Racemasa, Ronda 31. pdf

SEAP
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28045 MADRID
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Programa de Garantía de
Calidad en Patología
Módulo de Inmunohistoquímica GENERAL
Ronda nº 32, 17 de Abril de 2014
Antígeno probado: alfa-methilacil-CoA Racemasa (Racemasa)
Tejido probado: Próstata, Riñón
1. Instrucciones
Los participantes fueron invitados a teñir con Racemasa la preparación remitida por el
programa (riñón fijado en formol al 10%, pH 7 durante 24 horas) y su propia
preparación control, devolviendo ambas preparaciones para su evaluación. El cristal
enviado para teñir con inmunohistoquímica (IHQ) para Racemasa contenía:
·
·
Prostata, con adenocarcinoma infiltrante, neoplasia intraepitelial prostática
(PIN, prostate intraepithelial neoplasia) y epitelio glandular hiperplásico.
Riñón, con presencia de túbulos renales proximales
2. Inmunotinción óptima
Los criterios para considerar como óptima la tinción para Recemasa fueron los
siguientes (figuras 1, 2 y 3):
·
·
·
·
Una tinción granular citoplasmática, de moderada a fuerte, en las células
epiteliales de los túbulos renales proximales.
Una tinción citoplasmática, de moderada a fuete, de la mayoría de las células
neoplásicas del PIN y en las del adenocarcinoma.
Una tinción citoplásmica negativa o débil y focal en las células del epitelio
glandular hiperplásico prostático.
Una tinción citoplásmica negativa o débil y focal en las células estromales.
Además, con una adecuada relación en la intensidad de la tinción con respecto al
contraste empleado y con mínimo o ausente artefacto tanto de técnica
inmunohistoquímica (degradación del tejido por sobrecalentamiento, tinción de fondo,
etc.) como de técnica histológica (contraste inadecuado, ausencia de hidratación, etc.).
Los criterios generales de puntuación empleados son los reflejados en las hojas de
resultados individuales remitidas. Para ejemplos de las diferentes valoraciones se
puede visitar la página web de la SEAP, en el apartado del programa de Garantía de
Calidad. Las puntuaciones para cada control varían entre 0 (no entregado) y 20 (tinción
óptima por los cuatro evaluadores). Los rangos de puntuación se agrupan como sigue:
4-7 Pobre, 8-11 Regular, 12-15 Buena, 16-20 Óptima. Una puntuación de 12 fue la
considerada como punto de corte para considerar el control como adecuado para
diagnóstico.
3. Laboratorios
77 laboratorios han participado en esta ronda de control. De estos, 55 (71,4%)
devolvieron los controles para su evaluación y 22 (28,6%) no lo hicieron.
4. Anticuerpos
Los anticuerpos empleados de acuerdo con la información proporcionada por los
diferentes laboratorios son:
13H4 39 (DAKO 25, Master Diagnostica 8, Master Diagnostica-Vitro 2, Master
Diagnostica-ROCHE 1, Vitro 1)
P504S 4 (ROCHE 2, Master Diagnostic 2, Diagnostic Biosystem 1)
2876 1 (ROCHE)
3E6 1 (DAKO)
13H4+4A4 1 (Vitro-Master Diagnostica)
p504S/p63 1 (BIOCARE Medical)
Policlonal 2 (BIOCARE 1, En blanco 1)
No especificado 10: en blanco 6 (DAKO 2, DBS 1, en blanco 3), N/A 2 (BIOCARE), no
determinado 1 (BIOCARE), Racemasa 1 (ROCHE)
5. Estudio de los controles
De cada centro (gráfico 1.1): 48 (62,3) de las preparaciones remitidas se consideraron
como adecuadas. 16 (20,7 %) de las preparaciones obtuvieron una puntuación igual o
superior a 16/20, consideradas como óptimas o próximas al grado óptimo. La
puntuación más repetida fue de 12, con una valoración de buena.
Los tejidos utilizados como control, en los laboratorios que lo especificaron fueron:
• Próstata (incluidos TMA y trucut) 41
• Riñón: 5
• Apéndice cecal 1
• Multitejido (apéndice, riñón, placenta y páncreas) 1
• Próstata y riñón 2
• Próstata tumoral y no tumoral 1
• Próstata normal 1
Programa GCP (gráfico 1-2): 50 (64,9%) de las preparaciones remitidas se consideraron
adecuadas. 25 (32,5%) obtuvieron una puntuación igual o superior a 16/20,
consideradas como óptimas o muy cerca de la tinción óptima. La puntuación más
repetida fue de 16, con una valoración óptima.
El principal de los problemas detectados, para ambos tipos de controles, han sido una
alta frecuencia de pretratamiento excesivo (por sobrecalentamiento o pH inadecuado)
(figuras 7,9 y 10); aunque, generalmente, este sobretratamiento no afecta a la aptitud
de la técnica, si afecta a su idoneidad cuando se da en grado moderado o alto.
Asimismo, ha sido la observación más común, en las tinciones dentro del rango de
idónea (16-20 puntos).
Dentro del rango de tinciones buenas (12-15 puntos), los problemas más frecuentes
son una disminución de la calidad de la tinción de las células neoplásicas, ya sea por
una tinción más débil que la deseable o por una tinción inadecuada en algunas células.
Una tinción de fondo moderada es el siguiente problema por frecuencia, observándose
en 17/44 (39%) de los casos; aunque no dificulta la interpretación de la técnica, si
tendría fácil solución: un pretratamiento de menor intensidad con una buena digestión
enzimática y un bloqueo adecuado en tampón de buena calidad impedirían la difusión
excesiva del anticuerpo.
Dentro del rango de las técnicas con menos puntuación (<12 puntos), el principal
problema es una tinción muy débil, insuficiente, de las células neoplásicas diana
(figuras 5, 6 y 8). La solución en estos casos vendría dada por el uso de un anticuerpo
de buena calidad (aunque el 13H4 es el más utilizado no podemos afirmar que sea
mejor que los demás) con un pH elevado (entre 8 y 9) sobre un tejido desenmascarado
con calor, sin parecer importar tanto la duración o la temperatura de la incubación. En
estos casos con menor puntuación, además, destacaba la tinción inespecífica (figuras 4
y 7) a los que se añadían con relativa frecuencia los artefactos técnicos generales
(hidratación, contraste inadecuado por exceso o defecto, defectos en la manipulación
con rotura del corte, etc.) (figura 10) que suponen una merma global de la calidad de la
técnica.
La elección de control en relación a la puntuación obtenida está cerca de la
significación estadística en el análisis univariante, con una media de puntuaciones para
el grupo del control GCP del 14,67 y para el grupo de control local del 13,69 (0,060).
Estas diferencias se atenúan cuando consideramos la adecuación de la prueba en el
punto de corte definido en 12 puntos, independientemente de cualquier otro factor.
6. Resultados de la autoevaluación
Como se indica en las instrucciones remitidas, la autoevaluación es una parte
importante del programa de Garantía de Calidad. 53 (68,8%) de los GCP y 51 (66,2%)
de los controles locales se acompañaron de una autoevaluación por parte de técnico o
patólogo local. Si consideramos solo el grupo de los controles remitidos para
evaluación, 51/54 (94%) se acompañan de una autoevaluación por parte de técnicos
y/o patólogos, lo que supone una cifra superior a las rondas previas. Estos son los
resultados:
Control Local (gráficos2 y 3): al igual que en las rondas anteriores la percepción local
sobre los resultados de la técnica es superior a la valoración de los observadores
externos. Tanto dentro de los técnicos participantes como de los patólogos, 43 (80%)
los casos tenían una puntuación igual o superior a 16, mientras que solo 25 de estos
casos son óptimos según los evaluadores; estas valoraciones, aunque son casi el doble
de óptimas con respecto a lo observado de acuerdo con la valoración externa, suponen
una disminución con respecto a rondas previas.
Control del GCP (gráficos 2 y 3): los resultados son similares al control local, con 45
(81,8%) de preparaciones con una puntuación igual o superior a 16 tanto para los
técnicos como para los patólogos. Es evidente la notable discrepancia con las
valoraciones de los asesores externos (27 % frente a 85 % de media). La apreciación de
los técnicos y de los patólogos sigue siendo muy superior a la de los asesores externos.
De nuevo se observa una discrepancia importante pero menor que en rondas
anteriores, posiblemente debido a un mayor porcentaje de técnicas óptimamente
realizadas (casi un tercio del total según la valoración externa)
7. Mejores métodos
1 de los controles de GCP mostro una puntuación 20/20.
Fijación: Formol tamponado, 24 horas, a temperatura ambiente, sobre tejido tallado
previamente, con una dimensión de 2 cm.
Método: MULTIMERO
Bloqueo: Agua oxigenada
Automatización: BENCHMARK XT de ROCHE VENTANA
Digestión enzimática: NO
Recuperación antigénica: con calor, en tampón CC1 a pH 8,3, con un tiempo total en
MO de 30 minutos.
Anticuerpo primario: 13H4, prediluido, de DAKO, 48 minutos a 37ºC
Cromógeno: DAB de ROCHE VENTANA, prediluido, con un tiempo de incubación no
especificado.
1 de los controles mostró una puntuación de 19/20.
Fijación: Formaldehido al 10%, 24 horas, a temperatura ambiente, sobre tejido tallado
previamente con una dimensión de 2x1 cm.
Método: ENVISION FLEX
Bloqueo: Agua oxigenada
Automatización: AUTOSTAINER LINK 48 de DAKO
Digestión enzimática: NO
Recuperación antigénica: con calor, en sistema PTLINK, a pH 9, con un tiempo total en
MO no especificado.
Anticuerpo primario: 13H4, prediluido, de DAKO, 20 minutos a temperatura ambiente.
Cromógeno: DAB de DAKO, con una predilución y un tiempo de incubación no
especificados.
8. Comentarios
La Racemasa es una enzima que realiza la oxidación de las cadenas ramificadas de los
ácidos grasos y sus derivados. La Racemasa es una proteína que se encuentra en las
mitocondrias y peroxisomas de numerosas células de numerosos tejidos, como son
próstata, hígado, tracto biliar, riñón y pulmón. Mediante IHQ, las células de la próstata
muestran una tinción débil o focal, citoplasmática, en aproximadamente un 20% de los
casos, incluidas las células de las glándulas periuretrales y seminales. La reactividad de
la tinción tiende a disminuir con la edad, pero el coeficiente de correlación es bajo (1).
Mediante IHQ para Racemasa, se ha descrito una tinción difusa en más del 90% de los
carcinomas de próstata, independientemente de su grado de Gleason. Sin embargo, y
particularmente, las variantes hipernefroide, pseudohiperplásica y atrófica del
adenocarcinoma de próstata pueden ser negativas. En el PIN, los rangos de positividad
para este anticuerpo varían entre el 13 y el 72%.
La detección de la expresión de Racemasa mediante IHQ es utilizada principalmente en
el diagnóstico de lesiones prostáticas sospechosas de ser carcinoma. La tinción aislada
de proteínas de alto peso molecular (HMW-CK, High Molecular Weight Cytokeratins)
y/o p63 puede no ser suficiente para realizar el diagnostico de malignidad; es por ello
que la tinción de Racemasa y HMW-CK o p63 debe realizarse conjuntamente, ya sea
por separado o en forma de coctel de anticuerpos.
La recuperación antigénica mediante calor es el método predominante, mientras que
solamente un laboratorio utilizo la digestión enzimática.
El anticuerpo primario no parece tener importancia en los resultados de la técnica, si
bien el número de anticuerpos no 13H4 es pequeño y no se han podido establecer
conclusiones definitivas.
En conjunto, la mayoría de los laboratorios muestran tinciones adecuadas para su
utilización rutinaria, con casi un tercio de inmunotinciones óptimas. Sin embargo hay
un porcentaje apreciable con deficiencias, especialmente en la intensidad de la tinción,
que podrían ocasionar una disminución en la sensibilidad de la técnica para la
detección de células con relativamente escasa cantidad de antígeno, que
habitualmente no son percibidas ni por el técnico responsable ni por el patólogo.
Parece ser que la labor de instrucción sobre la valoración de la técnica, sobre la que se
incidió hace varias rondas con la puesta bajo el dominio público de las imágenes en la
web de la SEAP, con ejemplos de diferentes casos representativos de cada uno de los
distintos problemas, así como la mejor en la automatización y estandarización de las
técnicas han permitido una mejora en la calidad global de los controles valorados.
Asimismo, el conocimiento de los criterios a puntuar en una valoración en profundidad
de un control de inmunohistoquímica no solo ha disminuido la variabilidad
interobservador entre los distintos laboratorios y los evaluadores de la SEAP sino que
ha contribuido en la mejora de la calidad antes referida, al menos, para esta proteína
en concreto.
En resumen, los resultados son heterogéneos, muestran gran dispersión con gran
cantidad de variables, que impide extraer conclusiones estadísticamente significativas,
en gran medida por las características de la diana, el tipo de anticuerpo empleado y el
método de la recuperación antigénica. Una combinación adecuada de los diferentes
factores implicados podría ser la clave para obtener unos buenos resultados, teniendo
como referencia principal los mejores métodos reseñados.
9. Bibliografía seleccionada
1. Gologan A, Bastacky S, McHale T, Yu J, Cai C, Monzon-Bordonaba F, Dhir R. AgeAssociated Changes in Alpha-Methyl CoA Racemase (AMACR) Expression in
Nonneoplastic Prostatic Tissues. Am J Surg Pathol. 2005 Nov;29(11):1435-41.
2. Hameed O, Humphrey PA. p63/AMACR antibody cocktail restaining of prostate
needle biopsy tissues after transfer to charged slides: a viable approach in the
diagnosis of small atypical foci that are lost on block sectioning. Am J Clin Pathol. 2005
Nov;124(5):708-15.
3. Jiang Z, Woda BA. Diagnostic utility of alpha-methylacyl CoA racemase (P504S) on
prostate needle biopsy. Adv Anat Pathol. 2004 Nov;11(6):316-21.
4. Kunju LP, Chinnaiyan AM, Shah RB. Comparison of monoclonal antibody (P504S) and
polyclonal antibody to alpha methylacyl-CoA racemase (AMACR) in the work-up of
prostate cancer. Histopathology. 2005 Dec;47(6):587-96.
5. Varma M, Jasani B. Diagnostic utility of immunohistochemistry in morphologically
difficult prostate cancer: review of current literature. Histopathology. 2005 Jul;47(1):116.
Figuras
Figura 1. Una zona representativa de una tinción óptima, 20/20, con
una tinción citoplasmática fuerte en las células de los túbulos renales
proximales, con buen contraste, sin tinción en el túbulo renal y nada
de fondo.
Figura 2. Una zona representativa de una tinción óptima, 20/20, con
una tinción citoplasmática fuerte en las células neoplásicas de un
adenocarcinoma de próstata grado 3+3 de Gleasson, con buen
contraste, sin tinción en células estromales y nada de fondo.
Figura 3. Control con tinción optima, 20/20, con una tinción
citoplasmática fuerte en las células neoplásicas tanto del
adenocarcinoma infiltrante como del PIN, con tinción negativa en el
epitelio ductal glandular hiperplásico, con buen contraste y nada de
fondo.
Figura 4. Zona representativa de una tinción tinción inadecuada 8/20,
con una tinción citoplasmática moderada-fuerte en las células de los
túbulos renales proximales, pero con tinción inadecuada moderadafuerte de células mesangiales renales y de la capsula de Bowman.
Figura 5. Control con tinción insuficiente 8/20, con una tinción
citoplasmática muy débil en las células de los túbulos renales
proximales, con buen contraste pero discreta tinción de fondo, así
como depósitos de colorante inespecíficos sin lavar.
Figura 6. Tinción insuficiente 8/20 en una zona de adenocarcinoma
infiltrante, correspondiente al mismo control que en la figura 5. De
nuevo tinción débil y parcheada, irregular, además de un pobre
contraste en la contratinción.
Figura 7. Zona representativa de una tinción insuficiente 8/20, con
una tinción citoplasmática fuerte en las células epiteliales y moderada
en otras, destacando una pérdida de contraste y un marcado daño
tisular por excesivo pretratamiento. Además, tinción citoplasmática
inespecífica en células mesenquimales.
Figura 8. Zona representativa de una tinción insuficiente 8/20, con
una tinción citoplasmática muy débil o inexistente, parcheada en las
células neoplásicas de un adenocarcinoma infiltrante de próstata.
Además, depósitos de tinción inespecíficos en parte superior
derecha, probablemente debidos a un lavado incompleto.
Figura 9. Zona representativa de una tinción deficiente, 4/20, con una
tinción inespecífica y muy débil en células aparentemente
mesenquimales, sin contraste, con marcado daño tisular por excesivo
pretratamiento. El control local estaba, aparentemente, elegido de un
parénquima prostático no neoplásico
Figura 10. Zona representativa de un control insuficiente 8/20, con
una tinción citoplasmática débil y parcheada en las células de los
túbulos renales proximales, con daño tisular por excesivo
tratamiento, tinción inespecífica en dicha zonas y manchas claras no
contrastadas por pobre desparafinado.
Gráficos
Grafico 1. Valoración de la técnica por los asesores externos (n=55)
15
Total
4
8
9
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Recuento
10
5
0
1
2
ControlGCP
__
Gráfico 2. Autoevaluación de la técnica según técnicos. (n=55)
30
TecnicoLocal
-1
10
12
14
15
16
17
18
19
20
Recuento
20
10
0
Racemasa (GCP)
Racemasa (LOCAL)
Control
__
Gráfico 3. Autoevaluación de la técnica según patólogos. (n=55)
30
PatologoLocal
-1
8
9
12
14
15
16
17
18
19
20
Recuento
20
10
0
Racemasa (GCP)
Racemasa (LOCAL)
Control
__