anexo_309-5-2014-02-1

AVANCE DE RESULTADOS DEL SEMESTRE AGOSTO-DICIEMBRE 2014
EXTRACCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y VALORACIÓN BIOLÓGICA DE COMPUESTOS
ORGÁNICOS DE SEMILLA DE TUNA (Opuntia spp.)
1.1
1.1.1
Extracciones
Método de Maceración-Percolación
1.1.1.1 Preparación de los extractos
Se pesaron 100 g de semillas secas y molidas, las cuales fueron empacadas en una
columna de percolación, para ser sometidas a un proceso de extracción por maceraciónpercolación, el cual será descrito a continuación.
A la columna empacada con la muestra, se le adicionaron como fase móvil de forma
consecutiva los siguientes solventes en orden de polaridad creciente: hexano,
diclorometano y metanol.
La muestra fue dejada macerando 24 hrs. iniciando con hexano (300-400 mL), tiempo
después del cual se recuperó el macerado y se inició el proceso de percolación realizando
dos lavados consecutivos eluyendo a través de la columna (500-700 mL) de solvente,
utilizando la técnica por agotamiento del mismo, repitiendo esta operación de maceraciónpercolación dos veces para cada solvente, se realizó el mismo procedimiento para el
diclorometano y el metanol.
Los solventes fueron recuperados y las fracciones concentradas entre (45-50°C) mediante
destilación a presión reducida usando un rotavapor (BÜCHI R-200, Alemania), se dejó
evaporar el solvente de las fracciones a temperatura ambiente durante 48 hrs. y
posteriormente fueron secadas en una estufa de vacío (Vaccum Drying Oven PROLAB
DZF-6030) durante 24 hrs. a 40°C, para asegurar la eliminación total del solvente en las
muestras.
Se pesaron las muestras obtenidas al término del proceso anterior en un vial previamente
pesado, para evaluar el rendimiento de cada fracción obtenida y fueron almacenadas a
20°C para los análisis posteriores.
1.1.2
Método de prensado manual en frío
1.1.2.1 Preparación de la muestra
Se pesaron 100 g de semillas secas, las cuales fueron empacadas en un pistón de acero
inoxidable, el cual se sometió a una presión de 20 ton en una prensa para extraer aceite.
1.2
1.2.1
Derivatización.
Metilación o transesterificación de la muestra
Los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) presentes en la semilla, así como del
aceite obtenido de las mismas tanto por el método de maceración como por el prensado
en frío, fueron preparados de acuerdo a la AOAC-IUPAC método 969.33 (AOAC, 1990).
Se pesaron 5 mg del aceite al cual se le agregó 1 mL de isooctano (2, 2, 4 trimetilpentano)
y 0.8 mL de NaOH (0.1 g) en metanol (5 mL). La mezcla de reacción se sometió a
extracción con microondas (CEM, Discover) a 100°C y 150watts durante 13 min, al
término del proceso se agregó 1 mL de Trifluoruro de boro en metanol (14%v/v) y
nuevamente se sometió a un ciclo de microondas bajo las mismas condiciones,
posteriormente se agregó 1 mL de isooctano. Finalmente, se separó la fase orgánica la
cual fue secada con Na2SO4 anhidro y posteriormente almacenada hasta iniciar el
proceso de análisis por cromatografía.
Para las muestras de semillas de cada una de las variantes, fueron sometida a un
proceso de pulverización hasta la obtención de un polvo fino utilizando una licuadora
(Magic Bullet, Modelo MB 1001A, China), se pesaron 20 mg de este polvo fino, al cual se
le agregó 1 mL de isooctano como reactivo de extracción y se sometió a un ciclo de
microondas, posteriormente se filtraron los residuos de las semillas y se obtuvo el
sobrenadante al cual se le agregaron 0.8 mL de NaOH en metanol y se siguió a partir de
este punto con el procedimiento antes mencionado para los aceites.
1.2.2
Silanización de la muestra
Para la obtención de los derivados silanizados, se llevará a cabo el siguiente proceso: las
muestras serán pesadas, aceite (5 mg) y semilla pulverizada (20 mg) a los cuales se les
añadirá 1 mL isooctano y 100 µL de Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida al 10% de cloruro
de trimetilsililo. La mezcla de reacción se someterá a las mismas condiciones del
procedimiento de microondas descrito en la reacción de transesterificación.
1.3
Análisis e identificación de compuestos por CG/EM
La composición química se determinó por cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas, usando un cromatógrafo de gases 6890N (Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA) acoplado con un espectrómetro de masas de la
serie Agilent EM 5973.
Para las muestras derivadas del proceso de transesterificación, se utilizó una columna
capilar ZEBRON 7HM-G007-17 (L=30 m; DI=320 µm; f=0.50 µm).
Se inyectó 1 µL de la muestra en el puerto de inyección. La temperatura del puerto de
inyección fue de 250°C, en modo splitless. El equipo fue operado con helio como gas
portador a una velocidad de flujo constante de 0.7 mL/min.
La temperatura del horno fue programada de la siguiente manera: iniciando a 225°C
(2 min. isotérmicos), seguido de un incremento hasta 250ºC a razón de 25°C/min donde
permaneció durante 2 min. isotérmicos.
El espectrómetro de masas trabajó en modo scan de adquisición a 71 eV de voltaje de
ionización. Se utilizó un analizador cuadrupolar a 150ºC de temperatura del cuadrupolo, el
detector trabajó en un rango de masas de 33-800 m/z, las temperaturas de la interfase y
de la fuente fueron 280°C y 230°C respectivamente.
La identificación de los compuestos se confirmó por elucidación de los espectros de
masas de cada componente y por comparación de los tiempos de retención y los
espectros de masas observados, comparándolos con estándares y con el uso de la
librería NIST 02.
Fueron identificados los ácidos carboxílicos como derivados de esteres metílicos, los
aldehídos como sus acetales de metilo y los alcoholes como los ésteres de silano.
2. Resultados
Tabla1. Comparativa de rendimiento de aceite por los dos métodos de extracción
Variante
Maceración (mL)
Prensado (mL)
Amarilla
7.4
1.5
Blanca
8.8
1.25
Cardona
11.3
2.5
Charola
10.2
0.4
Picochulo
5.94
0
Rojo tapón
15.2
6.5
Tapona
14.3
6
Xoconostle
10.8
1.8
1. Gráficos de concentración de ácidos grasos por los tres diferentes tipos de
tratamiento
2. Gráficos de porcentaje de ácidos grasos en cada una de las variantes
*Los datos en la tabla en parte inferior son ppm (partes por millón).