un protocolo que confirme la eficiencia de
extracción de los metabolitos de cortisol fecal. Esta última observación queda abierta, por lo
que es necesario profundizar esta alternativa a futuro al incluir un análisis con HPLC.
6.1.3 Correlación plasma v/s fecas
El análisis de las concentraciones basales de cortisol plasmático y de los metabolitos
de cortisol en fecas posterior al desafío con ACTH no fue significativo. Asimismo, el valor de
los metabolitos de cortisol fecal como predictor de la concentración de cortisol plasmático, es
insuficiente para validar la determinación de estrés a partir de muestras fecales para la especie
pudú. Los resultados de este análisis, respaldan el argumento del error de detección del kit de
radioinmunoanálisis. Puesto que la regresión lineal se realizó a partir de las muestras basales
para sangre y fecas, las que corresponden a los niveles hormonales previos al desafío con
ACTH, y que reflejaron una amplia variabilidad en los niveles basales del grupo de animales.
6.2 FECAS DE ANIMALES SOMETIDOS A ELECTROEYACULACIÓN
Con el objeto de respaldar la validación farmacológica en este estudio, el
procedimiento de electroeyaculación fue equivalente a la manipulación recomendada en la
validación biológica. La concentración de los metabolitos de cortisol fecales de los pudúes
electroeyaculados fue estadísticamente no significativa. La variación temporal de los niveles
de glucocorticoides fecales, evidenció una tendencia a la disminución a partir de los niveles
basales, manteniéndose estables posterior a la administración de la ACTH
Es de esperar que la respuesta hormonal de la manipulación biológica no arrojara
resultados significativos, a raíz de la inconsistencia de los resultados anteriormente expuestos
en la regresión lineal de los niveles sanguíneos y fecales, y la imposibilidad de utilizar los
niveles hormonales encontrados en fecas como predictor de los niveles sanguíneos.
La validación biológica se ha utilizado para evaluar técnicas de reproducción asistida,
como es el caso del estudio de Morato y col (2004), que monitoreó la actividad adrenal y los
cambios en las concentraciones de los metabolitos de andrógeno en el jaguar (Panhtera onca),
posterior a un procedimiento de inmovilización química y electroeyaculación. Por otra parte,
29
Goymann y col (1999), describió los niveles de glucocorticoides fecales en hiena (Crocuta
crocuta) después de dos situaciones socialmente estresantes: durante una pelea de dos hienas,
y en la translocación de un macho de la especie, en ambas situaciones hubo un aumento de los
metabolitos de glucocorticoides fecales.
Huber y col (2003), expuso al ciervo rojo a diferentes tipos de disturbios de origen
humano, y como resultado obtuvo una respuesta adrenal con diferencias entre individuos.
Presumiblemente la obtención de una respuesta adrenal no uniforme, es el resultado de
diferencias individuales de temperamento, experiencias tempranas, y percepción del estrés.
6.3 Conclusiones
Debido a los resultados no significativos en la correlación de los niveles de cortisol
plasmático y los niveles de metabolitos de cortisol en fecas, no se pudo validar la técnica noinvasiva de medición de estrés mediante metabolitos de cortisol fecales en la especie pudú.
No fue posible evaluar los cambios cuantitativos de los metabolitos de
glucocorticoides fecales, posterior a la elevación de los niveles sanguíneos en el pudú, ni
evaluar las variaciones temporales de los metabolitos de glucocorticoides fecales en los
animales sometidos al procedimiento de electroeyaculación, debido a los resultados de la
correlación de los niveles basales de cortisol plasmático y los metabolitos de cortisol en fecas.
Los resultados obtenidos en este estudio no descartan la posibilidad de validar la
técnica de cuantificación de glucocorticoides fecales en pudú en el futuro, más bien se sugiere
perfeccionar los protocolos de laboratorio tomando en cuenta las siguientes recomendaciones:
i) trabajar en un laboratorio certificado para radioinmunoanálisis; ii) realizar un análisis de
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), a fin de escoger el inmunoensayo más
apropiado para la especie; y iii) evaluar el procedimiento de extracción del cortisol en fecas,
mediante las pruebas de paralelismo, precisión y eficiencia de recuperación.
Una vez consideradas las recomendaciones de este estudio en futuras investigaciones,
e incorporando la ejecución de un HPLC en la detección de los metabolitos específicos de
cortisol fecal en la especie Pudú puda, se podrán aprovechar las ventajas de esta técnica como
método no invasivo de monitoreo de estrés en pudúes, y se podrá aplicar esta herramienta
como indicador de la respuesta adrenal de la especie en programas de conservación.
30
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35
8. ANEXOS
ANEXO 1. Esquema de toma de muestras de sangre y almacenamiento en el desafío de ACTH
en Pudú puda.
36
ANEXO 2. Esquema de toma de muestras de fecas, almacenamiento y extracción de cortisol
fecal en en desafío de ACTH en Pudú puda.
37
ANEXO 3. Esquema de radioinmunoanálisis en desafío de ACTH en Pudú puda.
38
ANEXO 4. Tabla resumen del peso, sexo, edad, promedio y niveles basales de cortisol fecal y
plasmáticos por individuo, en el desafío de ACTH en Pudú puda.
Animal
Sexo
Edad
Peso
Cort. plasmático
(basal)
Metab. Cort.
Fecal (basal)
Prom. Cort.
plasmático
Prom. Met. Cort.
fecal
1
08-007
macho
5 años
8kg
16,45 ng/ml
118,68 ng/gr de
fecas
15,65 ng/ml
138,52 ng/gr de
fecas
2
08-011
macho
3,5 años
10,8kg
19,24 ng/ml
90,15 ng/gr de
fecas
19,68 ng/ml
116,96 ng/gr de
fecas
3
08-009
hembra
5,5 años
9kg
13,02 ng/ml
126,99 ng/gr de
fecas
24,25 ng/ml
116,71 ng/gr de
fecas
4
08-010
hembra
3 años
8,8kg
28,37 ng/ml
151,20 ng/gr de
fecas
18,27 ng/ml
132,77 ng/gr de
fecas
5
08-008
hembra
4,5 años
8,8 kg
11,41 ng/ml
90,13 ng/gr de
fecas
11,64 ng/ml
153,47 ng/gr de
fecas
6
08-016
hembra
1,5 años
6,1kg
16,04 ng/ml
125,79 ng/gr de
fecas
17,9 ng/ml
111,74 ng/gr de
fecas
7
08-019
hembra
2 años
6,7kg
15,7 ng/ml
102,95 ng/gr de
fecas
15,1 ng/ml
108,59 ng/gr de
fecas
39
ANEXO 5. Niveles de cortisol plasmático y fecal en el desafío de ACTH en Pudú puda.
08-007
22
Cortisol plasmático (ng/ml)
20
18
16
14
12
10
basal
30
55
70
85
115
Tiempo (minutos)
Col 1
08-007F
Cortisol fecal (ng/ml fecas)
160
150
140
130
120
110
basal
24
30
36
48
72
Tiempo (horas)
Col 1
Animal
08-007
Sexo
macho
Edad
5 años
Peso
8kg
Cort. plasmático (basal)
16,45 ng/ml
Metab. Cort. Fecal
(basal)
118,68 ng/gr de fecas
Prom. Cort.
plasmático
15,65 ng/ml
Prom. Met. Cort. fecal
138,52 ng/gr de fecas
40
08-008
18
Cortisol plasmático (ng/ml)
16
14
12
10
8
basal
30
55
70
85
115
Tiempo (minutos)
Col 1
08-008F
150
Cortisolfecal (ng/gr fecas)
140
130
120
110
100
90
80
basal
24
30
36
48
72
Tiempo (horas)
Col 1
Animal
Sexo
Edad
Peso
Cort. plasmático (basal)
Metab. Cort. Fecal (basal)
Prom. Cort.
plasmático
08-008
hembra
4,5 años
8,8 kg
11,41 ng/ml
90,13 ng/gr de fecas
11,64 ng/ml
Prom. Met.
Cort. fecal
153,47 ng/gr de
fecas
41
08-009
35
Cortisol plasmático (ng/ml)
30
25
20
15
10
basal
30
55
70
85
115
Tiempo(minutos)
Col 1
08-009F
240
Cortisol fecal (ng/gr fecas)
220
200
180
160
140
120
100
basal
24
30
36
48
72
Tiempo (horas)
Col 1
Animal
Sexo
Edad
Peso
Cort. plasmático (basal)
Metab. Cort. Fecal (basal)
Prom. Cort.
plasmático
08-009
hembra
5,5 años
9kg
13,02 ng/ml
126,99 ng/gr de fecas
24,25 ng/ml
Prom. Met.
Cort. fecal
116,71 ng/gr de
fecas
42
08-010
30
Cortisol plasmático (ng/ml)
28
26
24
22
20
18
16
14
12
basal
30
55
70
85
115
48
72
Tiempo(minutos)
Col 1
08-010F
160
Cortisol fecal (ng/gr fecas)
150
140
130
120
110
basal
24
30
36
Tiempo (horas)
Col 1
Animal
Sexo
Edad
Peso
Cort. plasmático (basal)
Metab. Cort. Fecal (basal)
Prom. Cort.
plasmático
08-010
hembra
3 años
8,8kg
28,37 ng/ml
151,20 ng/gr de fecas
18,27 ng/ml
Prom. Met.
Cort. fecal
132,77 ng/gr de
fecas
43
08-011
28
Cortisol plasmático (ng/ml)
26
24
22
20
18
16
14
12
basal
30
55
70
85
115
Tiempo(minutos)
Col 1
08-011F
180
Cortisol fecal (ng/gr fecas)
160
140
120
100
80
basal
24
30
36
48
72
Tiempo(horas)
Col 1
Animal
Sexo
Edad
Peso
Cort. plasmático (basal)
Metab. Cort. Fecal (basal)
Prom. Cort.
plasmático
08-011
macho
3,5 años
10,8kg
19,24 ng/ml
90,15 ng/gr de fecas
19,68 ng/ml
Prom. Met.
Cort. fecal
116,96 ng/gr de
fecas
44
08-016
28
Cortisol plasmático (ng/ml)
26
24
22
20
18
16
14
12
basal
30
55
70
85
115
48
72
Tiempo(minutos)
Col 1
08-016F
150
Cortisol fecal (ng/gr fecas)
140
130
120
110
100
90
80
basal
24
30
36
Tiempo (horas)
Col 1
Animal
Sexo
Edad
Peso
Cort. plasmático (basal)
Metab. Cort. Fecal (basal)
Prom. Cort.
plasmático
08-016
hembra
1,5 años
6,1kg
16,04 ng/ml
125,79 ng/gr de fecas
17,9 ng/ml
Prom. Met. Cort.
fecal
111,74 ng/gr de
fecas
45
08-019
17
Cortisol plasmático (ng/ml)
16
15
14
13
12
11
basal
30
55
70
85
115
Tiempo (minutos)
Col 1
08-019
130
Cortisol fecal (ng/gr fecas)
125
120
115
110
105
100
95
90
basal
24
30
36
48
72
Tiempo(horas)
Col 1
Animal
08-008
Sexo
hembra
Edad
4,5 años
Peso
8,8 kg
Cort. plasmático (basal)
11,41 ng/ml
Metab. Cort. Fecal
(basal)
90,13 ng/gr de fecas
Prom. Cort.
plasmático
11,64 ng/ml
Prom. Met. Cort.
fecal
153,47 ng/gr de fecas
46
9. AGRADECIMIENTOS
Iniciar este manifiesto no es menos complejo que concretar una tesis. Podría agradecer
íntimamente a ciertos momentos y recuerdos insignificantes dentro de algún contexto en
particular, sin embargo, infinitamente claves en mi constitución como persona y profesional.
Precisamente doy gracias a las palabras que improntaron efímeros soplos de dicha y
desamparo en mis exploradores pasos a lo largo de mis años universitarios en esta
imprecedible ciudad. Y para ser más concreta en mi reconocimiento, ¿Cómo no incluir a la
fiel lluvia?, que en cada desaire me hizo sentir más viva.
Asimismo retribuyo a la enigmática madera que tanto contiene y glorifica en sus vetas
y formas.
Es difícil olvidar en este personal homenaje al incondicional plato de comida, adobado
de amor por añosas manos de sacrificio, que me brindó los placeres culinarios más
entrañables.
Gracias a mis desmoronamientos, a las ausencias, a cada anochecer de estrellas
esperanzadas en que retomé mis harapientas fuerzas, a las miradas ajenas y fulminantes que
me hicieron renacer, sin ni siquiera sospecharlo…Y por supuesto, al sinsentido que reaparece
donde menos sospecho.
Sin duda este proceso no se podría haber concretado sin la participación de numerosos
y reconocidos colaboradores, entre los que quiero destacar: Alejandro Aleuy, Mauricio Soto,
Claudio Verdugo, Eugenia Reyes, George Bubenik, María Isabel Astorquiza, Eduardo Silva,
Gabriel Ortega, Guillermo Santibañez, Carlos Rodríguez, Sandra González, Carolina Tapia,
Alejandro Cordero, Roberto Freraut y Antonio Muñoz, Jose Morales, Roberto Leal, Natalia
Ciudad, Sergio Medel, Susana Muñoz, Ariana Cabrera, Angelo Espinoza, Annie, Mark y
Sara, Ricardo y Felipe Valenzuela, Oscar Alocilla, Carlos Lara, y a las tías del comedor San
Antonio de la Iglesia San Francisco. A todos ustedes mis infinitos agradecimientos y mis
mejores pretensiones para vuestros proyectos de vida.