hidrogeles de alginato con capilares de cobre y cisteína para el

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES
COORDINACIÓN DE INGENIERÍA DE MATERIALES
HIDROGELES DE ALGINATO CON CAPILARES DE COBRE Y CISTEÍNA PARA
EL TRANSPORTE DE FÁRMACOS VAGINALES.
Por:
Cessily del Carmen Durán Vivas
INFORME DE PASANTÍA
Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar
como requisito parcial para optar al título de
Ingeniero de Materiales
Sartenejas, Abril de 2011.
UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES
COORDINACIÓN DE INGENIERÍA DE MATERIALES
HIDROGELES DE ALGINATO CON CAPILARES DE COBRE Y CISTEÍNA PARA
EL TRANSPORTE DE FÁRMACOS VAGINALES.
Por:
Cessily del Carmen Durán Vivas
Realizado con la asesoría de:
Tutor Académico: Evis Penott
Tutor Industrial: Christopher Batich
INFORME DE PASANTÍA
Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar
como requisito parcial para optar al título de
Ingeniero de Materiales.
Sartenejas, Abril de 2011
.
iv
HIDROGELES DE ALGINATO CON CAPILARES DE COBRE Y CISTEÍNA PARA EL
TRANSPORTE DE FÁRMACOS VAGINALES.
Realizado por:
Cessily del Carmen Durán Vivas
RESUMEN
Existe un gran número de medicamentos vaginales comercialmente disponibles. Sin embargo, la
mayoría de ellos requieren de frecuentes aplicaciones debido a su corto tiempo de residencia en la
vagina. Los sistemas de transporte de fármacos mucoadhesivos pueden ser utilizados para
adherirse al tejido vaginal e incrementar el tiempo de residencia del fármaco en el organismo. En
el presente trabajo se sintetizaron hidrogeles de alginato en presencia de capilares de cobre con y
sin cisteína, para evaluar la influencia de ésta sobre las propiedades mucoadhesivas de estas
formulaciones. Los hidrogeles fueron caracterizados macroscópicamente para evaluar los
cambios físicos antes y después de las reacciones de entrecruzamiento, tales como, cambios en su
coloración y sus dimensiones. La caracterización físico-química se realizó a través de
microscopía electrónica de barrido (MEB) y espectroscopia de energía dispersiva de rayos X
(EDX). Las micrografías obtenidas evidenciaron la presencia de los capilares de cobre en todas
las formulaciones ensayadas. También se sintetizó moco cervical con pH comparable al reportado
para el moco cervical humano (pH = 7,4), esto con la finalidad de ensayar las propiedades
mucoadhesivas de los hidrogeles en condiciones similares a la zona de aplicación. Las
propiedades mucoadhesivas se evaluaron mediante el uso de un analizador de textura, el cual
proporcionó el trabajo de adhesión y la fuerza máxima de desprendimiento necesaria para que el
hidrogel se desprenda de la membrana mucosa. No se observó reproducibilidad en estos
resultados, sin embargo, la tendencia obtenida en la fuerza máxima de desprendimiento y en el
área del trabajo de adhesión fue mayor para los hidrogeles con cisteína que para sus homólogos
sin modificar. También, se evaluó el hinchamiento de los hidrogeles bajo dos condiciones
fisiológicas: en agua destilada a 23 °C y en una solución de moco cervical a 37 °C. Se puso en
evidencia el carácter hidrofílico y la capacidad de hinchamiento de estos hidrogeles en medio
acuoso. Sin embargo, las formulaciones ensayadas en la solución de moco cervical alcanzaron un
índice de hinchamiento menor que en agua, lo cual podría atribuirse a que esta solución presenta
una mayor viscosidad a 37 °C que el agua a 23 °C.
v
DEDICATORIA
A mi papá, siempre en mi corazón,
A mi mami, la mejor amiga que la vida me ha podido dar,
A mis cuchis, mis segundos padres.
vi
AGRADECIMIENTO
En primer lugar le agradezco a Dios por iluminar mi camino y permitirme alcanzar esta
meta tan importante en mi vida.
Quiero agradecerle al Dr. Christopher Batich por darme la oportunidad de realizar la
presente investigación en la Universidad de Florida. Al Dr. Bradley Willenberg por su tutoría, y
ayuda en el proyecto. Al. Dr. Gregory Schultz por permitirme trabajar en su laboratorio. A
Prateek Waste por su colaboración al comienzo del proyecto. A Scott Cooper por brindarme
ayuda en el laboratorio cuando más la necesité. Y a Titi y a Pinky por su apoyo en el “Batich
Research Group”.
Le quiero dar las gracias también a mi tutora académica, mi Prof. Evis Penott, quien a
pesar de la distancia utilizó los medios necesarios para guiarme, supervisarme y ayudarme con el
proyecto. Así como al Prof. Marco Sabino por su guía y aporte de conocimientos a pesar de no
ser mi tutor. También, agradezco a los demás profesores y personas que han contribuido en mi
formación profesional. Y a la Universidad Simón Bolívar.
A mi mami, quien es mi ejemplo a seguir, por absolutamente todo: formarme, guiarme,
aconsejarme, permitirme dar siempre un paso adelante, por apoyarme incondicionalmente en
todas las metas que me he propuesto, teniendo o no a la mano las facilidades. Por estar conmigo
siempre.
A mi papá, por su guía y enseñanzas hasta su último día de vida. Por sus sonrisas, chistes
y regaños que me formaron quien soy. En estos 6 años ha estado en mi corazón y lo estará por
siempre. Porque siempre que he vivido algo importante, ha estado en mis sueños, y, aunque es lo
más cercano a la realidad que puedo tener, sé que estará conmigo en cada momento especial.
A mis cuchis, mis segundos padres, quienes siempre han cuidado de mí. Y a mi herma
Davi y Julio, quienes son mi compañía en la casa.
vii
A mis vecis Marina y Gaby, quienes más que vecinas son mi familia.
A mis tíos Belza y Luis, por la ayuda que me han brindado en todo momento.
A Rich, tía Mery y Zaida. Gracias por recibirme y compartir juntos las navidades. Su
ayuda fue primordial para cumplir la pasantía, gracias por ayudarme desde el primer momento
hasta el último día que regresé a Venezuela.
A mis favoritas, mis primas Daya y Day por estar siempre conmigo. Las amo!
A mis gorditas Ana y Marbe, quienes estuvieron conmigo desde el colegio y en toda la
universidad. Sin duda alguna, esta etapa no hubiera sido tan divertida sin el trío ternura pal
mundo! Muchas experiencias juntas que jamás olvidaré.
A mis amigos, con quienes compartí mucho más tiempo que con mi propia familia: Kari,
Miren, Lili, Moi, Laura, Mariana, Ronild y a mi gente de Baja SAE USB. A Adalberto, mejor
conocido como “el viejo”, mi mejor amigo, quien siempre ha estado presente; gracias por
brindarme tu amistad incondicional. De igual forma le agradezco a Jorge por estar conmigo a
pesar de la distancia y ahora ser un recuerdo importante en mi vida. Gracias por todos los lindos
momentos; la universidad no hubiera sido tan amena sin ninguno de ustedes.
A Mary, Diego; la familia Quintero por abrirme las puertas de su hogar cuando estuve de
visita en Miami, para celebrar ese ameno “thanks giving”.
A mi gente de Gainesville: Pinar y Nathan, no pude tener mejores “roommies”. A mis
mejores amigos Alex y Luis, Ari Pa, Ariana, Francia; a “el grupo” Sonia, Martita, Esli, Mayra,
Kimmel, Cristóbal; así como Mafer, Elena, y demás personas con las que compartí. Jamás los
olvidaré. Mi estadía en Gainesville no hubiera sido la misma sin haberlos conocido, por eso les
agradezco enormemente por cada uno de esos recuerdos que ahora quedan en mí.
viii
ÍNDICE GENERAL
Pág.
RESUMEN
iv
DEDICATORIA
v
AGRADECIMIENTOS
vi
ÍNDICE GENERAL
viii
ÍNDICE DE TABLAS
x
ÍNDICE DE FIGURAS
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
INTRODUCCIÓN
xiv
1
Objetivo General
3
Objetivos Específicos
3
CAPÍTULO 1: MARCO TEÓRICO
1.1. Descripción de la Empresa
4
1.2. Sistema de Transporte de Fármacos
5
1.3. Bioadhesión
6
1.4. Factores que influyen en la mucoadhesión
8
1.5. Métodos de mucoadhesión
9
1.6. Polímeros en el transporte de fármacos mucoadhesivos
1.6.1. Hidrogeles
11
13
1.6.1.1. Alginato
13
1.6.1.2. Gel de alginato con capilares de cobre
16
1.7. Gelatina
16
1.8. Cisteína
18
1.9. Carbodiimidas
19
1.10. Evaluación de las propiedades mucoadhesivas
21
CAPÍTULO 2: MARCO EXPERIMENTAL
2.1. Materiales
25
2.2. Procedimiento
26
2.2.1. Síntesis de hidrogeles GCCAG
26
ix
2.2.2. Síntesis del moco cervical
30
2.2.3. Caracterización macroscópica
31
2.2.4. Caracterización físico-química: Microscopía Electrónica de
31
Barrido/Espectrometría
de Energía
Dispersiva de Rayos
X
(MEB/EDX)
2.2.5. Evaluación de la mucoadhesión
33
2.2.6. Estudio de hinchamiento de los hidrogeles
34
CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.1. Caracterización Macroscópica
3.2.Caracterización
Físico-Química:
35
Espectroscopia
Electrónica
de
38
Barrido/Espectrometría de Energía Dispersiva de Rayos X (SEM)
3.3. Evaluación de la mucoadhesión mediante un analizador de textura
46
3.4. Estudio de hinchamiento de los hidrogeles
52
3.4.1. Índice de hinchamiento de los hidrogeles sumergidos en agua
53
3.4.2. Índice de hinchamiento de los hidrogeles sumergidos en moco.
57
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
60
REFERENCIAS
63
APÉNDICES
Apéndice A. Determinación de la cantidad de EDC y sulfo-NHS requeridos en la
73
reacción de entrecruzamiento del GCCAG.
Apéndice B. Gráfico del ensayo mucoadhesivo del hidrogel 0,4-GCCAG obtenido
74
a través del analizador de textura.
Apéndice C. Gráfico del ensayo mucoadhesivo del hidrogel 0,4-GCCAG-Cist
75
obtenido a través del analizador de textura
Apéndice D. Gráfico del ensayo mucoadhesivo del hidrogel 0,5-GCCAG obtenido
76
a través del analizador de textura
Apéndice E. Gráfico del ensayo mucoadhesivo del hidrogel 0,5-GCCAG-Cist
77
obtenido a través del analizador de textura
Apéndice F. Datos para determinar el índice de hinchamiento de los hidrogeles
sumergidos en agua desioniazada a 23 °C.
78
x
ÍNDICE DE TABLAS
Pág
Tabla 2.1. Propiedades del alginato usado.
25
Tabla 2.2. Propiedades de las sustancias utilizadas en la reacción de
25
entrecruzamiento del CCAG
Tabla 2.3. Descripción de las sustancias empleadas en la formulación del moco
26
cervical sintético
Tabla 2.4. Formulación del Moco Cervical Sintético
31
Tabla 3.1. Fuerza Máxima de Desprendimiento (mN).
47
Tabla 3.2. Trabajo de Adhesión (µJ).
48
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Fig. 1.1. Etapas del proceso de la mucoadhesión.
10
Figura 1.2. Representación esquemática del proceso de absorción de agua
12
en los hidrogeles.
Fig. 1.3. Características estructurales de los alginatos: (a) monómeros de
14
alginato, (b) conformación de la cadena y (c) distribución en bloques.
Fig. 1.4. Modelo de la caja de huevos
divalentes
para enlaces de cationes
15
on bloques homopoliméricos de residuos de α- L –
guluronato, y probablemente sitio de unión en una secuencia GG.
Fig. 1.5. Proteínas contenidas en la gelatina
17
Fig. 1.6. Estructura molecular de la cisteína
18
Fig. 1.7. EDC 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida
19
Fig. 1.8. Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)
20
Fig. 1.9. Propuesta de la secuencia de reacción durante la modificación
21
química del alginato con cisteína, utilizando EDC y sulfo-NHS como
agentes entrecruzantes, a 4 °C y en PBS (pH = 7,4).
Fig. 1.10. Curva Fuerza vs Distancia obtenida del analizador de textura
23
Fig. 1.11. Probeta TA-57R de 7mm empleada en ensayos mucoadhesivos.
24
Fig. 2.1. Esquema de las reacciones involucradas para la síntesis del
30
GCCAG con cisteína
Fig. 2.2. Equipo utilizado para liofilizar las muestras antes de su
32
caracterización físico-química
Fig. 2.3. Analizador de textura TA.XT. Plus
33
Fig. 2.4. Montaje del ensayo mucoadhesivo usando el analizador de
34
textura
Fig. 3.1. Hidrogeles de alginato con capilares de cobre (A) y (B) antes de
la reacción de entrecruzamiento; (C) después de agregar PBS, Sulfo-NHS
y Cisteína; (D) después de agregar EDC, completando la reacción de
entrecruzamiento.
37
xii
Fig. 3.2. Morfología macroscópica del gel de alginato con capilares de
38
cobre sin entrecruzar (CCAG) y después del entrecruzamiento (GCCAG),
reportado por Willenberg et al.
Fig. 3.3. Hidrogel (A) antes de la reticulación (CCAG); (B) después de la
39
reticulación y posterior liofilización (GCCAG); (C) una vez sumergidos
en agua para la determinación del grado de hinchamiento.
Fig. 3.4. Imágenes MEB y EDX correspondientes a la muestra 0,4-
40
GCCAG sin cisteína. (A) Morfología de dos planos de la muestra a 35X;
(B) morfología a 100X de los capilares de una sección perpendicular al
eje longitudinal de capilares; (C) espectro EDX
Fig. 3.5. Imágenes MEB y EDX correspondientes a la muestra 0,4-
41
GCCAG-Cist (A) Morfología a 35X, se presentan dos planos de la
muestra; (B) morfología a 100X de los capilares de una sección
perpendicular al eje longitudinal de capilares; (C) espectro EDX.
Fig. 3.6. Imágenes MEB correspondientes a las muestras 0,5-GCCAG-
42
Cist. (A) 35X con cisteína.; (B) 100X sin cisteína; (C) 100X con cisteína;
(B) y (C) morfología de los capilares de una sección perpendicular al eje
longitudinal de capilares.
Fig. 3.7. (A) Morfología del MEB a 100X de la sección perpendicular al
44
eje longitudinal de capilares y (C) espectro EDX correspondientes a las
muestras 0,5-GCCAG; (B) Morfología de los capilares de una sección
perpendicular al eje longitudinal de capilares de un hidrogel 0,5-GCCAG
sintetizado por Willenberg et al.
Figura 3.8. Fuerza Máxima de Desprendimiento.
48
Figura 3.9. Trabajo de Adhesión.
49
Fig. 3.10. Fuerza (N) vs Distancia (mm) de una muestra de 0,4-GCCAG.
50
Fig. 3.11. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) de una muestra de 0,4-
50
GCCAG-Cist.
Fig. 3.12. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) de 0,5-GCCAG.
51
xiii
Fig. 3.13. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) de una muestra de 0,5-
52
GCCAG-Cist.
Fig. 3.14. Absorción de agua (%) en función del tiempo (h) para
54
hidrogeles de alginato con capilares de cobre a [CuSO4] = 0,4 M con
cisteína y sin cisteína, sumergidos en agua a 23 °C.
Fig. 3.15. A la izquierda: Índice de hinchamiento en peso (%) en función
54
del tiempo (h) para hidrogeles de alginato con capilares de cobre a una
[CuSO4] = 0,4 M con y sin cisteína, sumergidos en agua a 23 °C. A la
derecha: Gráfico anterior a bajos tiempos.
Fig. 3.16. Absorción de agua (%) en función del tiempo (h) para
55
hidrogeles de alginato con capilares de cobre a [CuSO4] = 0,5 M con
cisteína y sin cisteína, sumergidos en agua a 23 °C.
Fig. 3.17. A la izquierda: Índice de hinchamiento en peso (%) en función
56
del tiempo (h) para hidrogeles de alginato con capilares de cobre a una
[CuSO4] = 0,5 M con y sin cisteína, sumergidos en agua a 23 °C. A la
derecha: gráfico anterior a bajos tiempos.
Fig. 3.18. A la izquierda: Índice de hinchamiento en peso (%) en función
58
del tiempo (h) para hidrogeles de alginato con capilares de cobre a una
[CuSO4] = 0,4 M con y sin cisteína, sumergidos en una solución de moco
cervical a 37 °C. A la derecha: gráfico anterior a bajos tiempos.
Fig.3.19. A la izquierda: Índice de hinchamiento en peso (%) en función
58
del tiempo (h) para hidrogeles de alginato con capilares de cobre a una
[CuSO4] = 0,5 M con y sin cisteína, sumergidos en una solución de moco
cervical a 37 °C. A la derecha: gráfico anterior a bajos tiempos.
Figura B. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) del hidrogel 0,4-CCAG
71
Figura C. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) del 0,4-GCCAG-Cist
72
Figura D. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) del 0,5-GCCAG.
73
Figura E. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) del 0,5GCCAG-Cist
74
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
G: α-L-ácido gulurónico.
M: β-D-ácido manurónico.
CCAG: Hidrogel de alginato con capilares de cobre sin entrecruzar.
0,4-GCCAG: Hidrogel de alginato con capilares de cobre entrecruzado. El valor numérico 0,4 se
refiere a la concentración de CuSO4 utilizada en la síntesis (0,4 M).
0,5-GCCAG: Hidrogel de alginato con capilares de cobre entrecruzado. El valor numérico 0,5 se
refiere a la concentración de CuSO4 utilizada en la síntesis (0,5 M).
0,4-GGCCAG-Cist: Hidrogel de alginato con capilares de cobre entrecruzado, unido
covalentemente a la cisteína. El valor numérico 0,4 se refiere a la concentración de CuSO4
utilizada en la síntesis (0,4 M).
0,5-GGCCAG-Cist: Hidrogel de alginato con capilares de cobre entrecruzado, unido
covalentemente a la cisteína. El valor numérico 0,5 se refiere a la concentración de CuSO4
utilizada en la síntesis (0,5 M).
MEB: Espectroscopia Electrónica de Barrido.
EDX: Espectroscopia de Energía Dispersiva de Rayos X.
EDC: 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida.
Sulfo-NHS: N-hidroxisulfosuccinimida.
PBS: Buffer de Sales de Fosfato.
MDF: Fuerza Máxima de Desprendimiento.
TWA: Trabajo de adhesión.
Mw: Peso molecular
1
INTRODUCCIÓN
La ruta vaginal es comúnmente empleada para la administración de fármacos locales como
antimicrobiales, agentes espermicidas, prostaglandinas y esteroides. Paralelo a otras aplicaciones
en la mucosa, la vagina puede servir como una mejor ruta para la entrega de fármacos debido a
que permite una reducción de los efectos secundarios gastrointestinales; así como una reducción
en los efectos secundarios hepáticos, en el caso de algunos esteroides utilizados en terapias de
reemplazo hormonal. También evita las molestias causadas por el dolor, daño tisular y riesgo de
infecciones que se asocian a la vía parenteral, y facilita la auto-inserción y extracción de la forma
de dosificación.
La mucosa es una capa formada por el epitelio y el tejido conjuntivo subyacente que reviste las
paredes internas de los órganos: digestivos (cavidad oral, faringe, esófago, estómago, intestino
delgado, colon y recto), respiratorios (mucosa nasal, tráquea y bronquios), urológicos (uretra,
vejiga, uréteres) y genitales femeninos (parte de la vulva y vagina). Tiene como principales
funciones la protección, secreción y absorción, y suele estar asociada a numerosas glándulas
secretoras de moco. En comparación con todas las membranas mucosas, la mucosa vaginal ofrece
la ventaja de que los sistemas de administración de fármacos puedan permanecer por un tiempo
más largo en el sitio requerido.
El efecto de un fármaco puede ser optimizado mediante el uso de polímeros mucoadhesivos que
incrementen su tiempo de residencia en la mucosa, proporcionando una tasa de liberación
controlada con una duración adecuada para producir el efecto deseado dentro del organismo. Se
han realizado diversos estudios que se mencionarán a lo largo del trabajo, sobre las propiedades
mucoadhesivas de algunos polímeros, con el fin de reforzar el efecto de los fármacos a partir del
desarrollo de nuevos sistemas de transporte que controlen su liberación. Por ejemplo, en el
transporte nasal, se requieren formulaciones mucoadhesivas que permanezcan localizadas en la
cavidad nasal por períodos de tiempo largos para incrementar la absorción. Se ha demostrado que
algunos polímeros mucoadhesivos incrementan la permeabilidad epitelial, tales como el
quitosano [1] y el poli(ácido acrílico) [2]. Por otra parte, en la vía ocular, las células globulares de
la superficie conjuntival secretan mucina; un mucopolisacárido que se extiende sobre la
2
superficie del ojo mediante el parpadeo. Los sistemas mucoadhesivos pueden interactuar con el
moco y prolongar el tiempo de residencia de la medicación y así aumentar su biodisponibilidad.
Por ejemplo, en la investigación de Mengi et al. [3] se compararon los hidrogeles de poli(ácido
acrílico) (PAA) (Carbopol 940) y poloxámeros (bloque de copolímero polioxietilenopolioxipropileno no iónico) con gotas para los ojos como un sistema de transporte del
flurbiprofeno en conejos. Ambas formulaciones de geles mostraron una acción sostenida, pero los
resultados fueron superiores en el caso del gel PAA, lo cual lo relacionaron con la mucoadhesión.
Mansour et al. [4] desarrollaron un poloxámero basado en formulaciones con hidrogeles e
hidroclorato de ciprofloxacina que mostró un control en la liberación y propiedades
mucoadhesivas debido a la adición de hidroxipropilmetil-celulosa o de hidroxietil-celulosa, e
incrementó la biodisponibilidad ocular en comparación con formulaciones convencionales
comercialmente disponibles del tipo gotas oculares.
En la administración de medicamentos por vía oral, el alginato demuestra tener un tiempo de
retención elevado en el tejido esofágico de la porcina, además resulta ser un vehículo potencial de
transporte de fármacos y proporciona una barrera para proteger el epitelio subyacente de reflujo
gástrico [5]. Varios sistemas mucoadhesivos gástricos, tales como comprimidos, gránulos, pellets
y partículas, demostraron un aumento del tiempo de retención en el estómago de ratas y perros [6,
7]. Al escoger los materiales empleados en el transporte de fármacos, éstos deben tener buena
biocompatibilidad, un control estructural sobre el tamaño y la forma del fármaco, una adhesión
celular apropiada, una aceptable biodegradación, y una liberación controlada de fármaco. Entre
estos materiales usados se encuentran los portadores poliméricos, como las microesferas, las
nanopartículas, los sistemas de anticuerpos rígidos, etc.
Debido a que el bajo tiempo de residencia de los sistemas de transporte de fármacos vaginales
causan una pobre función de éstos en los pacientes, se han estudiado polímeros que brindan una
solución a este problema. Los hidrogeles biocompatibles se han utilizado en aplicaciones
biomédicas como materiales en contacto con sangre, materiales en contacto con lentes, tendones
artificiales, dispositivos de liberación controlada, materiales bioadhesivos, entre otras [8].
Witchterle y Lim [9] fueron los primeros en reportar la síntesis de hidrogeles utilizando poli(2hidroxietil metacrilato) y a partir de entonces se ha incrementado el número de publicaciones
3
sobre hidrogeles desde finales de los 70 hasta hoy en día [10]. Willenberg et al. [11] sintetizaron
geles de alginato en presencia de capilares de cobre (CCAG según sus siglas en inglés, Copper
Capillary Alginate Gel) como una herramienta modular de tejido de andamio. En la presente
investigación se trabajó con hidrogeles de alginato en presencia de capilares de cobre y cisteína
para evaluar la influencia de la cisteína en las propiedades mucoadhesivas de estos hidrogeles,
como su uso en el sistema de transporte para fármacos vaginales.
Objetivo General
Estudiar la influencia de la cisteína en las propiedades mucoadhesivas del alginato con
capilares de cobre, como su uso en el sistema de transporte de fármacos vaginales.
Objetivos Específicos

Sintetizar hidrogeles de alginato con capilares de cobre unidos covalentemente a la
cisteína.

Sintetizar moco cervical.

Caracterizar la morfología y composición de los hidrogeles usando microscopia
electrónica de barrido y espectroscopia de energía dispersiva de rayos X (MEB/EDX).

Evaluar las propiedades mucoadhesivas de los hidrogeles mediante un analizador de
textura.

Evaluar el hinchamiento de los hidrogeles en distintas condiciones fisiológicas.
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TEÓRICOS
1.1. Descripción de la Empresa
La presente investigación fue realizada en el “Batich Research Group” del Departamento de
Ciencia e Ingeniería de los Materiales ubicados en la Facultad de Ingeniería en la Universidad de
Florida (UF).
La UF se encuentra localizada en Gainesville y fue fundada en 1910. En el año 1967 se
construyó el primer edificio para la carrera de Ciencia e Ingeniería de los Materiales, la cual se
encuentra actualmente entre los ocho programas de pregrado y postgrado más reconocidos de las
Universidades de los Estados Unidos [12].
El Departamento de Ciencia e Ingeniería de los Materiales ofrece educacionalmente un
programa que trata temas científicos e ingenieriles de las estructuras, propiedades,
síntesis/procesamiento/manufactura y aplicaciones de los materiales. Está involucrado en el
desarrollo de nuevos materiales que aborden situaciones críticas que enfrenta actualmente la
sociedad, relacionado con la energía, sostenibilidad y cuidado de la salud [12]. Posee gastos en
investigaciones de más de 10 millones de dólares al año, provenientes de contratos externos. Con
la ideología de que la investigación es la enseñanza, los estudiantes están involucrados en
muchos proyectos de investigación y desarrollo. Este departamento cuenta con alrededor de 30
profesores distinguidos, 30 científicos e investigadores becados y con más de 300 estudiantes, lo
que incluye unos 200 estudiantes de postgrado, 150 de pregrado y 20 de personal técnicos y
soporte [12].
A nivel de pregrado, ofrecen títulos en Ciencia e Ingeniería de los Materiales con especialidad
en cerámicas, materiales electrónicos, metalurgia y polímeros. A nivel de postgrado, ofrece un
amplio rango de oportunidades en investigaciones en las áreas de biomateriales, cerámicas,
materiales electrónicos, metales y polímeros [12].
5
1.2. Sistema de Transporte de Fármacos
Un sistema de transporte de fármacos se define como un dispositivo capaz de introducir una
sustancia terapéutica dentro del organismo para incrementar su eficacia controlando su velocidad,
tiempo de residencia y lugar de liberación. Este proceso comprende desde la administración del
producto terapéutico, hasta la liberación de los ingredientes activos del mismo y su transporte a lo
largo de las membranas biológicas del sitio de acción [13].
La vagina proporciona un sitio prometedor para el transporte de fármacos sistémicos y locales
como los agentes antibacterianos, antivirales, y antiinflamatorios. Se ha demostrado que esta vía
le proporciona una buena permeabilidad a una amplia gama de compuestos que incluyen péptidos
y proteínas y hace que la vía vaginal sea una alternativa a las rutas parenterales de fármacos,
como bromocriptina, oxitocina, calcitonina, hormona de crecimiento y esteroides, utilizados
como terapia de reemplazo o anticoncepción [14]. Sin embargo, a pesar de estas ventajas, la ruta
vaginal para el transporte de fármacos sistémicos es muy específica porque depende del espesor
epitelial, el fluido vaginal y el moco cervical (volumen, viscosidad y pH) de cada persona, en
función de la edad, hormonas y el ciclo menstrual.
El moco cervical en un gel visco-elástico, compuesto por agua y mucina en un 99% de su
composición total. Actúa como un filtro biológico, impidiendo la entrada de la flora bacteriana a
la vagina y mejorando la supervivencia del esperma. Es un elemento esencial en la concepción;
sus propiedades físicas cambian predeciblemente durante el ciclo menstrual, y se produce en
respuesta a la acción de las hormonas estrógeno y progesterona. Dependiendo del contenido de
agua, la cual varía durante el ciclo menstrual, el moco funciona como barrera o como medio de
transporte de los espermatozoides. Durante la primera mitad del ciclo, antes de la mitad del ciclo
de ovulación, se incrementa la hormona de estrógeno, generándose un moco cervical acuoso,
abundante, claro y elástico. Después de la ovulación, las características físicas del moco cambian
en respuesta al incremento de los niveles de progesterona que lo hacen más espeso, y reducen su
cantidad a medida que el ciclo termina. La mitad del ciclo representa la mejor oportunidad para
una introducción exitosa del esperma, farmacéuticos, y aplicaciones similares designadas para ser
penetradas al sistema uterino debido al decrecimiento de la visco-elasticidad del moco. La
6
composición del moco cervical en esta etapa del ciclo, está compuesto por 1-1,5% de electrolitos
(calcio, sodio y potasio), alrededor de 0,5 a 1% de proteínas, 0,5 a 1% de lípidos, de 0,5 a 5% de
glicoproteínas, y alrededor de 95% de agua, con un pH de 7,4 [15].
La estructura gelatinosa del moco puede atribuirse a los enredos intermoleculares de las
glicoproteínas de la mucina con las interacciones no covalentes (ej. puentes de hidrógeno) que da
lugar a la formación de una estructura hidratada gelatinosa y a su naturaleza visco-elástica. Las
mucinas son una familia de glicoproteínas con alto peso molecular. El moco cervical está
compuesto por glicoproteínas de mucinas, de plasma y otras proteínas como lactoferrina, diversas
enzimas, aminoácidos, colesterol, lípidos e iones inorgánicos, cuyas concentraciones fluctúan
durante el ciclo menstrual [16].
Al evaluar polímeros mucoadhesivos resulta importante estudiar el fenómeno de la
bioadhesión.
1.3. Bioadhesión
El concepto de la bioadhesión comenzó a usarse en sistemas de transporte de fármacos, al
incorporar moléculas adhesivas a formulaciones farmacéuticas, con el fin de mantenerlas en
contacto directo con la membrana de absorción, manteniendo el fármaco en el sitio de acción. La
bioadhesión puede ser definida como el estado en el que un polímero natural o sintético puede
adherirse a un substrato biológico y mantenerse unido por un período de tiempo prolongado
debido a fuerzas interfaciales [17].
Cuando el substrato biológico se trata de una membrana mucosa, este fenómeno es conocido
como mucoadhesión. La mucoadhesión en el sistema vaginal es relevante debido a los
mecanismos de auto-limpieza dentro de la vagina, además de las funciones fisiológicas normales
que pueden limitar el grado de contacto entre la mucosa vaginal y la aplicación del bioadhesivo.
En un intento por superar los problemas asociados con la pobre retención del fármaco, los
polímeros mucoadhesivos ofrecen la posibilidad de una mayor retención del producto.
7
Los polímeros mucoadhesivos son macromoléculas sintéticas o naturales capaces de adherirse a
superficies mucosas. Este concepto ha sido introducido en la literatura farmacéutica desde 1947,
cuando se trató de formular un sistema de transporte de fármacos de penicilina para liberar el
agente bioactivo a la mucosa oral usando goma tragacanto y adhesivo dental en polvo. Los
resultados mejoraron cuando se utilizó carboximetilcelulosa y vaselina, y así se fueron empleado
otros polímeros para el desarrollo de las formulaciones [18]. Actualmente, son varios los
biopolímeros que poseen estas características y han sido usados en la medicina, como una
estrategia para prolongar el tiempo de residencia e impulsar la localización específica del sistema
de fármacos en distintas membranas [19-21]. Después de varias investigaciones realizadas en los
últimos años, se ha podido concluir que los polímeros que tienen suficientes propiedades
mucoadhesivas son aquellos que pueden formar puentes de hidrógeno intermoleculares fuertes
con la membrana mucosa, aquellos capaces de adherirse rápidamente a esta membrana sin
producir en ella ningún cambio físico, que tienen una mínima interferencia de la liberación del
agente activo, que son biodegradables sin producir ningún subproducto tóxico, y que aumentan la
penetración del agente activo (si el agente activo está destinado a ser absorbido por el sitio de
liberación) [16].
La bioadhesión ocurre debido a interacciones físicas o químicas. Las primeras se basan en la
formación de puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals y enlaces hidrofóbicos; y las
segundas incluyen la formación de enlaces iónicos y covalentes. Los puentes de hidrógeno se
forman por la interacción entre átomos electronegativos y electropositivos sin la transferencia de
electrones. Las fuerzas de Van der Waals se deben a la presencia de interacciones dipolo-dipolo
en moléculas polares o debido a las fuerzas de dispersión de los substratos no polares. Los
enlaces hidrofóbicos son formados por la interacción de grupos no polares cuando los polímeros
se dispersan en soluciones acuosas. Los enlaces iónicos se forman por interacciones
electrostáticas entre iones de cargas opuestas del polímero con la membrana mucosa, por
ejemplo, la formación instantánea de la estructura gelificada producto de la mezcla de soluciones
de alginato y quitosano en agua; mientras que los enlaces covalentes se forman por el intercambio
de electrones de los orbitales atómicos [22].
8
Existen algunos factores que pueden alterar la interacción del polímero con la membrana
mucosa, afectando sus propiedades mucoadhesivas; unos de estos factores están relacionados con
el ambiente en donde ocurre la adhesión y otros con el tipo de polímero adherido a la mucosa.
1.4. Factores que influyen en la mucoadhesión
Los polímeros usualmente se difunden en la capa mucosa y luego se adhieren a dicha capa
mediante la formación de enredos intermoleculares. Cuando se incrementa el peso molecular de
las cadenas poliméricas, se aumenta la mucoadhesividad del polímero. En general, los polímeros
que tienen un peso molecular mayor a 100.000 g/mol, poseen propiedades mucoadhesivas
adecuadas para aplicaciones biomédicas, por ejemplo, el poli(etilén glicol) (PEG) con un peso
molecular de 20.000 g/mol muestran propiedades mucoadhesivas despreciables, mientras que el
PEG de 400.000 g/mol tienen una excelente mucoadhesión [23]; también el poli(ácido acrílico)
de 750.000 g/mol y el poli (óxido de etileno) de 4.000.000 g/mol exhiben buenas propiedades
mucoadhesivas [24]. Por otra parte, con el incremento de la longitud de la cadena polimérica,
ocurre un aumento de sus propiedades mucoadhesivas. Los polímeros de cadenas flexibles
permiten una mejor penetración y entrelazamiento de sus cadenas con la mucosa, mejorando la
bioadhesividad. La flexibilidad de las cadenas del polímero suele verse afectada por las
reacciones de entrecruzamiento e hidratación de la red polimérica: a mayor densidad de
entrecruzamiento, menor flexibilidad de las cadenas. Además de la disminución en la flexibilidad
de las cadenas poliméricas, el entrecruzamiento reduce la difusión de agua dentro de la matriz
polimérica entrecruzada. Sin embargo, es necesaria una hidratación suficiente de la red
polimérica para la apertura de los poros dentro de la matriz, ya que, permite la movilización de
las cadenas [25]. Por lo tanto, una matriz polimérica altamente entrecruzada limita la
interpenetración del polímero y las cadenas de la mucina entre ellos mismos, lo cual se traduce en
la disminución del esfuerzo mucoadhesivo [26].
La formación de puentes de hidrógeno entre los grupos funcionales de los polímeros y de la
membrana mucosa también juega un papel importante. En general, fuertes puentes de hidrógeno
generan una fuerte adhesión. Los grupos funcionales responsables de este tipo de interacción
incluyen los grupos tipo amino, carboxilos e hidroxilos [16].
9
Además de los factores físicos y químicos de los polímeros, existen factores ambientales que
pueden afectar la mucoadhesión. Como se mencionó anteriormente, la mucoadhesividad depende
de la presencia de grupos funcionales los cuales pueden ionizar hasta dar una distribución de
cargas en las cadenas poliméricas. Esta ionización de grupos funcionales es dependiente del pH
del medio externo. Por lo tanto, el cambio en el pH del medio ambiente externo es importante en
la adaptación de la mucoadhesión.
El tiempo de contacto entre la matriz polimérica y la capa mucosa puede influir en la
mucoadhesión. Con el incremento inicial en el tiempo de contacto hay un incremento en la
hidratación de la matriz y una subsecuente interpenetración de las cadenas del polímero. La
fisiología de la mucosa va a depender de la naturaleza patofisiológica del cuerpo humano, por
ejemplo, la textura y espesor de la mucosa [27].
1.5. Métodos de Mucoadhesión
El proceso de mucoadhesión se divide principalmente en dos etapas: la etapa de contacto y la
etapa de consolidación (figura 1.1). La primera consiste en el contacto entre la membrana
mucoadhesiva y la mucosa, con difusión e hinchamiento de la formulación, iniciando su profundo
contacto con la membrana mucosa. La segunda es la etapa de la consolidación, en la que los
materiales mucoadhesivos son activados por la presencia de humedad, la cual plastifica el sistema
y permite que las moléculas mucoadhesivas se liberen y se unan por fuerzas de Van der Waals y
puentes de hidrógeno. Existen dos teorías que explican esta etapa: la teoría de difusión y la de
deshidratación. Según la teoría de difusión, las moléculas mucoadhesivas y las glicoproteínas de
la mucosa mutuamente interactúan por interpenetración de sus cadenas y por la generación de
enlaces secundarios. De acuerdo a la teoría de la deshidratación, los materiales son capaces de
gelificar rápidamente en medio acuoso cuando se ponen en contacto con la mucosa, y pueden
causar su deshidratación debido a la diferencia de presión osmótica. La diferencia en el gradiente
de concentración se basa en la presencia de agua dentro de la formulación hasta que alcanza el
equilibrio osmótico. Este proceso permite la unión entre la formulación y la mucosa e incrementa
el tiempo de contacto. Por lo tanto, la consolidación del enlace adhesivo se debe al movimiento
10
del agua y no a la interpenetración de las cadenas macromoleculares. Esta teoría no aplica para
formulaciones sólidas o altamente hidratadas [28]
Fig. 1.1. Etapas del proceso de mucoadhesión [28].
Para el estudio de farmacéuticos vaginales y los métodos de transporte de fármacos, resulta
importante conocer los conceptos de membrana mucosa y moco cervical que es el lugar donde el
fármaco se adhiere y donde se evalúan las propiedades mucoadhesivas.
1.6. Polímeros en el Transporte de Fármacos Mucoadhesivos
Los polímeros utilizados en el desarrollo de sistemas vaginales incluyen mucina, gelatina,
policarbofil y poloxamer, entre otros [29-31]. Un tipo de polímeros que pueden ser usados en
sistemas mucoadhesivos son los polímeros hidrofílicos, los cuales son solubles en agua. Las
matrices desarrolladas con estos polímeros se hinchan cuando se ponen en contacto con un medio
acuoso. Los polielectrolitos tienen mayores propiedades mucoadhesivas que los polímeros
neutrales. Por ejemplo, los polielectrolitos aniónicos, como los poli(ácido acrílico) y la
carboximetil celulosa han sido usados con este propósito por formar fuertes puentes de hidrógeno
con la mucina presente en la membrana mucosa [32]. El quitosano es un buen ejemplo de un
polielectrolito catiónico que ha sido usado como un polímero mucoadhesivo debido a su buena
biocompatibilidad y biodegradabilidad [33]; además cuando este polímero es sometido a
interacciones electrostáticas con la carga negativa de la mucina, exhibe propiedades
mucoadhesivas.
11
1.6.1. Hidrogeles
En general, se desea obtener un material, que se cargue con el principio activo del
medicamento, que responda a estímulos del ambiente y puedan liberar su carga en el lugar, el
tiempo y la velocidad deseada. Los hidrogeles son redes tridimensionales conformadas por
cadenas poliméricas flexibles que se caracterizan por ser hidrofílicos, suaves y elásticos. Se
hinchan en presencia de agua y se encogen en ausencia de ella, preservando en ambos casos su
forma general hasta alcanzar su equilibro fisicoquímico. La hidrofilicidad, la cual es la propiedad
que caracteriza la afinidad de una molécula con el agua, se debe a la presencia de grupos
funcionales hidrofílicos como los grupos tipo carboxilos, aminos e hidroxilos. La cantidad de
hinchamiento se determina por la naturaleza del polímero, principalmente por su hidrofilicidad y
la densidad de entrecruzamiento; las cadenas de hidrogeles se entrecruzan usualmente para
mantener su estructura tridimensional.
Cuando un hidrogel se pone en contacto con el agua, ocurre la difusión de la misma dentro del
polímero ocasionando su hinchamiento. Este hinchamiento se atribuye al volumen libre de la
molécula polimérica, el cual es ocupado rápidamente por el agua. Luego se da una segunda etapa
donde la absorción se hace más lenta, debido a que el volumen libre disminuye ocurriendo por
tanto el estiramiento entero de la red hasta alcanzar el equilibrio termodinámico. Esto le impide al
hidrogel absorber más cantidad de agua, manteniendo su peso a través del tiempo. Este proceso
está representado en la figura 1.2.
12
Fig. 1.2. Representación esquemática del proceso de absorción de agua en los hidrogeles.
La capacidad de absorción de agua que está determinada por el estado de equilibrio
hinchado se debe al balance que ocurre entre las fuerzas osmóticas, debidas al agua que entra en
la red, y las fuerzas que ejercen las cadenas poliméricas en oposición a esa expansión. El proceso
de obtención del hidrogel determina la capacidad de hinchamiento que este tendrá, dado que los
espacios que se establezcan entre las redes poliméricas flexibles que se formen en dicho proceso
determinará la cantidad de agua que el hidrogel pueda albergar. Esta flexibilidad a su vez se ha
mostrado que es función del peso molecular, el grado de pureza del polímero y de su
concentración en solución acuosa, además de factores propios del método físico o químico de
síntesis. [8].
Se ha demostrado que los hidrogeles poseen muy buenas propiedades para ser cargados con
medicamentos, por ser biocompatibles y presentar propiedades de hinchamiento en medio
acuoso, entre otras características de interés, lo que los perfila como una buena opción para ser
usados en la liberación controlada de medicamentos. Poseen una buena interacción con tejidos
vivos, ya que, por un lado muestran buenas propiedades de biocompatibilidad, principalmente por
su consistencia suave, elasticidad y contenido de agua; y por otro lado, son materiales inertes, las
células y proteínas no tienden a adherirse a su superficie [34].
13
Existen dos tipos de hidrogeles. Los químicos, cuyas cadenas poliméricas están unidas por
enlaces covalentes lo cual dificulta que cambien su forma, es decir, sus cadenas se encuentran
entrecruzadas y alcanzan un estado de equilibrio de hinchamiento sin disolverse, aunque se
encuentren a altas temperaturas. Mientras que los hidrogeles físicos, tienen sus cadenas
vinculadas a través de enlaces no covalentes, tales como, interacciones Van der Waals,
interacciones iónicas, puentes de hidrógeno o interacciones hidrofóbicas. [8].
1.6.1.1. Alginato
El alginato es un polímero hidrofílico utilizado en sistemas mucoadhesivos. Fue descubierto en
1880 por el químico británico E.C.C Standford, y corresponde a una familia de polisacáridos,
obtenida de la digestión álcali de diversas algas marinas marrones, principalmente de la
Phaeohycea. El alginato es un copolímero binario no ramificado, compuesto por residuos α-Lácido gulurónico (G) y β-ᴅ-ácido manurónico (M) de variada composición y secuencia (figura 1.3
a y b). Aunque se consideraba que el ácido algínico era un polímero compuesto únicamente por
ᴅ-ácido manurónico unido a enlaces β-1,4, se observó que los alginatos obtenidos a partir de
diferentes materias primas, eran químicamente idénticos a cualquier muestra dada de ácido
algínico. Por hidrólisis parcial, el alginato se separó en tres fracciones; dos de ellas con
homopolímeros G y M, mientras que la tercera fracción consistía en proporciones casi iguales de
ambos monómeros con un gran número de residuos dímeros MG. De lo anterior se puede decir
que el alginato es un copolímero natural en bloque compuesto por regiones homopoliméricas de
M y G, denominados bloques M y G respectivamente, intercalados por regiones de estructura
alterna (bloques MG; figura 1.3 c). Posteriormente fue demostrado que los alginatos no tenían
una unidad repetitiva regular y que no podía predecirse la distribución de monómeros a lo largo
de la cadena polimérica [35, 36].
14
Fig. 1.3. Características estructurales de los alginatos: (a) monómeros de alginato, (b)
conformación de la cadena y (c) distribución en bloques [36].
Comparado con otros polisacáridos gelificantes, la característica más resaltante entre las
propiedades físicas del alginato es la unión selectiva de cationes multivalentes; los alginatos
forman geles coloidales (hidrogeles o geles con alto contenido de agua) con cationes divalentes,
lo cual sirve como base para la formación del gel. Los experimentos que involucran diálisis en
equilibrio han mostrado que la unión selectiva de ciertos iones alcalinos aumenta notablemente
con el incremento del contenido de residuos α- L -guluronatos en las cadenas. La alta selectividad
entre iones similares como los alcalinos, indican que la gelación se lleva a cabo por
características estructurales de los bloques G. Este fenómeno se explica por un modelo llamado
“caja de huevos” [37], basada en la conformación de residuos α- L -guluronatos. Cuando no hay
presencia de iones de calcio, las cadenas del alginato se encuentran en forma de hélices
mantenidas por puentes de hidrógeno. En presencia de iones divalentes y polivalentes, los
alginatos son capaces de formar geles. Un ión de calcio presenta dos cargas positivas (Ca2+)
capaces de combinar dos grupos funcionales COO- libres de la molécula de alginato. Estos iones
de calcio forman puentes uniendo dos cadenas de alginato con alto contenido de bloques G,
creando la estructura conocida como “caja de huevos” (Fig. 1.4). Si el número de iones de calcio
es pequeño la red de alginato sólo produce soluciones viscosas, pero a medida que aumenta el
número de iones la solución se convierte gradualmente en un gel.
15
Fig. 1.4. Modelo de la caja de huevos para enlaces de cationes divalentes con bloques
homopoliméricos de residuos de α-L-guluronato, y probablemente sitio de unión en una
secuencia GG [38].
La
serie
de
afinidad
de
iones
en
los
alginatos
es:
Pb2+>Cu2+>Ba2+>Ca2+>Zn2+>Ni2+>Co2+>Mn2+, donde el Ca2+ es el más usado para formar geles.
Sus propiedades de gelación difieren entre sí de acuerdo a su composición monomérica y a su
estructura en bloques. Es difícil determinar la composición molecular del alginato en términos de
la longitud y distribución de sus bloques, y por esto, son usualmente conocidos por su alto
contenido de M o G, según sea el caso. La mayoría de los productos comerciales tienen alto
contenido M, que proviene de la alga marina Macrocystis pyriferia, mientras que la Laminaria
hyperborea provee un alto contenido G. En general, los alginatos ricos en G son geles fuertes,
frágiles y térmicamente estables; mientras que los alginatos con alto contenido de monómeros M
son débiles, más elásticos y con menor estabilidad térmica [39].
Las principales aplicaciones industriales del alginato como un material polimérico natural se
encuentran ligadas a su estabilización y propiedades gelificantes y viscosificantes, además de su
habilidad de retener agua. Ha sido usado como recubrimiento de papel para obtener superficies
uniformes y en la producción de barras soldadas, ya que, brinda estabilidad en la fase húmeda y
funciones como plastificante durante el proceso de extrusión. Un ejemplo de aplicaciones
técnicas es el alginato de amonio, usado para el sellado de latas. El alginato también es usado
como aditivos para la producción de mermeladas bajas en azúcar, en jaleas y como rellenos en
frutas [40].
16
1.6.1.2. Gel de alginato con capilares de cobre (CCAG)
Los geles de alginato con capilares de cobre (CCAG, según sus siglas en inglés “Copper
Capillary Alginate Gel”) han sido descritos y estudiados previamente en la literatura [41-43]
como un material auto ensamblado que posee una aquitectura microtubular paralela y regular
formada por la difusión unidireccional de iones de Cu2+ en una solución viscosa de alginato.
Durante este proceso de difusión, se incrementan inestabilidades en el fluido por la fricción de las
fuerzas involucradas en la contracción de las cadenas poliméricas del alginato frente a la
formación del gel [42]. Debido a estas inestabilidades hidrodinámicas ocurre un proceso de
convección donde el sistema disipa energía y se forma una microestructura tubular. El diámetro
de capilar del gel se puede ajustar manipulando una de estas condiciones, o la combinación de
todas: concentración inicial de alginato, concentración inicial de Cu2+ o el pH del sistema [41,
42]. Desafortunadamente, los hidrogeles CCAG no pueden implementarse directamente como
tejidos de andamios porque el medio de cultura celular desplaza los iones de Cu2+ del CCAG,
provocando su hinchamiento, la pérdida de su integridad mecánica y su eventual disolución
después de algunas horas. Por ello en un estudio previo [11] se sintetizaron geles de alginato en
presencia de capilares de cobre en combinación con gelatina degradada y se entrecruzó con EDC
y Sulfo-NHS para prevenir su disolución en medio de cultivo, con el propósito de utilizarlos
como herramienta modular de tejido de andamio. En el presente trabajo se sintetizaron hidrogeles
de alginato en presencia de capilares de cobre y cisteína para emplearlos como transporte de
fármacos vaginales, evaluando la influencia de la cisteína en las propiedades mucoadhesivas de
estos hidrogeles.
1.7. Gelatina
La gelatina es un polímero que participa en la síntesis del CCAG de este trabajo. Es una
proteína de constitución molecular uniforme derivada por hidrólisis del colágeno proveniente de
los tejidos animales. Es ampliamente usado en industrias de alimentos, cosméticos y
farmacéuticos, por ejemplo, se utiliza como agente clarificante en vino y como estabilizante,
espesante y texturizador de una gama de productos. Se hincha y absorbe de 5 a 10 veces su peso
en agua y forma un gel en soluciones acuosas entre 30 y 35 °C. Su mecanismo de gelificación es
17
relativamente insensible al pH y a la concentración de iones, lo cual reduce el número de
variables experimentales a ser consideradas.
Tiene una amplia variedad de aplicaciones médicas gracias a que es admitida y reabsorbida por
el organismo. Se ha determinado que puede ser usada en esponjas hemostáticas reabsorbibles
[44], en la reparación de articulaciones y en vendajes de heridas [45]. También se han estudiado
microesferas de gelatina para la liberación de fármacos [46].
La gelatina es una mezcla heterogénea de proteínas solubles en agua de alto peso molecular.
Estas proteínas están compuestas por amino ácidos polimerizados juntos por la formación de
enlaces péptidos (aminas). La secuencia de aminoácidos predominante es Gly-Pro-Hyp que
representa: glicina (Gly) 26-34%, prolina (Pro) 10-18%, hidroxiprolina (Hyp) 7-15%. Otros
aminoácidos significantes incluidos son la alanina (Ala) 8-11%, arginina (Arg) 8-9%, ácido
aspártico (Asp) 6-7% y ácido glutámico (Glu) 10-12%.
-
O OC
O
+
H3N
-
O
Glicina
H 2N
+
Prolina
Fig. 1.5. Proteínas contenidas en la gelatina [47]
La glicina y la prolina componen la secuencia de aminoácidos predominante en la gelatina
(figura 1.5); son estructuras relativamente hidrofóbicas, o no polares. La glicina es el amino ácido
más simple, su cadena lateral consiste en un solo átomo de hidrógeno. La prolina es el único
iminoácido; es decir, su grupo amino no es un grupo amino primario como los demás
aminoácidos, sino es un grupo secundario. [47].
18
1.8. Cisteína
La cisteína (figura 1.6.) es un aminoácido cuya estructura tiene grupos tioles, que son no
polares, y por esto es clasificada como una estructura hidrofóbica. El tiol es susceptible a la
oxidación para generar puentes disulfuros derivados de la cisteína; cuando se unen dos cisteínas a
través de un puente disulfuro, esto se trata de un dímero y es conocida como cistina.
O
+
H3N
O
-
SH
Fig. 1.6. Estructura molecular de la cisteína.
Para incrementar las propiedades adhesivas de los polímeros, se han realizado diversas
investigaciones, por ejemplo, el uso del poli(etilén glicol) lineal para promover la adhesión en los
hidrogeles [48], la neutralización de polímeros iónicos [49], y el desarrollo de conjugados
polímero-adhesina [50], proporcionando un enlace específico al epitelio. La mayoría de los
sistemas están basados en la formación de enlaces no-covalentes como puentes de hidrógenos,
fuerzas Van de Waals e interacciones iónicas, los cuales proveen una adhesión débil la cual es en
muchos casos insuficiente como para garantizar la localización del sistema de transporte de
fármaco a un sitio dado [51].
Sin embargo, recientemente se ha estudiado un nuevo tipo de polímero mucoadhesivo, el cual
es capaz de formar enlaces covalentes con la membrana mucosa. Los polímeros con grupos tiol
interactúan con los subdominios ricos en cisteínas de las glicoproteínas del moco formando
puentes disulfuros entre el polímero mucoadhesivo y la membrana mucosa. Por ejemplo, el
policarbofil con cisteína y el quitosano con ácido tioglicólico son polímeros conjugados que
muestran más de dos veces las propiedades adhesivas en la mucosa que en el caso de polímeros
sin modificar [52]. El alginato es un polímero hidrofílico que ha mostrado tener propiedades
mucoadhesivas [53], y por la presencia de grupos de ácidos carboxílicos, permite que el grupo
sulfidrilo de la cisteína pueda unirse covalentemente a dicho gel, como se muestra en la figura
1.9.
19
No obstante, para realizar la síntesis de este nuevo material, es necesaria la adición de otras
sustancias químicas, como el EDC y el sulfo-NHS, que se encuentran dentro de la clasificación
de carbodiimidas.
1.9. Carbodiimidas
Las carbodiimidas son usadas para mediar en la formación de enlaces amidas entre un
carboxilato y una amina, o enlaces fosforamidatos entre un fosfato y una amina. Estos son
probablemente los agentes entrecruzantes más eficientes en formar conjugados entre dos
moléculas proteicas, entre un péptido y una proteína, entre oligonucleótidos y proteínas, o
cualquier otra combinación de estas moléculas. Existen dos tipos básicos de carbodiimidas, las
que son solubles y las que son insolubles en agua. Las primeras son las más comunes para
conjugaciones bioquímicas debido a que sus macromoléculas de origen biológico son solubles en
soluciones acuosas tipo buffer; mientras que las insolubles en agua son frecuentemente usadas en
la síntesis y otras conjugaciones de moléculas que son solubles únicamente en solventes
orgánicos [47].
Una de las carbodiimidas solubles en agua más empleadas comúnmente en la conjugación de
sustancias biológicas, es el EDC [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida] (figura 1.7) Este
químico es lábil en presencia de agua, por lo que debe ser almacenado a -20°C para evitar la
humedad del ambiente. Cuando se desee usar, debe llevarse a temperatura ambiente antes de
abrirlo para evitar la condensación que puede causar su descomposición con el tiempo. Se emplea
típicamente en el intervalo de pH 4,0 a 6,0 [47].
CH3
N
H3C
N
+
NH
CH3
Fig. 1.7. EDC [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida] [47].
20
El EDC es usado para modificar grupos carboxilos a aminas primarias. Se emplea con el
compuesto soluble en agua N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) (figura 1.8) para formar
grupos funcionales activos con grupos carboxilatos tipo éster. Los ésteres de sulfo-NHS son
grupos activos hidrofílicos que reaccionan rápidamente con las aminas y se hidrolizan lentamente
en agua. Sin embargo, en la presencia de nucleófilos tipo amina que pueden atacar al grupo
carbonil del éster, el grupo N-hidroxisulfosuccinimida crea un enlace de amida estable con la
amina. Los grupos hidroxilos y sulfidrilos también reaccionan con este éster activo, pero los
productos de estas reacciones, tioésteres y ésteres, son relativamente inestables.
O
O
S
O
-
O Na+
HO N
O
Fig. 1.8. Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) [47].
La ventaja de agregar sulfo-NHS a reacciones de EDC, es incrementar la estabilidad del
intermediario activo, el cual reacciona con la amina. El EDC se agrega en una solución de PBS a
bajas temperaturas (4 °C) para evitar posibles reacciones secundarias, y se combina en presencia
de sulfo-NHS con los grupos aminas que reaccionan con un grupo carboxilato proveniente del
alginato, para formar un éster activo (O-acilosurea). Este complejo reactivo está sujeto a una
rápida hidrólisis en soluciones acuosas. Si la amina que ataca no encuentra el carboxilato activo
antes de que éste hidrolice, no ocurre el acoplamiento deseado. El éster sulfo-NHS sobrevive en
solución acuosa a un mayor tiempo que el éster activo formado de una reacción de EDC solo con
un carboxilato. Agregar sulfo-NHS incrementa la estabilidad del intermediario activo y permite
que reaccione con una amina y forme un conjugado de dos moléculas unidas mediante un enlace
amida estable, como se muestra en la figura 1.9 [47].
21
HO
CH3
OH
O
OH
O
O
O
HO
HO
O
HN
N
N
H3C
OH
OH
HO
O
+ Cl
+
O
-
CH3
EDC
Alginato
OH
O
HO
OH
O
O
HO
O
N
+
HN
O
S
HO
O
O
Sulfo NHS
OH
OH
O
-
HO N
O
HO
O
HN
OH
Cisteína
O
O Na+
HS
NH2
CH3
O
O
OH
OH
HO
O
NH
CH3
H3C
O
O
O
+
O
O
O
HO
OH
OH
SH
O
OH
Fig. 1.9. Propuesta de la secuencia de reacción durante la modificación química del alginato con
cisteína, utilizando EDC y sulfo-NHS como agentes entrecruzantes, a 4 °C y en PBS (pH = 7,4).
Tomado de Ref [47].
1.10. Evaluación de las propiedades mucoadhesivas.
Los métodos in vivo e in vitro permiten controlar los sistemas bioadhesivos porque estudian la
liberación, compatibilidad, estabilidad física y mecánica y las interacciones superficiales entre la
matriz polimérica y la membrana mucosa. Generalmente, se usan métodos in vitro/ex vivo que
incluyen por ejemplo, mediciones de la resistencia a la tracción y resistencia al desgarre, donde se
22
emplean diversas técnicas de imagen para evaluar los sistemas de liberación bajo condiciones in
vivo. A continuación se explicarán varios métodos para medir la mucoadhesión.
Un ensayo tensil in vitro consiste en sumergir un papel de filtro en una dispersión de 8% de
mucina. Luego, este papel de filtro con mucina se pone en contacto con las muestras poliméricas
hidratadas en soluciones fisiológicas por un período de tiempo determinado. Se calcula la fuerza
máxima necesaria para retirar el papel de filtro de la superficie del polímero después de generarse
las interacciones mucoadhesivas [54]. Los experimentos ex vivo se realizan de manera similar a
este ensayo, pero el papel de filtro con mucina es reemplazado por un tejido extirpado de
mucosas bucal, intestinal o vaginal [55-57]. Así mismo, las propiedades mucoadhesivas se
pueden determinar también mediante la incubación de la superficie de la matriz polimérica
dejándola en contacto con una solución visco-elástica de 30% de mucina en agua, para luego
determinar la fuerza de desprendimiento requerida para separar la matriz polimérica de la
superficie de la mucina después de la adhesión [58].
En un método que consiste en someter un bioadhesivo bajo una carga de compresión, es
importante estudiar el comportamiento del esfuerzo en función de la deformación. Chuang et al.
[59] realizaron un método llamado “Avery Denison” que se basa en un mecanismo de sonda que
incorpora una serie de controles que permiten variar los parámetros de ensayo como la fuerza de
contacto, el tiempo de contacto, la velocidad de desplazamiento de la probeta, etc.; y
adicionalmente, permite el uso de varios tipos de probetas y distintas geometrías para ensayar
diferentes tipos de bioadhesivos. Los valores del esfuerzo y la deformación son recogidos
digitalmente para su análisis, y por otra parte, el programa permite recoger múltiples datos de
adhesividad de una sola prueba. En la investigación realizada por Johnson [60] se hizo un
examen minucioso y exhaustivo de los ensayos de adhesión y de la importancia de varios
parámetros de prueba. Por otro lado, Zosel [61] estudió el parámetro de la falla de energía
adhesiva para determinar la viscosidad, la resistencia al desgarre y la resistencia a la cizalla de
adhesivos sensibles a presión (PSA), y se incluyen los efectos de la estructura molecular sobre las
propiedades de adhesión, señalando distintos valores que determinan la adherencia a nivel
molecular.
23
Un ensayo para evaluar la mucoadhesión consiste en el análisis de la fuerza mucoadhesiva, la
cual es la fuerza requerida para que se rompa el enlace formado entre el bioadhesivo y la
membrana mucosa. Esta fuerza se evalúa mediante ensayos de tracción y compresión, para lo que
se utiliza generalmente un equipo de análisis de textura [28]. El analizador de textura mide la
fuerza involucrada en ensayos de compresión y tensión. También determina la textura y
cuantifica la dureza, fragilidad, fractura, adherencia, rigidez, elasticidad, entre otras propiedades
de alimentos, cosméticos, productos farmacéuticos, geles, adhesivos, entre otros productos.
El equipo mencionado anteriormente permite determinar la fuerza requerida para separar la
muestra de la membrana mucosa. Esta membrana puede tratarse de un disco de mucina o un
pedazo de membrana mucosa animal. Se obtiene una curva fuerza vs distancia (figura 1.10), que
muestra la fuerza requerida para separar la mucina de la superficie de la muestra. Esta curva
también proporciona el trabajo de adhesión, dado por el área negativa bajo la curva, que
representa el trabajo necesario para superar las fuerzas de atracción entre las superficies de la
sonda y la muestra. Por otra parte, también es posible determinar la fuerza máxima requerida para
separar el material de la superficie mucosa, la cual representa la adhesividad de la muestra [28].
Fig. 1.10. Curva Fuerza vs Distancia obtenida mediante el analizador de textura [28].
La investigación de Tobyn et al. [62] demostró la importancia de la selección apropiada de los
protocolos de ensayos. Cuando las condiciones de ensayo fueron cambiadas, los
24
comportamientos del enlace adhesivo se vieron significativamente afectados. Es por esto que
durante el proceso se deben controlar los siguientes elementos: (a) velocidad de ensayo a la que
la sonda se desplaza hasta tocar la muestra bioadhesiva, (b) la sensibilidad con la que el
bioadhesivo es detectado, (c) la velocidad a la cual se aplica la fuerza, (d) la fuerza aplicada, (e)
la duración de la fuerza aplicada y (f) la velocidad a la que se retira [60].
Por ejemplo, para medir la adhesividad de vendajes y parches, se requieren aplicar fuerzas
ligeras por largas duraciones, de 20 a 30 minutos; aunque para la mayoría de los materiales
bioadhesivos se requieren cortos tiempos de adhesión. Con relación a la velocidad de ensayo, en
la mayoría de los casos se escogen velocidades relativamente lentas (0,1-10 mm/s), dependiendo
del material.
En cuanto a los tipos de probetas empleadas, las más comunes se tratan de cilindros con
diámetros de 7 a 10 mm, y ocasionalmente de 12,5 a 20 mm. Los tamaños tienden a ser pequeños
porque resulta más difícil preparar y ensayar grandes muestras de tejido mucoso, ya que, mientras
mayores sean las dimensiones es más difícil el contacto superficial entre el bioadhesivo y el
material. Se ha demostrado que probetas de 7 mm de diámetro de acero inoxidable (figura 1.11)
proporcionan una excelente sensibilidad y reproducibilidad para una amplia variedad de
bioadhesivos (geles semi-sólidos, hidrogeles, cremas, tabletas, etc). En general, las probetas
planas son menos reproducibles y confiables a la hora de realizar las mediciones.
Fig. 1.11. Probeta TA-57R de 7 mm de diámetro empleada en ensayos mucoadhesivos.
CAPÍTULO 2.
MARCO EXPERIMENTAL
2.1. Materiales
A continuación en la tablas 2.1 y 2.2, se presentan algunas propiedades: fórmula, estructura y
peso molecular de los materiales utilizados para el proceso de entrecruzamiento del gel de
alginato con capilares de cobre.
Tabla 2.1. Propiedades del alginato usado.
Marca
Tamaño de partícula Proporción
Tipo de alginato
Registrada
aproximado (µm)
M/G*
Alginato de
Keltone LVCR
106
1.50
Sodio
* M/G indica la proporción de ácido manurónico (M) y ácido algínico (G).
Densidad
Aparente
(g/mL)
0.606
Tabla 2.2. Propiedades de las sustancias utilizadas en la reacción de entrecruzamiento del
CCAG.
Sustancia
Nombre IUPAC
EDC
1-etil-3-(3dimetilaminopropil)
carbodiimida
Sulfo-NHS
Cisteína
Nhidroxisulfosuccinimida
L- clorhidrato de cisteína
monohidratada
Fórmula
Molecular
Peso
Molecular
(g/mol)
Fabricante
C8H17N3-HCl
191,7l
Sigma Aldrich
C4H4NSO6Na
217,13
Thermo
Scientific
C3H8NO2SClH2O
175,64
Cellgro
26
En la tabla 3.2 se presentan los materiales empleados en la formulación del moco cervical
sintético.
Tabla 2.3. Descripción de las sustancias empleadas en la formulación del moco cervical
sintético.
Sustancia
Descripción
Fabricante
Mucina
Proviene de estómago de porcina. Tipo III,
enlazado con ácido siálico 0,5-1,8%,
parcialmente purificado en polvo
Sigma-Aldrich
Guar
Goma guar
Metil 4-hidroxibenzoato
HOC6H4CO2CH3
p-ácido hidroxibenzoico metil éster, Metil
parabano.
Mw=152,15g/mol
Sigma-Aldrich
Imidúrea
C11H16N8O8
26,28% nitrógeno.
Mw=388,29g/mol.
Acros Organics
Propil 4-hidroxibenzoato
C10H12O3
Mw=180,20g/mol
Acros Organics
Azida de Sodio
N3Na
>99%, <0,5% agua.
Mw=65,01g/mol.
Fisher Scientific
Fosfato Dibásico de Potasio
K2HPO4
Mw = 174.18
Sigma-Aldrich
Fosfato Monobásico de Potasio
KH2PO4
Mw = 136,09
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
27
2.2. Procedimiento
Los hidrogeles sintetizados han sido denotados en este trabajo como 0,X-GCCAG y 0,XGCCAG-Cist, donde los primeros representan los hidrogeles de alginato con capilares de Cu y
los segundos sus homólogos con cisteína. El valor numérico 0,X (donde X puede ser 4 o 5) se
refiere a la concentración molar de CuSO4 utilizada. Por ejemplo, el hidrogel 0.4-GCCAG-Cist se
refiere al hidrogel de alginato con cisteína y 0,4 M de CuSO4.
2.2.1. Síntesis de los hidrogeles GCCAG.
El gel de alginato con capilares de cobre (CCAG, según sus siglas en inglés) fue sintetizado
según el procedimiento reportado por Bradley et al. [63]; el cual se describe a continuación:
A) Degradación de la gelatina
Una solución de agua desionizada que contiene 10% (p/v) de gelatina y 1% (v/v) de 1M NaOH
fue transferida a un Erlenmeyer el cual se cubrió con una lámina de aluminio. La solución fue
calentada en un horno de convección a 80 °C por 72 horas y se formó una solución viscosa que se
agitó a mano durante el tiempo de calentamiento. Luego se almacenó a 4 °C.
B) Preparación de la solución de 2% alginato de sodio
Se disolvieron 4g de alginato de sodio en 170 mL de agua destilada contenida en un matraz
Erlenmeyer de 500 mL. La solución se agitó en un plato de agitación a velocidad media alta hasta
que se obtuvo una solución clara y homogénea. Se adicionó más agua destilada hasta alcanzar un
volumen final de 200 mL, generando una solución de alginato de sodio de 2%. La solución de
alginato se agitó durante 2 h y luego se dejó reposar por 2 h para minimizar las burbujas de la
solución. Posteriormente fue almacenada a 4 °C.
28
C) Preparación de la cápsula de Petri con alginato.
En una cápsula de Petri se agregaron cinco capas delgadas de una solución de alginato de sodio
2% p/p, esperando unos minutos de secado al aire entre capa y capa. Una vez que se aplicaron las
5 capas, la cápsula de Petri se calentó en un horno a 120 °C durante 10 min. Luego la cápsula se
removió del horno, se dejó enfriar y se repitió el procedimiento tres veces más.
D) Síntesis de Gel de Alginato con Capilares de Cobre (CCAG)
Una cápsula de Petri recubierta de alginato fue llenada con una solución recién preparada al 2%
(p/v) de alginato de sodio y 2,6% (p/v) de gelatina degradada. Se humedeció un papel absorbente
(Kimwipe, Kimberly-Clark, Neenah, WI) con la solución [CuSO4] = 0,4 y 0,5 M para cada tipo
de formulación, y se colocó en la parte superior de la cápsula de Petri que contenía el alginato.
Después de 5 minutos, el papel absorbente fue removido y la cápsula de Petri fue transferida a un
recipiente plástico con tapa que permitió la sumersión de 3 mm en 600 mL de una solución
[CuSO4] = 0,4 o 0,5 M. El contenedor con la solución de sulfato de cobre se cubrió y se dejó en
reposo por 36 h. La cápsula de Petri fue removida del contenedor y el gel fue separado
cuidadosamente con una espátula delgada. El gel fue cortado en secciones de 5 mm de espesor,
las cuales se sumergieron en agua a 4 °C y se dejó bajo agitación mecánica (Basics, Bellco
Biotechnology, Vineland, NJ) a 50 rpm, dejando los hidrogeles purificándose durante toda la
noche. Estas tiras de hidrogel se cortaron paralelamente al eje de los capilares en bloques
rectangulares de 3 mm de grosor. La parte superior e inferior de los bloques fueron cortados
perpendicularmente al eje de capilares para producir un bloque de gel de dimensiones
aproximadas 5x5x3 mm de longitud (paralela a lo largo del eje capilar), ancho y grosor
respectivamente. Todos los bloques se colocaron en un tubo cónico de 50 mL, los que se
sumergieron en agua y fueron almacenados a 4 °C en un cuarto de refrigeración.
29
D.1.) Reacción de entrecruzamiento del hidrogel de alginato con capilares de cobre con
cisteína (GCCAG-Cist).
Los bloques de CCAG se colocaron sobre papel absorbente para secarlos y luego se insertaron
dentro de un tubo cónico de 15 mL (fabricado por Costar). Se determinó el peso del CCAG, que
representa aproximadamente 94% de masa en agua. Las cantidades de EDC y de Sulfo-NHS
adicionados fueron calculados en base a que 6% de la masa seca era totalmente alginato.
Basándose en esta aproximación, se empleó una relación molar de 1:2:2:0,5 de
alginato:EDC:Sulfo-NHS:cisteína respectivamente. El Sulfo-NHS fue disuelto en 10 mL buffer
de sales de fosfato (PBS, según sus siglas en inglés “Phosphaste Buffer Saline”) en un tubo de
ensayo de 15 mL que se mantuvo a 4 °C en un cuarto de refrigeración. A esta solución de
PBS+Sulfo-NHS, se le adicionó la cisteína, y luego dicha solución fue introducida al tubo de
ensayo que contenía el hidrogel y se mantuvo agitando durante 1 h a 4 °C. Luego se agregó el
EDC y se agitó a 4 °C durante 21 h. Al nuevo hidrogel entrecruzado GCCAG se le agregaron
volúmenes pequeños de PBS y se lavaron con grandes volúmenes de agua desionizada de 24 a 48
horas. Las muestras fueron almacenadas a 4 °C en un cuarto de refrigeración. El esquema de este
procedimiento se muestra en la figura 2.1.
D.2) Reacción de entrecruzamiento del hidrogel de alginato con capilares de cobre
(GCCAG).
Se siguió el procedimiento anterior de la síntesis del GCCAG-Cist, pero esta vez sin agregar la
cisteína. La relación molar utilizada fue 1:2:2 de alginato:EDC:Sulfo-NHS respectivamente.
30
Fig. 2.1. Esquema de las reacciones involucradas para la síntesis del GCCAG con cisteína.
2.2.2. Síntesis del Moco Cervical.
Se sintetizó moco cervical con viscosidad y pH comparables al moco cervical humano (1765 cP
a una velocidad de corte de 9 s-1 y 7,4 a 37 °C, respectivamente) [64]. En la literatura se han
empleado como sustitutos de la mucina: goma guar, ácido hialurónico, acrilamida y mezclas de
polietileno y acrilamida. En el presente trabajo se utilizó una formulación compuesta de goma
guar entrecruzada con ión borato, mucina (porcina gástrica seca) y un sistema de preservativos en
pH 7,4 y 0,1 M de borato de sodio. Las concentraciones en peso (p/p) de cada una de estas
sustancias que componen la formulación se presentan en la tabla 2.4 [64].
Los preservativos (metilparabeno, propilparabeno e imidúrea) fueron disueltos en 90% de agua
durante 5 minutos; éstos son capaces de preservar la formulación de un ataque microbiano por un
mínimo de tres semanas a temperatura ambiente. A esta solución se añadió lentamente goma guar
y se agitó hasta quedar totalmente disuelta, observando un incremento en la viscosidad. A esta
mezcla se le agregó mucina, seguida de una solución de sales de buffer (fosfato dibásico de
potasio y fosfato monobásico de potasio) en el agua remanente. Luego, se agregó 0,5 mL de una
31
solución de borato de sodio 0,1 M. Esta solución se dejó con agitación mecánica durante 1 día a
37 °C hasta que quedó completamente disuelta. La viscosidad no fue determinada.
Tabla 2.4. Formulación del Moco Cervical Sintético.
Nombre
%p/p
Metil parabeno
0,15
Propil parabeno
0,02
Imidúrea
0,30
Goma guar
1,00
Mucina
0,50
Fosfato dibásico de postasio
1,57
Fosfato monobásico de postasio
0,26
Agua
96,20
2.2.3. Caracterización macroscópica.
Una vez sintetizado el gel de alginato con capilares de cobre, se le tomó una foto antes y
después de la reacción de entrecruzamiento con el fin de evaluar algún cambio visible, cambio de
color, cambio en las dimensiones, agrietamiento de la pieza, etc. Además para observar si ocurre
algún cambio en las muestras una vez que son liofilizadas.
2.2.4. Caracterización físico-química: Microscopia Electrónica de Barrido/Espectrometría de
Energía Dispersiva de Rayos X (MEB/EDX)
Para la caracterización físico-química, se utilizaron muestras que se encontraban
sumergidas en agua destilada. Antes de utilizar el MEB/EDX, cada una de las muestras fue
colocada en tubos de centrifuga de polipropileno de 50 mL con una pequeña cantidad de agua
destilada (aproximadamente 2 mL). Luego, estas muestras fueron congeladas mediante la
colocación de los tubos en nitrógeno líquido durante 5 minutos, y posteriormente se liofilizaron a
-40 °C y 10-15 μm Hg durante 48 h utilizando un liofilizador (Labconco Kansas City, MO) (Fig.
32
2.2). Se sugiere el estudio de la caracterización química por medio de Espectrofotometría de
Infrarrojo por Transformada de Fourier (FT-IR).
Fig. 2.2. Equipo utilizado para liofilizar las muestra.
Las muestras secadas previamente con el liofilizador fueron colocadas por separado en
portamuestras de aluminio usando etiquetas de carbono de doble cara (SPI Supplies, West
Chester, PA) para su adherencia. Luego se recubrieron con carbón (Ion Equipment Corp., Santa
Clara, CA) y se almacenaron en un desecador hasta ser analizadas. Todas las muestras fueron
analizadas usando un microscopio electrónico de barrido (MEB) JEOL JSM-6400 MEB (JEOL
USA, Peabody, MA) equipado con un sistema de espectroscopia dispersiva de energía Oxford
(EDS) y un software LINK ISIS versión 3.35 (Oxford Instruments USA, Concord MA). Las
muestras fueron analizadas con un voltaje de aceleración de 15 keV, el cual es suficiente para
observar todos los picos de rayos X de interés con el espectrómetro de energía dispersiva de
rayos X (EDX). Sería importante realizar la caracterización química de los hidrogeles por medio
de Espectroscopia Infrarrojo de Transformada de Fourier (FT-IR) para evaluar la composición
química.
33
2.2.5. Evaluación de la mucoadhesión.
Con el fin de evaluar la mucoadhesión, se tomaron unas muestras de hidrogeles en forma de
cubos para ser ensayadas en el analizador de textura (TA.XT Plus, Stable Micro Systems, UK)
con una celda de carga de 50 N.
Fig. 2.3. Analizador de textura TA.XT Plus
Previamente, las muestras y el moco cervical fueron mantenidas a una temperatura de (37,0 ±
0,1) °C mediante un equipo de baño térmico (Isotemp 2006, Fisher Scientific). Una muestra
rectangular de dimensiones aproximadamente 5x5x3 mm, fue adherida con pega de secado rápido
(Super glue, Loctite) en la parte inferior de una probeta cilíndrica TA-57R de 7 mm de radio
(figura 2.3). Otra muestra fue adherida a la base del analizador de textura empleando pega, a la
que seguidamente se le adicionó 1,50 mL de moco cervical con el uso de una micropipeta. Las
condiciones de ensayo fueron 0,05 N de fuerza de contacto entre la muestra superior con el moco
y la muestra inferior, a una velocidad de ensayo de 0,05 mm/s y 60 segundos de contacto entre
las muestras y el moco. Usando el programa de analizador de textura, la fuerza máxima requerida
para separar la muestra del moco (fuerza máxima de desprendimiento; MDF) puede ser detectada
directamente por el software y la cantidad total de fuerzas involucradas en la probeta (trabajo de
34
adhesión; TWA) fueron calculados a partir del área bajo la curva Fuerza vs Distancia. El montaje
experimental se muestra a continuación (Fig. 2.4).
F
Fig. 2.4. Montaje del ensayo mucoadhesivo usando el analizador de textura.
2.2.6. Estudios de hinchamiento de los hidrogeles.
El grado de hinchamiento se midió gravimétricamente pesando los hidrogeles que se iban
hinchando en las distintas soluciones (agua desionizada y moco cervical) a intervalos de tiempo
regulares. En primer lugar, se pesaron los geles en estado xerogel (después de ser liofilizadas)
mediante una balanza analítica [Metler AE 240 (± 1x10-4 g)], representando el peso seco de la
muestra. Luego, estas muestras fueron sumergidas en agua desionizada a pH 6,0 y a temperatura
ambiente (23 ± 1) °C; el pH fue determinado a través de un pH metro (AB15 Accumet basic,
Fisher Scientific). Una vez que las muestras se sumergieron en agua, se midió el peso de cada una
a distintos intervalos de tiempo, teniendo un valor de peso húmedo en función del tiempo. La
diferencia entre el peso inicial y final fue atribuido al porcentaje de hinchamiento. Otro grupo de
muestras fue sumergido en una formulación de moco cervical a pH 7,4 y a una temperatura de
35
(37,0 ± 0,1) °C. De igual forma, a estas muestras se les hizo un estudio de su incremento de peso
en función del tiempo.
Posteriormente, con los valores de las masas de las muestras determinado para cada tiempo t, se
calcularon los grados de hinchamiento y se graficaron isotermas de absorción. El grado de
hinchamiento (%H) fue determinado mediante la siguiente ecuación:
 m  mo
% H   h
 mo

  100

(Ecuación 2.1)
donde mh es la masa del hidrogel húmeda a un tiempo t, y mo es la masa del xerogel.
Para medir la cantidad de agua absorbida por el hidrogel, se calcula por medio de la ecuación
2.2:
 m  mo
%W   h
 mh

  100

(Ecuación 2.2)
36
CAPÍTULO 3
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuatro tipos de hidrogeles de alginato con capilares de Cu (GCCAG) fueron sintetizados
exitosamente. Las muestras ensayadas se obtuvieron utilizando una relación inicial
alginato:gelatina oligomérica:CuSO4 de: (i) 2:2,6:0,4 sin cisteína; (ii) 2:2,6:0,4 con cisteína; (iii)
2:2,6:0,5 sin cisteína y (iv) 2:2,6:0,5 con cisteína. Primeramente se presentarán los resultados de
los cambios macroscópicos que se observaron durante la síntesis de los hidrogeles. Luego se
mostrarán la morfología y los elementos químicos presentes por medio de Espectroscopia
Electrónica de Barrido y Espectrometría Dispersiva de Energía (MEB/EDX). Se evaluó el efecto
que tiene la cisteína en la mucoadhesividad de estos materiales mediante el uso de un analizador
de textura, y finalmente, se estudió el comportamiento del hinchamiento de estos hidrogeles.
3.1. Caracterización Macroscópica
Una de las características más notorias de los hidrogeles sintetizados es el cambio de coloración
antes, durante y después del proceso de entrecruzamiento. Cuando los hidrogeles de alginato con
capilares de cobre fueron sintetizados, presentaron un color azul translúcido debido a la presencia
de iones CuSO4-, de consistencia firme al tacto y fueron fácilmente seccionados en bloques
regulares de aproximadamente 5x5x3 mm [Fig. 3.1 (A, B)]. Luego estos hidrogeles se colocaron
en una solución de buffer de sales de fosfato (PBS) a pH = 7,4 con sulfo-NHS y cisteína, y se
dejó mezclando por dos horas. Al transcurrir este tiempo, se observó un cambio de color en el
borde de los hidrogeles rectangulares: presentaron el mismo color azul pero con un borde más
oscuro de color gris en algunas de sus caras [Fig. 4.1 (C)]. Esto se podría asociar a la presencia de
la cisteína, ya que aquellos hidrogeles sin cisteína no presentaron esta coloración en el borde.
El siguiente paso del proceso de entrecruzamiento fue agregar EDC [1-etil-3-(3dimetilaminopropil) carbodiimida] a la solución salina. Y por último, se realizó el lavado de las
muestras, sustituyendo la solución salina de PBS por agua deionizada, lo que se hizo dos veces y
se dejó en agitación por dos días para lavar y purificar los hidrogeles. Después de este tiempo los
37
geles se tornaron incoloros en toda su superficie [Figura 3.1 (D)] tornándose más frágiles. Sin
embargo, los hidrogeles con cisteína presentaron una mayor fragilidad que aquellos sin cisteína,
observándose que algunos perdían masa cuando estaban sumergidos en agua. Esto podría
asociarse a que la cisteína posiblemente se adhirió sólo en algunas caras de las muestras pero no
en todas las superficies.
C
A
1cm
B
1cm
D
Fig. 3.1. Hidrogeles de alginato con capilares de cobre (A) y (B) antes de la reacción de
entrecruzamiento; (C) después de agregar PBS, Sulfo-NHS y Cisteína; (D) después de agregar
EDC, completando la reacción de entrecruzamiento.
Otra característica física que también cambió fue el tamaño de los hidrogeles antes y después
del entrecruzamiento. Se observa un aparente hinchamiento al comparar las figuras 3.1(B) y
3.1(D). Esto también se observa en la figura 3.2, extraída del trabajo de Willenberg et al. [63] en
donde el bloque CAAG se hincha de manera significativa después del entrecruzamiento
(obteniéndose el GCCAG con mayor tamaño).
38
Fig. 3.2. Morfología macroscópica del gel de alginato con capilares de cobre sin entrecruzar
(CCAG) y después del entrecruzamiento (GCCAG), reportado por Willenberg et al. [63].
Al parecer, en los hidrogeles ocurre una expansión anisotrópica, ya que se observa un
crecimiento preferencial en un eje que en otro (en este caso se observa un crecimiento mayor en
el vertical). Esto podría atribuirse al hecho de que en el CCAG, las cadenas de alginato se
orientan perpendicularmente al eje longitudinal de los capilares [41, 42]. Esta orientación
preferencial de cadenas indica que la hidratación de las moléculas y el entrecruzamiento de iones
metálicos (Cu2+) se localizan preferencialmente en el plano perpendicular al eje capilar,
influyendo el entrecruzamiento iónico y la hidratación de las cadenas en el cambio de las
dimensiones de las hidrogeles [63].
Adicionalmente, se evaluaron las características macroscópicas de los hidrogeles después de ser
sometidos a liofilización y posterior hidratación en agua (figura 3.3). La muestra hidratada
presenta un color traslúcido y después de la liofilización se vuelve de color blanco debido a su
deshidratación (fig.3.3 B). Su consistencia era más frágil y difícil de manipular; pero una vez que
fue sumergida en agua (después de 22 h) recuperó su carácter de hidrogel, se hincha debido a la
difusión del agua dentro de la estructura de la red y se vuelve más opaco (fig. 3.3 C).
39
1cm
1cm
A
B
1cm
C
Fig. 3.3. Hidrogel (A) después de la reticulación y antes de la liofilización; (B) posterior a la
liofilización; (C) una vez sumergidos en agua para la determinación del grado de hinchamiento.
3.2. Caracterización Físico-Química: Espectroscopia Electrónica de Barrido/Espectrometría
de Energía Dispersiva de Rayos X (MEB/EDX)
El MEB/EDX es una combinación de dos métodos de análisis. Un microscopio electrónico de
barrido (MEB) emplea un haz de electrones para analizar la topografía de un material. Este
equipo genera una alta energía de electrones que viajan a gran velocidad, cuyas radiaciones se
dirigen a la muestra y son absorbidas y escaneadas por toda la superficie de la misma, hasta ser
procesadas electrónicamente a una imagen. La mayoría de los microscopios electrónicos usados
actualmente para estudiar los materiales pueden producir una imagen con una resolución de hasta
10 Ǻ. La espectrometría de energía dispersiva de rayos X se aprovecha del fenómeno de que
cuando un material es irradiado con un haz de electrones de alta energía, originando una
40
excitación electrónica, la muestra emitirá rayos X. Estos rayos X tienen energías características
de los elementos que son irradiados, lo cual permite la identificación de todos los elementos
presentes en la micrografía observada por el MEB [65]. A continuación se presentan las
morfologías de las cuatro muestras con su respectivo espectro EDX, para su estudio físicoquímico.
Fig. 3.4. Imágenes MEB y EDX correspondientes a la muestra 0,4-GCCAG sin cisteína. (A)
Morfología de dos planos de la muestra a 35X; (B) morfología a 100X de los capilares de una
sección perpendicular al eje longitudinal de capilares; (C) espectro EDX.
En la figura 3.4 (A) se observan dos superficies de la muestra 0,4-GCCAG. El plano derecho de
esta figura, representa la sección perpendicular al eje longitudinal de capilares, el cual se presenta
en una mayor escala (100X) en la figura 3.5 (B). En esta superficie se observan unas manchas
41
blancas (encerradas en un círculo), sobre las cuales se obtuvo por rayos X el espectro EDX [Fig.
3.5 (C)] para determinar qué elementos se encuentran presentes. Los elementos con mayor
proporción son el oxígeno (O) e hidrógeno (H), los cuales componen la estructura del alginato.
También se observa la presencia de sodio (Na), azufre (S) y cloro (Cl) que se pueden asociarse a
las sales agregadas en la reacción de entrecruzamiento: PBS, EDC y sulfo-NHS.
Fig. 3.5. Imágenes MEB y EDX correspondientes a la muestra 0,4-GCCAG-Cist (A) Morfología
a 35X, se presentan dos planos de la muestra; (B) morfología a 100X de los capilares de una
sección perpendicular al eje longitudinal de capilares; (C) espectro EDX.
Las figuras 3.5 (A, B) muestran la morfología de la superficie del hidrogel 0,4-GCCAG- Cist.
En (A) se observan los capilares paralelos al eje longitudinal de capilares (como se indica con las
flechas rojas) y (B) representa una vista perpendicular al eje longitudinal de capilares. Como en
42
la muestra anterior, es una morfología de capilares distribuidos paralelamente a lo largo de un
volumen dado de material. El espectro EDX de este hidrogel se presenta en la figura 3.4 (C),
donde se observa tal y como en la muestra sin cisteína, elementos representativos de la estructura
del alginato (O, H y Cu). Bajas cantidades de silicio (Si) y azufre (S) probablemente provienen
del polvo del alginato usado para hacer 2% p/v de la solución de alginato de sodio y sulfato de
cobre residuales utilizados en la síntesis del gel, respectivamente. El Na, Cl y K podrían asociarse
al PBS, compuesto por cloruro de sodio (NaCl) y cloruro de potasio (KCl).
Fig. 3.6. Imágenes MEB correspondientes a las muestras 0,5-GCCAG-Cist. (A) 35X con
cisteína.; (B) 100X sin cisteína; (C) 100X con cisteína; (B) y (C) morfología de los capilares de
una sección perpendicular al eje longitudinal de capilares.
La figura 3.6 muestra la morfología obtenida por MEB y el espectro EDX del hidrogel 0,5GCCAG-Cist, donde se presentan también capilares distribuidos uniformemente a lo largo del
hidrogel. Las manchas blancas (encerradas en círculo) son trazas o restos, consecuencia de las
sales derivadas de la síntesis. Estas sales están representadas por los picos de fósforo (P),
43
nitrógeno (N), Cl, Ca, Na y S, que podrían provenir del EDC (el cual contiene N y Cl) y del
sulfo-NHS (constituido por grupos de NaSO3 y N) o bien del PBS, compuesto por cloruro de
sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), fosfato disódico de hidrógeno (Na2HPO4*H2O) y fosfato
potásico dihidrógeno (KH2PO4). A su vez, debido a la presencia de los elementos C, O y N, se
podría afirmar que la gelatina está todavía presente.
A continuación, en la figura 3.7 (A) se muestra la morfología del hidrogel 0,5-GCCAG, la cual
es similar a las anteriores y además es análoga a la imagen del MEB obtenida por Willenberg et
al. [63] de un hidrogel de 0,5-GCCAG [figura 3.6 (B)]. Sin embargo, ambas imágenes tienen
como diferencia las sales presentes (bordeadas con líneas rojas) en la figura 3.7 (A), por lo que
se puede concluir que el proceso de purificación de los hidrogeles en el presente trabajo no fue
suficiente.
La microestructura de capilares regulares que presentan los geles se puede relacionar con la
incorporación de la gelatina durante la síntesis. Previamente, sólo se había estudiado la adición
de la gelatina al sistema del gel de alginato con capilares de calcio, para la producción de
biocerámicas con estructura capilar para la regeneración ósea [66]. Se observó que adicionar 1%
de gelatina en sistemas de cobre, generaba geles con microestructuras irregulares. Se postuló que
las distorsiones eran consecuencia del aumento en la viscosidad de la solución de alginato
después de la adición de la gelatina, idea que es consistente con una investigación previa donde
se determinó que el agregar gelatina generaba geles de alginato con microestructuras menos
uniformes [66]. Por ello, Willenberg et al. [63] calentaron la gelatina con el fin de reducir el
promedio de la longitud de cadena (y en consecuencia el peso molecular Mw) antes de mezclarla
con la solución de alginato, reduciendo significativamente la viscosidad de toda la solución.
Durante el calentamiento, las cadenas de la gelatina están sometidas a escisión por acortamiento
o degradación. Después de calentar la gelatina, se tomó una solución de la misma a 10% (p/v)
formando un gel firme y no fluido una vez que fue enfriado a temperatura ambiente. Luego
ocurrió la solidificación de la solución de la gelatina cuando se enfrió a 4 °C, obteniéndose un
gel suave. Finalmente, se pudo observar que la reducción del Mw de la gelatina permitió la
producción de geles con microestructuras de capilares regulares, como se observó en las
micrografías obtenidas por medio del MEB [63].
44
Fig. 3.7. (A) Morfología MEB a 100X de la sección perpendicular al eje longitudinal de
capilares y (C) espectro EDX correspondientes a las muestras 0,5-GCCAG-Cist; (B)
Morfología de los capilares de una sección perpendicular al eje longitudinal de capilares de un
hidrogel 0,5-GCCAG sintetizado por Willenberg et al [63].
Los espectros EDX de los cuatro tipos de muestras presentan el pico de Cu, el cual es el ión
divalente responsable de la formación del gel y de la estructura capilar del mismo. Las dos cargas
positivas del cobre interaccionan iónicamente con las cargas negativas de los grupos del ácido
algínico, formando un puente que une dos cadenas de alginato con el ión de cobre, generando el
“modelo caja de huevo”, fig. 1.3 [38].
45
La preparación de los geles de alginato consistió en colocar cinco capas de este copolímero en
una cápsula de Petri. Estas capas fueron sumergidas en la solución con CuSO4 generando la
gelificación, formándose capilares regulares con espacio entre ellos a lo largo de la morfología.
Esta uniformidad de capilares se podría asociar a la presencia de los iones de cobre que forman
un puente con las cadenas algínicas que podrían relacionarse con el espacio entre capilares
debido al modelo de caja de huevos mencionado anteriormente.
Debido a la presencia de los capilares los diámetros de poros obtenidos a partir de las imágenes
micrográficas fueron: 71 ± 18 µm (N = 58) para 0,4-GCCAG-Cist; 79 ± 14 µm (N = 25) para 0,4GCCAG; 86 ± 14 µm (N = 49) para 0,5-GCCCAG-Cist; y 101 ± 20 µm (N = 35) para 0,5GCCAG, donde N representa el número de poros medidos. Se realizó un “t-test”, la cual es una
prueba que permite determinar si la diferencia observada entre dos medias distintas (calculadas a
partir de los datos recogidos de dos muestras) reflejan una verdadera diferencia o es una
coincidencia del muestreo aleatorio. El valor “p” es una probabilidad con un valor que va del
intervalo cero a uno; si este valor es pequeño, se concluye que es muy poco probable que la
diferencia sea causada por un muestreo al azar, lo que quiere decir que las muestras tienen
distintas medias. Comparando las medias determinadas del tamaño de poro de los hidrogeles 0,5GCCAG y 0,4-GCCAG; y del 0,5-GCCAG-Cist y 0,4-GCCAG-Cist, se obtuvo en ambos casos p
< 0,0001. Si bien se requiere de micrografías por Microscopía Electrónica de Transmisión (MET)
para determinar con mayor precisión los tamaños de los poros, los resultados obtenidos por MEB
permiten visualizar que el tamaño de poro del hidrogel 0,5-GCCAG es mayor que el de 0,4GCCAG, y que el tamaño de poro del 0,5-GCCAG es mayor que el del 0,4-GCCAG. También, se
efectuó un “t-test” para comparar las medias entre los hidrogeles 0,4-GCCAG-Cist y 0,4GCCAG, de lo que se obtuvo p = 0,0001; y entre el 0,5-GCCAG-Cist y 0,5-GCCAG, p = 0,0360.
Esto permite concluir que el tamaño de poro del 0,5-GCCAG-Cist es mayor que del 0,4GCCAG-Cist. Además, se observa que la cisteína influye en el tamaño de poro, ya que los
hidrogeles con cisteína presentaron un tamaño de poro menor que aquellos con cisteína.
La porosidad y el hinchamiento se encuentran estrechamente relacionados, ya que, los poros le
confieren al material la propiedad de capilaridad que le permite recibir una mayor cantidad de
46
líquido, de acuerdo al tamaño y cantidad de capilares en la estructura. Por esto, es necesario
evaluar la propiedad de hinchamiento de cada tipo de hidrogel.
3.3. Evaluación de la mucoadhesión mediante un analizador de textura.
El alginato representa el primer polímero aniónico natural que ha sido químicamente
modificado por enlaces covalentes de grupos tioles [39]. Se estudió el incremento de la cisteína
en las propiedades mucoadhesivas, las cuales son críticas para el éxito del transporte y liberación
de los fármacos, para que estos puedan permanecer firmemente en el lugar objetivo durante el
período necesario para el control de su liberación. El equipo de analizador de textura se utilizó
para medir las propiedades mucoadhesivas de los hidrogeles 0,4-GCCAG y 0,5-GCCAG y
evaluar la influencia de la cisteína en estas propiedades.
El proceso empezó cuando la probeta metálica descendió a 0,5 mm/s hasta encontrarse con la
membrana mucosa. Automáticamente, se aplicó una fuerza de compresión de 0,05 N sobre la
muestra durante 60 segundos. En este paso, el tiempo de contacto entre la muestra y la superficie
mucosa, la viscosidad del moco y la química del material afectan la fuerza del enlace creado.
Luego la probeta se retiró a la misma velocidad con la que descendió, y las propiedades
mucoadhesivas se midieron a partir del momento en que el hidrogel se separó del tejido mucoso.
La fuerza necesaria para separar el hidrogel de la membrana de la mucosa se registra en función
de la elongación, y se obtiene a partir de un gráfico fuerza (N) vs distancia (mm) proporcionado
por el programa del equipo. La fuerza máxima de desprendimiento (mN) se presenta en la tabla
3.1:
47
Tabla 3.1. Fuerza Máxima de Desprendimiento (mN).
0,4-GCCAG-Cist
Promedio
0,4-GCCAG
0,5-GCCAG-Cist
0,5-GCCAG
5
4
7
5
6
4
6
4
4
5
5
4
7
4
3
4
5
5
5±1
4± 1
5±2
4± 2
A partir de los resultados suministrados por la tabla 3.1 y de la figura 3.8, se observa una
variación de los valores y por tanto, una alta desviación estándar. Por ello, no es posible realizar
ninguna conclusión. En el gráfico se observa que tanto las muestras de 0,5-GCCAG como las de
0,5-GCCAG-Cist alcanzan valores similares de fuerza máxima de desprendimiento, dificultando
determinar cuál de los dos tipos de hidrogeles tiene una mayor adherencia (siendo el material más
adherente aquél al cual deba aplicársele una mayor fuerza para separarlo de la membrana
mucosa). Los errores podrían deberse a la no incorporación de la cisteína en toda la morfología de los
hidrogeles, ya que se observó macroscópicamente una coloración oscura únicamente en algunas
superficies de la muestra pero no a lo largo de todo el hidrogel. Otro factor que pudo haber influido sería
alguna falla que se haya podido generar en la posición central de la muestra, o debido a las
dimensiones irregulares del hidrogel, o a efectos de la pega utilizada para adherir el hidrogel a la
probeta metálica del equipo, arrojando la lectura de una mayor fuerza máxima de
desprendimiento.
48
Figura 3.8. Fuerza Máxima de Desprendimiento.
Tabla 3.2. Trabajo de Adhesión (µJ).
0,4-GCCAG-Cist
0,4-
0,5-GCCAG-
0,5-
GCCAG
Cist
GCCAG
2
3
14
2
1
1
8
1
4
2
3
5
3
1
1
2
2
Promedio
3±1
2±1
1
6±6
2±2
Al evaluar el trabajo de adhesión (TWA) a partir de la tabla 3.2 y del gráfico de la figura 3.9,
también se observa una elevada variación estándar de los resultados, lo cual no permitió definir el
49
comportamiento de cada material. Esto no permite concluir si la cisteína afecta el trabajo de
adhesión. Los resultados esperados eran que la cisteína incrementara la mucoadhesión del gel de
alginato con capilares de cobre, como se observó en la investigación de Bernkop-Schnurch et al.
[51] donde se estudió la influencia de la cisteína en las propiedades mucoadhesivas de los
polímeros conjugados alginato-cisteína, y se demostró que la mucoadhesividad del conjugado
modificado era cuatro veces mayor que para el alginato no modificado (control) (TWA: 100 μJ y
20 μJ, MDF: 70 mN y 10 mN, del modificado y control respectivamente).
Figura 3.9. Trabajo de Adhesión.
A pesar de que los resultados obtenidos en este trabajo no permiten llegar a una conclusión
cuantitativa, la tendencia observada cumple con lo esperado y lo reportado en trabajos similares,
como en el de Bernkop-Schnurch et al. [51] donde la fuerza máxima de desprendimiento y el
trabajo de adhesión tienden a ser mayores para los hidrogeles con cisteína, lo cual el autor
relaciona con que el enlace covalente de la cisteína tiene influencia en las propiedades
mucoadhesivas.
A continuación, se muestran los gráficos de la fuerza (N) en función de la distancia (mm) para
cada tipo de muestra, obtenidos por medio del analizador de textura. Por medio de estos gráficos
50
se calculó la fuerza máxima de desprendimiento, reportadas anteriormente, que está representada
por el valor del pico de fuerza de la curva, así como el trabajo de adhesión, que viene dado por el
área bajo la curva.
Fig. 3.10. Fuerza (N) vs Distancia (mm) de una muestra de 0,4-GCCAG.
Fig.3.11. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) de una muestra de 0,4-GCCAG-Cist.
51
Las figuras 3.10 y 3.11 muestran un zoom de las curvas de los ensayos de adhesión (en los
apéndices B y C se reportan las curvas completas) para una muestra de 0,4-GCCAG y una de 0,4GCCAG-Cist respectivamente. Al comparar ambas figuras, se podría afirmar que el área bajo la
curva del hidrogel sin cisteína es menor que para el gel que la contiene. De igual forma, al
comparar las muestras de 0,5-GCCAG y 0,5-GCCAG-Cist a partir de las figuras 3.12 y 3.13, se
podría concluir que el área bajo la curva del gel de alginato con capilares de cobre con cisteína, es
mayor que el área bajo la curva del hidrogel sin cisteína. Y como el área bajo la curva representa
el trabajo de adhesión, entonces se podría afirmar que el hidrogel con cisteína tiene una mayor
mucoadhesividad que aquel sin cisteína. Sin embargo, esto se observó particularmente en estas
muestras, pero no en todas las demás muestras (como se evidencia en las tablas 3.1 y 3.2) por lo
que no es posible generalizar los resultados y realizar esta conclusión.
Fig.3.12. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) de 0,5-GCCAG.
52
Fig.3.13. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) de una muestra de 0,5-GCCAG-Cist.
Como se mencionó anteriormente, una de las razones por las que hay variación en los
resultados podría deberse a que la cisteína no se incorporó totalmente en los hidrogeles, por lo
sería importante hacer un estudio de la composición química mediante FT-IR. Por otra parte,
también podría influir la irregularidad de las muestras de 0,5-GCCAG y 0,5-GCCAG-Cist, lo
cual es un factor muy importante en los ensayos mediante el analizador de textura, ya que sobre
la superficie es donde se concentran los esfuerzos aplicados por la probeta del equipo, entonces
resulta conveniente tener una superficie de contacto más regular.
3.4. Estudios de hinchamiento de los hidrogeles.
Una de las tareas más laboriosas en el campo de la tecnología de la liberación controlada, reside
en el desarrollo de formulaciones de polímeros capaces de liberar fármacos a velocidad constante
durante un tiempo determinado. Un acercamiento se basa en la utilización de polímeros
hidrofílicos que presenten la capacidad de hincharse en un medio acuoso, sin disolverse y
liberando el fármaco disuelto o disperso en ellos de manera de proporcionar una velocidad
53
prácticamente constante. La migración del fármaco al medio acuoso desde un sistema de esta
naturaleza, implica un proceso de absorción de agua o fluido biológico, y otro simultáneo de
desorción del fármaco, mediante un mecanismo de difusión controlado por el hinchamiento que
sufre el material polimérico. Por ello, es importante estudiar la capacidad de absorción de agua, la
cual está relacionada con el comportamiento del hinchamiento de los hidrogeles, una de las
características principales de estos polímeros al entrar en contacto con una solución acuosa.
Los hidrogeles tienen capacidades excepcionales para absorber grandes cantidades de agua con
respecto a su peso inicial. A su vez, esta propiedad se encuentra estrechamente relacionada con la
densidad de entrecruzamiento y el tipo de grupos funcionales presentes en las redes poliméricas.
Bajos porcentajes de hinchamiento se obtienen en muestras con un alto grado de
entrecruzamiento, lo cual limita considerablemente la movilidad de sus cadenas, haciendo los
geles más rígidos, lo que dificulta la difusión de agua a través de la red. Mientras que los
hidrogeles con altos porcentajes de hinchamiento tienen una mayor flexibilidad de sus cadenas y
una baja densidad de entrecruzamiento, es decir, las cadenas poseen una mayor movilidad debido
a un menor número de reticulaciones.
3.4.1. Índice de hinchamiento de los hidrogeles sumergidos en agua.
Cuando los hidrogeles de cada formulación fueron sumergidos en agua desionizada, se observó
un incremento en sus dimensiones y en su peso en función del tiempo, quedando en evidencia su
capacidad de hincharse. Para estudiar este comportamiento, se construyó un gráfico con el
porcentaje de hinchamiento en peso del hidrogel (%) en función del tiempo (h), como se indica
en la ecuación 2.1.
A continuación, se presentan las isotermas de absorción de agua y grado de hinchamiento de
dos muestras diferentes de cada tipo de hidrogel: 0,4-GCCAG (1 y 2) y 0,4-GCCAG-Cist (1 y 2)
sumergidos en agua desionizada a 23 °C (figuras 3.14 y 3.15).
54
Fig.3.14. Absorción de agua (%) en función del tiempo (h) para hidrogeles de alginato con
capilares de cobre a [CuSO4] = 0,4 M con y sin cisteína, sumergidos en agua a 23 °C.
Fig. 3.15. A la izquierda: Índice de hinchamiento en peso (%) en función del tiempo (h) para
hidrogeles de alginato con capilares de cobre a una [CuSO4] = 0,4 M con y sin cisteína,
sumergidos en agua a 23 °C. A la derecha: Gráfico anterior a bajos tiempos.
55
En la figura 3.14 se aprecia una rápida absorción de agua desionizada a 23 °C para las cuatro
formulaciones ensayadas, de alrededor de un 98% de absorción desde los primeros minutos de ser
sumergidos en el agua (15 min o 0,25 h). Esto se puede verificar en la figura 3.18 donde se
observa que los hidrogeles alcanzaron rápidamente un alto porcentaje de hinchamiento en los
primeros minutos.
Se ensayaron dos muestras de hidrogeles 0,4-GCCAG-Cist y dos muestras de 0,4-GCCAG,
cuyos resultados no revelan reproducibilidad para una misma formulación, lo cual se muestra en
la Fig. 3.15. Un hidrogel de 0,4-GCCAG sin cisteína y otro con cisteína alcanzan un
hinchamiento de más de 4000% en los primeros minutos con respecto a su peso inicial (peso de la
muestra seca después de la liofilización) mientras que las otras muestras de ambas formulaciones
presentaron un hinchamiento de alrededor de 3000% en peso. Debido a que los resultados no
muestran reproducibilidad, no se puede concluir la influencia que tiene la cisteína en el
comportamiento del hinchamiento de los hidrogeles.
En las figuras 3.16 y 3.17 se presenta el comportamiento de los hidrogeles de alginato con
capilares de cobre de [CuSO4] = 0,5 M con y sin cisteína que fueron sumergidos en agua
desionizada a 23 °C.
Fig. 3.16. Absorción de agua (%) en función del tiempo (h) para hidrogeles de alginato con
capilares de cobre a [CuSO4] = 0,5 M con y sin cisteína sumergidos en agua a 23 °C.
56
Fig.3.17. A la izquierda: Índice de hinchamiento en peso (%) en función del tiempo (h) para
hidrogeles de alginato con capilares de cobre a una [CuSO4] = 0,5 M con y sin cisteína,
sumergidos en agua a 23 °C. A la derecha: gráfico anterior a bajos tiempos.
La figura 3.16 muestra que los hidrogeles de 0,5-GCCAG con y sin cisteína alcanzan cerca del
100% de absorción de agua en 15 minutos, al igual que las muestras de 0,4-GCCAG y 0.4GCCAG-Cist, es decir, el agua penetra en las cadenas del polímero generando un elevado índice
de hinchamiento a bajos tiempos [67]. En la fig. 3.17 se observa variaciones en el índice de
hinchamiento de dos muestras distintas de una misma formulación de hidrogel. En otras palabras,
no se observa reproducibilidad en el comportamiento del hinchamiento de dos muestras del
mismo tipo de hidrogel (0,5-GCCAG-Cist (1) y (2)), ni al comparar las muestras de 0,5-GCCAG
(1) y (2).
Comparando el índice de hinchamiento de los cuatro tipos de hidrogeles, se observa en general
que tienen valores similares. Sin embargo, los hidrogeles de 0,4-GCCAG y 0,5-GCCAG deberían
presentar índices de hinchamiento diferentes, ya que el tamaño de capilares es distinto, y la
porosidad influye en la capacidad de hincharse. Los resultados que se esperaban obtener de
acuerdo a una investigación previa [51], era un mayor índice de hinchamiento en los hidrogeles
con cisteína, generando un rápido hinchamiento en estos polímeros porque se ve favorecido el
proceso de interdifusión entre el polímero y la mucosa, y de esta forma se produce una adhesión
más fuerte que para polímeros sin cisteína (menor hinchamiento).
57
La cantidad de hinchamiento se determina por la naturaleza del polímero, principalmente por su
carácter hidrofílico y por su densidad de entrecruzamiento. El grado de entrecruzamiento permite
afirmar que un mayor volumen libre dentro de la estructura del hidrogel permite que ocurra una
mayor retención de agua, lo cual se traduce en hinchamiento. Este hinchamiento puede ser
asociado con la hidrofilicidad, la cual se debe a la presencia de grupos funcionales hidrofílicos
presentes en estos hidrogeles, como los grupos carboxilos e hidroxilos contenidos en el alginato,
y los grupos tipo amina y tipo tioles presentes en la cisteína, los cuales son capaces de formar
puentes de hidrógeno. Estos grupos hidrofílicos se representan en la figura 1.2.
Tanto las muestras de 0,4-GCCAG y 0,5-GCCAG, presentan en las primeras horas de
absorción una difusión rápida de agua, ya que los hidrogeles tienen un mayor volumen libre, lo
que se traduce en un alto índice de hinchamiento [67]. El agua absorbida en esta primera etapa se
conoce como agua primaria. Luego de 20 horas, se puede decir que se da una segunda etapa, en la
que la absorción de agua se hace más lenta, y a esta se le denomina agua secundaria, como
consecuencia de la disminución del volumen libre. Por lo tanto, la red crece y se expande hasta
que alcanza el equilibrio termodinámico de hinchamiento, que es cuando el hidrogel mantiene su
peso a través del tiempo debido al estiramiento entero de sus cadenas, impidiéndole absorber más
cantidad de agua. Sin embargo, en algunas muestras se observa una disminución del porcentaje
de hinchamiento después de transcurrir 20 horas, lo cual puede deberse a que alguna muestras no
mantuvieron su forma inicial y se volvieron más frágiles, por lo que debían ser manipuladas
cuidadosamente, ya que, algunas se desintegraron en el agua durante este ensayo. Este proceso
está representado en la figura 3.17.
3.4.2. Índice de hinchamiento de los hidrogeles sumergidos en moco.
Con el fin de estudiar los efectos corporales sobre el hinchamiento de los hidrogeles, se
realizaron ensayos en moco cervical a 37 °C, y de la misma forma que en el caso anterior, se
evaluó la variación del peso de los hidrogeles sumergidos en la membrana mucosa. Se
construyeron los gráficos del índice de hinchamiento en peso (%) en función del tiempo (t) los
cuales se presentan a continuación.
58
Fig. 3.18. A la izquierda: Índice de hinchamiento en peso (%) en función del tiempo (h) para
hidrogeles de alginato con capilares de cobre a una [CuSO4] = 0,4 M con y sin cisteína,
sumergidos en una solución de moco cervical a 37 °C. A la derecha: gráfico anterior a bajos
tiempos.
Fig.3.19. A la izquierda: Índice de hinchamiento en peso (%) en función del tiempo (h) para
hidrogeles de alginato con capilares de cobre a una [CuSO4] = 0,5 M con y sin cisteína,
sumergidos en una solución de moco cervical a 37 °C. A la derecha: gráfico anterior a bajos
tiempos.
Los hidrogeles fueron sumergidos en una solución y a una temperatura distinta. Sin embargo,
las figuras 3.18 y 3.19 muestran porcentajes de hinchamiento menores en los hidrogeles
59
sumergidos en la solución de moco a 37 °C que aquellos sumergidos en agua desionizada a 23
°C. Como no se ensayaron los hidrogeles en agua desionizada a 37 °C, no se puede concluir si el
efecto observado es consecuencia del cambio de temperatura. Sin embargo, se debe tomar en
cuenta la viscosidad, ya que, es diferente en cada medio acuoso en el que los hidrogeles fueron
sumergidos. Se encuentra reportado que el agua a temperatura ambiente tiene una viscosidad de
0,01 poises, mientras que el moco cervical sintetizado tiene de 50 a 100 poises a 37 °C [64]. Se
podría decir que el paso de la solución de moco cervical a través de los capilares de los
hidrogeles está más impendido debido a que ésta es una solución mucho más viscosa que el agua.
Por ello la absorción de agua es más rápida y fácil y penetra en un mayor grado dentro de los
poros de los hidrogeles que el moco cervical, lo que se traduce en un hinchamiento mayor de las
cadenas, ya que, se genera un incremento de la reticulación de las redes de los hidrogeles, lo cual
limita la flexibilidad de las cadenas debido a la presencia de la solución de moco.
Así como el hinchamiento se encuentra relacionado con la densidad de entrecruzamiento del
polímero, a su vez, esta propiedad también puede relacionarse con la mucoadhesión. Según
fuentes bibliográficas, se puede afirmar en general que el incremento de la densidad de
entrecruzamiento se encuentra relacionado con una disminución en la mucoadhesión. Por
ejemplo, Thielmann et al. [68] trabajaron con poli(ácido acrílico) y metilcelulosa entrecruzados
térmicamente, y reportaron que el incremento en la densidad de entrecruzamiento generaba una
reducción en los parámetros de la solubilidad e hinchamiento, lo cual reducía las propiedades
mucoadhesivas. Se esperaba que los hidrogeles con cisteína presentaran una mayor
mucoadhesividad y por tanto mayor índice de hinchamiento, gracias a que su estructura contiene
átomos de azufre que le dan un carácter hidrofílico. Teóricamente, una mayor absorción de agua
indica una menor densidad de entrecruzamiento, y por tanto un incremento de las propiedades
mucoadhesivas. Sin embargo, no se pueden comparar ambas propiedades porque no se pudo
determinar ninguna conclusión a partir de los resultados que arrojó el ensayo mucoadhesivo.
60
CONCLUSIONES
 Se logró sintetizar exitosamente hidrogeles de alginato con capilares de cobre y cisteína
 La síntesis del GCCAG es sencilla, reproducible y no requiere de disolventes orgánicos,
moldeo, o de tecnología avanzada.
 En los hidrogeles ocurre una expansión anisotrópica, que se podría atribuir a que en el
CCGA las cadenas de alginato se orientan perpendicularmente al eje longitudinal de
capilares. Por lo tanto, los iones metálicos (Cu2+) durante el entrecruzamiento se localizan
preferencialmente en el plano perpendicular a los capilares, por lo que los cambios
dimensionales del hidrogel ocurren únicamente en este plano.
 No existe reproducibilidad en los resultados obtenidos por medio del analizador de
textura. Sin embargo, se observa una tendencia en que la fuerza máxima de
desprendimiento y el área del trabajo de adhesión es mayor en los hidrogeles con cisteína
que sin cisteína.
 Variaciones o errores en los resultados mucoadhesivos para las muestras 0,5-GCCAG y
0,5-GCCAG-Cist pueden ser atribuidas a que no presentaban dimensiones regulares.
 Los ensayos de hinchamiento muestran variaciones en el índice de hinchamiento de las
cuatro formulaciones, y los resultados para dos muestras de una misma formulación no
presentan reproducibilidad. Por lo tanto, no se puede afirmar la influencia que tiene la
cisteína en el comportamiento del hinchamiento de los hidrogeles.
 Los cuatro tipos de hidrogeles alcanzaron valores de absorción similares entre sí en los
primeros minutos de ser sumergidos en el agua a 23 °C, y presentaron un elevado índice
de hinchamiento a bajos tiempos.
61
 Los hidrogeles sumergidos en la solución de moco a 37 °C presentaron un porcentaje de
hinchamiento menor que los hidrogeles sumergidos en agua desionizada a 23 °C. Como
no se ensayaron los hidrogeles en agua desionizada a 37 °C, no se puede concluir si el
efecto observado es consecuencia del cambio de temperatura. Se podría decir que el paso
de la solución de moco a través de los capilares de los hidrogeles se dificulta gracias a que
ésta es una solución mucho más viscosa que el agua. Por ello la absorción de agua es más
rápida y fácil y penetra en un mayor índice dentro de los poros de los hidrogeles que el
moco cervical.
RECOMENDACIONES
 Realizar el proceso de diálisis para optimizar la purificación de los hidrogeles.
 Cambiar los parámetros de síntesis, por ejemplo, la relación molar entre la cantidad de la
cisteína y el alginato, para evaluar si ocurren cambios en la mucoadhesión, por influencia
de la cisteína.
 Recoger una mayor cantidad de micrografías MEB y MET por cada tipo de hidrogel y
tomarlas perpendicularmente a los capilares. De esta forma se puede determinar la
densidad de poros / mm2 y estudiar si existe alguna diferencia en la microestructura de los
capilares entre los hidrogeles con cisteína y sin cisteína, y entre los hidrogeles con una
concentración de CuSO4 de 0,4 y 0,5 M.
 Realizar los ensayos mucoadhesivos con hidrogeles con dimensiones más regulares y
superficies más uniformes. El área y el tiempo de contacto de la superficie del hidrogel
con el moco cervical es uno de los factores que más influye en las propiedades
mucoadhesivas.
 Cambiar los parámetros y las condiciones de ensayo del analizador de textura, como el
tiempo de pre-hidratación de los hidrogeles, el tiempo de contacto entre el hidrogel y la
62
membrana mucosa, la fuerza de contacto entre éstos y la velocidad de ensayo con que se
desplaza la probeta.
 Realizar una mayor cantidad de ensayos con el analizador de textura, evaluando cada una
de las variables mencionadas anteriormente para determinar cuáles son las mejores
condiciones para optimizar los resultados mucoadhesivos.
 Ensayar un mayor número de muestras de cada formulación de hidrogel para obtener
resultados de mucoadhesión más confiables.
 Evaluar los ensayos en el analizador de textura usando tabletas mucoadhesivas. Preparar
las tabletas, triturando el material polimérico (en este caso los hidrogeles secos) en
combinación con el fármaco.
 Realizar el estudio del hinchamiento hasta que los hidrogeles alcancen el equilibrio
termodinámico para determinar el mecanismo de difusión del agua.
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http://www.aapsj.org/abstracts/NBC_2007/NBC07-000679.PDF], revisado el 19 de Marzo de
2011.
73
APÉNDICES
Apéndice A. Determinación de la cantidad de EDC y sulfo-NHS requeridos en la reacción de
entrecruzamiento del GCCAG.
Masa del hidrogel = 0,06086 g
Como el 94% de la masa total del hidrogel es agua, el 6% representa el alginato:
Masa del alginato = 0,06086 gHidrogel 
6 gA lg inato
 0,00365 gA lg inato
100 gHidrogel
Fórmula molecular del alginato (ácido algínico) = (C6H8O6)n
Para calcular el peso molecular del monómero:
C = 12 g/mol x 6 = 72 g/mol
H = 1 g/mol x 8 = 8 g/mol
O = 16 g/mol x 6 = 96 g/mol
Entonces el peso molecular del ácido algínico es = 176g/mol
Se sabe que el peso molecular del EDC es 191,7 g/mol y del Sulfo-NHS es 217,13 g/mol.
Para la relación molar de Alginato: EDC: Sulfo NHS de 1:2:2, se requieren:
g EDC = 0,00365 gA lg inato 
1molA lg inato 2molesEDC 191,7 gEDC


 0,00795 gEDC
176 gA lg inato 1molA lg inato 1molEDC
g Sulfo-NHS= 0,00365gA lg inato 
1molA lg inato 2molesSulfo  NHS 217,3gSulfo  NHS


 0,00865g
176 gA lg inato
1molA lg inato
1molSulfo  NHS
74
Apéndice B. Gráfico del ensayo mucoadhesivo del hidrogel 0,4-GCCAG obtenido a través del
analizador de textura.
Figura B. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) del hidrogel 0,4-CCAG.
75
Apéndice C. Gráfico del ensayo mucoadhesivo de una muestra de hidrogel 0,4-GCCAG-Cist
obtenido a través del analizador de textura.
Figura C. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) del 0,4-GCCAG-Cist.
76
Apéndice D. Gráfico del ensayo mucoadhesivo del hidrogel 0,5-GCCAG obtenido a través del
analizador de textura.
Figura D. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) del 0,5-GCCAG.
77
Apéndice E. Gráfico del ensayo mucoadhesivo del hidrogel 0,5-GCCAG-Cist obtenido a través
del analizador de textura.
Figura E. Curva Fuerza (N) vs Distancia (mm) del 0,5GCCAG-Cist
78
Apéndice F. Datos para determinar el índice de hinchamiento de los hidrogeles sumergidos en
agua desioniazada a 23 °C.
Tabla G.1. Datos de hinchamiento de dos muestras de 0,4-GCCAG.
0,4-
0,4-
GCCAG
GCCAG
(1)
(2)
0
0,00277
0,1666
Tiempo
%H1
%H2
%W1
%W2
0,00204
0
0
0
0
0,08531
0,08256
1161,034
1543,75
96,75302
97,52907
0,3332
0,08610
0,08476
1600
2368,75
96,78281
97,5932
0,4998
0,08773
0,08861
1696,552
2106,25
96,84259
97,69778
0,7498
0,08673
0,08537
1544,828
2056,25
96,80618
97,6104
0,9998
0,08325
0,08266
1934,483
2506,25
96,67267
97,53206
1,2498
0,08701
0,09561
1917,241
2168,75
96,81646
97,86633
1,4998
0,08959
0,09622
1796,552
2318,75
96,90814
97,87986
1,8331
0,09012
0,09253
1665,517
2518,75
96,92632
97,79531
2,1664
0,08431
0,08445
1851,724
2362,5
96,71451
97,58437
2,6664
0,08493
0,08460
1772,414
2281,25
96,73849
97,58865
3,1664
0,08390
0,09059
1679,31
1500
96,69845
97,7481
3,6664
0,08095
0,08956
1706,897
2468,75
96,57813
97,7222
4,1664
0,77360
0,08310
1658,621
2387,5
99,64193
97,54513
20,1664
0,08614
0,09065
1844,828
2656,25
96,7843
97,74959
79
Tabla G.2. Datos de hinchamiento de dos muestras de 0,4-GCCAG-Cist.
0,4-
0,4-
GCCAG-
GCCAG-
Cist (1)
Cist (2)
0
0,00179
0,25
Tiempo
%H1
%H2
%W1
%W2
0,00163
0
0
0
0
0,04386
0,05443
2350,279
3239,264
95,91883
97,00533
0,5
0,05568
0,05602
3010,615
3336,81
96,7852
97,09032
0,75
0,05660
0,04875
3062,011
2890,798
96,83746
96,65641
1
0,05654
0,04163
3058,659
2453,988
96,8341
96,08455
1,25
0,05379
0,05386
2905,028
3204,294
96,67224
96,97364
1,5833
0,05495
0,04098
2969,832
2414,11
96,74249
96,02245
1,9166
0,05699
0,03874
3083,799
2276,687
96,8591
95,79246
2,2499
0,05858
0,04289
3172,626
2531,288
96,94435
96,19958
2,5832
0,05433
0,044
2935,196
2599,387
96,70532
96,29545
3,0832
0,06275
0,04624
3405,587
2736,81
97,14741
96,47491
3,5832
0,05388
0,03983
2910,056
2343,558
96,6778
95,90761
19,5832
0,05929
0,04612
3212,291
2729,448
96,98094
96,46574
41,5832
0,0581
0,02485
3145,81
1424,54
96,9191
93,44064
113,5832
0,07929
0,05825
4329,609
3473,62
97,74246
97,20172
80
Tabla G.3. Datos de hinchamiento de dos muestras de 0,5-GCCAG
Tiempo
0,5-
0,5-
GCCAG (1) GCCAG (2)
%H1
%H2
%W1
%W2
0
0,00062
0,00211
0
0
0
0
0,1666
0,0223
0,05695
3496,774
2599,052
97,21973
96,295
0,3332
0,02256
0,0618
3538,71
2828,91
97,25177
96,58576
0,4998
0,02175
0,06069
3408,065
2776,303
97,14943
96,52332
0,6664
0,0211
0,06621
3303,226
3037,915
97,06161
96,81317
0,9997
0,02209
0,06635
3462,903
3044,55
97,1933
96,81989
1,4997
0,0148
0,06491
2287,097
2976,303
95,81081
96,74935
2,4997
0,0206
0,06848
3222,581
3145,498
96,99029
96,91881
22,4997
0,02111
0,07392
3304,839
3403,318
97,063
97,14556
94,4997
0,02839
0,10286
4479,032
4774,882
97,81613
97,94867
190,4997
0,04809
0,11665
7656,452
5428,436
98,71075
98,19117
0
0,00062
0,00211
0
0
0,1666
0,0223
0,05695
3496,774
2599,052
97,21973
96,295
0,3332
0,02256
0,0618
3538,71
2828,91
97,25177
96,58576
0,4998
0,02175
0,06069
3408,065
2776,303
97,14943
96,52332
81
Tabla G.4. Datos de hinchamiento de dos muestras de 0,5-GCCAG
0,5-
0,5-
GCCAG-
GCCAG-
Cist (1)
Cist (2)
0
0,00125
0,1666
Tiempo
%H1
%H2
0,00083
0
0
0,0622
0,01375
4876
0,3332
0,04823
0,01093
0,4998
0,05431
0,6664
%W1
%W2
0
0
1556,626506
97,99035
93,96364
3758,4
1216,86747
97,40825
92,40622
0,01223
4244,8
1373,493976
97,6984
93,21341
0,04911
0,01275
3828,8
1436,144578
97,45469
93,4902
0,9997
0,05335
0,00986
4168
1087,951807
97,65698
91,58215
1,4997
0,05771
0,00954
4516,8
1049,39759
97,834
91,29979
2,4997
0,0579
0,01161
4532
1298,795181
97,84111
92,85099
22,4997
0,04194
0,01108
3255,2
1234,939759
97,01955
92,50903
94,4997
0,04341
0,01254
3372,8
1410,843373
97,12048
93,38118
190,4997
0,06309
0,01756
4947,2
2015,662651
98,0187
95,27335
0
0,00125
0,00083
0
0
0
0
0,1666
0,0622
0,01375
4876
1556,626506
97,99035
93,96364
0,3332
0,04823
0,01093
3758,4
1216,86747
97,40825
92,40622
0,4998
0,05431
0,01223
4244,8
1373,493976
97,6984
93,21341
82
Apéndice G. Datos para determinar el índice de hinchamiento de los hidrogeles sumergidos en
una solución de moco cervical a 37 °C.
Tabla G.1. Datos de hinchamiento de dos muestras de 0,4-GCCAG.
Tiempo
0,4-GCCAG (1)
0,4-GCCAG (2)
%H1
%H2
0
0,0029
0,0016
0
0
0,25
0,03657
0,0263
1161,034
1543,75
0,5
0,0493
0,0395
1600
2368,75
0,75
0,0521
0,0353
1696,552
2106,25
1
0,0477
0,0345
1544,828
2056,25
1,25
0,059
0,0417
1934,483
2506,25
1,5
0,0585
0,0363
1917,241
2168,75
1,8333
0,055
0,0387
1796,552
2318,75
2,1666
0,0512
0,0419
1665,517
2518,75
2,4999
0,0566
0,0394
1851,724
2362,5
2,9999
0,0543
0,0381
1772,414
2281,25
3,4999
0,0516
0,0256
1679,31
1500
3,9999
0,0524
0,0411
1706,897
2468,75
4,9999
0,051
0,0398
1658,621
2387,5
5,9999
0,0564
0,0441
1844,828
2656,25
83
Tabla G.2. Datos de hinchamiento de dos muestras de 0,4-GCCAG-Cist.
Tiempo
0,4-GCCAG-Cist (1)
0,5-GCCAG-Cist (2)
%H1
%H2
0
0,0014
0,0012
0
0
0,25
0,00203
0,013
45
983,3333
0,5
0,0272
0,0151
1842,857
1158,333
0,75
0,0264
0,0117
1785,714
875
1
0,025
0,0141
1685,714
1075
1,25
0,0281
0,0189
1907,143
1475
1,5
0,0296
0,0194
2014,286
1516,667
1,8333
0,029
0,0168
1971,429
1300
2,1666
0,0267
0,0141
1807,143
1075
2,4999
0,0287
0,0169
1950
1308,333
2,8332
0,0286
0,0156
1942,857
1200
3,1665
0,0327
0,021
2235,714
1650
3,4998
0,0289
0,0148
1964,286
1133,333
3,8331
0,0273
0,017
1850
1316,667
4,1664
0,0319
0,0209
2178,571
1641,667
84
Tabla G.3. Datos de hinchamiento de dos muestras de 0,5-GCCAG
Tiempo
0,5-GCCAG (1)
0,5-GCCAG (2)
%H1
%H2
0
0,0013
0,0019
0
0
0,25
0,0179
0,0173
1276,923
810,5263
0,5
0,0194
0,0225
1392,308
1084,211
0,75
0,0214
0,0218
1546,154
1047,368
1
0,0195
0,0266
1400
1300
1,25
0,0224
0,0253
1623,077
1231,579
1,5
0,0214
0,0245
1546,154
1189,474
1,8333
0,0259
0,0272
1892,308
1331,579
2,1666
0,0218
0,0271
1576,923
1326,316
2,4999
0,0229
0,0346
1661,538
1721,053
2,9999
0,0216
0,027
1561,538
1321,053
3,4999
0,0195
0,0237
1400
1147,368
3,9999
0,0198
0,016
1423,077
742,1053
4,9999
0,025
0,0275
1823,077
1347,368
5,9999
0,0298
0,028
2192,308
1373,684
85
Tabla G.4. Datos de hinchamiento de dos muestras de 0,5-GCCAG-Cist.
Tiempo
0,5-GCCAG-Cist (1)
0,5-GCCAG-Cist (2)
%H1
%H2
0
0,0017
0,0019
0
0
0,25
0,014
0,011
723,5294
478,9474
0,25
0,018
0,0177
958,8235
831,5789
0,25
0,0206
0,014
1111,765
636,8421
0,25
0,0231
0,0235
1258,824
1136,842
0,25
0,029
0,0183
1605,882
863,1579
0,25
0,0249
0,0203
1364,706
968,4211
0,3333
0,0283
0,0182
1564,706
857,8947
0,3333
0,0283
0,0237
1564,706
1147,368
0,3333
0,0275
0,026
1517,647
1268,421
0,5
0,0282
0,0181
1558,824
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