n por hormonas tiroideas de genes de se?alizaci?

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Regulación por hormonas tiroideas de
genes de señalización involucrados en
vías de sobrevida y proliferación en
células de linfoma T
Lic. María Florencia Cayrol
Directora: Dra. Graciela Cremaschi
Co-Director: Dr. Leandro Cerchietti
Lugar de Trabajo: Instituto de Investigaciones Biomédicas –CONICET.
Facultad de Ciencias Médicas, Pontificia Universidad Católica Argentina
2014
1
Los trabajos publicados relacionados con este trabajo de tesis se detallan
a continuación:
Induction of apoptosis in T lymphoma cells by long-term treatment with
thyroxine involves PKCz nitration by nitric oxide synthase. Barreiro Arcos ML,
Sterle HA, Vercelli C, Valli E, Cayrol MF, Klecha AJ, Paulazo MA, Diaz Flaqué
MC, Franchi AM, Cremaschi GA. Apoptosis. 2013, 18 (11): 1376-90.
Thyroid status modulates T lymphoma growth via cell cycle regulatory proteins
and angiogenesis. Sterle HA, Valli E, Cayrol F, Paulazo MA, Martinel Lamas
DJ, Diaz Flaqué MC, Klecha AJ, Colombo L, Medina VA, Cremaschi GA,
Barreiro Arcos ML. J Endocrinol. 2014, 222 (2): 243-55.
Integrin αvβ3 acting as membrane receptor for thyroid hormones mediates
angiogenesis in malignant T cells. Florencia Cayrol, María Celeste Díaz
Flaqué, Tharu Fernando, Shao Ning Yang, Helena Andrea Sterle, Marcela
Bolontrade, Mariana Amorós, Blanca Isse, Ricardo Norberto Farías, Haelee
Ahn, Ye F. Tian, Fabrizio Tabbo, Ankur Singh, Giorgio Inghirami, Leandro
Cerchietti,
Graciela
Alicia
Cremaschi.
Blood
Journal.
En
prensa
2
Agradecimientos
En primer lugar quisiera agradecer a mis compañeros de laboratorio que
hicieron que la realización de este trabajo haya sido una de las experiencias
más enriquecedoras de mi vida, no solo a nivel profesional sino también a nivel
personal. De cada uno de ellos aprendí algo. A mi directora, Graciela, le
agradezco haberme dado la oportunidad de formar parte de su grupo de trabajo
en un momento donde se me hacía difìcil creer que uno se podía desarrollar en
un lugar con obvias exigencias profesionales, pero rodeado de un ambiente de
respeto, alegría y cariño. Por formarme y hacerme crecer tanto a nivel científico
como personal, siempre con mucho amor y compañía, pero también mucha
libertad. Gracias Gra por dejarme ser, quererme tal cual soy y acompañarme
en todas mis locuras. A María Laura y Alicia por su preocupación y por siempre
estar dispuestas a darme una mano cuando lo necesito. A Cele, Lenki, Ale y
Edu por la compañía diaria con ricos mates, por las charlas sinceras cuando se
plantean ciertos problemas, los consejos y por su colaboración en los
experimentos realizados en este trabajo. También por todos los momentos
divertidos y salidas que pasamos juntos.
Quiero agradecer a mi co-director el Dr. Leandro Cerchietti el cual, en primer
lugar, me abrió las puertas de su laboratorio en el Weill Cornell Medical
College, y me permitió trabajar en un lugar de excelencia y conocer a personas
increíbles. Gracias por tus enseñanzas que me formaron y me hicieron crecer
tanto a nivel profesional como personal, por hacerme dar cuenta que se puede
hacer buena ciencia básica pensando en una aplicación clínica y por todos los
momentos increíbles vividos en NY. De esa experiencia conocí excelentes
personas, de las cuales aprendí muchísimo y compartí muchisimos momentos
de alegría e hicieron que mi estadía en NY sea una experiencia inolvidable.
Quisiera agradecer a Lali, Maca, Carla, María, Kolko, Diego, Gabriel, Fabio,
Cristian, Francisco y todos los compañeros del BIOMED, por siempre estar
dispuestos a ayudar, por la buena onda en los almuerzos, las charlas, los
chistes y todos los momentos compartidos. También quiero agradecer al Dr.
Santa Coloma por ofrecernos y permitirnos trabajar en un hermoso instituto.
3
A toda la gente del CEFYBO, lugar donde comencé este trabajo. A Ana Genaro
por su apoyo desde el inicio, a María, Miriam, María Rosa por su compañía.
Especialmente a Ceci, Dami, Bere, Romi, Yami, Joy y Emi con quienes
compartimos y seguiremos compartiendo momentos y experiencias tan lindas y
divertidas.
Quiero agradecer también a la Dra. Bolontrade y a Mariana Amorós con
quienes realizamos ensayos in vivo y de migración. Al Dr. Diego Martinel, por
su ayuda con los resultados de inmunohistoquímica y al Dr. Adrian Góngora
por su ayuda en los ensayos donde se utilizaron los anticuerpos anti-VEGF. Al
Dr. Ravinobich por siempre estar presente, especialmente, por haberme guíado
en un momento profesional muy difícil y ayudarme a encontrar el camino que
terminó llevandome a la realización de este trabajo.
Agradecer a la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, y al
CONICET, instituciones por las cuales a través de las becas otorgadas me
permitieron desarrollar esta etapa de mi vida científica.
A nivel personal, quiero agradecer a mis amigos de la UNQUI, Ana, Romi,
Gustavo, Axel y Leti, que a pesar que algunos siguieron su camino y no nos
vemos tan seguido, les agradezco tantos momentos lindos, de alegría y
diversión. Gracias Ro querida por permitirme conocerte más y por compartir
tantos momentos con Tizi. Gracias Anita por escucharme, por los consejos, por
tu presencia incondicional, por alentarme y apoyarme en los momentos más
difíciles, y por quererme tal cual soy.
A la familia Montali, quiero agradecerle por dejarme formar parte de ella,
particularmente a Lili por mimarme tanto, a David por todo su apoyo y a Fran
por creer tanto en mí, y por todos los momentos compartidos junto con Mati.
A mi familia, los Cayrol y los Molina-Schierenbeck, porque siempre me
apoyaron y creyeron en mí. A mi mamá por inculcarme desde muy chica lo
importante que es el estudio y la profesión para desarrollarse en la vida. A mi
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papá, por estar siempre pendiente de mí a pesar de la distancia. Gracias por tu
constante e increíble esfuerzo, el cual hizo realidad la posibilidad de estudiar
fuera de Mar del Plata y formarme como profesional. Gracias por tus consejos y
tu apoyo incondicional que hizo posible que hoy pueda concretar esta etapa de
mí vida.
Finalmente quisiera agradecerle a Mati, mi compañero desde hace ya 7 años.
Por crecer y compartir la vida junto a mí, por estar tanto en los momentos más
divertidos y alegres, como en los más tristes y difíciles. Por apoyarme en todas
mis locuras, por soportar mis momentos de ansiedad y mal humor extremo, por
enseñarme tantas cosas importantes que quizás no tengan que ver con la
ciencia, pero sí con la vida misma. Gracias por enriquecer mi vida con tu
conocimiento, tu arte y tu música, y por compartir conmigo tantas experiencias
increíbles.
5
Resumen
RESUMEN
La proliferación, sobrevida y resistencia a drogas de las células T malignas son
dependientes de una combinación de estímulos inducidos por el microambiente
tumoral. En este trabajo se muestra que el receptor transmembrana para las
hormonas tiroideas (HTs), la integrina αVβ3, juega un rol crítico entre la
interacción de los linfomas de células T (LCT) y las señales externas del
microambiente celular. Entre los ligandos de la integrina αVβ3 puede incluirse a
proteínas extracelulares asociadas a matriz y factores solubles, como dichas
hormonas. Demostramos que las HTs son capaces de estimular la proliferación
de los LCT a través de vías de señalización intracelulares complementarias que
involucran la activación del receptor de membrana para HTs (mTR). Por lo
tanto, la hipótesis de este trabajo es que el bloqueo del mTR podría representar
una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de pacientes con LCT.
En este trabajo evaluamos el rol que ejercen las HTs en líneas celulares que
representan los distintos subtipos de LCT humanos. Se encontró que las HTs a
concentraciones fisiológicas inducen in vitro la proliferación y la transcripción de
marcadores moleculares vinculados a la progresión del ciclo celular en células
LCT. Entre ellos se induce la expresión del antígeno nuclear de células en
proliferación, PCNA, y de las ciclinas D1, D2, D3, E2 y B1. En concordancia
con lo mencionado se observó también, una disminución regulada por HTs del
inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, p21, y del supresor tumoral, p53.
Estos efectos se dan mayoritariamente por la acción de las HTs sobre el mTR.
Es por ello que, particularmente, se focalizaron los estudios en los efectos
mediados por HTs unidas a agarosa (HT-AG, impermeables a la célula) sobre
el receptor de membrana en distintos subtipos de LCT, tanto de origen
inmaduro como maduro. De estos estudios se pudo demostrar que la integrina
αVβ3 es receptor de membrana para HTs en células T malignas.
Utilizando técnicas de secuenciación del ARN y herramientas bioinformáticas,
se identificaron los programas transcripcionales activados por HTs a través de
su receptor de membrana. Se identificaron 118 y 5 transcriptos regulados de
6
Resumen
manera positiva y negativa, respectivamente. Se encontró que a través de la
activación de la integrina αvβ3, las HTs inducen vías de señalización que
involucran la expresión de genes relacionados con la “traducción” (RPL13,
RPL27A, RPL36), con
la “cadena respiratoria oxidativa”
NDUFA13,
con
UQCR11),
la
“angiogénesis”
(NUDFB1/2,
(VEGFB),
con
la
proliferación/diferenciación de linfocitos y replicación del ADN (IL4, EDF1,
DOK2). El factor de transcripción NF-κB está involucrado en la regulación
transcripcional de los genes de proliferación y angiogénesis inducidos por la
acción de las HTs a través del mTR. La regulación positiva mediada por HTs de
IL-4, VEGFA y VEGFB, es disminuida de manera significativa por el inhibidor
de NF-κB, demostrando la implicancia de este factor de transcripción sobre la
inducción transcripcional mediada por HTs.
Se ha descripto que la angiogénesis y la expresión de VEGF está asociada con
la sobrevida y el pronóstico de pacientes con LCT; es por esto que la
regulación mediada por HTs de genes vinculados a estos procesos podría
contribuir al fenotipo maligno de estos linfomas. Por consiguiente, se analizó
con mayor profundidad si la inducción transcripcional mediada por HTs se
observa en los distintos subtipos de LCT. Se encontró que las HTs no sólo son
capaces de inducir la expresión de VEGF en subtipos de LCT de origen
inmaduro y maduro, sino que además, inducen la producción del ligando VEGF
funcionalmente activo. La acción del VEGF inducido por HTs parecería influir a
los LCT a través de mecanismos autócrinos y parácrinos.
También se desarrollaron modelos in vivo donde se evaluó el crecimiento
tumoral de células inmaduras, CUTLL1, en ratones inmunodeficientes NODSCID, y se encontró que la inhibición de la integrina αVβ3, utilizando ARN de
silenciamiento, disminuye el crecimiento de los mismos. Más aún, se analizó el
efecto de un inhibidor farmacológico de la integrina αVβ3, el cilengitide, sobre
el crecimiento tumoral de la línea PTCL-NOS, OCI-Ly12, y sobre un modelo
pre-clínico de linfoma T obtenido por el trasplante de tumores derivados de
pacientes ALCL, ALK+ y ALK- en ratones humanizados. Se encontró que el
tratamiento con cilengitide induce una disminución significativa del volumen
7
Resumen
tumoral. Estos resultados nos proporcionan un marco de conocimiento para el
desarrollo de nuevos regímenes terapéuticos, donde la inhibición selectiva de
la integrina αVβ3, constituye una posible estrategia para el tratamiento de
pacientes con linfomas de células T.
8
INDICE
1. INTRODUCCIÓN................................................................................ 12
1.1 HORMONAS TIROIDEAS ...................................................................... 13
12
1.1.1 Glándula tiroides........................................................................................................ 13
1.1.2 El eje Hipotalamo-Hipofiso (Pituitario)-Tiroideo (HPT).............................................. 15
1.1.3 Síntesis y metabolismo de las hormonas tiroideas ................................................... 17
1.1.4 Efectos biológicos de las hormonas tiroideas ........................................................... 21
1.1.5 Mecanismos de acción de las hormonas tiroideas.................................................... 23
1.1.5.1 Acciones clásicas de las HTs a través de los TRs ............................................ 24
1.1.5.2 Acciones no clásicas de las HTs........................................................................ 26
1.1.5.3 La integrina αVβ 3 como receptor de membrana para HTs (mTR) ................... 27
1.2 PROLIFERACIÓN Y CICLO CELULAR.................................................. 29
1.2.1 Ciclinas ...................................................................................................................... 30
1.2.2 Inhibidores de Cdks ................................................................................................... 32
1.2.3 Genes supresores tumorales .................................................................................... 33
1.3 PROCESOS NEOPLÁSICOS................................................................. 35
1.3.1 Características generales de los procesos neoplásicos ........................................... 35
1.3.2 Participación del eje tiroideo en procesos neoplásicos............................................. 38
1.3.3 Angiogénesis ............................................................................................................. 41
1.3.4 Participación del eje tiroideo en la regulación de la angiogénesis............................ 43
1.4 LINFOMAS.............................................................................................. 45
1.4.1 Características generales de los linfomas................................................................. 45
1.4.2 Linfomas T ................................................................................................................. 46
1.4.2.1 Linfomas Periféricos no especificados de otro modo (PTCL-NOS)................... 47
1.4.2.2 Linfomas Angioinmunoblasticos (AITL).............................................................. 48
1.4.2.3 Linfomas Anaplásicos de Células Grandes (ALCL)........................................... 49
1.4.2.4 Linfomas Cutáneos de células T (CTCL) ........................................................... 49
1.4.3 Rol de la angiogénesis en los linfomas ..................................................................... 50
1.4.4 Tratamientos de Linfomas T...................................................................................... 53
1.4.4.1
Anticuerpos monoclonales............................................................................ 54
1.4.4.2 Inhibidores de las Histonas Deacetilasas (HDAC).......................................... 56
1.4.4.3 Inhibidores de proteosomas .............................................................................. 57
1.4.4.4 Drogas citotóxicas convencionales y anti-metabolitos....................................... 57
1.4.4.5 Drogas inmunomoduladoras y no-citotóxicas .................................................... 58
1.4.4.6 Inhibidores de señales de transducción............................................................. 59
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS................................................................. 60
2.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO .................................................................... 60
61
2.2. OBJETIVOS........................................................................................... 61
2.2.1. Objetivo general ....................................................................................................... 61
2.2.2 Objetivos específicos................................................................................................. 61
3. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................... 64
9
3.1 PREPARACIÓN DE LAS HORMONAS T3 Y T4 UNIDAS A AGAROSA 64
65
3.2 ENSAYOS IN-VITRO CON LINEAS CELULARES HUMANAS DE LCT .. 65
3.2.1 Líneas celulares de linfoma T.................................................................................... 65
3.2.2 Tratamientos in vitro de las líneas de LCT ................................................................ 66
3.2.3 Ensayos de proliferación celular................................................................................ 66
3.2.4 Crecimiento in vitro en cultivos en 3 dimensiones .................................................... 68
3.2.5 Transfecciones transientes con ARN de interferencia (siRNA) ................................ 69
3.2.6 Análisis por RT-PCR en tiempo real.......................................................................... 69
3.2.7 Análisis de expresión de proteínas por western blot................................................. 71
3.2.8 Análisis por citometría de flujo................................................................................... 72
3.2.9 Ensayos de migración ............................................................................................... 72
3.2.10 Ensayos de microscopía confocal........................................................................... 73
3.3 SECUENCIACIÓN DE ARNM Y MICROARREGLOS DE EXPRESIÓN . 74
3.4 ANÁLISIS DE LOS MODELOS IN-VIVO DE LCT .................................... 75
3.4.1 Ensayos in vivo de células CUTLL1 y OCI-Ly12....................................................... 75
3.4.2 Ensayos in vivo con tumores derivados de pacientes ALCL .................................... 76
3.4.3 Ensayos de Inmunohistoquímica............................................................................... 76
3.4.4 Evaluación de la apoptosis por la técnica de TUNEL ............................................... 77
3.4.5 Ensayo de unión de NF-κB activado a ADN ............................................................. 77
FIGURA 3.4: ENSAYO DE LA UNIÓN DE NF-κB ACTIVADO A ADN .......................... 78
3.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ....................................................................... 78
4. RESULTADOS .................................................................................... 79
4.1 LAS HORMONAS TIROIDEAS INDUCEN LA PROLIFERACIÓN DE LOS
LINFOMAS DE CÉLULAS T A TRAVÉS DE SUS RECEPTORES NUCLEAR
80
Y DE MEMBRANA........................................................................................ 79
4.1.1 Evaluación de la expresión del receptor nuclear y del de membrana de las hormonas
tiroideas .............................................................................................................................. 80
4.1.2 Evaluación del efecto de las hormonas tiroideas sobre la proliferación y el ciclo
celular de LCT. ................................................................................................................... 82
4.2 IDENTIFICACIÓN DEL RECEPTOR DE MEMBRANA PARA HTS EN
LINFOMAS DE CÉLULAS T HUMANOS...................................................... 91
4.2.1 La activación de la integrina αVβ3 es la responsable de los efectos proliferativos
mediados por HTs en linfomas de células T ...................................................................... 91
4.2.2 Evaluación del crecimiento regulado por HTs de células LCT en presencia del
ligando biológico de la integrina αVβ3 ............................................................................... 97
4.3 PROGRAMAS TRANSCRIPCIONALES REGULADOS POR LAS HTS A
TRAVÉS DE SU RECEPTOR DE MEMBRANA ......................................... 101
4.3.1. Las hormonas tiroideas regulan programas transcripcionales vinculados a
proliferación y angiogénesis a través del mTR ................................................................ 101
4.3.2 Las hormonas tiroideas regulan genes involucrados en proliferación y angiogénesis
a través de su receptor de membrana.............................................................................. 104
10
4.3.3 NF-κB está involucrado en la regulación transcripcional inducida por HTs sobre los
genes de proliferación y angiogénesis ............................................................................. 110
4.4 LAS HTS INDUCEN LA EXPRESIÓN DE FACTORES ANGIOGÉNICOS
FUNCIONALES .......................................................................................... 113
4.4.1 La activación de la integrina αvβ3 por HTs induce la expresión de VEGF en los
distintos subtipos de linfomas de células T. .................................................................... 113
4.4.2 La expresión de VEGF mediada por HTs a través de la integrina αvβ3 induce la
migración de células endoteliales..................................................................................... 116
4.4.3 La expresión de VEGF mediada por HTs cumple un rol autócrino sobre los LCT . 117
4.5 EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN TRANSCRIPCIONAL O DEL
BLOQUEO FARMACOLÓGICO DE LA INTEGRINA αVβ3 SOBRE EL
CRECIMIENTO IN VIVO DE LOS LCT....................................................... 120
4.5.1 La regulación negativa de la integrina αvβ3 disminuye el crecimiento tumoral in vivo
de las células CUTLL1. .................................................................................................... 120
4.5.2 La inhibición farmacológica de la integrina αvβ3 disminuye el crecimiento in vivo de
las células OCI-Ly12......................................................................................................... 123
4.5.3 La inhibición farmacológica de la integrina αvβ3 disminuye el crecimiento in vivo de
tumores ALCL derivados de pacientes............................................................................. 126
5. DISCUSIÓN....................................................................................... 129
5.1 Efectos de las hormonas tiroideas sobre la proliferación y ciclo celular de linfomas de
células T humanos............................................................................................................ 131
5.2 Identificación del receptor de membrana para HTs en linfomas humanos de células T.
.......................................................................................................................................... 135
5.3 Programas transcripcionales regulados por las hormonas tiroideas a través de su
receptor de membrana ..................................................................................................... 138
5.3 Inducción de la expresión mediada por HTs de factores angiogénicos funcionales. 141
5.4 Modelos in vivo de LCT y efecto de la inhibición de la integrina αVβ3 sobre su
crecimiento ....................................................................................................................... 145
6. CONCLUSIONES.............................................................................. 148
7. ABREVIATURAS .............................................................................. 154
8. BIBLIOGRAFÍA................................................................................. 157
11
1. INTRODUCCIÓN
Introducción
1.1 HORMONAS TIROIDEAS
1.1.1 Glándula tiroides
La tiroides es una glándula neuroéndocrina, encargada de la síntesis y
secreción de las hormonas tiroideas (HTs) tiroxina y 3,3′-5 triyodotironina (T4 y
T3 respectivamente; Figura 1.1).
Figura 1.1: Estructura de las hormonas tiroideas
La glándula tiroides se sitúa en la región infrahioidea de la parte frontal del
cuello junto al cartílago tiroides y yace sobre la tráquea, a la que rodea hasta
alcanzar posteriormente al esófago. Está compuesta por dos lóbulos, situados
del lado izquierdo y derecho respecto de la tráquea, los cuales se encuentran
conectados por el istmo. También existe un pequeño lóbulo, llamado piramidal,
en contacto con el istmo (Figura 1.2)
La tiroides está recubierta por una vaina aponeurótica que ayuda a mantener la
glándula en su posición. La porción más externa de la cápsula de la tiroides se
continúa con la aponeurosis cervical y hacia atrás con la vaina carotídea. Los
músculos infrahioideos la recubren en su cara anterior; el músculo
esternocleidomastoideo lo hace lateralmente; y por su cara posterior, está
fijada a los cartílagos tiroides y traqueal y al músculo cricofaríngeo por medio
de un engrosamiento de la aponeurosis (Dumont y col, 2008).
13
Introducción
Esta glándula, tiene un flujo sanguíneo muy alto en relación a su tamaño. Está
irrigada por las arterias tiroideas superiores, ramificaciones de la carótida
externa, e inferiores que derivan de la subclavia. Hay tres venas que la drenan,
que son las venas tiroideas superior, media e inferior y que desembocan en las
yugulares internas. Los vasos linfáticos forman alrededor de la glándula un
plexo paratiroideo. Los troncos que parten de él se dividen en linfáticos
descendentes, que terminan en ganglios situados delante de la tráquea y
encima del timo y en linfáticos ascendentes. La inervación es simpática,
proveniente del simpático cervical, y parasimpática, proveniente de los nervios
laríngeos que a su vez proceden del nervio vago. La inervación regula el
sistema vasomotor y, a través de éste la irrigación de la glándula (Dumont y
col, 2008).
Figura 1.2: Localización y estructura de la glándula tiroidea
Representación frontal de la glándula tiroides y sus límites. La tiroides, ubicada junto al
cartílago tiroides, consta de un lóbulo derecho y otro izquierdo con respecto a la
tráquea, unidos por el istmo, el cual presenta una prolongación a la que se denomina
lóbulo piramidal. El istmo se encuentra justo debajo del nivel del cartílago cricoides. Se
muestra además el ligamento cricotiroideo que une los cartílagos tiroides y cricoides.
Adaptado de: www.highlands.edu
14
Introducción
La tiroides está compuesta por folículos o acinos que pueden ser considerados,
tanto desde el punto de vista estructural como funcional, como las unidades
primarias o secretoras del órgano. Las células de los folículos son las
productoras de las hormonas y el lumen es el depósito. Las paredes del folículo
están formadas por un epitelio continuo de una célula de profundidad, el
parénquima tiroideo. Dentro del folículo y contenido en el lumen se encuentra el
coloide, constituido por una mezcla de proteínas, principalmente la tiroglobulina
(Tg), y otras iodoproteinas de menor peso molecular y proteínas séricas, entre
ellas la albúmina (Livolsi, 2001). Adicionalmente a las células foliculares,
existen células individuales o pequeños grupos de células que se ubican entre
los acinos. Estas células parafoliculares, o células C, secretan calcitonina (o
tirocalcitonina) en respuesta al aumento del calcio sérico. Fuera de los folículos
hay células endoteliales y fibroblastos (Livolsi, 2001; Koulouri y col, 2013).
1.1.2 El eje Hipotalamo-Hipofiso (Pituitario)-Tiroideo (HPT).
La señalización neuroendócrina permite la integración de las funciones
biológicas de distintos tejidos en organismos complejos, conduciendo una
respuesta coordinada e incrementando la adaptación de ese organismo a una
condición dada. El eje hipotálamo-pituitario-tiroideo (HPT) es un buen ejemplo
de como el sistema neuroendócrino regula diferentes funciones de un
organismo, tanto durante su desarrollo como en la vida adulta (Laudet, 2011;
Patel y col, 2011).
El eje hipotálamo-hipófisis-tiroideo se representa gráficamente en la Figura 1.3.
La hormona hipotalámica involucrada en el eje HPT es la liberadora de
tirotropina (TRH), y es secretada por un grupo específico de células en los
núcleos arcuato y paraventricular del hipotálamo. La TRH es un tripéptido
sintetizado a través del clivaje de una prohormona (pre-pro-TRH), cuyo
procesamiento se inicia durante el transporte axonal luego de la remoción de
un péptido señal.
La TRH se secreta al sistema venoso portal hipofisario y al unirse
específicamente a los receptores de la membrana hipofisaria, activa y estimula
15
Introducción
la secreción de la hormona hipofisaria estimulante del tiroides (TSH), por
exocitosis de los gránulos que la contienen. La unión del ligando a estos
receptores acoplados a proteína G lleva también a la fosforilación y a cambios
en la concentración de proteínas nucleares, las que interaccionan con los
genes involucrados en la síntesis de TSH, incrementando de esta manera su
transcripción.
Figura 1.3: Esquema del eje hipotálamo-hipófisis-tiroideo
Hipotálamo
Hipófisis
Glándula Tiroidea
T3 y T4
**
Representación esquemática del eje HPT. La TRH viaja a través del sistema vascular
porta hipofisario estimulando la síntesis y liberación de TSH. Esta molécula actúa en la
glándula tiroides promoviendo la biosíntesis y liberación de T3 y T4. Estas son
liberadas en la circulación general para cumplir su rol fisiológico sobre los distintos
tejidos. Adicionalmente inducen la retroalimentación negativa en la hipófisis. Adaptado
de Appleton y Lange, 1994.
La TSH, hormona glicoproteica de 30 kDa, es un heterodímero formado por dos
16
Introducción
subunidades, α y β, unidas de forma no covalente. La subunidad α es idéntica a
la de las gonadotropinas LH y FSH, mientras que la subunidad β le confiere
especificidad, siendo la que se une al receptor en la célula tiroidea. El receptor
de TSH está acoplado a proteína G, tiene 7 dominios transmembrana y se
expresa principalmente en la glándula tiroidea, aunque también fue identificado
en varios tejidos incluyendo cerebro, testículo, riñón, corazón, hueso, timo,
linfocitos, tejido adiposo y fibroblastos (Davies y col, 2002; de Lloyd y col.
2010). La TSH liberada de la hipófisis anterior, actúa a nivel de sus receptores
en la glándula tiroidea. De esta forma, activa vías de señalización que
involucran el sistema adenilatociclasa, la cual regula la síntesis y liberación a la
circulación periférica de las HTs, T4 y T3. El 80 % de la T3 proviene de la
conversión extra-tiroidea por monodeyodinación de la T4 en los tejidos
periféricos; el resto se segrega por la glándula tiroides (Koulouri y col. 2013).
Las hormonas tiroideas T3 y T4 están unidas reversiblemente en sangre a
proteínas transportadoras, principalmente a globulinas fijadoras de tiroxina
(TBG) y en menor proporción a prealbúmina fijadora de tiroxina (TBPA) y a
albúmina. La T4 libre (FT4) y la T3 libre (FT3) son las formas metabólicas
activas y son los mejores indicadores del estado de las hormonas tiroideas. La
FT4 se aproxima al 0,03 % de la T4 total y la FT3 al 0,3 % de la T3 total. Las
HTs que circulan en forma libre actúan a nivel de sus órganos diana en la
modulación del metabolismo celular o participan en el mecanismo de
retroalimentación negativa a nivel del hipotálamo y la hipófisis inhibiendo la
síntesis y liberación de TRH y TSH, respectivamente. Este control tan preciso
permite mantener constantes las concentraciones de T3 y T4 y así evitar tanto
el exceso como la carencia de estas hormonas, ambas circunstancias
sumamente adversas para el organismo, en especial en etapas tempranas de
su desarrollo.
1.1.3 Síntesis y metabolismo de las hormonas tiroideas
La síntesis de hormonas tiroideas, tiene lugar tanto en la glándula tiroides como
en el tejido periférico; su síntesis dentro de la glándula tiroides requiere de 4
17
Introducción
elementos esenciales: Iodo, Peróxido de Hidrogeno (H2O2), Tiroglobulina (Tg),
Peroxidasa tiroidea (TPO de sus siglas en inglés). Las HTs controlan a través
de una retroalimentación negativa, la liberación tanto de la hormona liberadora
de tirotropina del hipotálamo (TRH); como de la TSH en la glándula pituitaria
anterior (Lin X y col, 2004; Dietrich y col, 2012).
El folículo tiroideo es la estructura funcional responsable de la biosíntesis,
almacenamiento y secreción de las HTs. Las células tiroideas foliculares se
encuentran polarizadas y especializadas en la producción de T4 y T3. La
función celular depende, entonces, de la expresión de un set de proteínas bien
caracterizadas que están involucradas en la biosíntesis de la hormona (Kopp P,
2013).
Las HTs son sintetizadas dentro de una estructura de alto peso molecular, una
proteína tiroidea específica, llamada tiroglobulina (Tg), y permanecen unidas
covalentemente a la estructura primaria de esta molécula hasta que ocurre la
degradación proteica y la hormona es secretada. Los pasos por los cuales
estas células sintetizan y secretan las HTs se encuentran esquematizados en
la Figura 1.4:
El primer paso (A) es el transporte del ioduro por captación activa y mediante la
proteína transportadora de iodo NIS (del inglés, Na/I symporter), la cual
transporta dentro de la célula dos cationes de Sodio (Na+) por cada anión
ioduro. El ioduro es transportado desde la membrana basal a la membrana
apical, donde sale al coloide mediante una proteína transportadora del anión
denominada pendrina, localizada en la membrana apical. En el siguiente paso
(B), se produce la oxidación del ioduro a iodonio, proceso en el que participa la
tiroperoxidasa (TPO), el que se incorpora a la Tg para producir iodotirosinas. La
TPO nuevamente participa en el acoplamiento (C) de las iodotirosinas para
formar las iodotironinas T3 y T4. Para poder disponer de las mismas para su
secreción, la célula folicular capta gotitas del coloide por endocitosis (D).
18
Introducción
Figura 1.4: Síntesis de las hormonas tiroideas
LUMEN
Membrana
Apical
B
Tiroglobulina
C
D
E
F
A
Transporte
ioduro
Membrana
Basal
Se señalan los pasos que llevan a la síntesis de HTs, su almacenamiento en la Tg y
finalmente su secreción. Adaptado de: fitsweb.uchc.edu
Luego se produce la ruptura proteolítica de los enlaces que unen a las HTs a la
Tg (E) y desiodación de la T4, de modo que tanto T4 como T3 pueden acceder
al torrente sanguíneo. La liberación de las HTs (F) se da mayoritariamente en
forma de T4, siendo su concentración en suero 40 veces mayor que la de T3;
aunque, solo una pequeña proporción de las HTs circulan en forma libre con
capacidad de entrar en la célula y ejercer los efectos biológicos. (Lester Reed y
col, 2001; Dentice y Salvatore, 2011; Peying Fong, 2011).
La mayor proporción de las HTs se encuentra unida a proteínas
transportadoras. La T4 se une a la globulina transportadora de HTs (TBG) en
un 70%, a la albumina en un 20% y a la transtiretina (TTR) en un 10%. La T3
se une principalmente a TBG (80%), y el resto a TTR y a albúmina. La
19
Introducción
influencia de esta última, que tiene una afinidad más o menos baja por las HTs,
se pone de manifiesto porque su concentración plasmática es elevada (Lester
Reed, 2001).
Por otra parte, la T3 puede producirse a través de la 5’-deiodinacion del anillo
externo de la T4 por deiodinasas. La deiodinasa de tipo 1 (DIO1) se encuentra
en tejidos periféricos como el hígado y el riñón y es responsable de la
conversión de la mayor parte de T4 a T3 en circulación. La deiodinasa de tipo 2
(DIO2) tiene una distribución más amplia encontrándose en tiroides, cerebro,
pituitaria, tejido adiposo, corazón y músculo esquelético, entre otros. Esta
deiodinasa tiene como función la conversión de T4 a T3 para uso intracelular.
Este paso metabólico constituye el camino principal para la provisión de T3 en
diferentes tejidos (Gereben y col, 2008; Bianco, 2011). Por su parte, la
deiodinasa tipo 3 (DIO3), puede inactivar a la T4 formando T3 reversa o a la
T3, dando como resultado T2 y terminando así su acción hormonal. La
localización celular de las deiodinasas individuales es una característica
importante, ya que las HTs están en circulación, pero su mecanismo de acción
tiene lugar en el interior celular mediante su interacción con receptores
nucleares. Estudios realizados con modelos celulares donde esas enzimas son
expresadas transitoria o endógenamente indican que DIO1 y DIO3 se
encuentran en la membrana plasmática, mientras que DIO2 es una proteína
residente en el retículo endoplásmico (Gereben y col, 2008). Por otra parte, las
membranas celulares son relativamente impermeables a las HTs, es por esto,
que son necesarios transportadores de membrana para que las mismas
accedan al microambiente intracelular (Heuer, 2009). Una vez dentro de la
célula, la pro-hormona T4 puede ser transformada por medio de la acción de
DIO2 a T3, molécula biológicamente activa, la que difunde hacia el núcleo
eventualmente uniéndose a sus receptores (TR) y dando como resultado la
transcripción de sus genes blanco (Cheng, 2010). Por lo tanto, la señalización
que inducen las HTs puede ser modificada por efecto de las deiodinasas, ya
sea, potenciando su acción a través de la conversión de T4 a T3 por medio de
la DIO2, o inactivando su acción a través de la expresión de la DIO3. Más aún,
estos eventos suceden dentro de la célula sin que ocurran cambios relativos en
los niveles plasmáticos de las HTs (Gereben y col, 2008).
20
Introducción
Finalmente, las HTs se metabolizan periféricamente por diversas vías,
esquematizadas en la Figura 1.5, a fin de transformarlas en sustancias más
hidrosolubles para permitir su eliminación. Además de los mecanismos de
inactivación ya mencionados, tiene lugar en el hígado la conjugación, que se
puede dar con sulfato o la glucuronidación.
Figura 1.5: Conversión metabólica periférica de las hormonas tiroideas
Adaptado de slideplayer.es
1.1.4 Efectos biológicos de las hormonas tiroideas
Las HTs modulan distintos procesos fisiológicos y son críticas para el
crecimiento, desarrollo, diferenciación y mantenimiento de la homeostasis
metabólica (Oetting y Yen, 2007). Las HTs ejercen su actividad en todos los
sistemas del organismo, ya que sus receptores se expresan en casi todos los
tejidos. Dado que, cada órgano posee diferente expresión de los mismos y de
sus isoformas, y presentan distinta actividad de las deiodinasas, existen
diferencias en la respuesta a las mismas. Las principales acciones sistémicas
de estas hormonas abarcan el aumento del metabolismo basal, la estimulación
21
Introducción
de la termogénesis y la regulación del consumo de oxígeno celular. Los
cambios en la función tiroidea aumentan la captación de glucosa, la demanda
de vitaminas y modifican las concentraciones de proteínas y enzimas séricas.
Las HTs tienen la habilidad de inducir vías anabólicas y catabólicas, como la
lipogénesis y la lipólisis, contribuyendo de esta manera a la inducción del
consumo energético (Pucci y col, 2000; Brent, 2012).
Las
hormonas
tiroideas
ejercen
una
serie
de
acciones
periféricas
fundamentales para el correcto funcionamiento de varios órganos y sistemas.
Suprimen la secreción de TSH por parte de las células tirotropas hipofisarias
regulando negativamente la transcripción de sus genes por un mecanismo
mediado por la deiodinación intracelular de T4 en T3. A nivel del sistema
nervioso, tienen un papel fundamental en el desarrollo del cerebro fetal y
durante el periodo neonatal. Además regulan proteínas y glúcidos que
participan en la mielinización (Williams, 2008).
En el hígado las HTs cumplen un importante rol en la hosmeostasis lipídica
hepática (Malik y Hodgson, 2002) estimulando las enzimas que regulan la
lipogénesis y la lipólisis, induciendo la síntesis de transaminasas y de proteínas
plasmáticas y regulando la síntesis del colesterol. Son capaces de modular el
número de βARs en el corazón aumentando la sensibilidad a catecolaminas.
En el tejido adiposo, la T3 regula el consumo basal de oxígeno, el
almacenamiento graso, la lipogénesis y la lipólisis. También induce la
diferenciación del tejido adiposo y estimula la proliferación de los adipocitos
(Hulbert, 2000; Brent, 2012).
Los efectos hormonales se extienden al músculo esquelético, donde favorecen
la acción contráctil, la biosíntesis de miosina y de enzimas lisosómicas, así
como también la captación de glucosa. Un correcto funcionamiento tiroideo es
fundamental para el desarrollo óseo (Gogakos y col, 2010). Por otro lado, una
secreción
inadecuada
de
estas
hormonas
se
ha
relacionado
con
irregularidades a nivel gonadal.
22
Introducción
Si todo el eje endócrino funciona correctamente, el individuo se encuentra en
estado eutiroideo. En el caso de existir patología tiroidea primaria, se pueden
dar diferentes escenarios.
Se denomina estado hipertiroideo a aquel donde los niveles hormonales están
por encima de los normales. La consecuencia de este estado es la
exacerbación, de acuerdo a la gravedad de la patología, de todas las funciones
sistémicas y periféricas señaladas en este apartado (Potenza y col, 2009;
Hörmann y Schumm-Draeger, 2010). Por el contrario, cuando la secreción
hormonal es insuficiente y los niveles de las HTs se encuentran por debajo de
los valores normales, se denomina estado de hipotiroidismo, estando los
síntomas clínicos relacionados a una disminución del metabolismo. También se
han definido estados leves y subclínicos de estos desórdenes, caracterizados
por un aumento o reducción de la TSH circulante según se trate de hipo o
hipertiroidismo subclínicos. Como sus
nombres lo indican, en estas
circunstancias los síntomas de la enfermedad son leves o inexistentes, pero
pueden progresar a enfermedad manifiesta si no se realiza la intervención
terapéutica (Karmisholt y col, 2011). También pueden darse casos de aumento
o reducción de los niveles hormonales pero secundarios a una patología
hipotalámica o hipofisaria.
1.1.5 Mecanismos de acción de las hormonas tiroideas
La acción de las HTs se define como la modificación de la expresión de genes
mediada por los receptores nucleares para HTs (TRs). Estos receptores están
codificados por dos genes diferentes, el THRA localizado en el cromosoma 17
y el THRB en el cromosoma 3, que codifican para las proteínas TRα y TRβ
respectivamente (Yen y col, 2001). Ambos genes comparten alta homología en
su estructura proteica incluyendo el dominio de unión al ADN (DBD de su sigla
en inglés) y la porción C-terminal del dominio de unión al ligando (LBD de su
sigla en inglés). Una secuencia corta de aminoácidos entre el DBD media la
unión al ADN e impone la especificidad de la secuencia. Dentro del DBD, los
TRs reconocen elementos de respuesta a HTs (TREs) en los promotores de
sus genes blanco. Los mismos actúan como potenciadores de la transcripción
de aquellos genes que son regulados positivamente por las HTs. El LBD une
23
Introducción
10-15 veces con mayor afinidad a la T3 que a la T4 (Yen y col, 2006; Cheng y
col. 2010). Existen varias isoformas de los TRs que se dan por empalme
(splicing) alternativo. El gen THRA genera dos isoformas TRα1, TRα2, que
difieren en la región carboxilo terminal donde está ubicado el dominio de unión
a la hormona; y el gen THRB genera otras dos isoformas TRβ1 y TRβ2 a través
de la elección de un promotor alternativo (Cheng y col, 2010). Los receptores
para HTs (TRs) son factores de transcripción específicos. Los TRs se
encuentran basalmente asociados al ADN, es decir aún en ausencia de
hormona tiroidea, pero su capacidad de transcripción génica estaría impedida
por unión a correpresores (ver más adelante). La expresión de los genes para
estos receptores es variable, siendo el TRβ2 el que se encuentra involucrado
principalmente en la regulación de la producción de la TSH. En el hipotálamo,
esta isoforma es quizás la única responsable de la regulación negativa del gen
de TRH por parte de la T3 (Oetting y Yen, 2007).
1.1.5.1 Acciones clásicas de las HTs a través de los TRs
En el modelo clásico de inducción de la transcripción de genes regulada por
HTs, los TRs actúan como factores de transcripción ligando-dependientes. Una
vez que la T3 atraviesa la membrana basal se une a su receptor en el núcleo;
generando un cambio conformacional, que permite que el TR dimerice
formando homodímeros (TR/TR) o heterodimeros con el receptor de rexinoides
(TR/RXR) que son los que tienen mayor actividad biológica (Lee y Privalsky,
2005; Moeller y Broecker-Preuss, 2011; Tata, 2013). Estos complejos hormonareceptor, se unen a los TREs en el promotor de los genes blanco. En ausencia
de T3, el TR se une constitutivamente a un grupo de proteínas con actividad de
histona deacetilasa (HDAC), denominadas correpresores nucleares, las cuales
se caracterizan por reclutar otras proteínas accesorias que a su vez compactan
a los nucleosomas y reprimen el proceso de transcripción (Figura 1.6-A). En
presencia de T3, el receptor cambia de conformación y los correpresores son
liberados y reemplazados por coactivadores, lo que lleva a que la cromatina se
desenrolle, facilitándose por lo tanto la transcripción (Figura 1.6-B), (Aranda y
24
Introducción
Pascual, 2001; Oetting y Yen, 2007; Moeller y Fuhrer, 2013). En el caso de los
genes regulados negativamente el proceso es el inverso; estos pueden ser
estimulados en ausencia de hormonas e inhibidos cuando la T3 se une a su
receptor. De esta manera el TR estaría actuando como un factor de
transcripción dependiente de ligando (Yen, 2001; You y col, 2010).
Se han realizado estudios con ratones transgénicos que no expresan los genes
del TR (knockout). Los mismos muestran una gran superposición de los
patrones genéticos de expresión positiva de los genes THRA y THRB,
sugiriendo que más que la isoforma, lo más importante es la cantidad de TR
expresada (Yen y col, 2003). Sin embargo, las distintas isoformas del TR
muestran diferentes afinidades de unión al ADN en un cierto promotor y, por lo
tanto, la respuesta transcripcional a un cierto gen en un tejido particular, podría
depender de la isoforma del TR predominante (Chan y Privalsky, 2009;
Chiamolera y col, 2012).
Figura 1.6: Mecanismo de acción clásico de las hormonas tiroideas
T3
T4
Citoplasma
T3
T4
D3
D1/D2
T3
rT3
Núcleo
TRE
TR
Coactivador
RXR
TR
RXR
Corepresor
T3
Transcripción
genes blanco
TRE
A
B
Esquema que muestra la unión del TR al ADN. (A) La unión constitutiva del TR al
correpresor provoca el reclutamiento de proteínas histidina acetilasas (HDAC), lo que
causa la condensación de la cromatina y la represión de la transcripción. (B) Al unirse
la T3 al TR provoca el intercambio del correpresor por un coactivador, se descondensa
la cromatina y se facilita la transcripción. Adaptado Juvenal, 2009.
25
Introducción
El estado de fosforilación del TR podría modular positivamente la unión del
complejo de la HT a su receptor y a las secuencias TRE del ADN. Evidencias
experimentales indican que las HTs podrían inducir la fosforilación de su
receptor en sitios específicos. En tal sentido, Davis y col (2000) han
demostrado que la T4 promueve la asociación entre la proteína quinasa
activada por mitógeno (MAPK) y el TR, causando su fosforilación en residuos
específicos de serina.
1.1.5.2 Acciones no clásicas de las HTs
Existen evidencias que sugieren que las acciones no clásicas de las HTs,
podrían ser mediadas por isoformas de los receptores nucleares asociados a la
membrana plasmática, citoplasmáticos o bien por otros tipos de receptores de
membrana de alta afinidad para HTs (Bassett y col, 2003). Davis y col. (2006),
han postulado la existencia de efectos genómicos y no genómicos de las HTs
que actuarían en forma cooperativa para la activación de la cascada de las
MAPK. Entre los mecanismos no clásicos de las HTs, podemos mencionar la
inducción de cambios en los patrones de fosforilación de proteínas efectoras de
distintas vías de señalización (Shih y col, 2004, Cordeiro y col, 2013), la
modulación de la disponibilidad de segundos mensajeros (Yamauchi y col,
2008) y la modificación de la estabilidad de ARN mensajeros (SerranoNascimento y col, 2010).
Algunos años atrás y luego de varios estudios, resultó evidente que las HTs y
un TRβ citoplasmático podían actuar a través de un mecanismo diferente al
clásico: el TRβ unido al ligando puede activar, a tiempos muy cortos, la
fosfoinositol 3-quinasa (PI3K), a través de la fosforilación de la vía de
señalización Akt/PKB, la cual subsecuentemente termina modulando la
expresión génica (Simoncini y col, 2000; Lei y col, 2004; Cao y col, 2005). Este
mecanismo no clásico, es independiente de la unión del TRβ al ADN y TREs,
pero también resulta en la inducción de la expresión génica. Resultados
similares fueron luego encontrados en la acción del TRα. Por ejemplo, se
demostró la activación de PI3K en células neuronales que sobreexpresan el
TRα (Cao y col, 2009); y también se encontró una asociación entre el TRα y
26
Introducción
p85a, seguido de la fosforilación de la vía Akt/PKB y la activación de la óxido
nítrico sintasa endotelial (Hiroi y col, 2006).
1.1.5.3 La integrina αVβ3 como receptor de membrana para HTs (mTR)
En 2005, Bergh y col. demostraron que las HTs pueden unirse a una proteína
de membrana, la cual fue descripta en células fibroblásticas como la integrina
αvβ3. Dicha integrina es el receptor de vitronectina y miembro de la
superfamilia de glicoproteínas de moléculas de adhesión que median la unión
de las células a la matriz extracelular por reconocer la secuencia conservada
RGD (Arginina- Glicina- Aspartato) de varias proteínas plasmáticas y de matriz.
Las acciones de la T3 y de la T4 sobre la integrina αvβ3 como receptor de
membrana, fueron demostradas tanto en células normales, como células de
vasos sanguíneos (Davis y col, 2011; Bergh y col, 2005), en células no
cancerosas inmortalizadas, como células embriónicas de riñon; y en varios
tipos de líneas celulares tumorales, como cáncer de próstata y carcinomas
renales, entre otros (Kimbro y Simons, 2006). Utilizando modelados
matemáticos de la cinética de unión de las hormonas a la integrina, se sugirió
que el dominio de unión de HTs sobre la misma se encuentra cerca del sitio
RGD (Arginina- Glicina- Aspartato) e incluye dos sitios de unión, denominados
S1 y S2 (Figura 1.7) que transducen las señales inducidas por HTs
diferencialmente (Davis y col 2011; Freindorf y col, 2012).
El sitio S1 une exclusivamente a la T3 y activa la vía de señalización mediada
por la fosfatidilinositol 3 kinasa (PI3K) activando el TRα y la posterior activación
de genes blanco; este dominio puede ser inhibido por el análogo de la T4, el
ácido tetraiodotiroacético (tetrac), y péptidos bloqueantes RGD. El sitio S2 une
a T4, y en menor medida a T3, activando una vía de señalización que involucra
a ERK1/2 y TRβ dando como resultado proliferación celular de células
tumorales (Lin y col, 2009). Las HTs pueden, vía el sitio S2 de la integrina
αvβ3, activar ERK1/2 e inducir la expresión del factor 2 de crecimiento
fibroblástico, promoviendo así la angiogénesis (Davis, 2009).
Estas formas de acción de las HTs sobre su receptor de membrana, tienen la
potencialidad de promover el crecimiento tumoral. Por ejemplo, se ha descripto
27
Introducción
que las HTs a través de una isoforma modificada del TRα estimulan programas
proliferativos y de sobrevida, incrementando las concentraciones intracelulares
de calcio, de óxido nítrico, y dando como resultado la activación de la proteína
quinasa G II, Src, ERK y la señalización vía Akt (Kalyanaraman y col, 2014).
Figura 1.7: Sitios de unión de las HTs a la integrina αvβ3
TRα
HIF-1α
TRβ1
Proliferación
celular
Representación esquemática propuesta, basada en modelos matemáticos, de la
organización del dominio de unión de la T4 y T3 a la integrina αvβ3, y las
consecuencias funcionales río abajo de la misma en las células humanas de glioma
U87MG. El dominio de unión incluye un sitio exclusivo para T3 (sitio S1) que activa la
fosfoinositol 3-quinasa (PI3K) y conlleva a la translocación del TRα al núcleo y la
transcripción del factor de hipoxia 1α (HIF-1α). El sitio 2 une tanto T4 como T3, y
traduce las señales inducidas por HTs mediadas por la activación de ERK1/2 que
conducen a la proliferación celular a través de la acción de TRβ. Adaptado de: HungYun Lin y col, 2009.
La vía oncogénica PI3K, también activada por HTs a través de su acción sobre
su receptor de membrana (mTR), facilita el crecimiento celular y sobrevida e
inhibe la apoptosis (Chalhoub y Baker, 2009). Vía la activación de PI3K, la T3
(a través del sitio S1 de la integrina αvβ3), induce la expresión de una
subunidad del factor de transcripción inducible por hipoxia 1 (HIF1; Moeller y
col, 2005). Los genes blanco de este factor de transcripción juegan roles claves
28
Introducción
en la biología del cáncer, entre ellos la angiogénesis para la adaptación a la
hipoxia, la cual se encuentra activada en tumores de crecimiento rápido,
invasión y metástasis (Semenza, 2009). La expresión de HIF1 también es un
marcador pronóstico en los carcinomas renales, cáncer de mama y de próstata,
entre otros (Kimbro y Simons, 2006).
1.2 PROLIFERACIÓN Y CICLO CELULAR
La célula puede encontrarse en dos estados claramente diferenciados: el
estado de división o mitosis y el estado de no división o interfase. Cuando la
célula se divide entra en el ciclo celular, proceso ordenado y repetitivo en el
tiempo en el que la célula proliferante crece y se divide en dos células hijas.
El ciclo celular consta de cuatro fases bien diferenciadas fase G1, fase S, fase
G2 y fase M. (Figura 1.8)
Figura 1.8: Fases del ciclo celular
Esquema representativo de las fases del ciclo celular. Frente a estímulos proliferativos,
las células atraviesan la interfase (I), que está compuesta por las fases Gap1 (G1),
síntesis (S) y Gap2 (G2) y luego ingresan en la fase de mitosis (M), lo que lleva a la
formación de dos células hijas. Adaptado de Galderisi y col, 2003.
29
Introducción
La interfase es la fase más larga del ciclo, ocupando casi el 95% del mismo, y
comprende tres etapas:
Fase G1 (Gap 1): En esta primera fase del ciclo celular tiene lugar el
crecimiento celular, dado que la célula sintetiza proteínas y ARN para su
posterior división.
Fase S: Fase en la cual ocurre la replicación del ADN.
Fase G2 (Gap 2): Continúa el crecimiento celular y la duplicación de
proteínas y ARN, observándose cambios en la estructura celular, que indican el
principio de la división. Esta fase termina cuando los cromosomas empiezan a
condensarse al inicio de la mitosis.
La mitosis corresponde a la fase M del ciclo celular. En esta fase la célula
progenitora se divide para formar dos células hijas.
Para asegurar el correcto desarrollo del ciclo, es decir, que cada nueva célula
hija reciba un genoma completo, tanto el inicio y progresión de la fase S como
la mitosis deben ser controladas exhaustivamente. En este control del ciclo
celular son muy importantes las ciclinas, las quinasas dependientes de ciclinas
(Cdks) y sus inhibidores (CdkI) y los genes supresores tumorales.
1.2.1 Ciclinas
Las ciclinas son proteínas reguladoras del ciclo celular, que forman complejos
enzimáticos con quinasas dependientes de ciclinas (Cdks), encargadas de
fosforilar residuos de serina y treonina de proteínas regulatorias específicas.
Cada complejo ciclina-Cdk regula distintas partes del ciclo celular (Figura 1.9).
Las ciclinas D conforman la subunidad regulatoria del complejo formado con
Cdk4 o Cdk6 y son importantes durante la transición G0/G1. La ciclina D1
fosforila la proteína del retinoblastoma (Rb), bloqueando su efecto inhibitorio
sobre el factor de transcripción E2F, involucrado en la expresión de un gran
número de genes regulatorios. La ciclina D1 se ha visto sobreexpresada en
varios tipos de cáncer, incluyendo el de paratiroides (Imanishi y col, 2001;
Corbetta y col, 2007), mama (Casimiro y col, 2012), próstata, colon, linfomas y
30
Introducción
melanomas (Siddon y col, 2012) entre otros. Las alteraciones de las otras
ciclinas D en células tumorales son menos frecuentes; aunque existen trabajos
donde muestran la sobreexpresión de la ciclina D2 en ciertos tumores gástricos
y de colon (Leach y col, 1993; Takano y col, 2000) y de la ciclina D3 en algunos
subtipos de carcinomas mamarios y tumores cerebrales (Bartkova y col, 1996;
Buschges y col, 1999).
Figura 1.9: Regulación de la expresión de ciclinas a lo largo del ciclo
celular
Esquema representativo de la regulación de la expresión de ciclinas a lo largo del ciclo
celular. Adaptado de: Roberti y col, 2009
La ciclina E forma un complejo con Cdk2 en la fase G1 del ciclo celular, lo cual
es necesario para la transición G1/S. Este complejo fosforila p27/Kip1, un
inhibidor de las ciclinas D, que es degradado en el proteasoma y que además
promueve la expresión de la ciclina A y, como consecuencia, la entrada y la
progresión de la fase S.
La ciclina A forma complejos enzimáticos con Cdk1 y Cdk2 y dependiendo con
cual forma esta unión, favorece la progresión de la fase S o la transición de la
fase G2 a la fase M, respectivamente. Esta ciclina se une a importantes
reguladores del ciclo celular, como proteínas de la familia Rb, factores de
transcripción E2F1 y a proteínas de la familia p21. Cdk1 también se une a la
ciclina B, lo cual es necesario para la progresión de las células a lo largo de la
31
Introducción
fase M. Las ciclinas A y B son consideradas ciclinas mitóticas y son
rápidamente degradadas durante la mitosis.
Se ha descripto que el estado tiroideo modula la proliferación mediante la
regulación de proteínas del ciclo celular. En hepatocitos el hipertiroidismo
aumenta la expresión de las ciclinas D1, E y A y disminuye la expresión de
inhibidores de Cdks y proteínas proapoptóticas p53 y p27. Por el contrario, en
condiciones de hipotiroidismo se encontró una disminución en los niveles de
expresión de ciclinas y un incremento en la expresión de proteínas
proapoptóticas (Alisi y col, 2005). En un trabajo reciente de nuestro grupo, se
describió el aumento de las Ciclinas D1 y D3 en tumores de linfomas T crecidos
en ratones hipertiroideos. Por el contrario los tumores crecidos en ratones
hipotiroideos mostraron una disminución en la expresión de inhibidores del ciclo
celular, como CDKN2A y CDKN1B, y de supresores tumorales como p53
(Sterle y col, 2013)
1.2.2 Inhibidores de Cdks
El ciclo celular se interrumpe en respuesta a diversas señales antiproliferativas,
como a la privación de factores de crecimiento y citoquinas, o al daño al ADN,
principalmente por la inhibición de la fosforilación de la proteína de Rb. Esto
lleva a la inhibición de factores de transcripción E2F, que son necesarios para
la activación transcripcional de genes de síntesis del ADN.
Los principales mediadores de este efecto son los inhibidores de Cdks. Los
inhibidores de Cdks están divididos en dos familias: la familia CIP/KIP, que
incluye a p21 y p27 y la familia INK4, que incluye las proteínas p15 y p16.
Ambas familias difieren en su estructura, mecanismo de acción y especificidad.
Los componentes de la familia INK4 interactúan previniendo la formación
específica de complejos ciclina/Cdk e inhiben la actividad de Cdk4 y Cdk6,
ambos involucrados en el control de la fase G1. Como consecuencia de esto,
se inhibe la fosforilación de Rb, que lleva a la inhibición de la transcripción de
32
Introducción
una variedad de proteínas necesarias para la progresión de G1 a S y para la
replicación del ADN, incluyendo las ciclinas E y A. El componente más
importante de la familia es p16, que se encuentra mutado en muchas
neoplasias. Además de su rol como inhibidor del ciclo celular, participa en los
procesos de angiogénesis, invasión tumoral, diseminación celular y apoptosis,
mediante la regulación negativa de la transcripción de diversos genes
implicados en estos procesos (Mirzayans y col, 2012a y 2012b).
El silenciamiento transcripcional de genes supresores de tumores, asociado a
la metilación del ADN, es un evento epigenético común en las neoplasias
hematológicas.
Cuando hay daño al ADN se genera un aumento en la concentración y
actividad de la proteína p53, que promueve la transcripción de p21. Como
consecuencia, p21 bloquea el ciclo celular en la transición G1/S. Este freno del
ciclo celular permite a la célula reparar el ADN dañado antes de la replicación.
A su vez, p21 también ejerce su efecto sobre el ciclo celular mediante la
inhibición del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) y la degradación
de Rb (Mirzayans y col, 2012a). Asimismo, p21 inhibe también a la ciclina B1,
regulando de esta manera la transición de G2 a S (Mirzayans y col, 2012a).
Cabe mencionar que se ha descripto que la depleción in vitro de HTs inhibe la
proliferación de células de glioblastoma mediante el arresto de las células en
G1, como resultado de la inducción de p21 (Toms y col, 1998).
1.2.3 Genes supresores tumorales
Los genes supresores tumorales son fundamentales en la regulación del ciclo
celular. Su rol principal es inhibir el ciclo frente a condiciones celulares
adversas e impedir la proliferación excesiva. Estos genes se encuentran
frecuentemente mutados en diversos tipos de tumores. En linfomas los genes
supresores tumorales más frecuentemente mutados son p53, Rb y PTEN
(Murakami y Tanaka, 1991; Nagai y col, 2002).
33
Introducción
Frente a situaciones como hipoxia, daño al ADN, acortamiento de telómeros,
estrés oxidativo o activación de oncogenes, se activa p53, que a su vez activa
otras proteínas efectoras que evitan el desarrollo de neoplasias. Como ya
mencionamos anteriormente, p53 puede activar la transcripción de proteínas
que frenan el ciclo celular, como p21 y regular la expresión de proteínas
vinculadas a la apoptosis, como Bax (Chipuk y col, 2004). También regula
negativamente proteínas involucradas en la angiogénesis, como VEGF
(Ghahremani y col, 2013). Se demuestra claramente la importancia de esta
proteína como supresora tumoral en distintos estudios clínicos, donde se
observó que más del 50% de los tumores humanos en general y el 30% de los
linfomas presentan mutaciones en el gen de p53 (Soussi, 2001).
La proteína Rb también realiza un control no transcripcional del ciclo celular,
mediante la estabilización de p27. Además del control del ciclo celular en G1,
Rb tiene acciones sobre otras funciones celulares, como la diferenciación
celular (Lipinski y Jacks, 1993), mediante la interacción con enzimas
remodeladoras de la cromatina, con lo que regula la expresión global de genes
(Harbour y Dean, 2000) y el control de la estabilidad genómica (Hernando y col,
2004).
El PTEN es la fosfatasa del fosfatidilinositol (3, 4, 5)-trifosfato (PIP3). Regula
negativamente los niveles intracelulares del PIP3 y la cascada de señalización
Akt/PKB. Es un regulador de la homeostasis celular y también está relacionado
con la regulación de la migración celular y la quimiotaxis (Sulis y Parsons,
2003). A PTEN se lo considera un gen supresor de tumores, ya que se ha
reportado su mutación en un número significativo de cánceres de mama y de
próstata, en carcinomas de endometrio, glioblastomas, algunos melanomas y
en linfomas no-Hodgkin (Sakai y col, 1998).
34
Introducción
1.3 PROCESOS NEOPLÁSICOS
1.3.1 Características generales de los procesos neoplásicos
Para estudiar en profundidad el efecto de las HTs sobre el desarrollo de
neoplasias, es necesario conocer las características que distinguen a las
células tumorales de las normales y que les otorgan la capacidad de proliferar
descontroladamente y hacer metástasis en sitios distantes. A continuación se
detallan las capacidades adquiridas por las células tumorales, descriptas por
Hanahan y Weinberg en el año 2000, que se encuentran representadas en la
Figura 1.10.
Figura 1.10: Capacidades adquiridas en cáncer
Capacidades adquiridas por la mayoría de las células tumorales durante su desarrollo
a través de diversas estratégias mecanísticas. Adaptado de Hanahan y Weinberg, 2000.
Autosuficiencia de señales de crecimiento: Para dividirse, las células
normales requieren de señales de crecimiento como factores solubles,
componentes de la matriz extracelular (ECM) o moléculas de adhesión célula-
35
Introducción
célula, que se unen a sus receptores y activan la división celular. Las células
tumorales adquieren la capacidad de dividirse independientemente de estos
factores. Los mecanismos que utilizan para lograrlo incluyen la sobreexpresión
de receptores que las hacen hiperreactivas, cambios en el patrón de expresión
de integrinas hacia aquellas que generan señales que favorecen el crecimiento
y alteraciones en las cascadas de señalización intracelular.
Insensibilidad a señales anti-proliferativas: Las células tumorales pueden
adquirir la capacidad de independizarse de factores solubles o de matriz
extracelular que inhiben la división y llevan al arresto del ciclo celular. Lo hacen
principalmente mediante la activación de proteínas que regulan la entrada a la
fase G1 del ciclo celular o por la disminución de la expresión de los receptores
de factores inhibitorios.
Evasión de la apoptosis: Las células normales frente a la detección de
anormalidades, tales como daño al ADN, desbalances en las señales
intracelulares por activación de oncogenes e insuficiencia de factores de
supervivencia o hipoxia, disparan procesos de apoptosis. Sin embargo, las
células tumorales presentan mecanismos como la sobreexpresión de genes
antiapoptóticos o la pérdida de reguladores proapoptóticos que impiden estos
procesos.
Potencial proliferativo ilimitado: Las células tumorales, tienen un potencial
de crecimiento ilimitado, ya que no sufren de acortamiento de los telómeros y
no entran en senescencia. Esto es posible porque sobreexpresan la enzima
telomerasa, encargada de colocar las repeticiones de hexanucleótidos al final
del ADN de los telómeros.
Angiogénesis: Las células que conforman neoplasias incipientes en general
no tienen capacidad angiogénica, pero para poder crecer en tamaño, hacen un
“switch angiogénico” y comienzan a producir el factor de crecimiento del
endotelio vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF),
disminuyen la expresión de factores anti-angiogénicos como trombospondina 1
36
Introducción
o interferón (IFN) β o inducen cambios en la expresión de integrinas hacia
aquellas que son pro-angiogénicas.
Invasión tisular y metástasis: El asentamiento de las células tumorales en
tejidos distantes es la principal causa de muerte por cáncer. Lo que permite la
separación del tejido tumoral y la entrada en circulación, son los cambios en la
expresión
de
integrinas
y
de
proteínas
de
adhesión
célula-célula,
principalmente cadherinas, que son las que unen a las células con la matriz
extracelular, y la activación de proteasas extracelulares que degradan la matriz.
En el año 2011 Hanahan y Weinberg, han descripto otras dos características
de las células tumorales y dos factores que facilitan el establecimiento de
neoplasias. (Figura 1.11).
Figura 1.11: Capacidades adicionales adquiridas en cáncer
Capacidades adquiridas por la mayoría de las células tumorales y características
tumorales que permiten el establecimiento de todas las capacidades descriptas.
Adaptado de Hanahan y Weinberg, 2011.
La desregulación del metabolismo celular, permite la supervivencia celular
mediante la glicólisis anaeróbica, que afecta no sólo el crecimiento de las
células tumorales, sino también la migración de las mismas para la generación
37
Introducción
de metástasis. La otra, es la capacidad de evadir al sistema inmune
responsable de la eliminación de la mayoría de las células tumorales
incipientes, mediante la detección de antígenos extraños en las mismas.
Los factores descriptos que facilitan el establecimiento de neoplasias son: (i) la
aparición de mutaciones e inestabilidad genómica en las células; y (ii) el
proceso inflamatorio, que podría aportar moléculas bioactivas al microambiente
tumoral, tales como citoquinas y factores de crecimiento. En algunos tipos de
cáncer, el proceso inflamatorio está presente antes de que ocurra la
transformación maligna, mientras que, en otros casos, el cambio oncogénico
induce un microambiente inflamatorio que promueve el desarrollo del tumor
(Montovani y col, 2008).
1.3.2 Participación del eje tiroideo en procesos neoplásicos
Como se mencionó anteriormente, las HTs son esenciales para la sobrevida y
están involucradas en procesos fisiológicos como el desarrollo, el crecimiento y
el
metabolismo.
Las
enfermedades
asociadas
a
las
HTs
están
mayoritariamente relacionadas a la falta o exceso de las mismas (hipo- e
hipertiroidismo) y a sus síntomas clínicos conocidos; pero las HTs también
están asociadas al desarrollo y curso de otras patologías. El crecimiento y la
progresión tumoral, están íntimamente vinculados con el entorno celular, como
por ejemplo, la influencia del sistema inmunológico y del sistema endócrino. En
este sentido existen trabajos donde asocian a las HTs con la transformación
celular, tumorigénesis y metástasis (Hercbergs y col, 2010; Moeller y Führer,
2013) y proponen que las HTs podrían cumplir un rol importante en la inducción
de angiogénesis (Pinto y col, 2011; Mondul y col, 2012).
Teniendo en cuenta una perspectiva clínica, es importante preguntarse: ¿Las
HTs pueden influenciar la incidencia y progreso tumoral y, en última instancia,
el éxito de un tratamiento? Existen varios estudios epidemiológicos que
sustentan la hipótesis que las HTs podrían influenciar el desarrollo tumoral;
entre ellos podemos mencionar, trabajos retrospectivos donde asocian al
38
Introducción
hipertiroidismo como una condición médica que incrementa en pacientes el
riesgo de cáncer de ovario (Ness y col, 2000) y cáncer pancreático (Ko y col,
2007). También se ha descripto que los pacientes con cáncer prostático
localizado, tienen mayores niveles de T3 en comparación a pacientes con
hiperplasia prostática benigna; y asocian a los altos niveles de T3 con un mayor
estadío clínico de la enfermedad y mayor riesgo de recurrencia (Lehrer y col,
2001 y 2002). Más aún, se han realizado estudios prospectivos en pacientes
con cáncer de mama y se ha encontrado que las pacientes con hipotiroidismo
eran diagnosticadas a una mayor edad, y tenían menores estadíos clínicos y
tamaño tumoral (Cristofanilli y col, 2005; Tosovic y col, 2014), sugiriendo una
relación entre el hipotiroidismo y la presencia de cáncer de mama menos
invasivo. Por último existen también estudios más generales, donde encuentran
conexión entre la función de las HTs y el factor de riesgo a distintos tipos de
cáncer (Hellevik y col, 2009).
Uno de los métodos experimentales que se ha utilizado para demostrar que las
HTs están involucradas en el crecimiento tumoral fue el crecimiento in vivo de
líneas
tumorales
murinas
y
humanas,
en
ratones
singeneicos
o
inmunodeficientes, respectivamente, con distintos estados tiroideos. Una vez
implantadas las células, se ha medido la tasa de crecimiento tumoral y la
aparición de metástasis. Shoemaker y col (1976) realizaron uno de los primeros
estudios donde se reportó una conexión entre la sobrevida y la inducción de
hipotiroidismo en los ratones luego de la implantación de células de
adenocarcinoma mamario. Resultados similares se encontraron utilizando otras
líneas tumorales, como adenocarcinomas de próstata (Theodoussiou y col,
1999; Theodossiou y Schawrzener, 2000), hepatocarcinomas, células de
cáncer de mama (Martinez-Iglesias y col, 2009) y líneas celulares de cáncer de
pulmón (Mousa y col, 2012). Nuestro grupo de trabajo, ha demostrado que las
HTs son capaces de inducir in vitro la proliferación de las células de linfoma T
murinas BW5147 (Barreiro Arcos y col, 2006 y 2011); y que el crecimiento y
volumen tumoral de las células de linfoma murino EL-4 es mayor en los ratones
hipertiroideos (Sterle y col, 2014).
39
Introducción
El efecto estimulante de las HTs sobre la proliferación celular y la angiogénesis
vía su receptor de membrana, la integrina αVβ3, ha sido demostrado en
diversas líneas de células tumorales. Por ejemplo, el estímulo con T4 y T3
induce la proliferación de células de cáncer de pulmón humanas de manera
dosis dependiente (Mousa y col, 2012). Este efecto inductor fue inhibido tanto
in vitro como in vivo, utilizando anticuerpos anti-integrina αVβ3, como también
utilizando el análogo de la hormona T4, el ácido tetraiodotiroacético (Tetrac),
(Mousa y col, 2012). El efecto antitumoral del Tetrac también ha sido
demostrado en otros modelos de xenotrasplantes, como carcinoma medular
tiroideo, carcinoma tiroideo folicular y carcinomas renales, entre otros (Yalcin y
col, 2009 y 2010). Estas observaciones son prometedoras ya que podrían
utilizarse a futuro para que surjan nuevos tratamientos.
Por último cabe mencionar que las patologías neoplásicas pueden llevar a
alteraciones en el eje tiroideo. En este sentido, se ha descripto la disminución
de los niveles séricos de HTs en animales singeneicos transplantados con
linfomas (Besedovsky y col, 1989). También existe una correlación positiva
entre el cáncer de mama y el desarrollo de alteraciones tiroideas de origen
autoinmune (Giani y col, 1996). Las alteraciones en el metabolismo de las HTs
son dos veces más comunes en pacientes con cáncer que no han sido tratados
por su enfermedad que en individuos sanos (Dişel y col, 2012). Más aún, es
común el síndrome de T3 baja en pacientes de edad avanzada con injurias
graves o diversas enfermedades terminales, siendo un indicador de mal
pronóstico (Tognini y col, 2010). Sin embargo, también se ha detectado este
síndrome en pacientes pediátricos con linfoma Hodgkin (Mohn y col, 2001).
Teniendo en cuenta estas evidencias, se puede deducir la existencia de un
fenómeno bidireccional en el que el estado tiroideo puede afectar el balance
entre la proliferación y la muerte de las células tumorales y por otro lado, las
neoplasias por sí mismas pueden afectar la función tiroidea.
40
Introducción
1.3.3 Angiogénesis
La angiogénesis es el proceso por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos
a partir de la vasculatura normal preexistente. Este proceso ocurre en
condiciones fisiológicas, como son la embriogénesis y la reparación de heridas,
y también en condiciones patológicas, como las enfermedades inflamatorias y
el cáncer. La angiogénesis está regulada por un balance de señales
parácrinas, que incluyen factores de crecimiento y citoquinas proinflamatorias.
Estas señales promueven y regulan la proliferación y migración de células
endoteliales, remodelado de la matriz extracelular, reclutamiento de pericitos y
la estabilización de los nuevos vasos. Entre las moléculas reguladoras de este
proceso, se pueden mencionar las angiopoyetinas (Ang-1 y Ang-2), la familia
del receptor de tirosina quinasas Tie-2, el factor de crecimiento del endotelio
vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (FigueroaVega y col, 2009).
El crecimiento tumoral, la invasión y la formación de metástasis están
fuertemente relacionados con la angiogénesis. Los nuevos vasos formados
promueven el crecimiento tumoral ya que facilitan la llegada del oxígeno y
nutrientes y permiten la remoción de catabolitos. El proceso de angiogénesis
tumoral consiste en una serie de pasos regulados (Figura 1.12) donde, en
primer lugar, las células tumorales secretan factores proangiogénicos (VEGF y
FGF) activando a las células endoteliales que conforman capilares cercanos a
la zona donde se generó la neoplasia. Como consecuencia, las células
tumorales comienzan a secretar metaloproteasas de matriz (MMPs), con el fin
de degradar la matriz extracelular y migrar hacia el estímulo. Allí, las células
endoteliales proliferan y generan brotes vasculares. Estos dan lugar finalmente
al desarrollo de una red circulatoria funcional con el posicionamiento
perivascular de células de soporte, como los pericitos (Rundhaug y col, 2005).
El proceso de neoangiogénesis en cáncer es influenciado de manera crítica por
el microambiente tumoral (Carmeliet y col, 2000; Rafii y col, 2002). El mediador
más importante de la angiogénesis es el factor de crecimiento vascular. Los
miembros de la familia VEGF incluyen a VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D
41
Introducción
y al factor de crecimiento placentario (PIGF de sus siglas en inglés) y regulan
varios aspectos de la angiogénesis vascular a través de sus receptores,
VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3. El VEGF-A es producido por una gran variedad
de células tumorales como también por ciertas células asociadas al tumor
(Fukumura y col, 1998; Kim y col, 1993) y puede ejercer su función a través de
dos receptores con actividad de tirosina quinasa, VEGFR-1 y VEGFR-2
(Ferrara y col, 2003). VEGFR-2 es el principal receptor que transmite las
señales mitogénicas de VEGF-A en células endoteliales a través de la
activación de las vías de señalización Raf-Mek-Erk y PI3K-Akt (Takahashi y col,
1999).
Figura 1.12: Proceso de angiogénesis tumoral
1
2
3
4
(1) Los tumores generan hipoxia, la cual lleva a la activación de genes
proangiogénicos como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEFG) o el
factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). (2) La secreción de estos factores activa
células endoteliales de capilares cercanos preexistentes, que producen
metaloproteasas de matriz (MMPs) para romper la matriz extracelular y poder migrar
hacia el estímulo. (3) Las células endoteliales proliferan y forman brotes vasculares.
(4) El nuevo vaso sanguíneo está disponible para la oxigenación del tejido y la
eliminación de desechos. Adaptado de: Weiss y col, 2012
42
Introducción
Algunas células tumorales expresan VEGFR-1 y VEGFR-2 y se ha demostrado
que promueven la sobrevida, la proliferación y las metástasis actuando a través
de mecanismos autócrinos (Dias y col, 2001; Fragoso y col, 2006).
La expresión de VEGF está regulada por la acción del factor inducible por
hipoxia 1 o HIF-1 (del inglés hipoxia-induced factor) y por el gen supresor
tumoral von Hippel-Lindau (VHL). En condiciones de niveles normales de
oxígeno la proteína VHL marca a HIF-1 para su ubiquitinación y degradación
proteosómica. En condiciones patológicas, la inactivación de VHL da como
resultado la acumulación de HIF-1 y la regulación positiva de VEGF. Entre los
reguladores positivos del eje HIF-1/VEGF se encuentran factores de
crecimiento, como el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), los
factores de crecimiento transformante α y β (TGF-α, TGF-β); citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF) y las interleuquinas 1-α
y 6 (Yancopoulos y col, 2000); mutaciones inactivadoras de genes supresores
como p53 y PTEN (Hamada y col, 2005; Kaelin y col, 2007) y mutaciones
activadoras de proto-oncogenes como c-myc y ErbB/Her (Ferrara y col, 2005;
Dews y col, 2006; Manning y col, 2007). La activación de AKT, una molécula de
señalización río abajo de PI3K, PTEN y Ras, parece ser necesaria y suficiente
para regular la expresión de VEGF y HIF-1. Aunque existen vías de
señalización de VEGF complementarias, que involucran, entre otros factores, al
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) el cual, es producido por
las células endoteliales y cumple un rol importante en el remodelamiento y
maduración vascular (Abramsson y col, 2003).
1.3.4 Participación del eje tiroideo en la regulación de la angiogénesis
Los estudios realizados sobre la modulación de la angiogénesis por el estado
tiroideo arrojaron resultados muy diversos. Por un lado, la endostatina, un
inhibidor natural de la angiogénesis, se vio aumentada en sueros de pacientes
hipertiroideos y disminuida en pacientes hipotiroideos (Kucharz y col, 2003).
Sin embargo, se han encontrado niveles séricos aumentados de moléculas
proangiogénicas, como Tie-2 y Ang-2, en pacientes con la enfermedad de
43
Introducción
Graves, lo cual fue revertido por el tratamiento con agentes antitiroideos
(Figueroa-Vega y col, 2009).
Los efectos pro-angiogénicos de las HTs han sido descriptos tanto a través de
su receptor nuclear como el de membrana (Luidens y col, 2010). Se ha
demostrado que la hormona T3 puede mediar la proliferación de capilares en el
corazón a través del receptor TRβ, el cual actúa como factor de transcripción
(Makino y col, 2009). También se ha demostrado la acumulación de Ang-2 en
células endoteliales luego de la estimulación in vitro con análogos de las HTs
(Mousa y col, 2008).
El receptor de membrana para HTs parece estar involucrado en el efecto
proliferativo de la hormona sobre las células de los vasos sanguíneos y las
células tumorales (Cheng y col, 2010). Experimentos realizados in vitro
demuestran un efecto positivo de la hormona T4 en la inducción de la
angiogénesis, la cual sería mediada por la vía no genómica de acción de estas
hormonas (Bergh y col, 2005).
Varios trabajos han reportado la rápida inducción de la angiogénesis en el
modelo de membrana corioalantoidea de embriones de pollo (Davis y col, 2004;
Bergh y col, 2005). La integrina αvβ3, descripta como el receptor de membrana
para HTs, induce la vía de transducción MAPK e interactúa con las vías del
VEGF y FGF (Davis y col, 2004; Mousa y col, 2006; Mousa y col, 2008; Makino
y col, 2009). Los pasos que siguen a la activación de las MAPKs y la
consecuente neovascularización no se conocen completamente, pero si se
sabe que es necesaria la traslocación de ERK1/2 activado al núcleo y la
consecuente transcripción del gen para bFGF. Se ha descripto que la adición
de una proteína anti-bFGF bloquea el efecto proangiogénico de las hormonas
tiroideas (Davis y col, 2004). También se ha sugerido que la transcripción del
gen de VEGF podría estar inducida en respuesta a la acción de las HTs sobre
la integrina αvβ3 y su subsecuente activación. Es decir que las HTs podrían ser
clasificadas como moduladores proangiogénicos “no clásicos” debido a estas
acciones mediadas por su receptor de membrana (Pinto y col, 2011)
44
Introducción
1.4 LINFOMAS
1.4.1 Características generales de los linfomas
Los linfomas son un grupo heterogéneo de células cancerosas que derivan del
sistema inmune, el cual está conformado por un gran número de células
especializadas, entre las que se encuentran los linfocitos B y T. Los linfomas
conforman un grupo muy amplio de más de 40 desórdenes linfoproliferativos
llamados tumores de los tejidos linfoides y hematopoyéticos (Vardiman et al,
2009). La Organización mundial de la Salud (OMS) clasifica estos desórdenes
para definir entidades patológicas clínicamente significativas; para ello utiliza
toda la información disponible y tiene en cuenta criterios morfológicos,
inmunológicos, genéticos y clínicos (Jaffe, 2008; Vardiman y col, 2008).
Según la OMS existen dos grupos principales de linfomas, (i) los linfomas
Hodking (LH); y (ii) linfomas Non-Hodking (LNH) que junto con otros dos
subtipos, los mielomas múltiples y las enfermedades inmunoproliferativas,
conforman este grupo de enfermedades hemato- oncológicas (Jaffe, 2008).
Los LH se caracterizan por la presencia de un tipo de célula característica
llamada célula de Reed Sternberg. Entre los dos tipos principales de
enfermedad de Hodgkin están el linfoma de Hodgkin clásico y linfoma de
Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares. Los LH tiene una distribución
bimodal de ocurrencia, con el primer pico en adolescentes y jóvenes adultos
(15-34 años) y el segundo en adultos mayores de 50 años. En general, los
tratamientos para los LH son exitosos dado que el 80-90% de los pacientes
luego de un tratamiento citotóxico quedan libres de enfermedad. Sin embargo,
entre un 15-20% sufren una recaída dentro de los dos años post-tratamiento y
tienen una media de sobrevida general de 3 años (Cuccaro y col, 2014;
Romano y col, 2014).
Los LNH son aproximadamente el 90% de todos los casos e incluyen un gran
número de subtipos de neoplasias malignas heterogéneas con distintos
45
Introducción
patrones de comportamiento y respuesta al tratamiento. Entre los LNH los
linfomas de células B representan entre el 85-88% y los linfomas de células T
alrededor del 15% del total de los LNH, aunque estos porcentajes tienen
variaciones según las regiones geográficas. Entre los linfomas B podemos
mencionar la incidencia de los distintos subtipos: 30% corresponden a linfomas
difusos de células B grandes, 25 % a linfomas foliculares, 7% a linfomas de la
zona marginal asociada a mucosas de tejido linfático, 7% a leucemias
linfocíticas crónicas y 5 % a linfomas de las células del manto (Ribatti y col,
2013). Los tumores linfoides pueden clasificarse en dos categorias, indolentes
o agresivos, de acuerdo a las características de la enfermedad en el momento
de la ocurrencia y a la expectativa de vida de los pacientes en ausencia de
tratamiento. Los linfomas de células T tienen, en general, un comportamiento
clínico mucho más agresivo en comparación a los de células B (Ribatti ycol,
2013).
1.4.2 Linfomas T
Los linfomas de células T (LCT) son un grupo heterogéneo de desórdenes
clínicos
linfoproliferativos
agresivos
de
considerable
variación
clínica,
morfológica, inmunofenotípica y genética, que incluyen aproximadamente
entre el 10-15% del total de las neoplasias linfoides Non-Hodking (de Leval y
Gaulard, 2011). Con una incidencia aproximada de 1.77 x 100.000
habitantes/año, su frecuencia varía geográficamente, siendo su prevalencia
mayor en Asia (Dearden y col, 2011; Armitage, 2012).
Los LCT se dividen en inmaduros y maduros dependiendo de su origen celular.
Los linfomas de origen maduro, también llamados periféricos, son los más
frecuentes, representan aproximadamente el 12% del total de las neoplasias
linfoides y resultan de la proliferación clonal de linfocitos T maduros posttímicos. La última clasificación de neoplasias hematopoyéticas publicada por la
OMS ha dividido a este grupo de desórdenes de acuerdo a su forma de
presentación:
predominantemente
leucémica
(diseminada),
ganglionar,
extraganglionar o cutánea (Jaffe y col, 2008; Dearden y col, 2011). Las
46
Introducción
variedades más comunes incluyen: los linfomas de células T periféricas no
especificados de otro modo (PTCL-NOS, del inglés Peripheral T Cell
Lymphoma Non Otherwise Specified), los linfomas de células grandes
anaplásicos (ALCL, del inglés Anaplastic Large Cell Lymphoma) y los linfomas
de células T angioinmunoblásticos (AITL, del inglés Angioinmunoblastic T cell
Lymphoma).
Independientemente del subtipo, los linfomas T periféricos comparten ciertas
características, como por ejemplo, un comportamiento clínico muy agresivo,
refractariedad a los tratamientos quimioterapéuticos convencionales y un mal
pronóstico en general. La excepción a estas características es el caso de los
linfomas ALCL que expresan la enzima ALK (del inglés Anaplastic lymphoma
Kinase), ya que en general responden mejor al tratamiento y tienen mejor
pronóstico (Petrich y Rosen, 2013).
1.4.2.1 Linfomas Periféricos no especificados de otro modo (PTCL-NOS)
Los linfomas PTCL-NOS representan entre el 40-60% del total de los linfomas
de células T. Usualmente afectan a adultos de entre la quinta o sexta década
de vida y son más frecuentes en hombres que en mujeres. Aunque algunos
subtipos pueden seguir un curso prolongado más benigno, la gran mayoría de
pacientes con PTCL-NOS tiene mal pronóstico, debido a la combinación de un
curso clínico agresivo y a la falta de tratamientos específicos (Foss y col, 2011).
En la mayoría de los casos, al tener caracteristicas tan heterogéneas, no
pueden clasificarse según su morfología, fenotipo o biología molecular (Evens y
Gartenhaus, 2004). Sin embargo, existen algunos casos donde se han podido
distinguir variantes raras como, por ejemplo, subtipos foliculares o epiteloides
(Rüdiger y col, 2000; Geissinger y col, 2004).
A nivel clínico los PTCL-NOS son de los LNHs más agresivos debido a su muy
baja respuesta a las terapias quimioterapéuticas convencionales, los pacientes
tienen solo un 26% de posibilidades de no experimentar recaídas y un 20% de
sobrevida general de 5 años (Kahl y col, 2002; Kojima y col, 2004; Gallaminiet y
47
Introducción
col, 2004). La patobiología de los PTCL-NOS es, como para la mayoría de las
neoplasias de células T, muy poco entendida. En particular, esto sucede
porque existen muy pocos estudios que hayan explorado los perfiles de
expresión genética de este tipo de patologías (Martinez-Delgado y col, 2004;
Ballester y col, 2006; Cuadros y col, 2007; de Leval y col, 2007; Lamant y col,
2007; Piccaluga y col, 2007).
Por lo mencionado anteriormente, sería muy importante profundizar en los
estudios sobre los mecanismos moleculares que intervienen en la patogénesis
de los LCT, ya que los mismos están basados en la evaluación de genes
desregulados que resultan ser indispensables para la sobrevida de las células
linfoides y aportan información vital para el diseño y desarrollo de regímenes
terapéuticos específicos para los PTCL-NOS.
1.4.2.2 Linfomas Angioinmunoblasticos (AITL)
Los linfomas angioinmunoblásticos de células T han emergido como un subtipo
distintivo con características patobiológicas únicas que los diferencia de otros
subtipos de linfomas periféricos.
Este subtipo de LCT se observa principalmente en los adultos de edad
avanzada, con una proporción parecida entre ambos sexos. No han sido
descriptos en niños. En general los pacientes con AITL no tienen buen
pronóstico aunque se los trate intensivamente. Sin embargo, no siempre es
letal, el 30% de los pacientes tiene una sobrevida general de 7 años.
Originalmente se pensaba que los AITL eran una respuesta anormal del
sistema inmune, porque la mayoría de los pacientes presentan linfoadenopatía
generalizada, hepatoesplenomegalia, erupciones en la piel entre otros
síntomas clínicos marcados. La hipergammaglobulinemia policlonal es una de
las características que se presenta en casi todos los casos asociada con
fenómenos autoinmunes. Aunque los AITL son una malignidad de células T,
presentan una característica expansión de células B y plasmáticas, que
probablemente reflejan la función de las células neoplásicas como de células T
48
Introducción
colaboradoras foliculares (TFH). Las células B pueden estar asociadas o no al
virus de Epstein-Barr (Jaffe, 2006; Bajor-Dattilo y col, 2013).
1.4.2.3 Linfomas Anaplásicos de Células Grandes (ALCL)
Los linfomas anaplásicos de células grandes constituyen uno de los subtipos
de LCT periféricos más comunes. Se presentan más frecuentemente de forma
nodal, pero pueden presentarse también en una gran variedad de sitios
extranodales. Es más común en niños y jóvenes adultos, pero puede
presentarse a cualquier edad. Una de las características patobiológicas más
notorias es la alta expresión del marcador CD30. También es característica la
expresión positiva de marcadores citotóxicos y, en general, hay una pérdida de
marcadores pan-T, con un 75% de los casos que no presentan expresión de
CD3 (Pulford y col, 1997; Jaffe, 2001; Bajor-Dattilo y col, 2013).
Si bien la OMS provisionalmente ha incluido dos categorías de ALCL, ALK
positivas y ALK negativas (Jaffe, 2008; Vardiman y col, 2008), se ha descripto
que los ALCL-ALK negativos difieren en gran número de características con
respecto a los ALCL-ALK +. Entre estas diferencias se puede mencionar que
los ALCL-ALK- se presentan mayoritariamente en un grupo de edad más
avanzada, tienen peor pronóstico y, generalmente, presentan un pleomorfismo
nuclear mayor. Estas características sugieren que los ALCL-ALK- podrían, en
realidad, pertenecer a un grupo independiente de patologías LCT (Jaffe, 2001;
Bajor-Dattilo y col, 2013).
1.4.2.4 Linfomas Cutáneos de células T (CTCL)
Los linfomas cutáneos incluyen una gama de neoplasias primarias de la piel y
representan la segunda manifestación más común de linfomas extranodales
(Dummer y col, 2012). Se clasifican en dos grandes grupos dependiendo de las
células de las que derivan, células T o B. En muy pocos casos, también,
pueden derivar de células NK (del inglés Natural Killer) o células dendríticas
plasmocitoides (Klemke, 2014). Dos tercios de los pacientes con linfomas
49
Introducción
cutáneos son CTCL. Los tumores malignos CTLC incluyen entre otros, la
micosis Fungoide (MF), el síndrome de Sézary (SS) y el Síndrome
Linfoproliferativo CD30+ cutáneo primario, los cuales representan el 90% del
total de los CTCL.
La mayoría de los casos de MF y SS, los cuales representan entre un 54-71%
del total de los CTCL (Bradford y col, 2009), derivan de células T CD4+,
presentan pérdida del marcador CD7 y muestran bajos niveles de marcadores
de activación como CD25. Sin embargo, existen casos donde en efecto se
observa expresión del marcador CD8. La MF se caracteriza por la proliferación
de linfocitos T neoplásicos, epidermotróficos, de tamaño medio, con
manifestaciones clínicas que varian entre la presencia de manchas, placas,
tumores o eritrodermia. Por otro lado, el SS, una variante leucémica de CTCL,
se
caracteriza
por
la
manifestación
de
eritrodermia,
linfoadenopatía
generalizada y la presencia de células T neoplásicas en la piel, nódulos
linfáticos y sangre periférica.
1.4.3 Rol de la angiogénesis en los linfomas
La importancia de la angiogénesis en desórdenes linfoproliferativos fue
estudiada en relación a su impacto en la progresión de la enfermedad. Estos
estudios sugieren una gran importancia de la angiogénesis en relación al
pronóstico de los pacientes en distintos subtipos de linfomas (Kini y col, 2004;
Koster y col, 2005; Ruan y col, 2009).
El crecimiento y la progresión de los linfomas están potenciados por al menos
dos mecanismos angiogénicos distintivos:
1- Estimulación autócrina de las células tumorales a través de la expresión
de VEGF y VEGFR en las células de linfoma.
2- Influencias parácrinas del microambiente tumoral pro-angiogénico sobre
la transformación neovascular local y el reclutamiento de progenitores
derivados de médula ósea circulantes.
50
Introducción
Existe evidencia donde el infiltrado de células asociado al linfoma, constituido
por células derivadas de médula ósea, monocitos hematopoyéticos, células T y
pericitos mesenquimales, fue relacionado con la patogénesis, la angiogénesis y
el prónostico de los pacientes que presentan esta patología (Ruan, 2009).
Los factores que afectan las propiedades pro-angiogénicas de un linfoma son:
(i) los niveles de expresión de VEGF y VEGFR, (ii) la densidad microvascular
del linfoma, (iii) el microambiente tumoral y (iv) los progenitores endoteliales
circulantes.
La expresión de VEGF en células neoplásicas fue demostrada en un amplio
rango de subtipos de linfomas agresivos, que incluye, entre otros, a los
linfomas T periféricos (PTCL), a los linfomas difusos de células B grandes
(DLBCL) y al linfoma de células del manto (MCL), (Foss y col, 1997; DoussisAnagnostopoulou y col, 2002); así como también, en leucemias linfocíticas
crónicas y en linfomas linfocíticos de células pequeñas (Chen y col, 2000; Kay
y col, 2002). Como contraste, sólo una minoría de casos de linfomas foliculares
indolentes muestra una expresión variable de VEGF (Koster y col, 2005;
Jorgensen y col, 2007). Los niveles de expresión de VEGF han sido asociados
con áreas de transformación de un linfoma B indolente a un DLBCL agresivo
(Shipp y col, 2002). Más aún, los niveles séricos de VEGF correlacionan
inversamente con la sobrevida de pacientes con LNH (Bertolini y col, 1999;
Jorgensen y col, 2009).
Se ha descripto que VEGF y sus receptores se expresan en un gran número de
células de linfoma, influyendo sobre los mismos tanto por mecanismos
autócrinos como parácrinos (Doussis-Anagnostopoulou y col, 2002; Wang y
col, 2004; Jorgensen y col, 2009). El bloqueo de VEGFR-1 y VEGFR-2 redujo
el crecimiento de linfomas humanos xeno-transplantados en ratones NODSCID (Wang y col, 2004). La señalización de VEGF a través de sus receptores
confiere resistencia a la apoptosis y promueve la sobrevida de leucemias
linfocíticas crónicas, pero este efecto es revertido con inhibidores de receptores
con actividad de tirosina quinasa (Lee y col, 2004). En células de linfomas
DLBCL se ha encontrado que entre el 42-60% expresan VEGF (Ganjoo y col,
51
Introducción
2006). Específicamente sobre los LCT, existen trabajos donde se ha observado
una alta expresión de VEGF en linfomas AITL (Piccaluga y col, 2007). Por otro
lado, se ha descripto una correlación positiva entre la expresión de VEGF y un
peor pronóstico en pacientes con PTCL-NOS (Jorgensen y col, 2007 y 2009).
La densidad microvascular (DMV) mide la neovascularización de los linfomas,
la cual es generada en respuesta a las células tumorales, células proangiogénicas estromales, linfocitos T y B normales del infiltrado tumoral y
células mieloides dentro del microambiente tumoral. La DMV varía mucho entre
los distintos estudios debido a la gran heterogeneidad del estroma de los
linfomas, al amplio rango de marcadores de membrana celular utilizados para
la tinción y a las grandes diferencias en las metodologías para la clasificación
de la marcación (score). En general los scores de DMV tienden a ser más
elevados en los subtipos más agresivos de linfomas, incluyendo el linfoma de
Burkitt´s y PTCL, en comparación a linfomas de agresividad intermedia, como
DLBCL, o indolentes como los linfomas foliculares (Ribatti y col, 1996). Sin
embargo, existen estudios donde no encuentran correlación entre la DMV y
VEGF con el prónostico clínico (Ganjoo y col, 2006; Ruan y col, 2006). Estos
estudios vislumbran la heterogeneidad y complejidad de los procesos
angiogénicos en los linfomas.
El microambiente tumoral ha sido reconocido como un factor que influencia la
progresión y el crecimiento de los tumores. Se han realizado muchos estudios
de perfiles genéticos a gran escala en distintos subtipos de linfomas. En estos
estudios se ha demostrado que los perfiles genéticos que expresan las células
estromales e inmunes del infiltrado tumoral definen grupos distintivos, de
manera que esta información puede ser utilizada como una herramienta
molecular pronóstica (Dave y col, 2004; Monti y col, 2005). Se ha descripto que
grandes cantidades de macrófagos intratumorales correlacionan con mal
pronóstico en pacientes con linfomas foliculares (Taskinen y col, 2007; Canioni
y col, 2008) y que el aumento del infiltrado hematopoyético por progenitores
mieloides y monocitos correlaciona con la progresión histológica de algunos
subtipos de linfoma (Farinha y col, 2005; Ruan y col, 2006)
52
Introducción
Las células endoteliales circulantes y los niveles de VEGF parecen
correlacionar con los volúmenes tumorales de los linfomas humanos crecidos
en ratones NOD-SCID (Monestiroli y col, 2001). Por otro lado, se ha descripto
también, una disminución de los niveles de estas células en pacientes con una
respuesta completa al tratamiento (Igreja y col, 2007), sugiriendo que la
presencia de progenitores endoteliales circulantes en linfomas puede llegar a
proporcionar un potencial biomarcador específico de angiogénesis para evaluar
la respuesta luego de una terapia anti-angiogénica.
Todos los mecanismos distintivos angiogénicos mencionados en esta sección,
parecen ser importantes blancos terapéuticos o futuros biomarcadores del
pronóstico de un paciente en ciertos subtipos de LNH. El conocimiento de estas
vías podría dar como resultado la utilización de estrategias de tratamiento con
drogas anti-angiogénicas para este tipo de patologías.
1.4.4 Tratamientos de Linfomas T
Los LCT se incluyen entre el 13-15% de los 60000 LNH diagnosticados
anualmente en Estados Unidos. Este resultado estima unos 8000-9000 casos
nuevos anuales de LCT (Rodriguez-Abreu y col, 2008). A pesar de que cada
subtipo de LCT tiene relativamente baja incidencia, la carga acumulada de
estas patologías es muy significativa. La epidemiología de varios subtipos de
LCT, particularmente aquellos asociados con factores ambientales tales como
algunos virus, difiere substancialmente en distintos lugares del mundo. En
algunas regiones de Asia, América Central, América del Sur y Medio Oriente,
las neoplasias de células T pueden llegar a representar hasta un 35-40% del
total de los LNH diagnosticados y, generalmente, están asociados con el Virus
Epstain Barr (EBV) y el Virus linfotrópico de células T humanas-1 (HTLV-1)
(Jaffe y col, 2006).
Como la mayoría de los LCT son de origen maduro, en esta sección nos
focalizaremos en los tratamientos disponibles para los mismos.
53
Introducción
Con propósitos clínicos, los LCT pueden dividirse convenientemente en 2
grupos:
1- Los que involucran neoplasias primarias de piel, denominados
genéricamente Linfomas Cutáneos de células T (CTCL), los cuales son
patologías crónicas y con recaídas caracterizadas por erupciones,
prurito, fatiga y susceptibilidad a infecciones debido a la ruptura de la
protección y del sistema inmune que provee la piel.
2- Los que involucran nódulos linfáticos o sitios extra-nodales, los cuales
en su mayoría son identificados como Linfomas Periféricos de Células T.
Estos últimos, son patologías sistémicas agresivas, caracterizadas por el
alto grado de avance de la enfermedad al momento de la aparición
clínica, con un extensivo involucramiento extra-nodal y progresión clínica
rápida, con baja respuesta completa a los tratamientos, aún cuando se
utilicen protocolos con combinación de drogas quimioterapéuticas
(Savage, 2007).
Uno de los desafíos más importantes en el estudio de los LCT, es la rápida
traslación a la clínica de los conocimientos básicos que se están obteniendo
sobre la biología molecular y genética de las células T. Salvo casos
excepcionales de LCT que tienen un pronóstico más favorable, la relevancia
clínica de los marcadores de expresión, como CD8, CD4 y CD56, marcadores
citotóxicos y una variedad de oncogenes, citoquinas y receptores de
quimoquinas, no han sido estudiados en profundidad.
El objetivo principal de esta sección es proveer una síntesis de las drogas que
se han aprobado o que están en fases avanzadas de desarrollo para el
tratamiento de CTCL y PTCL.
1.4.4.1 Anticuerpos monoclonales
a. Zanolimumab: es un anticuerpo IgG1κ monoclonal dirigido contra el
antígeno CD4 (Fishwild y col, 1996). Este marcador es específico de
54
Introducción
células T y es expresado débilmente en monocitos y macrófagos.
Originalmente fue testeado para la artritis reumatoidea y la psoriasis
(Choy y col, 2000) y está siendo evaluado en estudios clínicos de fase II
y III en CTCL y PTCL (Kim y col, 2007; Rider y col, 2007).
b. Anticuerpos anti-CD30: El marcador CD30 es una glicoproteína de
membrana miembro de la familia TNF (Horie y col, 1998) que se expresa
en células B y T activadas y que en ciertas condiciones puede inducir
muerte celular (Wahl y col, 2002; Younes y col, 2003). Se la ha descripto
como una proteína con distribución restringida en ciertos tipos de
leucemias maduras de células T y en PTCL (Pizzolo y col, 1994). En la
actualidad, se están investigando varios anticuerpos contra CD30 que se
encuentran en distintas fases de estudios clínicos, entre ellos podemos
mencionar, el MDX-060 para linfomas foliculares y ALCL (Younes y col,
2003); el SGN-30 en modelos de linfomas Hodking (Wahl y col, 2002;
Younes y col, 2008).
c. Siplizumab (MEDI-507): Es un anticuerpo anti-CD2, un marcador celular
expresado en células T maduras y en células NK, sobreexpresado en
células T activadas en comparación con células en reposo. El
Siplizumab fue estudiado inicialmente en modelos murinos de AITL y
luego en estudios clínicos de fase I en leucemias/linfomas CTCL o PTCL
CD2 positivos (Criscione y col, 2007; Rodriguez-Abreu y col, 2008).
d. Alemtuzumab (Campath-1H): Es un anticuerpo IgG1κ humanizado
dirigido contra el antígeno CD52, una glicoproteína expresada en todos
los linfocitos B y T, monocitos, macrófagos, eosinófilos y células
dendríticas (Frampton y Wagstaff, 2003). CD52 se encuentra expresado
de manera variable en ciertos tipos de linfomas, incluyendo los LCT. Si
bien existen algunos estudios que demuestran que el alemtuzumab es
activo contra los LCT (Lundin y col, 2003; Zinzani y col, 2005; Dearden y
col, 2006; Bernengo y col, 2007), los ensayos clínicos hasta el momento
han sido con un número reducido de pacientes, por lo que la aprobación
para su uso todavía no está garantizada.
55
Introducción
1.4.4.2 Inhibidores de las Histonas Deacetilasas (HDAC)
Este grupo de drogas funciona a través de la modificación de las actividades
epigenéticas que ocurren dentro de las células, es decir, la regulación de la
transcripción de genes por alteraciones al ADN o en la estructura de la
cromatina (Glaser, 2007). La efectividad de la modulación epigenética en
enfermedades hemato-oncológicas, a través de la inhibición de las vías de las
histonas deacetilasas, ya ha sido descripta en varios trabajos (Bhalla, 2007).
a. Vorinostat (SAHA, Zolinza): Es un inhibidor de la actividad histona
desacetilasa que se ha estudiado en estudios clínicos de fase I en una
gran variedad de enfermedades hemato-oncológicas, donde se observó
una dosis máxima tolerable con distintas respuestas clínicas (GarciaManero y col, 2008). La FDA aprobó al Vorinostat para su uso como
droga única en el tratamiento de CTCL (Mann y col, 2007).
b. Depsipeptide (Romidepsin): Se ha demostrado una respuesta parcial de
un grupo pequeño de pacientes con CTCL y una respuesta completa en
un paciente con PTCL (Piekarz y col, 2001). Este caso dio como
resultado un estudio clínico de fase I en 37 pacientes con tumores
sólidos (Sandor y col, 2002). Se ha publicado que la combinación de
Romidepsin con doxorubicina, etopósidos, ciclofosfamida, entre otras
drogas, genera un efecto aditivo en distintas líneas celulares (Kano y
col, 2007). Estos estudios pre-clínicos ayudan a demostrar la
sensibilidad general de los linfomas T a los inhibidores de histonas
deacetilasas.
c. LBH589 (Panobinostat): es un inhibidor histona deacetilasa nuevo, que
se encuentra en estudios pre-clínicos contra células de leucemia aguda
y de mieloma (George y col, 2005; Maiso y col, 2006). También se
encuentran en desarrollo estudios clínicos de fase I y II en leucemias
mieloides agudas y CTCL (Giles y col, 2006).
56
Introducción
d. PXD-101 (Belinostat): Es una droga nueva que todavía no está
estudiada en profundidad para su uso en desórdenes linfoproliferativos
de células T, aunque ha mostrado un efecto sinérgico significativo con el
bortezomib en líneas celulares de mieloma múltiple (Feng y col, 2007).
1.4.4.3 Inhibidores de proteosomas
Bortezomib (Velcade, PS-341): Es un inhibidor de proteosomas reversible que
muestra una marcada actividad inhibitoria sobre una gran variedad de
enfermedades malignas hematológicas y sólidas. Los estudios clínicos se han
realizado más profundamente en mielomas múltiples (Leonard y col, 2006),
aunque también existe información sobre su efectividad en el tratamiento de
distintos subtipos de LNH (Rajkumar y col, 2005). Se están desarrollando
estudios clínicos de fase II en pacientes CTCL y PTCL donde se sugiere su uso
como agente individual o en combinación con otras drogas (Hamamura y col,
2007).
1.4.4.4 Drogas citotóxicas convencionales y anti-metabolitos
a. Pralatrexato: Es un análogo del folato, con efectos antitumorales
efectivos bien descriptos, como los obtenidos en modelos murinos con el
Metotrexato. Se han realizado estudios de fase clínica II/III en pacientes
con linfomas B y linfomas T donde se ha observado una buena
respuesta al antifolato (Zinzani y col, 1998). También existen otros
estudios, con el anti-folato, PROPEL donde se ve que el 35% de los
pacientes con PTCL-NOS responden a la terapia.
b. Gencitabina: Es un análogo de pirimidinas muy estudiado como agente
quimioterapéutico. Existen múltiples estudios de fases clínicas II y III
que demostraron su uso en PTCL y CTCL (Marchi y col, 2005; Zinzani y
col, 2000).
57
Introducción
c. Doxorubicina liposomal pegilada (Doxil): La doxorubicina es una
antraciclina que se ha utilizado frecuentemente para una gran variedad
de LNH. La forma liposomal pegilada ha sido estudiada en varios
ensayos clínicos de fases I y II en pacientes con CTCL (Pulini S y col,
2007; Wollina y col, 2003; Wollina y col, 2001).
d. Pentostatina: Es un análogo de purinas y ha mostrado resultados
promisorios iniciales en CTCL (Kurzrock y col, 1999). En base a los
mismos, se han desarrollado estudios clínicos de fase I y II obteniendo
resultados razonables con una toxicidad media (Tsimberidou y col,
2004).
1.4.4.5 Drogas inmunomoduladoras y no-citotóxicas
a. Interferones (IFN): Son una familia de glicoproteínas que se producen y
secretan en respuesta a variedad de inductores virales y no virales. Los
IFNs inducen múltiples actividades biológicas y tienen actividad antiproliferativa,
anti-viral,
citotóxica
y
anti-angiogénica.
El
IFN-α
recombinante se ha utilizado en el tratamiento de CTCL durante al
menos dos décadas. En bajas dosis y en combinación con bexaroteno,
el IFN-α ha demostrado una rápida mejoría en pacientes con CTCL y
mielomas foliculares (McGinnis y col, 2004). Un aspecto negativo son
sus efectos secundarios, los cuales son dosis dependientes.
b. Agonistas de receptores Toll (TLR): Los patrones de expresión TLR 2, 4
y 9 fueron estudiados en la micosis fungoide y el síndrome de Sézary
(Jarrousse y col, 2006). Un ejemplo de este tipo de drogas, es el
Imiquimod, un agente inmunomodulador que activa el TLR7, aprobado
por la FDA para el tratamiento de cánceres superficiales. El Imiquimod
en ensayos in vivo, ha demostrado ser un potente inductor del TNFα,
IFNγ e IFNα. El Imiquimod al 5% en crema fue evaluado en pacientes
con micosis fungoide y ha demostrado mejorar la respuesta en la
mayoría de las lesiones tratadas (Deeths y col, 2005).
58
Introducción
1.4.4.6 Inhibidores de señales de transducción
El Enzastaurin es una molécula pequeña inhibidora de serina/treonina
quinasas, la cual ha mostrado un efecto inhibitorio sobre las vías PKC β y
PI3K/AKT. La experiencia clínica con esta droga en linfomas es todavía
limitada, pero existe un estudio clínico de fase II en CTCL en progreso.
El tratamiento efectivo del amplio espectro de los linfomas de células T todavía
es dificultoso. Salvo en los estadíos tempranos de la Micosis Fungoides y los
ALCL-ALK positivos, el pronóstico de las neoplasias de células T sigue siendo
malo. El mayor desafío por delante, es focalizar y racionalizar la aplicación de
los nuevos agentes terapéuticos y sus combinaciones para mejorar la eficacia
de los tratamientos contra los LCT.
59
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Hipótesis y Objetivos
2.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO
En base a los antecedentes presentados, la hipótesis de este trabajo es que las
hormonas tiroideas, a través de la regulación de programas genéticos, jugarían
un rol importante en la proliferación y supervivencia de las células de linfomas
T y, de esta manera, favorecerían al fenotipo maligno de los mismos.
Adicionalmente consideramos que la caracterización de las redes de genes
regulados por las HTs podría contribuir al conocimiento de la linfomagénesis T
y servir como base, en un futuro, para la modificación terapéutica de estas vías.
2.2. OBJETIVOS
2.2.1. Objetivo general
Para comprobar la hipótesis arriba mencionada, nos planteamos como objetivo
general evaluar la acción in vitro de las HTs sobre la proliferación y sobrevida
de linfomas de células T humanas y determinar que programas genéticos se
regulan a partir de la acción de las mismas. Adicionalmente, mediante la
intervención genética o farmacológica de estas vías in vivo evaluaremos su
implicancia en el desarrollo tumoral. Para poder cumplir nuestro objetivo
general, planteamos los objetivos específicos que se detallan a continuación.
2.2.2 Objetivos específicos
A fin de analizar la acción in vitro de las HTs sobre LCT humanos, contamos
con un panel de 9 líneas de linfomas T, las cuales representan distintos
subtipos de LCT humanos, a saber: de origen inmaduro, Jurkat y CUTLL1; de
origen maduro/periférico, OIC-LY12, OIC-Ly13.2, MJ, Mac2a, HuT 78, SUDHL1
y Karpas 299. En estas líneas nos propusimos:
1) Evaluar la expresión de los receptores de HTs, tanto nucleares como el de
membrana, mediante:
61
Hipótesis y Objetivos
a. RT-PCR en tiempo real para evaluar los niveles transcripcionales de
THRA, THRB, ITGAV e ITGB3
b. Citometría de flujo, para evaluar los niveles de expresión proteica de los
mismos.
2) Estudiar las acciones de las HTs sobre la proliferación y el ciclo celular, en
particular:
a. Evaluar el efecto de concentraciones fisiológicas de HTs libres o unidas
a agarosa (HT-AG) sobre la proliferación celular. Dado que las HT-AG
son impermeables a la membrana y no pueden ingresar a la célula, nos
permiten distinguir el efecto total de las HTs vs el efecto inducido por su
receptor de membrana (mTR).
b. Evaluar el efecto de las HTs a distintos tiempos sobre la expresión de
marcadores de proliferación y ciclo celular (como la expresión de PCNA,
ciclinas y genes supresores tumorales, entre otros)
3) Identificar si la integrina αVβ3 es receptor de membrana para HTs en
células de linfoma T.
a. Utilizando inhibidores farmacológicos.
b. Mediante el uso de ARN de interferencia contra las integrinas αV y β3
4) Determinar y comparar los programas transcripcionales inducidos por las
HTs en los linfomas T.
a. Por análisis de los genes regulados positiva y negativamente por las
HTs mediante la técnica de secuenciación del ARN.
b. Utilizando herramientas bioinformáticas de análisis como el software
Ingenuity Pathway Analysis para la identificación de los genes regulados
por HTs involucrados en programas biológicos relevantes para el
desarrollo, proliferación y sobrevida de los LCT.
62
Hipótesis y Objetivos
c. Validando la regulación por HTs de los genes de interés por RT-PCR en
tiempo real.
Por
otra
parte
hemos
desarrollado
modelos
tumorales
mediante
xenotrasplantes de las líneas de LCT en ratones inmunodeficientes.
También contamos con muestras de pacientes de distintos subtipos de LCT
de origen maduro. Con estas herramientas nos planteamos:
5) Analizar el efecto del bloqueo de la acción de HTs sobre el crecimiento in
vivo de los tumores de LCT humanos desarrollados en ratones NODSCID.
6) Evaluar la expresión de los receptores para HTs y genes de interés
regulados por las mismas en muestras primarias obtenidas de pacientes
con LCT.
63
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
3.1 PREPARACIÓN DE LAS HORMONAS T3 Y T4 UNIDAS A AGAROSA
Las hormonas triyodotironina y tiroxina unidas a agarosa (T3-AG and T4-AG,
respectivamente) se obtuvieron de la misma forma en la que se describió
previamente en nuestros trabajos (Barreiro Arcos y col, 2011). Brevemente, las
hormonas T3 y T4 adquiridas de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI) fueron
utilizadas sin ninguna otra purificación extra. El brazo espaciador (entre la
matriz y el grupo activado), “N-Hydroxysuccinimide (NHS)-activated Sepharose
4 Fast Flow 14-atom”, se obtuvo de la compañía GE Healthcare (Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden). Los grupos amino primarios de las HTs fueron
unidos directamente al grupo ester activo para formar una unión amida de
acuerdo a las indicaciones del proveedor (Amersham Biosciences). La
presencia de T3 y T4 libres, testeada por RIA, fue muy baja, aproximadamente
menos de 1 mol de hormona libre cada 105 - 104 moles de HTs unidas a
agarosa. La estabilidad del conjugado hormona-agarosa, se determinó en los
sobrenadantes de cultivos de 24 horas con T3-AG o T4-AG y no se obtuvieron
niveles detectables de hormonas libres en los mismos.
3.2 ENSAYOS IN-VITRO CON LINEAS CELULARES HUMANAS DE LCT
3.2.1 Líneas celulares de linfoma T
Utilizamos 9 líneas celulares, las cuales representan los distintos subtipos de
esta enfermedad. Este panel de líneas celulares incluye: células T de
linfoma/leucemia de origen inmaduro Jurkat y CUTLL1 (cedidas por la Dra.
Roxana Schillaci, IBYME-CONICET, Argentina, y por el Dr. Adolfo Ferrando,
Columbia
University,
USA,
respectivamente);
linfomas
T
cutáneos
representados por las líneas celulares MJ y HuT78 (ATCC) y linfomas T
periféricos representados por las líneas celulares OIC-Ly12 y OIC.Ly13.2
(Ontario Cancer Institute, Canadá), Mac2a, Karpass 299 y SUDHL1 (ATCC).
Las células fueron cultivadas en concentraciones óptimas para su crecimiento
(1–5 x 105 cel/ml) en el medio RPMI 1640 (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY)
65
Materiales y Métodos
suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB, Gibco BRL), 2mM de
glutamina (Gibco BRL) y antibióticos (Gibco BRL).
3.2.2 Tratamientos in vitro de las líneas de LCT
Para los distintos ensayos, las células LCT fueron tratadas a distintos tiempos
con concentraciones fisiológicas de HTs libres (T3 = 1 nM; T4 = 100 nM, Sigma
Aldrich Co) y con HTs unidas a agarosa (HT-AG) en concentraciones similares.
El bloqueo de la acción de las HTs se evaluó pre-incubando 15 minutos antes
del tratamiento hormonal a las células con el péptido RGD a una concentración
de 10 µM. Antes de realizar los tratamientos, la células fueron sincronizadas,
cultivándolas por 24 horas en RPMI con 1% SFB (para los ensayos de
incorporación de timidina tritiada y los ensayos de migración, ver abajo) o con
RPMI suplementado con 10% de un suero depletado de hormonas tiroideas
(Sunny-Lab Co, UK).
Para evaluar la inhibición de la acción del VEGF, 15 minutos antes del
tratamiento con las HTs se pre-incubó con un anticuerpo anti-VEGF
(Bevaczumab, 10 µg/ml) o con un inhibidor farmacológico del receptor VEGFR
(Axitinib, 3 µM). También se evaluó el efecto del VEGF y del ligando
Vitronectina (VN), utilizando, para ello 10 µg/ml de VEGF recombinante y 250
ng/ml de VN respectivamente. En los ensayos con VN, las placas fueron
preincubadas durante 16 horas a 4°C, para luego descartar el exceso de la
misma y realizar los estímulos con o sin HTs subsiguientes. Para evaluar el
efecto de la inhibición del factor de transcripción NF-κB se pre-incubaron a las
células durante 1 hora con el inhibidor farmacológico BAY 11-7082.
3.2.3 Ensayos de proliferación celular
La proliferación celular fue evaluada utilizando, la técnica de incorporación de
timidina tritiada ([3H]TdR), el conteo celular por marcación con Trypan Blue, o
el ensayo fluorométrico Cell Titer Blue. La marcación convencional con [3H]TdR
de las células en proliferación se realizó como se describió previamente
66
Materiales y Métodos
(Barreiro Arcos 2006 y 2011). De manera resumida, 5 x 105 células/ml fueron
colocadas en un volumen final de 0.2 ml por pocillo (placa de 96 pocillos) y
fueron tratadas o no (control) con HTs libres o unidas a agarosa durante 24
horas. Se agregó un pulso de [3H]-TdR (Perkin Elmer, USA, 20 Ci/mmol)
durante las últimas 16 horas de tratamiento. Todos los ensayos fueron
realizados por cuadruplicado.
También utilizamos el método fluorométrico de reducción de la resazurina
(CellTiter-Blue; Promega, Figura 3.1) para medir proliferación celular. Se
determinó la fluorescencia (560Ex/590Em) utilizando el Synergy4 microplate
reader (BioTek). El porcentaje de células proliferativas se calculó utilizando la
regresión lineal por cuadrados mínimos de la curva estándar. La fluorescencia
fue determinada a partir de 6 replicados por cada tratamiento y la proliferación
de las células tratadas con HTs fue normalizada a sus respectivos controles.
Figura 3.1: Ensayo Cell Titer Blue para evaluar proliferación
Célula Viable
Reacciones de
reducción
Resazurina
Resorufina
Representación ilustrativa del método fluorométrico de reducción de la resazurina. Las
células viables reducen la Resazurina a Resofurina, la cual emite a 590 nm. Adaptado
de www.promega.com
67
Materiales y Métodos
3.2.4 Crecimiento in vitro en cultivos en 3 dimensiones
La matriz tridimensional se obtuvo utilizando metoxi polietilenglicol maleimida
(PEG-MAL, Laysan Bio, Inc) y un péptido, como entrecruzador de secuencia
NH2-GCRDVPMSMRGGDRCG-COOH (Figura 3.2). Los hidrogeles fueron
preparados como se describió anteriormente (Singh y col, 2011; Lee y col,
2014; Patel y col, 2014). Brevemente, 4 brazos espaciadores de PEG-MAL
fueron funcionalizados con el ligando peptídico RGD (NH2-GRGDSPC-COOH)
y entrecruzados con un péptido de colagenasa degradable (VPM) para formar
el hidrogel. Cada 10 µl se encapsularon células OCI-Ly12 (PTCL-NOS) y
células dendríticas HK foliculares derivadas de amigdalas en una proporción
2(PTCL-NOS):1 (HK). Los hidrogeles fueron incubados con o sin hormonas
tiroideas (T3 y T4, 1 nM y 100 nM, respectivamente) y en presencia o ausencia
del inhibidor farmacológico cilengitide (4 µM). Luego de 48 horas de cultivo, los
hidrogeles fueron degradados enzimáticamente con la colegenasa tipo I
durante 2 horas (Worthington, 50 U/mL), para luego analizar molecularmente
las células cultivadas con los distintos tratamientos.
Figura 3.2: Cultivo de células LCT en 3 dimensiones
Hormonas
tiroideas
Droga RGD
cíclica
Hormonas Tiroideas
Droga RGD cíclica
Ligando RGD
Células OCI-Ly12
Células estromales HK
Representación ilustrativa del cultivo en 3 dimensiones de linfomas de células T.
68
Materiales y Métodos
3.2.5 Transfecciones transientes con ARN de interferencia (siRNA)
Por cada transfección se utilizaron 1 x 107 células en 400 µl de medio RPMI
1640 y fueron mezcladas con una concentración final de 50 nM de los
respectivos siRNA contra ITGAV y/o ITGB3, o contra una secuencia no
codificante utilizada como control (L-004565, L-004124 and D-001810,
respectivamente, ON-TARGETplus SMART pool, THERMO SCIENTIFIC).
Luego fueron electroporadas a 250 V y por 13 ms en el electroporador BTX
ECM 830 (Liu et al, 2007). Luego de la transfección, las células fueron
cultivadas en medio RPMI suplementado con 10% de SFB por 24 horas.
Posteriormente se empezó el protocolo ya mencionado para realizar los
distintos tratamientos con las HTs.
3.2.6 Análisis por RT-PCR en tiempo real.
Luego de los distintos tratamientos in vitro, aproximadamente 1-2.5 x106 células
de cada condición fueron homogeneizadas a temperatura ambiente en 1 ml del
reactivo Tri-Reagent (Genbiotech SRL) y el ARN total fue aislado siguiendo las
instrucciones del fabricante. Los pellets de ARN se disolvieron en agua libre de
ARNasas y guardados a -80°C. La concentración del ARN total fue cuantificada
midiendo la absorbancia a 260 nm (Nanodrop ND-1000, UK). La pureza de las
preparaciones de ARN se determinaron por espectrometría midiendo la
relación de absorbancias a 260/280 nm y corriendo las muestras en un gel de
agarosa 1% con Bromuro de Etidio. A partir de 2 µg de ARN por muestra, se
sintetizó el ADN complementario (cADN) por transcripción reversa utilizando el
kit Omniscript (Qiagen GMDH). La cuantificación del cADN presente en cada
muestra fue determinada utilizando una mezcla comercial SYBR Green para
PCR en tiempo real (qPCR) (Biodynamics SRL, Buenos Aires, Argentina). La
reacción de qPCR fue llevada a cabo en el equipo Applied Biosystems 7500.
Las secuencias de los primers (Biodynamics SRL, Buenos Aires, Argentina),
las cuales se muestran en la Tabla 1, se diseñaron utilizando el Primer Express
software version 3.0 (Applied Biosystems, California, USA) con una
69
Materiales y Métodos
temperatura de melting de entre 58-60°C. Para verificar que el fluoróforo solo
detecta un producto de PCR, todas las reacciones se sometieron al protocolo
de disociación por calor luego del ciclo final de la PCR (Ririe y col., 1997).
Tabla 3.1: Secuencia de primers utilizados para RT-PCR en tiempo real
Gen
B2M
CCR8
CCNB1
CCND1
CCND2
CCND3
CCNE2
DBP
DOK2
ELOVL4
IL2RA
IL4
ITGAV
ITGB3
PCNA
THRA
VEGFA
VEGFB
WNT5B
Temperatura
°C
Secuencia
AGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAA
TGCTGCTTACATGTCTCGATCCCA
AAAGGTGAGGACGATCAGGA
AATGGCGGTTAGCCATACTG
CATGGTGCACTTTCCTCCTT
TCTTAGCCAGGTGCTGCATA
TCCTCTCCAAAATGCCAGAG
TGAGGCGGTAGTAGGACAGG
TGGGGAAGTTGAAGTGGAAC
ATCATCGACGGTGGGTACAT
AGGGATCACTGGCACTGAAG
CTGTAGGAGTGCTGGTCTGG
TACTGACTGCTGCTGCCTTG
AAAAGTCTTCAGCTTCACTGGA
CCTCGAAGACATCGCTTCTC
GCCTCGTTGTTCTTGTACCG
ACTGGCCCTACAGGTTTCTG
CTCAAAGTTGCCCTCTCCAG
GGCCCATGGATTCAGAAATA
GGAAGGGGCAGTCAGTGTAA
ACTTCCTGCCTCGTCACAAC
GATCAGCAGGAAAACACAGC
TGAACAGCCTCACAGAGCAG
GCGAGTGTCCTTCTCATGGT
TGCCAAGTTGGGAGATTAGA
TGAAGCAGACGACTTCAGAGA
TGAGGATGACTGTGTCGTCAG
GTCTTGCTCTATCTTTCTTTGG
ATCCTCAAGAAGGTGTTGGAGGCA
ACGAGTCCATGCTCTGCAGGTTTA
CTGATCCACATTGCCACAGA
TTCCAGGTCCACCTTGTCTC
CTTCCTACAGCACAACAAAT
GTCTTGCTCTATCTTTCTTTGG
GACAGTGCTGTGAAGCCAGA
AGTGGGATGGGTGATGTCAG
TTTGGGAGAGTCATGCAGAT
TAGCCGTACTCCACGTTGTC
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
70
Materiales y Métodos
La detección directa de los productos de PCR se monitoreó midiendo el
incremento en la fluorescencia causada por la unión del colorante al ADN doble
cadena. Todas las muestras fueron testeadas contra el gen de referencia de la
proteína β2-microglobulina (“housekeeping gene”), usado como control interno
para la normalización de los datos, procedimiento para la corrección de las
variaciones en calidad y cantidad de cADN. La cuantificación de la expresión
del gen blanco fue realizada mediante un análisis de ∆∆Ct para calcular las
diferencias entre tratamientos (Livak y Schmittgen, 2001)
3.2.7 Análisis de expresión de proteínas por western blot
Muestras de lisados de 5x106 células de LCT, incubados en ausencia o
presencia de HT o HT-AG por distintos tiempos, fueron obtenidos por
disolución de los pellets celulares en 100 µl de una solución con 2-βmercaptoetanol 10 mM, EDTA 2 mM, ácido etileglicol bis(β-aminetileter)N-N’
tetraacético (EGTA) 2 mM, fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF) 1 mM, leupeptina
10 µg/ml y ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico (HEPES) 20 mM
pH 7,4; y se centrifugaron para obtener las fracciones solubles en el
sobrenadante. Se mezclaron 50 µg de proteínas de cada muestra en solución
de carga (SDS 2%, glicerol 10%, Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8; azul de bromofenol
0,2%, 2-β-mercaptoetanol 1%) y se sembraron en un gel de poliacrilamida al
10%, para separar dichas proteínas por SDS-PAGE y transferirlas a
membranas de nitrocelulosa. Para corroborar la eficiencia de la carga y de la
transferencia, dichas membranas fueron coloreadas con Ponceau S. Las
membranas se bloquearon con leche descremada 5% en PBS-Tween-200
(0,1%), durante 1 hora. Luego, se incubaron con los respectivos anticuerpos
primarios, anti-PCNA (Santa Cruz Biotechnology); ERK1/2 o ERK p42/44
(ab52245 y ab50011, respectivamente, Abcam), toda una noche a 4°C. Como
control de carga se utilizó el anticuerpo anti-Actina (1:100, Santa Cruz
Biotechnology). Tras realizar tres lavados, las membranas fueron incubadas
con un anticuerpo policlonal anti-IgG de conejo o de ratón conjugado con
peroxidasa, durante 1 hora (ab191866 y ab193651, respectivamente, Abcam).
La quimioluminiscencia fue visualizada usando el kit comercial de Amersham
71
Materiales y Métodos
ECL Western Blotting Analysis System (Amersham Biosciences), y utilizando el
documentador de geles Image Quant (GE). Las densitometrías se cuantificaron
mediante el software GelPro.
3.2.8 Análisis por citometría de flujo
La expresión de los receptores de HTs en las líneas celulares de LCT fue
analizada utilizando los anticuerpos primarios anti-TRαβ (sc-772, Santa Cruz
Biotechnology), anti- integrina αvβ3 (ab78289, Abcam), y sus correspondientes
anticuerpos anti-isotipo como control. Para evaluar el efecto proliferativo de las
HTs utilizando como marcador el PCNA, se usó el anti-PCNA (sc- 25280, Santa
Cruz Biotechnology) y su respectivo anti-isotipo control. La evaluación de la
apoptosis se realizó mediante el marcado de las células con un anticuerpo antianexina conjugado a FITC y la marcación nuclear con Ioduro de Propidio. Para
las muestras primarias de PTCL-NOS utilizamos los anticuerpos anti-integrina
β3 y anti-integrina αv (ab7167 y ab16821, respectivamente, Abcam). En todos
los casos, las muestras fueron fijadas en paraformaldehído al 1% y
permeabilizadas en PBS 0,1% Tween, antes de incubarlas durante 1 hora a
4°C con los anticuerpos primarios. Luego las células fueron lavadas e
incubadas con el anticuerpo secundario anti-IgG conjugado correspondiente
anti-IgG de ratón-Cy5 o anti-IgG conejo-FITC (Abcam). En todos los casos se
adquirieron al menos 10,000 eventos utilizando el citómetro de flujo BD Accuri
TM C6 flow cytometer
3.2.9 Ensayos de migración
La capacidad de inducción de respuesta quimiotáctica a medios condicionados
fue evaluada utilizando un sistema de 2 dimensiones en una micro-cámara de
Boyden modificada de 48 pocillos (#AP48 Neuropobe, Inc.) como se describió
previamente (Richards et al, 1984). Brevemente, una alícuota de 28.4 µl de los
medios condicionados de las células CUTLL1 tratadas durante 24 horas con
T4-AG+T3-AG o Control (células incubadas sólo con agarosa) fue agregada en
la parte inferior de la cámara. En algunos casos, se pre-incubó durante 1h a los
72
Materiales y Métodos
medios condicionados con un anticuerpo anti-VEGF (10 µg/ml). En la parte
superior de cada pocillo se agregaron 50 µl de una suspensión de 12.000
células endoteliales HMEC1 (Figura 3.3). Los dos compartimientos fueron
separados utilizando un filtro de policarbonato con poros de 8 µm (Neuroprobe,
Cabin John, MD). La cámara fue incubada por 4 horas a 37°C y 5% CO2. Se
utilizó RPMI suplementado con 5% SFB como control positivo o RPMI solo
como control negativo de la respuesta quimiotáctica. Luego del periodo de
incubación, la membrana fue removida, fijada y teñida con el colorante
Hoechst. El número de células migratorias fue contado con el software Cell
profiler. Todos los experimentos fueron repetidos al menos 3 veces.
Figura 3.3: Evaluación de la migración en cámara de Boyden modificada
Células HMEC1
Medio
condicionado
Representación ilustrativa de un pocillo de la cámara de Boyden modificada. Las
células endoteliales estimuladas por los factores quimioatractantes del medio
condicionado proveniente de células LCT, migran a través de los poros de la
membrana de policarbonato.
3.2.10 Ensayos de microscopía confocal
Se analizó la localización celular del factor de transcripción NF-κB en las
células CUTLL1. Para ello se incubó a las células con un anticuerpo primario
anti-NF-κB (ab7970, Abcam). Antes de la incubación las células fueron fijadas
en metanol frío por, al menos, 30 minutos, y luego permeabilizados con PBS-
73
Materiales y Métodos
Tritón 0,1% durante 20 minutos. Luego se incubó a 4°C durante 16 horas con el
anti-NF-κB. Al finalizar este paso, se lavaron las células y se incubaron durante
30 minutos con el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a FITC
(ab6717, Abcam). Finalmente, para la marcación nuclear, se utilizó 0,02 mg/ml
de Ioduro de Propidio (IP) durante 1 minuto.
3.3 SECUENCIACIÓN DE ARNm Y MICROARREGLOS DE EXPRESIÓN
El ARN fue aislado de células CUTLL1 tratadas o no con T3+T4 durante 24
horas utilizando el reactivo TRI-reagent (Life Technologies). El ADN genómico
fue eliminado y la concentración y pureza del ARN fue determinado en el
equipo Nanodrop (Thermo Scientific). La integridad del mismo fue evaluada
utilizando el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Los valores de
integridad fueron mayores a 8 en todas las muestras. Las bibliotecas de
secuenciación fueron generadas con el oligo polyA+ ARN, usando el TruSeq
RNA sample prep kit (Illumina). Brevemente, el ARNm fue aislado, utilizando 2
rondas de purificación con esferas magnéticas unidas al oligo Poly-T. El ARNm
obtenido fue fragmentado y luego se realizó la síntesis de la primera cadena
del cADN con primers aleatorios y transcripción reversa. La segunda cadena de
cADN se sintetizó para remover el templado de ARN y generar cADN doble
cadena. El cADN doble cadena generado fue reparado en sus extremos,
convirtiéndolos de cohesivos a romos. Bases A fueron agregadas en los
extremos 3´ de los fragmentos y múltiples adaptadores de indexación fueron
agregados y ligados a los extremos del cADN doble cadena. Los fragmentos de
ADN con las moléculas adaptadoras fueron amplificados por PCR utilizando 14
ciclos. Las bibliotecas fueron agrupadas, amplificadas y secuenciadas durante
50 ciclos utilizando el secuenciador Illumina HiSeq2000. Los resultados se
obtuvieron en lecturas (del inglés reads). Estas fueron alineadas a la secuencia
humana hg19 utilizando el software Tophat y la expresión diferencial de los
genes fue evaluada utilizando el software Cuffdiff.
Los microarreglos de expresión fueron reanalizados utilizando datos públicos
de un trabajo anterior (GEO). Este estudio analizó la expresión de transcriptos
74
Materiales y Métodos
por la técnica de microarreglos de ARN en muestras de pacientes de distintos
subtipos de LCT (74 PTCL-NOS, 30 ALCL-ALK+, 24 ALCL-ALK-, y 41 AITL).
3.4 ANÁLISIS DE LOS MODELOS IN-VIVO DE LCT
3.4.1 Ensayos in vivo de células CUTLL1 y OCI-Ly12
Para los ensayos in-vivo, se utilizaron ratones NOD-SCID (NOD.CB17Prkdcscid/J) tanto hembras como machos, de 6-10 semanas, de las
instalaciones para animales de la Fundación Instituto Leloir y de la empresa
Taconic farms, NY. Todos los ensayos que involucraron animales fueron
aprobados, tanto por el Comité para el uso y cuidado de animales de
experimentación de la Fundación Instituto Leloir, como por el del Weill Cornell
Medical College (WCMC). Un grupo de ratones fue inyectado subcutáneamente
en el flanco derecho con 2 x 107 células CUTLL1 las cuales fueron previamente
transfectadas con siRNA contra ITGAV, ITGB3 o contra una secuencia control
no codificante (Control). Otro grupo de ratones fue inyectado subcutáneamente
en el flanco izquierdo con 1 x 107 células OCI-Ly12. El volumen tumoral fue
medido todos los días del periodo que duró el experimento y se calculó el área
bajo la curva (ABC) del crecimiento tumoral. Cuando los tumores de células
OCI-Ly12 llegaron a un tamaño palpable (aproximadamente 75-100 mm3), los
ratones
fueron
divididos
aleatoriamente
en
dos
grupos
y
tratados
intraperitonealmente; uno recibió el vehículo (PEG300 35%, Tween-80 5% y
dextrosa 65% en 5% de agua) y el otro 125 mg/kg/día del inhibidor de la
integrina αVβ3, cilengitide (MedKoo, Inc). Los ratones fueron pesados cada día
del periodo de tratamiento. Todos los ratones fueron sacrificados bajo
anestesia por dislocación cervical cuando al menos el 20% de los tumores
alcanzaron un tamaño de 20 mm en todas sus dimensiones. Al final del ensayo,
los tumores fueron recolectados, pesados y examinados macroscópicamente
para evaluar signos de daño del tejido.
75
Materiales y Métodos
3.4.2 Ensayos in vivo con tumores derivados de pacientes ALCL
Se utilizaron ratones humanizados (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) de 610 semanas provenientes de la empresa Taconic farms, USA. Todos los
ensayos que involucraron animales fueron aprobados por el Comité para el uso
y cuidado de animales de experimentación del Weill Cornell Medical College
(WCMC). Se trasplantaron tumores derivados de 2 pacientes, uno ALCL-ALK
positivo (n=16) y otro ALCL-ALK negativo (n=8), luego fueron divididos
aleatoriamente en dos grupos de tratamiento. Los tratamientos se realizaron
intraperitonealmente durante 10 días; un grupo fue tratado con vehículo
(PEG300 35%, Tween-80 5% y dextrosa 65% en 5% de agua) y el otro con
Cilengitide (125 mg/kg/día, MedKoo, Inc). Los ratones fueron pesados cada día
del periodo de tratamiento. Todos los ratones fueron sacrificados bajo
anestesia por dislocación cervical. Al final del ensayo, los tumores fueron
recolectados, pesados y examinados macroscópicamente para evaluar signos
de daño tisular.
3.4.3 Ensayos de Inmunohistoquímica
Los tumores sólidos fueron extirpados y los tejidos tumorales se fijaron en
paraformaldheído 4% durante 18 horas. Luego las muestras fueron incluídas en
parafina y cortadas en secciones seriales de 4 µm de espesor utilizando un
micrótomo. La recuperación antigénica se realizó en Buffer Citrato (10 mM, pH
6.0) a 95°C; y luego, se bloqueó la actividad de la peroxidada endógena con
H2O2 al 3% en agua destilada. Después del bloqueo, se incubaron las muestras
durante 18 horas a 4°C en una cámara húmeda con los anticuerpos primarios
anti-integrina αV y anti-integrina β3 (1:25, ab16821 y ab7167, respectivamente,
Abcam), anti-CD31 (1:30, ab28364, Abcam), anti-Caspasa 3 activa (1:30,
ab2302, Abcam) y anti-VEGFA (1:30, Ab1m, cedido generosamente por el Dr.
A. Baldi, IBYME-CONICET, Argentina). La inmunoreactividad fue detectada
utilizando el sistema VECTASTAIN Elite ABC Kit (PK-6200) y fue visualizado
con el DAB Substrate Kit (SK-4100, VECTOR). Para el control de la señal
inespecífica, secciones seriales de las mismas muestras fueron tratadas bajo el
76
Materiales y Métodos
mismo protocolo, pero reemplazando el anticuerpo primario por una IgG
inespecífica de ratón o de conejo o con PBS. No se detectó señal en estos
controles de marcación.
3.4.4 Evaluación de la apoptosis por la técnica de TUNEL
La fragmentación del ADN ligada a la respuesta apoptótica fue detectada en los
núcleos morfológicamente identificables y en los cuerpos apoptóticos presentes
en los cortes de tumores fijados y embebidos en parafina utilizando el ensayo
TUNEL (ApopTag, Chemicon) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los
portaobjetos con los tejidos fueron pre-tratados con tripsina al 0.5% por 15
minutos para aumentar la exposición del ADN.
3.4.5 Ensayo de unión de NF-κB activado a ADN
La capacidad de unión al ADN de los miembros de la familia NF-κB fue
determinada utilizando un ensayo basado en el método de ELISA (TransAM,
Active Motif, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura
3.4). Brevemente, los tejidos de linfoma de los tumores de las células OCI-Ly12
tratados con el vehículo o con la droga Cilengitide, fueron disgregados y luego
se extrajeron las fracciones nucleares de los mismos. Posteriormente se
agregaron 10 µg de los lisados nucleares a pocillos pre-absorbidos con
oligonucleótidos consenso para NF-κB (5’-GGGACTTTCC-3’). El ensayo fue
realizado en ausencia o presencia de 20 pmol de oligonucleótidos
competidores, los cuales contienen un sitio consenso de unión a NF-κB mutado
o wild type. Extractos nucleares de células Raji (5 µg por well) fueron utilizados
como control positivo para el ensayo. Luego de la incubación y lavado, se
añadieron anticuerpos hechos en conejo anti-p65, -p50, -cRel, -p52 or –relB
(1:1000, Active Motif) a sus correspondientes pocillos, seguido de un
anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a HRP (1:1000, Active Motif).
Luego del agregado del sustrato HRP, se midió la absorbancia a 450 nm
(Synergy4, Biotek, Winooski, VT). En este ensayo, las medidas de absorbancia
son directamente proporcionales a la cantidad del factor de transcripción unido
77
Materiales y Métodos
a ADN presente en la muestra. Los experimentos se realizaron por
cuadruplicado y fueron expresados como el promedio de los valores de
absorbancia ± error estándar.
Figura 3.4: Ensayo de la unión de NF-κB activado a ADN
Adición extracto
nuclear
Anticuerpo
primario
anti IgG
conjugado a HRP
solución de frenado
de la reacción
Extracto celular con factor de
transcripción activo
Placa cubierta con
oligonucleótidos
El factor de transcripción activado en los extractos celulares se une a los sitios de
unión consenso en los wells con oligos inmovilizados. La incubación con los
anticuerpos primarios y secundarios cuantifica específicamente la cantidad de factor
de transcripción activo. Adaptado de http://www.activemotif.com/
3.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para todos los experimentos se calcularon las medias, desviaciones
estándares y errores estándares de los grupos. Las significancias estadísticas
se evaluaron con el software GraphPad PRISM 4.0 Version para Windows
(GraphPad Software Inc, La Jolla, California), utilizando la prueba estadística
ANOVA de una vía seguido con contraste de Bonferroni o Tukey. Las
diferencias entre las medias fueron consideradas significativas cuando p<0.05.
Los resultados están expresados como la media ± error estándar (SEM). Los
resultados de las correlaciones en las muestras de pacientes fueron analizadas
utilizando el test de Pearson para poblaciones Gaussianas (dos colas), y el test
de Spearman para las correlaciones no paramétricas.
78
4. RESULTADOS
Resultados
4.1 LAS HORMONAS TIROIDEAS INDUCEN LA PROLIFERACIÓN DE LOS
LINFOMAS DE CÉLULAS T A TRAVÉS DE SUS RECEPTORES NUCLEAR Y
DE MEMBRANA
4.1.1 Evaluación de la expresión del receptor nuclear y del de membrana
de las hormonas tiroideas
Estudios recientes de nuestro laboratorio demostraron que las HTs inducen in
vitro la activación de vías de señalización que llevan a la proliferación celular en
la línea murina de linfoma T BW 5147, a través de la activación de su receptor
nuclear, TR y del de membrana, mTR (Barreiro Arcos y col, 2011). Sin
embargo, los programas genéticos que involucran estos efectos y en qué
medida contribuyen ambos receptores a los mismos, no han sido estudiados
hasta el momento.
Para profundizar estos estudios y determinar la influencia de las HTs en la
proliferación celular de LCT humanas, se caracterizó, en primer lugar, la
expresión del TR y del posible mTR en un panel de 9 líneas celulares humanas
de LCT, las cuales representan los distintos subtipos de esta enfermedad. Este
panel incluye tanto linfomas T de origen inmaduro (Jurkat y CUTLL1), como de
origen maduro (Hut78, Mac-2A, OCI-Ly12, OCI-Ly13.2, SU-DHL-1, Karpas299).
Si bien el receptor de membrana para HTs no se ha descripto en células de
linfoma, en otro tipos celulares, como fibroblastos (Bergh y col, 2005) y ciertos
tipos de cáncer, como el de próstata y riñón (Kimbro y Simons, 2006), se
demostró que la integrina αVβ3 es el mTR. Basados en este antecedente, se
inició el estudio con la determinación de los niveles transcripcionales de los
genes de la integrina αVβ3 (ITGAV e ITGB3) como posible mTR también en
este tipo de células.
Los resultados muestran que, en comparación con la expresión observada en
células T periféricas, las líneas de LCT expresan niveles significativamente más
elevados de THRA, ITGAV e ITGB3 (Figura 4.1.A). Los niveles proteicos de
80
Resultados
esta integrina también fueron evaluados en algunas de las líneas de LCT
analizadas (Figura 4.1.B).
Figura 4.1: Niveles de expresión de los receptores para HTs en líneas
celulares humanas de LCT
80
60
40
**
**
**
**
** **
**
12
**
**
**
4
*
*
*
*
ITGAV
ITGB3
THRA
*
*
*
8
*
*
50
H
L1
29
9
SU
D
PA
S
M
ac
2a
KA
R
I-L
Y1
3.
2
TR αβ
300
Cuentas
100
O
C
O
C
Integrina αVβ3
150
I-L
Y1
2
M
J
78
uT
H
U
TL
L1
Ju
rk
at
C
C
C
el
-T
-G
0
200
Cuentas
** **
**
**
16
el
-T
-P
Niveles mRNA relativo a B2M
A
200
Isotipo
CUTLL1
SUDHL1
OCI-Ly12
HuT 78
100
0
0
102.3
103
104.1
102.3
103.3
104.4
A: Niveles de expresión del ARNm de los genes ITGAV, ITGB3 y THRA en el panel
completo de LCT en comparación a los linfocitos T periféricos (Cel-T-P). Se muestra el
promedio de 3 experimentos independientes ± ES. B: Niveles proteicos de la integrina
αVβ3 y del TRαβ evaluados por citometría de flujo, en las células CUTLL1, SUDHL1,
OCI-Ly12 y HuT 78. Resultado representativo de 3 experimentos. *P<0.05; **P<0.01.
81
Resultados
4.1.2 Evaluación del efecto de las hormonas tiroideas sobre la
proliferación y el ciclo celular de LCT.
Para determinar las consecuencias funcionales de la activación hormonal de
estos receptores para HTs, se evaluó la proliferación de la línea celular
CUTLL1 luego de un estímulo de 24 horas con concentraciones fisiológicas de
las hormonas T3 y T4 de forma libre y de las mismas unidas a agarosa (AG),
T3-AG y T4-AG. Estas últimas se encuentran unidas covalentemente por sus
grupos amino primarios a la mencionada matriz y por ende constituyen
derivados impermeables a la membrana celular. De esta manera, se pueden
evaluar de forma selectiva los efectos inducidos por la activación del mTR de
manera independiente al efecto total (TR+mTR) inducido por las hormonas
libres. Los resultados muestran que luego de 24 horas de estímulo, tanto las T3
y T4 libres como las unidas a agarosa, son capaces de inducir la proliferación
de las células CUTLL1 de manera significativa en comparación con sus
respectivos controles (Figura 4.2).
Figura 4.2: Evaluación de los efectos de las HTs sobre la proliferación de
las células CUTLL1
% Proliferación celular
relativa al Control
200
160
**
*
*
T4
T3
120
**
*
*
80
20
0
CT
HT
CT-AG T4-AG T3-AG HT-AG
Evaluación de la proliferación por Cell Titer Blue de las células de origen inmaduro,
CUTLL1, luego de 24 horas de tratamiento con concentraciones fisiológicas de las
hormonas libres o acopladas a agarosa, T3 (1nM) y T4 (100nM), de manera individual
o en combinación (HT). Los resultados representan el porcentaje de las células
proliferativas con respecto al control y se muestra el promedio de 3 experimentos
independientes ± ES. *P<0.05; **P<0.01.
82
Resultados
Más aún, se observó una mayor inducción de la proliferación celular cuando las
hormonas T3 y T4 fueron adicionadas en combinación, ya sea en su versión
libre (HT) o acoplada a AG (TH-AG), en comparación con los efectos inducidos
por cada una de las mismas por separado. Cabe mencionar, que en todos los
casos las células se cultivaron en un medio RPMI con 10% de suero depletado
de T3 y T4, de manera de poder analizar los efectos producidos solo por el
agregado de las mismas.
Luego se determinó si las HTs son capaces también de inducir la proliferación
celular de los subtipos de LCT de origen maduro. Para ello, se decidió realizar
los tratamientos con la combinación de las hormonas T3 y T4, ya que, como se
mencionó anteriormente, en estas condiciones se observa un mayor efecto
tanto de las HTs libres como unidas a AG (Figura 4.3).
Figura 4.3: Evaluación del efecto de las HTs sobre la proliferación celular
en el panel completo de líneas humanas de LCT
% Proliferación celular
relativa al control
180
160
*
140
HT
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
HT-AG
*
*
*
*
*
*
*
120
CT
100
80
20
L1
DH
SU
29
9
2a
Ka
rp
as
M
ac
2
y1
I-L
O
C
-L
CI
3.
y1
2
J
M
O
H
uT
78
at
rk
Ju
CU
TL
L1
0
Proliferación celular evaluada con el método Cell Titer Blue en el panel completo de
líneas celulares humanas de LCT, luego de 24 horas de tratamiento con HT y HT-AG
en las concentraciones antes especificadas. Los resultados representan el porcentaje
de las células proliferativas con respecto al control (CT, línea discontinua roja) y se
muestra el promedio de 3 experimentos independientes ± ES. *P<0.05.
El tratamiento durante 24 horas con HT y HT-AG en el panel completo de
líneas celulares de LCT mostró que las HTs son capaces de inducir, al igual
que lo observado en las células CUTLL1, la proliferación celular de todo el
83
Resultados
panel de LCT. Tanto las HTs libres como las HT-AG, aumentan entre un 3050% la proliferación, en comparación con sus respectivos controles.
Para analizar en mayor profundidad el efecto proliferativo de las HTs sobre las
células LCT, se decidió evaluar la síntesis de ADN por incorporación de [3H]TdR en las células CUTLL1, HuT 78 y OCI-Ly12, luego de 24 horas de estímulo
con las HTs (Figura 4.4). En concordancia con los resultados mencionados
anteriormente, se encontró que, tanto las HT libres como las HT-AG, aumentan
entre un 80-120% la síntesis de ADN en las 3 líneas evaluadas (Figura 4.4,
panel A).
Figura 4.4: Efecto de las hormonas tiroideas sobre la síntesis de ADN de
las células CUTLL1, HuT 78 y OCI-Ly12
Incorporación [3H]-TdR (dpm)
A
3000
Control
HT
HT-AG
**
2000
** **
*
**
*
1000
0
CUTLL1
B
CT
TH
HuT 78
OCI-Ly12
% Células apoptóticas
CUTLL1
HuT 78 OCI-Ly12
5,2±0,8
4,6±0,6
3,4±1,1
4,2±0,6
3,4±0,9
3,1±0,7
A: Evaluación de la síntesis de ADN por incorporación de [3H]TdR en las líneas
CUTLL1, HuT 78 y OCI-Ly12, luego de 24 horas de tratamiento con HT libres y HT-AG.
B: Apoptosis celular evaluada por marcación de anexina-FITC por citometría de flujo en
células LCT luego de 24 horas de tratamiento. Los resultados representan el promedio
de 3 experimentos independientes ± ES. *P<0.05; **P<0.01 vs Control.
84
Resultados
En estos experimentos, y de acuerdo a resultados previos de nuestro grupo
(Barreiro Arcos y col, 2006), se realizó la sincronización celular por deprivación
de SFB. En estas condiciones se puede inducir apotosis, por lo que podría ser
que las HTs estuvieran impidiendo que este fenómeno tenga lugar. Se verificó,
entonces, la apoptosis celular por marcación con Anexina-V en las células
CUTLL1, HuT78 y OCI-Ly12 luego de 24 horas de tratamiento con HTs (Figura
4.4, panel B). No se observaron diferencias significativas entre ambos
tratamientos en ninguna de las líneas celulares analizadas, lo que indicó que
las HTs estarían regulando preferentemente la división celular. Con el objeto de
profundizar el estudio en este aspecto, se evaluó el efecto de las HTs sobre la
expresión de marcadores moleculares implicados en la progresión del ciclo
celular, tales como las ciclinas. Para ello, se trataron células CUTLL1 con HTs
por disitntos tiempos (entre 2 a 18 horas) tanto con HTs libres como con HT-AG
(Figura 4.5, Panel A). Los resultados de la expresión de ciclinas, por RT-PCR
en tiempo real, muestran un aumento inicial de los niveles de ARNm de las
ciclinas D1, D2 y D3 (todas requeridas para la progresión de fase G0 del ciclo
celular a G1) seguido por un aumento en la ciclina E2 (progresión de G1 a S, y
fase S) y de la ciclina B1 (progresión de G1 a M). Es decir que el aumento de la
proliferación celular de CUTLL1 está asociado a la inducción del ciclo celular
dependiente de ciclinas.
El efecto de las HTs sobre la expresión transcripcional de marcadores de
progresión del ciclo celular también fue evaluado en células de linfomas T de
origen maduro. Para ello, se realizó un tratamiento similar con HTs libres y HTAG en células de LCT cutáneas, HuT 78, y PTCL-NOS, OCI-Ly12; luego se
evaluaron los niveles de expresión transcripcional de las ciclinas D1, E2 y B1
por RT-PCR en tiempo real (Figura 4.5, panel B). Los resultados muestran que
tanto las HT libres como las HT-AG, inducen la expresión de estas ciclinas en
las células HuT 78 y OCI-Ly12, en magnitudes similares a las observadas en las
células CUTLL1.
85
Resultados
Figura 4.5: Análisis de la progresión del ciclo celular por determinación de
5
4
HT vs CT
**
*
*
3
2
CT
1
0
2
6
6
18
h
CCND1
OCI-Ly12
HuT78
**
**
**
4
**
2
CT
0
2
6
12
2
Niveles ARNm relativo a B2M
Niveles ARNm relativo a B2M
B
12
6
h
12
4
HT-AG vs CT
3
*
*
CT
1
0
2
6
12
18
CCNE2
3
OCI-Ly12
HuT78
**
**
2
**
*
CT
1
0
h
2
6
12
2
6
12
h
CCNB1
3
OCI-Ly12
HuT78
2
**
* *
HT
HT-AG
*
CT
1
0
CCND1
CCND2
CCND3
CCNE2
CCNB1
2
Niveles ARNm relativo a B2M
Niveles ARNm relativo a B2M
A
Niveles ARNm relativo a B2M
los niveles de ARNm de ciclinas en células LCT tratadas con HTs
2
6
12
2
6
12 h
Niveles de expresión de los genes de ciclinas analizados por RT-PCR en tiempo real,
luego del tratamiento con HT libres y HT-AG (derecha e izquierda respectivamente)
durante 2, 6, 12 y 18 horas en las células CUTLL1 (A). Similar tratamiento se realizó
por 2, 6 y 12 horas en las LCT de origen maduro, HuT 78 y OCI-Ly12 (B). Los
resultados representan los niveles relativos de ARNm con respecto al control (CT, línea
discontinua roja). Se muestra el promedio de 3 experimentos independientes ± ES.
*P<0.05; **P<0.01.
86
Resultados
En concordancia con los resultados mencionados de los efectos de las HTs
sobre el ciclo celular, se encontró que luego de 6 y 12 horas de estímulo con
concentraciones fisiológicas de las mimas, disminuye la expresión del inhibidor
de la quinasa dependiente de ciclina, p21; y del supresor tumoral, p53, en las
células CUTLL1 y HuT 78 (Figura 4.6).
Figura 4.6: Evaluación de los niveles transcripcionales de p21 y p53 en
Niveles ARNm relativo a B2M
1.5
Niveles ARNm relativo a B2M
células LCT tratadas con HTs
1.5
CUTLL1
p21
p53
1.0
CT
* *
0.5
0.0
6
* *
12
6
12
HuT 78
p21
p53
CT
1.0
*
*
0.5
0.0
h
6
*
*
12
*
*
6
HT
HT-AG
* *
12
h
Niveles de expresión de los genes CDKN1A (p21) y TP53 (p53) analizados por RTPCR en tiempo real, luego del tratamiento con HT libres y HT-AG durante 6 y 12 horas
en las células CUTLL1 y las células HuT 78 (Panel de arriba y abajo, respectivamente).
Los resultados representan los niveles relativos de ARNm con respecto al control sin
tratar (CT, línea discontinua roja). Se muestra el promedio de 3 experimentos
independientes ± ES. *P<0.05.
También se observó que los efectos mediados por las HTs sobre la inducción de
la proliferación y progresión del ciclo celular en LCT, fue acompañada por un
87
Resultados
aumento en los niveles de expresión del antígeno nuclear de proliferación
(PCNA). Las células CUTLL1 fueron tratadas durante 12 y 24 horas con HT
libres y HT-AG; luego se analizaron los niveles de expresión transcripcional y
proteicos de PCNA por las técnicas de RT-PCR en tiempo real y citometría de
flujo o western blot, respectivamente. Los resultados muestran una inducción de
los niveles transcripcionales y proteicos del marcador evaluado (Figura 4.6,
Panel A y B, respectivamente), luego de estímulo con HTs y HT-AG. Como
señal intracelular de activación linfocitaria se evaluó la fosforilación de ERK1/2.
Se observó que luego de 15 minutos de estímulo con HTs se ven aumentados
los niveles de fosforilación del mismo (Figura 4.6, Panel C).
Figura 4.6: Inducción por hormonas tiroideas de los niveles de PCNA en
células LCT
A
**
**
1
CT
TH
Isotipo
Control
TH
TH-AG
150
2
0
CUTLL1
200
Cuentas
Niveles ARNm de PCNA
relativo a B2M
3
B
CUTLL1
4
TH-AG
100
50
0
103.1
104
105.1
C
CT
TH
TH-AG
CT
PCNA
p-ERK
(p42/44)
ACTINA
ERK total
T3+T4
A: Niveles transcripcionales de PCNA luego de 12 horas de estímulo con HTs. Los
resultados representan los niveles relativos de ARNm con respecto al control (CT, línea
discontinua roja). Se muestra el promedio ± ES de 3 experimentos independientes. B:
Niveles proteicos de PCNA evaluados por citometría de flujo luego de 24 horas de
estímulo con HTs. C: Evaluación por Western Blot de los niveles proteicos de PCNA
luego de 24 horas de estímulo y de la fosforilación de ERK1/2 luego de 15 minutos de
tratamiento con HTs en células CUTLL1. Para los niveles proteicos se muestran
resultados representativos de n=3 ensayos. **P<0.01.
88
Resultados
El efecto de las HTs sobre la expresión de PCNA también se evaluó en líneas
LCT de origen maduro. La figura 4.7 muestra que tanto las HT libres, como las
HT-AG, son capaces de inducir la expresión de los niveles transcripcionales
(Panel A) y proteicos (Panel B) de PCNA luego del tratamiento con HTs durante
12 y 24 horas, respectivamente, en las líneas LCT maduras, HuT 78 y OCILy12.
Figura 4.7: Inducción por hormonas tiroideas de los niveles de PCNA en
células LCT humanas de origen maduro
Niveles ARNm relativo a B2M
A
B
3
2
HT
HT-AG
**
200
100
*
1
0
CT
HuT 78
OCI-Ly12
OCI-Ly12
400
Cuentas
300
**
*
HuT 78
400
Cuentas
PCNA
4
Control
HT
HT-AG
300
200
100
0
0
10 2.5
10 3
PCNA
10 4.5
10 2.8
10 4
10 4.7
PCNA
Niveles del ARNm (A) y proteicos (B) de PCNA en las células HuT 78 y OCI-Ly12, a las
12 y 24 horas, respectivamente, de estímulo con HT libres y HT-AG. Los resultados
representan los niveles relativos de ARNm con respecto al control (CT, línea
discontinua roja). Se muestra el promedio ± ES de 3 experimentos independientes.
Para los niveles proteicos de PCNA se muestra un gráfico de citometría de flujo
representativo de 4 ensayos. *P<0.05; **P<0.01.
89
Resultados
Teniendo en cuenta los resultados mencionados en esta sección, se puede
inferir que las HTs, a través de la acción tanto sobre el TR como sobre el
receptor de membrana, constituyen una señal proliferativa para las células T
malignas, que podría ser necesaria para su crecimiento. Esto sugiere que los
mecanismos genéticos activados por las HTs podrían contribuir al fenotipo
maligno de los subtipos de linfomas de células T estudiados.
90
Resultados
4.2 IDENTIFICACIÓN DEL RECEPTOR DE MEMBRANA PARA HTs EN
LINFOMAS DE CÉLULAS T HUMANOS
4.2.1 La activación de la integrina αVβ 3 es la responsable de los efectos
proliferativos mediados por HTs en linfomas de células T
Los
resultados
mencionados
en
la
sección
anterior
sugieren
que
concentraciones fisiológicas de HTs inducen la proliferación de las células T
malignas actuando tanto a través de su receptor nuclear, como del mTR. Por
ende, el bloqueo de la acción de las HTs sobre las células de linfoma T
resultaría de utilidad, como posible estrategia terapéutica para el tratamiento de
los LCT. Sin embargo, la inhibición de la producción hormonal o el bloqueo del
receptor canónico nuclear para HTs, no parecería ser la mejor estrategia
terapéutica, ya que se generarían consecuencias negativas fisiológicas muy
importantes. Por lo cual, el receptor de membrana para HTs, parecería ser un
blanco terapéutico más atractivo para ser empleado en la terapia anti-linfoma.
Se ha descripto a la integrina αVβ3 como mTR de las HTs en distintos tipos de
células normales, como en fibroblastos y células vasculares (Bergh y col, 2005;
Davis, 2004) y en varios tipos de líneas celulares tumorales, como cáncer de
próstata y carcinomas renales, entre otros (Cohen y col, 2011; Kimbro y
Simons, 2006). Sin embargo, hasta el momento no se ha descripto si esta
integrina es el mTR y está involucrada en los efectos no genómicos de las HTs
en células de linfoma T.
El sitio de unión de las HTs en la integrina αVβ3 está muy próximo al sitio de
reconocimiento para el péptido RGD (Arg-Gly-Asp) presente en los ligandos
endógenos de este receptor (Bergh y col, 2005; Cheng et al, 2010). Por este
motivo, se analizó si el péptido RGD podría actuar como competidor de las HTs
y, de esta manera, bloquear el efecto proliferativo inducido por las mismas a
través de su receptor de membrana en los LCT. Se evaluó la proliferación
celular mediada por HTs luego de la pre-incubación con el péptido RGD en
células CUTLL1. La Figura 4.8 muestra los resultados donde se observa que,
91
Resultados
efectivamente, la pre-incubación con el péptido RGD inhibe el efecto inducido
por las HT-AG en las células CUTLL1. Más aún, el péptido RGD también
bloquea entre un 40 y 60 % el efecto proliferativo que inducen las HTs libres,
resultado consistente con un bloqueo específico de la integrina αvβ3. Cabe
señalar, que el péptido RGD por si sólo, no afecta de manera significativa la
proliferación basal de las células CUTLL1 (Figura 4.8).
Figura 4.8: Acción del péptido RGD sobre el efecto proliferativo de las
HTs en células CUTLL1
% Proliferación celular
relativa al Control
200
180
160
***
**
140
#
120
#
CT
100
80
20
0
D
RG
-A
HT
G
HT
AG
GD
+R
HT
D
RG
+
HT
Proliferación celular evaluada por Cell Titer Blue, luego de 24 horas de tratamiento con
concentraciones fisiológicas de HT y HT-AG en células CUTLL1 pre-incubadas o no,
15 minutos antes del tratamiento hormonal con el péptido RGD (10 µM). Los
resultados representan el porcentaje de células proliferativas con respecto al control
(CT, línea discontinua roja) y se muestra el promedio de 4 experimentos
independientes ± ES. ** P<0.01 *** P<0.001 vs control; # P<0.05 vs hormonas
Con el objetivo de analizar en profundidad la utilización del bloqueo de la
integrina αvβ3 como posible estrategia terapéutica en el tratamiento de LCT, se
realizaron ensayos en células transfectadas de manera transiente con ARN de
interferencia (siRNA, del inglés silencing RNA) contra la integrina αV (si-ITGAV)
y/o la integrina β3 (si-ITGB3). Como control, se utilizó un siRNA contra una
secuencia no codificante (si-CT).
92
Resultados
En primer lugar, se evaluó como control, la efectividad de los siRNA,
analizando la regulación negativa de los niveles transcripcionales de estas
integrinas a distintos tiempos post-transfección. Los resultados obtenidos en las
células CUTLL1 muestran que 24 y 48 horas post-transfección los si-ITGAV y
si-ITGB3
regularon
negativamente
de
manera
efectiva
los
niveles
transcripcionales y proteicos de la integrina correspondiente a cada siRNA
(Figura 4.9).
Figura 4.9: Regulación negativa de los niveles de ARNm y proteicos de la
integrina αvβ3 en las células CUTLL1
B
ITGAV
1.2
Integrina αVβ3
ITGB3
400
1.0
0.8
0.6
si-CT
si-ITGAV
si-ITGB3
siCT
**
**
**
Cuentas
Niveles ARNm relativo a B2M
A
**
0.4
300
200
100
0.2
0
0.0
24
48
h
10 2.4
10 3
10 4.3
A: Niveles de expresión del ARNm de ITGAV e ITGB3 medidos por RT-PCR en tiempo
real luego de 24 y 48 horas posteriores a la transfección por electroporación de células
CUTLL1 con 20 µM de los si-RNA (si-ITGAV y si-ITGB3) vs una secuencia no
codificante como control (si-CT). Los resultados son el promedio ± ES de 5
experimentos independientes. B: Niveles de expresión proteica de la integrina αVβ3
evaluados por citometría de flujo. El gráfico mostrado es representativo de 4
experimentos. **P<0.01.
Como siguiente paso, se evaluó si la regulación negativa de la integrina αvβ3
afecta el crecimiento dependiente de HTs de las células CUTLL1 luego del
tratamiento con las mismas por más de 120 horas (Figura 4.10). Los
resultados muestran que luego de 96 y 120 horas de cultivo en medio completo
con 10% de SFB, el crecimiento de las células que no expresan el receptor,
disminuye. Este dato sugiere que el receptor heterodimérico es necesario para
el normal crecimiento in vitro de las células CUTLL1.
93
Resultados
Figura 4.10: Efecto de la regulación negativa de la integrina αvβ3 sobre el
crecimiento de las células CUTLL1
n° de células (x 10 4)
24
*
*
20
si-CT
si-ITGAV
si-ITGB3
16
12
8
0
24
48
72
96
120
144 h
Crecimiento de las células CUTLL1 transfectadas con siRNA contra ITGAV (si-ITGAV),
ITGB3 (si-ITGB3) o con una secuencia no codificante como control (si-CT), analizando
el número de células por conteo microscópico con el colorante Trypan Blue. Los
resultados mostrados son el promedio ± ES de 3 ensayos independientes. *P<0.05
Para determinar si la integrina αvβ3 está relacionada con los efectos
proliferativos inducidos por las HTs sobre las células de LCT, analizamos la
incorporación de [3H]-TdR sobre las células CUTLL1 transfectadas con siITGAV, si-ITGB3, si-ITGAV + si-ITGB3, o si-CT, luego de 24 horas de
tratamiento con concentraciones fisiológicas de HTs libres y HT-AG. Los
resultados muestran que, ninguna de las condiciones de transfección afecta de
manera significativa la proliferación de las células CUTLL1; pero tanto el efecto
proliferativo inducido por las HT libres como las HT-AG, se ve completamente
inhibido en estas células (Figura 4.11). La inhibición producida por la
combinación de ambos siRNA (si-ITGAV + si-ITGB3), no fue significativamente
mayor a la inhibición producida por el si-ITGAV y el si-ITGB3 utilizados por
separado. Este resultado sugiere que la integrina αvβ3 es requerida para los
efectos proliferativos inducidos por HTs en células CUTTL1.
94
Resultados
Figura 4.11: Evaluación del efecto de la regulación negativa de la integrina
αvβ3 sobre la proliferación mediada por HTs en células CUTLL1
Control
HT
HT-AG
900
600
**
300
**
**
**
**
**
0
si
C
on
s
si
i I trol
IT
TG
G
AV si AV
I
+ TG
si B3
IT
G
B3
si
C
o
si ntro
si
IT l
IT
G
G
AV si AV
I
+ TG
si B3
IT
G
B3
si
C
o
si ntro
si
IT l
IT
G
G
s
AV i AV
IT
+
G
si B3
IT
G
B3
Incorporación [3H]-TdR
(dpm)
1200
Proliferación celular evaluada por incorporación de [3H]TdR, en células CUTTL1
transfectadas con los siRNA si-ITGAV, si-ITGB3 o una secuencia no codificante (siCT), luego de 24 horas de tratamiento con HT y HT-AG. La regulación negativa de los
genes ITGAV y/o ITGB3 inhibe el aumento de la proliferación inducido por HT libres y
HT-AG. Los resultados mostrados son el promedio ± ES de n=3 ensayos
independientes. **P<0.01.
Luego se quiso determinar si la regulación negativa de la integrina αvβ3, afecta
también la proliferación inducida por HTs en subtipos maduros de LCT. Para
ello, se transfectaron las líneas celulares de LCT de origen maduro, HuT-78 y
OCI-Ly12, con los siRNA contra los genes ITGAV e ITGB3 y se evaluó la
expresión de los niveles transcripcionales de los mismos 24 y 48 horas posttransfección (Figura 4.12, panel A). Los resultados muestran una disminución
de los niveles de ARNm de estos genes de forma similar a lo observado en las
células CUTLL1. Como siguiente paso, se evaluó la proliferación luego del
tratamiento durante 24 horas con concentraciones fisiológicas de HT y HT-AG.
Los resultados muestran que, de manera similar a lo observado en las células
inmaduras, la inducción de la proliferación mediada por HTs en las células HuT-
95
Resultados
78 y OCI-Ly12 se vio impedida en aquellas células que no expresan la integrina
αvβ3 (Figura 4.12, panel B). Estos datos indican que el dímero αvβ3 es
necesario para que la inducción de la proliferación mediada por HTs ocurra en
los distintos subtipos de LCT.
Figura 4.12: Efecto de la regulación negativa de la integrina αvβ3 sobre la
si CT
1.0
0.8
0.6
**
0.4
**
**
0.2
0.0
24h
B
48h
HuT
HuT
7878
180
TH-AG
140
120
*
100
*
*
*
80
20
1.0
si CT
0.8
0.6
CT
ITGAV
**
**
0.4
ITGB3
**
**
0.2
0.0
24h
48h
OCI-Ly12
OCI-Ly12
180
TH
160
OCI-Ly12
OCI-Ly12
1.2
160
TH
TH-AG
140
120
100
*
*
*
*
80
20
B3
G
IT
si-
G
AV
CT
IT
si-
si-
B3
G
IT
si-
G
AV
CT
IT
si-
si-
si
-C
si
-IT T
G
AV
si
- IT
G
B3
0
0
si
-C
si
-IT T
G
AV
si
- IT
G
B3
% Proliferación celular
relativa al Control
**
Niveles ARNm relativo a B2M
HuT
7878
HuT
1.2
% Proliferación celular
relativa al Control
A
Niveles ARNm relativo a B2M
proliferación mediada por HTs en células maduras LCT
A: Niveles transcripcionales de ITGAV e ITGB3 medidos por RT-PCR en tiempo real
luego de 24 y 48 horas post-transfección en las células HuT 78 y OCI-Ly12 con siITGAV, si-ITGB3, vs una secuencia no codificante como control (si-CT). Los resultados
son el promedio ± ES de 3 experimentos independientes. B: Proliferación celular
evaluada en las células HuT 78 y OCI-Ly12 transfectadas con los siRNA si-ITGAV, siITGB3 y si-CT, luego de 24 horas de tratamiento con HT y HT-AG. Los resultados
representan el porcentaje de las células proliferativas con respecto al control (CT, línea
discontinua roja) y se muestra el promedio de n=3 experimentos independientes ± ES.
*P<0.05, **P<0.01.
96
CT
Resultados
4.2.2 Evaluación del crecimiento regulado por HTs de células LCT en
presencia del ligando biológico de la integrina αVβ 3
El contexto fisiológico en el que las células de linfoma T crecen y proliferan
incluye un contexto biológico con distintos componentes de la matriz
extracelular. Es por esto que se decidió evaluar la magnitud de la acción de las
HTs mediada por la integrina αVβ3 sobre la proliferación de los LCT en
presencia de la vitronectina (VN), el ligando biológico del receptor de
membrana mencionado. Para ello se analizó, por incorporación de [3H]-TdR, la
proliferación inducida por 24 horas de estímulo con HTs, por VN y por la
combinación de ambos tratamientos, en las células CUTLL1, HuT 78 y OCILy12 (Figura 4.13)
Figura 4.13: Evaluación del efecto del ligando vitronectina sobre la
Incorporación [3H]-TdR (dpm)
proliferación de células de LCT
8000
CUTLL1
HuT 78
**
6000
**
**
OCI-Ly12
**
**
** *
4000
2000
0
HT
VN
- + - +
- - + +
- + - +
- - + +
- + - +
- - + +
Proliferación celular evaluada por incorporación de [3H]TdR en las células CUTLL1,
HuT 78 y OCI-Ly12, luego de 24 horas de tratamiento con HT libres en
concentraciones fisiológicas y vitronectina (VN, 250 ng/ml). Los resultados representan el promedio ± ES de 3 ensayos independientes. *P<0.05 **P<0.01.
97
Resultados
Los resultados muestran que la VN sola tiene una tendencia a incrementar la
proliferación de las células de LCT, siendo significativo el aumento únicamente
en las células HuT-78. Sin embargo este aumento fue menor que el observado
con las HTs (Figura 4.13). Cuando se agregan juntas, VN y HTs, la VN no
compitió con el efecto de las HTs, y para las células Hut-78 la combinación
proporciona un mayor efecto proliferativo del observado con cada ligando solo.
Para estudiar con mayor profundidad la proliferación mediada por HTs en un
contexto biológico más real, se decidió evaluar el crecimiento de las células
LCT en un modelo de cultivo en 3 dimensiones (3D). Para ello primero se
desarrolló una matriz tridimensional que incluye al péptido RGD y a células
estromales (ver Figura 3.2 en la sección de Materiales y Métodos).
Recordemos que el péptido RGD forma parte de la estructura de la VN que se
une al sitio de unión para su ligando de la integrina αVβ3. Una vez obtenida la
matriz, se cultivaron en ella células OCI-Ly12 en presencia o ausencia de las
HTs durante 48 horas. Los resultados muestran que existe un claro aumento en
el número de células OCI-Ly12 cuando éstas son cultivadas con HTs en
comparación con el control (Figura 4.14, panel A y B). También se estudió el
efecto de un inhibidor farmacológico de la integrina αVβ3, el cilengitide, sobre
el crecimiento de las células, mediado por HTs, en el cultivo 3D. El cilengitide
es un pentapéptido cíclico con actividad anti-angiogénica que muestra actividad
antagonista de la integrina αVβ3 en el orden subnanomolar y que se encuentra
actualmente en estudio de fase clínica III en glioblastomas, y de fase II en otros
tipos de tumores sólidos (Tabatabai y col, 2010; Nabors y col, 2009; Reardon y
col, 2008; Friess y col, 2006). Como puede observarse, el cilengitide inhibió el
crecimiento mediado por HTs de las células OCI-Ly12 (Figura 4.14, panel C)
98
Resultados
Figura 4.14: Efecto de las HTs y de un inhididor de la integrina αVβ3 sobre
el crecimiento in-vitro de células LCT en una matriz tridimensional
Estroma RGD
A
C
Estroma RGD + TH + cilengitide
Estroma RGD + HT
B
Imágenes representativas de los distintos tratamientos realizados sobre un cultivo
tridimensional de células OCI-Ly12. Se muestran imágenes del crecimiento control (A),
tratado con HTs libres (B) y tratado con el inhibidor Cilengitide (4 uM, C). Aumento
100X, barra escala = 100 µm.
99
Resultados
Estos resultados sustentan aún más la hipótesis de que la proliferación de
células LCT mediada por HTs a través de la integrina αVβ3, podría contribuir al
fenotipo maligno de las células de linfoma T y que esta vía proliferativa podría
ser capitalizada para desarrollar una nueva estrategia terapéutica para este tipo
de patologías.
100
Resultados
4.3 PROGRAMAS TRANSCRIPCIONALES REGULADOS POR LAS HTs A
TRAVÉS DE SU RECEPTOR DE MEMBRANA
4.3.1. Las hormonas tiroideas regulan programas transcripcionales
vinculados a proliferación y angiogénesis a través del mTR
Como próximo objetivo se planteó analizar de manera exhaustiva los
programas genéticos activados por las HTs en las células de LCT a través de
su receptor de membrana (mTR), tratando de identificar aquellos involucrados
en la proliferación de las células T malignas.
Para ello, se analizaron los cambios transcripcionales inducidos por las HT-AG,
luego de 24 horas de estímulo en células CUTLL1 utilizando una técnica de
última generación como es la secuenciación de ARN (RNAseq). Los
transcriptos fueron identificados utilizando el software edgeR (Robinson y col,
2010) y aquellos que mostraron un p-value <0.01, en comparación al control
(agarosa sola), fueron considerados transcriptos expresados diferencialmente.
Los resultados de este análisis muestran 118 y 5 genes regulados de manera
positiva y negativa, respectivamente. Algunos de los transcriptos regulados
diferencialmente se muestran en el mapa de calor de valores de expresión
génica en el Panel A de la Figura 4.14.
Utilizando
herramientas
informáticas
que
permiten
analizar
vías
de
señalización, como por ejemplo el software Ingenuity Pathway Analysis, se
identificaron los programas genéticos mayormente regulados luego de 24 horas
de estímulo con las HT-AG (Figura 4.15, Panel B). A través de la activación de
la integrina αvβ3, las HTs inducen vías de señalización que involucran la
expresión de genes relacionados con la “traducción proteica” (RPL13, RPL27A,
RPL36), con la “cadena respiratoria oxidativa” (NUDFB1/2, NDUFA13,
UQCR11), con la “angiogénesis” (VEGFB), con la proliferación/diferenciación
de linfocitos y con la replicación del ADN (IL4, EDF1, DOK2).
101
Resultados
Figura 4.15: Transcriptos regulados por las hormonas tiroideas a través
de su receptor de membrana en células CUTLL1
TH-AG
B
T
CT
C
A
VEGFB
RPL39L
RPL38
LTB
RPL36
AIF1
CCDC73
H2AFX
EDF1
RPL13
NDUFB1
NME1
RPL37A
NDUFB11
UQCR11
UQCRQ
CD3D
NDUFA13
NDUFB2
RPL27A
FTH1
TCTEX1D2
IL4
FOXH1
DOK2
GPR97
DBP
−
0
-3 log (FC) 3
2
A: Mapa de calor que representa los cambios significativos (p<0.01) de la expresión
de los genes regulados por las HT-AG con respecto al control, luego de 24 horas de
tratamiento en las células CUTLL1. Cada condición se realizó por triplicado en
ensayos independientes B: Representación de las vías de señalización reguladas por
las HT-AG respecto al control en las células CUTLL1 realizada con el programa
informático Ingenuity pathway.
En trabajos anteriores publicados por nuestro grupo, se identificó al factor de
transcripción, NF-κB, como efector río abajo de la activación del mTR en
linfomas T murinos (Barreiro Arcos y col, 2011). Los resultados que se
obtuvieron utilizando herramientas bioinformáticas y por el análisis de los genes
regulados por HT-AG, también sugieren una asociación con la molécula de
señalización NF-κB en los LCT humanos (Figura 4.16).
102
Resultados
Figura 4.16: Vías de señalización iniciadas por la acción de las HTs sobre
su receptor de membrana en células LCT
Vías y moléculas de señalización asociadas a los genes movilizados por las HT-AG
(P<0.01) luego de 24 horas de tratamiento en las células CUTLL1. Gráfico realizado
con el programa Ingenuity pathway.
Luego de un análisis más exhaustivo, se encontró que los genes regulados por
las HT-AG involucrados en angiogénesis, proliferación y replicación del ADN
(DBP, VEGFB, IL4 y DOK2) presentan en sus regiones promotoras, sitios de
unión a NF-κB1. Dada la implicancia de estos genes en la contribución al
fenotipo maligno de los LCT, se decidió validar su regulación por HTs con la
técnica RT-PCR en tiempo real. Para ello se evaluaron los niveles de los
ARNm de los mismos, tanto en las células de origen inmaduro CUTLL1, como
en las células LCT de origen maduro HuT 78 y OCI-Ly12 (Figura 4.17, Panel A
y B, respectivamente). Los resultados de este ensayo muestran que la
inducción de estos genes es regulada por las HT-AG en los subtipos de LCT
tanto de origen maduro como inmaduro.
103
Resultados
Figura 4.17: Validación de los transcriptos regulados diferencialmente por
las HT-AG en distintos subtipos de LCT.
Niveles ARNm relativo a B2M
A
CUTLL1
3.5
3.0
**
2.5
**
2.0
*
*
1.5
1.0
CT
0.5
0.0
DBP
Niveles ARNm relativo a B2M
B
3
2
IL4
HuT 78
5
4
VEGFB
DOK2
OCI-Ly12
*
**
*
*
*
*
*
*
1
CT
0
VEGFB IL4
DOK2 DBP
VEGFB IL4
DOK2 DBP
Niveles de expresión del ARNm de los genes DBP, VEGFB, IL4 y DOK2, evaluados
por RT-PCR en tiempo real, en las células de origen inmaduro, CUTLL1 (A) y en las
células de origen maduro HuT 78 y OCI-Ly12 (B), luego de 24 horas de estímulo con
concentraciones fisiológicas de HT-AG. Los resultados representan los niveles
relativos de ARNm con respecto al control (CT, línea discontinua roja). Se muestra el
promedio ± ES de 3 experimentos independientes. *P<0.05 **P<0.01.
4.3.2 Las hormonas tiroideas regulan genes involucrados en proliferación
y angiogénesis a través de su receptor de membrana.
Para determinar si las HTs en su forma libre también pueden modular la
expresión de los genes inducidos por las HT-AG, las células de LCT fueron
tratadas con concentraciones fisiológicas de HTs libres durante distintos
tiempos. Se observa que, luego de 2 horas de estímulo con las HTs, se induce
104
Resultados
la expresión de los genes IL-4 y VEGFB en células CUTLL1. Para poder atribuir
estos efectos a la acción de las HTs sobre su receptor de membrana, la
integrina αvβ3, se analizó la expresión transcripcional de estos genes en
células CUTLL1 que no expresan el receptor. Los resultados muestran que las
HTs no son capaces de inducir la transcripción de IL-4 y VEGFB en las células
CUTLL1 transfectadas con los ARN de interferencia si-ITGAV o si-ITGB3, en
comparación con las células transfectadas con el si-CT (Figura 4.18).
Figura 4.18: Efecto de la regulación negativa del mTR sobre la inducción
VEGFB
3
IL4
**
**
2
CT
1
AV
si
-IT
G
B3
G
T
si
-IT
si
-C
G
si
-IT
si
-C
AV
si
-IT
G
B3
0
T
Niveles ARNm relativo a B2M
de la expresión de los genes IL4 y VEGFB mediada por HTs
Expresión del ARNm de los genes VEGFB e IL-4, luego de 2 horas de tratamiento con
concentraciones fisiológicas de HTs libres en células CUTLL1 transfectadas con los
ARN de interferencia si-ITGAV o si-ITGB3 en comparación con el control (si-CT). Se
muestra el promedio ± ES de 3 experimentos independientes. **P<0.01.
Estos resultados indican que la regulación dependiente de HTs de estos genes,
se debe a la activación del mTR.
Como se mencionó anteriormente, VEGF está involucrado en la regulación de
la angiogénesis y su expresión podría contribuir al fenotipo maligno de los LCT.
De hecho, se ha demostrado una asociación entre la alta expresión de VEGF y
la menor sobrevida y peor pronóstico de pacientes con LCT de los subtipos
PTCL-NOS y AITL (Konstantinou y col, 2011; Konstantinou y col; 2009,
105
Resultados
Jorgensen y col, 2009). El factor VEGFB es miembro de la familia de factores
de crecimiento del endotelio vascular que incluye también a VEGFA, VEGFC,
VEGFD y PLGF (Goel y col, 2013).
Con el objetivo de evaluar con mayor profundidad la relación entre los genes de
proliferación y angiogénesis inducidos por las HTs y el fenotipo maligno de los
LCT, se analizó mediante microarreglos de ARN, la expresión de los miembros
de la familia de VEGF en una serie de muestras de pacientes de LCT (74
PTCL-NOS, 30 ALCL-ALK+, 24 ALCL-ALK- y 41 AITL). Además del factor
VEGFB, el único miembro que también se encuentra expresado en estas
muestras es VEGFA (Figura 4.19).
Figura 4.19: Niveles transcripcionales de VEGFB y VEGFA en muestras de
pacientes con distintos subtipos de LCT
VEGFB
15
Niveles ARNm relativo
a GAPDH
Niveles ARNm relativo
a GAPDH
15
12
9
6
3
0
12
9
6
3
0
PTCL-NOS AITL
ALK +
ALK -
VEGFA
PTCL-NOS AITL
ALK +
ALK -
Determinación de la abundancia de los transcriptos VEGFA (derecha) y VEGFB
(izquierda) en el panel de muestras de pacientes de los distintos subtipos de LCT. Los
resultados se obtuvieron por un analisis de microarreglos de ARN.
Teniendo en cuenta los datos obtenidos de las muestras de pacientes de LCT,
se decidió evaluar si la expresión de VEGFA se encuentra regulada por las HTs
a través de la integrina αvβ3 en las células CUTLL1. De manera similar a IL-4 y
VEGFB, la expresión de VEGFA es inducida luego de 2 horas de tratamiento
con las HTs en comparación al control. Más aún, las células CUTLL1
transfectadas que no expresan el receptor, son incapaces de producir esta
106
Resultados
inducción (Figura 4.20). De manera que este gen también forma parte de los
programas genéticos regulados por HTs a través de la activación de mTR.
Figura 4.20: Efecto de la regulación negativa del mTR sobre la inducción
Niveles ARNm relativo a B2M
de la expresión del gen VEGFA mediada por HTs
VEGFA
2.5
2.0
Control
HT
**
1.5
1.0
0.5
0.0
si-CT
si-ITGAV
si-ITGB3
Expresión del ARNm del gen de VEGFA, luego de 2 horas de tratamiento con HTs
libres, en las células CUTLL1 transfectadas con los siRNA si-ITGAV o si-ITGB3 en
comparación a la células control (transfectadas con si-CT). Se muestra el promedio ±
ES de 3 experimentos independientes. **P<0.01
Con el fin de determinar si la expresión de VEGFA y VEGFB en el panel de
muestras de pacientes de los distintos subtipos de LCT estudiado podría tener
alguna asociación con la expresión de receptores para HTs en dichas muestras
se decidió evaluar, en primer lugar, la expresión transcripcional de THRA,
ITGAV e ITGB3, a través del análisis por microarreglos de ARN (Figura 4.21,
Panel A). También se evaluaron los niveles proteicos de estos receptores en
muestras de pacientes con PTCL-NOS del panel antes mencionado, mediante
análisis por inmunohistoquímica en cortes de tejidos parafinados y por
citometría de flujo en muestras frescas, respectivamente (Figura 4.21, Paneles
B y C).
107
Resultados
Figura 4.21: Expresión de receptores para HTs en muestras de pacientes
con distintos subtipos de LCT
Niveles ARNm relativo a GAPDH
A
6
B
THRA
5
TRα
4
3
2
Niveles ARNm relativo a GAPDH
0
12
PTCL-NOS AITL
ALK +
ALK -
ITGAV
10
Integrina αV
1
8
4
2
8
7
6
5
4
3
2
1
0
PTCL-NOS AITL
ALK +
ALK -
C
ITGB3
Isotipo
PTCL-1
PTCL-2
PTCL-3
PTCL-4
PTCL-5
PTCL-6
100
80
Cuentas
Niveles ARNm relativo a GAPDH
0
Integrina β3
6
60
40
20
0
PTCL-NOS AITL
ALK +
ALK -
Anti-integrina αVβ3 FITC
A: Determinación de la abundancia de los transcriptos de THRA, ITGAV e ITGB3 en el
panel de muestras de pacientes con los distintos subtipos de LCT. Los resultados se
obtuvieron por analisis de microarreglos de ARN. B y C: Niveles proteicos del TRα y
de las integrinas αV y β3 evaluada por inmunohistoquímica y citometría de flujo,
respectivamente; en algunas muestras de pacientes PTCL-NOS. Aumento de las
imágenes 630X (Barra de escala: 20 µm).
108
Resultados
A fin de evaluar si existe una asociación entre los niveles del mTR y de VEGF
en las muestras de pacientes con LCT, se analizó si había una correlación
positiva entre los niveles transcripcionales de la integrina αVβ3 y de VEGF, en
las muestras primarias de los distintos subtipos de LCT. Efectivamente, como
puede observarse en las Figuras 4.22 y 4.23, existe una correlación positiva
entre la expresión de ITGAV e ITGB3, y la expresión de VEGFA y VEGFB en la
mayoría de los subtipos de LCT analizados. Estos resultados sugieren una
posible asociación funcional entre el mTR y los factores angiogénicos VEGF.
Figura 4.22: Correlación entre la abundancia de los transcriptos de ITGAV
y los de VEGFA y VEGFB en muestras primarias de LCT
PTCL-NOS
PTCL-NOS
10
12
4
P<0.0001
pearson r = 0,5818
2
0
2
4
6
8
VEGFA
6
6
P<0.0001
pearson r = 0,7310
3
0
10
0
2
PTCL-NOS
PTCL-NOS
8
0
10
4
P<0.001
pearson r = 0,3941
0
2
4
6
ITGAV
2
8
10
6
8
10
9
6
P<0.0001
pearson r = 0,7273
3
0
4
ALCL
ALCL
12
VEGFB
6
2
0
ITGAV
9
VEGFB
VEGFB
6
6
3
AITL
AITL
12
8
0
4
9
ITGAV
ITGAV
10
ALCL
ALCL
15
9
VEGFA
VEGFA
8
0
AITL
AITL
12
0
2
4
6
ITGAV
8
10
6
3
0
P=0.0014
pearson r = 0,4251
0
2
4
6
8
ITGAV
Correlación de los niveles de ARNm de VEGFA y VEGFB con los de la integrinas αV.
Cada punto representa una muestra individual. Los resultados se analizaron utilizando
el test de Pearson para poblaciones Gaussianas.
109
10
Resultados
Figura 4.23: Correlación entre la abundancia de los transcriptos de ITGB3
con los de VEGFA y VEGFB en muestras primarias de LCT
PTCL-NOS
PTCL-NOS
10
4
2
0
2
4
6
8
ITGB3
ITGAB3
10
0
1
2
3
4
0
5
P<0.001
pearson r = 0,4201
6
3
2
0
0
2
ITGB3
ITGB3
4
6
1
2
3
ITGB3
ITGB3
4
5
ALCL
ALCL
12
VEGFA
VEGFB
6
0
15
9
4
6
3
AITL
12
8
VEGFB
P<0.0001
pearson r= 0,7923
P<0.0001
pearson r = 0,6707
ITGB3
ITGB3
PTCL-NOS
PTCL-NOS
10
0
6
3
P<0.001
pearson r = 0,3941
0
9
VEGFA
6
ALCL
ALCL
12
9
VEGFA
VEGFA
8
0
AITL
AITL
12
P<0.0001
pearson r =0,5769
0
1
2
3
ITGB3
ITGB3
4
5
P<0.0001
pearson r = 0,5334
9
6
3
0
0
1
2
3
4
ITGB3
ITGB3
Correlación de los niveles transcripcionales de VEGFA y VEGFB con los de la
integrina β3. Cada punto representa una muestra individual. Los resultados se
analizaron utilizando el test de Pearson para poblaciones Gaussianas.
4.3.3 NF-κB está involucrado en la regulación transcripcional inducida
por HTs sobre los genes de proliferación y angiogénesis
Como ya se ha mencionado, nuestro grupo de trabajo demostró que el factor
de transcripción NF-κB es activado por la acción de las HT-AG sobre el
receptor de membrana en células de linfoma murinas (Barreiro Arcos y col,
2011). Más aún, los genes involucrados en procesos de proliferación y
angiogénesis inducidos por las HTs a través de la integrina αVβ3, poseen en
sus regiones promotoras, sitios de unión a este factor de transcripción. Es por
eso que se decidió analizar si la acción de las HTs activa a NF-κB en células
110
5
Resultados
humanas de LCT. Para ello, se evaluó la localización de NF-κB por
microscopía confocal en células CUTLL1 luego del tratamiento con HTs libres
durante 5, 15 y 30 minutos. Los resultados de estos ensayos muestran que
luego de 15 minutos de tratamiento con HTs, el factor de transcripción NF-κB
es traslocado del citosol al núcleo de las células LCT (Figura 4.24).
Figura 4.24: Las HTs a través del mTR inducen la activación del factor de
transcripción NF-κB en las células CUTLL1
HT
Mezcla
NF-κB
IP
Control
Localización de NF-κB por microscopía confocal en las células CUTLL1 tratadas o no
(Control) con concentraciones fisiológicas de HTs, durante 15 minutos. Se muestran
imágenes representativas con un aumento X1000 (Barra de escala = 20 µm)
Luego se evaluó la participación del factor de transcripción NF-κB en la
regulación mediada por HTs de los genes IL-4, VEGFA y VEGFB, relacionados
a procesos de proliferación y angiogénesis. Para ello, se analizó el efecto de
las HTs sobre la expresión transcripcional de los mismos, en células CUTLL1,
HuT 78 y OCI-Ly12, preincubadas o no con un inhibidor específico de NF-κB,
111
Resultados
BAY-11-7082 (Figura 4.25). La regulación positiva de los genes IL-4, VEGFA y
VEGFB, que se produce luego de 2 horas de estímulo con HTs, es
significativamente disminuida por el inhibidor de NF-κB en las tres líneas
celulares. Estos resultados, obtenidos en células humanas de linfoma T,
demuestran
que
el
factor
NF-κB
está
involucrado
en
la
inducción
transcripcional mediada por HTs a través de su receptor de membrana.
Figura 4.25: El factor de transcripción NF-κB participa en la inducción de
**
3
2
**
*
#
#
1
0
CT
##
HT
HT +BAY
BAY
2
**
3
2
**
*
1
0
#
##
HT
#
HT +BAY
CT
BAY
CUTLL1
HuT78
OCI-Ly12
*
**
*
#
##
1
0
VEGFA
4
IL4
4
3
Niveles ARNm relativo a B2M
VEGFB
4
Niveles ARNm relativo a B2M
Niveles ARNm relativo a B2M
programas transcripcionales mediada por HTs en células LCT
HT
#
HT +BAY
CT
BAY
Efecto del inhibidor de NF-κB (1 µM), BAY 11-7082, sobre la regulación mediada por
HTs de la expresión de los genes IL-4, VEGFB y VEGFA en las células CUTLL1, HuT
78 y OCI-Ly12. Se muestra el promedio ± ES de 3 experimentos independientes.
* P<0.05, ** P<0.01 vs Control; # P<0.05, ## P<0.01 vs HT.
112
Resultados
4.4 LAS HTs INDUCEN LA EXPRESIÓN DE FACTORES ANGIOGÉNICOS
FUNCIONALES
4.4.1 La activación de la integrina αvβ3 por HTs induce la expresión de
VEGF en los distintos subtipos de linfomas de células T.
Los factores de crecimiento endotelial vascular, VEGFA y VEGFB, pueden
contribuir e influir sobre la proliferación de los LCT a través de dos
mecanismos; el primero involucra un efecto autócrino a través de la expresión
de los receptores de VEGF en las propias células de linfomas (Zhao y col,
2004; Piccaluga y col, 2007); el segundo puede darse por la inducción y
mantenimiento de la angiogénesis a través de efectos parácrinos de estas
moléculas sobre el microambiente celular (Goel y col, 2013). Esto sugiere que
el incremento de VEGFA y VEGFB dependiente de HTs podría llegar a
promover el crecimiento de los LCT a través de mecanismos autócrinos,
induciendo la proliferación de las células malignas, o induciendo el crecimiento
de los vasos sanguíneos que se encuentran en el microambiente tumoral.
Para estudiar con mayor profundidad el efecto de las HTs sobre la expresión de
estos factores angiogénicos, se determinó si la inducción de los mismos es un
mecanismo generalizado que ocurre en los distintos subtipos de LCT, ya sean
de origen inmaduros o maduros. Para ello, se trató durante 24 horas a todo el
panel de líneas celulares de LCT con concentraciones fisiológicas de HT-AG y
luego se midieron los niveles transcripcionales de VEGFB y VEGFA por RTPCR en tiempo real (Figura 4.26). De manera similar al efecto que se observa
en las células CUTLL1, las HT-AG son capaces de inducir los niveles del
ARNm de VEGFB en las células Jurkat, HuT-78, OCI-Ly12 y Karpas299, como
también, los niveles de ARNm de VEGFA en las células Jurkat, HuT78, MJ y
OCI-Ly12
113
Resultados
Figura 4.26: Regulación de la expresión transcripcional mediada por HTs
de VEGFB y VEGFA en distintos subtipos de LCT
Expresión del ARNm de los genes VEGFA y VEGFB, luego de 24 horas de tratamiento
con HT-AG en el panel completo de líneas celulares de LCT. Los resultados
representan los niveles de ARNm en las células tratadas con HT-AG con respecto al
control (CT, línea discontinua roja) y se muestra el promedio de 3 experimentos
independientes ± ES. *P<0.05, **P<0.01.
Para confirmar que los efectos sobre la inducción de VEGF son mediados por
las HTs a través de la activación de la integrina αvβ3, células CUTLL1, HuT-78
y OCI-Ly12 fueron transfectadas con ARN de interferencia contra la integrina
αVβ3 (si-ITGAV o si-ITGB3) o con una secuencia no codificante como control
(si-CT), para luego tratarlas con concentraciones fisiológicas de HT-AG durante
24 horas. Los resultados muestran que la regulación negativa tanto de la
integrina αV como de la β3, inhibe la inducción mediada por las HT-AG (Figura
4.27, Panel A). Estos datos validan nuestras observaciones anteriores, donde
114
Resultados
se sugiere que en la mayoría de los subtipos de LCT la expresión de los
ligandos VEGF depende de la actividad de las HTs sobre su receptor de
membrana, la integrina αVβ3. Más aún, la inducción de la expresión de VEGFA
y VEGFB no se observa cuando se trata a las células de LCT con el ligando
biológico de la integrina, la vitronectina (VN) (Figura 4.27, Panel B). Con lo
cual se puede inferir que, si bien la VN podría contribuir a la proliferación de las
células, lo haría por programas genéticos diferentes.
Figura 4.27: Efecto de la regulación negativa de la integrina αvβ3 y del
ligando vitronectina sobre la expresión inducida por HTs de VEGF en
células LCT
A
HuT 78
OCI-Ly12
#
#
#
2
**
1
**
** **
**
**
0
CT
Niveles ARNm relativo a B2M
CUTLL1
3
CUTLL1
*
HuT78
CUTLL1
#
OCI-Ly12
*
1
CT
HT VN
HT VN
HuT 78
#
2
#
** **
1
OCI-Ly12
**
**
**
** CT
0
VEGFA
*
2
0
3
VEGFB
VEGFB
4
HT VN
Niveles ARNm relativo a B2M
Niveles ARNm relativo a B2M
B
VEGFA
VEGFA
s
si i-CT
- IT
G
si- AV
IT
G
B3
sisi CT
- IT
G
si- AV
IT
G
B3
sisi CT
- IT
G
si AV
- IT
G
B3
3
si
si -CT
-IT
G
si AV
-IT
G
B3
si
si -CT
-IT
G
si AV
-IT
G
B3
si
si -CT
-IT
G
si AV
-IT
G
B3
Niveles ARNm relativo a B2M
VEGFB
VEGFB
3
CUTLL1
HuT78
*
2
*
OCI-Ly12
*
CT
1
0
HT VN
HT VN
HT VN
A: Niveles de ARNm de VEGFA y VEGFB (derecha e izquierda, respectivamente)
luego de 24 horas de tratamiento con HT-AG, en la células CUTLL1, HuT 78 y OCILy12 transfectadas con los siRNA; si-ITGAV, si-ITGB3 o si-CT. B: Niveles de ARNm
de VEGFA y VEGFB (derecha e izquierda, respectivamente) luego de 24 horas de
tratamiento con HT-AG y con el ligando VN (250 ng/ml) en líneas de LCT Se muestra
el promedio de 3 experimentos independientes ± ES. **P<0.05 vs CT, **P<0.01 vs siCT
115
Resultados
4.4.2 La expresión de VEGF mediada por HTs a través de la integrina αvβ3
induce la migración de células endoteliales
Con el objetivo de estudiar y caracterizar si existen consecuencias parácrinas
funcionales de la inducción de la expresión de VEGF mediada por HTs a través
de la integrina αvβ3, se evaluó la capacidad de inducción de respuesta
quimiotáctica de medios condicionados provenientes de células LCT tratadas o
no con hormonas. Utilizando un sistema de 2 dimensiones en una microcámara
de quimiotaxis, se determinó la migración de células endoteliales HMEC1 en
presencia de dichos medios condicionados. Para ello se compararon los
resultados obtenidos con medios provenientes de células CUTLL1 tratadas con
HT-AG durante 24 horas, con los correspondientes a medios similares
generados en presencia de agarosa sola sin hormona (medio control). La
cuantificación de los 3 ensayos realizados demostró que el número de células
HMEC1 que migran es de 481 ± 118 con el medio proveniente de las CUTLL1
tratadas con HT-AG vs. 206 ± 82 con el medio control (P<0.001) (Figura 4.28).
Estos resultados muestran una mayor migración de células endoteliales
HMEC1 al ser cultivadas con un medio condicionado proveniente de células
CUTLL1 tratadas con las HT-AG.
Figura 4.28 Efecto de medios condicionados de células LCT tratadas con
HT-AG sobre la migración de las células endoteliales HMEC1
Medio condicionado HT-AG
Células HMEC1
Medio condicionado control
206 ± 82
481 ± 118
Migración de las células HMEC1 en presencia de medios condionados de células
CUTLL1 tratadas o no con HT-AG. Fotos representativas de las células que migraron a
través de la membrana de la microcámara (aumento 100x; barra escala= 60 µm).
116
Resultados
El aumento del número de células HMEC1 migrantes también fue confirmado
en las células LCT de origen maduro, HuT 78 y OCI-Ly12. Más aún, cuando los
medios condicionados de células LCT tratadas con HT-AG durante 24 horas
son luego pre-incubados con el anticuerpo anti-VEGF, Bevacizumab, la
inducción de la migración de las células endoteliales se ve inhibida (Figura
4.29, Panel A). Estos resultados sugieren que la inducción de la expresión de
los genes de VEGF mediada por HTs, lleva a la producción de VEGF funcional,
presente en los medios condicionados. Más aún, la inducción de la migración
de las células endoteliales se vio inhibida cuando las células LCT tratadas con
HT-AG durante 24 horas, no expresan la integrina αVβ3 por su regulación
negativa mediante siRNA contra ITGAV o ITGB3 (Figura 4.29, Panel B).
Figura 4.29 Cuantificación de la migración de células endoteliales tratadas
con medios condicionados de células LCT
CUTLL1
600
HuT 78
OCI-Ly12
*
400
**
#
#
200
*
#
0
HT-AG
-
+ - +
- + - +
- + - +
Anti-VEGF
-
- + +
- - + +
- - + +
Migración HMEC1 (n° células)
B
Migración HMEC1 (n° células)
A
800
600
si-CT
si-ITGAV
si-ITGB3
**
400
#
#
200
0
CT HT-AG CT HT-AG CT HT-AG
Cuantificación de la migración de las células HMEC1 luego de 4 horas de cultivo con:
A: medios condicionados de distintos subtipos de LCT, control o HT-AG, preincubados o no con Becavizumab (10 µg/ml). B: medios condicionados de las células
CUTLL1 transfectadas con siRNA contra ITGAV oITGB3 y tratadas o no con HT-AG.
#
P<0.05 vs si-CT, * P<0.05, ** P<0.01 vs Control.
4.4.3 La expresión de VEGF mediada por HTs cumple un rol autócrino
sobre los LCT
Se analizó el posible rol autócrino de la inducción de VEGF mediada por las
HTs. Para ello, se evaluó el efecto del anticuerpo bloqueante para VEGF,
117
Resultados
Bevacizumab, y de un inhibidor farmacológico del receptor de VEGF, Axitinib,
sobre la inducción de la proliferación inducida por HTs en las células de
linfomas T: CUTLL1, HuT 78 y OCI-Ly12. Tanto el Bevacizumab (anti-VEGF)
como el Axitinib (inhibidor de la tirosina quinasa del VEGFR) disminuyen el
efecto proliferativo de las HTs en todos los subtipos de LCT analizados (Figura
4.30), demostrando la contribución del VEGF y del incremento de su expresión
inducido por HTs sobre la proliferación de estas células.
Figura 4.30: Efecto de la inhibición del VEGF sobre la proliferación
Incorporación [ 3 H]-TdR (dpm)
regulada por HTs en LCT
HuT 78
CUTLL1
8000
OCI-Ly12
*
6000
*
*
4000
#
#
#
#
#
#
2000
0
-
- + + + - -
- + + + - -
Anti-VEGF
- - + - + -
- - + - + -
- - + - + -
Inhib VEGFR
- - - + - +
- - - + - +
- - - + - +
TH
- + + + -
Proliferación evaluada por incorporación de [3H]TdR en las células CUTLL1, HuT 78 y
OCI-Ly12 preincubadas o no por una hora con Bevacizumab (anti-VEGF, 10 µg/ml) o
Axitinib (inhib VEGFR, 3 µM) y luego tratadas por 24 horas con HTs. Los resultados
representan el promedio ± ES de 3 ensayos independientes *P<0.05 vs CT; #P<0.05
vs HTs.
Adicionalmente, se analizó el efecto de VEGF recombinante (VEGFr) sobre la
proliferación de distintas líneas LCT. La adición de VEGFr fue capaz de inducir
la proliferación de las células de los distintos subtipos de LCT de manera
significativa en comparación al control (Figura 4.31).
118
Resultados
Figura 4.31: Efecto de VEGF recombinante sobre la proliferación regulada
Incorporación [3 H]-TdR
(dpm)
por HTs en LCT
8000
CUTLL1
HuT 78
OCI-Ly12
6000
*
*
*
4000
2000
0
VEGFr
-
+
-
+
-
+
Proliferación evaluada por incorporación de [3H]TdR en las células CUTLL1, HuT 78 y OCILy12 tratadas por 24 horas con VEGF recombinante (VEGFr, 10ug/ml). Los resultados
representan el promedio ± ES de 3 ensayos independientes. *P<0.05.
Los resultados mencionados en esta sección sugieren que las HTs, a través de
su receptor de membrana, la integrina αVβ3, inducen la producción del ligando
VEGF funcionalmente activo.
Los efectos funcionales de este factor de crecimiento, parecerían darse tanto
por mecanismos autócrinos, induciendo la proliferación de las células de
linfoma T, como parácrinos a través de la inducción de la migración de células
endoteliales.
119
Resultados
4.5 EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN TRANSCRIPCIONAL O DEL
BLOQUEO FARMACOLÓGICO DE LA INTEGRINA αVβ3 SOBRE EL
CRECIMIENTO IN VIVO DE LOS LCT
4.5.1 La regulación negativa de la integrina αvβ3 disminuye el crecimiento
tumoral in vivo de las células CUTLL1.
En las secciones anteriores se describió como, la acción de las HTs sobre su
receptor de membrana, induce in vitro la proliferación de los distintos subtipos
de LCT, a través de la activación de programas transcripcionales vinculados
con la proliferación y la angiogénesis. Las vías de señalización activadas por
HTs podrían utilizarse como blanco terapéutico para el tratamiento de esta
patología. Para estudiar con mayor profundidad esta posible estrategia
terapéutica se propuso como siguiente objetivo la evaluación del efecto que la
inhibición de la integrina αvβ3 podría tener sobre el crecimiento in vivo de
células humanas de linfoma T en animales de experimentación.
Para ello, se desarrolló un modelo de xenotrasplante utilizando células CUTLL1
en
ratones
inmunodeficientes
NOD-SCID
(NOD.CB17-Prkdcscid/J).
Se
7
inyectaron subcutáneamente 2 x 10 células CUTLL1 en cada ratón y se midió
el volumen tumoral a lo largo del tiempo. Para evaluar el efecto de la inhibición
de la integrina αvβ3 se transfectaron previamente las células CUTLL1 con los
siRNA contra ITGAV (si-ITGAV), ITGB3 (si-ITGB3) o con una secuencia no
codificante (si-CT), como control. Los resultados muestran que los tumores
desarrollados a partir de las células transfectadas con los siRNA si-ITGAV o siITGB3, fueron significativamente menores que aquellos desarrollados con las
CUTLL1 si-CT (Figura 4.32, Panel A). Como control, se analizaron los niveles
proteicos de dichas integrinas por inmunohistoquímica en secciones de los
tumores. Se observa claramente que, los tumores provenientes de células
CUTLL1 transfectadas con si-ITGAV o si-ITGB3, expresan niveles proteicos
mucho más bajos de la integrina correspondiente en comparación con los
tumores control (Figura 4.32, Panel B).
120
Resultados
Figura 4.32: Efecto de la regulación negativa de las integrinas αV y β3
sobre el crecimiento in vivo de los tumores de células CUTLL1
A
Volumen tumoral
día 4 a día 15 (ABC)
9000
P<0.05
P<0.01
6000
3000
si-CT
si-CT
si-ITGAV
si-CT
si-ITGB3
Integrina β3
Integrina αV
B
si-ITGAV si-ITGB3
A: Las células CUTLL1 fueron transfectadas con los siRNA, si-ITGAV, si-ITGB3 o siCT, y luego inyectadas subcutáneamente (2 x 107 cel) en ratones NOD.CB17Prkdcscid/J. El gráfico representa el área bajo la curva (ABC) del volumen tumoral. B:
Expresión proteica de las integrinas αV y β 3 evaluada por inmunohistoquímica en
secciones de los tumores obtenidas en A. Aumento de las fotografías 630X, barra de
escala= 20 µm.
También se analizó, por inmunohistoquímica, la expresión de VEGFA, CD31 y
caspasa 3 activa en secciones de tejidos parafinados de dichos tumores
(Figura 4.33). Aquellos tumores provenientes de células CUTLL1 transfectadas
tanto con si-ITGAV como con si-ITGB3 mostraron una marcada disminución de
121
Resultados
los niveles proteicos de VEGFA y un aumento en la expresión de caspasa 3
activa en comparación con los tumores controles. El aumento de esta última
podría sugerir que la disminución en el volumen tumoral está relacionada con el
incremento de la apoptosis celular.
Figura 4.33: Efecto de la regulación negativa de las integrinas αV y β3
sobre la expresión de VEGFA y la apoptosis en los tumores CUTLL1.
si-ITGAV
si-ITGB3
Caspasa 3
activa
VEGFA
si-CT
Niveles de VEGFA y de Caspasa 3 activa evaluados por inmunohistoquimica en
secciones de tumores CUTLL1. Aumento de las fotografías 630X, barra de escala= 20
µm.
Adicionalmente, se evaluó la vascularización intratumoral mediante la
marcación con un anticuerpo contra el marcador endotelial CD31 y luego se
cuantificó el área de los vasos visualizados por microscopía (Figura 4.34). En
las imágenes obtenidas se observa que los tumores CUTLL1 si-ITGAV y siITGB3, desarrollan una vascularización anatómicamente defectuosa. También
se encontró una disminución en el área de los vasos sanguíneos con respecto
a los tumores si-CT (área en mm2: si-ITGAV= 0.40x10-3 ± 0.12x10-3, si-ITGB3=
0.34x10-3 ± 0.08 x10-3 vs. si-CT= 1.07x10-3 ± 0.25x10-3, p<0.01). Todos estos
datos sugieren que podría existir una disminución en el potencial angiogénico
en los tumores desarrollados a partir de las células CUTLL1 que no expresan
la integrina αVβ3.
122
Resultados
Figura 4.34: Efecto de la regulación negativa de las integrinas αV y β3
sobre la vascularización de los tumores CUTLL1.
Área vasos sanguíneos (mm 2)
5.0×10 -3
3.0×10 -3
2.0×10 -3
**
**
1.0×10 -3
0
si-CT
si-ITGAV si-ITGB3
si-CT
si-ITGAV
si-ITGB3
CD31
Niveles de CD31 evaluados por inmunohistoquimica en secciones de tejidos de
tumores CUTLL1 (izquierda). Aumento de las fotografías 630X, barra de escala=20
µm. Cuantificación del área de los vasos sanguíneos en los distintos grupos de
tumores. **P<0.001 vs si-CT.
4.5.2 La inhibición farmacológica de la integrina αvβ3 disminuye el
crecimiento in vivo de las células OCI-Ly12
Como siguiente objetivo se propuso determinar si la inhibición de la vía
regulada por las HTs a través de su receptor de membrana, puede ser
capitalizada terapéuticamente para el tratamiento de pacientes con linfoma de
células T. Para ello, se evaluó el efecto del inhibidor farmacológico, cilengitide,
sobre el crecimiento in vivo de células de LCT. Como se mencionó
anteriormente, el cilengitide es un pentapéptido cíclico anti-angiogénico que
muestra una actividad antagonista de la integrina αVβ3 en el orden
123
Resultados
subnanomolar. Además se encuentra en estudios de fase clínica III en
glioblastomas y en fase II en otros tipos de tumores sólidos.
La expresión de VEGF se ha descripto como un marcador predictivo de
sobrevida; su alta expresión está asociada a una mala respuesta a drogas
quimoterapéuticas convencionales en pacientes con PTCL-NOS (Jorgensen y
col, 2007, 2009). Por esto, se decidió desarrollar un modelo de xenotrasplante
de células PTCL-NOS en ratones inmunodeficientes NOD-SCID utilizando
células OCI-Ly12, para luego evaluar el efecto del cilengitide sobre su
crecimiento in vivo. Se inyectaron subcutáneamente 1 x 107 células OCI-Ly12
en el flanco izquierdo de cada ratón. Una vez que los tumores llegaron a un
volumen palpable de aproximadamente 75-100 mm3, se dividió de manera
aleatoria a los ratones en dos grupos de tratamiento, el cuál se administró
diariamente por 20 días. Uno de los grupos (n=9) recibió inyecciones
intraperitoneales diarias de cilengitide (110 mg/kg) y el otro grupo (n=6) recibió
el vehículo de la droga (PEG300 35%, Tween-80 5% y dextrosa 65% en 5% de
agua) como control (Figura 4.35).
Figura 4.35: Efecto del inhibidor farmacológico, cilengitide, sobre el
crecimiento in vivo de las células PTCL-NOS OCI-Ly12
15000
Volumen tumoral
día 1 a 20 (ABC)
P < 0.001
10000
5000
0
CONTROL
CILENGITIDE
Crecimiento in vivo de células OCI-Ly12 en ratones NOD-SCID. Se muestra el gráfico
del volumen tumoral (área bajo la curva, ABC) luego de 20 días de tratamiento diario
por vía intraperitoneal con 110 mg/kg del inhibidor cilengitide (n=9) o con el vehículo
como control (n=6).
124
Resultados
Una vez finalizado el tratamiento, se observó que los ratones tratados con el
inhibidor
de
la
integrina
αVβ3
desarrollaron
tumores
de
tamaño
significativamente menor a los generados en los ratones SCID tratados con el
vehículo (Figura 4.35).
El efecto inhibitorio del pentapéptido cíclico cilengitide sobre el crecimiento
tumoral de las células OCI-Ly12 fue asociado a la disminución de la activación
de la vía de señalización de NF-κB (Figura 4.36)
Figura 4.36: Efecto del tratamiento con el inhibidor Cilengitide sobre la
Actividad relativa de NFκB
activación de las vías de señalización de NF-κB en los tumores OCI-Ly12
Vehículo
Cilengitide
Capacidad de unión al ADN de los distintos miembros de la familia NF-κB (ver
Materiales y Métodos) en extractos nucleares de fracciones de tejido de linfoma
obtenidos de los tumores OCI-Ly12. *P<0.05 y ** P<0.01
También se evaluó la apoptosis celular, mediante la técnica de TUNEL, en
secciones tisulares de los tumores OCI-Ly12. Se encontró un aumento de
células apoptóticas inducido por el tratamiento (7.3 ± 3.5% vs. 12 ± 4.2%,
vehículo vs. cilengitide, respectivamente, Figura 4.37). Estos resultados
sugieren que la reducción en el volumen tumoral podría estar relacionada con
el aumento de la apoptosis celular.
125
Resultados
Cabe mencionar que si bien la dosis de cilengitide utilizada en el ensayo es la
concentración máxima tolerada descripta en pacientes, teniendo en cuenta el
peso corporal y el análisis macroscópico tisular de los ratones tratados, se
pudo determinar que no hay toxicidad asociada al tratamiento (datos no
mostrados).
Figura 4.37: Efecto del tratamiento con el inhibidor Cilengitide sobre la
apoptosis en los tumores OCI-Ly12
Vehículo
7.3 ± 3.5 %
Cilengitide
12 ± 4.2 %
Apoptosis celular analizada por la técnica de TUNEL en secciones tisulares
representativas de tumores OCI-Ly12 tratados con cilengitide o con vehículo como
control. Aumento de las fotografías 200X, barra de escala = 100 µm.
4.5.3 La inhibición farmacológica de la integrina αvβ3 disminuye el
crecimiento in vivo de tumores ALCL derivados de pacientes.
Para determinar si la estrategia terapéutica descripta podría tener una
traslación a la clínica, se evaluó el efecto del cilengitide en un modelo preclínico utilizando tumores derivados de pacientes. Los mismos se trasplantaron
en ratones humanizados (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) que luego fueron
tratados intraperitonealmente con el inhibidor farmacológico cilengitide como se
indicó anteriormente. Se realizaron dos ensayos, uno con tumores derivados de
un paciente ALCL-ALK+ y otro con tumores derivados un paciente ALCL-ALK–
126
Resultados
(n=16 y n=8 respectivamente). Una vez que los tumores fueron trasplantados,
se dividió aleatoriamente a los ratones en dos grupos de tratamiento
(Cilengitide vs Vehículo). Los resultados muestran que el tratamiento con
cilengitide durante 10 días indujo una disminución en el crecimiento in vivo de
ambos subtipos de tumores ALCL, ALK- y ALK+, en comparación con los
tumores tratados con el vehículo como control (Figura 4.38).
Figura 4.38: Efecto del tratamiento con cilengitide sobre el crecimiento de
tumores derivados de pacientes ALCL
día 1 a10 (ABC)
Volumen tumoral
P =0.0104
VEHÍCULO
CILENGITIDE
día 1 a10 (ABC)
Volumen tumoral
P =0.0159
VEHÍCULO
CILENGITIDE
Evaluación del volumen tumoral (área bajo la curva, ABC) de los tumores derivados de
un paciente ALCL-ALK+ y otro ALCL-ALK- (panel superior e inferior, respectivamente)
crecidos en ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ. Los mismos fueron divididos
en dos grupos de tratamiento, un grupo fue tratado durante diez días con cilengitide
(110 mg/kg) y el otro con el vehículo como control.
127
Resultados
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en este trabajo podemos plantear
que las HTs contribuirían al fenotipo maligno de los linfomas de células T a
través de la regulación de programas genéticos vinculados con la proliferación
y angiogénesis. Estos efectos se dan por la acción de las HTs sobre su
receptor de membrana, la integrina aVβ3, dando como resultado la activación
transcripcional de genes como VEGF, que favorece en última instancia la
vascularización y el crecimiento tumoral. La inhibición selectiva de la
integrina aVβ3, resulta en la inhibición de la proliferación y el crecimiento
tumoral de los LCT. De esta manera, podríamos plantear la utilización de este
receptor como nuevo blanco terapéutico para el tratamiento de esta patología.
128
5. DISCUSIÓN
Discusión
Las hormonas tiroideas modulan distintos procesos fisiológicos y son críticas
para el crecimiento, desarrollo, diferenciación y mantenimiento de la
homeostasis metabólica (Oetting y Yen, 2007). Las enfermedades asociadas a
las HTs están relacionadas a la falta o exceso de las mismas (hipo e
hipertiroidismo), pero también se las asocia al desarrollo y curso de otras
patologías. El crecimiento y la progresión tumoral están íntimamente vinculados
con el entorno celular. En el mismo juega un papel preponderante la influencia
del sistema inmunológico y del sistema endócrino, mediante la producción de
citoquinas y hormonas derivadas tanto del huésped como del tumor (Reiche y
col, 2004; Hammacher y col, 2005).
Los factores inmunológicos y endócrinos pueden orquestar la evolución y
diseminación de una patología oncológica (Reiche y col, 2004; Hammacher y
col, 2005). Las citoquinas derivadas de los linfomas de células T son capaces
de modular la respuesta inmune antitumoral, favoreciendo la progresión
tumoral (Shu y col, 2010; Gaulard y de Levald, 2014). Las células tumorales
también se encuentran expuestas a un complejo microambiente parácrino y
endócrino, compuesto por una variedad de factores de crecimiento y hormonas
elaboradas por las células vecinas o distales (Singh y Singh, 2009). En este
sentido existen trabajos donde asocian a las HTs con la transformación celular,
tumorigénesis y metástasis (Hercbergs y col, 2010; Moeller y Führer, 2013) y
proponen que las HTs podrían cumplir un rol importante en la inducción de la
angiogénesis (Pinto y col, 2011; Mondul y col, 2012).
Los LCT no son la excepción, también están influenciados por el entorno
celular. Recientemente nuestro grupo de trabajo describió que las HTs se
encuentran entre los factores que influencian, in vitro, la proliferación de células
murinas de linfomas T (Barreiro Arcos y col, 2006; 2011 y 2013). Más aún,
también se describió que el estado tiroideo afecta el crecimiento tumoral in vivo
de la línea de linfoma T murino EL-4 creciendo en ratones singeneicos (Sterle y
col, 2014). Es importante tener en cuenta que, salvo excepciones, los pacientes
con LCT tienen mal pronóstico debido a la combinación de un curso clínico muy
agresivo y a la falta de tratamientos específicos. Esto se pone en evidencia por
la ausencia de protocolos estándares para el cuidado y tratamiento de los
130
Discusión
pacientes y por la refractariedad a las quimioterapias convencionales. Por ello
es tan importante focalizar esfuerzos en el estudio de la biología genética y
tumoral de los LCT, para lograr el desarrollo de regímenes terapéuticos más
específicos y efectivos para el tratamiento de esta patología.
En este trabajo evaluamos el rol que ejercen las HTs a través de su acción
sobre sus receptores, nuclear y de membrana (TR y mTR, respectivamente),
sobre líneas de distintos subtipos de LCT humanos, demostrando por primera
vez los programas genéticos activados por las HTs a través del mTR, que, en
esta células, se identificó como la integrina αVβ3. Además, y en base a los
resultados encontrados, extendimos nuestros estudios a modelos animales de
xenotrasplante de células de LCT y de tumores de pacientes a fin de evaluar la
potencialidad del blanco terapéutico que representa el receptor de membrana
para las HTs. A continuación realizaremos un análisis de las acciones in vitro
de las HTs sobre la proliferación de las células de LCT y la inducción de genes
resultante de la activación del mTR, a fin de comprender mejor los mecanismos
por los cuales las HTs podrían estar contribuyendo al desarrollo y diseminación
de los LCT in vivo. Finalmente analizaremos la importancia de la inhibición
farmacológica del mTR como potencial terapia para esta patología.
5.1 Efectos de las hormonas tiroideas sobre la proliferación y ciclo
celular de linfomas de células T humanos.
El estudio de las acciones de las HTs sobre el crecimiento tumoral no es
reciente. Hace más de 30 años, se encontró que la remoción de las hormonas
T3 y T4 del suero suprimía la transformación neoplásica inducida por rayos X
en líneas celulares en cultivo, sin modificar la supervivencia celular (Guernsey y
col, 1980). Más aún, la adición de T3 al medio depletado de hormonas
restablecía la frecuencia de transformación esperada. También se ha descripto
que la T3 facilita la carcinogénesis química (Borek y col, 1983). Adicionalmente,
se demostró en ratas hipotiroideas una reducción de la inducción de cáncer de
131
Discusión
mama luego de la exposición a 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA). El
reemplazo hormonal incrementó un 78% su incidencia (Goodman y col, 1980).
Por un largo periodo, los estudios mencionados no fueron tenidos en cuenta
debido al tradicional concepto de la acción genómica de las HTs sobre la
transcripción de genes relacionados con la homeostasis y el metabolismo de las
células normales. Sin embargo más recientemente, luego de que se describiera
un receptor para HTs ubicado en la membrana plasmática capaz de estimular
señales intracelulares de activación, se pudo explicar la contribución de dichas
hormonas a la proliferación celular de distintos tipos de neoplasias. Estudios
realizados en líneas humanas de cáncer de mama (Tang y col, 2004), de
tiroides papilar y folicular (Lin y col, 2006), de glioma U-87 MG (Lin y col, 2009)
y de pulmón (Meng y col, 2011), demostraron que el tratamiento con
concentraciones fisiológicas de T3 y T4 lleva a la activación de ERK1/2 y
consecuentemente a la proliferación celular, evidenciada por una acumulación
del antígeno de proliferación nuclear, PCNA.
Pocos estudios se han centrado en el complejo rol que tienen los factores
endócrinos presentes en el microambiente tumoral de LCT humanos. Entre
ellos, se ha determinado la influencia de las HTs del microambiente tumoral en
modelos experimentales desarrollados en animales con diferente estado
tiroideo, demostrando que el mismo está asociado a la modificación
significativa de la sensibilidad a la radioterapia, la que se ve favorecida por el
estado hipotiroideo (Jordan y col, 2007). A fin de resaltar el rol de las HTs entre
dichos factores, en este trabajo evaluamos, en primer lugar, su efecto sobre la
proliferación celular en un panel de 9 líneas de LCT humanos, los cuales
representan tanto subtipos de origen inmaduro (Jurkat y CUTLL1), como de
origen maduro (Hut78, Mac-2A, OCI-Ly12, OCI-Ly13.2, SU-DHL-1, Karpas299).
El tratamiento in vitro de las células LCT con concentraciones fisiológicas tanto
de T3 y T4 libres (HT), como de las mismas acopladas a agarosa (TH-AG,
impermeables a las células) indujo un aumento de la proliferación celular, de la
síntesis del ADN, de la expresión del marcador proliferativo PCNA y de la
fosforilación de ERK1/2. La magnitud del efecto proliferativo de las HTs fue
similar en los distintos subtipos de LCT analizados; este resultado sugiere que
132
Discusión
la proliferación mediada por HTs podría tratarse de un mecanismo generalizado
que es aprovechado por las células de linfoma T para su supervivencia. Más
aún, se encontró que el mayor efecto mediado por HTs se obtiene con la
adición combinada de T3 y T4, o T3-AG y T4-AG. Asimismo, dicho efecto se
observó con concentraciones similares a los niveles circulantes de ambas
hormonas, acercando estos hallazgos in vitro a lo que tiene lugar
fisiológicamente en el microambiente tumoral. Más aún, estudios recientes
sugieren que los LCT podrían encontrarse en un microambiente enriquecido en
HTs por un mecanismo que involucra el control epigenético transcripcional de
la deiodinasa de tipo 3 (DIO3). El gen de esta enzima, que juega un rol esencial
en regular la inactivación de las HTs en los tejidos, fue encontrado
hipermetilado y reprimido en células T malignas (Martin-Subero et al, 2009).
Existen evidencias clínicas que sugieren que el hipertiroidismo subclínico
aumentaría la incidencia de ciertos tipos de tumores sólidos, y que el
hipotiroidismo espontáneo o inducido podría estar asociado a un mejor
pronóstico y mayor sobrevida de pacientes con distintos tipos de cáncer
(Hercbergs et al, 2010; Hamnvik et al, 2011). Nuestro grupo de trabajo describió
a las HTs como factores que inducen la proliferación de células murinas de
linfomas T y capaces también de regular positivamente la activación de células
T normales (Barreiro Arcos y col, 2006 y 2011). Adicionalmente comprobamos
que el hipertiroidismo experimental aumenta el crecimiento in vivo de un linfoma
T murino en ratones singeneicos (Sterle y col, 2014).
La regulación del ciclo celular es el mecanismo más importante de control del
crecimiento de los distintos tipos de células. Hay trabajos que describen
ensayos in vitro con las HTs que demuestran que las mismas son capaces de
modular la expresión de marcadores moleculares de la progresión del ciclo
celular e inducir la proliferación y síntesis de ADN. En cardiomiocitos de rata,
por ejemplo, se observó que el tratamiento con T3 induce la entrada al ciclo
celular mediante un incremento de la expresión de la ciclina D1 (LeddaColimbano y col, 2006). Se decidió entonces evaluar marcadores del ciclo
celular en las líneas LCT tratadas con HTs.
133
Discusión
Luego del tratamiento por distintos tiempos con las HT o HT-AG, se encontró un
aumento inicial de los niveles transcripcionales de las ciclinas D1, D2 y D3
(todas requeridas para la progresión de G0 a G1 del ciclo celular) seguido por
un aumento de la ciclina E2 (progresión de G1 a S, y fase S) y de la ciclina B1
(progresión de G1 a M). También se encontró una disminución de los niveles
transcripcionales del inhibidor de quinasas dependiente de ciclinas, p21, y del
supresor tumoral, p53. Recientemente, efectos similares fueron observados por
nuestro grupo en tumores sólidos de linfomas T murinos crecidos en ratones
hipertiroideos, en los que encontramos un aumento de las ciclinas D1 y D3. Por
el contrario los tumores crecidos en ratones hipotiroideos muestran una
disminución en la expresión de inhibidores del ciclo celular, como CDKN2A y
CDKN1B, y de supresores tumorales como p53 (Sterle et al, 2014).
En
concordancia con nuestros resultados también se describió la modulación por
HTs de reguladores del ciclo celular en otros tipos tumorales. Así, en células de
carcinoma papilar tiroideo se encontró que la T3 induce la expresión de la ciclina
D1 a través de la activación y reclutamiento al núcleo del complejo
transcripcional TRβ1/ Oct-1, promoviendo la proliferación celular (Perri y col,
2014). Resultados similares se describieron en una línea celular de carcinoma
pancreático humano (Yalcin y col, 2013).
La regulación de genes vinculados a la progresión del ciclo celular mediada por
HTs es un punto muy importante, ya que se ha descripto a las ciclinas como
marcadores moleculares del potencial oncogénico de los linfomas de células T y
su regulación estaría involucrada con la linfomagénesis (Møller y col, 2001;
Metcalf y col, 2010; Vaites y col, 2014). La inducción de la proliferación celular y
de la transcripción de ciertas ciclinas, mediada por HTs a través del mTR en las
líneas de LCT humanas, fue de magnitud similar al efecto total inducido por las
HTs libres. Existen observaciones experimentales y clínicas que sugieren que
tanto la T3 como la T4 son capaces de mantener la proliferación de células de
distintos tipos de cáncer a través de su unión a un receptor de membrana. Se ha
demostrado que la acción de las HTs sobre la integrina αVβ3 regula el
crecimiento de células de mieloma (Cohen y col, 2011) y glioblastomas (Lin y
col, 2009) a través de la activación de la vía de señalización MAPK y aumentan
la actividad proliferativa sobre células humanas de carcinoma de pulmón y de
134
Discusión
cáncer de ovario (Lin y col, 2013). También se ha descripto que el bloqueo de la
integrina αVβ3 disminuye el crecimiento tumoral in vivo y la angiogénesis de
células humanas de cáncer pancreático, acompañado por una disminución de la
expresión de marcadores de progresión del ciclo celular (Yalcin y col, 2013).
Como se mencionó anteriormente muchos trabajos asocian a las HTs con la
transformación celular, la tumorigénesis y las metástasis (Hercbergs y col, 2010;
Moeller y Führer, 2013). En este sentido y teniendo en cuenta los resultados
mencionados, se describe por primera vez que los LCT humanos no son la
excepción y que también son influidos por las HTs, induciendo su crecimiento y
proliferación celular y la expresión de marcadores moleculares asociados a la
progresión del ciclo celular.
5.2 Identificación del receptor de membrana para HTs en linfomas
humanos de células T.
En el año 2005 se demostró por primera vez que tanto la T3 como la T4
pueden unirse a una proteína de membrana en las células fibroblásticas CV-1.
Este receptor fue descripto como la integrina αvβ3 (Bergh y col, 2005).
Las integrinas son receptores de membrana αβ heterodiméricos que, luego de
la unión de sus ligandos, inducen una serie de señales intracelulares que
pueden regular la sobrevida, la proliferación, la migración y la diferenciación
celular. La respuesta celular depende del tipo de ligando y de los componentes
del receptor dimérico. La integrina αVβ3 es el receptor de proteínas de la
matriz
celular
como
la
vitronectina
(VN),
Cyr61,
eta-1/osteopontina,
fibronectina, fibrinógeno y factores solubles, como las hormonas tiroideas.
Las HTs se unen a una o varias isoformas de su receptor nuclear. El TR une
preferencialmente a la T3; sin embargo, la integrina αVβ3 une tanto T3 como
T4. Utilizando modelados matemáticos de la cinética de unión de las HTs a la
integrina, se describió que el dominio de unión de HTs sobre la misma se
encuentra cerca del sitio de unión a ligandos con secuencia RGD (Arginina-
135
Discusión
Glicina- Aspartato) e incluye dos sitios de unión, que transducen señales
mediadas por las HTs de manera diferencial (Davis y col 2011; Freindorf y col,
2012). Las acciones de las hormonas T3 y T4 sobre este receptor de
membrana, fueron demostradas en células normales, en células de vasos
sanguíneos
(Davis,
2004;
Bergh,
2005),
en
células
no
cancerosas
inmortalizadas, en células embrionarias de riñón y en distintos tipos tumorales,
tales como cáncer de próstata y carcinomas renales (Kimbro y Simons, 2006).
Hasta el momento no se había descripto si esta integrina es también el receptor
de membrana para las HTs en los LCT. En este trabajo se demuestra que,
tanto el TRα como la integrina αVβ3, se encuentran expresados en todas las
líneas celulares de linfomas T humanos evaluadas, indicando que estas células
podrían ser afectadas por los niveles circulantes de T3 y T4 que se encuentran
normalmente presentes en el microambiente tumoral. Más aún, la mayoría de
las células de LCT evaluadas expresan mayores niveles de estos receptores en
comparación a los linfocitos T periféricos normales, sugiriendo una mayor
respuesta de los LCT a las HTs. Es importante mencionar que la integrina
αVβ3 se encuentra altamente expresada en células endoteliales angiogénicas y
en células tumorales cumpliendo un rol preponderante en procesos patológicos
asociados a la supervivencia, al crecimiento tumoral y a las metástasis (Hood y
Cheresh, 2002). Dicho receptor de membrana fue implicado en la patofisiología
y progresión de melanomas (Dang y col, 2006), gliomas (Gingras y col, 1995) y
en distintos tipos de cáncer como los de ovario (Hapke y col, 2003), próstata
(Cooper y col, 2001) y mama (Harms y col, 2004; Vellon y col, 2006). Por
ejemplo, la integrina αVβ3 está altamente expresada en prácticamente todos
los cánceres de mama con metástasis óseas (Liapis y col, 2006). Estudios in
vitro sobre cultivos de células tumorales mamarias describen la existencia de
una correlación positiva entre la expresión de la integrina αVβ3 y la habilidad
de las células tumorales de adherirse a la matriz extracelular, de migrar y de
regular secreción de metaloproteasas, características que favorecen la
diseminación metastásica (Felding-Habermann y col, 2001; Rolli y col, 2003;
Gomes y col, 2004). También se ha descripto que las integrinas, ampliamente
expresadas en tejidos hematopoyéticos y no hematopoyéticos, tienen una
distribución diferencial en muestras primarias de Linfomas Non-Hodking,
136
Discusión
encontrándose que la expresión de ciertas integrinas está relacionada con el
subtipo histológico, influyendo en la difusión de la enfermedad y el pronóstico
de los pacientes (Terol y col, 1999). En este estudio se analizó la expresión de
las integrinas α2 a α6, αL, β1 y β2 en muestras primarias de LNH, pero no la
expresión de las integrinas αV o β3, las cuales si se encuentran expresadas en
nuestro panel de muestras primarias de los distintos subtipos de LCT.
Se ha descripto que el efecto inductor de las HTs sobre la proliferación celular
fue inhibido tanto in vitro como in vivo, utilizando anticuerpos monoclonales
contra la integrina αVβ3, como también utilizando el análogo de la T4, ácido
tetraiodotiroacético (Tetrac) (Mousa y col, 2012). El efecto antitumoral del
Tetrac también fue demostrado en otros modelos de xenotrasplantes de células
humanas de carcinomas medulares tiroideos, carcinomas tiroideos foliculares y
carcinomas renales (Yalcin y col, 2009 y 2010).
En este trabajo demostramos que la integrina αVβ3 es el receptor de
membrana para las HTs en las células T malignas. En primer lugar,
comprobamos que el mTR en células de LCT es una integrina con sitio de
unión para ligandos con el motivo RGD, ya que el efecto proliferativo de las
HTs fue inhibido in vitro de manera significativa cuando se preincuba a las
células con el péptido RGD. Más aún, la regulación negativa de los niveles
transcripcionales de las integrinas αV o β3 utilizando ARN de interferencia
inhibió la inducción de la proliferación mediada por HTs tanto en las células
LCT de origen inmaduro, CUTLL1, como en células de origen maduro, HuT 78
y OCI-Ly12. Estos estudios nos permitieron identificar a la integrina αVβ3
como receptor de membrana para las HTs en los LCT humanos.
Se ha descripto que el ligando biológico de la integrina αVβ3, la VN, es capaz
de estimular la proliferación de células tumorales de origen linfoide, incluyendo
células T de leucemias linfoblásticas (Vacca y col, 2001). Es por ello que se
evaluó la acción de la misma, como componente del microambiente tumoral,
sobre la proliferación de los LCT. Para ello se trató a células de los distintos
subtipos de LCT con VN, en presencia o ausencia de las HTs, de manera de
poder analizar el impacto de las hormonas sobre la proliferación en presencia
137
Discusión
del ligando natural de la integrina. Si bien la VN fue capaz de inducir la
proliferación de los LCT en comparación al control, la magnitud de este efecto
fue menor que la observada con HTs. Además el tratamiento con ambos
factores no potenció el efecto proliferativo. Estos resultados fueron confirmados
al evaluar la proliferación de células LCT mediada por HTs, en cultivos
tridimensionales que incluyen en su matriz, células mesenquimales y el péptido
RGD. De esta manera se pudieron analizar los efectos de las HTs en un
contexto más cercano al fisiológico. Observamos no sólo que las HTs son
capaces de inducir el crecimiento de las células LCT en los cultivos 3D, sino
también que la inhibición farmacológica del mTR inhibió el efecto proliferativo
de las HTs. Estos datos indicarían que las acciones mediadas por las HTs
pueden darse de manera independiente y, aún, en presencia del ligando
biológico de la integrina αVβ3.
5.3 Programas transcripcionales regulados por las hormonas
tiroideas a través de su receptor de membrana
El surgimiento de técnicas de última generación basadas en el análisis de
blancos moleculares, como la expresión diferencial de genes, la secuenciación
de ADN y ARN y los perfiles epigenéticos, han influido de manera significativa
en la comprensión y el enfoque terapéutico de distintos subtipos de neoplasias,
incluidas las linfoides (Tirado y col, 2012; Li y col, 2013). Estas nuevas
tecnologías permiten el rápido análisis en forma global de los perfiles genéticos
y de las vías de señalización activadas en estas patologías, ayudando de
manera considerable a la clasificación de los distintos subtipos e identificando
nuevas estrategias terapéuticas.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, se decidió evaluar los
mecanismos genéticos involucrados en los efectos proliferativos mediados por
HTs a través de su mTR. Para ello se analizaron los cambios transcripcionales
inducidos por las HT-AG (vs. AG sola como control) en las células CUTTL1 por
secuenciación de ARN. La activación mediada por las HT-AG a través de la
138
Discusión
integrina αvβ3, estimula vías de señalización que inducen finalmente la
expresión de genes relacionados con la “traducción proteica” (RPL13, RPL27A,
RPL36), con la “cadena respiratoria oxidativa” (NUDFB1/2, NDUFA13,
UQCR11), con la “angiogénesis” (VEGFB), con la proliferación / diferenciación
de linfocitos y con la replicación del ADN (IL4, EDF1, DOK2). Dado que estos
genes podrían contribuir al fenotipo maligno de los LCT, se validaron por RTPCR en tiempo real los genes involucrados en la angiogénesis, en la
proliferación linfocitaria y en la replicación del ADN (DBP, VEGFB, IL4 y DOK2),
no sólo en las células de origen inmaduro, CUTLL1, sino también, en las células
de origen maduro HuT 78 y OCI-Ly12. Encontramos que las HT-AG
incrementaron los niveles transcripcionales de IL4, DBP, DOK2 y VEGFB en
todas las líneas celulares analizadas. Existen evidencias experimentales que
demuestran que la IL-4 es capaz de estimular la proliferación de células T
tumorales y podría participar de los efectos proliferativos de las HTs. Así, la
producción de IL-4 por células T CD4+ y CD8+ de pacientes con diferentes LCT
periféricos puede inducir in vitro la proliferación de células T malignas
(Raziuddin y col, 1998). También se ha demostrado que esta citoquina induce la
proliferación de células T de leucemia linfoblástica aguda, a través de la
regulación de la progresión del ciclo celular dependiente de mTOR (Cardoso y
col, 2009). Por su parte DOK2 es una proteína adaptadora, expresada
principalmente en tejidos hematopoyéticos, que actúa como sustrato común
para varias tirosina quinasas y que regula negativamente la señalización
intracelular de inmuno-receptores (Mashima y col, 2009). Más aún, DOK2 ha
sido involucrado en la regulación positiva de la migración celular por interactuar
con un amplio rango de proteínas de señalización, incluyendo la cola
citoplasmática de la integrina β3 (Calderwood y col, 2003), y se ha demostrado
su sobreexpresión en linfomas anaplásicos de células grandes (ALCL) (Lamant
y col, 2007). El DBP es un factor de transcripción involucrado en la regulación
de ciertos genes metabólicos, como el de la albúmina, el CYP2A4 y el CYP2A5
y se ha descripto su regulación positiva por la acción de la T3 en el proceso de
diferenciación de oligodendrocitos y de regeneración mielínica (Dugas y col,
2012). Con respecto a VEGF, cabe mencionar que su expresión ha sido
relacionada con la sobrevida y el pronóstico de pacientes con distintos subtipos
139
Discusión
de linfomas de células T (Jorgensen y col, 2009), lo que resalta la importancia
de este factor angiogénico en la progresión de esta patología y cuyo estudio
hemos profundizado tal como se detalla más adelante.
También demostramos que las HTs libres a través de su acción sobre la
integrina αVβ3 son capaces de inducir la expresión de los genes evaluados.
Esta inducción se vio inhibida cuando la expresión transcripcional de dicho
receptor es disminuida utilizando ARN de interferencia. Estos resultados
confirman que la acción de las hormonas sobre su mTR y su posterior
activación es responsable de la regulación observada en los genes de
proliferación y angiogénesis.
En trabajos anteriores publicados por nuestro grupo, se identificó al factor de
transcripción NF-κB, como un efector río abajo de la activación de un putativo
mTR en linfomas T murinos (Barreiro Arcos y col, 2011). En este trabajo se
observó que dicho factor de transcripción es activado y translocado al núcleo
de células de LCT humanas luego del tratamiento por tiempos cortos con HTs,
lo que concuerda con los resultados observados en las células de linfoma T
murinas. De hecho, del análisis realizado con herramientas bioinformáticas
surge una asociación entre los genes regulados por HT-AG y el factor de
transcripción NF-κB: estos genes presentan en sus regiones promotoras sitios
de unión a NF-κB. Más aún, cuando se preincuba a los distintos subtipos de
LCT con un inhibidor específico de este factor de transcripción, la inducción de
los genes IL-4 y VEGF mediada por HTs se vio inhibida. Este resultado
sustenta aún más la implicancia de NF-κB en la regulación transcripcional
mediada por HTs de IL4 y VEGF.
NF-κB regula la expresión de genes involucrados en muchos procesos que
juegan un rol central en el desarrollo y progresión de las neoplasias, como la
proliferación, la migración y la apoptosis (Dolcet y col, 2005). Se ha encontrado
expresado y activado constitutivamente de forma aberrante en distintos tipos de
cáncer, entre los que podemos mencionar el cáncer de mama (Khan y col,
2013), linfomas de Hodgkin (Carbona y col, 2011) y linfomas cutáneos de
140
Discusión
células T (Thakur y col, 1994, Döbbeling, 2007). También se ha vinculado su
sobre activación con el desarrollo de distintos tipos de linfomas de células T en
ratones transgénicos Notch-/- (Bellavia y col, 2000). Más aún la expresión y
activación de este factor de transcripción ha sido relacionada de manera directa
con la expresión de VEGF y la angiogénesis. Así por ejemplo, en células de
glioma se ha descripto que el bloqueo de la señalización de NF-κB disminuye
el crecimiento tumoral in vivo acompañado por la disminución de factores
angiogénicos como el VEGF (Xie y col, 2010). Resultados similares han sido
descriptos en células de cáncer de próstata (Huang y col, 2001) ¿Podrían
también estos mecanismos estar involucrados en la patobiología de los LCT?
De acuerdo a nuestros datos, la activación de NF-κB induciría la expresión de
VEGF y precisamente el elemento desencadenante de estas vías serían las
HTs presentes en el microambiente tumoral al menos en concentraciones
semejantes a sus niveles plasmáticos. Es por ello que cabe preguntarse si es a
través de estos mecanismos de acción que las HTs contribuyen al fenotipo
maligno de los LCT. Nuestros resultados parecerían indicarlo. Por este motivo
se profundizó el estudio de la participación del VEGF en las acciones de las
HTs.
5.3 Inducción de la expresión mediada por HTs de factores
angiogénicos funcionales.
El factor de crecimiento del endotelio vascular, VEGF, está involucrado en la
regulación de la angiogénesis y su expresión podría contribuir al fenotipo
maligno de los LCT. De hecho, existen trabajos donde asocian la expresión de
VEGF y la angiogénesis, con la sobrevida y el pronóstico de pacientes con
PTCL-NOS y AITL (Konstantinou y col; 2009, Jorgensen y col, 2009;
Konstantinou y col, 2011; Geskin y col, 2014). VEGFB es miembro de una gran
familia de factores de crecimiento del endotelio vascular que incluye también a
VEGFA, VEGFC, VEGFD y PLGF (Goel y col, 2013). Por análisis de
microarreglos de ARN, se analizó la expresión transcripcional de los miembros
de la familia de VEGF en una serie de muestras provenientes de pacientes con
distintos subtipos de linfomas T. Además de VEGFB, el único miembro que
141
Discusión
también se encuentra expresado en estas muestras es VEGFA. Más aún, el
tratamiento de las líneas celulares de los distintos subtipos de LCT con HT-AG
indujo la expresión transcripcional de ambos factores en la mayoría de las
mismas; efecto que se vio inhibido en las células cuyo mTR fue regulado
negativamente. Precisamente este es el hallazgo más importante de nuestros
estudios, ya que señala a la integrina αvβ3 como un potencial blanco
terapéutico.
Está reportado que las células T malignas producen VEGF y expresan sus
receptores; sustentando la idea de la existencia de vías autócrinas y parácrinas
mediadas por VEGF en la linfomagénesis. Estudios realizados en muestras
provenientes de pacientes con linfoma T angioinmunoblástico (AILT), muestran
un aumento en la expresión de VEGF tanto en las células de linfoma como en
las células endoteliales (Zhao y col, 2004; Piccaluga y col, 2007). El grupo de
Zhang y col, en el año 2001, encontró que la expresión de VEGF está
íntimamente relacionada con el estadio tumoral, la invasión de la médula ósea
y el pronóstico en muestras de pacientes con PTCL-NOS. En estos estudios se
sugiere que VEGF podría estar involucrado en la tumorigénesis, la progresión,
la invasión y la angiogénesis en esta patología. Resultados similares fueron
descriptos en pacientes con otros subtipos de LCT, y en todos los casos se
encontró una correlación entre la expresión de VEGF, la sobrevida y el
pronóstico de la enfermedad (Konstantinou y col, 2009; Jorgensen y col, 2009;
Geskin y col, 2014). Más aún, la relación entre la expresión de la integrina αvβ3
y del VEGF y la promoción tumoral y crecimiento metastásico fue descripta en
otros tipos de neoplasias (Lorger y col, 2009; Chetty y col, 2010; Zhao y col,
2014)
Para evaluar la relación entre la integrina αVβ3 y el VEGF descripta en otras
neoplasias y que nosotros observamos en las líneas de LCT, analizamos la
expresión transcripcional de las integrinas en las muestras primarias de
pacientes de LCT y estudiamos su posible asociación con los niveles de VEGF.
Encontramos una correlación positiva entre los niveles de VEGFA/B y los de
ITGAV e ITGB3 en todos los subtipos analizados, lo que reforzaría la existencia
142
Discusión
de una asociación funcional entre los mismos en la patología humana. Es de
destacar, que la inducción de la expresión de VEGFA y VEGFB parecería ser
exclusiva de la acción de las HTs sobre la integrina, ya que no se observó este
efecto cuando se trata a las células con el ligando natural de dicha integrina, la
VN. Si bien la VN podría contribuir a la proliferación de las células LCT a través
de la integrina, este efecto se daría por la activación de programas genéticos
diferenciales a los inducidos por HTs. Como ya hemos referido, las células de
LCT pueden encontrarse en un microambiente “enriquecido” en HTs por
inactivación epigenética del gen DIO3. Se podría pensar entonces que este
mecanismo prioriza la acción de las HTs por encima de la ejercida por la VN.
Sin embargo el análisis de transcriptos de nuestro panel de muestras primarias
de LCT mostró niveles indetectables de DIO3 y DIO2 y bajos niveles de DIO1
(datos no mostrados). A pesar de esto, usando niveles fisiológicos de T3 y T4
hemos demostrado que las HTs son factores necesarios para el crecimiento de
los LCT.
Se ha descripto que la VN vía la integrina αvβ3 es capaz de activar al factor de
transcripción NF-κB en células de melanoma y de cáncer de páncreas (Yebra y
col, 1995; Das y col, 2005). Sin embargo, la relación entre dicha molécula de la
ECM y la expresión de VEGF ha sido muy poco estudiada. Recientemente se
describió que la acción de la VN jugaría un rol en la inducción de la
angiogénesis a través de la activación del receptor del VEGF en células
endoteliales. Más aún, se ha demostrado que la estimulación de células
endoteliales con VEGF resulta en la formación de un complejo entre VEGFR-2 y
la integrina αvβ3 (Serini y col, 2008 a y b); la consecuencia funcional de esta
interacción es el aumento de la actividad de dicha integrina (Payaningal y col,
2009). Esto sugiere que las HTs y la VN podrían estar ejerciendo una función
complementaria que favorecería la angiogénesis.
El crecimiento y progresión de los linfomas está potenciado por, al menos, dos
mecanismos
angiogénicos
distintivos:
(i)
influencias
parácrinas
del
microambiente tumoral pro-angiogénico sobre la transformación neovascular
local y el reclutamiento de progenitores derivados de médula ósea circulantes;
y por (ii) la estimulación autócrina de las células tumorales a través de la
143
Discusión
expresión de VEGF y VEGFR en las células de linfoma (Ruan y col, 2009). La
expresión de VEGF en células neoplásicas fue demostrada en un amplio rango
de subtipos de linfomas agresivos, entre los que se incluyen linfomas T
periféricos, linfomas difusos de células B grandes, linfoma de células del manto
(Foss y col, 1997; Doussis-Anagnostopoulou y col, 2002), como también en
leucemias linfocíticas crónicas y linfomas linfocíticos (Chen y col, 2000; Kay y
col, 2002). En células de linfoma, el factor VEGF y sus receptores fueron
involucrados tanto en mecanismos autócrinos como parácrinos (DoussisAnagnostopoulou y col, 2002; Wang y col, 2004). La señalización de VEGF a
través de sus receptores confiere resistencia a la apoptosis y promueve la
sobrevida de leucemias linfocíticas crónicas, pero este efecto es revertido con
inhibidores de tirosina quinasas que impiden la activación del VEGFR (Lee y
col, 2004; Ruan y col, 2009; Pedersen y col, 2013).
En este sentido, se realizaron estudios para analizar si existen consecuencias
parácrinas y autócrinas funcionales de la expresión de VEGF inducida por las
HTs a través de la integrina αvβ3 en las células LCT. La evaluación de la
capacidad
de
inducción
de
la
respuesta
quimiotáctica
con
medios
condicionados de LCT mostró que un mayor número de células endoteliales
migran
cuando
éstas
son
cultivadas
con
los
medios
condicionados
provenientes de células tratadas con las HT-AG. Estos resultados se
observaron tanto cuando se utilizaron líneas celulares de LCT de origen
inmaduro como de origen maduro. Más aún, cuando los medios condicionados
son pre-incubados con un anticuerpo anti-VEGF, Bevacizumab, o provienen de
líneas de LCT que no expresan la integrina αVβ3, la inducción de la migración
de las células endoteliales se vio inhibida.
Con respecto a los efectos autócrinos de VEGF, se encontró que tanto el
anticuerpo bloqueante para VEGF como un inhibidor farmacológico de su
receptor, el Axitinib, disminuyen el efecto proliferativo de las HTs sobre las
células de LCT. Más aún, la adición de VEGF humano recombinante también
fue capaz de inducir la proliferación de las líneas de LCT.
144
Discusión
Estos resultados refuerzan el importante rol que juega el VEGF en el fenotipo
maligno de los LCT. De hecho, se ha descripto que el Bevacizumab tiene
efectos anti-linfoma y anti-angiogénicos que potencian la acción de drogas
quimioterapéuticas sobre linfomas/leucemias de células T (Wang y col, 2011;
Mori y col, 2014)
5.4 Modelos in vivo de LCT y efecto de la inhibición de la integrina
αVβ3 sobre su crecimiento
Uno de los desafíos más importantes en el estudio de los linfomas de células T
es la rápida traslación a la clínica de los conocimientos que se van obteniendo
sobre la biología molecular y genética de los mismos. Como se mencionó
anteriormente, los pacientes que padecen distintos subtipos de linfomas T,
salvo escasas excepciones, tienen mal pronóstico debido a la combinación de
un curso clínico muy agresivo y la falta de tratamientos específicos. Es por ello,
que es tan importante profundizar el estudio de esta patología, de manera de
poder desarrollar nuevos regímenes terapéuticos con mayor especificidad y
efectividad.
Como último objetivo, se propuso determinar si la inhibición de la vía regulada
por las HTs a través de su receptor de membrana, la integrina αVβ3, puede ser
capitalizada terapéuticamente para el tratamiento de pacientes con LCT. En los
últimos años se ha logrado un gran progreso en el estudio, tanto a nivel preclínico como clínico, del bloqueo de las integrinas en patologías oncológicas.
Estos estudios muestran cierta efectividad de los inhibidores de distintas
integrinas para tratar de frenar la progresión tumoral de algunos tipos de cáncer
(Desgrosellier et al, 2010).
En primer lugar, se evaluó el efecto de la regulación negativa de la
transcripción de las integrinas αV o β3, utilizando ARN de silenciamiento, sobre
el crecimiento tumoral de células CUTLL1 en ratones inmunodeficientes NODSCID. Se observó en comparación a los tumores control, una reducción del
volumen tumoral, de la expresión de VEGF y del área de los vasos sanguíneos.
145
Discusión
También se observó un aumento del marcador de apoptosis caspasa 3 activa,
sugiriendo una asociación entre la inducción de la apoptosis y la disminución
del volumen tumoral. Estos datos sugieren que existiría una disminución en el
potencial angiogénico en los tumores que provienen de las células CUTLL1 que
no expresan tanto la integrina αV como la β3.
Como enfoque terapéutico y para un análisis más exhaustivo del efecto de la
inhibición de la integrina αVβ3 sobre el crecimiento tumoral in vivo de los LCT,
se evaluó el efecto del inhibidor farmacológico cilengitide, que muestra
actividad anti-angiogénica. Esta droga se encuentra en estudios de fase clínica
III en glioblastomas y en estudios de fase II en otros tipos de tumores sólidos
(Friess y col, 2006; Reardon y col, 2008; Nabors y col, 2009; Tabatabai y col,
2010). Como ya se mencionó, la alta expresión de VEGF está asociada a una
mala respuesta a drogas quimoterapéuticas convencionales en pacientes con
PTCL-NOS (Jorgensen y col, 2007, 2009). Es por esto que se desarrolló un
modelo de xenotrasplante de células de PTCL-NOS, OCI -Ly12, para evaluar el
efecto del cilengitide sobre su crecimiento in vivo. Se encontró que el
tratamiento diario con el inhibidor redujo significativamente el crecimiento
tumoral. El efecto inhibitorio del cilengitide, fue asociado a una disminución de
la activación de la vía de señalización de NF-κB y al aumento de la apoptosis
celular. Se ha descripto que el cilengitide induce la apoptosis celular en
distintos modelos experimentales; en xenotrasplantes de células de cáncer de
mama, por ejemplo, tiene una acción sinérgica con la radioterapia a través de
la inducción de la apoptosis (Burke y col, 2002); resultados similares se
observaron en células de glioblastoma (Oliveira-Ferrer y col, 2008)
El receptor de membrana para HTs constituye un blanco terapéutico atractivo
para utilizar como tratamiento anti-linfoma. Para determinar si el impacto de la
estrategia terapéutica descripta podría tener una traslación a la clínica, se
evaluó el efecto del cilengitide en un modelo pre-clínico utilizando tumores
derivados de pacientes ALCL xenotrasplantados en ratones humanizados. El
tratamiento diario con el inhibidor durante 10 días, indujo una disminución del
crecimiento tumoral, sin toxicidad asociada al tratamiento, posicionando al
146
Discusión
cilengitide como potencial herramienta terapéutica para el tratamiento de los
LCT humanos.
Figura 5.1 Mecanismo activados por las HTs vía la integrinaαVβ3 en la
células de linfomas T humanos
´
Finalmente podemos concluir que los resultados más salientes de este
trabajo señalan a las HTs como componentes reguladores fundamentales
de la patobiología de los LCT. A través de la activación del mTR, la
integrina αVβ3, las HTs estimulan vías de señalización relacionadas con la
proliferación y sobrevida en los distintos subtipos de LCT. Como
consecuencia de dichas vías, que incluyen a ERK 1/2 y al NF-κB, tiene
lugar la activación transcripcional de genes como el de VEGF y la
producción de dicho factor vascular, favoreciendo en última instancia el
crecimiento tumoral y la vascularización (ver Figura 7.1). Más aún, el
bloqueo farmacológico selectivo de la integrina αVβ3, resulta en la
inhibición de la proliferación y del crecimiento tumoral in vivo de distintos
subtipos de LCT. Estos resultados constituyen un marco teórico para la
utilización de la integrina αVβ 3 como posible blanco terapéutico para el
tratamiento
de
pacientes
con
linfomas
de
células
T.
147
6. CONCLUSIONES
Conclusiones
En este trabajo de Tesis pudimos demostrar que las HTs, en concentraciones
fisiológicas y a través de la integrina αVβ3, inducen la angiogénesis y la
proliferación de células de LCT inmaduras y maduras. Demostramos que la
integrina αVβ3 es el receptor de membrana para las HTs en células de LCT y
caracterizamos el programa transcripcional activado por las HTs vía dicho
receptor. Este programa está ligado a la inducción de genes de proliferación
celular y angiogénesis, tales como el VEGF. Más aún, hemos encontrado que
la inhibición de la integrina αVβ3 reduce la proliferación de células de linfoma T
en modelos pre-clínicos de LCT incluyendo xenotrasplantes de tumores ALCL
derivados de pacientes. Los estudios que nos han permitido demostrar lo
antedicho incluyen experimentos realizados tanto in vitro como in vivo.
Primeramente hemos visto el efecto del tratamiento con HTs sobre 9 líneas
celulares representativas de los distintos subtipos de linfomas de células T
humanos. En base a los resultados obtenidos in vitro podemos concluir
que:
1- Las HTs inducen la proliferación celular de distintos subtipos de LCT:
El tratamiento in vitro con concentraciones fisiológicas de T3 y T4 aumenta
la proliferación celular, la expresión de marcadores proliferativos, como PCNA,
y la síntesis de ADN en los distintos subtipos de LCT.
El tratamiento con HT-AG tiene casi el mismo efecto sobre la proliferación
de los LCT que las HTs libres, sugiriendo que los efectos proliferativos
mediados por HTs se dan también a través de su receptor de membrana.
El aumento de la proliferación mediada por HTs está asociado a la
inducción de la expresión de marcadores del ciclo celular como las ciclinas D1,
D2, D3, E2 y B1; y a la disminución de la expresión del inhibidor de ciclinas,
p21 y del supresor tumoral, p53.
2- La integrina αVβ 3 es receptor de membrana para HTs en LCT:
149
Conclusiones
Las líneas celulares de LCT expresan mayores niveles transcripcionales
de THRA, ITGAV e ITGB3 en comparación a los linfocitos T periféricos,
sugiriendo una mayor respuesta de las células T malignas a los efectos de las
HTs.
El efecto proliferativo mediado por las HTs en células de LCT es inhibido
cuando se pre-incuba con un péptido bloqueante RGD, lo que sugiere que el
mTR en células de LCT es una integrina con sitio de unión para ligandos con
dicho motivo RGD.
Esto fue confirmado por la inhibición de los efectos proliferativos de las
HTs mediante técnicas de ARN de silenciamiento e inhibidores farmacológicos
selectivos para la integrina αVβ3, lo que señaló a dicha integrina como el mTR
en células de LCT.
La unión del ligando biólogico de ECM, la vitronectina (VN), a la integrina
αVβ3, no disminuye el efecto de la proliferación de HT. En cultivos, la VN es
capaz de inducir la proliferación de los LCT, pero en menor proporción que las
HTs y algo similar ocurre en un cultivo 3D por activación simultánea con
ligandos que contienen RGD y HTs, en los que el inhibidor de la integrina, el
Cilengitide impide estos efectos. Esto indicaría que las acciones sobre la
proliferación mediadas por las HTs se dan de manera independiente a las
acciones de los otros componentes del microambiente tumoral.
3- Las HTs regulan, a través del mTR, programas transcripcionales
vinculados a proliferación y angiogénesis
Los programas genéticos mayormente regulados por HT-AG a través de la
activación de la integrina αvβ3, en las células CUTLL1, involucran la expresión
de genes relacionados con la “transducción” (RPL13, RPL27A, RPL36), con la
“cadena respiratoria oxidativa” (NUDFB1/2, NDUFA13, UQCR11), con la
“angiogénesis” (VEGFB) y con la proliferación/diferenciación de linfocitos y
replicación del ADN (IL4, EDF1, DOK2).
150
Conclusiones
La inducción de los genes VEGFB, IL4, DOK2 y DBP fue validada en
estas células y también en líneas celulares de LCT de origen maduro. Dada la
función de estos genes, puede sugerirse que los mismos pueden contribuir al
fenotipo maligno de los linfomas de células T.
El NF-κB está involucrado en las acciones de las HTs a través de su
receptor de membrana, ya que las HTs inducen la translocación de este factor
de transcripción al núcleo celular y el inhibidor irreversible de su activación
disminuye significativamente la regulación positiva de los genes de IL-4,
VEGFA y VEGFB mediada por HTs.
4- Existe una asociación entre la expresión de la integrina αvβ3 y la
expresión de VEGF en muestras de pacientes con LCT
El análisis de la expresión transcripcional demostró la presencia tanto de
las integrinas αV y β3 como de VEGFA y VEGFB en muestras de pacientes
con distintos subtipos LCT. Encontramos que los niveles de expresión de la
integrina αV y β3 correlacionan positivamente con los de VEGF, sugiriendo una
asociación entre la activación de la integrina αvβ3 y la expresión de VEGFA y
VEGFB en el panel de muestras primarias de pacientes estudiados.
5- Las HTs inducen la expresión de factores angiogénicos funcionales
que actúan de forma parácrina y autócrina
La expresión transcripcional de los factores de crecimiento del endotelio
vascular VEGFA y VEGFB, aumenta luego del tratamiento con HT-AG en las
líneas celulares de distintos subtipos de LCT.
Esta inducción es mediada por la integrina αVβ3, ya el efecto inductor de las
HTs es inhibido cuando los ensayos se realizan sobre líneas celulares en las
que se silenció la expresión del mTR.
151
Conclusiones
Los medios condicionados provenientes de líneas LCT inmaduras y
maduras tratadas con HT-AG, son capaces de inducir un incremento de la
migración in vitro de células endoteliales HMEC1. Ese efecto es mediado por
VEGF ya que la pre-incubación de dichos medios condicionados con un
anticuerpo anti-VEGF, inhibe la inducción de la migración de las células
endoteliales, sugiriendo la presencia de VEGF en los mismos.
La expresión de VEGF mediada por HTs tiene un rol autócrino sobre los
LCT ya que la inducción de la proliferación mediada por HTs se ve inhibida por
la acción del anticuerpo bloqueante para VEGF, Bevacizumab y del inhibidor
farmacológico del receptor de VEGF, Axitinib.
Por otra parte se realizaron xenotrasplantes de células humanas de LCT en
ratones inmunodeficientes y se evaluó el efecto de la inhibición de la integrina
αvβ3 sobre el crecimiento tumoral. De los resultados de estos estudios in
vivo podemos concluir que:
La regulación negativa de la integrina αV o β3 por ARN de interferencia en
células CUTLL1, reduce el volumen tumoral, disminuye la expresión de VEGF y
el área de los vasos sanguíneos; sugiriendo una disminución en el potencial
angiogénico de los tumores que provienen de las células CUTLL1 que no
expresan el mTR.
El tratamiento diario con el inhibidor farmacológico de la integrina, el
cilengitide, redujo significativamente el crecimiento tumoral in vivo de las
células OCI-Ly12 de origen PTCL-NOS. El efecto inhibitorio del cilengitide, fue
asociado con la disminución de la activación de la vía de señalización de NF-
κB y con el aumento de la apoptosis celular.
El tratamiento diario durante 10 días con cilengitide indujo una disminución
en el crecimiento de tumores derivados de pacientes ALCL-ALK- y ALCL-ALK+,
sin toxicidad asociada al tratamiento.
152
Conclusiones
Los resultados obtenidos en este trabajo indican que las hormonas tiroideas
regulan vías de señalización relacionadas con la proliferación y sobrevida de
los distintos subtipos de linfomas de células T. Estos efectos mediados por HTs
se dan por la acción de las mismas sobre la integrina αVβ3, la cual da como
resultado la activación transcripcional de genes como el VEGF, favoreciendo
en última instancia el crecimiento tumoral y la vascularización. Más aún, la
inhibición selectiva de la integrina αVβ3, resulta en la inhibición de la
proliferación y el crecimiento tumoral in vivo de distintos subtipos LCT (Figura
6.1).
Todos los resultados obtenidos en este trabajo y mencionados anteriormente,
sugieren que el receptor de membrana para HTs, la integrina αVβ3, constituye
un blanco terapéutico atractivo para la terapia de esta patología.
Figura 6.1: Esquema representativo de la acción de las HTs a través de su
receptor de membrana en células de linfoma T
T3 T4
αv β3
NFkB
Células LCT
Proliferación
VEGF
Angiogénesis
153
7. ABREVIATURAS
Abreviaturas
ADN, Ácido desoxiribonucleico
histona desacetilasa
AITL, linfoma de células T
HIF1, factor de transcripción inducible
angioinmunoblástico
por hipoxia 1
AKR1C1–3, aldo-keto-reductasas 1-3
HPT, hipotálamo-pituitario-tiroideo
ALCL, linfoma de células grandes
IFN, interferón
anaplásico
IL, interleuquinas
ALK, Kinasa del linfoma anaplástico
IP, ioduro de propidio
Ang, angiopoyetinas
LCT, linfomas de células T
ARN, Ácido ribonulceico
LH, linfomas Hodking
ARNm, Ácido ribonulceico
LNH, linfomas Non-Hodking
mensajero
MAPK, proteína quinasa activada
ARNasa, Ribonucleasa
por mitógeno
ARs, Receptores adrenérgicos
MCL, linfoma de células del manto
bFGF, factor de crecimiento de
MF, micosis Fungoide el
fibroblastos básico
MMPs, metaloproteasas de matriz
cADN, Ácido desoxiribonucleico
mTR, Receptor de membrana de
complementario
hormonas tiroideas
Cdk, quinasa dependiente de ciclinas
NIS, proteína transportadora de yodo
CdkI, inhibidor de quinasas
OMS, Organización mundial de la
dependientes de ciclinas
Salud
CR, respuesta completa
PCNA, antígeno nuclear de
CTCL, Linfomas Cutáneos de
proliferación celular
células T
PDGF, factor de crecimiento derivado
DBD, dominio de unión a DNA
de plaquetas
DIO, deiodinasa
PI3K, fosfoinositol 3-quinasa
DLBCL, linfomas difusos de células B
PIGF, factor de crecimiento placentario
grandes
PTCL, linfoma de células T periféricas
DMV, densidad micovascular
PTCL-NOS, linfoma células T
ECM, matriz extracelular
periféricas
ERK1/2, quinasa reguladora de
de otro modo no especificado
señales extracelulares ½
PTEN,fosfatasa del fosfatidilinositol
FGF, factor de crecimiento de
(3, 4, 5)-trifosfato
fibroblastos
Rb, proteína del retinoblastoma
FT4, tiroxina libre
RGD, péptido
FT3, 3,3′-5 triyodotironina libre
Arginina- Glicina- Aspartato
HDAC, proteínas con actividad
RIA, radioinmunoensayo
155
Abreviaturas
RXR, receptor de rexinoides
TR, Receptor nuclear de
S1, Sitio de unión 1
hormonas tiroideas
S2, Sitio de unión 2
TREs, elementos de respuesta
SFB, suero fetal bovino
a hormonas tiroideas
SS, síndrome de Sézary
TRH, hormona hipotalámica
T3, 3,3′-5 triyodotironina
liberadora de tirotropina
T3r, 3,3′-5 triyodotironina
TSH, hormona hipofisaria
reversa
estimulante del tiroides
T4, tiroxina
TPO, peroxidasa tiroidea
Tetrac, ácido tetraiodotiroacético
TTR, transtiretina
Tg, tiroglobulina
VEGF, factor de crecimiento
TBG, globulina transportadora
endotelial vascular
de hormonas tiroideas
VEGFR, Receptor del factor de
TNF, factor de necrosis tumoral
crecimiento endotelial vascular
156
8. BIBLIOGRAFÍA
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