XIII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular

XIII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular
XIII Biomedicine and Molecular Biotechnology Scientific Meetings
ANÁLISIS DE LA REGIÓN PROMOTORA DEL OPERÓN
rrn DE Mycobacterium kumamotonense
AUTORES: Méndez Guerrero, Oscar; Rivera Gutiérrez,Sandra; González y Merchand Jorge A.
DIRECCIÓN: Laboratorio de Microbiología Molecular, Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas, Prol. Carpio y Plan de Ayala s/n. México D.F. 11340
Email: [email protected]
INTRODUCCIÓN
Todas las micobacterias poseen uno o dos operones para el rRNA, denominados rrnA y rrnB. M.
tuberculosis, la típica micobacteria de crecimiento lento, tiene un solo operón rrn por genoma,
denominado rrnAs (s, del inglés “slow”). Este operón está regulado por dos promotores adyacentes
conocidos como P1 y PCL1. M. smegmatis, la especie típica de crecimiento rápido, tiene dos
operones del rRNA, denominados rrnAf y rrnBf (f, del inglés “fast”); el primero de ellos tiene tres
promotores, y el segundo tiene uno. Los “kits” comerciales disponibles actualmente para el
diagnóstico rápido de tuberculosis, los cuales están basados en la hibridación de sondas de DNA
en la región del operón rrn, presentan reacción cruzada con M. kumamotonense, lo cual tiene
repercusiones en el diagnóstico y tratamiento de los pacientes con micobacteriosis causada por
este patógeno emergente.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó la confirmación de la identidad de la cepa tipo de M. kumamotonense CST7247
mediante la técnica PRA-hsp65. Posteriormente, se construyó la curva de crecimiento a fin de
determinar las fases logarítmica y estacionaría. A partir de los cultivos en fase logarítmica, se
realizó la extracción del RNA total. A partir de los cultivos en fase estacionaria, se llevó a cabo la
extracción del DNA genómico para poder determinar el número de copias del operón del rRNA por
hibridación tipo Southern y, posteriormente, la amplificación y secuenciación de la región de
promotores del operón rrnA de M. kumamotonenese. Finalmente, se realizó la clonación de la
región de promotores en el vector pTZ57R/T
RESULTADOS
La fase logarítmica inició a los 1.5 días de cultivo, extendiéndose hasta los 5 días, momento en el
cual se alcanzó la fase estacionaria. El DNA genómico de M. kumamotonense se digirió con las
enzimas BamHI y PstI y se hibridó con una sonda que contenía el gen rrs de M. tuberculosis. Para
M. kumamotonense se observaron dos bandas de hibridación, lo que indica la presencia de dos
operones para su rRNA. Se amplificó la región de promotores del operón rrnA de M.
kumamotonense, empleando los iniciadores RA1/RAC8; el producto obtenido fue de
aproximadamente 900 pb. Al comparar la secuencia de la región de promotores de M.
kumamotonense y M. tuberculosis se identificaron los dos motivos CL1 y CL2 típicos de las
micobacterias. Además, se identificaron ciertas secuencias consenso que pudieran identificar a los
promotores PCL1 y P1 de M. kumamotonense. Después de clonar a la región de promotores, se
comprobó la presencia de un inserto de 950 pb en el plásmido recombinante pMkmA. La calidad de
las muestras de RNA de cada una de las fases de estudio, fue adecuada dado que se observaron
las bandas correspondientes al rRNA 23S y al RNA 16S
CONCLUSIONES
1. M. kumamotonense alcanza la fase logarítmica de crecimiento a los 1.5 días de cultivo y la fase
estacionaria a los 5 días. 2. M. kumamotonense presenta dos copias del operón del rRNA en su
genoma. 3. Se identificaron los dos motivos CL1 y CL2 típicos de las micobacterias. 4. Se
construyó el plásmido recombinante pMkmA, el cual contiene la región de promotores del operón
rrnA de M. kumamotonense.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Rodríguez-Aranda A., Jiménez M.S., Yubero. (2010) Misindentification of Mycobacterium
kumamotonense as M. tuberculosis. Emerging Infectious Diseases. 16: 1178-1180.
Unidad Profesional Lázaro Cárdenas, Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n, Col. Santo Tomas C.P. 11340
Delegación Miguel Hidalgo México, D.F. | http://www.encb.ipn.mx/ | http://biomedbiotec.encb.ipn.mx/jornadas2015/