Cat. IIDE-2023 VER.1 1 Distribuido por

TSH
Inmunoensayo Enzimático para la Determinación Cuantitativa de la
Hormona Estimulante Tiroidea (TSH) en Suero Humano
Solo para diagnóstico In Vitro
Para uso exclusivo en laboratorios clínicos o de gabinete
Conservar entre 2°C a 8°C
NOMBRES COMUNES Y DE PROPIEDAD
Inmunoensayo enzimático de TSH
USO DESTINADO
Para la determinación cuantitativa de la hormona estimulante tiroidea en
suero humano.
INTRODUCCIÓN
La determinación de niveles en suero o plasma de la hormona estimulante tiroidea (TSH o Tirotropina) es reconocida como un método sensible en el diagnóstico de hipotiroidismo primario y secundario. La TSH
es secretada por el lóbulo anterior de la glándula pituitaria e induce la
producción y liberación de tiroxina (T4) y triyodotironina (T3) desde la
glándula tiroides. Esta es una glicoproteína con un peso molecular de
28,000 daltons aproximadamente, consistiendo en dos subunidades
químicamente diferentes, alfa y beta.
Aunque la concentración de TSH en sangre es extremadamente baja,
ésta es esencial para el mantenimiento de la función tiroidea normal. La
liberación de TSH es regulada por una hormona TSH-libre (TRH) producida por el hipotálamo. Los niveles de TSH y TRH están inversamente
relacionados al nivel de la hormona tiroidea. Cuando existe un nivel alto
de hormona tiroidea en sangre, menos TRH se libera por el hipotálamo,
por lo que al menos TSH es secretada por la pituitaria. La acción opuesta
puede ocurrir cuando es disminuida la hormona tiroidea en sangre. Este
proceso es conocido como un mecanismo de regeneración negativa y es
responsable para mantener los niveles apropiados de estas hormonas
en sangre.
La TSH y la glicoproteínas pituitarias: la hormona luteinizante (LH), la
hormona folículo-estimulante (FSH), y la gonadotropina coriónica humana (hCG), tienen cadenas idénticas alfa. Las cadenas beta son distintas
pero contienen regiones con secuencias idénticas de aminoácidos. Estas
regiones de homología pueden causar considerables reacciones cruzadas con algunos antisueros policlonales de TSH. El uso de un anticuerpo
monoclonal en esta prueba ELISA TSH elimina tal reactividad cruzada
que podría producir valores de TSH falsamente elevados en mujeres
menopáusicas o embarazadas en poblaciones cuya evaluación de un
estado tiroideo es clínicamente significante.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
La prueba ELISA TSH está basada en el principio de la fase sólida de la
enzima-unida a una prueba inmunoabsorbente. El sistema del ensayo
utiliza un único anticuerpo monoclonal dirigido contra un antígeno distinto
determinante en la molécula de TSH intacta. El anticuerpo anti-TSH ratón
monoclonal es usado para la inmovilización de la fase sólida (en los micro
pozos). Un anticuerpo de anti-TSH de cabra está en la enzima-anticuerpo
(peroxidasa de rábano picante) de la solución conjugada. La muestra de
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la prueba es permitida que reaccione simultáneamente con los dos anticuerpos, mientras se producen las moléculas de TSH intercalándose entre la fase sólida y los anticuerpos unidos a la enzima. Después de una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente, los pozos se lavan con
agua para quitar los anticuerpos etiquetados desprendidos. Una solución
TMB es agregada e incubada durante 20 minutos, resultando el desarrollo de un color azul. El desarrollo del color se detiene con la adición de
Solución de Paro cambiando el color a amarillo. La concentración de TSH
es directamente proporcional a la intensidad del color de la muestra de la
prueba. La absorbancia es medida espectrofotométricamente a 450 nm.
REACTIVOS
Materiales proporcionados con el equipo:
1. Placa de micropozos cubiertos con anti-TSH de ratón monoclonal
con 96 pozos
2. Reactivo de Enzima Conjugada. 1 x 13 mL
3. Estándares de referencia: 0, 0.5, 2, 5, 10 y 25 µlU/mL. Liofilizados
4. Reactivo de TMB. 1 x 11 mL
5. Solución de Paro (1N HCI).1 x 11 mL
6. Instructivo de uso
Materiales requeridos pero no abastecidos
1. Pipetas de precisión 50 µL, 100 µL, 200 µL y 1.0 mL
2. Puntas para pipetas desechables.
3. Agua destilada o desionizada
4. Mezclador Vórtex o equivalente.
5. Papel absorbente o toalla de papel
6. Papel cuadriculado
7. Un lector de MicroElisa.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES PARA LOS USUARIOS
1. Precaución: Este kit contiene material humano. El material de base
utilizado para la fabricación de este equipo fue negativo para HbsAg,
HIV1/2 y HCV por métodos aprobados por la FDA. Sin embargo,
ningún método puede garantizar por completo la ausencia de estos
agentes. Por lo tanto, todos los productos de la sangre humana, incluidas las muestras de sueros, deben considerarse potencialmente
infecciosas. Su manejo y disposición debe ser definida por una adecuada guía nacional de seguridad de riesgo biológico o regulación,
cuando ésta existe.
2. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad y no mezclar o utilizar los componentes de kits con diferentes números de
lote.
3. No usar el reactivo cuando se sospeche de una contaminación de
este.
4. No utilizar los reactivos si algún frasco está dañado.
5. Coloque nuevamente las tapas de los reactivos inmediatamente de
su uso. No cambie las tapas.
6. Cada pozo puede ser utilizado una sola vez.
7. No pipetee los reactivos con la boca.
8. Soluciones que contienen aditivos y conservantes, tales como azida
de sodio, no deben ser utilizados en la reacción enzimática.
9. Evitar el contacto con HCl 1N. Puede causar irritación de la piel y
Distribuido por:
DIAGNÓSTICA INTERNACIONAL S.A. de C.V.
Rudyard Kipling 4886 Col. Jardines de la Patria
CP 45110 Zapopan, Jalisco, México
Lada sin costo: 01 800 440 0404 c/ 10 líneas
Tel: 01 (33) 3770 1940 c/ 10 líneas
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RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL ESPÉCIMEN
1. La sangre debe ser recolectada con técnicas estandarizadas de la
punción venosa y el suero debe ser separado de los glóbulos rojos,
tan pronto como sea posible. Evite hemólisis excesiva, muestras lipémicas o turbias.
2. Las muestras de suero deben ser almacenadas de 2 a 8 °C por hasta
48 horas, y deben ser congelados a -20°C o más bajo para periodos
más largos. No utilice muestras excesivamente lipémicas o hemolizadas. Muestras descongeladas deben ser invertidas en varias ocasiones antes de la prueba.
PREPARACIÓN DE REACTIVO
1. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (18 a 25 °C)
antes de su uso.
2. Todos los reactivos deben ser mezclados por inversión suave o torbellino antes de su uso. No inducir la formación de espuma.
3. Reconstituya cada estándar liofilizado con 1.0 mL de agua destilada.
Permita que el material reconstituido repose por al menos 20 minutos y mezcle cuidadosamente. Los estándares reconstituidos serán
estables por 30 días siempre y cuando sean almacenados de 2-8°C.
4. Muestras con valores esperados de TSH mayor a 25 µlU/mL debe
realizarse una dilución con el calibrador cero (1:10).
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
1. Asegure el número deseado de pozos cubiertos en la placa.
2. Vierta 100 µL, de estándares, muestras y controles dentro de los
pozos apropiados.
3. Agregue 100 µL del Reactivo de la Enzima Conjugada en cada pozo.
4. Mezcle perfectamente durante 30 segundos. Es muy importante
hacer la mezcla completa.
5. Incubar a temperatura ambiente (de 18 a 25ºC) durante 60 minutos.
6. Retire la mezcla de la incubación golpeando el contenido de la placa
a un recipiente de desechos.
7. Enjuague y de pequeños golpes a los micro pozos 5 veces con agua
destilada o desionizada (No use agua de la llave)
8. Golpeé los pozos firmemente en el papel absorbente para quitar las
gotas de agua residuales.
9. Deposite 100 µL de Solución de TMB en cada pozo. Mezcle cuidadosamente durante 10 segundos.
10. Incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.
11. Detenga la reacción agregando 100 µL de Solución de Paro (1N HCI)
a cada pozo.
12. Mezcle cuidadosamente durante 30 segundos. Es importante asegurarse que el color azul cambie a amarillo completamente.
13. Lea la absorbancia a 450 nm con un lector del micropozos en un
plazo no mayor a 15 minutos.
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
1. Calcule el valor de absorbancia media (A450) para cada juego de estándares de referencia, controles, y muestras.
2. Elabore una curva estándar al trazar la absorbancia media obtenida
para cada estándar de referencia comparada con su concentración
en µlU/mL sobre un papel cuadrícula, con valores de absorbancia
sobre el eje Y ó vertical y las concentraciones sobre el eje X u horizontal.
3. Utilizando los valores de absorbancia media para cada muestra, determine la concentración correspondiente de TSH en µlU/mL desde
4.
la curva estándar.
Cualquier valor obtenido para las muestras diluidas debe ser adicionalmente convertido al aplicar el factor de dilución apropiado en los
cálculos.
EJEMPLO DE CURVA ESTÁNDAR
Resultados típicos de una corrida estándar del ensayo se muestran a continuación. Esta curva estándar tiene el propósito de ilustrar solamente, y
no debe ser utilizada para hacer cálculos desconocidos. La curva estándar cubre un rango dinámico desde 0 hasta 25 µlU/mL.
TSH (µlU/mL)
Absorbancia (450 nm)
0
0.063
0.5
0.157
2.0
0.398
5.0
0.818
10.0
1.415
25.0
2.645
3.0
2.5
Absorbancia (450nm)
quemaduras. Si esto ocurre, lave con abundante agua y busque atención médica si persiste la irritación.
10. Para uso diagnóstico In vitro.
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
TSH Conc. (µlU/mL)
20
25
VALORES ESPERADOS
Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos normales basados
en la población de pacientes. Diferencias en la técnica de ensayo y la
aplicación de normas distintas pueden afectar los resultados. Los resultados indicados a continuación están basados ​​en 38 muestras de sangre
normales y 77 con hipertiroidismo. Los rangos se determinaron a partir de
2DE de la media (µlU/mL TSH) . Estos valores pueden ser diferentes de
otros datos publicados.
Normal
Hipertiroidismo
N media TSH
38
77
µlU/mL (Rango)
1.44
˂0.2
0.3 - 8.1
˂0.2
RANGOS DE REFERENCIA NORMALES
** los rangos de referencia a continuación se basan en Tietz 12
Adultos
TSH µlU/mL
21 - 54 años
0.4 - 4.2
55 - 87 años
0.5 - 8.9
Embarazo
1er. Trimestre
0.3 - 4.5
2do. Trimestre
0.5 - 4.6
3er. Trimestre
0.8 - 5.2
2
CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO
TSH ELISA ha sido comparado con la prueba de TSH del IMMULITE de
DPC 2000 de 3rd generación. Los métodos son similares ya que ambos
se utilizan para la determinación cuantitativa de TSH en suero humano,
y tanto el uso de la calibración y etiquetado en µlU/mL de la TSH se encuentra estandarizado por la OMS (2nd IRP, 80/558).
Esperado
(TSH µlU/mL)
Observado
(TSH µlU/mL)
% de
Recuperación
23.94
22.92
95.7%
11.75
11.01
93.6%
5.46
5.53
101.3%
2.76
3.04
110.1%
Se realizó un estudio con 39 muestras de pacientes eutiroideos y 20
muestras de pacientes con hipotiroidismo (según lo determinado por
análisis de un laboratorio de hospital). El rango de las muestras analizadas fue de 0.4 - 63.0 µlU/mL. La comparación demostró buena correlación con otro kit comercial como se muestra a continuación:
N= 59
Coeficiente de correlación= 0.994
Pendiente=1.027
Intercepción= 0.787
TSH ELISA Media= 8.39 µlU/mL
DPC Media= 9.41 µlU/mL
1.48
1.39
93.9%
En un estudio adicional se comparo el ensayo con el kit de DPC para 77
muestras de pacientes con hipertiroidismo donde presento también una
buena correlación como se muestra a continuación:
# muestras con hipertiroidismo ≤0.2 µlU/mL
DPC kit
N= 77
TSH ELISA kit
N= 77
SENSIBILIDAD
En las concentraciones de TSH de 1 µlU/mL y 0.2 µlU/mL, los CV interensayo determinaron que era el 11,4% y el 7,9%, respectivamente.
PRECISIÓN
a. Precisión Intra-ensayo:
Durante el ensayo la precisión fue determinada por replicas de determinaciones de 4 diferentes muestras de suero en un ensayo. Durante el
ensayo la variabilidad es mostrada en la siguiente tabla:
Muestras
1
2
3
4
# de Replicas
28
26
26
26
Media de TSH (µlU/mL)
0.62
1.51
15.48
26.14
D.S.
0.03
0.09
0.39
0.86
C.V. %
4.6%
5.7%
2.5%
3.3%
b. Precisión Inter-ensayo:
Entre el ensayo la precisión fue determinada por la medición de 4 diferentes muestras de suero sobre una serie de ensayos calibrados individualmente. La variabilidad es mostrada a continuación:
Muestras
1
2
3
4
# de Replicas
30
24
24
24
Media de TSH (µlU/mL)
0.64
1.46
15.38
25.26
D.S.
0.05
0.10
0.87
1.75
C.V. %
7.6%
7.1%
5.7%
8.9%
ESPECIFICIDAD
Las siguientes hormonas han sido procesadas para analizar reactividad
cruzada.
Hormona
Concentración
Intensidad producida
equivalente a TSH
(µlU/mL)
HCG
100 mIU/mL
600 mIU/mL
3,500 mIU/mL
10,000 mIU/mL
200,000 mIU/mL
0
0
0
0
0
FSH
20 mIU/mL
100 mIU/mL
200 mIU/mL
0
0
˂0.2
LH
75 mIU/mL
150 mIU/mL
300 mIU/mL
0
0
˂0.2
Prolactina
10 ng/mL
50 ng/mL
200 ng/mL
0
0
˂0.2
hGH
10 ng/mL
50 ng/mL
200 ng/mL
0
0
˂0.2
CRITERIO DE GESTIÓN DE CALIDAD EN EL LABORATORIO
Las buenas prácticas de laboratorio requieren que los controles sean corridos con cada curva de calibración. Un número estadísticamente significativo de controles debe ser analizado para establecer valores medios y
rangos aceptables para asegurar un desempeño apropiado.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1. Los resultados confiables y reproducibles serán obtenidos cuando el
procedimiento de ensayo sea llevado a cabo con un completo entendimiento de las instrucciones del inserto en el paquete y con acato a
las buenas prácticas de laboratorio.
2. Los resultados obtenidos del uso de este equipo de prueba deben
ser utilizados solamente como una adición a otros procedimientos
diagnósticos e información disponible para el médico.
3. Las muestras de suero que contengan lipemia, hemolisis o turbidez
no deberán ser usadas con ésta prueba.
4. El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente causará una deficiente precisión y lecturas de absorbancia falsamente
elevadas.
5. El ensayo de TSH no se ha probado en los recién nacidos, y no es
para su uso en el cribado de los recién nacidos
ESTUDIO DE RECUPERACIÓN
Varias muestras de sueros de pacientes de niveles de TSH conocidos
fueron combinados y ensayados por duplicado. La media de recuperación
fue de 98.9%
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REFERENCIAS
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12. Clinical Guide to Laboratory Tests, Ed. nw Tietz, 3rd Ed” W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA 19106, 1995.
FABRICADO POR:
INTERNATIONAL IMMUNO-DIAGNOSTICS
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