area03-res093

Función de la Cortactina en la Regulación de RhoA y ROCK en Células
Endoteliales
Rodolfo Ismael Cabrera Silva. Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de
Guadalajara, [email protected]. Asesor Michael Schnoor, Centro de Investigación
y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. [email protected].
Planteamiento del Problema:
La cortactina es una proteína ya conocida por su importancia en la regulación de
los filamentos de actina que forman parte del citoesqueleto de la célula. Se ha
visto involucrada en la re-estructuración de la célula durante procesos
inflamatorios. Datos preliminares muestran que en ausencia de cortactina hay un
aumento en la expresión y activación de ROCK, una cinasa que inhibe a la
fosfatasa de las cadenas ligeras de miosina (CLM) y fosforila CLM directamente,
permitiendo que se unan a la actina y formen actomiosinas (fibras de estrés) que
contraen a la célula y rompen las uniones intercelulares, aumentando así la
permeabilidad. Debido a la gran importancia que tiene la preservación de la
permeabilidad del endotelio para mantener la hemostasia, nos interesó
comprender cómo la cortactina regula la activación de ROCK, para ello evaluamos
la expresión y la principal vía de activación de ROCK: RhoA, una GTPasa de la
superfamilia de Ras.
Metodología:
Se empleó como modelo la línea celular HMEC-1 (Human Microvascular
Endothelial Cells) cuya expresión de cortactina fue depletada empleando un vector
lentiviral que codifica un “small hairpin” RNA (shRNA) específico para cortactina.
Se utilizó PCR-Inversa para observar los niveles de expresión de RNAm de
cortactina, RhoA y ROCK1. Los niveles de expresión proteica se detectaron con el
método de western-blot (WB). Se empleó el método “pull-down” con el péptido
rhotekin y Glutation-S-Transferasa (GST) como bandera para precipitar solo
RhoA-GTP (RhoA activo) que se detecta posteriormente por medio de WB. Para
observar los cambios morfológicos se empleó la inmunoflorescencia (IF) con
anticuerpos contra actina y cadherina vascular endotelial (VE-cadherina).
Resultados:
El proyecto no ha finalizado, pero los datos ya nos permiten concluir que cortactina
es un regulador importante de la permeabilidad endotelial. Con PCR y WB se pudo
demostrar la depleción de cortactina, de igual manera se detectó la presencia de
RhoA y un incremento de ROCK1 y CLM fosforilada. Estos datos se confirmaron
con una IF donde se observó un aumento de fibras de estrés y una reducción de
VE-cadherina. Estamos en proceso de analizar los niveles de RhoA activa.