Canales iónicos involucrados en la activación de Linfocitos T

Universidad de Colima
Facultad de Medicina
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
Canales iónicos involucrados en la activación
de Linfocitos T
TESIS
Que para obtener el grado de
Maestra en Ciencias Fisiológicas
PRESENTA
QFB. Mariana Irigoyen Anguiano
ASESOR
Dr. Carlos G. Onetti Percello
COASESOR
Dr. Alejandro Elizalde Lozano.
Colima, Colima Octubre 2007
Esta tesis se desarrollo en el laboratorio de “Biofísica de
canales iónicos” del Centro Universitario de Investigaciones
Biomédicas de la Universidad de Colima, bajo la dirección
del Dr. Carlos G. Onetti Percello y el Dr. Alejandro M.
Elizalde Lozano (coasesor) con el apoyo de CONACYT,
beca número: 201495
2
Dedicatoria
Dedico este trabajo a mi papi por su apoyo incondicional
y por ser siempre mi fuerza para salir adelante ante toda
adversidad, a mi madre (q.e.p.d ) la cual al pasar de los
años cada vez me hace más falta y a Renato Galván
Orozco por su amor .
3
Agradecimientos
Al Dr. Carlos Onetti por su apoyo y confianza para poder
realizar este trabajo en su laboratorio.
Al Dr. Alejandro Elizalde por su ayuda en la revisión de este
trabajo como coasesor.
A la Dra. Gabriela Ramírez por su gran ayuda en la revisión
de este trabajo.
A la Q.F.B. Adriana Leal por su amistad y apoyo.
Agradezco a la familia Galván Orozco por su apoyo
incondicional.
Agradezco a mi hermano
familia en general.
y mis niñas por su cariño y
Agradezco a mi tía Alida Reyes por su gran cariño y a todas
mis tías.
A mi amiga Maribel Martínez Casas por su apoyo en
momentos difíciles y momentos felices.
A mi amiga Karla Susana Vera por su gran apoyo y su
sincera amistad gracias nene!.
4
INDICE
Índice
Abreviaturas
Índice de figuras
Índice de Tablas
Resumen
Abstract
5
7
10
12
13
14
1. El sistema inmunológico
1.1 Tipos de Inmunidad
1.1.1 Inmunidad Innata
1.1.2 Inmunidad Adaptativa
1.1.2.1 Inmunidad Humoral
1.1.2.2 Inmunidad Celular
15
15
15
18
19
19
2. Respuesta Inmune
2.1 Reconocimiento del Antígeno
2.2 Presentación del Antígeno
21
21
25
3. Bases celulares del sistema
inmunitario
3.1 Linfocitos T y B
3.2 Distinción entre linfocitos T y B
mediante marcadores de superficie
3.3 Linfocitos T
3.3.1 Selección positiva
3.3.2 Selección negativa
26
4. Activación de los linfocitos T
4.1 Inducción
4.2 Expansión
33
33
40
5. Canales iónicos relacionados
con linfocitos
42
5.1 Canales de potasio
5.1.1 Canal Kv1.3
5.1.2 Canales de K+ activados
por calcio
5.1.3 Canales de potasio
sensibles a ATP (KATP)
5.1.3.1 Estructura de los
canales (KATP)
44
45
47
5.1.3.2
sulfonilurea
Receptores
26
28
31
31
32
49
49
a
51
5
53
5.1.4 Canales mitocondriales de
potasio sensibles a ATP (mitoKATP)
5.2 Canales CRAC
58
5.3 Canales de cloro (Cl-)
63
Conclusiones
Perspectivas
Referencias
66
67
68
6
Abreviaturas
Ac. Anticuerpo.
Ag. Antígeno.
API-1. Proteína activadora 1.
ChTx. Caribdotoxina.
CPA.Célula presentadora de antígeno.
CRAC. Canal activado por calcio liberador de calcio.
CSF. Factores estimuladores de colonias.
Em. Potencial de membrana.
ICAM. Moléculas de adhesión intracelular.
IFN. Interferón.
Ig. Inmunoglobulina.
IL. Interleucina.
IKCa1. canal de potasio sensible a calcio de conductancia intermedia.
IP3. Inositol trifosfato.
IPC. Pre-condicionamiento isquémico.
IP3R. Receptor específico a IP3.
KATP Canales de potasio sensible a ATP.
Kv1.3. Canal de potasio sensible a voltaje 1.3
KCOs. Abridores de canales de potasio.
LAT. Acoplador para la activación de células T.
LPS. Lipopolisacárido.
MHC. Complejo mayor de histocompatibilidad.
7
MgTx. Margatoxina.
mIg. Inmunoglobulina de membrana.
mitoKATP. Canal mitocondrial de potasio sensible a ATP.
NK. Célula citocida natural .
NLS. Localización de secuencias nucleares.
NFAT. Factor nuclear de células T activadas.
NF-kb. Factor nuclear de la cadena Kappa en células B.
NO. Óxido Nítrico.
PAMPs. Patrones moleculares asociados a patógenos.
PHA. Fitohemaglutinina.
PLA. Fosfolipasa A.
PLC. Fosfolipasa C.
PKC. Proteína cinasa C.
Po. Probabilidad de apertura del canal.
PRRs. Receptores de reconocimiento de patrones.
RVD. Regulación del decremento del volumen.
RVI. Regulación del incremento del volumen.
Tc. Linfocito T citotóxico.
TCR. Receptor de antígeno de células T.
TEA. Tetraetilamonio.
Th. Linfocito T colaborador.
TK. Tirosina cinasa.
TLR. Receptores toll.
8
TNF. Factor de necrosis tumoral.
VCAM-1. Molécula de adhesión vascular.
4(AP) 4-Aminopiridina.
5-HD. Hidroxidecanoato.
9
Índice de Figuras
Figura 1. Inmunidad Innata e
20
Inmunidad Adaptativa
Figura 2. Representación
22
esquemática de las moléculas
MHC I y MHC II
Figura 3. Estructura esquemática
23
del receptor para antígeno
de los linfocitos
Figura 4. Presentación del
25
antígeno
Figura 5. Clases principales de
27
linfocitos T
Figura 6. Moléculas accesorias
34
que participan en la sinapsis
entre linfocito T y la molécula
presentadora de antígeno
Figura 7. Principales vías de
36
señalización en la activación
de linfocitos T
37
Figura 8. Activación de c-Lck y
Fyn
10
Figura 9. Dominios ITAMs de las
38
moléculas ζ del CD3
y como interviene la ZAP-70.
Figura 10. Interacciones celulares
41
que participan
en la activación y proliferación de
los linfocitos.
Figura
11.
Relación hipotética
45
entre canales de K+
y proliferación celular
Figura 12. Estructura octamérica
50
del canal de potasio
sensible a ATP
Figura 13.
Estructura del canal
52
KATP
Figura 14. Reguladores
55
fisiológicos de canales KATP
mitocondriales
Figura 15. Corrientes
57
representativas del canal mitoKATP
Figura 16. Eventos de calcio en
linfocitos T
59
Figura 17. Canales iónicos en
linfocitos T
62
11
Índice de tablas
Tabla 1. Células fagociticas y sus
17
localizaciones.
Tabla 2. Inmunidad innata vs.
21
Inmunidad adaptativa
Tabla
3.
Clasificación
de
las
30
citosinas de acuerdo a su función
Tabla
4.
Canales
iónicos
43
caracterizados en linfocitos
Tabla 5. Isoformas del canal KATP
53
12
Resumen
Los linfocitos T son células del sistema inmune que reconocen un objetivo
no-propio como un patógeno, solo después de que los antígenos (pequeños
fragmentos del patógeno) han sido procesados y presentados en combinación
con un receptor propio, una molécula del llamado complejo mayor de
histocompatibilidad.
En los linfocitos T se han caracterizado diferentes tipos de canales
iónicos. Estudios electrofisiológicos en estas células del sistema inmunológico
han sugerido que los canales iónicos juegan un papel importante en la respuesta
inmune, quizá por el inicio de una cascada bioquímica de eventos
enzimáticamente controlados, por ejemplo, el canal CRAC el cual tiene un papel
esencial durante el desarrollo y maduración de los linfocitos, con la activación de
este canal viene la activación del canal Kv1.3, importante en la regulación del
potencial de membrana así como de la proliferación celular, por su parte el canal
IKCa1 responde a concentraciones elevadas de calcio en el linfocito
hiperpolarizando la membrana del linfocito y
podemos encontrar también al
-
canal de Cl responsable del volumen celular.
Por otro lado se han caracterizado canales de potasio sensibles a ATP en
mitoblastos de linfocitos T los cuales podrían estar implicados en la activación
de dichas células relacionando el estado energético de la célula con el potencial
de membrana.
13
Abstract
Lymphocytes T are cells of the immune system that recognize an not-own
objective like a pathogen,only after the antigens (small fragments of the
pathogen) process and have been presented in combination with an own
receiver, a molecule called Major Histocompatibility Complex.
In lymphocytes T different types from ionic channels have been
characterized. Electrophysiology studies in these cells of the immunological
system have suggested play an important role in the immune response, perhaps
by the beginning of a biochemical cascade of events enzymatically controlled, for
example, CRAC channel which has an essential paper during the development
and maturation of the lymphocytes, with the activation of this channel comes the
activation from the Kv1.3 channel, important in the regulation of the membrane
potential as well as of the cellular proliferation, on the other hand the IKCa1
channel responds to elevated calcium concentrations in the lymphocyte
hyperpolarizing the membrane of the lymphocyte and we can also find to the
channel of Cl- responsible for the cellular volume.
On the other hand sensible potassium channels to ATP have been
characterized in mitoplast of lymphocytes T which could be implied in the
activation of these cells relating the power state of the cell to the membrane
potential.
14
1. EL SISTEMA INMUNOLOGICO
1.1 Tipos de inmunidad
El término inmunidad, se ha definido en el campo biológico
protección contra enfermedades, y más específicamente
como
enfermedades
infecciosas.
El sistema inmunitario esta constituido por células y moléculas
responsables de esta inmunidad, y su colectiva y coordinada respuesta al
reconocimiento de sustancias extrañas incluyendo macromoléculas como
proteínas y polisacaridos provocan la respuesta inmunitaria. Existen dos tipos
de tipos de respuesta inmune: la inespecífica o innata y la específica o
adaptativa (Abbas y cols., 1997).
1.1.1 Respuesta Inmune innata
La inmunidad innata distingue aquellos agentes externos potencialmente
patógenos (antígenos Ag) de aquellos que no lo son aún cuando nunca antes
hubieran estado expuestos a ellos (Zambrano,1999), y constituye la primera
línea de defensa del organismo, ya que se activa rápidamente. Este tipo de
inmunidad esta presente en todos los individuos normales, sólo que varía de uno
a otro según sus condiciones fisiológicas; actúa de manera inespecífica porque
no distingue entre microorganismos de especies diferentes y su intensidad de
respuesta no se altera con exposiciones repetidas al antígeno.
Entre los mecanismos innatos de defensa participan las barreras
naturales físicas como la piel y la mucosa, los cilios en el epitelio de las vías
respiratorias o bien secreciones como el ácido del estómago o de las glándulas
15
sebáceas. Además de estas barreras físicas de defensa también participan una
serie de
mecanismos celulares y humorales mediados por la activación del
complemento, citosinas, el sistema fagocitario (neutrófilos, macrófagos) y de
células asesinas naturales o NK (del ingles natural killers) (Zambrano, 1999;
Pterov, 1982) y dependiendo de su secuencia de actuación podremos
agruparlos en:
•
Actuación rápida (entre los 4 minutos y las 4 horas) mediada por:
activación del complemento por la vía alternativa y activación de los
macrófagos.
•
Actuación media y lenta (entre las 4 horas y los 4 días) mediada por: La
inflamación, la activación de las células NK (asesinas naturales) y la
producción y liberación de interferón.
Los determinantes principales de éste tipo de inmunidad están bajo
control genético y el grado de protección, es por tanto, hereditario; pero se
modifica en el transcurso de la vida por factores como edad, sexo, alimentación
y estado físico del individuo ( Weir, 2004; Zambrano, 1999).
La capacidad de la inmunidad innata para reconocer agentes patógenos
que entran al organismo se basa en una serie de patrones de reconocimiento a
receptores (PRRs), que reconocen patrones moleculares conservados en
diferentes grupos de patógenos microbianos (PAMPs). La unión de estos
receptores con sus ligandos induce
la activación de diferentes mecanismos
dirigidos a la eliminación de los patógenos. Por ejemplo algunos receptores
solubles, como la proteína C reactiva, estimulan la vía del complemento (Abbas,
1997; Hernandez-Urzua y Alvarado-Navarro, 2001), el cual es un grupo complejo
de proteínas séricas, que existen en concentración baja en el suero normal,
activado también por reacciones antigeno-anticuerpo y que es esencial para la
hemólisis inmune y la bacteriólisis mediada por anticuerpos (Ac), juega un papel
importante en otras reacciones biológicas como la opsonización, quimiotaxis y
16
citólisis inmune; existen dos vías para su activación, la alterna y la clásica, que
llevan a las mismas consecuencias fisiológicas (opsonización, activación celular
y lisis) pero usan diferentes procesos de iniciación (Petrov 1982; Weir 2004, Bier
y col., 1981)
Otros receptores de membrana, como los receptores depuradores (o el
receptor de manosa, induce la fagocitosis o endocitosis de los microorganismos
por parte de macrófagos, neutrófilos y células dendríticas. (Abbas, 1997;
Hernandez-Urzua y Alvarado-Navarro, 2001 )
Existen tres tipos principales de células fagocíticas: 1) los neutrófilos; 2)
las células del sistema fagocítico mononuclear, incluyendo los monocitos de la
sangre y los macrófagos (que proceden de los monocitos) de los tejidos
conjuntivos; y 3) los fagocitos específicos de órganos como hígado, bazo,
ganglios linfáticos, pulmones y cerebro (Tabla 1).
Tabla 1. Células Fagocíticas y sus localizaciones
Fagocitos
Localización
Neutrófilos
Sangre y todos los tejidos
Monolitos
Sangre
Macrófagos (histiocitos)
Todos los tejidos (incluyendo bazo,
ganglios linfáticos, médula ósea)
Células de Kupffer
Hígado
Macrófagos alveolares
Pulmones
Microglia
Sistema nervioso central
Otra característica que puede observarse en este tipo de inmunidad es
que los mecanismos innatos de defensa pueden distinguir entre los hidratos de
carbono producidos por las células de los mamíferos y los producidos por
bacterias. Los hidratos de carbono bacterianos que “marcan” la célula para su
17
ataque fagocítico forman parte de las glucoproteínas y los lipopolisacáridos de la
pared bacteriana.
También algunos PRRs como los TLRs (receptores Toll) promueven la
producción de proteínas que ayudan a la eliminación de los microorganismos por
ejemplo la lisozima, fosfolipasa A (PLA), defensinas, proteínas de complemento,
lactoferina, óxido nítrico (NO) sintasa, mieloperoxidasa; y la producción de
citosinas que inducen la reacción inflamatoria local, caracterizada por la
atracción y activación de otros leucocitos. (Abbas, 1997; Hernandez-Urzua y
Alvarado-Navarro, 2001 )
En resumen la inmunidad innata, representa la respuesta inicial contra
numerosos microorganismos patógenos, y en muchos casos es suficiente para
eliminar el patógeno. No obstante, la inmunidad innata esta estrechamente
relacionada con la inmunidad adaptativa.
1.1.2 Respuesta inmune adaptativa
La inmunidad adaptativa (también denominada inmunidad adquirida o
específica), es un mecanismo de respuesta más evolucionado, que es
estimulado de forma específica tras la exposición a un determinado agente
extraño. Aunque la activación completa de estos mecanismos requiere varios
días, se adquiere mayor especificidad e intensidad de la respuesta alcanzada,
así como capacidad de memoria (Tabla 2). De esta manera, la respuesta de
estos mecanismos ante exposiciones repetidas al mismo patógeno, es mucho
más efectiva que la respuesta innata sin embargo, la activación de la respuesta
adaptativa depende de la activación previa de la respuesta innata, puesto que es
esta última la que tiene la capacidad de distinguir aquellos agentes con potencial
patógeno (Abbas y col., 1997 ; Puertas 2006).
18
Las respuestas de la inmunidad específica están clasificadas en dos
tipos, basados en los componentes del sistema inmune que median esta
respuesta: la inmunidad humoral y la inmunidad celular.
1.1.2.1 Inmunidad Humoral
La Inmunidad Humoral
es mediada por
moléculas en la sangre que son
responsables del reconocimiento específico y eliminación de antígenos;
llamados anticuerpos como son las inmunoglobulinas (Igs) producidas por los
linfocitos B (Fig. 1). Los linfocitos B se renuevan periódicamente, pero siempre
permanecen células de memoria que permiten repetir una respuesta inmune al
producirse un nuevo contacto con el antígeno específico.
La zona del antígeno reconocida por los anticuerpos es el epítope o
determinante antigénico. Cuando los anticuerpos se unen específicamente al
antígeno, pueden tener un efecto neutralizante directo.
Además, la unión
del anticuerpo a la superficie de los agentes
infecciosos se puede favorecer en función del isotipo de la inmunoglobulina en
cuestión (IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, en humanos), la lisis
mediada por el complemento, mecanismos de fagocitosis y (o) la liberación de
mediadores inflamatorios (Abbas y col., 1997; Jeneway y col., 1999; Penninger y
Crabtree., 1999; Puertas 2006).
1.1.2.2 Inmunidad Celular
La Inmunidad celular es mediada por células llamadas linfocitos T y este
tipo de inmunidad esta especialmente orientada a la eliminación de aquellos
microorganismos que residen y proliferan en el interior de las células del
huésped por lo que no son accesibles a los anticuerpos circulantes. Los
linfocitos T citotóxicos, mayoritariamente CD8+, tienen función citolítica sobre las
19
células infectadas. Por su parte, los linfocitos T CD4+ colaboradores, están
especializados en la producción de citosinas que coordinan el desarrollo de la
respuesta inmunitaria entre una de sus funciones esta la de estimular a los
linfocitos B para producir anticuerpos. Según el patrón de citosinas producido
por estos linfocitos se favorece la activación de una respuesta de tipo celular,
también denominada Th1 y Th2 (Fig. 1) (Abas y col., 1997).
Figura 1. Inmunidad Innata e Inmunidad Adaptativa. En la figura se muestra
la activación de la inmunidad innata por la presencia del antígeno. En la inmunidad
adaptativa se puede presentar una respuesta humoral la cual esta dada por la
liberación te anticuerpos de los linfocitos B gracias al estimulo de los linfocitos
colaboradores 2 por la liberación de diferentes citosinas, por otro lado la inmunidad
celular esta dada por la estimulación de linfocitos T colaboradores tipo 1.
20
En la siguiente tabla 2 se presenta una comparación de características de
la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa.
Tabla 2. Inmunidad natural vs. Inmunidad adaptativa
Característica
Reconoce
Inmunidad natural
antígenos
Inmunidad adaptativa
No
Si
Si
No
Desarrolla memoria
No
Si
Mediada por receptores
Si
Si
Si
Si
concretos
Reconoce “patrones” de
patógenos
Participan
citosinas
y
otros mediadores
2. RESPUESTA INMUNE
2.1 Reconocimiento del antígeno
Para que se inicie la respuesta inmune específica, se requiere el
reconocimiento del antígeno por parte de los linfocitos y la subsiguiente
activación de los mismos.
Los linfocitos B reconocen el antígeno mediante inmunoglobulinas de
membrana (mIg)
las cuales puede reconocer a estos antígenos en su
conformación nativa, mientras que los linfocitos T lo reconocen mediante el
21
receptor de linfocitos T (TCR) (Fig.3) el cual sólo puede reconocer fragmentos
peptídicos derivados del antígeno que este unido a moléculas del MHC a lo cual
se le conoce como “ fenómeno de restricción del MHC” (García y col., 1998).
Para ello, los antígenos procedentes de agentes externos son internalizados,
procesados y presentados por células especializadas que se denominan células
presentadoras de antígeno (CPA) (Abbas y col., 1997; Jeneway y col., 1999;
Penninger y Crabtree., 1999; Reinherz y col., 1999).
Las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad mencionadas
anteriormente son glicoproteínas presentes en las membranas de la mayoría de
las
células
nucleadas,
entre
las
que
se
encuentran
las
células
inmunocompetentes. Estas moléculas son esencialmente de dos tipos, tipo I y
tipo II y tienen entre otras funciones la de presentar el antígeno a los linfocitos
así como participar en el proceso de maduración de los linfocitos T en el timo
(Fig. 2).
Figura 2.
Representación esquemática de las moléculas MHC I y MHC II. Se
muestran lo lugares de presentación del Ag y el lugar de anclaje en la membrana celular
así como el tipo de cadenas en cada clase.
22
Las moléculas de este complejo son altamente polimórficas y presentan
más de cuarenta alelos comunes para cada gen individual. Estas proteínas,
identificadas como antígenos, distinguen a los miembros de una misma especie.
Tanto las moléculas de clase I como las de clase II fueron reconocidas
originalmente por su capacidad de inducir respuesta por parte de los linfocitos T,
originándose así el rechazo de tejidos transplantados (Abbas y col., 1997;
Matheux, 2004; Reinherz y col., 1999).
El reconocimiento antigénico por los linfocitos T mediante el receptor TCR
es muy importante para la generación y regulación de una respuesta inmunitaria
eficaz por lo cual es una pieza clave dentro de este proceso. (Lanzavecchia y
col., 1999; Chang y col.,1997). (Fig. 3)
Figura 3 Estructura esquemática del receptor
para antígeno de los linfocitos T. constituido
por una glucoproteína heterodimérica unida por
puentes disulfuro (αβ ó δγ) el cual se encuentra
estrechamente ligado con CD3 que es un
complejo polipeptídico. (Tomado de Peña
Imunologyonline)
El TCR está constituido por una glucoproteína heterodimérica unida por
puentes disulfuro (αβ ó γδ), lo cual se define durante su diferenciación. En las
etapas tempranas de la ontogenia, hay un predominio de linfocitos γδ; a partir
del nacimiento, más del 90% de los timocitos expresan receptores αβ. Estos dos
linajes muestran además una distribución diferencial en el organismo, y llevan
acabo funciones diferentes.
Más del 95%
de los linfocitos T periféricos y de la mayoría de los
timocitos que expresan TCR corresponden al tipo αβ. Por el contrario, los
linfocitos γδ son abundantes en diversos epitelios, como la epidermis (en
23
ratones), el epitelio intestinal, el útero y la lengua, aunque la función para los
linfocitos γδ no está muy bien establecida. El TCR, a su vez, se encuentra en
estrecha asociación en la superficie celular con un complejo polipeptídico
conocido como CD3 (Rud,1999). Esta asociación es necesaria para una correcta
expresión en la superficie celular del TCR. Los componentes de CD3 no
muestran variabilidad de aminoácidos en diferentes células T, por lo que no
contribuyen a la diversidad genética del receptor. La función mejor conocida
para este complejo de proteínas es la transducción de señales generadas por la
activación celular como resultado del reconocimiento del antígeno por el
heterodímero del receptor. El complejo polipeptídico CD3 comprende al menos
cinco cadenas polipeptídicas, llamadas γ, δ, ε, ζ, ψ, η (Bronstein-Sitton, 2006;
Chang y col., 1997).
Las cadenas α, β, γ y δ de los receptores antigénicos presentan una
región constante, común para cada una de ellas, y una región variable propia de
cada uno de los distintos clones de linfocitos T y diferentes a todas las demás.
La presencia de esta región variable es lo que le confiere su carácter polimórfico
al receptor. Las cuatro cadenas provienen de la reordenación de genes
constituidos a su vez por la unión de un elemento procedente de cada una de
las diferentes regiones del gen, denominadas V (variable), D (diverso), J (unión)
y C (constante). Este proceso se cumple para las cadenas β, γ y δ. La cadena α
está constituida solo por elementos de las regiones V, J y C. los dominios
extracelulares tipo inmunoglobulinas de estas cadenas, junto con los de las
cadenas γ, δ, ε del CD3, probablemente forman asociaciones; se propone que
al menos los dos dominios V (variables) de los receptores de ambos tipos se
asocian de manera similar a como lo hacen los dominios VH/VL de las
moléculas de inmunoglobulinas. (Bronstein-Sitton, 2006; Gascoigne y col., 1987
Chang y col., 1997).
24
2.2 Presentación del antígeno
Para que los linfocitos T, tal como se ha dicho anteriormente puedan
reconocer al Ag, éste debe ser debidamente presentado por las células CPA
(Janeway y cols, 1999). Los péptidos resultantes después del procesamiento
intracelular del Ag son presentados en la superficie de las células, unidos a
moléculas del MHC de clase II (linfocitos T CD4+) ó clase I (linfocitos T CD8+) y
estos péptidos podrán interactuar con el TCR de linfocitos T (Fig.1). Las
moléculas del MHC de clase I, presentes en la mayoría de las células de un
organismo, presentan péptidos derivados de proteínas endógenas; mediante
este mecanismo, los linfocitos T citotóxicos pueden unirse a péptidos originados
por un microorganismo patógeno intracelular (Armstrong y col., 1997 ;Modino y
col., 1996) (Fig.4).
Figura 4. Presentación del antígeno. El antígeno es reconocido por los linfocitos B pero los
linfocitos T requieren que este sea presentado por moléculas de histocompatibilidad.
25
3. BASE CELULAR DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO
3.1 Linfocitos B: respuesta de anticuerpos humorales; Linfocitos T:
respuesta inmunitaria mediada por células.
Durante la década de 1960 se descubrió que dos clases de respuesta
inmune estaban mediadas por diferentes clases de linfocitos: las células T, que
se desarrollan en el timo, y que son responsables de la inmunidad mediada por
célula; y las células B, que en los mamíferos se desarrollan a partir de la médula
ósea en el adulto o en el hígado fetal, y que producen anticuerpos.
Existen dos clase principales de linfocitos T: los linfocitos T colaboradores
(Th, del inglés helper) y los linfocitos T citotóxicos (Tc) (Fig 5). Los linfocitos
colaboradores aumentan la respuesta de otras células inmunitarias, como los
linfocitos B que producen los anticuerpos. Por su parte, los linfocito T citotóxicos
se encargan de destruir células infectadas, y debido a que, a diferencia de la
células Th, participan directamente en la defensa contra infecciones, las Tc
reciben el nombre de células efectoras. Las células Th caen dentro de dos
categorías generales, Th1 y Th2, definidas por el tipo de citosinas que secretan
(Abbas y cols, 1997; Farrar y cols, 2002). Las citosinas particulares producidas
durante una respuesta inmune determina otras células inmunes reclutadas.
Aunque existen excepciones, la separación de las funciones de los linfocitos Th
y Tc viene dada por el origen de los antígenos que reconocen.
26
Figura 5. Clases principales de linfocitos T. El antígeno (péptido) es presentado por
moléculas de histocompatibilidad clase I a las células Tc mientras que las moléculas
clase II lo hacen a los Th.
Los Tc, mayoritariamente CD8+, tienen función citolítica sobre las células
infectadas. Por su parte, los linfocitos T CD4+ colaboradores, están
especializados en la producción de citosinas que coordinan el desarrollo de la
respuesta inmune. Según el patrón de citosinas producido por estos linfocitos se
favorece la activación de una respuesta de tipo celular, también denominada
Th1 (IL-2, IL-12, IFNδ, TNFBβ) tienden a promover la respuesta citotóxica y
activación de macrofagos, o de tipo humoral Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13).
(Bergman 2001; Fanger y col., 2000; Hernández-Ruiz y col., 2006).
27
3.2 Distinción entre linfocitos T y linfocitos B mediante marcadores
de superficie
Los linfocitos T y B se pueden distinguir morfológicamente sólo después
de su activación por el antígeno.
Las células T y B no estimuladas (en “reposo”) tienen un aspecto muy
similar, incluso al microscopio electrónico; ambas son pequeñas, la mayor parte
de la célula corresponde al núcleo y tienen que ser activadas por el antígeno
para poder proliferar y avanzar en la maduración. Los linfocitos B activados se
convierten en células productoras de anticuerpos, en cuyo estado maduro, se
conocen como células plasmáticas, que poseen un abundante retículo
endoplásmico rugoso. Las células T activadas contienen muy poco retículo
endoplásmico y no secretan anticuerpos, aunque sí diversos mediadores
denominados linfocinas, interleucinas y citosinas. (Abbas y col.,1997; Zambrano,
199).
Las interleucinas son proteínas solubles de bajo peso molecular
mediadoras de crecimiento celular, inflamación, inmunidad, diferenciación y
reparación, entre otras actividades. (Hernandez-Urzua y Alvarado-Navarro,
2001).
Las citosinas constituyen un grupo grande de moléculas que participan
en la señalización entre las células durante las respuestas inmunitarias. Por lo
general son proteínas pequeñas solubles y, en algunos casos, glucoproteínas,
producidas por una célula que pueden afectar el comportamiento y las
propiedades de otras células. Son producidas por diferentes tipos celulares, no
sólo por las células inmunitarias, y por lo general regulan las fases efectoras de
la respuesta inmunitaria tanto natural como especifica. En la inmunidad natural
las citosinas efectoras son producidas principalmente por los fagotitos
mononucleares y por ello reciben el nombre de monocinas. Las monocinas
pueden ser producidas directamente como respuesta a un estímulo microbiano,
28
o bien en respuesta a los linfocitos T estimulados por Ag, como parte de una
respuesta específica. (Abbas y col.,1997; Zambrano, 199; Petrov, 1982).
También desempeñan un papel importante como coestimuladoras de la
activación de linfocitos, proporcionando mecanismos de amplificación para las
respuestas inmunitarias especificas. La mayoría de las citosinas presentes
durante una respuesta inmunitaria específica son producidas por los linfocitos T
activados, y tales citosinas han sido denominadas linfocinas (Carosi, 1990;
Chung, 2001). En general, las citosinas provenientes de los linfocitos T son las
moléculas efectoras de la inmunidad mediada por células y son también
responsables de la comunicación
entre células del sistema inmunitario e
inflamatorio. Los linfocitos T producen diversas citosinas que regulan la
activación, el crecimiento y la diferenciación de diferentes poblaciones de
linfocitos, también tiene otras funciones como activadoras y reguladoras de
células inflamatorias, tales como los fagocitos mononucleares, los neutrófilos y
los eosinofilos. (Abbas y col., 1997)
Existen también otro grupo de citosinas producidas tanto por linfocitos
como por fagocitos mononucleares, llamadas de forma genérica factores
estimuladores de colonias, CSF, las cuales estimulan el crecimiento y la
diferenciación de los leucocitos inmaduros de la médula ósea.
Las citosinas poseen la capacidad de influir tanto en la síntesis de otras
citosinas como en la acción de estas (Granger, 2004; Chung 2001). Al igual que
otras hormonas polipeptídicas, las citosinas inician su acción al unirse a
receptores específicos presentes en la superficie de las células diana, y la
expresión de muchos de estos receptores esta regulada por señales específicas.
En general, la mayoría de las respuesta celulares a las citocinas ocurren en un
período de horas y requieren de la síntesis de novo de ARNm y de proteínas.
Finalmente, para muchas células diana, las citosinas actúan como reguladoras
de la división celular, esto es, como factores de crecimiento.(Abbas 1999; Weir,
29
2004). Una forma de clasificar las citosinas es sobre la base de sus funciones,
como se muestra en la (tabla 3). (Chung, 2001)
Tabla 3 . Clasificación de las citosinas de acuerdo a su función.
Función
Citosina
Mediadores de la inmunidad natural
IFN-α ó β (Tipo I), TNF-α, IL-1, IL-6,
Quimiocinas (IL-8, MCP-1, MIP-1α y
1β)
Reguladores
de
la
activación, IL-2, IL-4 y TGF-β
crecimiento y diferenciación de los
linfocitos.
Activadores
de
las
células IFN-γ, LT, IL-10, IL-5, IL-12, MIF
inflamatorias.
Estimuladores
del
crecimiento
y CSFs, IL-3, ligando para c-kit, SCF,
diferenciación de leucocitos inmaduros. GM-CSF
Aunque morfológicamente los linfocitos T y los linfocitos B son muy
similares, existen muchas diferencias en sus proteínas de membrana
plasmática, que se pueden considerar como marcadores de superficie; como
ejemplos de marcadores se puede citar CD3, específicos de las células T, o los
marcadores CD4 y CD8, específicos de subpoblaciones de linfocitos T (Janeway
y col., 1999).
30
3.3 Linfocitos T
Los linfocitos T derivan de células pluripotenciales de la médula ósea y
sufren la reorganización de sus genes en un microambiente especializado, para
producir moléculas receptoras únicas en cada célula. Están células migran
desde etapas muy tempranas hacia el timo (el nombre de linfocitos T se refiere a
que derivan del timo), donde se lleva a cabo su maduración, pasando por una
serie de estadíos o fases que se distinguen por la expresión de diferentes
moléculas de superficie como son CD44 y CD25, el complejo CD3:TCR
(Glimcher y Singh., 1999) y las proteínas correceptoras CD4 y CD8 (Modino y
cols, 1996). Por lo tanto solo aquellas células que reconocen las moléculas del
MHC propias de su organismo serán capaces de contribuir al desarrollo de la
respuesta inmunitaria adaptativa. De igual forma, algunas células T deberán
reconocer péptidos propios también unidos a moléculas
de MHC para
convertirse en autotolerantes.
Para cumplir este doble requisito, los linfocitos T sufren dos procesos de
selección, un proceso de selección positiva en el cual son seleccionados de
acuerdo con la restricción por las moléculas del MHC, y un proceso de selección
negativa, durante el cual se eliminan las células especificas contra péptidos
propios unidos a moléculas propias del MHC (Modino y col., 1996).
3.3.1 Selección positiva
En el timo, además de la maduración de linfocitos T también tiene lugar
un proceso de selección de timocitos (linfocitos inmaduros), previo a la liberación
de éstos al torrente circulatorio. Las células epiteliales de la corteza tímica
presentan péptidos derivados de autoantígenos en el contexto de moléculas
MHC entonces durante su paso por la corteza tímica, aquellos timocitos cuyo
31
TCR no es capaz de interaccionar adecuadamente con las moléculas de MHC
vuelven a reordenar su TCR o son delecionados directamente.
Mediante este proceso de selección positiva, solo aquellos timocitos que
se pueden unir adecuadamente a las moléculas de MHC sigue su proceso de
maduración en la medula tímica (Modino y col., 1996; Kisielow y col., 1995;
Singer y col., 1990).
3.3.2 Selección negativa
En la médula, las células epiteliales medulares tímicas y las células
dendríticas son las responsables de la presentación de autoantígenos a los
timocitos, en presencia de moléculas coestimuladoras (CD80 y CD86). En esta
fase, los timocitos son muy sensibles a la apoptosis por hiperactivación, de
manera que aquellos que reconocen autoantígenos son eliminados “in situ”
(selección negativa) (Palmer, 2003). Además cabe destacar que las células
epiteliales medulares tímicas son capaces de expresar, de manera ectópica,
autoantígenos que normalmente sólo se expresan en ciertos tejidos periféricos.
Tras estos procesos de selección positiva y negativa, sólo maduran y salen del
timo aquellos linfocitos que pueden interactuar con moléculas de MHC pero no
reconocen autoantígenos (Liston y col., 2007).
De lo anterior podemos observar que el desarrollo de los linfocitos T se
acompaña de acontecimiento de muerte celular, reflejo del intenso procesos de
selección de los linfocitos T y de la eliminación de clones con especificidades
por péptidos propios.
32
4. ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T
La activación de los linfocitos T puede provocar una variedad de
respuestas incluyendo proliferación, migración y aún apoptosis (Bronstein-Sitton,
2006) y la intervención de los canales iónicos en la activación de dichas células
ha sido sugerida por los reportes de despolarización de la membrana,
hiperpolarización, incremento en el flujo iónico a través de la membrana y un
incremento intracelular de calcio después de una estimulación mitogénica
(Chandy et al., 1984). La “decisión” de las células T de ser activadas o no es
crucial: una respuesta inapropiada o exagerada podría provocar enfermedades
autoinmunes mientras que una falla en la respuesta provocaría infección o
incluso muerte (Bronstein-Sitton, 2006).
Por lo general, la respuesta de anticuerpos y las reacciones de inmunidad
celular están dirigidas hacia determinantes antigénicos diferentes. Esto se debe
a que los antígenos no son presentados por las moléculas del MHC de forma
intacta, sino que, como se explica con anterioridad, requieren ser procesados y
presentados en la superficie celular. Una diferencia importante en este
mecanismo de procesamiento y presentación radica en que del origen del
antígeno depende el tipo de respuesta.
4.1 Inducción
Una vez que el complejo TCR/CD3 reconoce el epitope antigénico en
unión con las moléculas del MHC, las moléculas involucradas sufren cambios
bioquímicos importantes (Lanzavecchia y cols, 1999; Penninger y Crabtree.,
1999). Sin embargo, dicho reconocimiento no es suficiente para lograr la
activación total de linfocitos que conduce a la generación de respuestas
biológicas, ya que para iniciar una respuesta inmunitaria se requieren señales
33
coestimuladoras (CD4, CD8, CD2, CD45, y CD28 y sus ligandos respectivos)
(Fig. 6), (Janeway y col., 1999).
Por el contrario, la ausencia de estas señales tras el reconocimiento del
antígeno conduce a la inactivación de los linfocitos T.
Figura 6. Moléculas accesorias que participan en la sinapsis entre linfocitos T y la
molécula presentadora de antígeno.
Dentro de las principales moléculas accesorias que contribuyen a
proporcionar las señales coestimuladoras se encuentran, en el caso de los
linfocitos T, algunas moléculas de adhesión, correspondientes a la familia de las
integrinas, tales como LFA-1 y VLA-4, las cuales unen a ICAM (moléculas de
adhesión intracelular) y VCAM-1 (del ingles Vascular cell adhesión molecule)
respectivamente sobre la superficie de las CPA (Dustin y col., 1991); miembros
de la superfamilia de las inmunoglobulinas como la molécula CD28 la cual se
expresa en todos los linfocitos CD4 y aproximadamente en el 50% de los
linfocitos CD8. Los ligandos naturales de la molécula CD28 pertenecen a la
familia B7, ésta molécula es muy importante porque además de su papel en el
proceso de adhesión también participa en el mecanismo de transducción de
34
señales y activación de la célula T. Las moléculas CD2, son moléculas de
adhesión que contribuyen a potenciar la afinidad de unión del linfocito T con la
CPA, sus ligandos naturales son CD58 (LFA-3) y CD45 (ICAM-1).
La tirosina fosfatasa CD45 de los linfocitos T, también ha sido
relacionada con la generación de las señales coestimuladoras. La unión de
todas estas moléculas trae como consecuencia una serie de acontecimientos a
nivel intracelular llamados de manera colectiva activación de los linfocitos T.
Estos cambios se inician con la generación de segundos mensajeros, los cuales
finalmente desencadenan un complejo proceso de señalización que se traduce
desde la membrana plasmática hasta el núcleo, dando lugar a las principales
respuestas biológicas que son: 1) acontecimientos tempranos de transducción
de señales; 2) activación transcripcional de algunos genes; 3) expresión de
nuevas moléculas de superficie; 4) secreción de citoquinas efectoras y/o
desarrollo de funciones citolíticas; 5) inducción de actividad mitogénica (Fig. 7)
(Bronstein-Sitton, 2006; Dustin y col., 2000; LLoyd y col., 1987).
35
Figura 7. Principales vías de señalización en la activación de linfocitos T. Se
aprecia el reconocimiento del epitópe por el TCR lo cual trae como consecuencia una
serie de acontecimientos intracelulares Como la activación transcripcional de algunos
genes, acontecimientos tempranos de transducción de señales y expresión de nuevas
moléculas de superficie así como la activación de algunos canales iónicos. (BronsteinSitton, 2001).
Un acontecimiento intracelular después del reconocimiento de complejo
TCR/CD3, es el incremento en la fosforilación de las cadenas no polimórficas de
la molécula CD3. Estas cadenas tienen dominios intracitoplasmáticos regiones
llamadas ITAM (del ingles Immunoreceptor Tyrosine-based activation Motifs) que
se fosforilan por la acción de tirosinas cinass como c-Lck o c-fyn (Fig.8) (Aguado
y col, 2006; Lovatt y col, 2006; Sugie y col, 2004).
36
Figura 8. Activación de c-Lck y Fyn. Tras el reconocimiento del TCR de la molécula
de antígenos leucocitarios, HLA (del inglés Human Leukocyte Antigen) y péptidos, se
produce la activación de la tirosina cinasas c-Lck y Fyn que fosforilan las cadenas ζ del
CD3.
La tirosina cinasa c-Lck está localizada en la parte intracelular de la
membrana plasmática unida a la bicapa lipídica y la asociación física y funcional
de CD4 y CD8 con el complejo TCR/CD3 provoca que la c-Lck asociada a éstas
moléculas se aproxime a la porción citoplasmática de las proteínas del complejo
CD3 donde puede fosforilar en tirosinas a sus regiones ITAM (Racioppi y cols,
1996; Dustin y Chan 2000; Sugie y cols, 2004),
una vez fosforiladas se
convierten en sitios específicos de acoplamiento para la unión de proteínas
citoplasmáticas como la ZAP-70 (Fig. 8 y 9), ésta proteína es muy importante ya
que funciona como acoplador de señales desde la superficie celular hasta el
núcleo por fosforilación de adaptadores como Lat (acoplador para células T) y
una de las consecuencias de su mal funcionamiento o de su ausencia es una
falla en la función de los microtubulos del citoesqueleto por lo que la transmisión
de señales se vería afectada (Goda y cols, 2004; Blanchard 2002; Dustin y
Chan, 2000; Myung y cols, 2000). Los adaptadores para células T como por
ejemplo el adaptador Lat, son proteínas transmembrana con 4 residuos tirosina
37
requeridos para su activación (Y132, Y171, Y191 y Y226) cuya función una vez
fosforilados
es
organizar
complejos
multimoleculares
en
determinados
subdominios lipídicos de la membrana plasmática (Aguado y cols, 2006), estos
complejos contienen proteínas claves en la señalización interior de la célula
como la PLC-γ (Fosfolipasa C- gamma) (Faccetti y col, 1999; Sommers y col.,
2002).
Figura 9. Dominios ITAM de las moléculas ζ del CD3 y como interviene la ZAP70.
La PLC-γ se fosforila en tirosina y se activa dentro de los complejos
multimoleculares lipídicos de la membrana donde se induce la hidrólisis de su
substrato
específico,
el
fosfotidilinositol
bifosfato
(PIP2)
generando
los
metabolitos inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DGA) (Bronstein- Sitton, 2001;
Granja y col., 1991).
El metabolito inositol trifosfato IP3 se une a un receptor específico (IP3R)
localizado en unas estructuras específicas localizada en el retículo endoplásmico
facilitando la liberación del calcio intracelular. La depleción de las cisternas
internas de calcio activa a los canales CRAC y el flujo de Ca+2 del espacio
38
extracelular a través de estos canales resulta en una despolarización de la
célula.
Como se ha comentado anteriormente, la activación fisiológica de
receptores extracelulares, TCR, originan un incremento de Ca+2 intracelular esto
conduce a la activación de la fosfatasa calcineurina (dependiente de Ca+2 y
calmodulina) que desfosforila al factor nuclear de células T activadas (NFAT),
altamente fosforilado en células T en reposo. (Wu y col, 2003)
La translocación al núcleo, el aumento de afinidad para unirse al ADN y la
inducción de la actividad transcripcional de NFAT están regulados por esta
desfosforilación
que promueve cambio conformacionales en el factor que
permiten la exposición de sus secuencias de localización nuclear (NLS), y a la
entrada del factor al núcleo. Esta entrada la realiza NFAT acomplejado con la
calcineurina, que mantiene el factor desfosforilado en el núcleo lo que permite la
transcripción de múltiples genes dependientes de NFAT como los que codifican
para citosinas (IL2, IL4, TNF-α, GM.CSF) y receptores de superficie (FasL,
CD40L) todo esto mientras se mantiene las señales de calcio. Cuando el calcio
intracelular desciende, la calcineurina se desactiva y varias cinasas fosforilan al
factor, provocando su exportación al citosol. (Quesada y Redondo, 2003: Wu y
col., 2003).
Por otro lado, la proteína cinasa C (PKC) mostrada en la figura 7 es una
proteína de la familia de isoenzimas ampliamente distribuida en tejidos y órgano
de mamífero. En condiciones de reposo celular se encuentra localizada en el
cistosol donde es inactiva, una vez que recibe el estímulo del DAG se trasloca a
la membrana donde en presencia de fosfolípidos como la fosfatidilserina ejerce
su función de cinasa de proteínas en aminoácidos serina y treonina. Las PKCs
regulan la activación de genes en linfocitos T, mediante el control de varios
factores de transcripción.
39
Las tirosinas cinasas son activadas por la unión del epitope al TCR, esto
no solamente induce hidrólisis de fosfolípidos, también activa vías de
señalización a través de Ras (Fig. 7)
mediadas por Lat, el cual, una vez
fosforilado por ZAP70 se une a un adaptador intermediario (Grb-2) acoplándose
a una proteína de intercambio de nucleotidos de guanina (Sos), convirtiendo la
forma inactiva de Ras (Ras-GDP) a su forma activa (Ras-GTP) el cual se une a
C-Raf activandolo, una vez activado
actúa como una cinasa de MAPK
(MAPKKK) que a su vez activará y fosforilará una o más MAPKs como a ERK-1
y ERK-2 las cuales después de ser activadas migran al núcleo donde regulan a
determinados factores de transcripción involucrados en la proliferación y
diferenciación celular por ejemplo el complejo API-1 (proteína activadora-1). El
factor de transcripción API-1 está formado por proteínas pertenecientes a las
familias Jun (c-Jun, v-Jun, JunB y JunD), Fos (c-Fos, FosB, Fra1 y Fra2) o ATF
(ATF2 y ATF3). (Wu y col., 2003; Czyzyk y col., 2002).
Otro factor de transcripción es el NF-kB (Factor nuclear de la cadena
Kappa en células B) el cual se encuentra fundamentalmente en todos los tipos
celulares y esta implicado en la activación de multitud de genes en respuesta a
inflamación, infeccion y otras situaciones de stress que requieren una rápida
reprogramación génica. Los complejos de NF-kB se encuentran en el citoplasma
retenidos por moléculas llamadas inhibidores de NF-kB o IkB, dos de las más
estudiadas en linfocitos T son IkB-a e IkB-b que en condiciones de reposo están
unidas a los dimeros de NF-kB. Cuando el linfocito es activado se induce una
cascada de cinasas y proteasas que regulan la degradacion de IkB lo que
provoca la liberación de NF-kB/rel y su traslocación al núcleo (Fig. 7) (Wu y cols,
2003; Czyzyk y cols, 2002).
4.2 Expansión
Uno de los requerimientos mas importantes para que se lleve acabo la
proliferación de los linfocitos T es la presencia de la IL-2 definida como el factor
40
autocrino para dicha población, por lo que la transcripción de este gen es
necesaria para que ocurra la mitosis. De manera correspondiente, la
transcripción del gen para el receptor de IL-2 (IL-2R) es otro de los componentes
del proceso de activación necesario para el crecimiento de los linfocitos T en
respuesta a la IL-2 producida (Solomou y cols., 2001; Fierro y cols 2003). En la
parte 5´ del gen IL-2 se encuentra una región de aproximadamente trescientos
pares de bases que contienen sitios de unión para factores de transcripción
como los descritos anteriormente (NF-kB, API-1, NFAT), la acción conjunta de
estos factores es necesaria para conseguir la activación completa del gen IL-2.
En términos generales, tanto el proceso de inducción o activación como el
de expansión se aplica a todas las poblaciones de linfocitos T, con diferencia de
que las células CD4+ o T colaboradoras proliferan y secretan citosinas, mientras
que las CD8+ o T citotóxicas proliferan y son entonces capaces de ejercer su
activación citotóxica (Hernandez-Ruiz y cols., 2006)(Fig. 1o).
Figura 10. Interacciones celulares que participan en la activación y
proliferación de los linfocitos.
41
5. CANALES IÓNICOS EN LOS LINFOCITOS
Los canales son proteínas insertadas en la membrana que permiten el
flujo pasivo de iones bajo sus gradientes electroquímicos. Estos canales tienen
importantes funciones en diversos procesos como la excitación nerviosa y
muscular, secreción hormonal, proliferación celular, aprendizaje y memoria,
regulación de la presión sanguínea, balance de agua y sales, proliferación de
linfocitos, fertilización y muerte celular, también existen canales iónicos
involucrados en las funciones del sistema inmune (Ashcroft, 2006; DeCoursey y
col., 1985; Pardo 2004; Ledoux y col., 2006). Debido a sus importantes
funciones, su localización en membrana, su heterogenicidad estructural y la
restrictiva expresión de algunos tipos de canales en tejidos, los canales iónicos
son blanco atractivo para terapias farmacológicas. De hecho muchas de las
drogas existentes, como anestésicos locales, sedantes, drogas antidiabéticas e
incluso terapias antivirales, ejercen sus efectos interactuando con canales
iónicos. (Ashcroft, 2006; DeCoursey y col., 1985).
En linfocitos T de humano, células que no son eléctricamente excitables,
existen diferentes tipos de canales iónicos, estudios electrofisiológicos en estas
células del sistema inmunológico (Gardner P, 1990; Teisseyre, 2001), han
sugerido que los canales iónicos juegan un papel importante en la respuesta
inmune, quizá por el inicio de una cascada bioquímica de eventos
enzimáticamente controlados. Algunas de las funciones inmunológicas en las
que se encuentran involucrados los canales iónicos son: fagocitosis y activación
de macrófagos y citotoxicidad de linfocitos T y células NK.
Los linfocitos T han sido blanco de numerosos estudios
+
iónicos debido a que tanto canales de K como canales de Ca
de canales
+2
han sido
caracterizados en linfocitos T y relacionados con su función celular (McCann y
col., 1990) por ejemplo los canales de potasio dependientes de voltaje tienen un
El canal Kv1.3 ha sido claramente
papel importante en su activación.
42
demostrado que tienen un papel importante en la proliferación y regulación del
volumen celular (Szabo y col., 2004; Teisseyre A. 2001).
En la siguiente tabla se muestran canales iónicos que han sido
caracterizados en linfocitos T
Tabla 4 Canales iónicos caracterizados en linfocitos T
Nombre
Kv1.3
Expresión
Función
Referencia
Células T de ratón, rata y
Proliferación celular,
Pardo, 2004;
Humano.
Regulación del
Aiyar y cols., 1994;
Celulas T (Jurkat)
potencial de membrana
Beeton y cols, 2001;
Mitocondria de linfocito T
en reposo
Lewis 1995; Cahalan
1991; Gutman, 2005
Deutch y col., 1993
IKCa1
Células T (Jurkat)
En el aumento de la
Beeton y cols, 2001;
Células T de Humano
regulación
Ghanshani y cols,
transcripcional durante
2000; Kerschbaum y
la mitogenesis,
cols, 1997
principal regulador de
señales de calcio en la
activación de linfocitos.
KATP
Mitocondria de linfocito T
Vincula el estado
Dhalem y cols, 2004
energético de la célula
con el potencial de
membrana.
CRAC
Cl-
Células T de humano
Sostenimiento del
Panyi y cols, 2004;
Células T (Jurkat)
influjo de calcio para la
Lewis y Cahalan,
Timocitos de rata
activación de linfocitos
1995; Ross, 1995;
T
Feske y cols, 2005
Células T T (Jurkat).
Regulación del
Lewis y cols, 1993;
Timocitos de rata
volumen celular
Lepple- Wienhues,
1998
43
5.1 Canales de potasio
Como se menciona anteriormente, se ha encontrado evidencia de que los
canales de K+ juegan un papel relevante en el control del proceso de
proliferación celular. En general, la inhibición de la función de estos canales da
como resultado un decremento en la proliferación; esto se ha visto en modelos
donde la proliferación es una respuesta fisiológica (como en el caso de los
linfocitos) y en donde hay manifestación de una condición patológica (como en
células cancerosas) (Cahalan y cols, 1991), en el año de 1996 fue publicada
una lista de líneas celulares donde bloqueadores no específicos del canal de K+
como la 4-aminopiridina (4-AP) (Choquet y Korn, 1992), quinidina, y
tetraetilamonio (TEA) tienen efectos antiproliferativos en linfocitos, células de
Schwan, melanoma, cáncer de mama, neuroblastoma y cáncer pulmonar entre
otros (Pardo, 2004).
Por otro lado, cambios en el potencial de membrana y en el volumen
celular son necesarios para la progresión del ciclo celular (Fig. 11) y ambos
requieren la acción de los canales de K+. Si los canales particulares
involucrados en ambos procesos no fueran los mismos, seria concebible que
algunas drogas interfirieran con la proliferación mediante la regulación del
volumen y algunas otras con la interferencia en cambios del potencial de
membrana. (Pardo, 2004).
44
Figura. 11 Relación hipotética entre canales de K+ y proliferación celular.
Señales mitogénicas alcanzan a las señales supramoleculares que transfieren la señal
al canal de K+ tanto porque el canal es una parte física del complejo o indirectamente
por segundos mensajeros. La naturaleza exacta de la activación del canal dependerá
particularmente de ser activados y resultará de la combinación de los efectos entre el
potencial de membrana y los cambios en la regulación del volumen (Pardo, 2004).
5.1.1 Canal Kv1.3
Los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) son aquellos que
controlan el flujo de iones potasio a través de la membrana, y su mecanismo de
acción se basa en la sensibilidad a la diferencia de potencial a ambos lados de
ésta y juegan un papel importante en la activación de linfocitos T.
Pocos tipos de canales de K+ han sido identificados para una correlación
con la proliferación celular, los casos mas estudiados corresponden al canal
Kv1.3 (KCNA3) (Robbins et al., 2005) y el IKCa1 (KCa3.1. KCNN4), los cuales
gobiernan la respuesta mitogénica en linfocitos ( Aiyar y cols, 1994; Beeton col.,
2001).
45
xComo ya se había mencionado los canales Kv1.3 y los canales IKCa1
fueron el primer caso donde hubo un claro ligamiento entre los canales de K+ y
mitogenesis. El canal Kv1.3 es un típico canal 6TM1P (seis segmentos
transmembrana y un asa entre el quinto y el sexto segmento transmembrana). El
canal se aber durante una despolarización aproximada de -40mV, si esta
despolarización es mantenida, el canal se inactiva con una constante de tiempo
de 100-200 msec.
El canal Kv1.3 fue clonado por primera vez en cerebro de rata, donde se
le llamó RCK3, Kv3 o RGK5. Posteriormente se clonó en cerebro de ratón y se
le llamó MK3. Por otro lado este canal también fue clonado en linfocitos T de
ratón, rata y por primera vez en humano al cual se le llamó HGK5 y HLK3. Todos
estos clones codifican para el mismo canal de potasio que, con la nomenclatura
estandarizada, pasó a llamarse Kv1.3. La distribución mayoritaria de esta
proteína es en sistema inmunitario, donde se expresa en linfocitos T, linfocitos B
y microglía (Cahalan et al., 2001), y en sistema nervioso con una localización
restringida al hipocampo, córteza piriforme y el bulbo olfatorio. También se ha
encontrado éste canal en la membrana interna de mitocondria de linfocitos T
(Jurkat) con propiedades que son idénticas a las que presenta éste canal en la
membrana de esta misma línea celular (Rourke., 2007). En linfocitos T se sabe
que el canal Kv1.3 expresa las subunidades auxiliares Kvγ1.1 y Kvγ2.1 las cuales
incrementan su expresión cuando los linfocitos son estimulados con la citosina
proliferativa IL2.
Existen péptidos bloqueadores de Kv1.3 como la margatoxina (MgTX)
(Kerschbaum y col., 1997) y la caribdotoxina (ChTx) que resultan en una
despolarización en las células T. (Koo y col., 1997). Existe evidencia de que la
Genisteina
puede afectar la actividad de este canal, recordando que la
Genisteina es un isoflavonoide abundante en algunos vegetales y conocida
como un importante inhibidor específico de la proteína tirosina cinasa (PTK), ha
sido reportada como un agente natural anticáncer, inhibe la proliferación celular
46
y promueve la apoptosis en cáncer de colon en células HT-29; así los canales de
potasio pueden ser considerados un blanco importante en el tratamiento del
cáncer (Teisseyre y Michalak, 2005).
5.1.2 Canales de potasio activados por Ca+2
Los canales de potasio activados por calcio no son tan numerosos como
los canales de potasio dependientes de voltaje y han sido clasificados en tres
diferentes familias en base a la conductancia del canal. Son usualmente
nombrados de alta- (big, BK), intermedia- (IK) (11-35 pS) y pequeña (SK) (2-8
pS) conductancia En linfocitos T están presentes el canal de pequeña
conductancia y el de conductancia intermedia. Farmacológicamente los canales
SK e IK han sido estudiados extensamente, la actividad de ambos puede ser
incrementado
por
1-etil-2-benzimidazolinona
(1-EBIO)
a
concentraciones
milimolares.
La estructura de los canales SKCa es muy similar a la de los (Kv) : seis
dominios transmembrana (1-6) y una región P, con terminación N y C
intracelular, además poseen un dominio C-terminal llamado “de union a
calmodulina” (CaMBD), el cual permite al canal interactuar con la calmodulina y
ser regulada por Ca2+. Estos canales presentan una condctancia de 2-8pS, se
encuentran escasamente en linfocitos B, no se encuentran en celulas T de
humano pero son abundantes en celulas Jurkat, este canal es bloqueado por
TEA y apamina. Tanto el canal SkCa como el IKCa son activados por una
concentración de calcio intracelular de 200-400nM
A pesar que el canal IKCa1 no es un canal de K+ dependiente de voltaje,
su rol fisiológico en la proliferación de linfocitos es conceptualmente muy difícil
separarlo del canal Kv1.3, en muchas ocasiones se refieren a ellos en conjunto
(Pardo, 2004). El canal Kv1.3 es abierto en respuesta a una despolarización de
la membrana y mantienen el potencial de reposo, mientras que el canal IKCa1
47
es abierto en respuesta a un incremento de Ca2+ citosólico e hiperpolariza el
potencial de membrana (Aiyar y cols, 1994; Beeton y cols, 2001) por lo que se le
considera un canal dependiente de calcio y parece estar constitutivamente
asociado a calmodulina (aún en la ausencia de Ca2+), y unido a calcio para esta
asociación, la calmodulina induce un cambio conformacional en el canal que
abre las vías de permeación. (Panyi y col., 2004; Ghanshani y col., 2000).
Se ha demostrado que la actividad de los canales de K+ se requiere para
la migración, adhesión, y regulación de volumen en linfocitos T pero el proceso
mejor estudiado donde se requieren éstos canales de K+ es en la activación de
estos linfocitos (Beeton y col., 2001; Pardo, 2004).
El fenómeno de la activación fisiológicamente relevante, lo podemos
observar en el proceso de inmunotolerancia a la placenta donde la progesterona
inhibe a los canales Kv1.3 y al IKCa1 dañando la activación de los linfocitos T y
mientras los niveles de ésta hormona sean altos (en la placenta) y manteniendo
la activación normal de estos canales en el resto del organismo de la madre.
De forma similar, la modulación del canal Kv1.3 por hipoxia podría ser la razón
de los efectos inmunosupresivos del bajo Po2 (Robbins y col., 2005; Pardo,
2004).
Bloqueadores selectivos de Kv1.3, pero no de IKCa1, suprimen la
estimulación por mitógenos, producción de citosinas y la proliferación de células
T en humanos (in vitro), y una respuesta hipersensitiva retardada (in vivo), un
selectivo bloqueo del canal IKCa1 suprime
la producción de citosinas y la
mitogénesis de células pre-activadas. (Beeton, 2001).
Es importante mencionar que al hablar de mitógenos nos referimos a
sustancias que estimulan a los linfocitos y a la síntesis de DNA, transformación
blástica y ploriferación. Contrario a la estimulación inmune, los mitógenos
activan de forma policlonal. Hay mitógenos específicos de linfocitos T como
48
concanavalina A y fitohemaglutinina (PHA) (Ghanshani y col., 2000) y otros de
linfocitos B como LPS.
Una particular aplicación terapéutica de estos canales sería en
enfermedades autoinmunitarias, más específicamente en la esclerosis múltiple
(MS) (Beeton et al., 2001) ya que en esta patología se ha mostrado que la
activación de linfocitos conservan un fenotipo “preactivado” (alto Kv1.3, bajo
IKCa1) (Pardo, 2004).
5.1.3 Canales de potasio sensibles a ATP (KATP)
Los canales de K+ sensibles a ATP (KATP), son una familia de
rectificadores entrantes débiles de K+ que se pueden encontrar en diferentes
tipos celulares. Los canales KATP en células pancreáticas β, como otro tipo de
canales
KATP descritos en neuronas (Birgit y Jochen., 2001), músculos liso,
cardiaco y esquelético, (Dahlem y cols., 2004; Quayle y cols., 1997)
y en
mitocondria de linfocitos T de humano (Szewczyk y col., 2006) son inhibidos por
ATP intracelular (Aguilar-Bryan and Bryan, 1999; Ashcroft., 2005).
Los canales KATP son muy importantes en el acoplamiento del
metabolismo energético celular con la excitabilidad de la membrana de
diferentes tipos celulares, y quizás han sido los canales K+ más extensamente
explorados en términos de su potencial terapéutico (Noma, 1983; Misler y col.,
1986). La actividad de estos canales se reduce por el ATP intracelular y se
incrementa por MgADP.
5.1.3.1 Estructura de los canales KATP
Los canales KATP son estructuras de estequiometria octamerica (SURx/
KIR6.y)4 (Fig. 12) compuestos por cuatro subunidades Kir6.1 (Kir6.1 o Kir6.2)
(Loussouarn y cols, 2000) que forma el poro y cuatro subunidades reguladoras,
49
el receptor a sulfonilureas (SUR1 o SUR2) (Inagaki y col., 1997; Aguilar-Bryan
and Bryan, 1999; Koster y col., 2005; Matsuo y col., 2005). En células-β y
neuronas encontramos canales KATP conformados por SUR1/Kir6.2, en músculo
cardiaco SUR2A/Kir6.2 y SUR2B/Kir6.1 (o Kir6.2) en músculo liso vascular (Isomoto y
cols, 1996; Inagaki y col., 1997; Okuyama y col., 1998; Schwanstecher y cols,
1998; Koster y col., 2005; Song y Ascroft., 2001). La sola expresión de Kir6.1 o
Kir6.2 no forma canales funcionales. (Gribble y col., 1997). Puesto que
mutaciones en Kir6.2 modulan la conductancia de los canales SUR1/ Kir6.2 de
manera característica (Shyng y col., 1997), se concluyó que Kir6.1 o Kir6.2,
respectivamente, representa a la subunidad formadora del poro. Se han usado
dos criterios farmacológicos para definir y clasificar los canales KATP,
generalmente es posible distinguir dos tipos de canales de KATP basados en su
sensibilidad a las sulfonilureas (SUR1 100-1000 veces mas sensibles que SUR2).
De la misma forma, hay diferencias en la respuesta a los KCOs (abridores de
canales de potasio), como por ejemplo, los canales con SUR1 y SUR2B
responden mejor al diazoxido que el SUR2A de los canales cardiacos. Se cree
que los sitios de unión tanto para las sulfonilureas como para los KCOs residen
en el receptor SUR (Aguilar-Bryan y Bryan, 1999; Tucker y col., 1998).
Figura 12. Estructura octamerica del canal de
potasio sensible a ATP. El canal consiste de cuatro
subunidades SURx y cuatro Kir6.y
50
5.1.3.2 Receptores sulfonilurea
Los receptores sulfonilureas (SURs) son sensores intracelulares de
ATP/ADP, regulando así la actividad de los canales Kir6.y, además, pertenecen
a la familia de proteínas ABC (Fig. 13) (Tusnády y col., 1997; Aguilar-Bryan y
Bryan, 1999; Matsuo y col., 2005), mas específicamente de la subfamilia ABCC
(ABC8 para SUR1 y ABC9 para SUR2), que se identifican como transportadores
activos de membrana de varios aniones orgánicos y drogas hidrofóbicas
(Tusnády y col., 2006). Esta familia es probablemente el grupo más grande de
proteínas
transportadoras
selectivas
de
sustancias
a
través
de
las
biomembranas (Higgins, 1995). Un requerimiento estructural mínimo para un
transportador ABC funcional es la presencia de dos dominios transmembranales
TMD1-2 y dos dominios de unión a nucleótidos como el ATP, NBD1-2. En los
seres humanos éstos pueden estar presentes dentro de una cadena
polipéptidica (transportadores completos), o en membrana formando homo o
heterodimeros (transportadores incompletos), con arreglos variables, los cuales
serán definidos por la topología de la membrana (Tusnády y col., 2006). Algunas
proteínas como las MRP1-3, MRP6-7 y SURs, tienen un TMD0 que se conecta
con TMD1 por una asa citoplasmática conocido como L0 (Chan y col., 2003:
Campbell y col., 2003; Babenko y Bryan., 2002). Babenko y Bryan (2003)
demostraron que el dominio L0 de SUR1 (junto con TMD0) modula la compuerta
del canal de K+. Además, Chan y col., (2003) demostraron que la región TMD0
de SUR1, es esencial tanto para el ensamblaje del complejo SUR1/Kir6.2 como
para la modulación de la compuerta y el trafico del canal KATP. Se ha demostrado
que solo los TMDs y no los NBDs son necesarios para la interacción con Kir6.2.
Tusnády y cols, (1997) sugiere que SUR1 esta formada por once segmentos
transmembana antes de NBD1 y seis entre NBD2 y el carboxilo terminal.
51
Figura 13. Estructura del canal KATP. En A se aprecia la subunidad SUR 2 A
con el Kir6.2 presentes en tejido cardiaco y músculo esquelético así como los sitios de
unión a nucleótidos
y sus dominios transmembranales TMD. En B se aprecia la
subunidad SUR1 con el Kir6.2 presente en células β pancreáticas y tejido neuronal se
aprecian también los sitios de unión a nucleótidos y sus dominios transmembranales,
se observa la unión de la glibeclamida, compuesto bloqueador de los canales KATP por
lo que el canal esta cerrado (Modificado de Babenko y col., 1999).
Las NBDs catalizan la hidrólisis del ATP, y la energía libre resultante es
utilizada para conducir el substrato a través de un camino específico formado
por TMD1 y TMD2 (Locher y col., 2002; Chan y col., 2003; Matsuo y col., 2005).
La secuencia y estructura de ambos NBD está altamente conservada a través de
todas las proteínas ABC en células eucariontes y procariontes. Cada una
contiene accesorios Walker A y Walker B (WA y WB) altamente conservados y
una unión accesoria intermedia (Aguilar-Bryan y Bryan, 1999; Campbell y col.,
2003). Estudios funcionales en proteínas ABC de eucariontes y bacterias han
proveído
evidencia de que ambas NBD de la proteína ABC interactúan
operando como una unidad funcional. Estos estudios soportan un modelo en el
52
cual las NBDs se dimerizan en una conformación ‘nucleotide-sandwich’, esto
porque WA y WB de NBD1 se asocian con la secuencia de union de NBD2 y
viceversa (Locher y col., 2002; Smith y col., 2002; Campbell y col., 2003).
La Tabla 5. Muestra las subunidades conocidas del canal por el tipo de
tejido. Esta clasificación esta basada en un criterio farmacológico .
Receptor Sulfonilurea
Rectificador entrante
Tejido /subtipo de canal
SUR1
Kir6.1
Kir6.2
??
Células β
pancreáticas/neuronal
SUR2A
Kir6.1
Kir6.2
SUR2B
Kir6.1
Kir6.2
??
Músculo/cardiaco y
esquelético
Músculo liso vascular
Músculo liso vascular
Tabla 5. Isoformas del canal KATP (modificado de Matsuo et al., 2005)
5.1.4 Canales mitocondriales de K+ sensibles a ATP
Una variedad de vías de transporte de iones en mitocondria han sido
identificados a través de mediciones de fluorescencia en mitocondrias aisladas y
por patch-clamp en mitocondrias aisladas y mitoblastos (Rourke 2007).
Años atrás se realizaron mediciones de corriente del canal KATP en el
interior
de
la
membrana
mitocondrial
(mitoKATP)
en
hígado
de
rata
complementando los canales KATP de membrana plasmática. El canal mtKATP
permite
el transporte de potasio dentro de la matriz mitocondrial bajo
condiciones control de ATP intracelular. Estos canales vinculan el estado
energético de la célula con el potencial de membrana. (Dahlem y cols, 2004;
53
Jiang y cols, 2005). Se han encontrado canales mitoKATP en el interior de la
membrana mitocondrial de corazón, cerebro y linfocitos T (Bajgar y cols, 2001).
Los canales mitoKATP son bloqueados por ATP (~10-100µM), ADP, 5hidroxidecanoato (5-HD), palmitoil y glibenclamida (Sanguinetti y Salata 1996).
La activación puede
llevarse acabo por aplicación de GTP o GDP,
además agentes sintéticos como el diazoxido y la cromakalim fueron
identificados como activadores, donde los canales mitoKATP son 2000 veces
más sensibles al diazoxido que los canales KATP de la membrana plasmática.
(Dhalem y col., 2004, Quast, 1996).
El canal mitoKATP ha sido caracterizado en mitoplastos obtenidos de
cultivos de linfocitos T de humano y se ha demostrado que bajo condiciones
control este canal se encuentra permanentemente abierto con cierres cortos
regulares a frecuencias de 17.7 Hz. La cinética es similar a la del canal mitoKATP
encontrado en hígado de rata y en miocardio bovino y de acuerdo a estos
mismos experimentos realizados por Dahlem y cols, 2004. El ATP no solo
reduce la actividad Po (probabilidad de apertura) de los canales sino que también
modula la frecuencia de ráfagas del canal (Dahlem y col., 2004).
La actividad del canal (mitoKATP) es modulada por varios nucleotidos (Fig. 14).
Recientemente se ha mostrado que los efectos del ATP en el canal KATP puede
ser modulada por Ca+2. (Szewczyk y col., 2006).
54
Figura 14. Reguladores fisiológicos de canales de potasio mitocondriales.
Regulados por ATP (mitoKATP), Canal de calcio de larga conductancia (mitoBKCa) Canal
de potasio voltaje dependiente (mitoKv1.3), especies oxigeno reactivas (ROS), oxido
nítrico (NO). Tomado de Szewczyk y col., 2006; Samavati y col, 2002.
De acuerdo con Szewczyk y cols ( 2006), se tendrá un canal mitoKATP si
las siguientes propiedades farmacológicas están presentes en el registro del
canal de potasio:
(1) El canal tiene que ser bloqueado por ATP/Mg,
(2) La inhibición del canal por ATP/Mg puede ser activado por diazoxido,
(3) El canal puede ser bloqueado por acido 5-hidroxidecanoico (5-HD), como
se menciona anteriormente, una sustancia conocida como bloqueador del
canal mitocondrial,
(4) El canal puede ser bloqueado por glibenclamida,
(5) El bloqueo del canal KATP de la membrana plasmática del tejido cardiaco
por HMR1098 no tendra efecto en la actividad del canal.
55
Dahalem y col. (2004), propusieron un mecanismo hipotético de la
modulación del canal mitoKATP por Ca2+. Este modelo esta basado en las
siguientes afirmaciones (1) el canal mtKATP tiene dos sitios donde Ca2+ y ATP se
unen irreversiblemente, (2) Incremento de la frecuencia de rafagas y la siguiente
reducción de Po es debida a la formación del complejo Cax y ATPy.Ca (x, y
numero de iones unidos, x,y ≥2).
Una vez que la concentración se incrementa sobre un valor umbral, el
2+
Ca
puede ser irreversiblemente único al canal mitoKATP. En soluciones que
contienen ATP esto provoca un sitio viable para la formación del complejo ATPCax y causar el bloqueo del canal mitoKATP. Entonces si el canal es expuesto a
ATP y alto Ca+2
(>100µM), existen dos sitios en donde
puede ocurrir un
bloqueo.
Sin embargo no se puede excluir la posibilidad de que el ATP-Cax/ATPyCa se una a otros sitios alostéricos del canal mitoKATP y causar cambios
conformacionales e inhibir la actividad del canal (Dahlem y cols, 2004).
En la figura 14 se muestran evidencias experimentales del registro de
este tipo de canales en membrana interna de mitocondria de linfocito.
56
Figura 15. En A Corrientes representativas del canal mitoKATP en linfocitos T
humanos, a varios potenciales de membrana, obtenidas en condiciones simétricas de
K+ (150mM). En B se muestra la curva I/V de un canal rectificador saliente con una
conductancia de 15 y 82 pS a potenciales negativos y positivos respectivamente.
Tomado de Dahlem y col., 2004
57
5.2 Canales CRAC.
El Ca+2 tiene un papel esencial durante el desarrollo y maduración de
linfocitos. En linfocitos T maduros la presentación del antígeno provoca una serie
coordinada de eventos los cuales culminan en la activación y proliferación
celular.
Las etapas tempranas de la activación de los linfocitos T pueden ser
separados en dos eventos: (1) el evento pre- Ca+2 y post- Ca+2. La presentación
del antígeno al receptor se da de 1-100 segundos, en donde ocurrirán
eventos pre- Ca
+2
los
que incluyen la activación de tirosina cinasa y la generación
de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) (Cahalan y Chandy., 1997; Verheugen , 1998)
provocando, como se menciona anteriormente, la liberación de Ca+2
e
incrementando la concentración intracelular de Ca+2 (Lewis y Cahalan, 1990),
después se necesitaran de minutos a horas para que ocurran los eventos postCa+2 que involucran cambos en la serina/treonina cinasa y actividades fosfatasa,
alteración en el citoesqueleto y actividad de canales iónicos y transcripción de
genes. El incremento de Ca+2 intracelular activa a la fosfatasa calcineurina la
cual desfosforila los factores de transcripción localizados en el citoplasma,
permitiendo que se acumulen en el núcleo uniéndose a elementos promotores
del gen de interleucina 2 (IL2) (Fig. 15). Además de otros eventos paralelos
como la activación de la proteína cinasa C (PKC) y Ras, la transcripción de
genes provoca la proliferación celular (Fig. 7) (Cahalan y Chandy., 1997).
58
Figura 15. Eventos de calcio en linfocitos T. Existe una cascada de
señalización desde el receptor TCR hasta la secreción de IL-2. DAG, diacilglicerol; Em
potencial de membrana plasmática; IP3R receptor a inositol 1,4,5-trifosfato; NF-AT,
factor nuclear de activación de células T; TG, tapsigargina; TK, tirosina cinasa.
En la figura anterior, uno de los eventos post- Ca+2 la calcineurina, es
blanco y el sitio de acción para la inmunosupresión. Desafortunadamente
inhibidores de la calcineurina como la ciclosporina A y FK506 son tóxicos, en
enfermedades renales o del hígado, su uso se ve limitado (Chalan y Chandy,
1997).
Uno de los pasos bioquímicos tempranos en este proceso es la
activación de la fosfolipasa C (PLC)γ generando IP3 el cual como se ilustra en la
figura 7 y 15 , mediante la continua activación del IP3R depleta las cisternas
internas de Ca+2. El resultado de un decremento de Ca+2 en el ER provoca un
59
flujo de Ca+2 por la apertura de una clase de canal de Ca+2 en la membrana
plasmática conocido como canal de liberación de calcio activado por calcio
(CRAC) (Panyi y cols, 2004; Lewis y Cahalan, 1995; Ross, 1995). Sólo la
apertura del canal CRAC en la membrana plasmática permite la entrada de Ca+2
para mantener los niveles altos requeridos en el interior de la célula. Debido a
esta entrada de Ca+2 existe una despolarización de la célula lo cual reduce la
fuerza para entradas futuras de Ca+2, una sostenida entrada de Ca+2 solo puede
lograrse por la participación de canales Kv. En el caso de los linfocitos T es el
canal Kv1.3 localizado en la membrana y el cual se abre en respuesta a la
despolarización de la membrana causada por la entrada de Ca+2. Otro canal
involucrado en la regulación de la entrada de Ca+2 es el IKCa1 pero este canal al
contrario que el Kv 1.3 responderá a un incremento intracelular de Ca+2 y no por
la despolarización de la membrana (Fig. 7 y 15) (Bronstein-Sitton, 2006). La
función de los dos canales de K+ estabiliza el potencial de membrana a un valor
suficientemente negativo adecuando las fuerzas de manejo y manteniendo el
flujo de Ca+2 a través de los canales CRAC. El resultante mantenimiento de
[Ca+2]i elevado, activa vías de transcripción requeridas para la proliferación y
función
efectora inmune. El Ca+2 también tiene un papel esencial en el
desarrollo de linfocitos T por la influencia de motilidad y selección positiva de
timocitos
(Ross,
1995).
Evidencias
farmacológicas,
electrofisiológicas
y
genéticas soportan la noción de que los canales CRAC son la principal vía del
flujo de Ca+2 en el desarrollo y maduración de linfocitos T, y de esta manera,
están relacionados con muchos aspectos del desarrollo y función de los
linfocitos. La importancia de la entrada de Ca+2 para las defensas inmunológicas
del huésped es principal para ayudar a las deficiencias en la activación de
linfocitos T y expresión de genes en pacientes que carecen de esta entrada de
Ca+2. De esta manera se sabe que las propiedades funcionales y moleculares
de los canales CRAC es central para una completa comprensión de la activación
de linfocitos T (Feske y col., 2005).
60
Para finalizar la señal de Ca2+, este ha de volver a sus niveles basales
que son muy bajos en el citosol gracias a la actividad de diversas enzimas
transportadoras de iones. Las ATPasas de Ca2+, presentes en la membrana del
ER (SERCAs del ingles Sarco Endoplasmic Reticylum Calcium ATPase),
bombean Ca2+, hacia el interior de los reservorios, mientras que la ATPasas de
la membrana plasmática (PMCAs del ingles Plasma Membrana calcium ATPase)
y el intercambiador Na+/ Ca2+ llevan el Ca2+ hacia el exterior celular. La TG es
un inhibidor de SERCAs el cual produce vaciamiento de reservorios del ER por
salida pasiva de Ca2+ a favor de gradiente y es potente porque actúa
directamente sobre los mecanismos de regulación de la concentración
intracelular de Ca2+ sin involucrar ningún otro sistema de transducción de señal.
Panyi y col., (2004) muestran evidencia de la relación del canal Kv1.3 y
el canal IKCa1 después de la activación del canal CRAC y la función de estos
canales en la regulación del potencial de membrana (Kv1.3 e IKCA1) y la
señalización de calcio (CRAC) (Fig. 17).
61
Figura 17. Canales iónicos en linfocitos T. En A se muestra la estimulación
del antígeno a través del TCR/CD3 provocando una liberación de Ca2+ del ER vía
PLC/IP3, la depleción de Ca2+ resulta en una despolarización de la membrana. Los
canales Kv1.3 son abiertos por la despolarización y el sobrevenir del flujo de K+
hiperpolariza la membrana. El incremento de concentraciones internas de Ca+2 activa el
canal de K+ activado por calcio de conductancia intermedia (IKCa1). La función de los
dos canales de K+ estabiliza el potencial de membrana a un valor suficientemente
negativo adecuando las fuerzas de manejo y manteniendo el flujo de Ca+2 a través de
los canales CRAC. La señal de Ca+2 es requerida para activar factores nucleares y
estimular la producción d IL-2. En B se muestran corrientes de K+ en una célula T en
reposo. Las corrientes fueron obtenidas por pulsos de prueba de
1s de duración
incrementando el potencial de mantenimiento de -80 mV a +30 mV como se indica en
la figura. Bajo estas condiciones exclusivamente los canales Kv1.3 contribuyen a la
corriente. En C corrientes de K+
en una célula T estimulada por mitógenos. Las
corrientes fueron observadas por rampas de voltaje de 200 ms de -120 a +25mV. La
parte lineal del trazo a voltajes negativos representa corriente voltaje-independiente a
través de canales IKCa1 (la corriente es directamente proporcional al voltaje). La parte
en la que se observa un incremento de corriente en el trazo indica activación de canales
Kv1.3 a voltajes más positivos que -40mV. La pequeña corriente fue registrada en
62
presencia de 10 nM de caribdotoxina, la cual bloquea ambos canales y reduce ambos
componentes de la corriente. Tomado de Panyi 2004.
5.3 Canales de cloro (Cl-)
La regulación del volumen es un extenso proceso que permite a las
células mantener su volumen en cambios de osmolaridad extracelular. Se han
investigado dos mecanismos de regulación de volumen en linfocitos expuestos a
soluciones hiperosmóticas o hipoosmóticas. Soluciones hiperosmóticas inducen
el eflujo de agua, contracción celular, fosforilación de una variedad de sustratos
celulares y activación de un mecanismo de intercambio de sodio-hidrogeno el
cual resulta en una subsecuente regulación del incremento del volumen (RVI).
Cuando los linfocitos son expuestos a soluciones hipoosmóticas, inicialmente se
edematizan por el agua entrante, pero en un periodo de minutos se contraen de
manera que igualan su volumen normal. Basado en mediciones de volumen
celular, potencial de membrana, y flujo de iones, han mostrado que una
regulación del decremento de volumen (RVD) involucra vías conductivas
separadas para iones de Cl- y K+. La conductancia de la membrana para los
dos iones Cl- y K+ se ve incrementada por la edematización resultando en un
eflujo de ambos iones y un eflujo osmoticamente obligado de agua. (Lewis y col.,
1993 ;Ross y col., 1993).
El eflujo de Cl-
y el RVD son bloqueados por algunas drogas que
bloquean canales de Cl-
en otros tejidos, incluidos el
ácido stilbene 4-
actemido-4´isotiociano-2,2´ disulfonico (SITS) y el ácido stilbene 4,4´-diisotociano-2,2´-disulfonico (DIDS).
Una función del Cl- en la proliferación de linfocitos se propuso desde que
DIDS o
la remoción del Cl-
externo inhibe el flujo de Ca+2 estimulado por
63
anticuerpos que es necesario para la activación del linfocito (Pahapill y Sclichter,
1992; Lewis y col., 1993).
Se ha demostrado que elementos del citoesqueleto participan en la activación de
estos canales. Estudios realizados por Lepple-Winhues (1998), demuestran que
la fosforilación de la tirosina cinasa p56lck activa la corriente de cloro que
dematiza a la célula (ICl-swell) mediando el RVD y que en células deficientes de
p56lck presentaban un defecto en RVD en la activación de la corriente ICl-swell.
Además la retransfección de esta cinasa resulta en una restauración osmótica
de la corriente de activación por lo que se concluyó que el edema osmotico
activa la corriente ICl-swell en linfocitos vía tirosina cinasa p56lck.
64
Conclusiones
- La expresión de canales iónicos en linfocitos T juega un papel muy
importante en el control del potencial de membrana y señalización de calcio,
afectando vías de transducción de señales para la activación de estas células
después de la estimulación antigénica.
- El canal de potasio Kv1.3 tienen un papel importante en la proliferación y
regulación del volumen celular.
- El canal ICa1 se requiere para la migración, adhesión, y regulación de
volumen en linfocitos T. El proceso mejor estudiado donde se requieren éstos
canales de K+ es en la activación de los linfocitos.
- Los canales CRAC son la principal vía del flujo de Ca+2 en el desarrollo
y maduración de linfocitos T, y de esta manera, están relacionados con muchos
aspectos del desarrollo y función de los linfocitos.
- Los canales mitoKATP vinculan el estado energético de la célula con el
potencial de membrana.
- Los canales iónicos involucrados en la activación de linfocitos T son
blancos para la producción de drogas inmunomoduladoras.
65
Perspectivas
De acuerdo a las funciones de los canales de KATP en diferentes
tejidos, y con la evidencia de la presencia de estos canales en la membrana
mitocondrial de los linfocitos T, se podría efectuar estudios para comprobar la
presencia del canal KATP en la membrana plasmática y las propiedades
biofísicas de este canal, así como su papel fisiológico en la respuesta inmune
y las probables alteraciones originadas por patologías metabólicas, por
ejemplo, la Diabetes Mellitus.
66
Referencias
Abbas A. K., Lichtman A. H., Pober J.S. (1997) Celular and Molecular
Immunology. 3ra. Edición. Edit Saunders pp 4,100.
Aguado E., Martinez-Florensa M., Aparicio Pedro. (2006). Activation of T
lymphocytes and the role of adapter LAT. Transplant Immunology.17:23-26
Aguilar-Bryan L. and Bryan J. (1999). Molecular Biology of Adenosine
Triphosphate-sensitive
Potassium
Channels.
The
endocrine
Society.
20(2):101-135.
Aiyar J. Nguyen A. N., Chabdy K. G., Grissmer S. (1994). The P-Region and
S6 of
Kv3.1 Contribute ti the Formation of the Ion Conduction Pathway.
Biophysical Journal. 67:2261-2264.
Ashcroft F.M.(2006). From molecule to malady. Nature.440:447
Ashcroft F.M. (2005). ATP-Sensitive potassium channelopathies: focus on
insulin secretion. Journal of Clinical Investigation. 115:2047-2059
Ashcroft F. M. and Grible Fiona (1998) Correlating structure and function in
ATP-sensitive K+ channels. Trends Neuroscience 21:288-294.
Armstrong, C.M. y Hille, B. (1998) Voltagegated ion channels and electrical
excitability. Neuron. 20: 371-380.
Armstrong T.D. C., Clements V.J., Martin B. K., Ting J. P., OstrandRosenberg S. (1997) Major histocompatibility complex class II.transfected
67
tumor cells present endogenous antigen and are potent inducers of tumorspecific immunity. Immunology. 94: 6886-6891.
Babenko A. P. Gonzalez G., Bryan J. (1999). The tolbutamide site of SUR1
and a mechanism for its functional coipling to KATP channel closure. FEBS
Letters. 459:367-376.
Babenko A. P. and Bryan J. (2002). SUR-dependent Modulation of K
ATP
Channels by an N-terminal KIR6.2 Peptide. Journal of Biological and
Chemestry. 277:43997-44004.
Babenko, A.P. and Bryan, J. (2003) SUR domains that associate with and
gate KATP pores define a novel gatekeeper. Journal of Biological and
Chemestry. 278:41577–41580.
Bajgar R., Seetharaman S., Kowaltowski A. J., Garlid K. D. Paucek P. (2001).
Identification and properties of a Novel Intracellular (mitochondrial) ATPsensitive Channel in Brain. Journal of Biological and Chemestry. 276:3336933374.
Beeton C., Wulff H., Barbaria J., Clot-Faybesse O., Pennington M., Bernard
D., Cahalan M. D., Chandy K. G., Beraud E. (2001). Selective blockade of T
lymphocyte
K+
channels
ameliorates
experimental
autoimmune
encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. PNAS. 98;139242-13947.
Bergman (2001) Th1 or Th2: How an Appropriate T Helper Response can be
Made. Bulletin of Mathematical Biology 63: 405-430.
Birgit J. and Roeper J. (2001). A role for neuronal KATP channels in metabolic
control of seizure gate. Trends in Pharmacological Sciences. 22:599-601.
68
Bier O. G., Dias da Silva W., Gotze D., Mota I. (1981). Fundamentals of
Immunology. Edit. Springer-Verlag 130-138, 60-67
Blanchard N., Di Bartolo V., Hivroz C. (2002). In the immune synapse, ZAP70 controls T-cell polarization and recruitment of signaling proteins but not
formation of the synaptic pattern. Immunity. 17:389-399.
Bronstein-Sitton, (2006) T Cell Signaling and Activation: No Simple Matter.
Pathways: No. 2.
Cahalan M. D., and Chandy K. G. (1997). Ion channels in the immune system
as target for immunosupression. Pharmaceutical Biotechnology 8:749-756.
Cahalan M. D., Chandy and Grissmer S. (1991) Potassium Channels in
Development Activation and Disease in T lymphocytes J. Clin. Immunol. 39:
357-391.
Cahalan, M.D., Wulff, H. y Chandy, K.G. (2001) Molecular properties and
physiological roles of ion channels in the immune system. J. Clin. Immunol.
21:235- 252.
Campbell JD, Sansom MSP & Ashcroft FM (2003). Potassium channel
regulation: Structural insights into the function of the nucleotide -binding
domains of the human sulphonylurea receptor. EMBO reports Vol. 4:1038–
1042.
Carosi H., Verdaguer C., Solá L., Acosta N., Ambrosoni P., Mazzuchi N.
(1990). Lesion glomerular mínima. Rev. Med. Uruguay. 6:160-168
69
Chan,
K.W.,
Zhang,
H.
and
Logothetis,
D.E.
(2003)
N-terminal
transmembrane domain of the SUR controls trafficking and gating of Kir6
channel subunits. EMBO J. 22:3833–3843.
Cjang H. C., Smolyar A., Spoerl R., Witte T., Yao Y., Goyarts E. C., Natheson
S. G., Reinherz E. L. (1997) topology of T cell receptor-peptide/Class I MHC
Interaction defined by Charge Reversal Complementation and Reversal
Analysis. J. Mol. Biol. 271:278-293
Chandy G, DeCoursey T. E, Chalan M. D., McLaughlin C., Gupta S. (1984).
Voltage-gated Potassium Channels are required for Human T Lymphocyte
Activation. J. Exp. Med 160:369-385.
Chandy G., Wulff H., Beeton C., Pennington M., Gutman G. and Cahalan M.
(2004).
K+
channels
as
targets
for
specific
inmunomodulation.
Pharmacological Sciences. 25:280-289.
Char-Chang S., Coghlan M., Sullivan J., and Gopalakrishnan M. (2000).
Potassium
Channel:
Molecular
defects,
diseases
and
therapeutic
opportunities. Rev Pharmacol 52:557-593.
Choquet D. and Korn H. (1992) Mechanism of 4-Aminopiridine Action on
Voltage.gated Potassium Channels in Lymphocytes. J. Gen. Physiol. 99:217240.
Chung K. F. (2001) Cytokines in chronic obstructive pulmonary disease. ERS
Journal. 18:50-59
70
Czyzyk J. Brogdon J., Badou A., Henegariu O., Preston P., Flavell R.,
Bottomy K.(2000). Activation of CD4 T cells by Raf-independient effecrors of
Ras. PNAS. 100:6003-6008.
Dahlem Y. A.,. Horn T. F. W., Buntinas L., Gonoi T., Wolf G., Siemen D.
(2004). The human mitochondrial KATP channel is modulated by calcium and
nitric oxide: a patch-clamp approach. Biochimica et Biophysica 1656: 46-56
DeCoursey T.E., Chandy K.G., Gupta S. and Cahalan (1985) VoltageDependent Ion Channel in T-Lymphocytes. Journal of Neuroinmunology,
10:71-95.
Dustin M. L. and Chan A. C. (2000) Signaling Takes Shape in the Immune
System. Cell. 103:283-294
Dustin M.L. and Springer T.A. (1991) Role of lymphocyte adhesion receptors
in transient interactions and cell locomotion.Rev. Immunol. 9:27-66.
Faccetti F., Chan J. K., Zhang W., Tironi A., Chilosi M., Parolini S.
Notarangelo L., Samelson L. (1999) Linker for activation of T cells (LAT), a
novel immunohistochemical marker for T cells, NK cells, Mast cells, and
megakaryocytes. American Journal of Pathology 154:1037-1046.
Fanger C., Neben A. and Cahalan M. (2000). Differential Ca2+ Influx, KCa
Channel Activity, and Ca2+ Clearance Distinguish Rh1 and Th2 lymphocytes.
Journal of Immunology 164:1153-1160.
Farrar J. D., Asnalgi H., y Murphy K. M. (2002). T helper subset development:
roles of instruction, selection, and transcription. Journal of Clinical
Investigation.109: 431-435
71
Felzen B., Lavy R., García M., Berke G., Phyllis G., Binah O. (1995).
Interaction of Cytotoxic T Lymphocytes and Guinea pig Ventricular myocytes.
Circulation research 78:253-261.
Feske S., Prakriya M., Rao A., Lewis R. S. (2005). A serve defect in CRAC
Ca+2 channel activation and altered K+ channel gating in T cells from
inmunodeficient patients. JEM. 5:651-662.
Fierro A., Mora J. R. Bono M. R. Morales J., Buckel E., Sauma D.,
Rosemblatt M. (2003) Dendritic cells and the mode of action of
anticalcineurinic drugs: an integrating hypothesis. Nephrol Dial Transplant.
18:467-468
García C. K., Degano M., Pease L. R. , Huang M., Peterson P. A., Teyton L.,
Wilson I. A. (1998). Structural Basis of Plasticity in T Cell receptor
Recognition of a Self peptide- MHC Antigen. Science 279:1166
Garcia R. (2005) El canal de potasio Kv1.3 papel fisiológico y biología del
complejo funcional. Tesis. Departamento de bioquímica y biología molecular
Universidad de Barcelona.
Gardner P. (1990). Patch Clamp studies of lymphocyte Activation. Rev
Immunol. 8:231-252.
Gascoigne N. R., Goodnow C. C., Dudzik K. I., Oi V. T., Davis M. M. (1987)
Secretion of a Chimeric T- cell receptor-immuglobulin protein. Immunology
84:2936-2940.
72
Ghanshani S., Wulff H., Miller M., Rohm H., Neben A., Gutman G., Cahalan
M., Chandy G. (2000). Up-regulation of the IKCa1 Potassium Channel during
T-cell Activation. Journal of Biological Chemestry. 275:37137-37149.
Glimcher L. and Singh H. (1999). Transcription Factors in Lymphocyte
Development T and B cells Get Together. Cell 96:13-23.
Granger J. P., (2004) Inflamatory Cytokines, Vascular Function and
Hypertension. J.Physiol 286:989-990.
Goda S., Quale A. C., Woods M. L., Felthauser A., Shimizu Y. (2004). Control
of TCR-Mediated Activation of β1 Integrins by the ZAP-70 Tyrosine Kinase
Interdomain B Region and the Linker for Activation of T Cells Adapter Protein.
J of Immunology. 172:5379-5387.
Granja C., Lin L., Yunish E., Relas V., Dasgupta J., (1991). PLCγ1, a posible
Mediator of T Cell Receptor Function. J. of Biological Chemestry. 266:1627716280.
Gribble FM, Ashfield R, Ämmälä C, Ashcroft FM (1997): Properties of cloned
ATP-sensitive K+ currents expressed in Xenopus oocytes. J Physioll. 498:8798.
Grissmer D., Zawar C., Neumcke B. (2002) Cell- type specific depression of
neuronal excitability in rat hippocampus by activation of ATP-sensitive
potassium channels. Eur Biophys J. 31: 467-477.
Gros L., Trapp Stefan, Dabrowski M., Ashcroft F., Bataille D. and Blache P.
(2002). Characterization of two novel forms of the rat sulphonylurea receptor
SUR1A2 and SUR1B31. British Journal of Pharmacology 137:98-106.
73
Hernández-Urzúa
M.A.,
Alvarado-Navarro
A.
(2001)
Interleucinas
e
inmunidad innata. Biomed. 12:272-280.
Hernandez-Ruiz J., Becker I. (2006). Linfocitos T citotóxicos CD8+ en la
leishmaniasis cutánea. Salud Publica de Mexico. 48:430-439Higgins CF (1995). The ABC of channel regulation. Cell, Vol. 82:693 - 696.
Hille, B. (2001) Ion channels of excitable cells. 3rd Ed. Sinauer Associates,
Sunderland.
Hubner C. and Jentsch T. (2002). Ion channel diseases. Human Molecular
Genetics. 11:2435-2445.
Inagaki N, Gonoi T and Seino S, (1997). Subunit stoichiometry of the
pancreatic beta-cell ATP-sensitive K1 channel. FEBS Letters, 409:232–236.
Isomoto S, Kondo C, Yamada M, Matsumto S, Higashiguchi O, Horio Y,
Matsuzawa Y, Kurachi Y (1996): A novel sulfonylurea receptor forms with BIR
(Kir6.2) a smooth muscle type ATP-sensitive K+ channel. J Biol Chem. 271:
24321-24324.
Janeway C.A., Travers P.; Walport M. (1999) Inmunobiology: The immune
system in healt and disease. 4ta edición, Edit. Garland 1:9-31
74
Jiang M. T., Ljubkovic M., Nakae Y., Shi Y., Kwok W. M., Stowe D. F. Bonsjak
Z- J. (2005) Characterization of Human Cardiac mitochondrial ATP-sensitive
Potassium Channel and Its regulation by Phorbol ester in vitro. Journal of
physiology. 10:2-34
Jiménez M. and Orías M. (2006) Canales de Potasio, tono vascular e
hipertensión. Boletín del Consejo Argentino. pp. 5-7.
Kerschbaum H., Negulescu P., and Cahalan M. (1997). Ion Channels, Ca2+
Signaling, and reporter Gene Expresion in Antigen-Specific Mouse T Cells.
Journal of Immunology. 159:1628-1638.
Kisielow P., Miazek A. (1995). Positive Selection of T cells: Rescue from
programmed cell death and differentiation require continual engagement of
the T cell receptor. J. Exp. Med. 181:1975-1984.
Koo G., Blake T., Talento A., Nguyen M., Lin S., Sirotina A. (1997). Blockade
of the voltage-Gated Potassium Channel Kv1.3 Inhibits Immune responses in
Vivo. Journal of Immunology. 158:5120-5128.
Koster JC, Permutt MA, and Nichols CG (2005). Diabetes and Insulin
Secretion: The ATP-Sensitive K+ Channel (KATP) Connection. Diabetes, Vol.
54:3065-3072.
Lanzavecchia A., Lezzi G. and Viola A.. (1999) From TCR Engagement to T
Cell Activation: A Kinetic View of T Cell Behavior. Cell 96:1-4.
75
Ledoux J., Werner M.E., Brayden J. E., Nelson M. T., (2006). CalciumActivated Potassium Channels and Regulation of Vascular Tone. Physiology.
21:69-79
Lepple-Wienhues A., Szabo I., Laun T., Kaba N., Gulbins E. (1998). The
tyrosine kinase
p56lck mediates activation of swelling-induced Chloride
channels in lymphocytes. Journal of Cell Biology. 141:281-286
Lewis R. S. and Cahalan M. D. (1990). Ion Channels and Signal Transduction
in Lymphocytes. Physiology. 52:415-430.
Lewis R. S., Ross P., Cahalan M. (1993). Chloride Channels Activated by
Osmotic stress in T lymphocytes. J. Gen. Physiol.101:801-826.
Lewis R. S. and Cahalan M. D. (1995). Potassium and Calcium Channels in
lymphocytes. Immunol. 13:623-653.
Liston A., Hardy K., Pittelkow., Wilson S.R. Makaroff L. E., Fahrer A.M.
Goodnow C.C. (2007) Impairment of organ-specific T cell negative selection
bye diaetes susceptibility genes: genomic analysis by mRNA profiling. Biology
8:R12.
Lloyd S. Gray, James R. Gnarra, John H. Russell and Victor H. Engelhard
(1987). The role of K+ in the regulation of the increase in intracellular Ca2+
mediated by the T Lymphocyte Antigen receptor. Cell 50:119-127.
Locher, K.P., Lee, A.T. & Rees, D.C. (2002). The E. coli BtuCD structure: a
framework for ABC transporter architecture and mechanism. Science,.
296;1091–1098.
76
Loussouarn G., Elena N.M., Rose T., Nichols C. G. (2000) Structure and
Dynmics of the Pore of Inwardly Rectifying KATP Channels. Journal of
Biological and Chemestry 275:1137-1144.
Loussouarn G., Pikes L. J., Ashcroft F. M., Makhina E. N., Nichols C.G.
(2001). Dynamic Sensitivity of ATP-sensitive K+ Channel to ATP. Journal of
Biological Chemestry. 276:29098-29103.
Lovatt M., Filby A., Parravicini V., Welen., Palmer E., and Zamoyska R.,
(2006). Lck regulates the threshold nof activation in primary T cells, While
both Lck and Fyn contribute to magnitude of extracellular signal-related
kinase response. Molecular and Cellular Biology. 26:8655-8665.
Matheux F., y Villard J. (2004). Celular and gene Theraphy for major
Histocompatibility Complex Class II Deficiency. News Physiol Sci. 19:154158.
Matsuo M., Kimura Y., Udea K. (2005). KATP channel interaction with adenina
nucleotides. Journal of Molecular and cellular cardiology. 38:907-916
McCann F. V., McCarthy D. C. Noelle R. J. (1990). Patch-Clamp Profile of Ion
Channels in Resting Murine B Lymphocytes. J. Membrane Biol. 114:175-188.
Minor, D.L., Lin, Y-F., Mobley, B.C., Avelar, A., Jan, Y.N., Jan, L.Y. y Berger,
J.M. (2000) The polar T1 interface in linked to conformational changes that
open the voltage-gated potassium channel. Cell. 102: 657-670.
77
Misler S, Falke LC, Gillis K, MCDaniel ML (1986): A metabolite-regulated
potassium channel in rat pancreatic B cells. Proc Natl Acad Sci USA. 83:7119
- 7123.
Modino A., Khoruts A., Jenkins M. K. (1996). The anatomy of T-cell activation
and tolerance. Proc Natl. Acad Sci. 93:2245-2252.
Myung P. S., Borethe N., Koretzky G. (2000) Adapter proteins in lymphocyte
antigen-receptor signaling. C. O. Immunology 12:256-266
Noma A (1983): ATP-regulated K+ channels in cardiac muscle. Nature..
305:147-148.
Okuyama Y, Yamada M, Kondo C, Satoh E, Isomoto S, Shindo T, Horio Y,
Kitakaze M, Hori M, Kurachi Y (1998): The effects of nucleotides and
potassium channel openers on the SUR2A/Kir6.2 complex K+-channel
expressed in a mammalian cell line, HEK293T. Pflügers Arch, Vol. 435:595603.
Pahapill and Schlichter. (1992). Cl- channels in intact human T lymphocytes.
Journal of Membrane Biology. 125:171-183.
Pahapill and Schlichter. (1992). Modulation of potassium Channels in Intact
Human T Lymphocytes. Journal of Phisiology. 445:407-430.
Palmer E. (2003). Negative selection- clearing out the bad apples from the Tcell repertorie.Immunol 3:383-391
Panyi G. and Deutsch C. (1996) Assembly Supression of Endogenous Kv1.3
Channels in Human T Cells. J,Gen, Physiol. 409-420
78
Panyi G. Zoltán V., Rezso G. (2004). Ion channel and lymphocyte activation.
Immunology Letters. 92:55-65
Pardo L. (2004) Voltage-gated Potassium Channels in Cell Proliferation.
Physiol 19:285-292.
Penninger J., Crabtree G. (1999). The Actin Cytoskeleton and Lymphocyte
Activation. Cell. 96:9-12.
Petrov R.V. (1982) Inmunología. Edit Mir Moscú, pp. 40-43
Puertas M. (2006). Caracterización Fenotípica y funcional de los linfocitos B
infiltrantes en islotes pancreáticos en ratones NOD. Tesis Doctoral.
Departamento de Biología Celular , Fisiología e Inmunología. Universidad
Autónoma de Barcelona
Quast U. Cap. 8. Effects of Potassium Channel Activators in isolated blood
Vessels.
Evans, J.M. Hamilton T.C., Logman S. D., Stemp G. (1996).
Potassium Channels and their Modulators. Edit. Taylor and Francis pp. 173179
Quayle J.M., Nelson M.T. Standen N.B. ATP-sensitive and Inwarsly
Rectifying potassium Channels in Smooth Muscle. (1997). Physiological
Society. 77:1165-1215.
Quesada
A.,
Redondo
J.,
(2003).
La
ruta
de
señalización
Ca+2/calcineurina/NFAT en activación endotelial y angiogénesis: efectos de la
ciclosporina A. Nefroloíia. 23:44-48
79
Racioppi L., Matarese G., D`Oro U., Pascale M. Masci A., Fontana S.,
Zappacosta S. (1996). The role of CD4-Lck in T-cell receptor antagonism:
Evidence for negative siugnaling. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10360-10365.
Regueiro J. R. Lopez C. (1998). Inmunologia: Biología y patología del
sistema inmune Edit. Panamericana. 2da edición pp.23-70
Reinherz E.l., Tan K., Tang L., Kern P., Liu J., Xiong Y., Hare B., Zhang R.,
Chang H., Wang J. (1999) The crystal structure of a T cell receptor in
complex with peptide and MHC class II. Science. 286:12913-1921
Robbins J. R., Molleran S., Filipovich A., Szigligeti P., Neumeier L., Petrovic
M. and Conforti L. (2005). Hypoxia modulates early events in T cell receptormediated activation in human T lymphocytes via Kv1.3 channels. Journal of
Physiology. 131-143.
Ross P. E., and Cahalan M. D. (1995). Ca+2 Influx Pathways mediated by
Swelling or Stores depletion in Mouse Thymocytes. J. Gen. Physiol. 106:415444.
Rourke B. O., (2000).
Pathophysiological and protective roles of
mitochondrial ion channels. Journal of Physiology. 529.1:23-36
Rourke B. O., (2007). Mitochondrial Ion Channels. Journal of Physiology.
69:19-49
Rud C.E. (1999) Adaptors and Molecular Scaffolds in inmune Cell Signaling.
Cell 96:5-8.
80
Russell J.H., Rush B., Weaver C., Wang R. (1993) Mature T cells of
autoimmune Ipr/Ipr mice have a defect in antigen stimulated suicide. Proc natl
Acad Sci USA, 90: 4409-4413.
Samavati L., Monick M. M., Sanlioglu S. Buettner G. R., Oberley L. W.
Hunninghake G. W. (2002). Mitochondrial KATP channel openers activate the
ERK kinase by an oxidant-dependent mechanism. Journal of Physiology.
283:273-281
Sakura H., Trap S., Liss B., Ashcroft F. M. (1999). Altered functional
properties of KATP channel conferred by a novel splice variant of SUR1.
Journal of Phisiology. 521.2:337-350.
Sanguinetti M. C. and Salata J. J. Cap. 10. Cardiac potassium Channel
modulators: potential for
antiarrhymythmic.
Evans, J.M. Hamilton T.C.,
Logman S. D., Stemp G. (1996). Potassium Channels and their Modulators.
Edit. Taylosr and Francis pp. 249.
Shyng SL, Ferrigni T, Nichols CG (1997): Control of rectification and gating of
cloned KATP channels by the Kir6.2 subunit. J Gen Physiol, Vol. 110:141153.
Singer P., Balderas R., Theofilopulos N., (1990). Thymic selection defines
multiple T cell receptor Vβ repertoire phenotypes at the CD4/CD8. EMBO
Journal. 9:3641-3648
Smith, P.C., Karpowich, N., Millen, L., Moody, J.E., Rosen, J., Thomas, P.J. &
Hunt, J.F. (2002). ATP binding to the motor domain from an ABC transporter
drives formation of a nucleotide sandwich dimer. Mol. Cell, Vol. 10:139–149.
81
Solomou E. E., Juang y. T., Gourley M. F., Kammer G. M., Tsokos G.C.
(2001). Molecular Basis of Deficient Il-2 Production in T cells from Patients
with systemic Lupus Erythematosus. Journal of Immunology. 166:4216-4222.
Sommers C., Park C., Lee J., Feng C., Fuller C., Grinberg A., Hildebrand J.,
Lacaná E., Menon R., Shores E., Samelson L., Love P. A LAT mutation that
inhibits T cell Development yet induces lymphoploriferation. SCIENCE.
296:2040-2043
Song D-K. and Ashcroft F. M. (2001) ATP Modulation of ATP- sensitive
Potassium Channel ATP Sensitivity Varies with the Type of SUR Subunit.
Journal of Biological Chemestry. 276:7143-7149.
Spence P.M., Sriram V., Kaer L.V., Hobbs J.A. Brutkiewicz R.R. (2001)
Generation of cellular immunity to lymphocytic choriomeningitis virus is
independent of CD1d1 expression. Immunol. 104:168-174.
Sugie K., Jeon M. S., Grey H. M. (2004). Activation of navi CD4 T cells by
anti-CD3 reveals an important role for Fyn in Lck-mediated signaling.PNAS
101:14859-14864.
Susumu S. (1999). ATP-Sensitive potassium channels: A model of
heteromultimeric potassium channel/receptor assemblies. Physiology 61:337362
Susumo S. and Takashi M. (2003). Gene targeting approach to clarification of
ion channel function: studies of Kir6.x null mice. Journal of Phisiology.
554.2:295-300.
82
Schwanstecher M, Sieverding C, Dörschner H, Gross I, Aguilar-Bryan L,
Schwanstecher C, Bryan J (1998): Potassium channel openers require ATP
to bind to and act through sulfonylurea receptors. EMBO J, Vol. 17:55295535.
Szabo I., Bock J., Kekle A. Soddemann M., Adams C., Lang F., Zoratti M.,
Gulbins E. (2004) A Novel potassium Channel in Lymphocyte Mitochondria.
Journal of Biological Chemistry. 280:12790-12798
Szabò. I., Adams, C. y Gulbins, E. (2004) Ion channels and membrane rafts
in apoptosis. Eur. J. Physiol. 448: 304-312.
Szewczyk A., Skalska J., Glab M., Kulawiak B., Malinska D., KoszelaPiotrowska I., Kunz W. (2006) Mitochondrial potassium channels: From
pharmacology to function. Biochimica et Biophysica Acta 1757:715-720
Takahashi T, Kuniyasu Y, Toda M, Sakaguchi N, Itoh M, Iwata M, Shimizu J,
Sakaguchi S. (1998) Immunologic self-tolerance maintained bye CD25+CD4+
naturally
anergic
and
autoimmune
disease
by
breaking
their
anergics/suppressive state. Int Immunol, 10: 1969-1980.
Teisseyre A. and Michalak K. (2001). The Patch-Clamp Technique and its
Application in Investigations of the Properties of Human T Lymphocyte
Potassium Channel. Celular and Molecular Biology Letters. 6;93-105.
Teisseyre A. and Michalak K. (2005). Genistein Inhibits the Activity of Kv1.3
Potassium Channels in Human T lymphocytes. Journal of Membrane Biology.
205:71-79.
Trimmer, J.S. (1993) Expression of delayed rectifier K+ channel isoforms in
the developing rat brain. FEBS Letters. 324: 205- 210.
83
Tucker S. J. and Ashocrft F. M. (1998) A touching case of channel regulation:
the ATP-sensitive K+ channel. Neurobiology 8:316-320.
Tusnády GE, Bakos E, Varadi A, Sarkadi B (1997). Membrane topology
distinguishes a subfamily of the ATP-binding cassette (ABC) transporters.
FEBS Letters, Vol. 402:1–3.
Verheugen J. (1998). Elevation of intracellular Ca+2in the physiologically
relevant range does not inhibit voltage.gated K+ channels in human T
lymphocytes. Journal of Physiology 167-177.
Weir D.M., (2004) Inmunología. Edit Manual Moderno, pp 24-56
Wu C., Hsu S., Shi H., Lai M. (2003). Nuclear Factor of activated T cells Is a
Target of p38 Mitogen-Activated Protein kinase in T Cells. Molecular and
Celular Biology. 23:6442-6454
Zambrano A. (1999). Inmunología. Edit. Interamericana, pp 12-40
84