COLECCIÓN, CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y

COLECCIÓN, CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y
MOLECULAR DE POBLACIONES DE UCHUVA
Physallis peruviana
COLLECTION, PHENOTYPIC AND MOLECULAR CHARACTERIZATION
OF UCHUVA Physallis peruviana POPULATIONS
KATHERINE ESPINOSA1, MARTHA LILIANA BONILLA1, JAIME EDUARDO MUÑOZ 2,
ANDRÉS MAURICIO POSSO4, HERNEY DARÍO VÁSQUEZ3
PALABRAS CLAVE:
RESUMEN
Physalis peruviana L. , diversidad
genética, RAMS, caracterización
morfológica.
Physalis peruviana L. se destaca
en la exportación de frutas colombianas ocupando el segundo lugar
después del banano. Este estudio
de diversidad genética y caracterización morfológica de poblaciones
de uchuva comprendió tres etapas:
una colección de 222 introducciones en sitios entre los 1800 y 3200
m.s.n.m., pertenecientes a los departamentos de Nariño, Valle del
Cauca, Cauca, Caldas y Cundinamarca. La segunda fué la caracterización morfológica de 24 introducciones de la colección analizando
10 variables cualitativas y 17 cuantitativas mediante análisis
multivariados de correspondencia
múltiple y componentes principales respectivamente; se realizó
también la evaluación de algunas
variables de interés a nivel de fruto
como: peso, tamaño, número de
semillas y contenido de sólidos
KEY WORDS:
Physalis peruvian L, genetic
diversity, RAMS, morphological
characterization.
____________
Recibido para evaluación: Diciembre 1 de 2003. Aprobado para publicación: 27 de febrero de 2004.
1
2
4
3
Tesis de pregrado. Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.
Profesor Asociado Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.
Laboratorio de Biología Molecular. Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.
Ing. Agr. MSc. Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.
Correspondencia: Jaime Eduardo Muñoz, e_mail: [email protected]
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solubles en 65 introducciones de la colección para generar ecuaciones de regresión con alta capacidad de predicción del peso del fruto con base en el producto de los diámetros y la identificación de los materiales con potencialidades para el procesamiento, mercado y programas de mejoramiento. La tercera corresponde al análisis de la
diversidad genética en 43 introducciones utilizando la técnica molecular RAMS (Random Amplified Microsatellites);
este análisis se realizó sobre 42 loci polimórficos obtenidos con 7 cebadores, encontrándose baja diversidad para
las introducciones de Nariño, Cauca, Caldas y Cundina-marca, excepto para la población del Valle del Cauca en la
cual se encuentra reunida la mayor diversidad.
ABSTRACT
Physalis peruvian L. stands out in Colombian fruits exportation in a second place before the banana. This genetic
diversity study and morphological characterization of uchuva population comprised three stages: a collection of 222
introductions in sites between 1800 and 3200 m.s.n.m., from the departments of Nariño, Valle del Cauca, Cauca ,
Caldas and Cundinamarca. The second one was the morphological characterization of 24 introductions of the
collection analyzing 10 qualitative and 17 quantitative variables by means of a multivariate multiple correspondence
analysis and main components respectively; the evaluation of some variables of interest at fruit level such as weigh,
size, seed number and soluble solid content in 65 introductions of the collection in order to produce some regression
equations with a high prediction capacity of the fruit weight based on the diameter product and materials identification
with potential for the processing, market and improvement programs. The third stage corresponded to a genetic
diversity analysis in 43 introductions using the molecular technique RAMS ( random, amplified, microsatellites); this
analysis was accomplished over 42 locipolimorphics obtained with 7 cebadores, finding a low diversity for the
Nariño, Cauca, Caldas and Cundinamarca introductions , except for Valle del Cauca population in which the major
diversity is assembled.
INTRODUCCION
Muchas de las especies cultivadas durante uno o más
períodos de tiempo, fueron representadas por solo un
limitado número de plantas, tal “cuello de botella”
genético podría limitar la diversidad genética de actuales especies cultivadas. Por el contrario, especies silvestres y subespecies tienen frecuentemente una amplia diversidad genética.
El género Physalis per tenece a la familia de las
Solanáceas, incluye aproximadamente 100 especies
entre hierbas perennes y anuales, se caracterizan porque sus frutos están encerrados dentro de un cáliz.
Physalis peruviana L. es la especie más conocida de
este género, es originaria de los Andes suramericanos
y se caracteriza por tener un fruto azucarado y buenos
contenidos de vitamina A y C, además de hierro y fósforo. (Fischer, et al., 2000). (1)
La uchuva es hoy la fruta más importante en términos
de exportaciones para Colombia, excluyendo banano
y plátano. En el año 2000 las exportaciones de frutas
colombianas sin banano alcanzaron los 61 millones
de dólares, de los cuales 44 millones correspondieron
a plátano y los otros 17 millones al resto de frutas. De
estos 17 millones de dólares el 45% correspondieron a
exportaciones de uchuva. (Observatorio Agrocadenas
2002). (2)
Este proyecto que tiene como objetivo iniciar un estudio de diversidad genética realizando una colecta en
algunas zonas de los Departamentos del Valle, Cauca,
Nariño y Caldas, estos materiales son el punto de partida para el establecimiento de una colección de trabajo
inicialmente regional. El estudio será ampliado con una
caracterización morfológica y molecular de algunas introducciones colectadas, utilizando microsatélites RAMS
(Random Amplified Microsatellite), una técnica molecular
que no requiere isótopos radioactivos y que es accesible, reproducible, cubre todo el genoma y permite diferenciar poblaciones.
MATERIALES Y METODOS
La primera etapa correspondió a la colecta de los materiales en sitios ubicados entre los 1800 – 3200 m.s.n.m.,
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abarcando los departamentos del Valle del Cauca, Cauca,
Caldas y Nariño; éstas zonas fueron definidas teniendo
en cuenta los sitios de distribución de la especie, basadas en sus condiciones ambientales y geográficas, vías
de acceso y ambiente sociopolítico que permiten buscar
y recolectar la mayor variabilidad genética de la especie
cultivada y silvestre. Los datos de altura sobre el nivel del
mar, latitud y longitud se tomaron con un geoposicionador
GPS II plus Garmin Corporationâ 1998, con el fin de establecer el sitio exacto de colección de la muestra. Todas
las introducciones fueron registradas con los datos del
pasaporte establecidos por el IPGRI. Con la información
obtenida se desarrolló una base de datos computarizada
utilizando el programa Acrview versión 3.1â. Los materiales colectados y adquiridos por donación se almacenaron en el cuarto frío del Centro Experimental de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira (CEUNP)
ubicado en la vía Candelaria-Cali a una altura de 1000
m.s.n.m. Las condiciones del cuarto frío son de 12-15
ºC y una humedad relativa del 30-40%. Los ejemplares
de los materiales colectados fueron llevados al herbario
José Cuatrecasas Arumi de la Universidad Nacional de
Colombia Sede Palmira. Para la identificación se contó
con la asesoría del Ingeniero Forestal Eugenio Escobar.
Inicialmente se compararon los materiales colectados con
los ejemplares que se tienen en el herbario; con la ayuda
del estereoscopio se observaron las estructuras florales
(anteras, corola); los tricomas de las hojas, las nervaduras, y las semillas, importantes para el uso de las claves
botánicas de las diferentes especies que corresponden
al género Physalis.
La segunda etapa comprendió la caracterización
morfológica y evaluación de algunas introducciones
colectadas, la cual se realizó en el Municipio de Ginebra
Valle, vereda La Cecilia ubicada a una altura de 2100
m.s.n.m., con una temperatura promedio anual de 18
ºC. Se procedió inicialmente a determinar el estado de
madurez de los frutos, comparándolos con los 6 grados de madurez establecidos por la norma ICONTEC
NTC 4580 (1). En 49 materiales de la colección
intercambiados con la Universidad de Nariño se realizó una estimación del peso del fruto inicial (PFi) con
base en el producto de los diámetros (PD) , de esta
manera se genera la ecuación de regresión PFi = PF+
b (PDi-PD). De cada material se escogieron frutos en
los diferentes estados de maduración. En cada fruto
se hicieron tres determinaciones de los sólidos solubles utilizando un refractómetro 107910 ATAGO Honey
premiumâ. Con esta información se realizó un análisis
de varianza para los estados 3 y 4 correspondientes a
frutos fisiológicamente maduros. Para comparar los
promedios de las introducciones se usó la prueba de
rango múltiple de DUNCAN. El análisis de varianza se
realizó con el procedimiento GLM de SAS. Para frutos
de estado de maduración 3 y 4 se escogieron entre 10
y 30 frutos dependiendo de la disponibilidad, se les
evaluó el número de semillas por fruto y peso de semillas secas (al ambiente). Se realizó un análisis de
varianza y prueba de rango múltiple de Duncan para
comparar los promedios de las introducciones.
De la colección se escogieron al azar 24 introducciones
para probar los descriptores morfológicos. Se utilizaron los descriptores cuantitativos y cualitativos propuestos por (3). Dentro del conjunto de los descriptores
utilizados hubo necesidad de efectuar algunos cambios,
los cuales consistieron en la adición de algunos
descriptores cualitativos y se eliminaron otros los cuales se consideraron poco discriminativos materiales
(Anexo 2). Los materiales seleccionados se muestran
en la Tabla 1.
Tabla 1. Introducciones caracterizadas morfológicamente.
'(3$57$0(172
9$//('(/&$8&$
&$8&$
&$/'$6
48,1',2
,1752'8&&,21(6
8138813881388138
8138813881388138
8138813881388138
813881388138
8138813881388138
81388138
81388138
8138
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Análisis estadístico de la información fue el siguiente:
para los caracteres cuantitativos se realizó el Análisis
Multivariado de Componentes Principales y para los
caracteres cualitativos el Análisis de Correspondencias
Múltiples (ACM), obtenidos mediante el paquete estadístico SPAD versión 3.5.
La tercera etapa consistió en la caracterización molecular
de 46 introducciones de la colección. Se maceraron
100 mg de tejido vegetal con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino y seco. El tejido se resuspendió en
600 ul de Buffer de extracción (0.5 M NaCl, 0.2 M Tris Hcl
pH 7.5, 10mM EDTA, 1% SDS). La suspensión se incubó durante una hora en baño maría a una temperatura de
65 º C. A cada muestra se le adicionaron 300 ul de Acetato
de Amonio 7.5 M, y se dejaron a temperatura ambiente
por 10 minutos. Las muestras se centrifugaron a 12000
rpm durante 10 minutos, y se recuperó el sobrenadante al
cual se le agregaron 600 ul de isopropanol y se incubaron a (-20 ºC) por 12 horas. Posteriormente se
centrifugaron los tubos a 12000 rpm durante 15 minutos. El precipitado se lavó con 800 ul de Etanol al 70% (20 ºC) centrifugando por 5 minutos a 12000 rpm y se
secó a temperatura ambiente durante 1 hora. El precipitado se resuspendió en 100 ul de Buffer 1X TE (Tris Hcl 1M,
EDTA 0.5M). Por último se agregó a cada muestra 2 ul de
RNAsa. El ADN se conservó a 4 ºC hasta su utilización.
(4). Las concentraciones de ADN fueron estimadas por
comparación con patrones de ADN del bacteriófago de
lambda en geles de agarosa. El ADN cuantificado se diluyó en agua HPLC hasta una concentración de 5 ng/ul y se
almacenó a –20 ºC.
Para la técnica RAMs se seleccionaron 7 cebadores teniendo en cuenta su habilidad para revelar polimorfismo,el número de bandas polimór ficas y su
reproducibilidad. (Tabla 2)
Las siguientes designaciones son usadas para los sitios
degenerados: H(A,T,C); B(G,T,C); V(G,A,C) y D(G,A,T).
Los productos amplificados fueron separados por
electroforesis durante 4 horas a 100 v en geles de
agarosa al 1.2% usando Bromuro de Etidio (0.8 ug/ml
para la tinción. Se visualizó en un transiluminador con
Luz ultravioleta, finalmente fue fotografiado en un equipo de fotodocumentación Gel –DOC 1000 (BIO_ RAD).
La longitud de los productos de amplificación fueron
estimados por comparación con un marcador Lambda
(g) de 100pb de Promega. (Figura 1).
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Análisis de la información.
La similitud genética entre todas las introducciones fue
calculada con el coeficiente de Nei- Li, S= 2a/ (2a+b+c)
donde a = bandas compartidas por ambos individuos, b
= bandas presentes en el individuo (1) pero no en (2), y
C = bandas presentes en el individuo (2) pero no en (1).
Posteriormente se construye la matriz de Similaridad con
el programa SIMQUAL del paquete “Numerical Taxonomy
System for Personal Computer” (NTSYS – pc versión 1.8).
A partir de esta matriz se construye una de agrupamiento
con el programa SAHN de NTSYS –pc, utilizando el método UPGMA método gráfico de agrupamiento por parejas en función del promedio aritmético (Unweighted pairgroup arithmetic mean). A partir de esta matriz se construyó el dendrograma con el programa TREE de NTSYS
– pc versión 1.80). Se realizó un análisis multivariado de
correspondencia múltiple, para facilitar la representación
multidimensional del grupo de individuos con las características descriptivas de ellos en un espacio determinado como el plano (SAS Versión 8.1. Statistical Análisis
System). Para el análisis de la diversidad genética se
estimaron los parámetros de heterocigosidad promedio
(H), y el porcentaje de loci polimórficos (P) fué estimado
sobre todos los loci y el promedio de los mismos de
acuerdo a la fórmula no sesgada de Nei.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se constituyó una colección de trabajo de uchuva
que consta de 222 introducciones colectadas en la
región central y suroccidental del país, almacenadas
en el Centro Experimental de la Universidad Nacional
de Colombia sede Palmira (CEUNP) y registrada en
una base de datos computarizada a través del programa Arcview SIG versión 3.1,
Tabla 2. Cebadores utilizados en microsatélites RAMS.
35,0(5
6(&8(1&,$
*7
9+9*7*7*7*7*7$
&7
'<'&7&7&7&7&7&7&7&
&*$ '+%&*$&*$&*$&*$&*$
&$
'%'$&$&$&$&$&$&$&$
$* +%+$*$*$*$*$*$*$*$
7*
+9+7*7*7*7*7*7*7*7
&&$ ''%&&$&&$&&$&&$&&$
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Figura 1. Productos amplificados de las introducciones del género Physalis.
NARIÑO
1 2
3 4
VALLE
0M
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
6600pb
b
Patrones de bandas generadas por el primer microsatélite RAMS (CGA)n en introducciones de Physalis peruviana L.,
la línea 30 representa el marcador molecular de 100pb.
Introducciones de fruto rojo
Introducciones relacionadas al género Physalis
Con base en la identificación botánica se encontró que
las introducciones UNPU074, UNPU075, UNPU076 y
UNPU077 pertenecen posiblemente a la especie Physalis
angulata. Las introducciones UNPU048, UNPU052 y
UNPU053 presentaron variaciones en las características
morfológicas reportadas en las claves botánicas para la
especie Physalis peruviana L., pero de acuerdo a las
mismas no pertenece a otra especie; por lo cual, se
puede tratar de una variedad natural de la especie o una
subespecie de ésta. En el análisis molecular las introducciones UNPU048 y UNPU053 presentaron 5 alelos
únicos que las diferencian de las demás introducciones
analizadas.
La caracterización cuantitativa de los frutos de 65 introducciones de la colección permitió generar
ecuaciones de regresión con alta capacidad de predicción del peso del fruto con base en el producto de
los diámetros, las cuales pueden utilizarse para estudios futuros de crecimiento y desarrollo de los frutos
de uchuva. La relación de diámetro ecuatorial / diámetro polar permitió clasificar los frutos de acuerdo
a tres formas: alargados, redondos y achatados.
De acuerdo a la evaluación de las características de los
fr utos las introducciones UNPU145, UNPU017,
UNPU141, UNPU111, UNPU162, UNPU096 y UNPU019
presentaron los mayores pesos de fruto, contenido de
sólidos solubles y bajo número de semillas, caracte-
rísticas que representan ventajosas posibilidades para
el mercado y el procesamiento de la fruta.
A través del análisis de correspondencia múltiple
(ACM) la variabilidad observada en los 24 materiales
caracterizados morfológicamente es explicada por los
dos primeros componentes en los cuales las características morfológicas de mayor aporte fueron color
de las máculas (CM), color de las anteras (CA), color
de la baya madura (CBM), color de la semilla (CS) y
prolongación del color secundario en la corola
(PCSC).
En el dendrograma (Figura 2) realizado para las características morfológicas cualitativas no mostró una
tendencia al agrupamiento de las introducciones con
las variables evaluadas, sin embargo, el agrupamiento
no mostró una correspondencia exacta con la distribución geográfica de las introducciones. La posible
causa puede deberse a que la distribución geográfica de algunos de estos materiales es accidental por la
manipulación del hombre.
En el análisis de componentes principales (ACP) para
las variables cuantitativas (Figura 3), las de mayor
aporte a la variabilidad son las relacionadas con el
fruto (peso, tamaño transversal y longitudinal, peso
de la semilla húmeda y seca, número de semillas y el
contenido de sólidos solubles).
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Figura 2. Clasificación jerárquica del análisis de correspondencia múltiple (ACM)
V: Valle C: Cauca Cl: Caldas Q: Quindío
0.45
0.25
3
0%
0%
1%
0.13
0.10
0.05
0.05
0.04
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
1
24
3
19
20
12
7
16
14
0.02
0.01
10
2
6
8
18
17
0.00 0.00 0.00
0.00
15
11
13
0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
22
23
9
4
5
21
V C C C C Q C Cl Cl V V V V C V V V V V V V V V V
Figura 3. Clasificación jerárquica del análisis de componentes principales (ACP).
V: Valle C: Cauca Cl: Caldas Q: Quindío
3.51
2.03
1.59
1.14
5
0%
0%
0%
0.93
0%
0%
0.87
0.84
0.75
0.73
0.50
0.55
0.48
0.55
0.26
0.18
0.18
11
7
8
22
4
17
5
15
3
0.18
0.13 0.10
0.08
1
0.55
0.28
23
9
12
6
16
0.13
2
13
21
20
18
10
19
24
V C V V C V V V V V C V V V V V V Cl Cl C C Q C V
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Figura 4. Dendrograma de la estructura genética de 43 introducciones de P.peruviana L. basado en el coeficiente de
similaridad de Nei-Li y calculado de los datos combinados de los 7 cebadores microsatélites RAMS, con el método
de clasificación UPGMA, usando los programas SAHN y TREE de NTSYS-pc versión 1.8 (Exeter Software, Setauket,
NY, USA).
La evaluación de la estructura genética de la población en estudio de Physalis peruviana L. demostró
que la técnica RAMS empleada es útil para detectar
variabilidad genética entre y dentro de individuos de
ésta especie.
El dendrograma (Figura 4) basado en el coeficiente
de similaridad de Nei-Li no mostró agrupamientos
relacionados con el origen geográfico, por lo tanto la
distribución geográfica pudo haber sido accidental
por la manipulación que el hombre ha hecho de este
recurso genético, diseminando materiales comerciales. Lo anterior explica la poca diversidad encontrada en los materiales colectados en los departamentos de Cauca, Cundinamarca, Caldas y Nariño, donde la uchuva proveniente de semilla es cultivada a
pequeña escala en muchos municipios. Las introducciones colectadas en el corregimiento de Juntas,
municipio de Ginebra Valle, apor taron la mayor diversidad, debido a que la mayoría de los materiales
colectados provienen de un bosque secundario donde se encuentran en estado silvestre y la intervención
del hombre ha sido mínima.
REFERENCIAS
(1) FISCHER, G.; FLOREZ, R.; ANGEL, D.; SORA, R.
2000. Producción, poscosecha y exportación de
la uchuva Physalis peruviana L. Universidad Nacional de Colombia sede Santa Fé de Bogotá. Facultad de agronomía. 175pp.
(2) OBSERVATORIO AGROCADENAS. 2002.Análisis
de los frutales de exportación de Colombia. Disponibles en: (http://agrocadenas.gov.co/frutales).
(3) HEJEILE, R.; IBARRA, A. 2001. Colección y caracterización de recursos genéticos de uvilla
Physalis peruviana L. Universidad de Nariño. Facultad de Ciencias Agrícolas. Programa de Ingeniería Agronómica. 165pp.
(4) HENRIQUEZ, N.M.A. 2000. Diversidad genética de
Phaeoisariopsis griseola (Sacc.) Ferraris utilizando marcadores moleculares. Tesis Ing. Agrónomo. Universidad Nacional de Colombia sede
Palmira. 102 p.
OSEPH, H.; ANDERSON, R.; TATHAM, R.; and
BLACK, W. 1992. Multivariate data Analysys with
Readings. Third Edition USA. 554 págs.