Efecto de tres Condiciones de Pasteurización sobre la Actividad

Efecto de tres Condiciones de Pasteurización sobre la Actividad
Enzimática y Antimicrobiana de un Extracto de Glucosa Oxidasa
Nirza Noguera, Luis Ojeda*, Ingrid Velásquez, Ninoska Ramírez, Antonio Yépez.
Instituto de Investigaciones Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Salud,
Universidad de Carabobo. Maracay-Venezuela. Apartado Postal 2351.
*Email: [email protected]
RESUMEN
En la actualidad existe una tendencia a incorporar enzimas en los alimentos como
aditivo; sin embargo, estas pueden perder actividad cuando son sometidas a tratamientos
térmicos, lo cual limita su aplicación. La Glucosa oxidasa (GOX) posee una capacidad
antimicrobiana que favorece la conservación de alimentos en estado sólido y líquido, por
lo que se determinó su potencial como aditivo natural, para ser incorporado durante el
procesamiento en bebidas, previo a la pasteurización. Para ello, se sometió un extracto de
GOX a tres condiciones de pasteurización: (a) 63°C por 30 min, (b) 72°C por 1 min y (c)
80°C por 1 min y se determinó su efecto sobre la actividad catalítica y antimicrobiana del
mismo. La actividad antimicrobiana fue probada sobre una cepa de Escherichia coli ATCC
25922, cultivada en medio LB con 1 mg/ml de glucosa y 1 U del extracto por ml de medio.
Se encontró que la enzima experimentó un descenso de su actividad catalítica de 33%
con el tratamiento térmico (condición a), 36% con (b) y 62% con (c). En cuanto a la
actividad antimicrobiana, se observó que independientemente del tratamiento térmico, los
sistemas con presencia de la enzima mantuvieron la población bacteriana aproximada a
4.5 x105 UFC/ml, mientras que la bacteria crecida en el medio sin la enzima alcanzó una
población superior a 1x106 UFC/ml. Esto demuestra que la GOX puede ser incorporada
previamente a los procesos de pasteurización y mantener sus propiedades catalítica y
antimicrobiana.
Palabras Clave: Glucosa oxidasa, pasteurización, actividad antimicrobiana.
ABSTRACT
Currently there is a tendency to incorporate enzymes as food additives. However,
these enzymes may lose activity when subject to thermic treatment, situation which limits
their application. Glucose oxidase (GOX) has antimicrobial properties which promote food
conservation either in solid or liquid state. Therefore, its potential as a natural additive
during drinks processing prior to pasteurization, was determined. For this purpose, a GOX
BioTecnología, Año 2013, Vol. 17 No. 2
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extract was subjected to three pasteurization conditions: (a) 63°C for 30 min, (b) 72°C for 1
min and (c) 80°C for 1 min and their effects on its catalytic activity and antimicrobial action,
were determined. Antimicrobial activity was tested on Escherichia coli strain ATCC 25922,
grown in LB medium containing 1 mg/ml glucose and 1 U extract per ml of medium. A
decrease in enzyme activity of 33% with thermic treatment (condition a), 36% with (b) and
62% with (c), was observed. Regarding antimicrobial activity, it was found that regardless
the thermic treatment used, the presence of enzyme maintained the bacterial population
approximately to 4.5 x105 CFU/ml, whereas the bacterial grown in medium lacking enzyme
reached a population greater than 1 x10 6 CFU / ml. These results show that GOX may be
incorporated prior to the pasteurization processes and maintain its catalytic and
antimicrobial properties.
Keywords: Glucose oxidase, pasteurization, antimicrobial activity.
la β-D-glucosa a D-glucono-1,5-lactona,
INTRODUCCIÓN
En la industria de alimentos, suelen
peróxido de hidrogeno y finalmente ácido
utilizarse diferentes métodos para la
D-gluconico en presencia de oxígeno
conservación
(Fiedurek & Gromada, 2000; Zia, et al
de
los
productos,
los
cuales van desde tratamientos térmicos
2010).
(la pasteurización, esterilización, secado,
aeróbicos y funciona normalmente en
deshidratación osmótica, la refrigeración
conjunto con la catalasa. La glucosa
y
químicos
oxidasa (GOX) es obtenida por fuentes
físicos
microbianas y normalmente es producida
la
congelación);
(incorporación
de
aditivos);
Está presente en organismos
(irradiación, pulsos electromagnéticos) y
por
biológicos (incorporación de enzimas).
Aspergillus niger y especies Penicillium
En
como Penicillium notatum, Penicillium
muchos
casos
se
busca
la
combinación de varios de éstos para
prolongar la vida útil del alimento. El uso
la
fermentación
aerobia
de
chrysosporium (Khurshid et al, 2011).
Esta enzima posee una capacidad
de enzimas en la conservación de
antimicrobiana
que
favorece
la
alimentos es una práctica que se ha
conservación de alimentos en estado
venido generalizando en el transcurso de
sólido y líquido (Fresl et al., 1984;
los años (Taylor & Richardson, 1979;
Dziezak, 1986; Field et al., 1986; Kantt &
Meyer & Isaksen, 1995).
Torres, 1993; Wong et al. 2008). Los
La glucosa oxidasa (EC1.1.3.4) es
productos obtenidos de la oxidación de la
una enzima que cataliza la oxidación de
β-D-glucosa tienen capacidad probada
BioTecnología, Año 2013, Vol. 17 No. 2
32
como bactericidas sobre especies como
Staphylococcus
aureus,
Salmonella
Extracto de Glucosa Oxidasa (GOX)
infantis, Clostridium perfringens, Bacillus
La obtención del extracto enzimático
cereus, Campylobacter jejuni, Listeria
se hizo siguiendo el protocolo propuesto
monocytogenes, Yersinia enterocolitica
por Ojeda et al. (2011).
(Tiina & Sandholm, 1989), Pseudomona
fragi (Yoo & Rand, 1985), Escherichia
coli enterotóxica (Massa et al., 2001).
En
la
presente
investigación
Actividad Enzimática
La actividad de GOX se evaluó
se
mediante la detección del peróxido de
evaluó el efecto que las temperaturas
hidrógeno
producido
pasteurización usadas en bebidas (63,
glucosa
72 y 80°C), tienen sobre la actividad
colorimétrico descrito por Zoghbi et al.
catalítica y antimicrobiana de la enzima
(2008). La unidad de actividad (U) fue
GOX, con la finalidad de determinar su
definida como la cantidad de glucosa
potencial como aditivo natural, para ser
oxidasa que cataliza la oxidación de 1
incorporado durante el procesamiento de
µmol de D-glucosa por minuto a pH 7 y a
las bebidas, previo a los tratamientos
25°C.
(sustrato),
al
por
oxidarse
el
la
método
térmicos.
Actividad Antimicrobiana de GOX sobre
la cepa de E. coli ATCC 25922
METODOLOGÍA
Se
Microorganismos
determinó
la
capacidad
antimicrobiana del extracto producido
La producción del extracto de GOX
sobre la cepa de E. coli seleccionada,
se obtuvo a partir de una cepa silvestre
para ello se tomó como referencia las
de Aspergillus niger, proveniente de un
investigaciones desarrolladas por Tiina &
aislado
el
Sandholm (1989) y Massa et al. (2001).
Departamento de Microbiología de la
Se cultivó la bacteria en un medio Luria-
Escuela de Bioanálisis de la Universidad
Bertani estéril (LB) con 1 mg/ml de
de
glucosa
clínico,
Carabobo
donada
por
(Maracay-Venezuela).
y
se
probaron
tres
Para probar el efecto antimicrobiano del
concentraciones de la enzima 0.1 U/ml;
extracto de GOX, se utilizó la cepa de
0.5 U/ml y 1.0 U/ml. El volumen de
Escherichia coli ATCC 25922, facilitada
cultivo fue de 50 ml, el inoculó de 1x104
por el Instituto Nacional de Higiene
UFC/ml y las condiciones a 37°C bajo
(Caracas-Venezuela),
agitación continua (100 rpm) durante 4 h.
BioTecnología, Año 2013, Vol. 17 No. 2
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Como control se cultivó la bacteria en
inoculadas con un total de 1 x 10 5
medio LB estéril con 1 mg/ml de glucosa
células/ml de E. coli, incubadas a 37°C
sin extracto enzimático. El experimento
bajo agitación constante a 100 rpm y su
se realizó por duplicado y el crecimiento
crecimiento fue monitoreado durante 5 h
fue monitoreado por el cambio de
por turbidez a 600 nm, las medidas
absorbancia a 600 nm.
fueron transformados a UFC/ml. Este
ensayo
se
hizo
por
duplicado
y
Efecto de la pasteurización sobre la
adicionalmente
actividad enzimática
controles, uno positivo, en el que la
se
incorporaron
dos
Se tomaron muestras de 1 ml de un
enzima fue adicionada al medio estéril
extracto enzimático, las cuales fueron
sin tratamiento térmico, y otro negativo,
sometidas
de
en el que no se incorporó la enzima.
pasteurización: (a) 63°C, (b) 72°C y (c)
Ambos controles fueron inoculados con
80°C y diferentes tiempos de exposición.
la
Para la temperatura de 63°C los tiempos
incubados junto con las demás muestras.
considerandos fueron 10, 20 y 30 min.
Se trabajó con un total de 12 fiolas las
Para las temperaturas más altas (72 y
cuales fueron arregladas bajo un diseño
80°C) se consideran tiempos cortos de
completamente al azar.
a
tres
temperaturas
misma
cantidad
de
células
e
15, 30 y 60 s. Todas las mediciones se
Análisis Estadístico
realizaron por duplicado.
Para la caracterización del efecto de
Efecto de la pasteurización sobre la
la
actividad antimicrobiana de la enzima
catalítica de las muestras, se calcularon
Para
determinar
sobre
la
actividad
efecto
los valores promedio y su desviación
antimicrobiano después del tratamiento
estándar con el fin de determinar los
térmico,
de
porcentajes de pérdida de actividad. El
experimento tipo bloques al azar, en el
crecimiento bacteriano fue presentado
que se incorporó un volumen del extracto
mediante
enzimático “pasteurizado” en medio LB
representar las UFC/ml por tiempo. Para
estéril con glucosa 1 mg/ml, volumen
transformar los datos de absorbancia a
final de ensayo 50 ml. Las condiciones
UFC/ml se empleó la ecuación UFC/ml =
de pasteurización establecidas fueron:
4.8x104(Abs600) + 9.9x103 (R2 = 0.88);
(a) 63°C por 30 min, (b) 72°C por 30 s,
obtenida por regresión lineal al relacionar
se
aplicó
el
temperatura
un
diseño
gráficos
de
dispersión,
(c) 80°C por 30 s. Las fiolas fueron
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34
al
los datos de la turbidez y contaje en
utilizar concentraciones de 0.5 y 1 U por
placas (datos no mostrados).
ml de medio LB con glucosa a razón de 1
mg/ml, exhibiendo una mayor inhibición a
la concentración más alta. En esta última
RESULTADOS Y DISCUSION
concentración el sistema la población
alcanzó
un
GOX con una actividad enzimática de 4.5
UFC/ml,
mientras
± 0.12 U/ml y con éste se desarrollaron
promedio en el sistema usado como
todos los experimentos descritos.
control fue de 7.5 x104 UFC/ml (Fig. 1).
Este
promedio
resultado
que
de
la
2.5
x104
Se obtuvieron 2.5 L de extracto de
población
concuerda
con
los
Efecto del extracto de GOX sobre el
reportes previos del efecto inhibitorio
crecimiento de E. coli ATCC 25922
sobre el crecimiento bacteriano de la
Al
determinar
la
enzima GOX (Massa et al., 2001; Tiina &
capacidad
antimicrobiana del extracto sobre el
Sandholm,
crecimiento de E. coli se encontró que
resultados, se decidió emplear esta para
este
los siguientes ensayos la concentración
fue
capaz
significativamente
su
de
retardar
crecimiento,
al
1989).
Dados
estos
de 1 U de GOX por ml de medio.
5
Número de Bacterias (UFC/ml)
1.0
x10
1,0E+05
4
7.5
x10
7,5E+04
4
Control
5.0
x10
5,0E+04
1U
GOX/ml
1.0U
GOX/ml
0,5U
0.5U GOX/ml
GOX/ml
4
2.5
x10
2,5E+04
0,1U
0.1UGOX/ml
GOX/ml
0
0,0E+00
0
60
120
180
240
Tiempo (min)
Fig. 1. Actividad antimicrobiana del extracto de GOX sobre E. coli ATCC 25922 cultivada en medio
LB estéril con glucosa 1 mg/ml. Utilizando tres concentraciones del extracto 0,1; 0,5 y 1 U/ml y un
control de medio LB estéril con glucosa sin enzima.
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35
Efecto de la pasteurización sobre la
estadísticamente similar al inicial (4.5 ±
actividad enzimática
0.09 vs. 4.47 ± 0.05; Tabla 1). En los
En cuanto a los efectos de las
temperaturas
de
pasterización
se
siguientes 30 s se presenta un cambió
drásticamente,
evidenciándose
una
encontró que el extracto sometido al
disminución de la actividad en 1.2 U/ml y
tratamiento térmico de 63°C, exhibió un
para los 60 s es cercana a 1.5 U/ml,
descenso de la actividad de 0.77 U/ml
obteniendo
durante los primeros 10 min del proceso,
promedio al final del proceso cercana al
y para los siguientes 20min la caída fue
65% (Fig. 2).
una
actividad
residual
alrededor de 1.5 U/ml, tal como se
Para el tratamiento a 80°C durante
muestra en la tabla 1. La actividad
los primeros 15 s la pérdida de actividad
residual promedio al final del proceso fue
fue alrededor de 0.25 U/ml (Tabla 1), a
de 67% (Fig. 2).
medida que transcurrió el tiempo de
Al
aumentar
la
temperatura
y
exposición el descenso de la actividad
disminuir los tiempos se encontró que en
fue mayor alcanzando una actividad
el caso del tratamiento a 72°C, se
residual de 38% (Fig. 2).
observó que durante los primeros 15 s la
pérdida de actividad enzimática promedio
fue
mínima,
obteniendo
un
valor
Tabla 1. Efecto de las condiciones de pasteurización sobre la actividad de GOX presente en el
extracto enzimático.
Condiciones de Pasteurización del extracto de GOX
63°C por 30 min
72°C por 1 min
80°C por 1 min
Tiempo
(min)
0
Actividad
(U/ml)
4.50 ± 0.09
Tiempo
(s)
0
Actividad
(U/ml)
4.50 ± 0.09
Tiempo
(s)
0
Actividad
(U/ml)
4.50 ± 0,09
10
3.73 ± 0.10
15
4.47 ± 0.05
15
4.25 ± 0.13
20
3.42 ± 0.11
30
3.31 ± 0.07
30
3.32 ± 0.04
30
3.02 ± 0.06
60
2.96 ± 0.04
60
1.70 ± 0.08
BioTecnología, Año 2013, Vol. 17 No. 2
36
% de Actividad Residual
100
75
50
25
0
63 C por 30min
72 C por 1min
80 C por 1min
Temperatura ( C)
Fig. 2. Actividad residual del extracto de GOX al final de los procesos de pasteurización, partiendo
de una actividad inicial de 4.5 U/ml.
La desnaturalización térmica de GOX
inicia el proceso de desnaturalización
ha sido ampliamente estudiada, se ha
térmica, con una significativa pérdida de
descrito que sigue una cinética de primer
su poder catalítico (Matos et al., 2012).
orden y que la pérdida de actividad se
Estos
debe
la
exponer la enzima a 41°C por 10 min
interacciones
ocurre una pérdida del 50% de su
iónicas e hidrofóbicas, y a la ruptura de
actividad inicial. De igual manera, Zoldak
enlaces de hidrógeno y fuerzas de van
et al. (2004) demostraron que por arriba
der Waals,
cambios
de los 55°C se evidencian cambios
conformacionales a nivel de la estructura
estructurales importantes que tienden a
secundaria,
la
ser irreversibles al superar los 58.5°C. En
consecuente pérdida del cofactor Flavin
consecuencia, la pérdida de actividad
adenin dinucleótido (FAD) (Matos et al.,
observada en el presente estudio, está
2012; Zoldak et al., 2004; Gouda et al.,
asociada
2003).
desnaturalización
principalmente
desestabilización
Se
que
que
ha
de
a
ocasionan
traen
consigo
reportado
que
a
temperaturas superiores a los 40°C, se
BioTecnología, Año 2013, Vol. 17 No. 2
autores
con
comprobaron
el
que
al
proceso
térmica.
de
Las
temperaturas de pasteurización probadas
37
están
por
encima
valores
que las cultivadas en presencia del
previamente descritos. Sin embargo, hay
extracto de GOX pasteurizado exhibieron
que destacar el hecho de que el extracto
valores entre 4–5 x 105 UFC/ml. Lo que
de
implica
GOX utilizado
de
los
exhibió
una alta
que
la
enzima
GOX
sigue
termoestabilidad, ya que su exposición a
manteniendo su actividad pese a haber
63°C por 10 min sólo ocasionó una
sido sometida a tratamientos térmicos
pérdida de actividad promedio del 16%,
(Figura 3). De hecho, la curva de
porcentaje que está por debajo del
crecimiento obtenida en los sistemas con
reportado por Matos et al. (2012) para
GOX pasteurizada a 63°C por 30 min
una temperatura de 41°C.
mostró
un
comportamiento
estadísticamente similar al crecimiento
Efecto de la pasteurización sobre la
en los sistemas con GOX sin pasteurizar,
actividad antimicrobiana
con
Al observar el crecimiento bacteriano
una
alrededor
población
de
4x105
promedio
final
UFC/ml.
Estos
en los sistemas de cultivo donde se
hallazgos abren una gran posibilidad en
incorporó la enzima pasteurizada a las
el campo de la tecnología de alimentos,
diferentes condiciones, se encontró que
puesto que se podría utilizar la GOX
la enzima mantuvo su efecto inhibitorio.
como aditivo natural en los procesos de
Las bacterias cultivadas en medio LB sin
elaboración de bebidas, previo a su
adición de GOX (control) incrementaron
pasteurización, para incrementar su vida
su población a 1x106 UFC/ml, mientras
en anaquel.
BioTecnología, Año 2013, Vol. 17 No. 2
38
6
x10
1.4
1,4E+06
6
Número de Bacterias (UFC/ml)
x10
1.2
1,2E+06
6
1,0E+06
x10
1.0
5
x10
8.0
8,0E+05
63 C por 30 min
72 C por 30s
5
80 C por 30s
x10
6.0
6,0E+05
Sin enzima
5
Enzima sin pasteurizar
x10
4.0
4,0E+05
5
2,0E+05
x10
2.0
0
0,0E+00
180
Tiempo (min)
90
0
270
360
Fig. 3. Curvas de crecimiento de la bacteria E. coli en medio LB – glucosa 1 mg/ml en presencia de
un extracto de GOX (1 U/ml) pasteurizado a diferentes condiciones: 63°C por 30 min, 72°C por 30
s y 80°C por 30 s.
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