EVALUACIÓN DE LA PARTICIPACIÓN DE TcAP1 y TcAP2

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE POSTGRADO
EVALUACIÓN DE LA PARTICIPACIÓN DE TcAP1 y TcAP2 EN LA
VÍA DE REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASES (BER) DEL DNA
EN Trypanosoma cruzi Y SU ROL EN LA SOBREVIDA DEL
PARÁSITO FRENTE A ESTRÉS OXIDATIVO
SOFÍA ELIZABETH SEPÚLVEDA CONTRERAS
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS
Directores de Tesis
Prof. Norbel Galanti Garrone
Prof. Gonzalo Cabrera Vallejos
2012
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE POSTGRADO
INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS
Se informa que la Comisión de Grados Académicos de la Facultad de Medicina, que la Tesis
de Doctorado en Ciencias Biomédicas presentada por la candidata
SOFÍA ELIZABETH SEPÚLVEDA CONTRERAS
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al Grado de Doctor
en Ciencias Biomédicas en Examen de Defensa de Tesis rendido el día 12 de octubre de 2012.
Prof. Dr. Norbel Galanti
Director de Tesis
Programa de Biología Celular, I.C.B.M.
Facultad de Medicina, Universidad de Chile
Prof. Dr. Gonzalo Cabrera
Director de Tesis
Programa de Biología Celular, I.C.B.M.
Facultad de Medicina, Universidad de Chile
COMISIÓN INFORMANTE DE TESIS
PROF. DRA. JUANA PINCHEIRA
Presidenta Comisión de Examen
PROF. DR. JOSÉ LUIS ARIAS
PROF. DR. JORGE FERREIRA
PROF. DR. JORGE GONZÁLEZ
TESIS FINACIADA POR:
BECA PARA ESTUDIOS DE DOCTORADO EN CHILE CONICYT, BECAS DE APOYO A LA
REALIZACIÓN DE LA TESIS DOCTORAL 24110156, PROYECTOS FONDECYT 1090124 Y
11100053, PROYECTO ANILLO ACT 112.
A mis padres
Agradecimientos
No quiero cansar a mis estimados lectores pero al terminar un camino como éste, que
comenzó hace tanto tiempo, no puedo ser breve a la hora de agradecer. Son tantas las
personas que llegan y se van en cinco años, tantas vidas distintas que, lejos de sólo ser una
gran experiencia académica, hacer un doctorado ha sido para mi una de las experiencias de
vida más enriquecedoras, educativas y fortalecedoras.
Muchas gracias a mi familia que siempre me ha apoyado y creído en mí. Gracias
porque me impulsaron de diversas maneras, con sus palabras e incluso con su ausencia, a
seguir adelante. A mis padres, Margarita y Raúl; a mi marido, Jaime; a mis hermanos, Evelynn
y Tomás, y por su puesto a mi pequeño sol, Haro Rangi. Los amo.
Quiero agradecer a mis tutores y amigos, los profesores Norbel Galanti y Gonzalo
Cabrera, por recibirme en su laboratorio a pesar de no conocerme. Por confiar en mí todo
este tiempo. Por apoyarme, por sus palabras de aliento y por los sabios consejos sobre la
vida. Gracias por estar presentes en mis momentos difíciles. Gracias profe Norbel por confiar
en mí y aconsejarme a través de su propia historia. Gracias por los almuerzos en los
peruanos, ecuatorianos, chinos o coreanos. Gracias Gonzalo por creer en mí, y por
enseñarme que a veces reírse de los problemas es la mejor forma de enfrentarlos. Gracias
por aceptar ser mis tutores y guiarme en este largo y a la vez breve camino. Gracias
especialmente por su amistad.
Gracias a los profesores de la comisión informante de tesis. Gracias por escuchar
hasta el cansancio mi relato sobre el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi y las especies
reactivas de oxígeno. Gracias por estar cada vez que fue necesario, aun viniendo desde lejos.
Gracias por todos los consejos que me dieron para mejorar la calidad de mi tesis. Gracias
especialmente a la Dra. Juana Pincheira por su constante interés en que mi trabajo fuera
cada vez mejor.
Y bueno, cuando pasas más de ocho horas al día, cinco días a la semana con tus
compañeros de laboratorio, éstos se transforman en tu familia. Primero los conoces, después
los quieres y también los odias un poco, y haces tuyos sus problemas, sus tristezas y alegrías.
Y para qué negarlo, en este laboratorio te ríes con ellos…y de ellos. Entonces, ¿cómo no
agradecer a cada uno por haberme acompañado en este camino? Gracias a todos los monos
(en orden de aparición): A Cristóbal, que llegó a poner un poco de desorden en el laboratorio
hace varios años y se convirtió en un buen y querido amigo. A la sita Lu, quien siempre está
dispuesta a ayudar a los demás y que ha sido para mí un apoyo invaluable durante todo este
tiempo. A Carlita María que llegó de Puerto Montt a vivir a la ciudad, se hizo nuestra amiga y
compartimos tristezas y alegrías. A Princess Naty, gracias mona por ayudarme a descubrir lo
reconfortante que es salir a correr y subir cerros. Gracias sobretodo por acompañarme en
uno de los períodos más tristes y complejos de mi vida, gracias por tu apoyo y cariño. A José
Pablo María y Shago, dos “amigos” que llegaron a pesar de no pasar la pre-selección de
tesistas. Par de monos, para mí son dos buenos amigos, dos personas maravillosas que
siempre me levantan el ánimo. Gracias por el cariño, la buena onda y el apoyo. A Iván (Aivan,
Andreas, Rapunzel, etc) que ha sido un buen amigo todo este tiempo, muy paciente a pesar
de mis muchas mañas. Gracias por el pool y las papas fritas que nos permitieron conversar
mucho rato. Gracias por todos los consejos que me has dado, los que he seguido y los que
no. A Pauli (Doña, “Valiente”, Colora, etc), Sole (oveja, Xica da Silva, etc) y Gigi, que me
conocieron cuando ya este capítulo se estaba cerrando. Gracias por las salidas con papas
fritas, empanadas y cerveza. Gracias porque han sido buenas amigas y por la confianza que
han depositado en mi cuando se trata de hablar de la vida. Gracias a todos mis monos
sobretodo por ser hermosas personas.
Y por supuesto gracias a tantos otros que fueron apareciendo al hacer camino. A la
Sita Galia Andrea Ramírez, con quién he compartido actividades académicas y extraacadémicas de tipo recreativo y deportivo... Gracias por su amistad y por su incansable buena
onda. A Mariana Osorio, gracias amiga por acompañarme siempre, porque aunque muchas
veces pasemos semanas sin hablar sé que estás pendiente de mí y siempre puedo contar
contigo. A Macarena Garrido que fue mi primera amigui del doctorado, gracias por eternos
fines de semana estudiando mientras comíamos malvas con chocolate. Gracias a los amigos
que me acompañaron desde antes de empezar este camino (Alyson, Fran, Dany, Ale, Pablo,
Manzanita) y a todos los que de alguna forma llegaron a mi vida durante este tiempo: a los
vecinos del subterráneo de Biología Celular, en especial a Javier, cuya devoción al trabajo es
un incentivo para todos quienes trabajamos con él; a mis compañeros del doctorado; a los
amigos del proyecto Anillo; a mis ex-compañeritos de inmunología, donde empezó todo esto
(Caroll, Sergio, Alexis, Ramon, Lucía, Paty, Rodrigo, Pauli) y tantos otros más que quizás he
olvidado mientras escribo esto pero que seguro recordaré cuando ya no pueda anotarlos.
Gracias a todos!
ÍNDICE
Índice
I
Índice figuras
V
Abreviaciones
VII
Resumen
1
Abstract
2
Introducción
Enfermedad de Chagas y Trypanosoma cruzi
3
Características de Trypansoma cruzi
4
Características de la enfermedad de Chagas
6
Estrés oxidativo e infección con Trypanosoma cruzi
7
Estrés oxidativo y Tripomastigotes
8
Estrés oxidativo y Amastigotes
9
Estrés oxidativo y Epimastigotes
11
Daño al DNA por ROS/RNS
12
Mecanismos de evasión al estrés oxidativo y de reparación del daño
al DNA en Trypanosoma cruzi
13
Familia APE1 y su homólogo en Trypanosoma cruzi, TcAP1
16
Hipótesis
20
Objetivos
20
Materiales y Métodos
1. Cultivos celulares
21
2. Generación de las proteínas recombinantes TcAP1 y TcAP2
21
I
2.1 Clonamiento de tcap2 en pQE-80L
21
2.2 Obtención de las proteínas recombinantes TcAP1 y TcAP2 en
condiciones denaturantes
22
2.3 Generación de TcAP1 y TcAP2 recombinantes en diferentes
modelos de expresión
23
2.4 Obtención de la proteína TcAP2 en condiciones nativas
26
3. Identificación de TcAP1 y TcAP2 en T. cruzi
27
4. Generación de dominantes negativos (DNs) de las proteínas TcAP1 y TcAP2
28
5. Ensayos para comprobar actividad enzimática de TcAP1, TcAP2 y sus DNs
29
6. Generación de cepas de T. cruzi que sobreexpresen TcAP1 y TcAP2 nativas
y sus DNs
31
7. Localización subcelular de las proteínas recombinantes TcAP1-GFP y
TcAP2-GFP expresadas en epimastigotes de T. cruzi transfectados
33
8. Evaluación de la viabilidad de cepas mutantes frente a estrés oxidativo
34
9. Estadística
34
10. Bioseguridad
34
Resultados
Objetivo específico 1_ Comprobar la expresión de TcAP1 y TcAP2 en T. cruzi
35
I.
Obtención de la proteína recombinante TcAP2 en bacterias E.coli BL21
35
II.
Generación de anticuerpo policlonal anti-TcAP1 y anti-TcAP2
37
III.
Determinación de la expresión de TcAP1 y TcAP2 en las distintas
formas celulares de T. cruzi
38
II
IV.
Nivel de expresión de TcAP1 y TcAP2 en epimastigotes de T. cruzi
sometidos a estrés oxidativo
40
Objetivo específico 2_ Comprobar la funcionalidad de TcAP1 y TcAP2 por
ensayos in vitro
42
I.
Obtención de constructos para generar TcAP1 y TcAP2 recombinantes
II.
Detección y purificación de la proteína recombinante TcAP2 en
condiciones nativas
III.
42
44
Generación de dominantes negativos de las proteínas TcAP1 y
TcAP2 mediante mutagénesis sitio-dirigida de las secuencias
nucleotídicas codificantes
IV.
45
Detección de la actividad endonucleasa AP de extractos proteicos de
epimastigotes y de la proteína recombinante TcAP2 purificada sobre
oligonucleótidos con un sitio abásico
V.
47
Evaluar la actividad endonucleasa AP de extractos proteicos de
epimastigotes y de la proteínas recombinante TcAP2 en presencia
o ausencia de metoxiamina (inhibidor de la vía BER)
53
Objetivo específico 3_ Generar cepas de T. cruzi que sobreexpresen las
proteínas nativas y dominantes negativos de TcAP1 y TcAP2. Evaluar su
viabilidad en condiciones de estrés oxidativos
I.
56
Inserción de las secuencias nucleotídicas codificantes para TcAP1,
TcAP2 y dominantes negativos putativos de ambas proteínas en el
vector de expresión pTREX-gfp
56
III
II.
Transfección de epimastigotes con los constructos pTREX-gfp-tcap1 y
pTREX-gfp-tcap2, y confirmación de la expresión de las proteínas
correspondientes
III.
57
Evaluación de la viabilidad de epimastigotes que sobreexpresan las
proteínas TcAP1 y TcAP2, expuestos a agentes oxidantes
Resumen de resultados
61
66
Discusión
Estrés oxidativo y mecanismos de defensa en Trypanosoma cruzi
68
Daño oxdativo y reparación del DNA mediante la vía BER
69
Vía BER en Trypanosma cruzi: identificación de TcAP1 Y TcAP2
70
Nivel de expresión de TcAP1 y TcAP2 frente a estrés oxidativo
72
Localización subcelular de TcAP1 y TcAP2
74
Obtención de TcAP1 y TcAP2 recombinantes de Trypanosoma cruzi
75
Actividad enzimática de TcAP1 y TcAP2
77
inhibición de la actividad endonucleasa AP de Trypanosoma cruzi
80
Conclusiones y proyecciones
82
Bibliografía
84
Anexo 1
95
Anexo 2
96
IV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Vías de reparación del DNA por escisión de bases (BER)
16
Figura 2: Diseño de oligonucleótido para la determinación de la actividad
endonucleasa AP
30
Figura 3: Generación de la proteína recombinante TcAP2
36
Figura 4: Identificación de TcAP2 recombinante mediante espectrometría de masa
37
Figura 5: Determinación de la expresión de TcAP1 en las distintas formas
celulares de T. cruzi
39
Figura 6: Análisis de la secuencia nucleotídica y aminoacídica de
TcAP1 de T. cruzi
39
Figura 7: Determinación de la expresión de TcAP2 en las distintas formas
celulares de T. cruzi
40
Figura 8: Nivel de expresión de TcAP1 en epimastigotes sometidos a
agentes oxidantes
41
Figura 9: Nivel de expresión de TcAP2 en epimastigotes sometidos a H 2 O 2
42
Figura 10: Confirmación de la inserción de las secuencias nucleotídicas tcap1
y tcap2 en el vector de expresión pLEXSY, mediante ensayos de PCR
43
Figura 11: Expresión de la proteína recombinante TcAP2 en
células de L. tarentolae.
44
Figura 12: Purificación de la proteína recombinante TcAP2
45
Figura 13: Secuenciación de plasmidios pMT/V5-tcap1-DomNeg y
pMT/V5-tcap2-DomNeg
47
V
Figura 14: Detección de la actividad endonucleasa AP de
epimastigotes de T. cruzi
49
Figura 15: Reparación de sitios AP por epimastigotes de T. cruzi
50
Figura 16: Detección de la actividad endonucleasa AP y reparación de
sitio AP en las distintas formas celulares de T. cruzi
51
Figura 17: Detección de la actividad endonucleasa AP de TcAP2 recombinante
52
Figura 18: MTX inhibe de la actividad endonucleasa AP de T. cruzi
54
Figura 19: MTX inhibe de la actividad endonucleasa AP de TcAP2
55
Figura 20: Verificación de la inserción de las secuencias nucleotídicas
codificantes para TcAP1, TcAP2 y dominantes negativos putativos de
ambas proteínas en el vector de expresión pTREX-gfp mediante PCR
57
Figura 21: Localización de TcAP1-GFP y TcAP2-GFP en epimastigotes
transfectados
58
Figura 22: TcAP1-GFP y TcAP2-GFP se localizan exclusivamente en el núcleo
de epimastigotes de T. cruzi
59
Figura 23: Expresión de TcAP1-GFP y TcAP2-GFP en
epimastigotes transfectados
60
Figura 24: Separación celular por citometría de flujo de parásitos transfectados
con pTREX-tcap1
62
Figura 25: Evaluación de la viabilidad de epimastigotes transfectados
sometidos a estrés oxidativo
63
Figura 26. Evaluación de la viabilidad de epimastigotes transfectados con
APE1-DN sometidos a estrés oxidativo
Figura 27: APE1-DN inhibe de la actividad endonucleasa AP de TcAP2
VI
65
65
ABREVIACIONES
APE
: Endonucleasa apurínica/apirimidínica
APE1
: Endonucleasa apurínica/apirimidínica 1 de Homo sapiens
APE1-DN
: Dominante negativo de APE1
APE2
: Endonucleasa apurínica/apirimidínica 2 de Homo sapiens
ATP
: Adenosin-5'-trifosfato
BER
: Vía de Reparación por Escisión de Bases (Base Excision Repair)
DN
: Dominante Negativo
Ensayo MTT
: Ensayo para determinar viabilidad mediante la reducción mitocondrial de sales
de tetrazolio (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetrazolio) a
formazán.
Exo III
: Exonucleasa III, principal endonucleasa apurínica/apirimidínica de E. coli
GFP
: Proteína Fluorescente Verde (Green Fluorescent Protein)
H2O2
: Peróxido de hidrógeno
His
: Histidina
MTX
: Metoxiamina
NOO·-
: Peroxinitrito
VII
PCR
: Reacción en Cadena de la Polimerasa
RNS
: Especies Reactivas de Nitrógeno
ROS
: Especies Reactivas de Oxígeno
SDS-PAGE
: Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio
TcAP1
: Endonucleasa apurínica/apirimidínica 1 de Trypanosoma cruzi
TcAP2
: Endonucleasa apurínica/apirimidínica 2 de Trypanosoma cruzi
UDG
: uracil DNA glicosilasa
VIII
RESUMEN
Trypanosoma cruzi (T. cruzi) es un protozoo hemoflagelado agente causal de la
enfermedad de Chagas. Se presenta en tres formas celulares: epimastigote, amastigote y
tripomastigote, estas dos últimas presentes en hospederos mamíferos. Este parásito sobrevive al
daño del DNA por especies reactivas (ROS/RNS) durante todo su ciclo de vida. En esta tesis se
propuso que T. cruzi sobrevive al daño oxidativo por activación del mecanismo de reparación del
DNA por escisión de bases (vía BER). Este es un proceso altamente conservado en el que las
endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (APEs) juegan un rol fundamental. Consecuente con esta
propuesta, en trabajos previos realizados se observó que la viabilidad de epimastigotes y
tripomastigotes sometidos a diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno y peroxinitrito
disminuye significativamente cuando se tratan simultáneamente con un inhibidor de APEs.
En esta tesis se determinó la expresión, funcionalidad e importancia de dos APEs, TcAP1,
ortóloga de APE1 humana, y TcAP2, ortóloga de APE2 humana y de Apn2 de Schizosaccaromyces
pombe. Se pudo comprobar que la viabilidad de epimastigotes que sobreexpresan alguna de
estas endonucleasas aumenta frente a estrés oxidativo comparado con epimastigotes controles.
Por otra parte, la inhibición de la actividad endonucleasa AP en el parásito mediante el uso de un
dominante negativo disminuye su viabilidad frente a especies reactivas.
Estos resultados confirman la participación de la vía BER en la resistencia de T. cruzi al
daño oxidativo al DNA a través de la activación de APEs específicas del parásito. Esto hace factible
el comienzo de la búsqueda de inhibidores específicos de dichas enzimas, que podrían potenciar
el efecto citotóxico del daño oxidativo al DNA generado por las células del hospedero, como
tratamiento alternativo o complementario para la enfermedad de Chagas.
1
ABSTRACT
Trypanosoma cruzi (T. cruzi), a parasitic protozoan, is the etiological agent of Chagas
disease. T. cruzi is found in three cellular forms: epimastigotes, amastigote and tripomastigote,
the two last being present in mammalian hosts. The parasite has to face oxidative damage by
ROS/RNS along its entire life cycle to survive and to establish a chronic infection. In this work it is
proposed that T. cruzi survives oxidative DNA damage by activation of the DNA base excision
repair (BER) pathway. This pathway is highly conserved in eukaryotes with apurinic/apirimidinic
endonucleases (APEs) playing a fundamental role. Previous results showed that epimastigotes
and tripomastigotes viability exposed to hydrogen peroxide and peroxinitrite significantly
decreases when co-incubated with an AP inhibitor.
In this work the presence, expression and functionality of two T. cruzi APEs (TcAP1, Homo
sapiens
APE1
orthologous
and
TcAP2,
orthologous
to
Homo
sapiens
APE2
and
Schizosaccaromyces pombe Apn2p) was determined. These enzymes are present in the three
cellular forms of the parasite and their expression is not increased in the presence of H 2 O 2 or
NOO-. Overexpression of any of those enzymes increases epimastigotes viability when they are
exposed to ROS/RNS. Moreover, inhibition of AP endonuclease activity in the parasite by a
negative dominant enzyme decreases its viability in oxidative stress conditions.
These results confirm that the BER pathway is involved in the T. cruzi resistance to DNA
oxidative damage by specific APEs activation in the parasite. Furthermore, these outcomes open
the possibility of searching for specific inhibitors of these enzymes, which could enhance the antiparasitic effect generated by human host cells and/or improve the action of conventional anti
chagasic drugs.
2
INTRODUCCIÓN
ENFERMEDAD DE CHAGAS Y Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi es un protozoo hemoflagelado agente causal de la enfermedad de
Chagas (Chagas, 1909). Esta enfermedad es actualmente una de las mayores preocupaciones en
materia de salud pública para América Latina, siendo asociada a vectores de mayor prevalencia y
mortalidad después de la malaria (Committee, 2002). La zona endémica se extiende desde el sur
de EE.UU hasta el sur de Argentina y Chile y se estima que existen de 10 a 15 millones de
personas infectadas en esta región (Coura, 2007; Yun et al., 2009; Salomon, 2011). De acuerdo a
lo informado por países donde la enfermedad de Chagas es endémica, anualmente el número de
casos nuevos debido a transmisión vectorial es de 42.000 mientras que el Chagas congénito
aporta aproximadamente 15000 (Organization, 2005; Salomon, 2011). Por otro lado, según lo
reportado por la Organización Mundial de la Salud, las tasas de mortalidad varían entre 8 y 12%
dependiendo del país estudiado, la edad, estado fisiológico de los pacientes y modalidad de
tratamiento recibido (Committee, 2002).
En Chile, la enfermedad de Chagas se distribuye desde la región de Arica-Parinacota hasta
la región del Libertador Bernardo O’Higgins (MINSAL, 2011). Se calcula que la población expuesta
a la enfermedad es de aproximadamente 850.000 personas, distribuidas en áreas rurales y
periurbanas (MINSAL, 2007). Actualmente se estima que existen alrededor de 120.000 habitantes
infectados (MINSAL, 2012), concentrados mayoritariamente en la región de Coquimbo, donde se
ha registrado la más alta tasa acumulada de mortalidad, 20 por 100.000 habitantes (MINSAL,
2007). La mortalidad se ha mantenido relativamente estable con una discreta tendencia a la
disminución en los últimos años, con tasas de 0,44 por 100 mil habitantes en 2001 y 0,31 en
3
2008, lo que equivale a 52 muertes al año aproximadamente. Las muertes por Chagas
representan el 0,05% de las muertes totales anuales (MINSAL, 2011). Pese a que en 1999 Chile
fue declarado libre de transmisión vectorial aún es una enfermedad que debe ser notificada
(MINSAL, 2011).
Características de Trypanosoma cruzi
T. cruzi es un parásito flagelado del orden Kinetoplastidae, de la familia Trypanosomatidae
(Chagas, 1909). Los organismos pertenecientes a este orden se caracterizan por presentar
diferentes formas celulares durante su ciclo de vida y poseer una única gran mitocondria que
contiene el 15 al 30% del DNA de la célula (kinetoplasto) (Sibley, 2011). Además, los
tripanosomátidos presentan interesantes características biológicas como histonas no
conservadas, ausencia de condensación de la cromatina durante la mitosis, trans-splicing nuclear,
edición del DNA del kinetoplasto y síntesis de RNA mensajeros policistrónicos (Solari, 1980;
McCarthy-Burke et al., 1989; Galanti et al., 1998; Elias et al., 2001; Spadiliero et al., 2002a;
Spadiliero et al., 2002b; Lukes et al., 2005). Actualmente se describe la existencia de 6 grupos
genéticos o linajes de T. cruzi que tendrían su origen en hibridaciones generadas a lo largo de la
evolución del parásito (TcI a TcVI) (Diosque et al., 2003; Zingales et al., 2009; Telleria et al.,
2010).
T. cruzi presenta un ciclo de vida indirecto, que comprende tanto a insectos hematófagos
(triatominos), que actúan como hospederos y vectores, y a mamíferos, incluido el hombre, como
hospederos definitivos (De Souza, 2002b) Los principales triatominos vectores de T. cruzi en Chile
son Triatoma infestans (ciclo domiciliario) y Mepraia spinolai (ciclo silvestre). (Committee, 2002).
Recientemente se han agregado dos especies, Mepraia gajardoi, que participa del ciclo silvestre,
4
habitando playas y desiertos costeros de las regiones de Arica-Parinacota, Tarapacá y
Antofagasta (Carvajal, 2007), y Mepraia parapatrica, que se encuentra en el norte de nuestro
país (MINSAL, 2012).
El ciclo de transmisión de la enfermedad se inicia por la picadura de un triatomino vector
parasitado por T. cruzi que, al alimentarse de la sangre de un mamífero, deposita sobre la piel
fecas contaminadas con tripomastigotes metacíclicos, forma infectiva no replicativa del parásito.
Estos ingresan al torrente sanguíneo a través de la piel, mecanismo facilitado por rascado de la
zona de la picadura y por enzimas proteolíticas presentes en la saliva del insecto (Amino et al.,
2002; De Souza, 2002a). Una vez en la epidermis y dermis, los tripomastigotes son fagocitados
por células presentadoras de antígeno tales como macrófagos, dentro de los cuales se
diferencian a amastigotes, forma replicativa intracelular no infectiva. Tras cierto número de
divisiones, los amastigotes se diferencian a tripomastigotes sanguíneos, forma infectiva no
replicativa y extracelular de T. cruzi. Posteriormente, los tripomastigotes son liberados al torrente
sanguíneo, dirigiéndose a los tejidos blancos como miocardio, músculo liso visceral, músculo
esquelético, células de la glía del sistema nervioso central y placenta. Cuando un triatomino se
alimenta de la sangre de un hospedero mamífero infectado, los tripomastigotes sanguíneos
ingeridos pasan al intestino medio del vector y se transforman a epimastigotes, forma replicativa
extracelular no infectiva del parásito. Al avanzar hacia el tracto digestivo posterior del insecto, los
epimastigotes se transforman en tripomastigotes metacíclicos, forma no replicativa que posee la
capacidad de infectar a nuevos hospederos mamíferos, completando así el ciclo de vida (Tyler
and Engman, 2001; De Souza, 2002a)
5
Otras formas importantes de contagio son las transfusiones sanguíneas, el transplante de
órganos, la infección oral por consumo de alimentos infectados y la transmisión transplacentaria.
Estas formas de infección alternativas han adquirido cada vez más importancia epidemiológica
(Prata, 2001; Yoshida, 2008) principalmente porque que el incremento de las migraciones
poblacionales ha permitido que la enfermedad de Chagas esté presente en países no endémicos
(Bern and Montgomery, 2009; Bern et al., 2011).
Características de la enfermedad de Chagas
La enfermedad de Chagas posee manifestaciones clínicas que están clasificadas en tres
fases. La fase aguda, inmediatamente posterior a la infección, se presenta con parasitemia
intensa y sintomatología solo en algunos pacientes (linfadenopatías regionales, edema unilateral
bipalpebral o signo de Romaña y alteraciones características del electrocardiograma). En la
mayoría de los casos la infección aguda se presenta asintomática, pasando así a la fase de
latencia que puede extenderse por meses e incluso años (Soares et al., 2001; Teixeira et al., 2006;
Teixeira et al., 2011). La fase crónica de la enfermedad se presenta en un 30% de los individuos
infectados y se asocia a la presencia de megacolon, megaesófago, denervación del sistema
nervioso autónomo, arritmia e hipertrofia cardíaca que ocasiona insuficiencia cardíaca progresiva
(Prata, 2001). En esta etapa, la enfermedad puede ser inhabilitante o causa directa de
mortalidad. El curso de la enfermedad depende de diferentes factores: carga parasitaria en el
sitio de la inoculación, grupo genético y cepa del parásito, primoinfección o reinfección, estado
inmunológico del hospedero y tipo de vector (triatomino) (Coura, 2007).
Actualmente los medicamentos más utilizados en el tratamiento de la enfermedad de
Chagas son Nifurtimox (3-metil-N-[(5-nitro-2-furfuril) metilene]-4-tiomorfolinoamina-1,1-dioxido)
6
y Benznidazole (2-nitro-N-(fenilmetil)-1H-imidazol-1-acetamida). Estos medicamentos poseen un
alto grado de eficacia para el tratamiento de la sintomatología aguda en pacientes jóvenes; sin
embargo, en adultos o pacientes crónicos presentan baja eficacia clínica y efectos colaterales no
deseados (Organization, 2005).
El hecho de que T. cruzi persista por años en el hospedero, sin que exista una cura
espontánea de la enfermedad, sugiere que el parásito ha desarrollado mecanismos potentes para
evadir la detección y destrucción por parte del hospedero mamífero. La ausencia de fármacos
efectivos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas crónica hace necesaria la exploración
de nuevas áreas dentro de la biología de T. cruzi, que puedan utilizarse a futuro como blancos
terapéuticos. Una de estas áreas se relaciona con la capacidad de T. cruzi de sobrevivir en
ambientes con alto estrés oxidativo, reparando el daño que éste le pueda generar.
ESTRÉS OXIDATIVO E INFECCIÓN CON Trypanosoma cruzi
El estrés oxidativo se define como un aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS)
y/o una disminución de los mecanismos antioxidantes de defensa celular (Dusting and Triggle,
2005). Muchas ROS poseen electrones no apareados y por lo tanto constituyen radicales libres.
Dentro de los principales ROS encontramos: anión superóxido (O2·-), radical hidroxilo (OH·-) y
peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ). Aunque el anión superóxido no es una molécula altamente
reactiva, su interacción con óxido nítrico (NO·) genera una molécula de alta reactividad, el
peroxinitrito (NOO·-). Esta última pertenece a las especies reactivas de nitrógeno (RNS) que
favorecen el estado de estrés oxidativo (Zacks et al., 2005). Tanto H 2 O 2 como NO· son moléculas
altamente difusibles y por lo tanto pueden interactuar con moléculas distantes dentro de la
célula, propagando la oxidación (Zacks et al., 2005).
7
Estrés oxidativo y Tripomastigotes
La forma tripomastigote de T. cruzi puede invadir cualquier célula nucleada, sin embargo,
al infectar un mamífero el tripomastigote induce primariamente su fagocitosis principalmente
por macrófagos. Durante la invasión, el tripomastigote es incorporado en una vesícula
parasitófora en la membrana de la cual se ensamblan las diferentes subunidades del complejo
NADPH oxidasa que genera altas concentraciones de O2·- y H 2 O 2 , proceso denominado “estallido
respiratorio” (Piacenza et al., 2009). Por otra parte, en el hospedero mamífero los
tripomastigotes son reconocidos por receptores tipo Toll (TLR2 y TLR9) presentes en células
dendríticas y macrófagos. La activación de estos receptores induce la expresión de IL-12, TNF-α e
INF-γ (Sibley, 2011) que favorece la expresión de óxido nitrico sintasa inducible (iNOS) en
macrófagos con la consecuente generación de NO·. Esta molécula difunde desde el citoplasma
hacia el interior de la vesícula parasitófora reaccionando con O2·- llevando a la formación de
NOO·- (Machado et al., 2000; Aliberti et al., 2001; Piacenza et al., 2009).
Experimentos in vivo realizados en modelos murinos de Chagas agudo indican que entre
el día 12 y 14 de la infección se produce un aumento en los niveles de ROS en macrófagos de
bazo y monocitos aislados de sangre periférica (Borges et al., 1995; Melo et al., 2003). A su vez,
experimentos in vitro realizados por Metz y colaboradores determinan un importante aumento
de los niveles de óxido nítrico en macrófagos peritoneales de ratón, activados por INF-γ, luego de
infectarlos con tripomastigotes de T. cruzi. Además estos autores demuestran la importancia del
incremento de este agente oxidante para la reducción del número de parásitos intracelulares en
este tipo de células (Metz et al., 1993). Apoyando este trabajo, indagaciones realizadas por Vespa
y colaboradores en un modelo murino de enfermedad de Chagas revelan que durante la fase
8
aguda de la patología se produce un incremento en la producción de NO· que se relaciona
directamente con la sobrevida de ratones infectados (Vespa et al., 1994). Sin embargo,
Cummings y Tarleton (2004) señalan que ratones C57BL/6 knock-out para el gen de la enzima
iNOS presentan un porcentaje de sobrevida similar a ratones silvestres infectados con T. cruzi
(Cummings and Tarleton, 2004). Según estos autores, este resultado podría ser atribuible al
incremento de numerosas citoquinas que probablemente compensarían la ausencia de NO·. No
obstante, ambos autores también demuestran la existencia de un incremento en la producción
de NO· en ratones silvestres luego de la infección con T. cruzi.
A pesar de la presencia de los mecanismos de defensa, los hospederos mamíferos no son
capaces de eliminar completamente toda la población parasitaria, estableciéndose una infección
crónica (Zambrano-Villa et al., 2002; Peluffo et al., 2004; Piacenza et al., 2009).
Estrés oxidativo y Amastigotes
Luego de que los tripomastigotes han ingresado a células blanco, son capaces de liberarse
de la vesícula parasitófora y transformarse, en el citoplasma de la célula infectada, en
amastigotes. En algunos tipos celulares, como cardiomiocitos, esta proliferación genera “nidos de
amastigotes”, que permiten mantener la infección a lo largo de toda la vida del paciente. Se ha
demostrado que durante la fase crónica de la enfermedad existe un importante aumento del
estrés oxidativo en células cardíacas (Zacks et al., 2005; de Oliveira et al., 2007). Diversos
estudios han establecido que la producción de ROS/RNS en pacientes con cardiopatía chagásica
crónica es atribuible a dos procesos: un importante grado de infiltrado inflamatorio presente en
el miocardio y la disfunción mitocondrial que afecta a los cardiomiocitos parasitados. (Gupta et
al., 2009).
9
Es conocido que los procesos inflamatorios crónicos inducen estrés oxidativo/nitrosativo
y peroxidación lipídica mediante la generación de ROS, RNS y aldehídos, entre otros (Bartsch and
Nair, 2006). En relación a cardiopatía chagásica se ha demostrado que pacientes que cursan la
fase indeterminada de la patología presentan focos de infiltrado inflamatorio miocárdico (Higuchi
et al., 1987). Más aún, una gran cantidad de pacientes que cursan la fase crónica de la
enfermedad presentan inflamación miocárdica severa (Pereira Barretto et al., 1986; Carrasco
Guerra et al., 1987; Higuchi et al., 1987). Exámenes histopatológicos realizados en tejido
miocárdico de estos pacientes demuestran la presencia de extensos infiltrados inflamatorios de
células mononucleares, macrófagos y células T CD8+ (Higuchi, 1995; Milei, 1995), asociado a un
incremento de citoquinas proinflamatorias, NO· y actividad mieloperoxidasa a nivel plasmático
(Perez-Fuentes et al., 2003; Dhiman et al., 2009). Coincidentemente, estudios realizados en
modelo de ratones con enfermedad de Chagas crónica indican que, las reacciones inflamatorias
cardíacas se acompañan de un incremento en la producción de citoquinas proinflamatorias que,
a su vez, inducen un aumento en la generación de ROS/RNS (Machado et al., 2000; Silva et al.,
2003; Zacks et al., 2005). Por otra parte, se ha planteado que el incremento en los niveles de RNS
en el corazón de ratones infectados estaría estrechamente vinculado con lesiones típicas de la
enfermedad de Chagas en su fase crónica, como la dilatación ventricular y la disfunción sistólica
(Chandra et al., 2002).
En relación a la disfunción mitocondrial que afecta a los cardiomiocitos parasitados,
análisis de microscopía electrónica de muestras de tejido cardíaco pertenecientes a pacientes
chagásicos crónicos indican la presencia de mitocondrias con severas alteraciones morfológicas
(Garg et al., 2003; Zacks et al., 2005). Además, se ha reportado que la actividad de los complejos I
y III de la cadena transportadora de electrones mitocondrial se encuentra alterada lo que
10
conduciría a un incremento del estrés oxidativo del tejido miocárdico de ratones infectados con
T. cruzi (Vyatkina et al., 2004). La disminución de la actividad de ambos complejos también ha
sido detectada en pacientes humanos con la patología (Wen et al., 2006). Finalmente, Gupta et
al. (2009) señalan que la invasión de cardiomiocitos con amastigotes de T. cruzi induce
alteraciones en el potencial de membrana de la mitocondria que determina el incremento de la
producción de ROS. Sin embargo, un porcentaje importante de amastigotes resisten el estrés
oxidativo y sobreviven largos períodos dentro de la células hospederas (Machado et al., 2000; de
Oliveira et al., 2007; Gupta et al., 2009; Piacenza et al., 2009).
Estrés oxidativo y Epimastigotes
En el intestino medio del triatomino, los tripomastigotes de T. cruzi, presentes en la
sangre del mamífero ingerida por el insecto, se transforman a epimastigotes. Se ha descrito que
los epimastigotes también son capaces de sobrevivir al ambiente oxidativo que se genera en el
intestino medio del vector triatomino producto de la degradación de la hemoglobina presente en
la sangre ingerida por el vector (Graca-Souza et al., 2006). La hemoglobina, formada por cuatro
subunidades de globina asociadas a un grupo hem, se encuentra involucrada en muchas
reacciones biológicas, que incluyen entre otras transporte de oxígeno. El grupo hem es un anillo
tetrapirrólico (protoporfirina IX) que contiene un ión ferroso en la posición central del anillo. El
catabolismo del grupo hem genera ROS, mediante la reacción de Fenton, debido a la liberación
ión ferroso (Balla et al., 2005; Gozzelino et al., 2010).
En resumen, las tres formas celulares de T. cruzi se ven sometidas a estrés oxidativo a lo
largo del ciclo de vida del parásito. Se ha descrito una participación directa de ROS/RNS en el
control de la replicación y la sobrevivencia de T. cruzi en células infectadas, así como en modelos
11
animales de la enfermedad de Chagas (Cardoni et al., 1997). Sin embargo, la infección es
controlada pero no eliminada por el sistema inmune, estableciéndose una infección crónica en el
hospedero vertebrado (Peluffo et al., 2004). Al respecto, Fiorelli y cols. (Fiorelli et al., 2005)
describen una reactivación clínica de la enfermedad de Chagas en pacientes crónicos
inmunocomprometidos, indicando que T. cruzi sobrevive por largos periodos en el hospedero.
Considerando lo anterior, el estudio de la interacción entre el daño oxidativo y T. cruzi, junto con
los mecanismos desarrollados por el patógeno para evitar o reparar los daños inducidos por ROS
y RNS, constituyen aspectos fundamentales para la búsqueda de blancos terapéuticos eficaces.
DAÑO AL DNA POR ROS/RNS
ROS/RNS constituyen probablemente la fuente más importante de inducción de
mutaciones al DNA, causando cambios en pares de bases, reordenamientos, deleciones,
inserciones y amplificación de secuencias, entre otros, y contribuyendo en la promoción y
progresión de neoplasias (Wiseman and Halliwell, 1996).
Entre las ROS, el radical OH·- es especialmente dañino debido a su alta reactividad, ya que
puede resultar en la modificación de las distintas bases nitrogenadas del DNA. Las modificaciones
más frecuentemente generadas y estudiadas para medir daño oxidativo al DNA son 8hidroxiguanina (8-OHG; 8-oxo-G) y 8-hidroxideoxiguanosina (8-OhdG; 8-oxo-dG) (Wiseman and
Halliwell, 1996). Debido a la corta vida media del radical hidroxilo es necesario que éste sea
generado en sectores inmediatamente adyacentes al DNA para provocar daño genotóxico. En la
célula, el H 2 O 2 (debido a su alta capacidad de difundir) genera dentro del núcleo o cercano al
DNA mitocondrial, radicales OH·- (Marnett, 2000).
12
Otra molécula capaz de producir daño al DNA es el NOO·-, un oxidante extremadamente
fuerte que posee la capacidad de difundir, permitiendo la generación de daño oxidativo en
lugares distantes a su sitio de origen. El NOO·- puede interactuar con DNA por una vía de
oxidación directa o por una vía indirecta a través de mecanismos mediados por radicales libres
(Pacher et al., 2007). Es importante destacar que el NOO·- es generado en macrófagos como una
primera línea de defensa durante la fagocitosis (Hogg et al., 1992).
MECANISMOS DE EVASIÓN AL ESTRÉS OXIDATIVO Y DE REPARACIÓN DEL DAÑO AL DNA EN
Trypanosoma cruzi
Para sobrevivir y perpetuar la infección en el hospedero, los parásitos intracelulares
utilizan mecanismos que les permiten lidiar con ambientes altamente oxidantes. En la mayoría de
los organismos el sistema glutatión-glutatión reductasa es el encargado de mantener un
ambiente reductor al interior de la célula. No obstante, T. cruzi carece de este mecanismo y en
su lugar posee el sistema tripanotión-tripanotión reductasa, encargado de controlar el estrés
oxidativo en este parásito (Krieger et al., 2000; Ariyanayagam and Fairlamb, 2001; Oza et al.,
2002). Cepas de T. cruzi carentes de tripanotión-tripanotión reductasa presentan una alta
sensibilidad al estrés oxidativo (Krieger et al., 2000). Se ha sugerido que, en comparación a
células de hospederos mamíferos, T. cruzi es menos eficiente en el control de ROS/RNS {Turrens,
2004 #135).
La persistencia de estrés oxidativo puede inducir daño a macromoléculas como proteínas
y DNA, siendo este último uno de los más deletéreos para la viabilidad celular. La acumulación de
daño oxidativo en el DNA es una importante fuente de mutaciones que puede llevar incluso a la
muerte celular. Se ha visto que la acumulación de bases oxidadas, por ejemplo la formación de 8-
13
oxo-G, incrementa la frecuencia de mutaciones como sustituciones de bases, deleciones e
inserciones (Arai et al., 2002). En consecuencia, la existencia de mecanismos que aseguren la
resolución temprana del daño oxidativo al DNA son fundamentales para garantizar la sobrevida
celular.
Dentro de los mecanismos que contribuyen a la reparación del daño oxidativo al DNA se
encuentran la Reparación por Escisión de Bases (BER, Base Excision Repair), la reparación por
escisión de nucleótidos (NER, Nucleotide Excisión Repair), la reparación de bases mal apareadas,
la recombinación homóloga y la reparación de unión entre cadenas (ICL, interstrand crosslink
repair) (Slupphaug et al., 2003; Berquist and Wilson, 2012). Estos mecanismos están además
integrados con otros procesos celulares como regulación del ciclo celular, transcripción y
replicación del DNA (Slupphaug et al., 2003; Berquist and Wilson, 2012).
La vía BER es un proceso evolutivamente conservado que permite mantener la integridad
del DNA nuclear y mitocondrial. Es el principal mecanismo de reparación de daño oxidativo del
DNA y también está involucrada en la reparación de quiebres de hebra simple de DNA
(Slupphaug et al., 2003; Hegde et al., 2008; Robertson et al., 2009). En términos generales, la vía
BER utiliza dos rutas por las cuales puede reparar: la vía corta o “short-patch” que repara
nucleótidos únicos, y la vía larga o “long-patch” que reemplaza fragmentos de dos o más
nucleótidos. Las circunstancias que determinan una u otra vía aún no han sido dilucidadas
(Robertson et al., 2009).
En mamíferos, la vía BER se inicia con la escisión de una base dañada por acción de una
DNA glicosilasa que corta el enlace N-glicosídico, generando un sitio abásico (apurínico o
apirimidínico) denominado sito AP. Entre las DNA glicosilasas se encuentran aquellas que son
14
monofuncionales, es decir dejan el sitio AP intacto, o aquellas que son bifuncionales, las que
además de la actividad glicosilasa poseen actividad liasa; ésta corta en la región 3’ del sitio AP
dejando un 3’-aldehido α/β insaturado y un 5’ fosfato. El siguiente paso de la vía es realizado por
la enzima AP endonucleasa (APE1) que hidroliza el enlace 5’ fosfodiester dejando en el DNA
sitios 3’OH y 5’ deoxiribosa fosfato, disponibles para la inserción de un nuevo nucleótido. A
continuación una DNA polimerasa completa este espacio con el nucleótido correcto y finalmente
una ligasa restaura la hélice uniendo los extremos de los fragmentos reparados (figura 1)
(Mandavilli et al., 2002; Slupphaug et al., 2003; Hegde et al., 2008; Robertson et al., 2009).
Existen distintas DNA glicosilasas que pueden participar de la vía BER. La generación de
ratones carentes de alguna de ellas ha permitido demostrar que su ausencia puede ser
compensada por otras, llevando a fenotipos casi normales. Por el contrario, ratones carentes de
APE1 mueren tempranamente en el desarrollo (Robertson et al., 2009). Estos experimentos
ponen de manifiesto la necesidad de la vía BER en la sobrevida celular y paralelamente la
importancia de APE1 en la reparación del DNA mediante esta vía.
15
Figura 1: Vías de reparación del DNA por escisión de bases (BER). Tomado de Ide y Kotera, 2004.
FAMILIA APE1 Y SU HOMÓLOGO EN Trypanosoma cruzi, TcAP1
Las endonucleasas AP son enzimas pequeñas (~30-40 kDa), monoméricas, dependientes
de iones metálicos divalentes y pueden ser inactivadas por agentes quelantes de metales (Mol et
al., 2000). La principal endonucleasa AP de Homo sapiens, APE1 (HAP1, APEX o Ref1) es una
proteína ortóloga a exo III, la endonucleasa AP más importante de E. coli. En mamíferos, más del
95% de la actividad de procesamiento de sitios AP es realizada por APE1 (Marenstein et al.,
2004). La mayor parte de APE1 se mantiene en el citosol y su traslocación a núcleo es inducida
por estrés oxidativo (Mitra et al., 2007).
Como se mencionó anteriormente, la actividad de APE1 es fundamental para la
mantención del genoma y la sobrevida celular. Así, se ha observado que la deleción del gen ape1
16
determina la muerte embrionaria temprana, durante la etapa de blastocisto, en ratones
(Xanthoudakis et al., 1996). Igualmente, hasta el momento no ha sido posible obtener líneas
celulares carentes de APE1 (Ludwig et al., 1998). La utilización de RNA de interferencia en
distintas líneas celulares demostró que la disminución de la expresión de APE1 conlleva la
detención de la proliferación y un aumento de la apoptosis, asociado a una acumulación de sitos
AP en el DNA (Fung and Demple, 2005). En contraste a células de mamíferos, cepas de E. coli
carentes de exo III son viables pero sensibles a agentes oxidantes como peróxido de hidrógeno,
luz UV y rayos X (Souza et al., 2006). A su vez, estudios sobre cáncer describen una forma
dominante-negativa de APE1 que carece de actividad endonucleasa y que se une a su sustrato
(sitios AP) con una afinidad 13 veces mayor que la proteína nativa. Esta forma mutante de APE1,
denominada APE1-DN, posee dos sustituciones de aminoácidos en el sitio activo de la enzima
(residuos ácido glutámico 96 que cambia a glutamina y residuo ácido aspártico 210 que cambia a
asparagina). Ensayos bioquímicos in vitro revelan que APE1-DN no permite que APE1 nativa se
una al sitio AP, impidiendo la remoción del azúcar-fosfato remanente, bloqueando la vía BER. Por
otra parte, células de mamífero que sobreexpresan la forma APE1-DN y que son sometidas a
agentes genotóxicos, presentan una elevada acumulación de sitios AP que determinan la muerte
celular (McNeill and Wilson, 2007).
Resultados obtenidos en nuestro laboratorio sugieren que la vía BER se encuentra activa
en T. cruzi ya que se observó que la viabilidad de epimastigotes y tripomastigotes sometidos a
diferentes concentraciones de H 2 O 2 o NOO·- disminuye significativamente cuando se tratan
simultáneamente con metoxiamina, un inhibidor de la vía BER (Cabrera et al., 2011). Debido a
que metoxiamina impide el reconocimiento de los sitios AP por las endonucleasas AP, estos
resultados sugieren que en ambas formas celulares debería expresarse alguna endonucleasa de
17
este tipo. En T. cruzi se ha descrito la secuencia del gen ape1 (tcap1) y se ha demostrado que la
complementación de cepas de E. coli carentes de exo III con el gen que codifica para la proteína
TcAP1 les confiere resistencia frente a agentes oxidantes y alquilantes (Perez et al., 1999).
En mamíferos, también se ha descrito la existencia de una segunda endonucleasa AP
llamada APE2. Esta enzima presenta una baja actividad endonucleasa AP, pero alta actividad 3’
fosfodiesterasa y exonucleasa 3’- 5’ (Burkovics et al., 2006). Se ha demostrado que frente al
tratamiento con H 2 O 2 APE2 se redistribuye en el núcleo en focos que colocalizan con PCNA
(antígeno nuclear de proliferación celular). PCNA estimularía la función exonucleasa 3’- 5’ y
permitiría reducir las consecuencias mutagénicas inducidas por el estrés oxidativo (Burkovics et
al., 2006; Burkovics et al., 2009). Por otra parte, ratones carentes de APE2 son viables pero
presentan un menor tamaño y una moderada alteración de la linfopoyesis (Ide et al., 2004).
En otros eucariontes se ha demostrado que homólogos de APE2 pueden tener un rol
fundamental en la reparación del daño oxidativo del DNA y la sobrevida celular, llegando a ser
incluso más importantes que homólogos de APE1. Por ejemplo, estudios en Arabidopsis thaliana
demostraron que existen tres genes que tienen homología con endonucleasas AP de bacterias,
levaduras y mamíferos: Ape1L, Ape2 y Arp. La mutación de cada una de estas enzimas por
separado genera semillas con fenotipos aparentemente normales, sin embargo la mutación de
Ape1L en conjunto con Ape2 lleva a la detención del desarrollo durante el período embrionario
(Murphy et al., 2009). Por otra parte, estudios en Schizosaccharomyces pombe demuestran que
Apn2p, una endonuleasa AP que comparte homología con Exo III, APE2 de mamíferos y Apn2p
de Saccharomyces cerevisiae, es la más importante para esta levadura, a diferencia de S.
18
cerevisiae donde Apn1p es la endonucleasa AP de mayor relevancia (Ribar et al., 2004;
Tanihigashi et al., 2006).
La secuencia del gen que codifica para APE2 también se encuentra en T. cruzi (TcAP2,
genbank accesion nro. 71654547), sin embargo hasta ahora no se han realizado estudios sobre su
probable expresión y/o función.
La confirmación de la participación de la vía BER en la resistencia de T. cruzi al daño
oxidativo al DNA a través de la activación de endonucleasas AP específicas del parásito, haría
factible el comienzo de la búsqueda de inhibidores específicos de dichas enzimas sin afectar las
endonucleasas AP del paciente, fundamentalmente para el tratamiento de la fase crónica de la
enfermedad de Chagas. Estos inhibidores podrían potenciar el efecto citotóxico del daño
oxidativo al DNA generado por cardiomiocitos y células del sistema inmune innato.
En resumen, las secuencias de las endonucleasas AP TcAP1 y TcAP2 de T. cruzi exhiben
homología de secuencia aminoacídica con endonucleasas AP de otros eucariontes,
principalmente en residuos críticos presentes en la región catalítica de la enzima. Por otra parte,
se ha demostrado que la complementación de cepas de E. coli carentes de exo III con el gen que
codifica para la proteína TcAP1 les confiere resistencia frente a agentes oxidantes. Sin embargo,
no existen datos en la literatura acerca de la actividad enzimática de TcAP1 y TcAP2. Tampoco se
ha determinado la relevancia de estas enzimas en la reparación de daño oxidativo al DNA en T.
cruzi. Por lo tanto, en esta tesis se propone la siguiente hipótesis:
19
HIPÓTESIS
TcAP1 y TcAP2 se expresan en las distintas formas celulares de T. cruzi y su inhibición incrementa
la sensibilidad de estos parásitos frente a daño oxidativo del DNA.
OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la expresión, funcionalidad e importancia de TcAP1 y TcAP2 en la sobrevida
de Trypanosoma cruzi sometido a estrés oxidativo.
Objetivos específicos
1_ Comprobar la expresión de TcAP1 y TcAP2 en T. cruzi
2_ Comprobar la funcionalidad de TcAP1, TcAP2 y dominantes negativos de ambas proteínas por
ensayos in vitro
3_ Generar cepas de T. cruzi que sobreexpresen las proteínas nativas y dominantes negativos de
TcAP1 y TcAP2. Evaluar su viabilidad en condiciones de estrés oxidativo.
20
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Cultivos celulares
El cultivo de epimastigotes de T. cruzi (cepa Dm28c) se realizó en medio Diamond
(Diamond, 1968) suplementado con 10% de suero fetal bovino, hemina 75 µM y antibióticos
(penicilina 75 U/ml y estreptomicina 75 µg/ml). Los cultivos de epimastigotes fueron mantenidos
a 28º C.
Tripomastigotes de la cepa Dm28c se obtuvieron mediante la infección de células Vero
mantenidas en medio RPMI 1640 con 5% de suero fetal bovino. Las células fueron infectadas
durante 24 hrs con tripomastigotes obtenidos desde cultivos celulares previamente infectados
con dicha cepa. Alrededor del día 4 los tripomastigotes liberados al medio fueron obtenidos y
purificados mediante centrifugación. Por otra parte, la obtención de la forma celular amastigote
se realizó de manera similar, pero infectando células Vero con un alto número de
tripomastigotes. De este modo, es posible generar una sobreinfección con la consecuente
ruptura temprana de las células Vero, permitiendo la liberación de amastigotes.
2. Generación de las proteínas recombinantes TcAP1 y TcAP2
2.1 Clonamiento de tcap2 en pQE-80L
Basados en análisis bioinformáticos realizados previamente, se identificó la región
codificante para la endonucleasa apurínica/apirimidínica 2 de T. cruzi (tcap2, genbank accesion
nro. 71654547). Utilizando dicha secuencia se generaron partidores específicos para amplificar la
secuencia nucleotídica de tcap2 mediante ensayos de PCR, utilizando DNA genómico de T. cruzi
21
como molde (tamaño del amplificado esperado de 1839 pb) y DNA polimerasa Taq Platinum®
(Invitrogen).
Los
partidores
diseñados
fueron:
sentido
5’-
GGGGTACCATGTTTATCATTAGTTGGAATGTG-3’, que presenta una cola nucleotídica con el sitio de
corte para las enzima de restricción Kpn I en color rojo y antisentido
5’-
CCCAAGCTTTTAGGAAATAACATCGGTAATTTC-3’, que presenta una cola nucleotídica con el sitio de
corte para las enzima de restricción Hind III en color azul. La secuencia amplificada de tcap2 fue
purificada a partir de geles de agarosa 1% p/v, en buffer TBE pH 8.0, utilizando el kit SV Gel and
PCR Clean-Up System® (Promega) según las instrucciones del fabricante. El producto de PCR fue
sometido a digestión con las enzimas de restricción Kpn I y Hind III; el fragmento obtenido se
insertó en el vector de expresión pQE-80L (QIAGEN). Este vector genera una proteína de fusión
con 6 histidinas en el extremo amino-terminal. Para el ligamiento del fragmento amplificado de
las secuencia codificante para TcAP2 en el vector de expresión se utilizó DNA ligasa T4 (Promega).
Bacterias E. coli pLysE BL21 fueron transformadas con el constructo pQE-80L-tcap2 mediante
electroporación. Las colonias resultantes fueron evaluadas mediante PCR y ensayos de restricción
con las enzimas Kpn I y Hind III para comprobar la presencia del inserto en el constructo.
Finalmente, el constructo fue analizado mediante secuenciación automática de DNA.
2.2 Obtención de las proteínas recombinantes TcAP1 y TcAP2 en condiciones denaturantes
Para obtener las proteínas TcAP1 y TcAP2 en condiciones denaturantes se aplicó la
técnica de cromatografía de afinidad en columnas de níquel que permite la retención de
proteínas de fusión con cola de histidinas. Para tales propósitos se amplificaron bacterias
transformadas con el constructo pQE-80L-tcap1-ΔN (generada previamente en el laboratorio de
Biología Celular y Molecular, ICBM, Universidad de Chile) (Fernández, 2009) o el constructo pQE-
22
80L-tcap2, obtenido en punto 2.1, en 250 ml de medio LB-ampicilina hasta alcanzar una OD 595nm
de 0,6 - 0,8. La expresión de la proteína fue inducida con IPTG 0,5 mM durante toda la noche a
37ºC. Posteriormente, las bacterias fueron suspendidas e incubadas en una solución de lisis (6 M
GuHCl; 0,1 M NaH 2 PO 4 ; 0,01 M Tris-Cl ajustado a pH 8,0) durante 45 minutos, sonicadas y
centrifugadas para separar el sobrenadante conteniendo la proteína de interés. Las proteínas se
cargaron en una columna de níquel-agarosa, la que posteriormente fue lavada con una solución 8
M urea; 0,1 M NaH 2 PO 4 ; 0,01 M Tris-Cl ajustado a pH 6,3. La elusión de las proteínas retenidas en
la columna se realizó con una solución 8M urea; 0,1 M NaH 2 PO 4 ; 0,01 M Tris-Cl ajustado a pH 4,5
en fracciones de aproximadamente 500 µl. Las proteínas purificadas fueron dializadas a 4º C
durante toda la noche en PBS y posteriormente almacenadas a -20º C.
2.3 Generación de TcAP1 y TcAP2 recombinantes en diferentes modelos de expresión
Debido a resultados obtenidos previamente que señalan que la expresión de la proteína
recombinante TcAP1 es altamente tóxica en bacterias y que TcAP2 expresada en bacterias forma
cuerpos de inclusión insolubles, se procedió a obtener las proteínas recombinantes en modelos
eucariontes. Para ello se utilizaron vectores de expresión para levaduras Saccharomyces
cerevisiae (pYES2, Invitrogen) y Pichia pastoris (pPICZ, Invitrogen), así como en células S2 de
Drosophila melanogaster (pMT/V5, Invitrogen) y el tripanosomátido
Leishmania tarentolae
(pLEXSY, Jena Bioscience) que generan una proteína de fusión con 6 histidinas.
Para la obtención de amplificados de secuencias de DNA codificantes para las
endonucleasas TcAP1 (1218 pb) y TcAP2 (1839 pb) de T. cruzi se empleó la técnica de reacción de
polimerasa en cadena (PCR) utilizando DNA genómico de T. cruzi como DNA molde. Los
partidores específicos para ambos genes fueron diseñados para insertarlos de manera dirigida en
23
los diferentes vectores de expresión. Para insertar los genes tcap1 y tcap2 en el vector de
expresión pYES2 se diseñaron oligonucleótidos partidores sentido con sitios de corte para la
enzima Hind III (en rojo) y antisentido con sitios de corte para Xba I (en azul). Para insertar ambos
genes en el vector de expresión pPICZ se diseñaron oligonucleótidos partidores sentido y
antisentido con sitios de corte para la enzima Xba I (en rojo). Para el uso del vector de expresión
pMT/V5 se diseñaron oligonucleótidos partidores sentido con un sitio de corte para Spe I (en
rojo) para tcap1 y con un sitio de corte para Kpn I (en rojo) para tcap2, así como oligonucleótidos
partidores antisentido con un sitio de corte para Age I (en azul) para ambos genes. Finalmente,
para insertar ambos genes en el vector de expresión pLEXSY se diseñaron oligonucleótidos
partidores sentido con un sitio de corte para Bgl II (en rojo) para ambos genes y oligonucleótidos
partidores antisentido con un sitio de corte para Nhe I para tcap1 y Kpn I para tcap2 (en azul).
Las secuencias nucleotídicas de los oligonucleótidos partidores, para cada endonucleasa y
para cada vector de expresión, son los que se muestran a continuación. En gris se destacan las
secuencias Kozak presentes en los oligonucleótidos partidores sentido, diseñados para P. pastoris
y D. melanogaster:
Oligonucleótidos partidores utilizados para amplificar tcap1:
Modelo de levaduras S. cerevisiae.
-
Sentido pYES2: CCCAAGCTTACTATGGGAGGAATCGCATCAC
-
Antisentido pYES2: GCTCTAGATCACCTGCGCAGCCACATC
Modelo de levaduras P. pastoris.
-
Sentido pPICZ B: AGTCTAGAGCAATGGGAATGCCGTCGGGACCTAAGG
-
Antisentido pPICZ B: GCTCTAGACCCCTGCGCAGCCACATCTGC
Modelo de células S2 de D. melanogaster.
-
Sentido pMT/V5: GACTAGTGCAATGGGAATGCCGTCGGGACCTAAGG
-
Antisentido pMT/V5: CACACCGGTCCTGCGCAGCCACATCTGC
Modelo de L. tarentolae.
-
Sentido pLEXSY: GGAAGATCTGCCATGCCGTCGGGACCTAAGG
24
-
Antisentido pLEXSY: CTAGCTAGCCCTGCGCAGCCACATCTGC
Oligonucleótidos partidores utilizados para amplificar tcap2:
Modelo de levaduras S. cerevisiae.
-
Sentido pYES2: CCCAAGCTTACTATGGGAGGATCGCATCAC
-
Antisentido pYES2: GCTCTAGATTAGGAAATAACATCGGTAATTTC
Modelo de levaduras P. pastoris.
-
Sentido pPICZ: AGTCTAGAGCAATGGGAATGTTTATCATTAGTTGGAATGTG
-
Antisentido pPICZ: GCTCTAGACCGGAAATAACATCGGTAATTTCAAT
Modelo de células S2 de D. melanogaster.
-
Sentido pMT/V5: GGGGTACCGCAATGGGAATGTTTATCATTAGTTGGAATGTG
-
Antisentido pMT/V5: CACACCGGTGGAAATAACATCGGTAATTTCAAT
Modelo de L. tarentolae.
-
Sentido pLEXSY: GGAAGATCTGCCATGTTTATCATTAGTTGGAATGTG
-
Antisentido pLEXSY: GGGGTACCGGAAATAACATCGGTAATTTCAAT
Las secuencias amplificadas fueron purificadas a partir de geles de agarosa 1% p/v, en
buffer TBE pH 8.0, utilizando el kit SV Gel and PCR Clean-Up System® (Promega) según las
instrucciones del fabricante. Los productos de PCR fueron sometidos a digestión con las enzimas
de restricción e insertadas en los vectores de expresión correspondientes utilizando DNA ligasa
T4 (Promega). Los constructos obtenidos fueron analizados mediante secuenciación automática
de DNA.
Los constructos fueron transfectados en los distintos organismos antes descritos
mediante electroporación, según las indicaciones de los fabricantes. La expresión de las distintas
proteínas recombinantes fue evaluada mediante ensayos de western blot utilizando anticuerpos
específicos anti histidina (Biotech) en una dilución de 1:5000 en PBS-Tween 0,05% v/v. Se utilizó
los anticuerpos secundarios anti ratón conjugado con fosfatasa alcalina en una dilución 1:2000
v/v o conjugado con peroxidasa de rábano en una dilución 1:10000 v/v, ambos en PBS-Tween
0,05%. El revelado se logró por la adición de los sustratos colorimétricos NBT/Bcip® (Promega) o
25
mediante quimioluminiscencia utilizando el kit West pico Chemioluminescent (Pierce),
respectivamente.
La generación de anticuerpos policlonales específicos para las proteínas TcAP1 y TcAP2,
se realizó utilizando distintos protocolos. Inicialmente se desarrolló la obtención de sueros
hiperinmunes obtenidos desde conejos inmunizados con ambas proteínas obtenidas en 2.2
(Servicio de Generación de Anticuerpos Policlonales, Laboratorio Inmunología de la Agresión
Microbiana, Programa de Inmunología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile) según la técnica descrita por Ferreira et al. (Ferreira et al., 2004). Estas
proteínas también fueron utilizadas para obtener sueros hiperinmunes de ratones inmunizados
con el mismo protocolo. Finalmente, se encargó a la empresa AbBcn la generación de péptidos
sintéticos inmunogénicos de TcAP1 y TcAP2 y la obtención de anticuerpos policlonales
purificados contra ellos, los que fueron evaluados mediante ensayos de western blot utilizando
homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes de T. cruzi como se señala en 3.
2.4 Obtención de la proteína TcAP2 en condiciones nativas
Para la purificación de la proteína recombinante TcAP2, líneas celulares de L. tarentolae,
transfectadas con el constructo pLEXSY-tcap2, fueron cultivadas en 100 ml de medio BHI (brain
heart infusión, Gibco) suplementado con hemina (500 ng/ml) y penicilina/estreptomicina (50
U/ml y 50 µg/ml, respectivamente) durante 24 hrs. Posteriormente, las células fueron
centrifugadas 10 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente, suspendidas en 5 ml de buffer de
lisis para purificación de proteínas nativas (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM pH
8,0, Tritón X-100 1%, glicerol 10%) e incubadas durante 30 minutos con agitación a 4º C. Luego las
muestras se sonicaron durante 1 minuto en hielo. El lisado resultante fue centrifugado a 10.000 x
26
g durante 15 minutos a 4º C. El sobrenadante, conteniendo la proteína de interés, fue transferido
a una columna de agarosa-níquel la que posteriormente fue lavada con 20 ml de buffer de lavado
(Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM pH 8,0, Tritón X-100 1%, glicerol 10%). La
elusión de la proteína recombinante TcAP2 se realizó utilizando 10ml de buffer de elusión (Tris 50
mM pH 8,0, NaCl 200 mM, imidazol 300 mM, pH 8,0, Tritón X-100 1%, glicerol 10%) tomando
alícuotas secuenciales de 500 µl. Finalmente se detectó la presencia de TcAP2 recombinante
mediante ensayos de western blot utilizando los anticuerpos anti-his y anti-TcAP2 (dilución
1:2000 v/v).
3. Identificación de TcAP1 y TcAP2 en T. cruzi
Para identificar la expresión de TcAP1 y TcAP2 en T. cruzi se realizaron ensayos de
western blot sobre lisados de epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes, utilizando
anticuerpos policlonales específicos anti-TcAP1 y anti-TcAP2 obtenidos en 2.4. Para tales efectos,
los lisados de las distintas formas celulares de T. cruzi fueron separados electroforéticamente
mediante SDS-PAGE en geles de acrilamida al 10%. Las proteínas fueron transferidas a
membranas de nitrocelulosa que posteriormente fueron bloqueadas con una solución de 5% de
albúmina de suero bovino (BSA) en PBS por 2 h a 37º C. Las membranas fueron incubadas durante
toda la noche a 4º C con anticuerpos de conejo anti-TcAP1 o anti-TcAP2 en una dilución de 1:2000
en PBS-Tween 0,05% v/v. Posteriormente las membranas fueron lavadas con PBS-Tween 0,05% e
incubadas con un anticuerpo secundario cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano
(Jackson ImmunoResearch) en una dilución 1:10000 en PBS-Tween 0,05% v/v. El revelado se
realizó mediante quimioluminiscencia utilizando el kit West pico Chemioluminescent (Pierce),
según las instrucciones del fabricante.
27
Para evaluar modificaciones en los niveles de expresión de las proteínas TcAP1 o TcAP2
en epimastigotes y tripomastigotes, sometidos a diferentes concentraciones y tiempos con
agentes oxidantes, se realizaron ensayos de western blot de la misma forma como se menciona
anteriormente. Para ello, 12x106 parásitos fueron expuestos a 200 y 500 µM de H 2 O 2 o NOOdurante 0, 15, 30, 60 y 240 minutos a 28º C. Por otra parte, 12x106 parásitos fueron expuestos a
concentraciones crecientes de H 2 O 2 (2, 5, 100, 200, 500 y 1000 µM) durante 30 minutos a 28º C.
La identificación de TcAP1 y TcAP2 se realizó utilizando los anticuerpos específicos generados
durante esta tesis. Como control de carga se verificó los niveles de expresión de α-tubulina
1:14000 en PBS-Tween 0,05% v/v, empleando un anticuerpo monoclonal específico (Sigma).
4. Generación de dominantes negativos (DNs) de las proteínas TcAP1 y TcAP2
Los residuos nucleotídicos a mutar para generar los DNs de las proteínas TcAP1 y TcAP2
fueron determinados basándonos en los estudios realizados previamente por McNeill y Wilson
(McNeill and Wilson, 2007) sobre generación de dominantes negativos de la endonucleasa
apurínica/apirimidínica APE1 (H. sapiens). En consecuencia, a partir de la secuencia génica
codificante de las proteínas TcAP1 y TcAP2, se diseñaron oligonucleótidos partidores que
incluyen las mutaciones E-Q (ácido glutámico por glutamina) y D-N (ácido aspártico por
asparragina):
TcAP1 E-Q forward: GCGTTGTGTCTGCAGCAAACGAAGCTGAACCCG
TcAP1 D-N forward: GTTTCATCTGGGCAGGCAACCTGAATGTCGCCG
TcAP2 E-Q forward: CATTGTTTGCCTACAGCAAGTGAAGGGGTCGTG
TcAP2 D-N forward: GTCATTTTGCTAGGGAATTTGAATCAGACATATCGAGCGG
La mutación de la secuencia nucleotídica codificante de TcAP1 y TcAP2 para la generación
de los dominantes negativos se realizó utilizando los oligonucleótidos partidores diseñados y el
28
kit QuikChange® Lightning Site-Directed Mutagenesis (Stratagene), utilizando como DNA molde
los plasmidios pMT/V5-tcap1 y pMT/V5-tcap2 (por tener un tamaño menor que los otros
plasmidios generados durante esta tesis). De esta forma se generó en primer lugar la mutación EQ y luego la mutación D-N.
Cada plasmidio amplificado fue tratado con Dpn I para digerir el DNA parental (metilado y
hemimetilado) y conservar el plasmidio amplificado que contiene las secuencias mutadas. El
producto resultante fue transformado en bacterias XL1-blue para sellar los cortes y amplificar el
plasmidio resultante. Finalmente cada plasmidio mutado fue secuenciado automáticamente y
utilizado para obtener, mediante PCR, la secuencia nucleotídica codificante de cada dominante
negativo con el objetivo de insertarlos en el vector de expresión de T. cruzi pTREX.
5. Ensayos para comprobar actividad enzimática de TcAP1, TcAP2 y sus DNs
Con el objetivo de detectar la actividad enzimática AP de epimastigotes de T. cruzi se
diseñó un oligonucleótido sintético de 24 mer con un uracilo en la posición 8 (figura 2). Este
uracilo puede ser escindido por la actividad de una uracil DNA glicosilasa (UDG) dando origen a
un oligonucleótido con un sitio abásico AP (oligo AP). El oligonucleótido fue marcado en 5’ con
Pγ32, utilizando el kit DNA 5’ End Labeling System (Promega), y alineado con el oligonucleótido
complementario no marcado. Paralelamente fueron obtenidos extractos de proteínas totales de
epimastigotes en fase exponencial de crecimiento mediante incubación en buffer de lisis AP
durante 2 hrs a 4º C (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM KCl, 1 mM EDTA, 20% v/v glicerol, 0,25% v/v
Nonidet P-40, 1 mM DTT, cocktail inhibidores proteasas (Roche)). El lisado resultante fue
centrifugado a 25000 x g durante 10 minutos a 4º C y el sobrenadante (extracto proteico) fue
cuantificado mediante el método del ácido bicinconínico (BCA) para determinar la concentración
29
de proteínas. Posteriormente 50 µg del extracto proteico fueron incubados con ~2 pg de oligo AP
previamente tratado o no con la enzima UDG de E. coli (New England Biolabs) en buffer BER (50
mM hepes KOH pH7,8, 0,36% p/v BSA, 70 mM KCl, 5 mM MgCl 2 y 0.5 mM DTT) durante 2 hrs a
30º C. Luego las muestras fueron calentadas a 75º C por 10 minutos para inactivar las enzimas
presentes en la reacción y se agregó 1 volumen de buffer de carga con formamida (96% v/v
formamida, 20 mM EDTA, 5 mM Tris pH 7,5, xylene cyanol 0,05% p/v, azul de bromofenol 0,05%
p/v). Las muestras fueron separadas electroforéticamente en geles denaturantes de formamidaacrilamida (acrilamida 20% p/v). Posteriormente, la radiactividad fue detectada utilizando un
equipo phosphorimager (BioRad). Como control negativo de la reacción el oligonucleótido AP fue
incubado con 1U de UDG, en ausencia de endonucleasa AP. Como control positivo el
oligonucleótido AP fue incubado con 1U de UDG y 1U de Exonucleasa III (endonucleasa AP de E.
coli, New England Biolabs) en buffer BER, generándose un fragmento de 7 mer.
Oligo-AP
5’- CCG CTA GUG GGT ACC GAG CTC GAAT-3’
Figura 2: Diseño de oligonucleótido para la determinación de la actividad endonucleasa AP.
Para evaluar la capacidad de T. cruzi de reparar un sitio AP, se incubó extractos proteicos de
epimastigotes con el oligonucleótido AP (de la forma descrita previamente) junto con 20 µg
dNTP, en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de ATP. La regeneración de la
sonda de 24 mer fue considerada como reparación del sitio AP.
Con el objetivo de determinar si metoxiamina es capaz de inhibir la actividad endonucleasa
AP de T. cruzi se incubó extractos proteicos de epimastigotes, o la proteína TcAP2 recombinante,
30
con el oligonucleótido AP (previamente tratado con UDG en presencia o ausencia de 10 mM de
metoxiamina) a 30º C durante distintos tiempos de forma similar a lo mencionado previamente.
Finalmente, se determinó la inhibición de la actividad endonucleasa AP ejercida por APE1-DN,
un dominante negativo de la enzima APE1 (homologa humana de TcAP1) sobre las enzimas del
parásito. La secuencia nucleotídica de APE1-DN (generada en el laboratorio de Biología Celular y
Molecular, ICBM, Universidad de Chile) se insertó en el plasmidio pYUKO, que corresponde al
plásmido pTREX con una modificación que agrega una cola de 8 histidinas en la región aminoterminal de la proteína generada. Utilizando epimastigotes transfectados con este plasmidio
(como se detalla a continuación) se purificó la proteína recombinante APE1-DN. Para evaluar la
capacidad de inhibir la endonucleasa recombinante TcAP2 se realizaron incubaciones de ésta
enzima con concentraciones crecientes de APE1-DN en conjunto con la sonda AP previamente
tratada con UDG durante 2 hrs a 30º C. En todos los casos la visualización de los resultados se
realizó como se describió previamente.
6. Generación de cepas de T. cruzi que sobreexpresen TcAP1 y TcAP2 nativas y sus DNs
Para generar cepas de T. cruzi que sobreexpresen TcAP1, TcAP2 y los respectivos
dominantes negativos, se utilizó el vector pTREX, que genera una proteína de fusión con GFP
(proteína fluorescente verde). Se ha descrito que este sistema de transfección de DNA es estable
en T. cruzi (Vazquez and Levin, 1999). Los partidores diseñados fueron: sentido 5’GCTCTAGAATGCCGTCGGGACCTAAGG-3’
para
TcAP1
y
sentido
5’-
GCTCTAGAATGTTTATCATTAGTTGGAATGTG-3’ para TcAP2, ambos con una cola nucleotídica con
el sitio de corte para las enzima de restricción Xba I en color rojo, y antisentido
5’-
CCCAAGCTTCCTGCGCAGCCACATCTGC
5’-
-3’,
para
31
TcAP1
y
antisentido
CCCAAGCTTGGAAATAACATCGGTAATTTCAAT -3’ para TcAP2, ambos con una cola nucleotídica
con el sitio de corte para las enzima de restricción Hind III en color azul. Con estos partidores se
amplificaron las secuencias nucleotídicas que codifican cada una de las proteínas mediante
ensayos de PCR. Las secuencias amplificadas fueron purificadas a partir de geles de agarosa 1%
p/v, en buffer TBE pH 8.0, utilizando el kit SV Gel and PCR Clean-Up System® (Promega) según las
instrucciones del fabricante. Los productos de PCR fueron sometidos a digestión con las enzimas
de restricción e insertadas en el vector de expresión pTREX utilizando DNA ligasa T4 (Promega).
La presencia de la secuencia nucleotídica codificante para cada endonucleasa AP en el vector fue
comprobada por PCR, digestión con enzimas de restricción y secuenciación automática de DNA.
Posteriormente, epimastigotes en fase exponencial de crecimiento fueron electroporados
con los plasmidios pTREX-gfp, pTREX-gfp-tcap1, pTREX-gfp-tcap1-DN, pTREX-gfp-tcap2 y pTREXgfp-tcap2-DN. Los parásitos fueron contados y lavados en PBS estéril. Luego fueron
resuspendidos en medio de electroporación (120 mM KCl, 0.15 mM CaCl, 10 mM K 2 HPO 4 , 25 mM
Hepes, 2 mM EDTA, 5 mM MgCl 2 , pH 7.6) a una concentración de 1x108 parásitos/ml. Se tomaron
400 µl de los parásitos resuspendidos y se incubaron con 50-100 µg de cada plasmidio. Se
electroporó con 0.3 kV y 500 µF en dos pulsos, separados por un intervalo de 10 segundos en
hielo. Inmediatamente los parásitos fueron transferidos a medio Diamond con 20% FBS y se
incubaron por 24 hrs. Posteriormente se agregó el antibiótico G418 a una concentración de 250
µg/ml para seleccionar los parásitos que poseían el plasmidio. Esta concentración de antibiótico
fue mantenida durante 48 hrs y posteriormente se aumentó a 500 µg/ml. La evaluación del
porcentaje de transformación de los epimastigotes se realizó por observación al microscopio de
fluorescencia a partir de la tercera semana post-transfección, utilizando un filtro de 520±20 nm,
que permite la identificación de fluorescencia verde. La comprobación de la expresión de cada
32
proteína se realizó mediante ensayos de western blot utilizando un anticuerpo monoclonal antiGFP (Thermo Scientific) en una dilución 1:5000 en PBS-Tween 0,05% v/v y los anticuerpos antiTcAP1 y anti-TcAP2 generados durante esta tesis en una dilución 1:2000 en PBS-Tween 0,05%
v/v. La intensidad de las bandas obtenidas fue analizada mediante densitometría utilizando el
programa Scion Image 4.0.2 para comparar el nivel de expresión de las diferentes proteínas.
7. Localización subcelular de las proteínas recombinantes TcAP1-GFP y TcAP2-GFP expresadas
en epimastigotes de T. cruzi transfectados.
La
localización
subcelular
de
TcAP1-GFP y
TcAP2-GFP se
realizó mediante
inmunodetección de GFP sobre extendidos de parásitos transfectados, fijados con metanol 70%
frio durante 30 minutos. Para tales efectos, las muestras fueron tratadas con solución de bloqueo
(BSA 1% p/v, saponina 0,1 %v/v, suero de ternero 3% v/v en PBS) durante 2 horas a 37° C e
incubadas con un anticuerpo primario monoclonal de ratón anti-GFP (Thermo Scientific) en una
dilución 1:100 v/v en solución de bloqueo durante toda la noche a 4° C. Posteriormente, los
extendidos fueron lavados con PBS e incubados con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón
conjugado con el fluorocromo Alexa 488 (Molecular Probes) en una dilución 1:300 v/v en
solución de bloqueo. Finalmente, las muestras fueron sometidas a contra-tinción nuclear con
DAPI, montadas y visualizadas con un microscopio de fluorescencia. Las fotografías fueron
obtenidas con filtro 430±20 nm para evidenciar fluorescencia azul (DAPI) y con filtro 520±20 nm,
que permite la identificación de fluorescencia verde (Alexa fluor 488). Las fotografías fueron
procesadas computacionalmente para determinar la sobreposición de DAPI (utilizando
pseudocolor rojo) con Alexa fluor 488 (verde).
33
8. Evaluación de la viabilidad de cepas mutantes frente a estrés oxidativo
Para evaluar si la sobreexpresión de TcAP1 o TcAP2 incrementa la viabilidad de T. cruzi
frente a estrés oxidativo los parásitos transfectados fueron tratados con diferentes
concentraciones de H 2 O 2 o NOO·- durante 30minutos a 28ºC (200, 350 y 500 µM H 2 O 2 ; 200, 500
y 1000 µM de NOO·-). Posteriormente se incubaron en medio fresco durante 4 horas para
permitir su recuperación (reparación de DNA). La viabilidad de los parásitos fue evaluada
mediante la reducción mitocondrial de sales de tetrazolio (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)2,5 difeniltetrazolio) a formazán, un producto de coloración púrpura y cuya absorbancia es
directamente proporcional al número de células vivas en el medio (ensayo de MTT) (Muelas et
al., 2002).
9. Estadística
Los resultados obtenidos en cada experimento fueron analizados estadísticamente con el
software GraphPad Prism versión 5. En todos los casos los resultados representan el promedio
de 3 experimentos ± el error estándar de la media. Se aplicó análisis de varianza (ANOVA) de dos
vías con corrección de Bonferroni para múltiples comparaciones, a fin de determinar diferencias
significativas.
10. Bioseguridad
Los experimentos previamente descritos fueron realizados en el laboratorio bajo las
normas establecidas por la Unidad de Prevención de Riesgos y Bioseguridad de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Chile (anexo 1).
34
RESULTADOS
Objetivo específico 1_ Comprobar la expresión de TcAP1 y TcAP2 en T. cruzi
I.
Obtención de la proteína recombinante TcAP2 en bacterias E.coli BL21
El gen de TcAP2 fue amplificado desde DNA genómico de T. cruzi mediante PCR (tamaño
del amplificado esperado de 1839 pb), utilizando partidores específicos con sitios de restricción
para las enzimas Kpn I y Hind III para el clonamiento direccionado en el vector de expresión
pQE80L. El producto de PCR digerido fue insertado en dicho vector para generar el constructo
recombinante pQE80L-tcap2, el cual fue electroporado en bacterias E. coli de la cepa BL21. El
constructo aislado de las bacterias fue analizado mediante digestión con enzimas de restricción,
para observar la liberación del inserto (figura 3A) y ensayos de PCR, utilizando el constructo
generado como DNA molde (figura 3B), confirmando la presencia del inserto.
35
A
2
1
3
4
B
1
2
3
C
4
SDS-PAGE 10%
1
2
3
4
WESTERN BLOT
5
6
7
8
9
10
79
3000
2000
3000
2000
64
49
1000
37
1000
Figura 3: Generación de la proteína recombinante TcAP2. El gen tcap2 (←) fue clonado en el vector
pQE80L para su expresión en E. coli. A) Identificación mediante digestión enzimática de la presencia de
tcap2 en el constructo pQE80L-tcap2. 1: marcador de fragmentos de DNA cada 100 pb (Promega); 2:
control positivo (amplificado de tcap2 mediante PCR, utilizando DNA genómico de T. cruzi como molde); 3:
vector pQE80L-tcap2 sin digerir; 4: vector pQE80L-tcap2 digerido con enzimas de restricción Kpn I y Hind
III. B) Comprobación mediante PCR de la presencia de tcap2 en el constructo generado. 1: marcador de
fragmentos de DNA cada 100 pb (Promega); 2: control positivo (amplificado de tcap2 mediante PCR,
utilizando DNA genómico de T. cruzi como molde); 3: control negativo de la técnica de PCR sin DNA molde;
4: amplificado de tcap2 utilizando el constructo pQE80L-tcap2 como DNA molde. C) Inducción de la
expresión de la proteína TcAP2 (←) en bacterias E. coli transformadas con el constructo pQE80L-tcap2. Las
fracciones purificadas en columnas de níquel fueron evaluadas mediante SDS-PAGE 10% y ensayos de
western blot utilizando un anticuerpo anti-histidina. 1: lisado de proteínas totales de bacterias inducidas
para la expresión de TcAP2 recombinante; 2-5: alícuotas de elusiones obtenidas desde la columna de
níquel; 6: marcador de tamaño molecular en kDa (Invitrogen); 7-10: alícuotas de elusiones obtenidas
desde la columna de níquel reconocidas por el Ac anti-histidina.
La inducción con IPTG de las bacterias transformadas con pQE80L-tcap2 genera el
aumento en la expresión de una proteína de aproximadamente 68kD, la cual correspondería con
la masa esperada para la proteína TcAP2 fusionada con un hexámero de histidinas, dispuestos en
el carboxilo terminal. Esta proteína fue purificada utilizando columnas de níquel-agarosa y
reconocida mediante el uso de anticuerpos anti-histidina (figura 3C). La banda purificada fue
extraída desde un gel de poliacrilamida y enviada a un laboratorio externo para su identificación
mediante
espectrometría
de
masa
(MALDI-TOF).
Se
identificaron
nueve
péptidos
correspondientes con la secuencia teórica de TcAP2. Esto confirma que la proteína recombinante
TcAP2 fue generada correctamente (figura 4).
36
TcAP2
Maldi-TOF
TcAP2
Maldi-TOF
TcAP2
Maldi-TOF
TcAP2
Maldi-TOF
TcAP2
Maldi-TOF
TcAP2
Maldi-TOF
TcAP2
Maldi-TOF
TcAP2
Maldi-TOF
MFIISWNVAGWSSTSRMIREDFGSIASFLQRTQADIVCLQEVKGSWAKLEADPCGMGASD
-------------------EDFGSIASFLQR----------------------------************
GGRTLAIDGWESFWSFSGKAHRGFNGVVSFVRKDLTWWCDSRPFSEEDLNDEGRVIVTCH
---TLAIDGWESFWSFSGK---GFNGVVSFVRKDLTWWCDSRPFSEEDLNDEGR-----****************
********************************
WSLRRLSLPALRNLVHVCQAGGEEAEKTWAQQFPWLPMPTLQRLQGIITEQVSCMLLAGD
---------------------------TWAQQFPWLPMPTLQR----------------****************
DNEDVVDSNKSISVDSAVLDETRNDTEDGKNGNTGAHKSLTLLKQLIRERREQRRRNGGS
----------SISVDSAVLDETR------------------------------------*************
DPLATLEELCRAGLQDVPVESFMRRQPSTHNRELFALTQYCGLPPHEDVGVQFMKRLLDE
-----------AGLQDVPVESFMRRQPSTHNR---------------------------*********************
LHLCDTLLVTSSSAENKAQRQEGGEASMRVVCPYTCWDQSRNRRQRNEGTRIDYILIDEM
--------------------QEGGEASMR------------------------------*********
LLPALVPCGMTENNVGVFSPMMGEANSLFAAKKEASSAFFDEFDGRSALVGARRAMADGM
--------------------------------KEASSAFFDEFDGR--------AMADGM
**************
******
YPAAPFDGSGLPPLSTEARDVQFRGLPSTGLFVTPPQYSDHSGVCAHFDGISLAPRPGKL
YPAAPFDGSGLPPLSTEAR----------------------------------------*******************
Figura 4: Identificación de TcAP2 recombinante mediante espectrometría de masa. Las bandas de
TcAP2 recombinante, reconocidas mediante ensayos de western blot, fueron secuenciadas por
espectrometría de masa MALDI-TOF. Se identificaron 9 péptidos (Maldi-TOF) cuya secuencia
aminoacídica fue idéntica a la segmentos de la secuencia putativa para TcAP2.
II.
Generación de anticuerpo policlonal anti-TcAP1 y anti-TcAP2
Utilizando las proteínas recombinantes TcAP1 (previamente generada en el laboratorio) y
TcAP2, se intentó obtener sueros hiperinmunes (anticuerpos policlonales), inmunizando ratones
y conejos con cada una de las proteínas emulsionadas en adjuvante de Freund completo e
incompleto. Pese a sucesivos intentos, no fue posible obtener sueros que reconocieran
específicamente las proteínas recombinantes generadas (resultados no mostrados).
Debido a lo anterior, se solicitó la generación de anticuerpos policolonales purificados
anti-TcAP1 y anti-TcAP2 a la empresa AntibodyBcn. Para ello, se diseñaron los siguientes péptidos
sintéticos a partir de las secuencias de ambas proteínas:
37
TcAP1 80-96: Ac-TEKDIWSQVEPFQRRTAC-amida
amida
302-316: Ac-YDRYFAGSYKAMQKC-amida
amida
TcAP2 66-85: CAIDGWESFWSFSGKAHRGFN525-543:
CAHFDGISLAPRPGKLEER-
Ambos péptidos, seleccionados por su inmunogenicidad y especificidad, fueron utilizados
para inmunizar conejos. Los sueros pre-inmune e inmune fueron evaluados mediante ensayos de
western blot sobre homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes de T. cruzi (resultados
no mostrados).
Los anticuerpos, purificados a partir de los sueros hiperinmune de conejo mediante
columnas de afinidad, fueron utilizados para reconocer las proteínas TcAP1 y TcAP2 en las
diferentes formas celulares del parásito.
III.
Determinación de la expresión de TcAP1 y TcAP2 en las distintas formas celulares de T.
cruzi
La expresión de TcAP1 en T. cruzi fue determinada mediante ensayos de western blot
utilizando homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes
de T. cruzi de la cepa Dm28c y el anticuerpo anti-TcAP1 generado previamente. En la figura 5 se
muestra el resultado obtenido, en el que se aprecia una doble banda cercana a 45 y 49 kDa en el
homogeneizado correspondiente a proteínas de epimastigotes (carril 1) y una banda única de
aproximadamente 58 kDa en los homogeneizados de proteínas de tripomastigotes y amastigotes
(carriles 2 y 3, respectivamente). La presencia de la doble banda en epimastigotes, así como las
diferencias observables entre la masa de TcAP1 para epimastigotes comparada con los resultados
obtenidos para tripomastigotes y amastigotes podría deberse a la generación de distintas
isoformas de esta enzima en las diferentes formas parasitarias. En relación a esto, el análisis de la
secuencia de DNA genómico de la región codificante para TcAP1 indica la presencia de diversos
38
tripletes ATG, en marco de lectura, río arriba del primer ATG descrito para TcAP1 (Figura 6). No se
descarta la existencia de modificaciones post-transcripcionales de la enzima que expliquen las
diferencias en la movilidad electroforética.
1
2
3
64
49
Figura 5: Determinación de la expresión de TcAP1 en las distintas
formas celulares de T. cruzi. Homogeneizados de proteínas totales de:
1, epimastigotes; 2, tripomastigotes; 3, amastigotes, reconocidas con el
anticuerpo específico anti-TcAP1.
A ATGTCCCTGTCGCCACCAGGGGCGAAATTTTTTTTTTTTTTTATGGTGTCATTTTGGATTCTGCGACTTTTCCTTTGTGTGTGTTTGTG
TGTAGGTTTCATCTGCATTGATTGTGCGACGTGTACACGTCTTGTTTGTACCGCGGTGCTTTGCTCCGCCTCCCTTTCTTTCAACCTTT
CAATTCACTGTTTCTGTGGATTATTTGCTGCCTGTGGTCGATCGCAGGGGCATCGTGCTGCCACCGCGCCTTTTATTTTACTTTGCATC
TTTTTATTTTTATTTTTATTTTGCCCGCACGTATCATTTGTAATGTGCGTTTCTATCGTGCGGCTGTGCGGTGCCGTAAGTGTCATGCC
GTCGGGACCTAAGGAACAGAAGCCGGTTGCGGCGGCCGGGGGGAAGCGCACACGCAGTCGATCCCCGTCGGCCACATCGCCGAAGAAAC
CCGCCACGCGTTCCACGCGAATTCGTACGCCGACACCACCTTCCCGCTCGCTAAATTCTGCGGGTGCGGAGGCGACATCTCCCAATCGT
CCCCTCGCGGCCGTATTGACCGCCCCGCCACCGTCGGACGATGACACGAGGAAGACGGAGAAGGATATTTGGAGCCAAGTGGAGCCCTT
CCAGCGCCGAACAGCGGCGAAGGATTTCGACAGCAAACATATGCTGAAATTCATCACGTGGAATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGC
GGAAGGATGACCAGGCGATCCAACGACTGCTCGAGGAGGAGGGGCCGGACGCGTTGTGTCTGCAGGAAACGAAGCTGAACCCGGACGAT
CCACAAAATGAAAAGTTGGGCGAGGTGCCAGGGTACCGCTTCGTCGACCACGTCTGCCGCGCAAAGAAGGGGTACTCTGGCACACGGAC
GTACATCAAAAATACGGCGGCCGCGGAGTGGAAGACGGTCACCGTAAAGGGATTTGACACCTTGAAAAGCCCGCAGGATGTCGGTCATA
GTGAAGGGGATGAGGAGGGACGCGTTCTCACCACGTACTTTGGGACGCAAGGAAAGGGCAGCGAGACTTTTGCCCTGGCGCTGGTGAAT
ACATACATCCCCAACAGTGGGATGTCGTTGGAGCGCCTCCCGTACCGCTGCCAGAAGTTTGATTTGCGGATCCGGCAACATTTATGCAC
CTTGGGACGCTCTTGCAACCACGACAAGGAGGAGGGCGACGCCCCGTCACTCGCAGGTTTCATCTGGGCAGGCGACCTGAATGTCGCCG
AGCGTGACTACGACCGTTACTTTGCCGGCTCCTACAAGGCGATGCAGAAGTGCAGCGGCTTCACCCCGGAGGAACGCGCCTCGTTCCGT
GAAACATTGCGGGTGGCAAATGCGGTGGACACCTTCCGTGCGTTGTACCCAAAGGCGGCACCCGTTTACACATTTTGGTCCGCGCGCAT
CAACGGCAGGGCCCGGGGCCTCGGTTGGCGGCTGGACTACTTCGTGGTCTCCGCCGCGTTGGCCCGCCACGTCGTGGACTGCTTCACGA
TGCCCCACGTGATGGGGAGTGATCACTGCCCGCTGCAGATGTGGCTGCGCAGGTGA
B
MSLSPPGAKFFFFFMVSFWILRLFLCVCLCVGFICIDCATCTRLVCTAVLCSASLSFNLSIHCFCGLFAACGRSQGHRAA
TAPFILLCIFLFLFLFCPHVSFVMCVSIVRLCGAVSVMPSGPKEQKPVAAAGGKRTRSRSPSATSPKKPATRSTRIRTPTP
PSRSLNSAGAEATSPNRPLAAVLTAPPPSDDDTRKTEKDIWSQVEPFQRRTAAKDFDSKHMLKFITWNVAGLRGLLR
KDDQAIQRLLEEEGPDALCLQETKLNPDDPQNEKLGEVPGYRFVDHVCRAKKGYSGTRTYIKNTAAAEWKTVTVKG
FDTLKSPQDVGHSEGDEEGRVLTTYFGTQGKGSETFALALVNTYIPNSGMSLERLPYRCQKFDLRIRQHLCTLGRSCN
HDKEEGDAPSLAGFIWAGDLNVAERDYDRYFAGSYKAMQKCSGFTPEERASFRETLRVANAVDTFRALYPKAAPVY
TFWSARINGRARGLGWRLDYFVVSAALARHVVDCFTMPHVMGSDHCPLQMWLRR
Figura 6: Análisis de la secuencia nucleotídica y aminoacídica de TcAP1 de T. cruzi. El análisis de la
secuencia génica (A) de TcAP1 demostró la presencia de tripletes ATG (ATG) río arriba del ATG utilizado
para el clonamiento de la proteína TcAP1 (ATG). La secuencia aminoacídica deducida (B) muestra las
metioninas (M) que se generarían producto de los diversos ATG río arriba de la primera metionina (M).
39
La expresión de TcAP2 en T. cruzi también fue determinada mediante ensayos de western
blot utilizando homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes, tripomastigotes y
amastigotes de T. cruzi de la cepa Dm28c (Figura 7, carriles 1, 2 y 3, respectivamente). En este
caso, se identificó una sola banda de aproximadamente 68 kDa en las tres formas celulares de T.
cruzi.
1
2
3
82
64
Figura 7: Determinación de la expresión de TcAP2 en las distintas
formas celulares de T. cruzi. Homogeneizados de proteínas totales de:
1, epimastigotes; 2, tripomastigotes; 3, amastigotes, reconocidas con
anticuerpo específico anti-TcAP2.
IV.
Nivel de expresión de TcAP1 y TcAP2 en epimastigotes de T. cruzi sometidos a estrés
oxidativo
Con el objetivo de determinar posibles modificaciones en el nivel de expresión de TcAP1 y
TcAP2 en epimastigotes de T. cruzi expuestos a agentes genotóxicos (como ha sido reportado por
Ramana y cols. para APE1 de H. sapiens (Ramana et al., 1998)), se evaluó la expresión de ambas
endonucleasas AP en parásitos tratados con diferentes concentraciones de H 2 O 2
o NOO·-
durante distintos tiempos. Posteriormente se realizaron ensayos de western blot, utilizando
anticuerpos específicos para cada una de las enzimas (descritos en II) (figuras 8 y 9). Los
resultados obtenidos fueron normalizados con el nivel de expresión de α-tubulina.
40
La incubación de epimastigotes con 200 µM de H 2 O 2 o NOO·- (figuras 8A y 8B,
respectivamente) durante diferentes tiempos (0, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos) no induce un
incremento en los niveles de expresión de TcAP1. A su vez, la exposición de epimastigotes a 200
µM de H 2 O 2 en los tiempos mencionados tampoco induce cambios en los niveles de expresión de
TcAP2 (figura 9A). Resultados similares se obtuvieron utilizando concentraciones de 500 µM de
H 2 O 2 o NOO·- (no mostrado). Por otra parte, la exposición de epimastigotes a concentraciones
crecientes de H 2 O 2 durante 30 minutos, tampoco determina un incremento en los niveles de
expresión de TcAP1 (figura 8C) y TcAP2 (figura 9B).
A
0
H2O2 200 µM
30
60
15
120
240 min
49
TcAP1
64
49
α-tubulina
B
0
NOO- 200 µM
30
60
15
120
240 min
49
TcAP1
64
49
C
49
α-tubulina
0
2
0
5
0
H2O2 [ µM ]
100
200
500
1000
TcAP1
64
49
α-tubulina
Figura 8: Nivel de expresión de TcAP1 en epimastigotes sometidos a agentes oxidantes. 12x106
epimastigotes/ml tratados con 200uM de H 2 O 2 (A) o NOO·- (B) durante 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min, así
como epimastigotes tratados con diferentes concentraciones de H 2 O 2 (0, 2, 5, 100, 200, 500 y 1000 µM)
durante 30 min (C) fueron lisados y sometidos a ensayos de western blot, utilizando un anticuerpo
primario policlonal anti-TcAP1 y un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a peroxidasa de rábano
(Jackson ImmunoResearch)
41
A
H2O2 200µM (min)
0
15
30
60
120
240
82
64
82
64
B
H2O2 (µM)
82
0
20
50
100
200 500 1000
64
82
64
Figura 9: Nivel de expresión de TcAP2 en epimastigotes sometidos a H 2 O 2 . 12x106 epimastigotes/ml
tratados con 200uM de H 2 O 2 durante 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min (A) o sometidos a diferentes
concentraciones de H 2 O 2 (0, 20, 50, 100, 200, 500 y 1000 µM) durante 30 min (B) fueron lisados y
sometidos a ensayos de western blot, utilizando un anticuerpo primario policlonal anti-TcAP2 y un
anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch)
Objetivo específico 2_ Comprobar la funcionalidad de TcAP1 y TcAP2 por ensayos in
vitro
I.
Obtención de constructos para generar TcAP1 y TcAP2 recombinantes
Resultados obtenidos previamente durante el transcurso de esta tesis determinaron que la
expresión de la proteína recombinante TcAP1 es altamente tóxica en bacterias y que TcAP2
expresada en estos organismos forman cuerpos de inclusión insolubles. Por tales motivos, se
procedió a obtener las proteínas recombinantes en células eucariontes. Para ello se utilizaron
modelos de expresión de levaduras S. cerevisiae y P. pastoris, así como células S2 de D.
melanogaster. A pesar de la gran cantidad de ensayos destinados a obtener ambas
endonucleasas AP en estos modelos, no fue posible lograr resultados satisfactorios (ver
42
secuenciaciones de los constructos obtenidos en anexos). Basados en estudios que indican que
para la obtención de proteínas recombinantes es recomendable el uso de modelos celulares
homólogos, o al menos filogenéticamente muy similares a las células de las cuales proviene el
gen exógeno que codifica la proteína de interés (Greene, 2004; Hambsch et al., 2010) se procedió
a utilizar el modelo L. tarentolae, un protozoo de la familia Trypanosomatidae, a la que pertenece
T. cruzi, para la expresión de ambas endonucleasas AP. Este modelo requiere del uso del vector
de expresión pLEXSY que permite la expresión de proteínas recombinantes fusionadas a una cola
de 6 histidinas (Breitling et al., 2002; Lukes et al., 2006).
Los genes tcap1 y tcap2 se insertaron en el vector pLEXSY para generar los constructos
pLEXSY-tcap1 y pLEXSY-tcap2, respectivamente. Éstos se amplificaron en bacterias E. coli y se
analizaron mediante PCR (Figura 10) y secuenciación automática de DNA (no mostrado,
secuencia nucleotídica corresponde a la esperada). Los constructos generados fueron
transfectados, mediante electroporación, en células de L. tarentolae cepa P10.
1
2
3
4
5
6
7
1500
1000
500
Figura 10: Confirmación de la inserción de las secuencias nucleotídicas tcap1 y tcap2 en el
vector de expresión pLEXSY, mediante ensayos de PCR. 1: marcador de fragmentos de DNA cada
100 pb (Promega); 2: control positivo (amplificado de tcap1 mediante PCR, utilizando DNA
genómico de T. cruzi como molde); 3: control negativo de la técnica de PCR sin DNA molde; 4:
amplificado de tcap1 utilizando el constructo pLEXSY-tcap1 como DNA molde; 5: control positivo
43
(amplificado de tcap2 mediante PCR, utilizando DNA genómico de T. cruzi como molde); 6, control
negativo de la técnica de PCR sin DNA molde; 7: amplificado de tcap2 utilizando el constructo
pLEXSY-tcap2 como DNA molde.
II. Detección y purificación de la proteína recombinante TcAP2 en condiciones nativas
La detección de la expresión de las proteínas recombinantes TcAP1 y TcAP2 en L. tarentolae
fue realizada mediante ensayos de western blot sobre homogeneizados de proteínas totales
obtenidas desde cultivos de estos parásitos transfectados, seleccionados con G418 e incubados
en medio BHI durante diferentes tiempos (24, 48, 72 y 96 horas post-selección). Para tales
efectos, se utilizaron los anticuerpos anti-TcAP1 o anti-TcAP2 obtenidos previamente. Sólo fue
posible observar la expresión de una banda de masa cercana a la esperada para la proteína
recombinante TcAP2 en este modelo de expresión (figura 11).
1
2
3
4
5
115
82
64
49
Figura 11: Expresión de la proteína recombinante TcAP2 en células de L. tarentolae. Se
obtuvo homogeneizados de proteínas totales desde cultivos de L. tarentolae transfectadas con
el constructo pLEXSY-tcap2. Las muestras fueron tomadas a diferentes tiempos y la evaluación
se realizó mediante ensayos de western blot utilizando un anticuerpo primario policlonal anti
TcAP2 y un anticuerpo secundario anti conejo conjugado a peroxidasa de rábano (Jackson
ImmunoResearch). 1: homogeneizado de proteínas totales de L. tarentolae sin transfectar; 2:
homogeneizado de proteínas totales de L. tarentolae obtenido luego de 24 hrs post-selección;
3: homogeneizado de proteínas totales de L. tarentolae obtenido luego de 48 hrs post-
44
selección; 4: homogeneizado de proteínas totales de L. tarentolae obtenido luego de 72 hrs
post-selección; 5: homogeneizado de proteínas totales de L. tarentolae obtenido luego de 96
hrs post-selección.
Posteriormente, la proteína recombinante TcAP2 obtenida en L. tarentolae fue purificada
mediante columnas de agarosa-níquel. Las eluciones obtenidas fueron evaluadas mediante
ensayos de western blot utilizando anticuerpos anti-TcAP2 (figura 12A) y anticuerpos antihistidina (figura 12B). Como se observa en la figura, ambos anticuerpos identifican una banda
cercana a los 80 kDa (masa de tamaño superior a lo esperado) que correspondería a TcAP2
recombinante.
A
1
2
3
4
5
B
6
115
82
115
82
64
49
64
1
2
3
4
5
6
49
Figura 12: Purificación de la proteína recombinante TcAP2. La purificación de TcAP2 (
) se realizó
mediante columnas de agarosa-níquel. Las fracciones obtenidas fueron analizadas mediante ensayos de
western blot utilizando un anticuerpo primario policlonal anti-TcAP2 (A) o primario monoclonal antihistidina (B). Posteriormente se aplicó un anticuerpo secundario anti conejo conjugado a peroxidasa de
rábano (Jackson ImmunoResearch). 1-2: alícuotas de lavados de la columna previo a la elusión de la
proteína de interés; 3-6: alícuotas de elusión secuenciales obtenidas desde la columna de agarosa-níquel.
III.
Generación de dominantes negativos de las proteínas TcAP1 y TcAP2 mediante
mutagénesis sitio-dirigida de las secuencias nucleotídicas codificantes
La mutación de la secuencia nucleotídica de la endonucleasa APE1 (homóloga humana de
TcAP1) permitió a los investigadores McNeill y Wilson (McNeill and Wilson, 2007) generar un
45
dominante negativo de ésta proteína. Esta enzima mutante tiene la capacidad de reconocer un
sitio AP pero no puede realizar la hidrólisis del DNA, permaneciendo unida al sitio durante un
tiempo prolongado. Como resultado, impide el reconocimiento del sitio AP por APE1 no mutada
y, por lo tanto, inhibe su actividad endonucleasa AP. Basándonos en estos estudios, se identificó
los residuos homólogos a los modificados en APE1-DN (E96 y D210), determinando que éstos
corresponden los aminoácidos E260 y D411 para TcAP1, así como E49 y D169 para TcAP2. Ambos
residuos forman parte del sitio catalítico de las enzimas. Se diseñaron partidores nucleotídicos
específicos para cada mutación, que determinan cambios en residuos aminoacídicos E-Q (ácido
glutámico por glutamina) y D-N (ácido aspártico por asparragina) de ambas proteínas. Utilizando
como molde los plasmidios pMT/V5-tcap1 y pMT/V5-tcap2 (descritos en Materiales y Métodos)
se usó el kit QuikChange® Lightning Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) con el objetivo de
introducir ambas mutaciones de manera secuencial, es decir, en primer lugar la mutación E-Q y
luego la mutación D-N. Cada plasmidio mutado fue secuenciado automáticamente (figura 13) y
posteriormente las secuencias nucleotídicas codificantes de cada dominante negativo putativo
fue utilizada para su inserción en el vector de expresión de T. cruzi pTREX.
46
TcAP1
DOM-EQ-TCAP1
TTGTGTCTGCAGGAAACGAAGCTGAACCCGGACGATCCACAAAATGAAAA 464
TTGTGTCTGCAGCAAACGAAGCTGAACCCGGACGATCCACAAAATGAAAA 500
************ *************************************
TcAP1
DOM-DN-TCAP1
GGCGACGCCCCGTCACTCGCAGGTTTCATCTGGGCAGGCGACCTGAATGT 890
GGCGACGCCCCGTCACTCGCAGGTTTCATCTGGGCAGGCAACCTGAATGT 447
*************************************** **********
TcAP2
DOM-EQ-TCAP2
CGGACTCAAGCGGACATTGTTTGCCTACAGGAAGTGAAGGGGTCGTGGGC 140
CGGACTCAAGCGGAAATTGTTTGCCTACAGCAAGTGAAGGGGTCGTGGGC 170
************** *************** *******************
TcAP2
DOM-DN-TcPA2
GGGTAAACCTGTCATTTTGCTAGGGGATTTGAATCAGACATATCGAGCGG 529
GGGTAAACCCGTCATTTTGCTAGGGAATTTGAATCAGACATATCGAGCGG 395
********* *************** ************************
Figura 13: Secuenciación de plasmidios pMT/V5-tcap1-DomNeg y pMT/V5-tcap2-DomNeg. Los
plasmidios con los insertos de las secuencias nucleotídicas codificantes para dominantes negativos de
TcAP1 y TcAP2 fueron evaluados mediante secuenciación automática. Los resultados muestran el cambio
de nucleótidos esperados, GAA→CAA (Ac.glutámico →glutamina), GAC→AAC y GAT→AAT (Ac. aspártico
→asparragina).
IV.
Detección de la actividad endonucleasa AP de extractos proteicos de epimastigotes y de
la proteína recombinante TcAP2 purificada sobre oligonucleótidos con un sitio abásico
Con el objetivo de detectar actividad enzimática AP en extractos de proteínas totales de
epimastigotes, se diseñó un oligonucleótido sintético de 24 mer con un uracilo en la posición 8
que puede ser escindido por la actividad de una uracil DNA glicosilasa (UDG) dando origen a un
oligonucleótido con un sitio abásico AP (oligo AP). Para tales propósitos, el oligonucleótido fue
marcado en 5’ con Pγ32 y alineado con el oligonucleótido complementario no marcado.
Posteriormente el oligo fue tratado o no con la enzima UDG de E. coli e incubado con el extracto
proteico de epimastigotes. Finalmente, se realizó una separación electroforética en geles
denaturantes de formamida-acrilamida y se detectó la radiactividad con un equipo
phosphorimager (BioRad). En la figura 14 se muestran los resultados obtenidos en este ensayo.
47
En el carril 1 se observa la presencia de una banda de 7 mer correspondiente al oligo AP tratado
con UDG y co-incubado con la endonucleasa AP Exo III de E. coli, como control positivo de la
técnica. En el carril 2 se aprecia una banda de 24 mer correspondiente al oligo AP tratado sólo
con UDG, como control negativo de la técnica. En los carriles 3 y 4 se muestran los resultados
obtenidos al incubar el oligo AP con extractos de proteínas totales de epimastigotes sin pre-tratar
y tratados con UDG de E. coli, respectivamente. Tanto en presencia como ausencia del pretratamiento con la DNA glicosilasa se identifica una banda de aproximadamente 7 mer
correspondiente al producto generado por la actividad endonucleasa AP presente en
epimastigotes, que corta el oligonucleótido inicial de 24 mer en dos fragmentos, uno de 16 mer
con un residuo azúcar fosfato (no marcado, no detectado) y uno de 7 mer marcado con Pγ32 en el
extremo 5’. Estos resultados demuestran la existencia de
actividad endonucleasa AP en
epimastigotes de T. cruzi, así como actividad uracil-DNA glicosilasa intrínseca que permite
generar un sustrato adecuado (sitio AP) para la actividad enzimática de las endonucleasas AP.
48
1
2
3
4
- 24mer
- 7mer
Figura 14: Detección de la actividad endonucleasa AP de epimastigotes de T. cruzi. Extractos
proteicos de epimastigotes fueron incubados con el oligo-AP pre-tratado o no con la enzima UDG
durante 2 hrs a 30⁰ C. 1: control positivo de la técnica, oligo-AP tratado con UDG, co-incubado con
Exo III de E. coli; 2: control negativo de la técnica, oligo-AP tratado sólo con UDG; 3: oligo-AP
incubado con extractos proteicos de epimastigotes sin pre-tratar con UDG; 4: oligo-AP incubado con
extractos proteicos de epimastigotes pre-tratado con UDG.
Posteriormente, para evaluar la capacidad de T. cruzi de reparar el oligonucleótido con un
sitio AP, se agregó dos concentraciones diferentes de ATP (5 mM o 10 mM) a la misma reacción
descrita previamente. La reparación del sitio AP se evidencia por la regeneración del
oligonucleótido de 24 mer. Como se observa en la figura 15 (carril 2) y de forma similar a lo
observado anteriormente, la incubación del oligo AP con extractos proteicos de epimastigotes en
ausencia de ATP determina la presencia de una banda de 7 mer, que corresponde al
oligonucleótido AP cortado. Sin embargo, al agregar ATP 5 mM (carril 3) o ATP 10 mM (carril 4) a
la reacción, se aprecia la existencia de una banda de aproximadamente 24 mer que
correspondería al oligonucleótido con el sitio AP reparado. Como control negativo de la actividad
endonucleasa AP, el oligo-AP fue tratado sólo con UDG (carril 1). Como control positivo de la
49
actividad endonucleasa AP, el oligo-AP fue tratado con UDG y con Exo III de E. coli (carril 5). Estos
resultados sugieren que los epimastigotes de T. cruzi son capaces de reparar el sitio AP generado
en el oligonucleótido de forma ATP dependiente. Resultados similares se obtienen al utilizar
extractos proteicos de tripomastigotes y amastigotes de T. cruzi en presencia y ausencia de ATP 5
mM (figura 16). Bandas de tamaños inferiores a 24 mer y superiores a 7 mer que se observan en
las figuras 15 y 16 podrían corresponder a productos de degradación del oligonucleótido de 24
mer.
1
2
4
3
5
- 24mer
- 7mer
Figura 15: Reparación de sitios AP por epimastigotes de T. cruzi. Extractos proteicos de epimastigotes
fueron incubados durante 2 hrs a 30⁰ C con el oligo-AP pre-tratado con UDG en ausencia o presencia de
distintas concentraciones de ATP. 1: control negativo de actividad endonucleasa AP, oligo-AP tratado con
UDG; 2: oligo-AP incubado con extractos proteicos de epimastigotes sin agregar ATP; 3: oligo-AP incubado
con extractos proteicos de epimastigotes y ATP 5 mM; 4: oligo-AP incubado con extractos proteicos de
epimastigotes y ATP 10 mM; 5: control positivo de actividad endonucleasa AP, oligo-AP pre-tratado con
UDG co-incubado con Exo III de E. coli.
50
1
2
3
4
5
6
7
8
- 24mer
- 7mer
Figura 16: Detección de la actividad endonucleasa AP y reparación de sitio AP en las distintas
formas celulares de T. cruzi. Extractos proteicos de epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes
fueron incubados durante 2 hrs a 30⁰ C con el oligo-AP pre-tratado con UDG en presencia o
ausencia de 5mM de ATP. 1: control negativo de actividad endonucleasa AP, oligo-AP tratado con
UDG; 2: control positivo de actividad endonucleasa AP, oligo-AP pre-tratado con UDG coincubado con Exo III de E. coli; 3: oligo-AP incubado con extractos proteicos de epimastigotes sin
agregar ATP; 4: oligo-AP incubado con extractos proteicos de epimastigotes y ATP 5 mM; 5: oligoAP incubado con extractos proteicos de tripomastigotes sin agregar ATP; 6: oligo-AP incubado con
extractos proteicos de tripomastigotes y ATP 5 mM; 7: oligo-AP incubado con extractos proteicos
de amastigotes sin agregar ATP; 8: oligo-AP incubado con extractos proteicos de amastigotes y
ATP 5 mM
51
Por otra parte, se evaluó la actividad enzimática de la proteína recombinante TcAP2
expresada y purificada desde L. tarentolae, utilizando el oligonucleótido sintético de 24 mer con
un uracilo en la posición 8 en condiciones similares a las descritas previamente. Sin embargo, la
incubación de TcAP2 recombinante con el oligo AP fue realizada a diferentes tiempos (0, 15, 30 y
60 minutos). Como se observa en la figura 17, la actividad endonucleasa AP de TcAP2
recombinante aumenta en función del tiempo de incubación con el oligonucleótido AP,
evidenciada por una disminución de la intensidad de la banda correspondiente al sustrato (24
mer) y un incremento de la intensidad de la banda correspondiente al producto (7 mer).
1+
2-
3
4
5
6
- 24mer
- 7mer
Figura 17: Detección de la actividad endonucleasa AP de TcAP2 recombinante. La proteína
TcAP2 recombinante purificada fue incubada a 30⁰ C con el oligo-AP pre-tratado con la enzima
UDG a distintos tiempos. 1: control positivo de la técnica, oligo-AP tratado con UDG, co-incubado
con Exo III de E. coli; 2: control negativo de la técnica, oligo-AP tratado sólo con UDG; 3: oligo-AP
incubado con TcAP2 recombinante a tiempo 0; 4: oligo-AP incubado con TcAP2 recombinante
durante 15 min; 5: oligo-AP incubado con TcAP2 recombinante durante 30 min; 6: oligo-AP
incubado con TcAP2 recombinante durante 60 min.
52
V.
Evaluar la actividad endonucleasa AP de extractos proteicos de epimastigotes y de la
proteínas recombinante TcAP2 en presencia o ausencia de metoxiamina (inhibidor de la
vía BER)
Metoxiamina (MTX) es un inhibidor de la vía BER que reconoce sitios AP del DNA y se une a
estos de forma irreversible, impidiendo el reconocimiento, unión y actividad de las enzimas
endonucleasas AP. Para determinar si MTX es capaz de inhibir la actividad endonucleasa AP
descrita anteriormente para T. cruzi, se incubó extractos proteicos de epimastigotes con el
oligonucleótido AP con un uracilo en la posición 8 previamente tratado con UDG, en presencia o
ausencia de MTX 10mM. Como se muestra en la figura 18, en los extractos incubados con el
oligonucleótido AP de 24 mer, tratado previamente con UDG en ausencia de MTX, se aprecia una
banda de 7 mer, indicativa de la escisión del oligo por la actividad endonucleasa AP de T. cruzi
(carril 3). Por el contrario, cuando el oligo de 24 mer es tratado durante 30 minutos con UDG y 15
minutos con metoxiamina 10 mM, y posteriormente es incubado con el extracto proteico de
epimastigotes, la actividad endonucleasa AP de T. cruzi es inhibida, evidenciado por la presencia
de una banda de 24 mer y la ausencia de una banda de 7 mer (carril 4).
53
1
2
3
4
Figura 18: MTX inhibe de la actividad endonucleasa AP de T. cruzi. Extractos proteicos de
epimastigotes fueron incubados a 30⁰ C con el oligo-AP pre-tratado con UDG en presencia o
ausencia de MTX 10 mM. 1: control positivo de la técnica, oligo-AP tratado con UDG, coincubado con Exo III de E. coli; 2: control negativo de la técnica, oligo-AP tratado sólo con UDG;
3: oligo-AP pretratado con UDG, en ausencia de MTX e incubado con extractos proteicos de
epimastigotes; 4: oligo-AP pretratado con UDG, en presencia de MTX 10mM e incubado con
extractos proteicos de epimastigotes.
La actividad endonuclesa AP de TcAP2 recombinante también es inhibida por MTX. Para
visualizar esta inhibición, oligonucleótidos de 24 mer con un uracilo en la posición 8 fueron
sometidos a la actividad enzimática de UDG y posteriormente tratados y no tratados durante 15
minutos con MTX 10mM. Luego, los oligonucleótidos AP fueron incubados durante diferentes
tiempos (0, 15 y 30 minutos) con TcAP2 recombinante. Como se puede apreciar en la figura 19,
en ausencia de tratamiento con MTX el corte del oligo AP aumenta de manera directamente
proporcional al tiempo de incubación con la proteína TcAP2 recombinante (carriles 3, 4 y 5). Por
el contrario, el tratamiento del oligo AP con MTX 10 mM bloquea completamente la actividad
endonucleasa AP de TcAP2 recombinante en todos los tiempos probados (carriles 6, 7 y 8).
54
1
2
3
4
5
6
7
8
- 24mer
- 7mer
Figura 19: MTX inhibe de la actividad endonucleasa AP de TcAP2. La proteína recombinante
TcAP2 fue incubada con el oligo-AP pre-tratado con UDG en presencia o no de 10 mM de MTX a
distintos tiempos. 1: control negativo de la técnica, oligo-AP tratado sólo con UDG; 2: control
positivo de la técnica, oligo-AP tratado con UDG, co-incubado con Exo III de E. coli; 3, 4 y 5:
oligo-AP pretratado con UDG, en ausencia de MTX, e incubado con TcAP2 durante 0, 15 y 30
min, respectivamente. 6, 7 y 8: oligo-AP pretratado con UDG, en presencia de MTX, e incubado
con TcAP2 durante 0, 15 y 30 min, respectivamente.
En resumen, los resultados obtenidos hasta el momento nos permiten concluir que:
I.
Existe actividad uracil glicosilasa y endonucleasa AP en las tres formas celulares de T. cruzi.
La actividad endonucleasa AP de T. cruzi estaría dada, al menos en parte, por la enzima
TcAP2.
II.
Las tres formas celulares de T. cruzi son capaces de reparar sitios abásicos del DNA de
manera ATP dependiente.
III.
La actividad endonucleasa AP de T. cruzi, y particularmente TcAP2, puede ser inhibida por
metoxiamina. No se descarta que TcAP1 también pueda ser inhibida por esta droga.
55
El hecho de que metoxiamina inhiba la actividad endonucleasa AP de T. cruzi es indicativo
IV.
de la existencia de una vía BER evolutivamente conservada desde Kinetoplástidos a
mamíferos para la reparación del DNA.
Objetivo específico 3_ Generar cepas de T. cruzi que sobreexpresen las proteínas nativas y
dominantes negativos de TcAP1 y TcAP2. Evaluar su viabilidad en condiciones de estrés
oxidativo
I.
Inserción de las secuencias nucleotídicas codificantes para TcAP1, TcAP2 y dominantes
negativos putativos de ambas proteínas en el vector de expresión pTREX-gfp
El vector pTREX-gfp, específico para la expresión de proteínas recombinantes en T. cruzi,
permite generar una proteína de fusión con GFP en la región carboxilo-terminal. Utilizando
partidores con sitios para las enzimas de restricción Xba I y Hind III se amplificaron las secuencias
nucleotídicas codificantes para TcAP1, TcAP2 y los dominantes negativos de ambas proteínas,
previamente generados, mediante PCR. Los productos obtenidos se insertaron en el vector de
expresión, obteniéndose los constructos pTREX-gfp-tcap1, pTREX-gfp-tcap1-DN (dominante
negativo de TcAP1), pTREX-gfp-tcap2 y pTREX-gfp-tcap2-DN (dominante negativo de TcAP2). Los
constructos fueron electroporados en bacterias E. coli DH5α para su amplificación. La presencia
de las secuencias codificantes para cada una de las endonucleasas y sus dominantes negativos
fue comprobada por PCR (figura 20) y secuenciación automática de DNA (no mostrado, secuencia
corresponde a la esperada).
56
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1500
1000
500
Figura 20: Verificación de la inserción de las secuencias nucleotídicas codificantes para TcAP1, TcAP2 y
dominantes negativos putativos de ambas proteínas en el vector de expresión pTREX-gfp mediante PCR.
1: marcador de fragmentos de DNA cada 100 pb (Promega); 2: control positivo para TcAP1 (amplificado de
tcap1 utilizando DNA genómico de T. cruzi como molde); 3: control negativo para TcAP1 de la técnica de
PCR sin DNA molde; 4: amplificado de tcap1 utilizando el constructo pTREX-gfp-tcap1 como DNA molde; 5,
amplificado de tcap1-DN utilizando el constructo pTREX-gfp-tcap1-DN como DNA molde; 6, control
positivo para TcAP2 (amplificado de tcap2 utilizando DNA genómico de T. cruzi como molde); 3: control
negativo para TcAP2 de la técnica de PCR sin DNA molde; 4: amplificado de tcap2 utilizando el constructo
pTREX-gfp-tcap2 como DNA molde; 4, amplificado de tcap2-DN utilizando el constructo pTREX-gfp-tcap2DN como DNA molde.
II.
Transfección de epimastigotes con los constructos pTREX-gfp-tcap1 y pTREX-gfp-tcap2,
y confirmación de la expresión de las proteínas correspondientes
Los distintos constructos pTREX-gfp-tcap1 y pTREX-gfp-tcap2 fueron electroporados en
epimastigotes en fase exponencial de crecimiento. Luego de 4-5 semanas post-transfección se
identificó la expresión de las distintas proteínas mediante observación directa al microscopio de
fluorescencia. Los epimastigotes transfectados con el plasmidio vacío pTREX-gfp expresan la
proteína fluorescente verde GFP en su citoplasma (figura 21A). Por otra parte, la fluorescencia de
los parásitos transfectados con los constructos destinados a expresar ambas endonucleasas AP
fusionadas a GFP se encuentra delimitada a un área específica del epimastigote (figuras 21B y C)
que probablemente corresponda al núcleo. Para comprobar si TcAP1-GFP y TcAP2-GFP se
expresan exclusivamente en éste organelo, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia
57
utilizando un anticuerpo policlonal anti-GFP. La comparación de la localización de GFP con las
zonas ricas en DNA (núcleo y kinetoplasto) marcadas con DAPI, permitió demostrar que tanto
TcAP1-GFP como TcAP2-GFP se expresan exclusivamente en el núcleo (Figura 22).
A
B
C
D
E
F
Figura 21: Localización de TcAP1-GFP y TcAP2-GFP en epimastigotes transfectados. Epimastigotes
transfectados con el plasmidio vacío pTREX-gfp (A y D) y con los plasmidios pTREX-gfp -tcap1 (B y E) o
pTREX-gfp-tcap2 (C y F) fueron observados al fresco en un microscopio de fluorescencia utilizando un filtro
de 520±20 nm para determinar la expresión y la localización de las proteínas de fusión. A, B y C: detección
de fluorescencia verde. D, E y F: contraste de fase. Flechas → TcAP1-GFP o TcAP2-GFP. Barra 10 µm.
58
A
B
C
D
F
G
H
10µm
E
10µm
Figura 22: TcAP1-GFP y TcAP2-GFP se localizan exclusivamente en el núcleo de epimastigotes de
T. cruzi. Localización subcelular de TcAP1 (A-D) y TcAP2 (E-H) determinada por
inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-GFP. A y E) Contraste de fase; B y F)
Observación con filtro 430±20 nm para evidenciar fluorescencia azul de DAPI; C y G) Observación
con filtro 520±20 nm para evidenciar fluorescencia verde de GFP; D) Sobreposición utilizando
pseudocolor rojo de B con fluorescencia verde de C; H) Sobreposición utilizando pseudocolor rojo
de F con fluorescencia verde de G. Flecha (→): núcleo; Cabeza de flecha (◄): kinetoplasto. Barra
10 µm.
La presencia de TcAP1-GFP en los epimastigotes transfectados también fue evaluada
mediante ensayos de western blot utilizando un anticuerpo anti-GFP (figura 23A) o un anticuerpo
anti TcAP1 (figura 23B). En la figura 23A se observa que TcAP1-GFP presenta una masa molecular
mayor a la esperada (aproximadamente 73kDa). Sin embargo, la misma banda se identifica con el
anticuerpo anti-TcAP1 (figura 23B), confirmando que se trata de la proteína de fusión esperada.
El nivel de expresión de la enzima recombinante es alrededor de 1.4 veces comparado con el
nivel de expresión de TcAP1 endógena (figura 23 E). De manera similar a lo observado para
TcAP1-GFP, la proteína de fusión TcAP2-GFP presenta una masa molecular mayor a la esperada,
59
aproximadamente 90 kDa (figura 23C y 23D). El nivel de expresión de TcAP2-GFP es similar al
nivel de expresión de TcAP2 endógena (figura 23F). Para expresar TcAP2 se empleó un vector con
una secuencia de 78 nucleótidos entre tcap2 y gfp que genera un péptido con estructura de αhélice que separa ambas proteínas (TcAP2 y GFP). Este plasmidio genera una proteína GFP de
masa molecular cercana a 30kDa (figura 23C y 23D), mientras que el plasmidio utilizado para
TcAP1 genera una proteína GFP de aproximadamente 27kDa (figura 23A y 23B).
A
1
2
B
1
2
C
3
4
D
3
4
E
140
120
100
82
64
49
37
82
64
49
37
82
82
64
49
Endógeno
60
Recombinante
40
64
20
49
120
37
37
80
0
F
100
80
60
Endógeno
Recombinante
40
20
0
Figura 23: Expresión de TcAP1-GFP y TcAP2-GFP en epimastigotes transfectados. Detección mediante
ensayos de western blot de las proteínas recombinantes sobre lisados de epimastigotes transfectados.
Identificación de TcAP1-GFP mediante western blot utilizando un anticuerpo anti-GFP (A) y un anticuerpo
anti-TcAP1 (B). Identificación de TcAP2-GFP utilizando un anticuerpo anti-TcAP2 (C) y un anticuerpo antiGFP (D). 1 y 3: Homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes transfectados con el vector vacío
pTREX-gfp, expresando GFP (←); 2 y 4: Homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes
transfectados con el constructo pTREX-tcap1-gfp o pTREX-tcap2-gfp, expresando TcAP1-GFP (←) o TcAP2GFP (←), respectivamente. Adicionalmente se muestran las bandas correspondientes a TcAP1 (◄) y TcAP2
(◄) endógenos. E y F: Densitometría comparativa entre los niveles de expresión de TcAP1-GFP (←) y
TcAP1 endógena (◄) o TcAP2-GFP (←) y TcAP2 endógena(◄).
60
Con los resultados obtenidos se concluye que los parásitos transfectados efectivamente están
expresando las proteínas deseadas y, por lo tanto, son adecuados para utilizar en el desarrollo de
los experimentos de evaluación de viabilidad frente a estrés oxidativo.
Hasta el momento no se ha logrado obtener epimastigotes que sobreexpresen los
dominantes negativos putativos para ambas endonucleasas AP.
III.
Evaluación de la viabilidad de epimastigotes que sobreexpresan las proteínas TcAP1 y
TcAP2, expuestos a agentes oxidantes
A pesar de que los epimastigotes transfectados con constructos basados en pTREX-GFP son
seleccionados con el antibiótico G418, no es posible obtener poblaciones homogéneas en las que
el 100% de los parásitos expresen la proteína de interés. Por lo tanto, normalmente luego de la
selección se presentan poblaciones donde coexisten parásitos que expresan la proteína de
interés fusionada a GFP con parásitos que no la expresan. Por lo anteriormente mencionado,
para conseguir poblaciones homogéneas los cultivos parasitarios debieron ser sometidos a una
separación celular utilizando citometría de flujo (Cell sorter flow cytometry). Con este método los
cultivos alcanzaron, en general, sobre un 95% de parásitos fluorescentes (figura 24). Estos
cultivos enriquecidos en parásitos que expresan la proteína de interés fueron utilizados para
realizar los ensayos de viabilidad.
61
8,7%
97,6%
Figura 24: Separación celular por citometría de flujo de parásitos transfectados con pTREXtcap1. Los epimastigotes transfectados con pTREX-tcap1-gfp fueron separados de parásitos no
transfectados mediante citometría de flujo, con el objetivo de incrementar la proporción de
parásitos que expresan TcAP1-GFP. A) Porcentaje de epimastigotes que expresan TcAP1-GFP en
un cultivo heterogéneo de parásitos (8,7% parásitos fluorescentes); B) Porcentaje de
epimastigotes que expresan TcAP1-GFP posterior a la separación mediante citometría de flujo
(97,6% parásitos fluorescentes).
Para evaluar si la sobreexpresión de TcAP1 o TcAP2 incrementa la viabilidad de T. cruzi frente
a estrés oxidativo, los parásitos transfectados fueron tratados con diferentes concentraciones de
H 2 O 2 o NOO·- durante 30 minutos. Posteriormente se incubaron en medio fresco durante 4 horas
para permitir su recuperación (reparación de DNA, (Cabrera et al., 2011)) y, finalmente, se
determinó su viabilidad mediante ensayos de MTT. Cada cepa transformada (pTREX-gfp-tcap1 o
pTREX-gfp-tcap2) fue comparada con su control. En la figura 25 se aprecia que la exposición a
H 2 O 2 o NOO·- disminuye la viabilidad de los epimastigotes de forma concentración dependiente.
Sin embargo, tanto la sobreexpresión de TcAP1 como de TcAP2 incrementa moderadamente la
viabilidad de los epimastigotes frente al tratamiento con NOO·- (figura 25A y 25B). Por otra parte,
la sobreexpresión de TcAP1 también aumenta la viabilidad de los epimastigotes expuestos a H 2 O 2
62
(figura 25C). La sobreexpresión de TcAP2 no demostró tener un efecto protector frente a este
agente oxidante (figura 25D).
A
B
NOO·-μM
NOO·-μM
C
D
Figura 25: Evaluación de la viabilidad de epimastigotes transfectados sometidos a estrés
oxidativo. Epimastigotes que sobreexpresan TcAP1 (A y C) o TcAP2 (B y D) y sus controles fueron
tratados durante 30 min a 28º C con distintas concentraciones de NOO·- (A y B) o H 2 O 2 (C y D).
Posteriormente, los parásitos fueron incubados en medio fresco durante 4 horas a 28º C. El
análisis de viabilidad se realizó mediante ensayos de MTT y los resultados obtenidos fueron
analizados estadísticamente aplicando ANOVA de dos vías con corrección de Bonferroni. *** p<
0,001; ** p< 0,01.
Dado que no fue posible obtener cepas recombinantes de T. cruzi que expresen los
dominantes negativos putativos de TcAP1 o TcAP2, se procedió a evaluar el efecto de la
expresión de la endonucleasa APE1 dominante negativa humana en epimastigotes sometidos a
estrés oxidativo (APE1-DN, descrito previamente por Mc Neill y Wilson (McNeill and Wilson,
63
2007)). El vector pTREX-ape1-DN-gfp utilizado para expresar dicha proteína en T. cruzi fue
generado en el laboratorio de Biología Celular y Molecular, ICBM, Universidad de Chile. Los
resultados demostraron que epimastigotes que expresan APE1-DN-GFP presentan menor
viabilidad que parásitos control frente a la exposición a diferentes concentraciones de H 2 O 2
(figura 26). Paralelamente, mediante ensayos in vitro utilizando oligonucleótidos sintéticos de 24
mer con un uracilo en la posición 8, se evaluó la capacidad de APE1-DN de inhibir la actividad
endonucleasa AP de la proteína recombinante TcAP2. En la figura 27, se aprecia una intensa
banda de 7 mer correspondiente a la incubación del oligo AP con 2 μg de TcAP2 recombinante,
indicativo de corte enzimático del oligo (carril 3). Por el contrario, se aprecia una mayor
intensidad de la banda de 24 mer posterior a la incubación del oligo con 2 μg de APE1-DN (carril
4). Finalmente, la co-incubación del oligo AP con 2 μg de TcAP2 y concentraciones crecientes de
APE1-DN (2, 4 y 6 μg, carriles 5, 6 y 7, respectivamente) determina una disminución paulatina de
la intensidad de la banda de 7 mer y un incremento de la banda de 24 mer. Este resultado
demuestra que la proteína recombinante APE1-DN se comporta como dominante negativo
inhibiendo la actividad endonucleasa AP de la proteína recombinante TcAP2, incluso al utilizar
una relación 1:1 de concentración de ambas enzimas. Estos resultados en conjunto demuestran
que la inhibición de la actividad endonucleasa AP de epimastigotes disminuye su viabilidad frente
a estrés oxidativo.
64
Figura 26. Evaluación de la viabilidad de epimastigotes transfectados con APE1-DN sometidos a
estrés oxidativo. Epimastigotes que sobreexpresan APE1-DN y controles fueron tratados durante 30
min a 28ºC con distintas concentraciones de H 2 O 2 . Posteriormente, los parásitos fueron recuperados
en medio fresco durante 4 horas a 28º C. El análisis de viabilidad se realizó mediante ensayos de MTT.
1
2
3
4
5
6
7
Figura 27: APE1-DN inhibe de la actividad endonucleasa AP de TcAP2. La proteína recombinante
TcAP2 fue incubada con el oligo-AP pre-tratado con UDG en presencia o ausencia de diferentes
concentraciones de la proteína recombinante APE1-DN a 30º C durante 2 hrs. 1: control positivo de
la técnica, oligo-AP tratado con UDG, co-incubado con Exo III de E. coli; 2: control negativo de la
técnica, oligo-AP tratado sólo con UDG; 3: oligo-AP pretratado con UDG, en ausencia de APE1-DN e
incubado con 2 μg de TcAP2; 4: oligo-AP pretratado con UDG, incubado con 2 μg de APE1-DN; 5:
oligo-AP pretratado con UDG, co-incubado con 2 μg de TcAP2 y 2 μg de APE1-DN; 6: oligo-AP
pretratado con UDG, co-incubado con 2 μg de TcAP2 y 4 μg de APE1-DN; 7: oligo-AP pretratado con
UDG, co-incubado con 2 μg de TcAP2 y 6 μg de APE1-DN.
65
Resumen de resultados
En este trabajo se ha comprobado que T. cruzi expresa las endonucleasas TcAP1 y TcAP2 en
todas sus formas celulares. Además, se determinó que estas proteínas no incrementan su
expresión frente a estrés oxidativo en epimastigotes, en las condiciones experimentales
utilizadas. Estas condiciones no permiten definir el tiempo y concentraciones precisos de
exposición a los agentes oxidantes. En consecuencia, no se descarta que una exposición más
prolongada o permanente a agentes oxidantes incremente la expresión o activación de TcAP1 y/o
TcAP2.
Por otra parte, utilizando células de L. tarentolae, un tripanosomátido de la misma familia
que T. cruzi, se expresó TcAP2. Esta proteína fue purificada en condiciones nativas y se determinó
que posee actividad enzimática endonucleasa AP. Esta actividad fue detectada también en
extractos proteicos de epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes de T. cruzi, en los que se
comprobó la capacidad del parásito de reparar un sitio abásico. Se determinó además que la
actividad endonucleasa AP de extractos proteicos del parásito y de TcAP2 recombinante puede
ser inhibida por MTX, un inhibidor de la vía BER. Este resultado es indicativo de la existencia de
una vía BER evolutivamente conservada para la reparación del DNA desde kinetoplástidos a
mamíferos.
Por otra parte, se generó una serie de constructos específicos para T. cruzi que poseen las
secuencias génicas de TcAP1 y TcAP2. Con éstos se generaron cepas recombinantes de
epimastigotes de T. cruzi que sobreexpresan las proteínas TcAP1-GFP y TcAP2-GFP. Se demostró
que ambas endonucleasas AP se expresan con una masa molecular mayor pero cercana a la masa
66
esperada, localizándose sólo en el núcleo de los epimastigotes transfectados. La sobreexpresión
de TcAP1 o TcAP2 en epimastigotes de T. cruzi produce un incremento en la viabilidad de estos
parásitos frente a estrés oxidativo. Estos experimentos no pudieron ser realizados en
epimastigotes que expresan los dominantes negativos de cada endonucleasa dado que no fue
posible generar los transfectantes. Sin embargo, la utilización de una cepa de epimastigotes que
expresa APE1-DN, permitió determinar que el bloqueo de la actividad endonucleasa AP de los
parásitos induce una disminución de su viabilidad frente al estrés oxidativo. Esto se complementa
con la determinación de que APE1-DN recombinante es capaz de inhibir la actividad
endonucleasa AP de TcAP2 recombinante en ensayos in vitro.
En conjunto, estos resultados responden a la pregunta central de esta Tesis, remarcando la
importancia de las endonucleasas TcAP1 y TcAP2 en la sobrevida de T. cruzi frente a estrés
oxidativo.
67
DISCUSIÓN
ESTRÉS OXIDATIVO Y MECANISMOS DE DEFENSA EN Trypanosoma cruzi
ROS son moléculas con una alta capacidad oxidativa que pueden interactuar con distintas
macromoléculas presentes en las células (Valko et al., 2006). Se cree que ROS serían uno de los
principales agentes involucrados en el envejecimiento celular y en el desarrollo de neoplasias en
el ser humano (Cadenas and Davies, 2000). Paradójicamente, en eucariontes una de las
principales fuentes de ROS es la fosforilación oxidativa, mecanismo indispensable para el
metabolismo energético y la sobrevida celular (Cadenas and Davies, 2000; Valko et al., 2006;
Murphy et al., 2009). Otras fuentes endógenas de ROS son el metabolismo de ácidos grasos de
cadena larga en los peroxisomas (Gehrmann et al., 2010) y los mecanismos de defensa
empleados por las células del sistema inmune (Valko et al., 2006; Ferrari et al., 2011).
Exógenamente, las radiaciones ionizantes y UV pueden generar ROS por mecanismos directos o
indirectos en la célula (Herrling et al., 2003).
Debido a lo anteriormente mencionado, los organismos eucariontes están preparados para
sobrevivir a la exposición de agentes oxidantes, utilizando diversos mecanismos de detoxificación
(Turrens, 2004; Valko et al., 2006). En mamíferos, enzimas como peroxidasas, superoxido
dismutasa y catalasa son capaces de inactivar eficientemente ROS/RNS. Un mecanismo
particularmente importante que determina la sobrevida de células de mamífero expuestas a este
tipo de agentes es el sistema glutatión-glutatión reductasa (Turrens, 2004; Valko et al., 2006).
Una serie de reportes han establecido que T. cruzi carece de este sistema, además de presentar
nula actividad catalasa y una baja actividad superóxido dismutasa. Sin embargo, este parásito
68
posee el sistema tripanotión-tripanotión reductasa, mecanismo que controla eficientemente la
presencia de agentes oxidantes (Krieger et al., 2000; Ariyanayagam and Fairlamb, 2001; Oza et
al., 2002; Turrens, 2004). Además se ha descrito que T. cruzi expresa dos triparedoxinas y dos
glutatión peroxidasas dependientes de cisteína (Wilkinson et al., 2000; Wilkinson et al., 2002a;
Wilkinson et al., 2002b; Piacenza et al., 2008). A pesar de la existencia de diferentes sistemas de
detoxificación de ROS/RNS en eucariontes, muchas veces estos mecanismos son sobrepasados,
permitiendo la oxidación de macromoléculas como lípidos, carbohidratos, proteínas y DNA.
DAÑO OXIDATIVO Y REPARACIÓN DEL DNA MEDIANTE LA VÍA BER
El daño en el DNA afecta procesos claves del metabolismo celular y como consecuencia es
capaz de activar diversas vías de respuesta, como la detención de la proliferación celular, la
reparación del daño por diferentes mecanismos y la inducción de la apoptosis, si el nivel de daño
sobrepasa estos mecanismos de reparación (Mates et al., 2008; Aziz et al., 2011). Además puede
inducir mutaciones que alteran genes que codifican enzimas fundamentales para el control del
ciclo celular, como P53, determinando la generación de células cancerosas (Aziz et al., 2011). En
relación al daño genotóxico, se han descrito más de 20 tipos de alteraciones que afectan a las
bases nucleotídicas, así como modificaciones en el esqueleto azúcar-fosfato del DNA (Berquist
and Wilson, 2012). El daño oxidativo en particular, modifica principalmente bases nitrogenadas,
generando lesiones no abultadas. A pesar de que todas las bases nitrogenadas pueden ser
oxidadas, la alteración más común se produce en guanina (Zharkov, 2008; Berquist and Wilson,
2012). Por otra parte, ROS/RNS también puede generar lesiones que distorsionan la hebra de
DNA, tales como uniones intra e inter-cadena y unión a proteínas, entre otras.
69
Estudios realizados en levaduras y algunos metazoos indican que el daño oxidativo que se
produce en las bases del DNA, es reparado principalmente mediante la vía de escisión de bases
(BER). Este mecanismo es altamente conservado durante la evolución de eucariontes (Lu et al.,
2001; Slupphaug et al., 2003; Hegde et al., 2008; Zharkov, 2008; Cordoba-Canero et al., 2009;
Robertson et al., 2009). En T. cruzi se ha descrito la presencia de algunas de las enzimas que
participan en la vía BER, como una uracil-DNA glicosilasa y la secuencia génica que codifica para
una endonucleasa AP (TcAP1) (Perez et al., 1999; Pena-Diaz et al., 2004). Además, como se
mencionó previamente, en el genoma de T. cruzi se encuentra la secuencia codificante de una
segunda endonucleasa AP (TcAP2). Las endonucleasas AP son particularmente importantes en
esta vía ya que realizan una función única y su ausencia, en distintos organismos, ha demostrado
ser letal (Xanthoudakis et al., 1996; Ludwig et al., 1998; Murphy et al., 2009).
VÍA BER EN Trypanosma cruzi: IDENTIFICACIÓN DE TcAP1 Y TcAP2
Con el objetivo de detectar la expresión de TcAP1 y TcAP2 en las distintas formas celulares de
T. cruzi, se generaron anticuerpos policlonales específicos anti-TcAP1 y anti-TcAP2 en conejos.
Utilizando estos anticuerpos en ensayos de western blot contra homogeneizados de proteínas
totales de las diferentes formas celulares de T. cruzi se determinó que epimastigotes,
tripomastigotes y amastigotes expresan las dos endonucleasas AP mencionadas. Dado que se ha
descrito que las tres formas celulares de T. cruzi se encuentran expuestas a ROS/RNS en los
diferentes hospederos colonizados (Metz et al., 1993; Graca-Souza et al., 2006; de Oliveira et al.,
2007; Gupta et al., 2009; Piacenza et al., 2009) y, considerando que los mecanismos que
controlan estas especies reactivas no siempre son capaces de evitar el daño a las macromoléculas
70
del parásito, es muy probable que ambas enzimas se expresen a lo largo de todo el ciclo de vida
del parásito para reparar las alteraciones oxidativas que pueden generarse en su DNA.
A diferencia de TcAP2, que se expresa como una única proteína de igual masa en todas las
formas celulares del parásito, TcAP1 se detecta en ensayos de western blot sobre
homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes como una doble banda, cercana a los 45 y
49kDa, mientras que en amastigotes y tripomastigotes se expresa como una única proteína
cercana a los 58kDa. Como se mencionó previamente, las diferencias de masa encontradas para
TcAP1 podrían deberse a la generación de isoformas en las distintas formas parasitarias. Al
analizar la secuencia río arriba de la región de DNA genómico codificante para TcAP1 se
identificaron tripletes ATG en el mismo marco de lectura que el ATG inicial descrito
primariamente por Pérez y cols para esta endonucleasa (Perez et al., 1999). Estos distintos ATG
podrían originar isoformas de TcAP1 en T. cruzi que tendrían masas moleculares de entre 45 y 58
kDa, como las encontradas en esta Tesis en epimastigotes. Sin embargo, no es posible descartar
que las diferencias en la movilidad electroforética de la proteína deriven de modificaciones posttraduccionales. Al respecto, Duffieux y col (Duffieux et al., 2000) describieron que la secuencia
que codifica para la enzima 6-fosfogluconato deshidrogenasa de T. brucei posee dos codones de
inicio putativos que podrían dar origen a isoformas de esta enzima. Sin embargo, el análisis del
mRNA demostró que la isoforma que utilizaría el primer codón de inicio generaba un sitio 5’UTR
poco común muy corto, probablemente incompatible con una correcta traducción.
Posteriormente, Igoillo-Esteve y col (Igoillo-Esteve and Cazzulo, 2006) estudiaron esta enzima en
T. cruzi, y determinaron que también posee dos sitios de inicio de traducción putativos y que, a
diferencia de T. brucei, ambos serían funcionales. Estos investigadores generaron las dos
isoformas de 6-fosfogluconato deshidrogenasa de T. cruzi como proteínas recombinantes y
71
demostraron que ambas tienen actividad enzimática, aunque presentan diferencias en su
afinidad por los sustratos y sensibilidad a agentes reductores. No obstante, estos autores
comprobaron que en las distintas formas celulares del parásito sólo se expresa la isoforma larga
de la proteína, no siendo detectable una segunda isoforma. Un análisis en profundidad sobre la
estructura del mRNA de TcAP1 nos permitiría determinar con mayor certeza la importancia de los
distintos ATG descritos en su secuencia y la factibilidad de obtener isoformas a partir de ellos.
NIVEL DE EXPRESIÓN DE TcAP1 Y TcAP2 FRENTE A ESTRÉS OXIDATIVO
En relación a la expresión de las AP endonucleasas frente a agentes genotóxicos,
investigaciones realizadas por Fung y cols (Fung et al., 2001), indican que tratamientos con
agentes que dañan el DNA inducen una mayor expresión de APE1 en fibroblastos de ratón
NIH3T3. A su vez, experimentos en ratas jóvenes sometidas a estrés oxidativo mostraron un
incremento en la expresión de APE1 en la región del hipocampo (Edwards et al., 1998). También,
estudios realizados por Ramana y cols. (Ramana et al., 1998) han descrito un incremento en la
expresión de APE1 en células HeLa, luego del tratamiento con H 2 O 2 , así como con agentes
alquilantes del DNA (Wolff et al., 1991). El aumento en la expresión de esta proteína se relaciona
directamente con un incremento de la resistencia de las células frente a agentes genotóxicos.
Igualmente, Silber y cols. (Silber et al., 2002) señalan que APE1 contribuye de manera importante
al aumento de la resistencia frente a agentes alquilantes de células de glioma humano SNB19.
Estos mismos autores indican un incremento en la expresión y actividad de APE1 frente a la
exposición a HClO (un generador de ROS) en este mismo tipo de células. Esto último se encuentra
relacionado a la disminución de la cantidad de sitios AP encontrados en el DNA.
72
Al contrario de lo descrito para células de mamífero, el nivel de expresión de TcAP1 y TcAP2
en epimastigotes de T. cruzi no se modifica luego de tratamientos con agentes oxidantes, incluso
luego de 4 hrs de exposición. Esto no descarta que en condiciones experimentales diferentes,
como incubación de parásitos en presencia de estrés oxidativo sostenido, pueda detectarse
variación en los niveles de expresión de ambas endonucleasas AP, considerando que tanto en el
insecto triatomino y particularmente en el interior de macrófagos, las concentraciones de
ROS/RNS que enfrentan los parásitos se mantienen constantes por horas (Piacenza et al., 2009).
En relación a esto último, es importante destacar que en los experimentos relacionados a
determinar los niveles de expresión de ambas endonucleasas AP, realizados en esta tesis, se
utilizaron los agentes oxidantes H 2 O 2 y NOO·-, moléculas altamente inestables que se
descomponen rápidamente en solución (Koppenol et al., 1992; Pryor and Squadrito, 1995). Para
imitar las condiciones fisiológicas a las cuales se encuentran sometidos los parásitos dentro de
sus hospederos se han desarrollado sistemas generadores de ROS/RNS que permiten mantener
concentraciones constantes in vitro de ambos agentes (Rudich et al., 1997; Singh et al., 1999). No
se puede descartar que el uso de estos sistemas permita evidenciar un incremento en la
expresión de las endonucleasas AP de T. cruzi. Sin embargo, también es probable que ambas
enzimas cumplan un rol tan importante para la sobrevida del parásito, en todas sus formas
celulares y en sus distintos hospederos, que por lo tanto se expresen de manera constitutiva. Por
otra parte, las endonucleasas AP de T. cruzi podrían encontrarse en un estado inactivo y posibles
modificaciones post-traduccionales podrían representar un mecanismo de activación de ellas
frente a un daño oxidativo al DNA. Se ha descrito, por ejemplo, que APE1 es acetilada y
posteriormente desacetilada cuando líneas celulares son tratadas con H 2 O 2 , lo que permite su
traslocación al núcleo por unión a la proteína desacetilasa de histonas SIRT1 (Yamamori et al.,
73
2009). En T. cruzi esté mecanismo es utilizado en proteínas como la histona H4, donde se ha
reportado que la acetilación de distintas lisinas presentes en su secuencia aminoacídica estaría
relacionado con distintas funciones celulares de esta proteína (Nardelli et al., 2009). Una
búsqueda computacional en predictores de sitios de acetilación nos permitió determinar que
TcAP1 posee dos probables sitios de acetilación (lisinas) por acetiltransferasas de histonas en su
secuencia aminoacídica, mientras que TcAP2 posee cuatro probables sitios (ASEB web server).
Además, ambas enzimas poseen también sitios probables de fosforilación (NetPhos 2.0 Server),
otra modificación post-traduccional que podría dar cuenta de una activación enzimática.
LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE TcAP1 Y TcAP2
En células de mamífero, el estrés oxidativo incrementa la traslocación de APE1 del citoplasma
al núcleo, siendo esencial para esto los primeros 20 residuos aminoacídicos del extremo amino
terminal (Mitra et al., 2002). APE1 también juega un rol en la mantención de la integridad del
genoma mitocondrial. En este último caso, la remoción de los primeros 33 residuos
aminoacídicos del extremo amino terminal favorece la traslocación de la enzima a la mitocondria
(Chattopadhyay et al., 2006). De manera similar, el estrés oxidativo induce la redistribución de
APE1 a la mitocondria (Mitra et al., 2002). Se ha descrito que APE2 de H. sapiens se localiza
principalmente en el núcleo de la célula, aunque
una parte también se encuentra en
mitocondrias (Tsuchimoto et al., 2001). En esta tesis se localizó TcAP1 y TcAP2 dentro del núcleo
del parásito cuando se expresan como proteínas de fusión con GFP en epimastigotes,
independiente de la presencia de agentes oxidantes. Sin embargo, ya que el reconocimiento se
realizó identificando la porción correspondiente a GFP en las proteínas de fusión, no se descarta
que TcAP1 y TcAP2 endógenas puedan encontrarse también en el citoplasma y por lo tanto
74
puedan sufrir modificaciones post-traduccionales luego de daño al DNA, que modifiquen su
localización subcelular. En relación a estos resultados, recientemente se ha determinado que la
DNA polimerasa beta se expresa en el kinetoplasto de epimastigotes de T. cruzi, y que su
sobreexpresión protege a los parásitos frente al daño oxidativo, disminuyendo las lesiones
presentes en el DNA (Schamber-Reis et al., 2012).
OBTENCIÓN DE TcAP1 Y TcAP2 RECOMBINANTES DE Trypanosoma cruzi
Debido a que la sola expresión de TcAP1 y TcAP2 en las diferentes formas celulares de T.
cruzi no garantiza que éstas posean actividad endonucleasa AP, fue necesario obtener ambas
enzimas en condiciones nativas para determinar, en ensayos in vitro, la presencia de actividad
endonucleasa AP. A pesar de los múltiples modelos de expresión de enzimas recombinantes
utilizados en esta tesis, sólo fue posible expresar TcAP1 en T. cruzi, mientras que TcAP2 pudo ser
expresada en T. cruzi, L. tarentolae, D. melanogaster (baja expresión) y E. coli (formación de
cuerpos de inclusión). Por otra parte, ninguna de las endonucleasas AP de T. cruzi fue expresada
en levaduras. Trabajos previos realizados en el laboratorio de Biología Celular y Molecular, ICBM,
de la Universidad de Chile, demostraron que TcAP1 sólo se expresa en E. coli cuando las bacterias
son transformadas con un constructo que codifica la región C-terminal de ésta enzima. Por el
contrario, los intentos por obtener la secuencia aminoacídica completa de ésta fracasaron debido
a la alta toxicidad para las bacterias. Así mismo, es posible suponer que ambas endonucleasas AP
parasitarias también resultarían ser tóxicas para levaduras, razón por la cual no pudieron ser
expresadas en estos organismos. Lo mismo podría ocurrir con TcAP1 en células S2 y L. tarentolae.
Un problema muy común que suele presentarse a la hora de expresar proteínas recombinantes
en organismos heterólogos es la diferencia en el uso de codón que existe entre el modelo celular
75
utilizado para expresar la proteína recombinante y el organismo al cual pertenece el gen que se
desea expresar (Gustafsson et al., 2004). La diferencia en el uso de codón implica que las
secuencias génicas poseen codones que los organismos de destino rara vez utilizan, lo que puede
impedir la generación de las proteínas foráneas. El fracaso de la gran mayoría de los modelos
para la expresión de las endonucleasas AP de T. cruzi podría relacionarse a problemas en el uso
de codones, con el consecuente término prematuro de la traducción de la proteína, tal como ha
sido descrito para la expresión de proteínas recombinantes de mamífero en modelos de
eucariontes ancestrales (Greene, 2004; Daly and Hearn, 2005; Hershberg and Petrov, 2008;
Angov, 2011). Una segunda explicación podría involucrar algunos problemas en la generación de
modificaciones post-traduccionales específicas de T. cruzi de ambas endonuleasas AP que
generan un plegamiento incorrecto de las proteínas, con la consecuente degradación de estas
(Greene, 2004). Cualquiera sea la razón, en esta tesis se logró demostrar que, en general, la
expresión de endonucleasas AP de T. cruzi resulta de mejor forma en el mismo parásito o en
organismos filogenéticamente cercanos, como L. tarentolae. Sólo TcAP2 pudo ser expresada con
un sistema que permitiera su purificación mediante una cola de histidinas (pLEXSY) y por ende
pudo ser utilizada para ensayos funcionales. Sin embargo, la expresión de TcAP1 utilizando el
vector pTREX modificado que expresa una proteína de fusión con residuos de 8 histidinas
(generado en laboratorio de Biología Celular y Molecular, ICBM, de la Universidad de Chile)
podría permitir a futuro obtener esta proteína recombinante para analizar su actividad
enzimática.
76
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE TcAP1 Y TcAP2
La mayoría del conocimiento generado durante los últimos 20 años que tiene relación con la
mecanística y enzimología de la vía BER en procariontes y eucariontes, se ha obtenido aplicando
ensayos in vitro sobre extractos de proteínas totales de diferentes organismos. La vía BER fue
inicialmente reconstituida in vitro por Matsumoto y Bogenhagen (1989) incubando DNA circular
que presentaba un análogo de sitio abásico en una única posición con extractos de proteínas
totales de oocitos de Xenopus leavis (Matsumoto and Bogenhagen, 1989). Este ensayo resultó en
un rápido corte en la región correspondiente al sitio abásico del DNA, mediado por una
endonucleasa AP, seguido de la completa reparación del sustrato luego de 40 minutos de
incubación. Subsecuentemente, Kubota y cols. reconstituyeron la vía BER usando sólo cuatro
enzimas purificadas desde células de H. sapiens (Uracil DNA glicosilasa, APE1, DNA polβ y DNA
ligasa 1 o 3) (Kubota et al., 1996). Hasta el momento, una gran cantidad de ensayos in vitro
diseñados para reconstituir la vía BER usando extractos de proteínas totales o enzimas
purificadas han sido realizados para diversos organismos como E. coli (Dianov et al., 1992), S.
cerevisiae (Wang et al., 1993), S. pombe (Alseth et al., 2004), Plasmodium falciparum
(Haltiwanger et al., 2000), Caenorhabditis elegans (Shatilla and Ramotar, 2002), Arabidopsis
thaliana (Cordoba-Canero et al., 2009) y Mycobacterium tuberculosis (Kumar et al., 2011). Para
evaluar la presencia de actividad endonucleasa AP en T. cruzi se desarrollaron ensayos in vitro
similares a los realizados por otros investigadores, usando extractos proteicos de cultivos de las
diferentes formas celulares del parásito, así como la proteína TcAP2 recombinante purificada en
condiciones nativas. De esta forma se pudo detectar que extractos proteicos de epimastigotes,
tripomastigotes y amastigotes, así como TcAP2 recombinante, presentan la capacidad de
hidrolizar un oligonucleótido que posee un sitio AP. Además se determinó que en presencia de
77
ATP las tres formas celulares del parásito son capaces de reparar el sitio alterado. El uso de MTX,
un inhibidor de la vía BER, demostró que la actividad endonucleasa AP de extractos proteicos de
epimastigotes y TcAP2 recombinante puede ser bloqueada. Estos resultados apoyan los
experimentos realizados por Cabrera et al (Cabrera et al., 2011) donde se demuestra que la
viabilidad de epimastigotes y tripomastigotes expuestos a ROS/RNS disminuye al incubarlos con
MTX. En conjunto, estos datos demuestran que T. cruzi posee endonucleasas AP funcionales, que
posibilitan la reparación del DNA y que son susceptibles de ser inhibidas farmacológicamente.
Se ha demostrado que la función de determinadas endonucleasas AP es fundamental
para la sobrevida de algunos organismos mientras que para otros su ausencia sólo genera
alteraciones menores (Xanthoudakis et al., 1996; Ludwig et al., 1998; Ide et al., 2004; Ribar et al.,
2004; Fung and Demple, 2005; Tanihigashi et al., 2006; Murphy et al., 2009). En mamíferos, APE1
es una enzima esencial para la viabilidad de diferentes tipos celulares. La supresión de la
expresión de APE1 mediante el uso de RNA de interferencia (RNAi) genera detención del ciclo
celular e inducción de apoptosis en diferentes tipos celulares (Demple and Sung, 2005). De
manera similar, ratones knock-out para APE1 no se desarrollan más allá de la etapa de blastocisto
(Ludwig et al., 1998). En contraste, cepas de E. coli carentes de exo III son viables pero sensibles a
agentes oxidantes (Souza et al., 2006). Por otra parte, como se mencionó previamente, en
muchos tipos de células de humanos la expresión de APE1 se ve incrementada frente a la
exposición de agentes genotóxicos (Wolff et al., 1991; Ramana et al., 1998; Fung et al., 2001;
Silber et al., 2002). Estos resultados podrían indicar que el incremento en los niveles de expresión
de APE1 estaría relacionado a una mayor actividad de la vía BER, aumentando la resistencia de las
células a agentes oxidantes. Sin embargo, la sobrexpresión de APE1 exógena, utilizando vectores
de expresión, en células C6 de glioma de rata no incrementa la resistencia a radiación γ y agentes
78
alquilantes (Herring et al., 1999). Resultados similares fueron obtenidos por Prieto-Alamo y Laval
al sobrexpresar APE1 en células CHO (Prieto-Alamo and Laval, 1999). Por lo anteriormente
mencionado, no se descarta que la sobrexpresión de APE1 que se detecta en células cancerígenas
se encuentre en un contexto donde otras enzimas que participan de la reparación del DNA se
encuentren sobrexpresadas o con un mayor nivel de actividad, lo que se relacionaría a una mayor
resistencia frente a agentes genotóxicos.
En esta tesis se comprobó que la sobreexpresión exógena de TcAP1 y TcAP2 conlleva un
aumento de la viabilidad de epimastigotes sometidos a estrés oxidativo. Si bien las diferencias
generadas no son significativas en todos los puntos, demuestran claramente una marcada
tendencia hacia un incremento en la sobrevida de los parásitos transfectados en comparación
con los controles. Las diferencias moderadas podrían explicarse en parte porque la
sobreexpresión de ambas endonucleasas AP corresponde a no más de 1,4 veces la expresión de
la enzima endógena, lo que se considera a su vez como un incremento moderado. Otra posible
explicación se relaciona a que la sobreexpresión de una sola enzima (endonucleasa AP) en
epimastigotes, sin la consecuente sobrexpresión del resto de las enzimas que participan de la vía
BER, podría generar la saturación de la vía. Por otra parte, T. cruzi se encuentra constantemente
enfrentado a ambientes altamente oxidantes y por lo tanto debe estar continuamente preparado
para lidiar con ROS/RNS. Así, el parásito expuesto a ROS/RNS no sobre-expresa las
endonucleasas, como se demuestra en esta Tesis. Por ello, es también probable que los niveles
de expresión endógena de ambas endonucleasas AP sean suficientes para hacer frente a estas
especies reactivas y que, por lo tanto, un aumento en la expresión de las endonucleasas AP no
genere, necesariamente, un incremento marcado en la sobrevida parasitaria.
79
INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENDONUCLEASA AP DE Trypanosoma cruzi
La evaluación del fenómeno de inhibición de la actividad enzimática endonucleasa AP
también entregó datos reveladores sobre la importancia de la vía BER en T. cruzi. APE1-DN, un
dominante negativo de la enzima APE1 (homóloga humana de TcAP1), permite interferir el
reconocimiento del sitio AP por parte de otra endonucleasa (McNeill and Wilson, 2007). La
expresión de APE1-DN en T. cruzi permitiría la inhibición de la actividad endonucleasa AP ya que
este dominante negativo se une a los sitios AP en moléculas de DNA, interfiriendo con la
actividad AP endonucleasa endógena. Así, ensayos in vitro utilizando APE1-DN demostraron que
esta proteína inhibe la actividad endonucleasa AP de la enzima recombinante TcAP2 a partir de
una relación de concentración 1:1. Coincidentemente, epimastigotes de T. cruzi que expresan
APE1-DN presentan una menor viabilidad que epimastigotes controles cuando son sometidos a
estrés oxidativo. Esta diminución, al igual que lo observado al sobreexpresar las endonucleasas
AP en epimastigotes, no representa más del 20 – 30%. Esto puede deberse, por una parte, a que
los niveles de expresión de APE1-DN no son suficiente en el parásito para impedir la actividad de
todas las endonucleasas AP endógenas presentes. Por otra parte, al igual que muchos otros
organismos, es probable que T. cruzi posea otros mecanismos de reparación del daño oxidativo
que actúen en concomitancia con la vía BER para reparar el daño oxidativo al DNA. Como se ha
reportado, vías como NER, reparación de ICL, recombinación homóloga, entre otras, participan
en la reparación de daño oxidativo al DNA (Slupphaug et al., 2003; Berquist and Wilson, 2012) y,
aunque hasta el momento estas vías no se han caracterizado en T. cruzi, es muy probable que se
encuentren presentes y activas en el parásito. El estudio de otras vías de reparación del daño
oxidativo al DNA podría complementar la comprensión de los mecanismos empleados por T. cruzi
para enfrentar y sobrevivir al estrés oxidativo en sus diferentes hospederos.
80
Dado que las endonucleasas AP han demostrado tener importancias relativas distintas
dependiendo del organismo y, considerando que se ha reportado que es posible generar cepas
knock out de T. cruzi (Conte et al., 2003), una investigación interesante para realizar a futuro es la
generación de cepas de T. cruzi carentes de TcAP1 y/o TcAP2. Estos experimentos permitirían
determinar si estas enzimas son necesarias y/o indispensables para la sobrevida del parásito.
81
CONCLUSIONES Y PROYECCIONES
En conclusión, en esta tesis se demostró que las endonucleasas AP de T. cruzi son
importantes en la reparación del daño oxidativo al DNA, principalente en epimastigotes, y que su
inhibición induce sensibiliad frente al estrés oxidativo. Uno de los pasos siguientes para esta
investigación es el estudio de la función y actividad de ambas endonucleasas AP en las formas
tripomastigotes y amastigotes, así como los posibles efectos en la infectividad y sobrevida
parasitaria en células de mamíferos. Para ello será necesaria la obtención de tripomastigotes que
sobreexpresen las endonucleasas AP a partir de epimastigotes transfectados mediante
metaciclogénesis in vitro (Avila et al., 2003; Ferreira et al., 2008), tema que está en estudio en el
laboratorio.
Los resultados aquí obtenidos, sumados a lo ya descrito por Cabrera et al (Cabrera et al.,
2011), confirman que la vía BER se activa en T. cruzi frente al daño oxidativo al DNA. La vía BER y
otras vías de reparación del daño oxidativo al DNA, en conjunto con mecanismos celulares
antioxidantes, interactuarían para permitir a T. cruzi sobrevivir al estrés oxidativo en el
triatomino y en los hospederos mamíferos, perpetuando la infección.
Finalmente, es importante mencionar que ha sido demostrado que es posible lograr la
inhibición farmacológica diferencial de endonucleasas AP de diferentes organismos (Simeonov et
al., 2009; Zawahir et al., 2009). Esta inhibición diferencial se centra principalmente en la
identidad de secuencia y forma existente entre una enzima y otra, en diferentes especies. El
análisis computacional de las secuencias aminoacídicas de las endonucleasas AP del parásito y las
humanas permite determinar que la identidad entre TcAP1 y APE1 es cercana al 20%, mientras
82
que la de TcAP2 y APE2 es de aproximadamente 15%. Con estos antecedentes, y luego de
determinar que la vía BER, y las endonucleasas AP en particular, son importantes para la
viabilidad del parásito, este estudio posiciona a éstas enzimas como un blanco terapéutico
promisorio para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.
83
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94
ANEXO 1
95
ANEXO 2: Secuenciaciones de vectores de expresión con los insertos TcAP1 y TcAP2
Seq
TcAP1
---------------------------------------GTGCTGCGGAAG-ATGACCAG 20
CTGAAATTCATCACGTGGAATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATGACCAG 420
*********** ********
Seq
TcAP1
GCGATCCA-CGACTGCTCG-GGAGGAGGG--CGGACGCGTTGT-TCTGCAG-AAACGA-G 73
GCGATCCAACGACTGCTCGAGGAGGAGGGGCCGGACGCGTTGTGTCTGCAGGAAACGAAG 480
******** ********** ********* ************ ******* ****** *
Seq
TcAP1
CTGACC---GACGATC-ACAAAATGAAAAGT-GGGCGAGGTGC-AGGGTACG--CTCGTC 125
CTGAACCCGGACGATCCACAAAATGAAAAGTTGGGCGAGGTGCCAGGGTACCGCTTCGTC 540
**** *
******* ************** *********** *******
*****
Seq
TcAP1
GAC-ACGTCTGCCGCGCAAAGAAGGGGTACTCTGGCACACGGACGTACATCAAAAATACG 184
GACCACGTCTGCCGCGCAAAGAAGGGGTACTCTGGCACACGGACGTACATCAAAAATACG 600
*** ********************************************************
Seq
TcAP1
GCGGCCGCGGAGTGGAAGACGGTCACCGTAAAGGGATTTGACACCTTGAAAAGCCCGCAG 244
GCGGCCGCGGAGTGGAAGACGGTCACCGTAAAGGGATTTGACACCTTGAAAAGCCCGCAG 660
************************************************************
Seq
TcAP1
GATGTCGGTCATAGTGAAGGGGATGAGGAGGGACGCGTTCTCACCACGTACTTTGGGACG 304
GATGTCGGTCATAGTGAAGGGGATGAGGAGGGACGCGTTCTCACCACGTACTTTGGGACG 720
************************************************************
Seq
TcAP1
CAAGGAAAGGGCAGCGAGACTTTTGCCCTGGCGCTGGTGAATACATACATCCCCAACAGT 364
CAAGGAAAGGGCAGCGAGACTTTTGCCCTGGCGCTGGTGAATACATACATCCCCAACAGT 780
************************************************************
Seq
TcAP1
GGGCTGTCGTTGGAGCGCCTCCCGTACCGCTGCCAGAAGTTTGATTTGCGGATCCGGCAA 424
GGGATGTCGTTGGAGCGCCTCCCGTACCGCTGCCAGAAGTTTGATTTGCGGATCCGGCAA 840
*** ********************************************************
Secuenciación del vector pYES2-tcap1. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación
automática de DNA del plasmidio pYES2-tcap1. TcAP1: Secuencia nucleotídica del gen codificante para
TcAP1 (GenBank access 2393782).
96
TcAP1
Seq
GGCGGCCGCCAGCTTTCTAG--CAATGGGAATGCCGTCGGGACCTAAGGAACAGAAGCCG 238
GGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAGCAATGGGAATGCCGTCGGGACCTAAGGAACAGAAGCCG 174
******************** **************************************
TcAP1
Seq
GTTGCGGCGGCCGGGGGGAAGCGCACACGCAGTCGATCCCCGTCGGCCACATCGCCGAAG 298
GTTGCGGCGGCCGGGGGGAAGCGCACACGCGGTCGATCCCCGTCGGCCACATCGCCGAAG 234
****************************** *****************************
TcAP1
Seq
AAACCCGCCACGCGTTCCACGCGAATTCGTACGCCGACACCACCTTCCCGCTCGCTAAAT 358
AAACCCGCCACGCGTTCCACGCGAATTCGTACGCCGACACCACCTTCCCGCTCGCTAAAT 294
************************************************************
TcAP1
Seq
TCTGCGGGTGCGGAGGCGACATCTCCCAATCGTCCCCTCGCGGCCGTATTGACCGCCCCG 418
TCTGCGGGTGCGGAGGCGACATCTCCCAATCGTCCCCTCGCGGCCGTATTGACCGCCCCG 354
************************************************************
TcAP1
Seq
CCACCGTCGGACGATGACACGAGGAAGACGGAGAAGGATATTTGGAGCCAAGTGGAGCCC 478
CCACCGTCGGACGATGACACGAGGAAGACGGAGAAGGATATTTGGAGCCAAGTGGAGCCC 414
************************************************************
TcAP1
Seq
TTCCAGCGCCGAACAGCGGCGAAGGATTTCGACAGCAAACATATGCTGAAATTCATCACG 538
TTCCAGCGCCGAACAGCGGCGAAGGATTTCGACAGCAAACATATGCTGAAATTCATCACG 474
************************************************************
TcAP1
Seq
TGGAATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATGACCAGGCGATCCAACGACTG 598
TGGAATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATGACCAGGCGATCCAACGACTG 534
************************************************************
TcAP1
Seq
CTCGAGGAGGAGGGGCCGGACGCGTTGTGTCTGCAGGAAACGAAGCTGAACCCGGACGAT 658
CTCGAGGAGGAGGGGCCGGACGCGTTGTGTCTGCAGGAAACGAAGCTGAACCCGGACGAT 594
************************************************************
Secuenciación del vector pPICZ-tcap1. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). TcAP1: Secuencia nucleotídica del gen codificante
para TcAP1 (GenBank access 2393782). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación automática de
DNA del plasmidio pPICZ-tcap1.
97
Seq
TcAP2
-----------------------ATGTTTATCATTAGTTGGAATGTGGCAGGGTGGTCCT 37
GCCAGCTTTCTAGAGCAATGGGAATGTTTATCATTAGTTGGAATGTGGCGGGGTGGTCCT 180
************************** **********
Seq
TcAP2
CGACGTCCCGAATGATACGAGAGGACTTTGGAAGCATTGCATCTTTTCTGCAGCGGACTC 97
CGACGTCCCGAATGATACGAGAGGACTTTGGAAGCATTGCATCTTTTCTGCAGCGGACTC 240
************************************************************
Seq
TcAP2
AAGCGGACATTGTTTGCCTACAGGAAGTGAAGGGGTCGTGGGCAAAATTAGAGGCGGATC 157
AAGCGGAAATTGTTTGCCTACAGGAAGTGAAGGGGTCGTGGGCAAAATTAGAGGCGGATC 300
******* ****************************************************
Seq
TcAP2
CTTGTGGTATGGGCGCCAGTGACGGCGGAAGGACGTTGGCCATCGATGGATGGGAGTCGT 217
CTTGCGGTATGGGCGCAAGTGACGGCGGAAGGACGTTGGCCATCGATGGATGGGAGTCGT 360
**** *********** *******************************************
Seq
TcAP2
TTTGGTCCTTCAGTGGTAAAGCACACCGTGGATTCAATGGGGTGGTGTCATTTGTCCGGA 277
TTTGGTCCTTCAGTGGTAAAGCACACCGTGGATTCAATGGGGTGGTGTCATTTGTCCGGA 420
************************************************************
Seq
TcAP2
AGGATCTCACATGGTGGTGTGACTCCCGTCCGTTTAGTGAAGAGGATTTGAATGATGAAG 337
AGGATCTCACATGGTGGTGTGACTCCCGTCCGTTTAGTGAAGAGGATTTGAATGATGAAG 480
************************************************************
Seq
TcAP2
GCCGTGTGATTGTCACCTGCCATAGTGCCTTTGTGGTGGTGAACACGTACGTCGTGAACG 397
GCCGTGTGATTGTCACCTGCCATAGTGCCTTTGTGGTGGTGAACACGTACGTCGTGAACG 540
************************************************************
Seq
TcAP2
CCCGTCATGGCCAACGCATGGCGTTTAAAATGCGTTTTTTGTCCAGTCTAAAAAATCTTT 457
CCCGTCATGGCCAACGCATGGCGTTTAAAATGCGTTTTTTGTCCAGCCTAAAAAATCTTT 600
********************************************** *************
Secuenciación del vector pPICZ-tcap2. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación
automática de DNA del plasmidio pPICZ-tcap2. TcAP2: Secuencia nucleotídica del gen codificante para
TcAP2 (GenBank access 71654547).
98
TcAP1
Seq
-----------------------------------------ATGCCGTCGGGACCTAAGG 19
CAGAAGGACTAGATCGGGGTACCTACTAGTGCAATGTCGGAATGCCGTCGGGACCTAAGG 60
*******************
TcAP1
Seq
AACAGAAG-CCGGTTGCGGCGGCCGGGGGGAAGCGCACACGCAGTCGATCCCCGTCGGCC 78
AACAGAATGCCGGTTGCGGCGGCCGGGGGGAAGCGCACACGCGGTCGATCCCCGTCGGCC 120
******* *********************************.*****************
TcAP1
Seq
ACATCGCCGAAGAAACCCGCCACGCGTTCCACGCGAATTCGTACGCCGACACCACCTTCC 138
ACATCGCCGAAGAAACCCGCCACGCGTTCCACGCGAATTCGTACGCCGACACCACCTTCC 180
************************************************************
TcAP1
Seq
CGCTCGCTAAATTCTGCGGGTGCGGAGGCGACATCTCCCAATCGTCCCCTCGCGGCCGTA 198
CGCTCGCTAAATTCTGCGGGTGCGGAGGCGACATCTCCCAATCGTCCCCTCGCGGCCGTA 240
************************************************************
TcAP1
Seq
TTGACCGCCCCGCCACCGTCGGACGATGACACGAGGAAGACGGAGAAGGATATTTGGAGC 258
TTGACCGCCCCGCCACCGTCGGACGATGACACGAGGAAGACGGAGAAGGATATTTGGAGC 300
************************************************************
TcAP1
Seq
CAAGTGGAGCCCTTCCAGCGCCGAACAGCGGCGAAGGATTTCGACAGCAAACATATGCTG 318
CAAGTGGAGCCCTTCCAGCGCCGAACAGCGGCGAAGGATTTCGACAGCAAACATATGCTG 360
************************************************************
TcAP1
Seq
AAATTCATCACGTGGAATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATGACCAGGCG 378
AAATTCATCACGTGGAATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATGACCAGGCG 420
************************************************************
Secuenciación del vector pMT/V5-tcap1. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). TcAP1: Secuencia nucleotídica del gen codificante
para TcAP1 (GenBank access 2393782). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación automática de
DNA del plasmidio pMT/V5-tcap1.
99
Seq
-------------------------------ATGTTTATCATTAGTTGGAATGTGGCAGG 29
TcAP2
AAAGAGGACTAGATCGGGGTACCGCATGGGAATGTTTATCATTAGTTGGAATGTGGCGGG 60
************************** **
Seq
GTG-GTCCTCGACGTCCCGAATGATACGAGAGGACTTTGGAAGCATTGCATCTTTTCTGC 88
TcAP2
GTGTGTCCTCGACGTCCCGAATGATACGAGAGGACTTTGGAAGCATTGCATCTTTTCTGC 120
*** ********************************************************
Seq
AGCGGACTCAAGCGGACATTGTTTGCCTACAGGAAGTGAAGGGGTCGTGGGCAAAATTAG 148
TcAP2
AGCGGACTCAAGCGGAAATTGTTTGCCTACAGGAAGTGAAGGGGTCGTGGGCAAAATTAG 180
**************** *******************************************
Seq
AGGCGGATCCTTGTGGTATGGGCGCCAGTGACGGCGGAAGGACGTTGGCCATCGATGGAT 208
TcAP2
AGGCGGATCCTTGCGGTATGGGCGCAAGTGACGGCGGAAGGACGTTGGCCATCGATGGAT 240
************* *********** **********************************
Seq
GGGAGTCGTTTTGGTCCTTCAGTGGTAAAGCACACCGTGGATTCAATGGGGTGGTGTCAT 268
TcAP2
GGGAGTCGTTTTGGTCCTTCAGTGGTAAAGCACACCGTGGATTCAATGGGGTGGTGTCAT 300
************************************************************
Seq
TTGTCCGGAAGGATCTCACATGGTGGTGTGACTCCCGTCCGTTTAGTGAAGAGGATTTGA 328
TcAP2
TTGTCCGGAAGGATCTCACATGGTGGTGTGACTCCCGTCCGTTTAGTGAAGAGGATTTGA 360
************************************************************
Seq
ATGATGAAGGCCGTGTGATTGTCACCTGCCATAGTGCCTTTGTGGTGGTGAACACGTACG 388
TcAP2
ATGATGAAGGCCGTGTGATTGTCACCTGCCATAGTGCCTTTGTGGTGGTGAACACGTACG 420
************************************************************
Secuenciación del vector pMT/V5-tcap2. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación
automática de DNA del plasmidio pMT/V5-tcap2. TcAP2: Secuencia nucleotídica del gen codificante para
TcAP2 (GenBank access 71654547).
100
tcap1
Seq
--------------ATGCCGTCGGGACCTAAGGAACAGAAGCCGGTTGCGGCGGCCGGGG
CCACCAGATCTGCCATGCCGTCGGGACCTAAGGAACAGAAGCCGGTTGCGGCGGCCGGGG
**********************************************
tcap1
Seq
GGAAGCGCACACGCAGTCGATCCCCGTCGGCCACATCGCCGAAGAAACCCGCCACGCGTT
GGAAGCGCACACGCAGTCGATCCCCGTCGGCCACATCGCCGAAGAAACCCGCCACGCGTT
************************************************************
tcap1
Seq
CCACGCGAATTCGTACGCCGACACCACCTTCCCGCTCGCTAAATTCTGCGGGTGCGGAGG
CCACGCGAATTCGTACGCCGACACCACCTTCCCGCTCGCTAAATTCTGCGGGTGCGGAGG
************************************************************
tcap1
Seq
CGACATCTCCCAATCGTCCCCTCGCGGCCGTATTGACCGCCCCGCCACCGTCGGACGATG
CGACATCTCCCAATCGTCCCCTCGCGGCCGTATTGACCGCCCCGCCACCGTCGGACGATG
************************************************************
tcap1
Seq
ACACGAGGAAGACGGAGAAGGATATTTGGAGCCAAGTGGAGCCCTTCCAGCGCCGAACAG
ACACGAGGAAGACGGAGAAGGATATTTGGAGCCAAGTGGAGCCCTTCCAGCGCCGAACAG
************************************************************
tcap1
Seq
CGGCGAAGGATTTCGACAGCAAACATATGCTGAAATTCATCACGTGGAATGTTGCTGGCC
CGGCGAAGGATTTCGACAGCAAACATATGCTGAAATTCATCACGTGGAATGTTGCTGGCC
************************************************************
tcap1
Seq
TGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATGACCAGGCGATCCAACGACTGCTCGAGGAGGAGGGGC
TGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATGACCAGGCGATCCAACGACTGCTCGAGGAGGAGGGGC
************************************************************
tcap1
Seq
CGGACGCGTTGTGTCTGCAGGAAACGAAGCTGAACCCGGACGATCCACAAAATGAAAAGT
CGGACGCGTTGTGTCTGCAGGAAACGAAGCTGAACCCGGACGATCCACAAAATGAAAAGT
************************************************************
Secuenciación del vector pLEXSY-tcap1. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). TcAP1: Secuencia nucleotídica del gen codificante
para TcAP1 (GenBank access 2393782). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación automática de
DNA del plasmidio pLEXSY-tcap1.
101
tcap1
Seq
tcap1
Seq
tcap1
Seq
tcap1
Seq
tcap1
Seq
tcap1
Seq
tcap1
Seq
tcap1
Seq
--------------------------ATGCCGTCGGGACCTAAGGAACAGAAGCCGGTTG
TGCTGTGCCTTGCCACCAGATCTGCCATGCCGTCGGGACCTAAGGAACAGAAGCCGGTTG
**********************************
CGGCGGCCGGGGGGAAGCGCACACGCAGTCGATCCCCGTCGGCCACATCGCCGAAGAAAC
CGGCGGCCGGGGGGAAGCGCACACGCGGTCGATCCCCGTCGGCCACATCGCCGAAGAAAC
************************** *********************************
CCGCCACGCGTTCCACGCGAATTCGTACGCCGACACCACCTTCCCGCTCGCTAAATTCTG
CCGCCACGCGTTCCACGCGAATTCGTACGCCGACACCACCTTCCCGCTCGCTAAATTCTG
************************************************************
CGGGTGCGGAGGCGACATCTCCCAATCGTCCCCTCGCGGCCGTATTGACCGCCCCGCCAC
CGGGTGCGGAGGCGACATCTCCCAATCGTCCCCTCGCGGCCGTATTGACCGCCCCGCCAC
************************************************************
CGTCGGACGATGACACGAGGAAGACGGAGAAGGATATTTGGAGCCAAGTGGAGCCCTTCC
CGTCGGACGATGACACGAGGAAGACGGAGAAGGATATTTGGAGCCAAGTGGAGCCCTTCC
************************************************************
AGCGCCGAACAGCGGCGAAGGATTTCGACAGCAAACATATGCTGAAATTCATCACGTGGA
AGCGCCGAACAGCGGCGAAGGATTTCGACAGCAAACATATGCTGAAATTCATCACGTGGA
************************************************************
ATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATGACCAGGCGATCCAACGACTGCTCG
ATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATGACCAGGCGATCCAACGACTGCTCG
************************************************************
AGGAGGAGGGGCCGGACGCGTTGTGTCTGCAGGAAACGAAGCTGAACCCGGACGATCCAC
AGGAGGAGGGGCCGGACGCGTTGTGTCTGCAGCAAACGAAGCTGAACCCGGACGATCCAC
******************************** ***************************
Secuenciación del vector pLEXSY-tcap1-dn. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). TcAP1: Secuencia nucleotídica del gen codificante
para TcAP1 (GenBank access 2393782). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación automática de
DNA del plasmidio pLEXSY-tcap1-dn. En amarillo se destaca una de las mutaciones introducidas en la
secuencia para generar el dominante negativo (GAA →CAA).
102
tcap2
Seq
tcap2
Seq
tcap2
Seq
tcap2
Seq
tcap2
Seq
tcap2
Seq
tcap2
Seq
--------------ATGTTTATCATTAGTTGGAATGTGGCAGGGTGGTCCTCGACGTCCC
CCACCAGATCTGCCATGTTTATCATTAGTTGGAATGTGGCGGGGTGGTCCTCGACGTCCC
************************** *******************
GAATG-ATACGAGAGGACTTTGGAAGCATTGCATCTTTTCTGCAGCGGACTCAAGCGGAC
GAAAGGATACGAGAGGACTTTGGAAGCATTGCATCTTTTCTGCAGCGGACTCAAGCGGAA
*** * *****************************************************
ATTGTTTGCCTACAGGAAGTGAAGGGGTCGTGGGCAAAATTAGAGGCGGATCCTTGTGGT
ATTGTTTGCCTACAGGAAGTGAAGGGGTCGTGGGCAAAATTAGAGGCGGATCCTTGCGGT
******************************************************** ***
ATGGGCGCCAGTGACGGCGGAAGGACGTTGGCCATCGATGGATGGGAGTCGTTTTGGTCC
ATGGGCGCAAGTGACGGCGGAAGGACGTTGGCCATCGATGGATGGGAGTCGTTTTGGTCC
******** ***************************************************
TTCAGTGGTAAAGCACACCGTGGATTCAATGGGGTGGTGTCATTTGTCCGGAAGGATCTC
TTCAGTGGTAAAGCACACCGTGGATTCAATGGGGTGGTGTCATTTGTCCGGAAGGATCTC
************************************************************
ACATGGTGGTGTGACTCCCGTCCGTTTAGTGAAGAGGATTTGAATGATGAAGGCCGTGTG
ACATGGTGGTGTGACTCCCGTCCGTTTAGTGAAGAGGATTTGAATGATGAAGGCCGTGTG
************************************************************
ATTGTCACCTGCCATAGTGCCTTTGTGGTGGTGAACACGTACGTCGTGAACGCCCGTCAT
ATTGTCACCTGCCATAGTGCCTTTGTGGTGGTGAACACGTACGTCGTGAACGCCCGTCAT
************************************************************
Secuenciación del vector pLEXSY-tcap2. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación
automática de DNA del plasmidio pLEXSY-tcap2. TcAP2: Secuencia nucleotídica del gen codificante para
TcAP2 (GenBank access 71654547).
103
Seq
TcAP2
CCAGATCTGCCATGTTTATCATTAGTTGGAATGTGGCGGGGTGGTCCTCGACGTCCCGAA 120
-----------ATGTTTATCATTAGTTGGAATGTGGCAGGGTGGTCCTCGACGTCCCGAA 49
************************** **********************
Seq
TcAP2
TGATACGAGAGGACTTTGGAAGCATTGCATCTTTTCTGCAGCGGACTCAAGCGGAAATTG 180
TGATACGAGAGGACTTTGGAAGCATTGCATCTTTTCTGCAGCGGACTCAAGCGGACATTG 109
******************************************************* ****
Seq
TcAP2
TTTGCCTACAGCAAGTGAAGGGGTCGTGGGCAAAATTAGAGGCGGATCCTTGCGGTATGG 240
TTTGCCTACAGGAAGTGAAGGGGTCGTGGGCAAAATTAGAGGCGGATCCTTGTGGTATGG 169
*********** **************************************** *******
Seq
TcAP2
GCGCAAGTGACGGCGGAAGGACGTTGGCCATCGATGGATGGGAGTCGTTTTGGTCCTTCA 300
GCGCCAGTGACGGCGGAAGGACGTTGGCCATCGATGGATGGGAGTCGTTTTGGTCCTTCA 229
**** *******************************************************
Seq
TcAP2
GTGGTAAAGCACACCGTGGATTCAATGGGGTGGTGTCATTTGTCCGGAAGGATCTCACAT 360
GTGGTAAAGCACACCGTGGATTCAATGGGGTGGTGTCATTTGTCCGGAAGGATCTCACAT 289
************************************************************
Seq
TcAP2
GGTGGTGTGACTCCCGTCCGTTTAGTGAAGAGGATTTGAATGATGAAGGCCGTGTGATTG 420
GGTGGTGTGACTCCCGTCCGTTTAGTGAAGAGGATTTGAATGATGAAGGCCGTGTGATTG 349
************************************************************
Seq
TcAP2
TCACCTGCCATAGTGCCTTTGTGGTGGTGAACACGTACGTCGTGAACGCCCGTCATGGCC 480
TCACCTGCCATAGTGCCTTTGTGGTGGTGAACACGTACGTCGTGAACGCCCGTCATGGCC 409
************************************************************
Secuenciación del vector pLEXSY-tcap2-dn. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación
automática de DNA del plasmidio pLEXSY-tcap2-dn. TcAP2: Secuencia nucleotídica del gen codificante para
TcAP2 (GenBank access 71654547).En amarillo se destaca una de las mutaciones introducidas en la
secuencia para generar el dominante negativo (GAA → CAA).
104
TcAP1
Seq
--------------------------------------------------ATGCCGTCGG 10
TATGATGTCTTTTCTTTTTTTTTTTTGCTCTATAAGTTGTCTTGTCTAGAATGCCGTCGG 180
**********
TcAP1
Seq
GACCTAAGGAACAGAAGCCGGTTGCGGCGGCCGGGGGGAAGCGCACACGCAGTCGATCCC 70
GACCTAAGGAACAGAAGCCGGTTGCGGCGGCCGGGGGGAAGCGCACACGCAGTCGATCCC 240
************************************************************
TcAP1
Seq
CGTCGGCCACATCGCCGAAGAAACCCGCCACGCGTTCCACGCGAATTCGTACGCCGACAC 130
CGTCGGCCACATCGCCGAAGAAACCCGCCACGCGTTCCACGCGAATTCGTACGCCGACAC 300
************************************************************
TcAP1
Seq
CACCTTCCCGCTCGCTAAATTCTGCGGGTGCGGAGGCGACATCTCCCAATCGTCCCCTCG 190
CACCTTCCCGCTCGCTAAATTCTGCGGGTGCGGAGGCGACATCTCCCAATCGTCCCCTCG 360
************************************************************
TcAP1
Seq
CGGCCGTATTGACCGCCCCGCCACCGTCGGACGATGACACGAGGAAGACGGAGAAGGATA 250
CGGCCGTATTGACCGCCCCGCCACCGTCGGACGATGACACGAGGAAGACGGAGAAGGATA 420
************************************************************
TcAP1
Seq
TTTGGAGCCAAGTGGAGCCCTTCCAGCGCCGAACAGCGGCGAAGGATTTCGACAGCAAAC 310
TTTGGAGCCAAGTGGAGCCCTTCCAGCGCCGAACAGCGGCGAAGGATTTCGACAGCAAAC 480
************************************************************
TcAP1
Seq
ATATGCTGAAATTCATCACGTGGAATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATG 370
ATATGCTGAAATTCATCACGTGGAATGTTGCTGGCCTGCGTGGGCTGCTGCGGAAGGATG 540
************************************************************
TcAP1
Seq
ACCAGGCGATCCAACGACTGCTCGAGGAGGAGGGGCCGGACGCGTTGTGTCTGCAGGAAA 430
ACCAGGCGATCCAACGACTGCTCGAGGAGGAGGGGCCGGACGCGTTGTGTCTGCAGGAAA 600
************************************************************
Secuenciación del vector pTREX-gfp-tcap1. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación
automática de DNA del plasmidio pTREX-gfp-tcap1. TcAP1: Secuencia nucleotídica del gen codificante para
TcAP1 (GenBank access 2393782).
105
TcAP2
Seq
---------------------------------------------------ATGTTTATC 9
TTATGATGTCTTTTCTTTTTTTTTTTTGCTCTATAAGTTGTCTTGTCTAGAATGTTTATC 180
*********
TcAP2
Seq
ATTAGTTGGAATGTGGCAGGGTGGTCCTCGACGTCCCGAATGATACGAGAGGACTTTGGA 69
ATTAGTTGGAATGTGGCGGGGTGGTCCTCGACGTCCCGAATGATACGAGAGGACTTTGGA 240
***************** ******************************************
TcAP2
Seq
AGCATTGCATCTTTTCTGCAGCGGACTCAAGCGGACATTGTTTGCCTACAGGAAGTGAAG 129
AGCATTGCATCTTTTCTGCAGCGGACTCAAGCGGAAATTGTTTGCCTACAGGAAGTGAAG 300
*********************************** ************************
TcAP2
Seq
GGGTCGTGGGCAAAATTAGAGGCGGATCCTTGTGGTATGGGCGCCAGTGACGGCGGAAGG 189
GGGTCGTGGGCAAAATTAGAGGCGGATCCTTGCGGTATGGGCGCAAGTGACGGCGGAAGG 360
******************************** *********** ***************
TcAP2
Seq
ACGTTGGCCATCGATGGATGGGAGTCGTTTTGGTCCTTCAGTGGTAAAGCACACCGTGGA 249
ACGTTGGCCATCGATGGATGGGAGTCGTTTTGGTCCTTCAGTGGTAAAGCACACCGTGGA 420
************************************************************
TcAP2
Seq
TTCAATGGGGTGGTGTCATTTGTCCGGAAGGATCTCACATGGTGGTGTGACTCCCGTCCG 309
TTCAATGGGGTGGTGTCATTTGTCCGGAAGGATCTCACATGGTGGTGTGACTCCCGTCCG 480
************************************************************
TcAP2
Seq
TTTAGTGAAGAGGATTTGAATGATGAAGGCCGTGTGATTGTCACCTGCCATAGTGCCTTT 369
TTTAGTGAAGAGGATTTGAATGATGAAGGCCGTGTGATTGTCACCTGCCATAGTGCCTTT 540
************************************************************
TcAP2
Seq
GTGGTGGTGAACACGTACGTCGTGAACGCCCGTCATGGCCAACGCATGGCGTTTAAAATG 429
GTGGTGGTGAACACGTACGTCGTGAACGCCCGTCATGGCCAACGCATGGCGTTTAAAATG 600
************************************************************
Secuenciación del vector pTREX-gfp-tcap2. Alineamiento realizado utilizando el programa Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Seq: Secuencia obtenida mediante secuenciación
automática de DNA del plasmidio pTREX-gfp-tcap2. TcAP2: Secuencia nucleotídica del gen codificante para
TcAP2 (GenBank access 71654547).
106