Trabajo Practico 2009 Nº1 -Esterilización y Cultivos

Trabajo Practico Nº 1 (año 2009)
1.- Esterilización . Métodos
Por autoclave. Estufa. Filtración.
Preparación de material de vidrio para esterilización por autoclave. Envolver pipetas,
cápsulas de Petri, preparar cámaras húmedas con papel de filtro –
Esterilización por filtrado:
Demostración de filtración de antibiótico.
2.- Preparación de medios de cultivo
Se prepararán medios de cultivo para hongos y bacterias que serán usados en trabajos
prácticos posteriores.
Medios sólidos:
Preparar 500 ml de cada medio de cultivo /(Calcular los ingredientes para medio litro)
Para hongos patógenos:
Sabouraud dextrosa agar con 2 % de extracto de levadura (25 %) 1/4
Peptona :10 g. (2,5 g)
Dextrosa (glucosa): 40 g. (10 g)
Extracto de levadura 20 g. (4 g)
Agar- agar: 15 g.
Agua destilada: 1 litro
Medio selectivo para aislamiento de los hongos entomopatógenos Beauveria
bassiana y Metarhizium anisopliae a partir de suelo (**) (Calcular los
ingredientes para medio litro)
Dextrosa (Glucosa): 20 g
Peptona: 5 g
Agar- agar: 10 g
Cristal violeta : 0.01 g
Dodine (antifúngico): 0.13 g
Cloramfenicol (antibiótico): 0.5 g
Agua destilada: 500 ml
Cicloheximida o clortetracilcina: 5 mg /l
Nota: Los antibióticos y antifúngicos se disuelven en 10 ml de agua destilada estéril se
esterilizan por filtrado con filtros de membrana y se agregan al medio una vez que este
fue esterilizado en autoclave; cuando el medio está aún líquido pero no muy caliente.
(**) Fuente: Doberski, J.W. & Tribe, H.T. 1980 Isolation of entomogenous fungi from
Elm Bark and soil with reference to ecology of Beauveria bassiana and Metarhizium
anisopliae Trans. Br. Mycol. Soc . 74 (1) 95- 100 .
Para Bacterias: (medio generalizado) (calcular los ingredientes para medio litro)
Agar nutritivo:
Peptona: 5 g
Extracto de carne: 3 g
Agar-agar: 15 g
Agua destilada: 1 litro
Pasar el medio líquido a cápsulas de Petri de 100 mm de diámetro previamente
esterilizadas en autoclave, bajo condiciones de esterilidad, en cámara de flujo laminar
.
Demostración de preparación de medio de cultivo
mantenimiento /conservación de cultivos en colecciones.
en
tubos
en
estría
para
NOTA IMPORTANTE:
Se preparará medio litro de cada medio de cultivo, los Erlenmeyers deberán ser
rotulados con el nombre del medio de cultivo y la fecha, además se colocará cinta
indicadora de esterilización en cada material a utilizar. Los medios de cultivo se
guardarán en heladera hasta su utilización.
-.Esterilizar material de vidrio y medios de cultivo en autoclave de Chamberland
durante 20 minutos a 120 º C y 1 atmósfera de presión. Dejar el material de vidrio a
secar en estufa de secado después de esterilizado.
3.- Preparación de material para microscopía óptica
Preparados de preparados por medio de “extendidos” de material (tejidos sanos o
infectados con patógenos de acuerdo a disponibilidad) los cuales serán coloreados con
la tinción Giemsa.
Protocolo de Tinción Giemsa:
Preparar 0.02 M de buffer fosfato:
Solución 1: 28,39 g de Na
2
PO
Solución 2 : 31.21 g de Na 2Po
4
disuelto en 1 litro de agua destilada .
4 ..2
H 2 0 disuelto en 1 litro de agua destilada .
Mezclar 55 ml de la solución 1 con 45 ml de la solución 2 y llevar a 1 litro con agua
destilada, preparar una solución de trabajo de buffer fosfato con pH entre 6.9 – 7.
Preparar fijador para Giemsa:
94 % alcohol absoluto
5 % solución de formalina
1 % ácido acético
Cría de insectos :
*Observación de colonias de Aedes aegypti, explicación de la metodología de cría
utilizada.