identificación microbiológica mediante técnicas de

IDENTIFICACIÓNMICROBIOLÓGICAMEDIANTE
TÉCNICASDEBIOLOGÍAMOLECULAR
Título original: Identificación Microbiológica mediante Técnicas de Biología Molecular
Autores: Joaquín Cano Medina. T.S.S. de Laboratorio de Diagnóstico Clínico
Regina Baño Mata. T.S.S de Laboratorio de Diagnóstico Clínico
Edita e imprime: FESITESS ANDALUCÍA
C/ Armengual de la Mota 37
Oficina 1
29007 Málaga
Teléfono/fax 952 61 54 61
www.fesitessandalucía.es
ISBN: 978-84-694-4215-9
Diseño y maquetación: Alfonso Cid Illescas
Edición Octubre 2011
INDICE
UNIDADDIDÁCTICAI
PRESENTACIÓNYMETODOLOGÍADELCURSO
1.1SistemadeCursosaDistancia
1.2Orientacionesparaelestudio
1.3EstructuradelCurso
UNIDADDIDÁCTICAII
FUNDAMENTOS,BASESBIOQUÍMICAS,METODOSY
EXTRACCIÓNDELDNA/RNA.
5 7 8 10 13
2.1Fundamentos
2.2 Basesbioquímicas.DNAyRNA
2.3Métodosmolecularesdetipificaciónenellaboratoriodemicrobiología
2.4 Característicasdelosmarcadoresmoleculares.Criteriosparalaeleccióndeunbuen
marcadormolecular
2.5 Evaluacióndelosmarcadoresmoleculares
2.6 ExtraccióndelDNA/RNA
15 18 34 35 37 40 UNIDADDIDÁCTICAIII
TÉCNICASDEHIBRIDACIÓN
41 3.1 Técnicasdehibridación
3.2 AnálisisdelADNmedianteprocedimientosderestricciónehibridación
3.3Fundamentosyvariantestécnicas
3.4 Procedimientotécnico
3.5Criteriosparalainterpretaciónderesultados
3.6Indicaciones
3.7Inconvenientesdelatécnica
43 46 47 48 51 52 52 UNIDADDIDÁCTICAIV
TECNOLOGÍADELOSCHIPS(ARRAYS)
4.1Introducción
53 55 UNIDADDIDÁCTICAV
MÉTODOSDEAMPLIFICACIÓN
57 5.1Introducción
5.2Amplificacióndeladiana
59 59 UNIDADDIDÁCTICAVI
REACCIÓNENCADENADELAPOLIMERASA
6.1Reacciónencadenadelapolimerasa
6.2AnálisisdelADNmedianteamplificaciónconPCR
6.3Tratamientopreviodelosmicroorganismos
6.4Fundamentosyvariantestécnicas
6.5Criteriosparalainterpretacióndelosresultados
6.6Indicaciones
6.7Inconvenientesdelatécnica
63 65 91 92 93 93 93 93 UNIDADDIDÁCTICAVII
ANÁLISISDELADNMEDIANTEPROCEDIMIENTOSDERESTRICCIÓN
EHIBRIDACIÓN
95 7.1Aspectosdelanálisis
97 UNIDADDIDÁCTICAVIII
ANÁLISISDELADNCROMOSÓMICOMEDIANTEMACRORRESTRICCIÓN:
ELECTROFORESISENCAMPOPULSANTE(PFGE)
99 8.1Introducción
8.2Tratamientopreviodelosmicroorganismos
8.3Fundamentosyvariantestécnicas
8.4Criteriosparalainterpretaciónderesultados
8.5Indicaciones
8.6Inconvenientesdelatécnica
UNIDADDIDÁCTICAIX
ANÁLISISDELADNPORSECUENCIACIÓN.
MULTILOCUSSEQUENCETYPING(MLST)
9.1Introducción
9.2Tratamientopreviodelosmicroorganismos
9.3Fundamentosyvariantestécnicas
9.4Criteriosparalainterpretaciónderesultados
9.5Indicaciones
9.6Inconvenientesdelatécnica
UNIDADDIDÁCTICAX
OTRASTÉCNICASDETIPIFICACIÓNMOLECULAR.
AMPLIFICATIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM(AFLP)
10.1Amplificationfragmentlengthpolymorphism(AFLP)
UNIDADDIDÁCTICAXI
ANÁLISISDELADNEXTRACROMOSÓMICOYDELOSELEMENTOS
GENÉTICOSDETRANSMISIÓNHORIZONTAL
11.1Introducción
11.2Plásmidos
11.3FUENTES
CUESTIONARIO
Cuestionario
101 101 103 106 108 109 111 113 113 113 115 117 117 119
121 123 123 125 125 130 131 133 UNIDADDIDÁCTICAI
PRESENTACIÓNYMETODOLOGÍADELCURSO
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
Presentación,normasyprocedimientosdetrabajo.
Introducción
Antes de comenzar el Curso, es interesante conocer su estructura y el método que
se ha de seguir. Este es el sentido de la presente introducción.
Presentación
1. Sistema de Cursos a Distancia
En este apartado aprenderá una serie de aspectos generales sobre las técnicas de
formación que se van a seguir para el estudio.
2. Orientaciones para el estudio.
Si usted no conoce la técnica empleada en los Cursos a Distancia, le
recomendamos que lea atentamente los epígrafes siguientes, los cuales le ayudarán a
realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario, sólo tiene que seguir los
pasos que se indican en el siguiente índice:
Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del
proceso de aprendizaje propuesto por el equipo docente.
3. Estructura del Curso
Mostramos cómo es el Curso, las Unidades Temáticas de las que se compone, el
sistema de evaluación y cómo enfrentarse al tipo test.
1.1SistemadeCursosaDistancia
1.1.1RégimendeEnseñanza
La metodología de Enseñanza a Distancia, por su estructura y concepción, ofrece
un ámbito de aprendizaje donde pueden acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo
individual de dedicación, estudio y aprendizaje, a los conocimientos que profesional y
personalmente le interesen. Tiene la ventaja de estar diseñada para adaptarse a las
disponibilidades de tiempo y/o situación geográfica de cada alumno. Además, es
participativa y centrada en el desarrollo individual y orientado a la solución de problemas
clínicos.
La Formación a Distancia facilita el acceso a la enseñanza a todos los Técnicos
Especialistas/Superiores Sanitarios.
1.1.2CaracterísticasdelCursoydelalumnadoalquevadirigido
Todo Curso que pretenda ser eficaz, efectivo y eficiente en alcanzar sus objetivos,
debe adaptarse a los conocimientos previos de las personas que lo estudiarán (lo que
saben y lo que aún no han aprendido). Por tanto, la dificultad de los temas presentados se
ajustará a sus intereses y capacidades.
Un buen Curso producirá resultados deficientes si lo estudian personas muy
diferentes de las inicialmente previstas.
Los Cursos se diseñan ajustándose a las características del alumno al que se dirige.
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TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
1.1.3OrientacióndelosTutores
Para cada Curso habrá, al menos, un tutor al que los alumnos podrán dirigir todas
sus consultas y plantear las dificultades.
Las tutorías están pensadas partiendo de la base de que el aprendizaje que se
realiza en esta formación es totalmente individual y personalizado.
El tutor responderá en un plazo mínimo las dudas planteadas a través de correo
electrónico exclusivamente.
Diferenciamos para nuestros Cursos dos tipos de tutores:

Académicos. Serán aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso,
planteamientos sobre cuestiones test y casos clínicos. El tutor resuelve las
dudas que se plantean por correo electrónico.

Orientadores y de apoyo metodológico. Su labor se centrará
fundamentalmente en cuestiones de carácter psicopedagógicas, ayudando al
alumno en horarios, métodos de trabajo o cuestiones más particulares que
puedan alterar el desarrollo normal del Curso. El tutor resuelve las dudas que
se plantean por correo electrónico.
1.2Orientacionesparaelestudio
Los resultados que un estudiante obtiene no están exclusivamente en función de
las aptitudes que posee y del interés que pone en práctica, sino también de las técnicas de
estudio que utiliza. Aunque resulta difícil establecer unas normas que sean aplicables de
forma general, es más conveniente que cada alumno se marque su propio método de
trabajo, les recomendamos las siguientes que pueden ser de mayor aprovechamiento.
Por tanto, aún dando por supuestas la vocación y preparación de los alumnos y
respetando su propia iniciativa y forma de plantear el estudio, parece conveniente
exponer algunos patrones con los que se podrá guiar más fácilmente el desarrollo
académico, aunque va a depender de la situación particular de cada alumno y de los
conocimientos de la materia del Curso:
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
Decidir una estrategia de trabajo, un calendario de estudio y mantenerlo con
regularidad. Es recomendable tener al menos dos sesiones de trabajo por
semana.

Elegir el horario más favorable para cada alumno. Una sesión debe durar
mínimo una hora y máximo tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo
que se necesita de preparación, mientras que más de tres horas, incluidos los
descansos, puede resultar demasiado y descendería el rendimiento.

Utilizar un sitio tranquilo a horas silenciosas, con iluminación adecuada, espacio
suficiente para extender apuntes, etc.

Estudiar con atención, sin distraerse. Nada de radio, televisión o música de
fondo. También es muy práctico subrayar los puntos más interesantes a modo
de resumen o esquema.
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
a) Fase receptiva.

Observar en primer lugar el esquema general del Curso.

Hacer una composición de lo que se cree más interesante o importante.

Leer atentamente todos los conceptos desarrollados. No pasar de uno a otro
sin haberlo entendido. Recordar que en los Cursos nunca se incluyen
cuestiones no útiles.

Anotar las palabras o párrafos considerados más relevantes empleando un
lápiz o rotulador transparente. No abusar de las anotaciones para que sean
claras y significativas.

Esquematizar en la medida de lo posible sin mirar el texto el contenido de la
Unidad.

Completar el esquema con el texto.

Estudiar ajustándose al horario, pero sin imbuirse prisas o impacientarse.
Deben aclararse las ideas y fijarse los conceptos.

Resumir los puntos considerados primordiales de cada tema.

Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos
detenidamente. No insistir de momento más sobre ellos.
b) Fase reflexiva.

Reflexionar sobre los conocimientos adquiridos y sobre las dudas que hayan
podido surgir, una vez finalizado el estudio del texto. Pensar que siempre se
puede acudir al tutor y a la bibliografía recomendada y la utilizada en la
elaboración del tema que puede ser de gran ayuda.

Seguir paso a paso el desarrollo de los temas.

Anotar los puntos que no se comprenden.

Repasar los conceptos contenidos en el texto según va siguiendo la solución de
los casos resueltos.
c) Fase creativa.
En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolución de pruebas de
autoevaluación y a los casos concretos de su vivencia profesional.

Repasar despacio el enunciado y fijarse en lo que se pide antes de empezar a
solucionarla.

Consultar la exposición de conceptos del texto que hagan referencia a cada
cuestión de la prueba.

Solucionar la prueba de cada Unidad Temática utilizando el propio cuestionario
del manual.
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TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
1.3EstructuradelCurso
1.3.1ContenidosdelCurso

Guía del alumno.

Temario del curso en PDF, con un cuestionario tipo test.

FORMULARIO, para devolver las respuestas al cuestionario.

ENCUESTA de satisfacción del Curso.
1.3.2LosCursos
Los cursos se presentan en un archivo PDF cuidadosamente diseñado en Unidades
Didácticas.
1.3.3LasUnidadesDidácticas
Son unidades básicas de estos Cursos a distancia. Contienen diferentes tipos de
material educativo distinto:

Texto propiamente dicho, dividido en temas.

Bibliografía utilizada y recomendada.

Cuestionario tipo test.
Los temas comienzan con un índice con las materias contenidas en ellos. Continúa
con el texto propiamente dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la
redacción del mismo se evita todo aquello que no sea de utilidad práctica.
El apartado de preguntas test serán con los que se trabajen, y con los que
posteriormente se rellenará el FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo
test se adjuntan al final del temario.
Cuando están presentes los ejercicios de autoevaluación, la realización de éstos
resulta muy útil para el alumno, ya que:

Tienen una función recapituladora, insistiendo en los conceptos y términos
básicos del tema.

Hacen participar al alumno de una manera más activa en el aprendizaje del
tema.

Sirven para que el alumno valore el estado de su aprendizaje, al comprobar
posteriormente el resultado de las respuestas.

Son garantía de que ha estudiado el tema, cuando el alumno los ha superado
positivamente. En caso contrario se recomienda que lo estudie de nuevo.
Dentro de las unidades hay distintos epígrafes, que son conjuntos homogéneos de
conceptos que guardan relación entre sí. El tamaño y número de epígrafes dependerá de
cada caso.
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IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
1.3.4SistemadeEvaluación
Cada Curso contiene una serie de pruebas de evaluación a distancia que se
encuentran al final del temario. Deben ser realizadas por el alumno al finalizar el estudio
del Curso, y enviada al tutor de la asignatura, con un plazo máximo de entrega para que
pueda quedar incluido en la edición del Curso en la que se matriculó y siempre
disponiendo de 15 días adicionales para su envío. Los tutores la corregirán y devolverán al
alumno.
Si no se supera el cuestionario con un mínimo del 80% correcto, se tendrá la
posibilidad de recuperación.
La elaboración y posterior corrección de los test ha sido diseñada por el personal
docente seleccionado para el Curso con la intención de acercar el contenido de las
preguntas al temario asimilado.
Es IMPRESCINDIBLE haber rellenado el FORMULARIO y envío de las respuestas
para recibir el certificado o Diploma de aptitud del Curso.
1.3.5Fechas
El plazo de entrega de las evaluaciones será de un mes y medio a partir de la
recepción del material del curso, una vez pasado este plazo conllevará una serie de
gestiones administrativas que el alumno tendrá que abonar.
La entrega de los certificados del Curso estará en relación con la fecha de entrega
de las evaluaciones y NUNCA antes de la fecha de finalización del Curso.
1.3.6Aprendiendoaenfrentarseapreguntastipotest
La primera utilidad que se deriva de la resolución de preguntas tipo test es
aprender cómo enfrentarnos a las mismas y evitar esa sensación que algunos alumnos
tienen de “se me dan los exámenes tipo test”.
Cuando se trata de preguntas con respuesta tipo verdadero / falso, la resolución
de las mismas está más dirigida y el planteamiento es más específico.
Las preguntas tipo test con varias posibles respuestas hacen referencia a
conocimientos muy concretos y exigen un método de estudio diferente al que muchas
personas han empleado hasta ahora.
Básicamente todas las preguntas test tienen una característica común: exigen
identificar una opción que se diferencia de las otras por uno o más datos de los recogidos
en el enunciado. Las dos palabras en cursiva son expresión de dos hechos fundamentales
con respecto a las preguntas tipo test:

Como se trata de identificar algo que va a encontrar escrito, no va a ser
necesario memorizar conocimientos hasta el punto de reproducir con exactitud
lo que uno estudia. Por lo tanto, no debe agobiarse cuando no consiga
recordad de memoria una serie de datos que aprendió hace tiempo; seguro
que muchos de ellos los recordará al leerlos formando parte del enunciado o
las opciones de una pregunta de test.

El hecho de que haya que distinguir una opción de otras se traduce en muchas
ocasiones en que hay que estudiar diferencias o similitudes. Habitualmente se
11
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
les pide recordar un dato que se diferencia de otros por ser el más frecuente, el
más característico, etc. Por lo tanto, este tipo de datos o situaciones son los
que hay que estudiar.
Debe tenerse siempre en cuenta que las preguntas test hay que leerlas de forma
completa y fijándose en determinadas palabras que puedan resultar clave para la
resolución de la pregunta.
La utilidad de las preguntas test es varia:

Acostumbrarse a percibir errores de conceptos.

Adaptarse a los exámenes de selección de personal.
Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser
planteados en estas preguntas, conceptos que se retienen con facilidad.
1.3.7Envío
Una vez estudiado el material docente, se contestará la encuesta de satisfacción, la
cual nos ayudará para evaluar el Curso, corregir y mejorar posibles errores. Cuando haya
cumplimentado la evaluación, envíe las respuestas a la dirección indicada.
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UNIDADDIDÁCTICAII
FUNDAMENTOS,BASESBIOQUÍMICAS,METODOSY
EXTRACCIÓNDELDNA/RNA.
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
2.1Fundamentos
Los organismos eucariotas se caracterizan por la presencia de un núcleo en el que
se encuentra el material genético. En los procariotas, como las bacterias, el material
genético se encuentra en un área no limitada, pero reconocible, de la célula denominada
nucleoide. En los virus, el material genético está enfundado en una cubierta proteica
denominada cabeza o cápsula viral.
Tanto en eucariotas como en procariotas el DNA (ácido desoxirribonucleico) es la
molécula que almacena la información genética. El RNA (ácido ribonucleico) constituye el
material genético de algunos virus. Éstos son los dos tipos de ácidos nucleicos que se
encuentran en los organismos. Los ácidos nucleicos, juntamente con hidratos de carbono,
lípidos y proteínas, forman las cuatro clases principales de biomoléculas orgánicas que
caracteriza la vida en nuestro planeta.
En términos sencillos, el gen es la unidad funcional de la herencia. En términos
químicos es una cadena lineal de nucleótidos (los bloques químicos que constituyen el
DNA y el RNA). Una definición más conceptual es considerarlo como una unidad de
almacenamiento de información capaz de sufrir replicación, mutación y expresión.
El material genético se encuentra empaquetado en unidades discretas,
denominadas cromosomas.
Aunque algunos virus poseen varios cromosomas, la mayoría presentan sólo uno,
constituido por una molécula única de DNA o RNA. Según el tipo de virus, la molécula
puede ser unicatenaria o bicatenaria, lineal o circular. El cromosoma bacteriano consiste
en una estructura integrada por una molécula circular y bicatenaria de DNA asociada a
proteínas y RNA. Algunas bacterias poseen elementos genéticos adicionales denominados
plásmidos, de pequeño tamaño y también de DNA bicatenario y circular.
Bajo el microscopio, los cromosomas se ven como estructuras delgadas y
alargadas. Tienen un brazo corto y otro largo separados por un estrechamiento o
constricción primaria, llamada centrómero. El brazo corto se designa como p y el largo
como q. El centrómero es el punto de unión del huso mitótico y es parte integral del
cromosoma. Es esencial para el movimiento y segregación normales del cromosoma
durante la división celular. Los cromosomas metafásicos humanos presentan tres formas
básicas y se pueden clasificar de acuerdo con la longitud de los brazos corto y largo, así
como por la posición del centrómero. Los cromosomas metacéntricos tienen los brazos
corto y largo de aproximadamente la misma longitud, con el centrómero en el punto
medio. Los cromosomas submetacéntricos tienen los brazos corto y largo de longitudes
desiguales, con el centrómero más próximo a uno de los extremos. Los cromosomas
acrocéntricos tienen el centrómero muy cerca de un extremo, con un brazo corto muy
pequeño. Con frecuencia tienen constricciones secundarias en los brazos cortos,
conectando trozos muy pequeños del DNA, llamados tallos y satélites, al centrómero. Los
tallos contienen genes que codifican el RNA ribosómico.
En las células eucariotas, cada cromosoma consiste en una molécula de DNA
bicatenario asociada con proteínas básicas denominadas histonas, y con otras proteínas
no histónicas. La función de las histonas es la de constituir el soporte estructural del DNA
en una fibra de estructura compleja, la cromatina, cuya subunidad básica es el
nucleosoma.
15
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
En eucariotas, los cromosomas son visualizables más fácilmente con el microscopio
óptico cuando están en mitosis o en meiosis. Después de la división, este material,
llamado cromatina, se desespiraliza en la interfase y se puede estudiar más fácilmente con
el microscopio electrónico.
Aunque hay muchas excepciones, los miembros de muchas especies tienen un
número específico de cromosomas, denominado número diploide (2n), presentes en cada
célula somática. Mediante un cuidadoso análisis, se ve que estos cromosomas están en
parejas y cada miembro del par, cuando son visibles en la división celular, comparte casi la
misma apariencia. Los miembros de cada par, denominados cromosomas homólogos, son
idénticos en cuanto a su longitud y a la localización del centrómero, el punto en el que se
unen las fibras del huso en la división. También tienen la misma secuencia de lugares
génicos o loci y se aparean en la meiosis.
El número de tipos diferentes de cromosomas de cualquier especie diploide es
igual a la mitad del número diploide, que se denomina el número haploide (n). Otros
organismos, especialmente muchos vegetales, se caracterizan por ser poliploides, en este
caso, el número de tipos diferentes de cromosomas se llama número monoploide (n).
En células eucariotas existe un ciclo celular, dividido en dos fases: interfase y
mitosis. La interfase se compone a su vez de tres fases: G1, S, G2. La replicación del DNA
de los cromosomas tiene lugar durante la fase S al término de la cual cada célula presenta
2n cromosomas y 4n cromátidas. La mitosis (fase M) o división celular se compone a su
vez de cuatro fases: profase (durante la cual los cromosomas se hacen visibles como
estructuras con dos cromátidas); metafase (durante la cual los cromosomas se disponen
en el plano ecuatorial de la célula unidos al huso acromático); anafase (durante la cual
tiene lugar la separación de cromátidas); telofase (fase de reconstitución del núcleo). Al
final de la mitosis cada célula hija presenta 2n cromosomas y 2n cromátidas.
La meiosis es un proceso especial de división celular que da lugar a la aparición
de cuatro gametos haploides, los cuales, reciben uno de los miembros de cada una de las
parejas de cromosomas homólogos, a partir de una célula diploide. Este proceso consta
de dos mitosis sucesivas, denominadas primera y segunda división meióticas. Durante la
primera profase tiene lugar el apareamiento de cromosomas homólogos y el intercambio
de material genético (entrecruzamiento). Durante la primera anafase cada cromosoma
homólogo migra hacia un polo (n cromosomas, 2n cromátidas) y durante la segunda
anafase tiene lugar la separación de cromátidas (n cromosomas, n cromátidas). Al final de
la meiosis cada célula hija presenta n cromosomas y n cromátidas.
Hay dos causas de variación genética: las alteraciones cromosómicas estructurales
y alteraciones cromosómicas numéricas. Entre las primeras, también llamadas
aberraciones cromosómicas, se encuentran la duplicación, la delección y la reordenación
de segmentos de cromosomas (inversiones, translocaciones, fusiones y fisiones o cambios
robertsonianos). Las formas alternativas de un gen, que se producen como consecuencia
de la mutación, se denominan alelos. Frecuentemente, aunque no siempre, la variación
genética da lugar al cambio de alguna característica del organismo. Una vez que forma
parte del repertorio genético del organismo, tal variante puede extenderse por toda la
población mediante diversos mecanismos reproductivos.
Las alteraciones en el número de cromosomas que afectan solo a uno o varios
cromosomas reciben el nombre de aneuploidías (nulisomía, monosomía, trisomía,
tetrasomía…). Estos fenómenos se deben a la ocurrencia de no disyunción meiótica o de
16
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
un retráso anafásico durante la primera o segunda división meiótica. Las monosomías y
trisomías pueden afectar tanto a los autosomas como a los cromosomas sexuales, y
originan síndromes muy diversos en el hombre, así como anormalidades en las
segregaciones meióticas. No obstante, las plantas son más tolerantes a las aneuploidías.
Las variaciones consistentes en presentar un número de cromosomas múltiplo del
complemento haploide normal de una especie se denominan euploidías. Dependiendo del
número de dotaciones cromosómicas de los organismos que las presentan, éstos se
clasifican en monoploides, diploides, triploides, tetraploides, etc. Dependiendo del origen
de las múltiples series cromosómicas que presentan, los individuos poliploides reciben el
nombre de autopoliploides (cromosomas homólogos de una misma especie) o
alopoliploides (cromosomas homólogos de dos o más especies que han hibridado entre
sí). Las plantas autotriploides y autotetraploides presentan propiedades que les confieren
mayor valor comercial (por ejemplo, mayor tamaño).
2.1.1 ¿CómosealmacenalainformacióngenéticaenelDNA?
La secuenciación de nucleótidos de un fragmento de DNA que constituye un gen
está presente en forma de un código genético. Este código especifica la naturaleza
química de las proteínas (la composición de los aminoácidos) que son el producto final de
la expresión génica. Se producen mutaciones cuando se altera la secuencia de nucleótidos.
En el DNA hay cuatro nucleótidos distintos, diferenciándose entre sí por uno de sus
componentes, la base nitrogenada. El código genético es un triplete, por consiguiente,
cada combinación de tres nucleótidos constituye una palabra del código. Casi todos los
posibles tripletes especifican uno de los 20 aminoácidos (unidades químicas que forman
las proteínas).
2.1.2 ¿Cómoseexpresaelcódigogenético?
La información codificada en el DNA se transfiere primero en el proceso de
transcripción a la molécula de RNA mensajero (mRNA). Posteriormente, el mRNA se asocia
con un orgánulo celular, el ribosoma, en donde se traduce en una molécula proteica.
2.1.3 ¿Hay excepciones en donde las proteínas no son el producto final
deungen?
Sí. Por ejemplo, los genes que codifican el RNA ribosómico (rRNA), que forma
parte del ribosoma, y los del RNA transferente (tRNA), que actúan en el proceso de
traducción, se transcriben pero no se traducen. Por consiguiente, a veces, el RNA es el
producto final de la información genética almacenada.
2.1.4 ¿Porquélasproteínasqueconstituyenelproductofinaldelagran
mayoríadelosgenessontanimportantesparalosseresvivos?
Muchas proteínas son catalizadores biológicos, altamente específicos (enzimas). El
papel de estas proteínas es controlar el metabolismo celular, determinando qué
carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos u otras proteínas se encuentran en la célula.
Muchas otras proteínas llevan a cabo misiones no enzimáticas. Por ejemplo, la
hemoglobina transporta oxígeno, el colágeno proporciona soporte estructural y
flexibilidad a muchos tejidos, las inmunoglobulinas son la base de la respuesta inmunitaria
y la insulina es una hormona.
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TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Las enzimas, como catalizadores biológicos, disminuyen la energía de activación
necesaria para muchas reacciones bioquímicas y aceleran la consecución del equilibrio. De
otro modo, estas reacciones se darían tan lentamente que no tendrían efecto en los seres
vivos en las condiciones de nuestro planeta.
2.2 Basesbioquímicas.DNAyRNA
2.2.1 Lamoléculadelaherencia
El ADN, ácido desoxirribonucleico, es la molécula portadora y transmisora de la
información genética desde una generación a la siguiente. Un cambio en su composición
química puede provocar una alteración importante tanto en la anatomía como en la
fisiología del ser vivo portador de dicho cambio o mutación.
La molécula de ADN es un polímero formado por la repetición de subunidades
denominadas nucleótidos (fig.1). Cada nucleótido está constituido por un glúcido (la
pentosa desoxirribosa), un grupo ortofosfato unido al carbono 5' de la desoxirribosa y una
base nitrogenada unida al carbono 1' de la pentosa por un enlace N-glicosídico. Se
distinguen cuatro tipos de nucleótidos en función de la base nitrogenada: bases púricas
(adenina y guanina) y bases pirimidínicas (citosina y timina).
Fig.1. Estructura de una molécula de ADN, indicando los componentes de
los nucleótidos (pentosa, grupo fosfato y base nitrogenada, ya sea púrica o
pirimidínica), la formación de enlaces fosfodiéster entre ellos y la polaridad
de la cadena.
Los nucleótidos se unen entre sí a través de un enlace fosfodiéster establecido
entre el grupo hidroxilo del carbono 3' de un nucleótido y el grupo hidroxilo del carbono
5' del nucleótido siguiente. De esta forma, se constituye una cadena polinucleotídica de
longitud variable con una polaridad 5'-3' preestablecida. La información genética del
organismo viene codificada por la secuencia o sucesión de nucleótidos en la cadena.
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IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
2.2.2 LaestructuradelADN
En 1953, Watson y Crick publicaron en la revista Nature (1953;171:737-8) la
estructura del ADN, que fue dilucidada mediante el empleo de técnicas de difracción de
rayos X sobre cristales puros de ADN. Tras el estudio de los patrones de difracción
obtenidos, y basándose en las leyes de Chargaff, describieron la estructura tridimensional
de esta molécula y además sugirieron un posible mecanismo de replicación. El ADN está
constituido por dos cadenas polinucleotídicas enrolladas en sentido dextrógiro en torno a
un eje común para así constituir una doble hélice de 20 Å de diámetro. Las dos hebras se
disponen de forma antiparalela (una cadena en sentido 5' - 3' y la otra, en sentido 3' - 5')
que se envuelven mutuamente, de forma que no pueden separarse sin desenrollar la
hélice previamente (enrollamiento plectonémico).
2.2.2.1TiposdeconformacionesqueelADNpuedeadoptarenelespacio:
1. B-ADN: es la conformación cuyas características se asemejan a las descritas por
Watson y Crick.
2. A-ADN: aparece cuando la concentración de agua es inferior al 75% o cuando se
forman híbridos ADN-ARN. Se trata de una doble hélice más corta pero más ancha.
3. Z-ADN: aparece in vitro en soluciones de alta concentración salina e in-vivo, en
tractos de purinas-pirimidinas alternadas (GC o AT) o en secuencias con citosinas
metiladas. Cabe destacar que se trata de una hélice levógira con estructura en zig-zag.
Por último, es necesario apuntar que el ADN no es una molécula rígida, sino que su
estructura posee gran dinamismo: la doble hélice puede curvarse, retorcerse y
desenrollarse.
2.2.2.2EmpaquetamientodelADN
La longitud del ADN es mucho mayor que el tamaño del núcleo que lo contiene;
en consecuencia, el ADN debe condensarse y empaquetarse. Por ejemplo, el cromosoma
humano más pequeño contiene 4,6 107 bp, que equivalen a 14.000 µm y en mitosis este
cromosoma mide 2 µm, por lo que el grado de empaquetamiento es igual a × 7.000, es
decir, condensado 7000 veces. Dentro del núcleo, el ADN se organiza en varios grados de
empaquetamiento (fig.2)
1. Doble hélice de ADN = 2 nm.
2. Fibra de 10 nm con un grado de empaquetamiento igual a × 6. El ADN se asocia
a unas proteínas llamadas histonas, formando así un nucleoproteido denominado
cromatina, que presenta una estructura de "collar de cuentas ensartadas", que equivale a
una sucesión lineal de nucleosomas. El nucleosoma es la estructura básica en el
empaquetamiento del ADN en células eucarióticas y está constituido por ADN enrollado
alrededor de unas proteínas denominadas histonas. Aproximadamente 200 bp de ADN se
enrollan alrededor de ocho histonas, dos de cada tipo H2A, H2B, H3 y H4. Estas pequeñas
proteínas, que se encuentran muy conservadas a lo largo de la evolución, poseen una
naturaleza fuertemente básica, por lo que establecen interacciones electrostáticas con el
ADN. Por término medio, de los 200 bp de ADN por nucleosoma, 147 bp están enrolladas
1,8 vueltas alrededor del octámero proteico y de 8 bp a 114 bp constituyen el ADN
espaciador, que une los nucleosomas contiguos y contribuye a dar flexibilidad a la
cromatina. La fibra de cromatina de 10 nm es la llamada cromatina activa, ya que se puede
transcribir a ARN.
19
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Fig.2. Grados de empaquetamiento del ADN en el núcleo celular.
3. Fibra de 30 nm, que presenta un grado de empaquetamiento de × 40. Cada n
ucleosoma se asocia con una histona H1 y se disponen adoptando una estructura
solenoidal con seis nucleosomas por vuelta. Esta estructura se forma gracias a la
cooperatividad en la unión de las histonas H1 entre sí. Junto con la fibra de cromatina de
10 mn, constituye la eucromatina (aproximadamente el 90% del ADN), que es la cromatina
menos condensada que puede transcribirse (eucromatina activa) o no (eucromatina
inactiva).
4. Sección extendida del cromosoma (fibra de 300 nm): La fibra de 30 nm
constituye dominios en forma de bucles que se anclan a un eje proteico por las SAR
(Scaffold Attachment Region: regiones del ADN que se disponen cada 200 kb); estas
"proteínas andamio" son proteínas ácidas de mayor Pm que las histonas. A su vez, la fibra
de 300 nm se une a la lámina nuclear por las MAR (Matrix Attachment Regions: regiones
del ADN ricas en A-T pero sin secuencia consenso); todavía no está muy claro si las SAR
equivalen a las MAR.
5. Sección condensada del cromosoma (fibra de 700 nm) con grados de
condensación de × 1.000 (en interfase) e incluso de × 10.000 (en mitosis): la fibra de 300
nm se asocia a otro eje proteico, constituyendo así la fibra de 700 nm del cromosoma
metafásico, que equivale al máximo estado de condensación del ADN y junto con la fibra
de 300 nm constituye la heterocromatina que es funcionalmente inactiva y no contiene
genes. La heterocromatina se divide en constitutiva que siempre aparece como tal en
todos los cromosomas y forma parte de estructuras como el centrómero y los telómeros, y
facultativa, que no es permanente y sólo aparece en ciertas células, como pueden ser los
corpúsculos de Barr.
20
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
2.2.2.3Anatomíafuncionaldelgen
Un gen es un fragmento de ADN de 2-20 kb que funciona como una unidad y
codifica para un producto determinado, ya sea un ARN o una proteína. Actualmente se
distinguen como partes integrantes de un gen los elementos que a continuación se
describen (fig.3):
Fig.3. Estructura génica. LCR: Locus Control Region
MAR = Matrix Attachment Region; P = potenciador
PR = promotor regulador; N = núcleo central del promotor
EF = elemento frontera; E: exón; I: intrón

Región de control (Locus Control Region: LCR)
Elemento regulador en cis- que permite una expresión génica de alta eficacia,
específica de tejido, dependiente del número de copias e independiente de la posición en
el cromosoma. Los LCR son considerados como lugares que remodelan la cromatina y
controlan el acceso global de activadores y represores a una región amplia del ADN.
Dentro del LCR se pueden distinguir:

Secuencias MAR (Matrix-Associated Regions)
Ricas en nuecleótidos A y T, que flanquean los genes activos y los organizan en
dominios o bucles de cromatina.

Elementos aisladores o frontera
Secuencias reguladoras que poseen la propiedad de impedir que un potenciador
(enhancer) actúe sobre otro gen situado fuera del dominio establecido. De esta forma,
ayudan a definir la frontera entre dos loci regulados de forma diferencial y establecer
dominios funcionalmente independientes en el cromosoma.
21
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
Potenciadores (enances)
Secuencias de ADN que pueden aumentar la transcripción de un gen en un factor
de × 1.000 independientemente de su posición y orientación en el genoma. Los
potenciadores suelen ser necesarios para la transcripción eficiente de los genes y por ello
median la expresión génica selectiva en eucariotas. Los potenciadores pueden actuar
provocando cambios reconocibles en la estructura del ADN, uniéndose a determinados
factores de transcripción o bien actuando como lugar de entrada para la ARN polimerasa
y otros factores de transcripción basal.

Promotor
Secuencias de ADN localizadas entre ¬500 y ¬1 bp en relación con la secuencia de
inicio de transcripción de un gen, a las que se unen otras proteínas que modifican la
velocidad de transcripción. Dentro del promotor regulador se pueden encontrar los
siguientes elementos en distinto número, localización y orientación:
Secuencias GC (localizadas entre ¬40 y ¬100 bp en relación con el sitio de inicio de
transcripción del gen)
Se pueden encontrar en múltiples copias y en ambas orientaciones dentro del
mismo gen; determinan la eficiencia del promotor y sobre todo aparecen en genes
constitutivos. Es el lugar de unión para la proteína SP1.
Caja CAAT
Localizada habitualmente a ¬80 bp, y caja CACCC situada 5' de CAAT; determinan
la unión inicial de la maquinaria de transcripción. Son los lugares de unión para factores
de transcripción como C/EBPs, CTF, CP1 y CP2.

Potenciadores
A los que ya nos hemos referido anteriormente.

Silenciadores o represores
Secuencias de ADN que dificultan o bloquean la transcripción de un gen.

Núcleo del promotor (localizado entre las posiciones ¬40 a + 50)
Secuencia de ADN que permite la transcripción basal de un gen (velocidad de
transcripción muy baja). Generalmente, pero no siempre, contiene la caja TATA o Hogness
box (localizada entre ¬25 bp y ¬10 bp), que es la zona del ADN donde se une la proteína
TBP (TATA Binding Protein) y determina el punto de iniciación de la transcripción.
Deleciones en la caja TATA determinan un punto de iniciación variable.

Gen (propiamente dicho)
Secuencia de ADN que codifica para un producto (ARN o proteína). Dentro de un
gen se pueden distinguir los siguientes elementos:

Exón o secuencia codificante
Fragmento de ADN que contiene la información para sintetizar parte de una
proteína. Los exones de un gen, además de contener secuencias codificantes, también
22
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
presentan elementos situados 5', denominados leader, y 3', denominados trailer, de la
secuencia codificante que determinan un correcto inicio y terminación de la traducción del
mARN. Cabe destacar que los exones de un gen siempre son colineares con la proteína
codificada.

Intrón
Secuencia no codificante que se intercala entre dos exones de un mismo gen. Los
intrones pueden ser muy grandes, incluso mayores que los exones, y se encuentran
flanqueados por las secuencias consenso que intervienen en el proceso de maduración del
ARN (splicing).
2.2.3ReplicacióndelADN
El dogma central de la Biología Molecular establece las relaciones entre el ADN,
ARN y proteínas, en el que el ADN dirige su propia replicación y su transcripción a ARN, el
cual a su vez dirige su propia traducción a proteínas. La replicación consiste en la
duplicación del material genético de las células. En células eucariotas este proceso se lleva
a cabo dentro de la fase S, o de síntesis, del ciclo celular.
Durante el proceso general de la replicación, se produce en primer lugar un
desenrollamiento de la doble hélice de ADN y posteriormente la síntesis de dos hebras
hijas complementarias a las hebras progenitoras. Por este motivo se dice que el proceso
es semiconservativo, cada célula hija recibe una cadena progenitora y una de nueva
síntesis.
La replicación del ADN tiene lugar en las denominadas horquillas o burbujas de
replicación, que son puntos concretos del ADN donde se produce simultáneamente el
desenrollamiento de la doble hélice y la síntesis de nuevo ADN. En células eucariotas
existen entre 100 y 1000 orígenes de replicación por cromosoma. En estas horquillas de
replicación se encuentra toda la maquinaria que interviene en el proceso, conjunto
denominado replisoma. El proceso de síntesis es llevado a cabo por las ADN-polimerasas
que utilizan ADN monocatenario como molde para la síntesis y necesitan unas secuencias
cebadoras para comenzar el proceso de síntesis de nuevo ADN. En eucariotas se han
descrito cinco tipos de polimerasas:
, ß,
,
y
que se diferencian entre sí por su
distribución dentro de la célula, sus propiedades cinéticas y la sensibilidad a distintos
inhibidores.
La presencia de las histonas y demás proteínas que intervienen en el
superenrollamiento del ADN dificultan el mecanismo de replicación en eucariotas, siendo
necesaria la acetilación de las histonas en residuos de lisina y arginina, lo que desestabiliza
su unión con el ADN y facilita la replicación. Una vez que se van generando las nuevas
hebras hijas, el mismo ADN se enrolla y superenrolla alrededor de las histonas
desacetiladas.
La linearidad del ADN también influye en el proceso de replicación. Aunque en
principio cabría esperar que los extremos del ADN se acortasen progresivamente en cada
fase de replicación, debido a la incapacidad de las polimerasas para restituir las secuencias
cebadoras de los extremos del inicio de la replicación, el problema se ha solucionado
gracias a la peculiaridad de que el ADN de estos extremos está formado por secuencias
repetitivas (telomeros), y a la existencia de unas enzimas denominadas telomerasas que
son capaces de reponer estos extremos en el ADN.
23
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
2.2.3.1TranscripcióndelADN
La transcripción es el proceso por el cual se produce la síntesis de ARN a partir de
un molde de ADN mediante un complejo enzimático denominado ARN-polimerasa. La
transcripción se lleva a cabo en tres fases denominadas: iniciación, elongación y
terminación (fig.4).
Fig.4. Modelo de transcripción: 1, iniciación; 2, elongación; 3, terminación.
La ARN-polimerasa contiene dos lugares de unión de ribonucleótidos, en uno
comienza la transcripción y en el otro tiene lugar la elongación. El lugar donde comienza
la transcripción tiene preferencia por ribonucleótidos de purina, por lo que generalmente
el primer ribonucleótido será purínico. El siguiente paso es la entrada de un
ribonucleótido complementario con el del ADN molde y la unión con el nucleótido ya
existente. El enlace fosfodiéster se produce como consecuencia de un ataque nucleofílico
por parte del hidroxilo 3' del primero de los nucleótidos sobre el fosfato a del nucleótido
entrante, quedando el primer nucleótido con tres residuos fosfato en 5'. La elongación se
produce por la entrada de más ribonucleótidos complementarios a la cadena de ADN
molde y la generación de nuevos enlaces fosfodiester entre el hidroxilo en 3' de la cadena
que se está formando y el grupo fosfato en
del ribonucleótido entrante. En la
terminación de la síntesis del ARN, la ARN-polimerasa suele transcribir más allá del final
de la secuencia codificante del gen, hasta que encuentra una serie de secuencias entre las
que se encuentra la secuencia AATAAA, que es reconocida por una endonucleasa en el
pre-mARN, que introduce un corte entre 11 y 30 residuos hacia 3', quedando el premARN listo para el procesamiento postrascripcional.
El pre-mARN formado va a sufrir una serie de modificaciones postranscripcionales,
que estabilizan las moléculas de ARN y permiten la eliminación de elementos que no se
van a traducir. Nada más ser sintetizada, la molécula de pre-ARN sufre, por acción de una
polimerasa que no está dirigida por el ADN molde, la adición en el extremo 3' de una cola
de poliadenina de hasta 200 residuos que recibe el nombre de cola poli-A cuya función no
se conoce con exactitud. Además, en el extremo 5', en un proceso llevado a cabo por una
guanilil transferasa, se le añade una 7-metil-guanina en sentido inverso, cuya función es
facilitar la unión del ARN al ribosoma.
24
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
2.2.3.2TraduccióndelARN
El proceso de transferencia de la información desde el lugar de almacenamiento, el
ADN, hasta el sistema ejecutor de esa información, las proteínas, consta de un primer paso
en el que se transportan las moléculas de mARN desde el núcleo hasta el lugar donde
preferentemente actúan las proteínas, el citoplasma. El segundo paso consiste en la
síntesis de proteínas a partir de lo que está escrito en el mARN, proceso que se conoce
con el nombre de traducción. La información contenida en el ADN se "traduce" mediante
el código genético, que relaciona la información contenida en el mensaje nucleotídico con
el orden en que están los aminoácidos en las proteínas.
Así como el ADN necesita un "mensajero" (mARN) que transporte la información
hasta el citoplasma, el cambio de un sistema basado en la unión de nucleótidos a otro
basado en la unión de aminoácidos, requiere la participación de moléculas adaptadoras:
los ARN de transferencia (tARN). Los tARN se unen por uno de sus extremos a un codón
(triplete de nucleótidos) específico de la molécula de mARN y por el otro al aminoácido
específico para este codón y, de esta forma, permiten que los aminoácidos se alineen de
acuerdo con la secuencia de nucleótidos del mARN.
Sabiendo que normalmente en la naturaleza existen 20 aminoácidos distintos
(recientemente se han conocido posibles excepciones a este criterio) y que el mARN
presenta cuatro nucleótidos diferentes, se necesitan, al menos, combinaciones de esos
cuatro elementos tomados de tres en tres (4 =64) para obtener un número mayor de 20
combinaciones posibles, ya que si se combinase de dos en dos (4 =16) no serían
suficientes para todos los aminoácidos. Tres de los 64 codones no codifican ningún
aminoácido, sino que determinan el final de una cadena polipeptídica (codones de
terminación), quedando 61 codones para los 20 aminoácidos diferentes, motivo por el que
la mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón, lo que justifica la
expresión de que el código genético es un código degenerado. Dos aminoácidos,
metionina y triptófano, son codificados por un único codón cada uno, lo que explica que
sean los menos abundantes de las proteínas.
La degeneración del código genético implica o que existe más de un tARN para
cada aminoácido o que una misma molécula de tARN puede aparearse con más de un
codón. De hecho se producen ambas cosas. Para algunos aminoácidos existe más de una
molécula de tARN, y algunas moléculas de tARN están construidas de tal manera que
únicamente exigen un apareamiento exacto de las dos primeras posiciones del codón, de
forma que pueden tolerar una adaptación defectuosa en la tercera que explica por qué
muchos de los codones alternativos para un mismo aminoácido se diferencian entre ellos
únicamente en el tercer nucleótido.
La traducción comienza cuando el mARN se une a un complejo ribonucleoproteico,
formado por rARN y proteínas, denominado ribosoma que está formada por dos
subunidades: una subunidad pequeña, que se une al mARN y a las moléculas de tARN, y
otra subunidad grande, que cataliza la formación de los enlaces entre los distintos
aminoácidos que se van a incorporar a la proteína (enlaces peptídicos). El rARN
desempeña un papel central en las actividades catalíticas del ribosoma.
Cada ribosoma contiene tres lugares de unión para moléculas de ARN: uno para
mARN y dos para tARN: el Sitio P (donador) que acoge a la molécula de tARN que está
unida a la cadena polipeptídica en crecimiento; el sitio A (aceptor) que acoge a la
25
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molécula de tARN entrante cargada con un aminoácido, y c) finalmente, el sitio E (salida)
que acoge a la molécula de tARN saliente vacía.
Como mostramos en la figura 5, el proceso de elongación puede representarse en
un ciclo de tres etapas.
Fig.5. Dibujo esquemático del proceso de elongación en la traducción: existe un peptidil-tARN en
formación en el lugar P; llega un aminoacil-tARN al lugar A; se forma un enlace peptídico entre el
último aminoácido del peptidil-tARN y el aminoácido que trae el aminoacil-tARN transfiriéndose la
cadena polipeptídica con un aminoácido más a este tARN, que del lugar A se trasloca al P y
comienza de nuevo el ciclo.
La fidelidad del proceso de síntesis de proteínas depende de la precisión de los
dos principales mecanismos de adaptación: a) el mecanismo que une específicamente
cada uno de los aminoácidos activados con sus moléculas de tARN correspondientes, que
depende de la actividad de las enzimas denominadas aminoacil-tARN-sintetasas que
acoplan cada aminoácido a su grupo de moléculas de tARN apropiadas, y b) el
apareamiento de bases de los codones del mARN con los anticodones del tARN. Para
ambos sistemas las células han desarrollado, a lo largo de la evolución, mecanismos de
corrección.

Control de la expresión en células eucariotas
Los mecanismos que controlan la expresión de la información contenida en los
genes actúan a varios niveles, desde elementos que tienen que ver con la estructura
génica hasta mecanismos postraduccionales. A continuación resumimos lo que se sabe
hasta el momento sobre este proceso (fig.6).
26
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
Fig.6.Esquema de las etapas en las que se puede controlar la expresión de los genes
eucariotas.

A nivel del ADN
La cromatina interfásica se puede clasificar en dos categorías, eucromatina, difusa y
transcripcionalmente
activa,
y
heterocromatina,
altamente
condensada
y
transcripcionalmente inactiva, debiendo la maquinaria de transcripción abordar de manera
específica los diferentes niveles de la estructura de la cromatina eucariota.
En este punto es necesario mencionar la denominada regulación epigenética, es
decir, la modulación de la expresión génica atendiendo a razones estructurales presentes
en el ADN, que se sitúan por encima de la secuencia primaria (niveles de
empaquetamiento, estructuras terciarias, etc.), ya q ue se ha visto que desempeña un
papel importante en el control transcripcional. De hecho, se sabe que, en general, un alto
nivel de empaquetamiento cromatínico reprime la transcripción y que, si disminuimos ese
nivel, por ejemplo, acetilando las histonas, activamos la transcripción. También se ha
sugerido que los bucles del ADN, presentes en los cromosomas pueden corresponder a
unidades de regulación génica, es decir, regiones dentro de las cuales, amplificadores y
represores transcripcionales pueden existir juntos y actuar modularmente.
Por otra parte, la metilación en vertebrados (unión de un grupo metilo en la
posición N-5' de la citosina en un par CpG) tiene un efecto represor en la iniciación de la
transcripción, posiblemente mediante la unión de una proteína específica al dinucleótido
CpG metilado. Las islas CpG son regiones de entre 1 y 2 kilobases de longitud en las que
la cantidad de G + C supera el 50% de la bases. Aparecen casi siempre en la zona 5' de los
genes, solapando con el primer exón. Se estima que el 56% de los genes humanos están
asociados con una isla CpG.
27
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico

A nivel del ARN
El control de la expresión eucariota se realiza principalmente en la transcripción, ya
que el modo que tienen las células de expresar las distintas proteínas que las caracterizan
en función del ambiente o del momento de su ciclo vital es transcribiendo unos genes y
silenciando otros, es decir, las células ahorran energía iniciando la transferencia de
información únicamente de aquellos genes que interesan, evitando así un gasto
innecesario de energía si el control no se realizase en la etapa más temprana de la
expresión y, por ejemplo, se transcribieran todos los genes y sólo se tradujeran aquéllos
necesarios. El mecanismo general de regulación de la transcripción está basado en la
existencia de secuencias particulares hacia 5' del codón de iniciación en el ADN,
reconocidas por proteínas reguladoras (factores de transcripción), que se unen al ADN
modificando la transcripción del gen. Estas proteínas se deslizan a través del surco mayor
del ADN mediante interacciones electrostáticas inducidas por la secuencia particular del
ADN en el promotor. Sin embargo, no todas las proteínas reguladoras génicas activan la
transcripción, muchas de ellas actúan como proteínas represoras, impidiendo o
silenciando determinados genes. Por otra parte, la expresión de diversos genes eucariotas
puede estar también controlada por la selección de sitios alternativos para la iniciación de
la transcripción.
La atenuación de la transcripción se produce cuando la cadena de ARN naciente
adopta una conformación que interacciona con la ARN-polimerasa abortando su
transcripción. La existencia de ciertas proteínas que se ensamblan al promotor parece que
determinan la conformación de atenuación.
Desde el punto de vista del procesamiento del mARN, la mayoría de los genes se
transcriben inicialmente generando precursores largos de mARN, que contienen
secuencias exónicas e intrónicas, que posteriormente son procesados para dar una
molécula madura de mARN. Una de las etapas de la maduración está caracterizada por el
corte y empalme de secuencias, de tal manera que se eliminan los intrones dejando
solamente los exones como secuencias que se expresan (splicing). Muchas veces una
célula puede madurar un precursor de diferentes formas, obteniéndose así polipéptidos
finales distintos a partir de un mismo gen. Se trata, por una parte, de una forma de control
y también de otro modo de ahorro de energía al generar proteínas diferentes (aunque
relacionadas entre sí) a partir de un solo gen.
Un mecanismo recientemente caracterizado, relacionado con la modificación del
mensaje, es la edición del mARN, proceso mediante el cual se modifica la información en
la molécula de mARN sin que exista ninguna variación en el ADN. En los mamíferos estos
cambios suelen ser sustituciones en forma de deaminaciones en las cuales una C pasa a U
o una A a I (inosina, purina precursora de la A y la G).
En la regulación de la transcripción también tiene importancia el transporte del
mARN, determinando qué mARNs van a salir hacia el citoplasma. En este proceso
desempeña un papel fundamental la membrana nuclear, que permite la salida selectiva de
ciertos mARNs de manera que los poros nucleares actúan como puertas complejas y no
como simples canales abiertos.
La maquinaria que regula el almacenamiento, intercambio y activación traduccional
no está aún dilucidada, en parte por la complejidad y la naturaleza heterogénea de las
partículas ribonucleoproteicas encargadas de la traducción: los ribosomas. La velocidad de
inicio de traducción responde a la presencia de distintas sustancias como el grupo hemo
28
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
en los reticulocitos o el interferón; la longitud de las cadenas de poli-A puede afectar
tanto a la traducción como a la estabilidad del mARN y, por último, algunos mARN
contienen señales de reconocimiento que interrumpen el proceso normal de la traducción,
cambiando la pauta de lectura tradicional, lo que permite sintetizar más de una proteína a
partir de un mismo mARN.
La degradación del mARN es otro mecanismo regulador de la transcripción. Así,
ciertas ribonucleasas presentes en el citoplasma degradan algunos mARNs impidiendo, de
esta forma, que sean tra ducidos a proteína. Parece ser que en este proceso de
degradación diferencial está implicada la cola de poli-A que se añade al extremo 3' del
mARN durante su maduración.

A nivel de las proteínas
Los polipéptidos sintetizados se ven sometidos a roturas proteolíticas que, una vez
más, demuestran la capacidad ahorrativa de un célula para, a partir de un solo precursor,
generar más de un producto. Modificaciones covalentes, como las fosforilaciones y
desfosforilaciones, relacionadas con la activación de enzimas, receptores, proteínas
transductoras de señales, e incluso hasta de factores de transcripción; glucosilaciones
relacionadas con la selección de la ruta que va a seguir la proteína hasta llegar a su
destino final, e inserciones y rotura de secuencias determinadas con el fin de activar o
desactivar modifican la estructura de las proteínas y modulan su función
La identificación de organismos patógenos, clasicamente está fundamentada en el
estudio de características fenotípicas. Los microorganismos asociados a una enfermedad
son identificados por medio de tinción y observación bajo el microscopio, cultivo,
características bioquímicas o de crecimiento o reactividad inmunológica (reconocimiento
por anticuerpos). Sin embargo, la mayoría de estas técnicas no son siempre disponibles y
consumen mucho tiempo antes de obtener un resultado, o presentan bajos niveles de
sensibilidad o especificidad. Con el tiempo muchos de estos métodos serán
complementados o sustituídos por análisis de características genotípicas.
Las estrategias diagnósticas usando técnicas de biología molecular en
enfermedades infecciosas pueden ser resumidas de la siguiente manera: A) Amplificación
del ADN del organismo patógeno (PCR, LCR, etc.). B) Hibridación (Southern blots, dot
blots, sondas moleculares, etc.). C) Hibridación in situ con sondas moleculares (ADN o
ARN) o amplificación del ADN in situ.
Un requisito indispensable para el uso de la biología molecular en el diagnóstico
de agentes patógenos es el conocer parcial o totalmente el genoma del organismo en
cuestión. Para poder desarrollar sondas moleculares específicas a un organismo tenemos
que haber clonado y secuenciado o parcialmente caracterizado el material genético que
permita identificar regiones específicas a cada organismo y a cada especie. Con frecuencia
se usan secuencias repetitivas en el ADN (i.e. ARN ribosomal) que generan patrones
distintivos de hibridación similares al polimorfismo observado en eucariotas.
Una vez identificada la secuencia específica perteneciente al organismo patógeno,
el proceso diagnóstico sigue los mismos principios descritos anteriormente para el uso de
mapas de restricción, amplificación del ADN o hibridación. Basados en técnicas de
biología molecular el diagnóstico microbiológico se encuentra limitado principalmente
por la representación del material genético perteneciente al organismo patógeno en la
muestra a ser estudiada y la sensibilidad del mismo a ser degradado.
29
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Muchas ventajas pueden ser adscritas al uso de sondas de ADN y a las técnicas de
amplificación del ADN, las cuales podemos resumir en:
A. Alta sensibilidad.
B. Alta especificidad.
C. Rapidez en el diagnóstico.
D. relativo bajo costo.
Debido a la alta sensibilidad de estas técnicas, el mayor riesgo es el de
contaminación de las muestra, lo cual disminuye la especificidad. Esto es particularmente
cierto en el caso de la amplificación del ADN por la PCR, donde es posible amplificar
secuencias de ADN a partir de una sola copia del genoma del organismo patógeno.
Esta altísima sensibilidad es particularmente útil en el diagnóstico de infecciones
virales. En un estudio multicéntrico donde se compararon, usando PCR, 105 pacientes
seronegativos para VIH-1 (Virus de Inmunodeficiencia Humana tipo 1) y 99 pacientes
seropositivos/cultivos positivos para el mismo virus, se demostró un porcentaje de
sensibilidad del 99% y especificidad del 94,7% para el diagnóstico hecho por PCR
(Sheppard, 1991). En la actualidad existen firmas comerciales encargadas de distribuir kits
diagnósticos para VIH-1 basados en la PCR con sensibilidad entre 97-100% y especificidad
del 100%. También están disponibles comercialmente, kits que permiten evaluar la carga
viral basados en la misma tecnología. Este último punto es de mucha importancia a la
hora de evaluar la respuesta al tratamiento.
Muchos otros virus son diagnosticados por medio de técnicas de amplificación del
ADN o hibridación, tal es el caso de Virus de Papiloma Humano (VPH) y todos sus
genotipos al igual que el Virus de la hepatitis C. Comparando distintos métodos
diagnósticos para el Virus de Hepatitis B (HBV) se encontró que el inmunoensayo
enzimático era capaz de detectar ~3 x 107 partículas virales por mL de suero. Usando
hibridación de ADN, incrementa la sensibilidad a niveles de detectar ~105 partículas
virales por mL de suero. Aplicando amplificación por la PCR se logra detectar entre 1-10
copias de virus por mL.
Muchos otros agentes patógenos pueden ser diagnosticados usando tecnología
molecular, en donde la mayor ventaja no sólo radica en la sensibilidad o especificidad,
sino en el corto tiempo para la obtención del
resultado. La meningitis tuberculosa afecta a más del
10% de los pacientes con tuberculosis y a pesar de
existir tratamiento efectivo, la mortalidad y la
morbilidad permanece alta. Esto puede ser debido a
un retardo en el diagnóstico, el cual, usualmente
depende de la visualización del mycobacterium bajo el
microscopio, usando tinciones especiales con muy
baja sensibilidad, o el uso del inmunoensayo
enzimático de muestras de líquido cefalorraquídeo. El
cultivo
confirmatorio
de
la
infección
por
mycobacterium puede tomar entre dos a tres semanas
en dar resultados. Usando la PCR podemos obtener
resultados confirmatorios con bastante buena
sensibilidad y discriminación entre especies en menos
de seis horas desde la toma de la muestra.
30
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
Muchas de las infecciones por organismos intracelulares pueden ser
diagnosticadas con relativa facilidad con la ventaja agregada de poder hacer distinciones
taxonómicas entre las especies de una misma familia en relativo corto tiempo.
El desarrollo de nuevas sondas moleculares y la validación de muchos protocolos
de amplificación por la PCR, están aumentando en forma exponencial y muy pronto
muchas de las técnicas convencionales en el laboratorio de microbiología se verán
complementadas o substituídas por técnicas que involucren el uso de la genética
molecular.
En los laboratorios de Microbiología Clínica, las técnicas genéticas se utilizan para:
1.-la detección de los microorganismos directamente en las muestras clínicas,
identificando un fragmento específico del genoma del microbio.
2.-la cuantificación del nº de virus presentes en muestras de sangre o plasma:
carga viral
3.-la identificación de un microorganismo tras su aislamiento por métodos
convencionales.
4.- La detección de factores de virulencia.
5.- La determinación de resistencia a los antimicrobianos, que puede llevarse a
cabo sobre el microorganismo aislado o en la muestra.
6.- Estudios de epidemiología molecular que permiten comparar las cepas aisladas.
Para optimizar las técnicas preexistentes o para desarrollar técnicas nuevas que no
estén protegidas por patentes, se han propuesto infinidad de variantes y novedades
metodológicas sobre las técnicas genéticas preexistentes, muchas de ellas de un ingenio
sorprendente. En este capítulo sólo se describen algunas de las técnicas más utilizadas
para la detección, identificación y determinación de la resistencia de los microorganismos,
que se hallan en el comercio. La mayoría de ellas se adscriben a dos tipos: técnicas de
hibridación y técnicas de amplificación.
Los sistemas de tipificación molecular constituyen una de las aportaciones
microbiológicas que más difusión han tenido en los últimos años. Estos sistemas
comprenden una gran variedad de técnicas que tienen como objeto comparar la
composición de los ácidos nucleicos de dos o más microorganismos. De este modo, se
puede reconocer la relación entre aislamientos vinculados epidemiológicamente y, por
tanto, derivados recientes de un microorganismo precursor común. A la vez, deben ser
técnicas capaces de diferenciar aislamientos no relacionados, con independencia de su
pertenencia a la misma especie microbiológica o taxón. Con anterioridad estos estudios se
basaban en las características fenotípicas de los microorganismos (propiedades
antigénicas, metabólicas o de resistencia antibiótica). Sin embargo, muchos de estos
sistemas fenotípicos son limitados para establecer diferencias o similitudes concluyentes
entre microorganismos.
En este documento se utilizará una nomenclatura que mantiene las siglas
originales en inglés de las diferentes técnicas y que son como se las conoce
internacionalmente.
El año 1995 marcó un hito en el desarrollo de las ciencias biológicas, pues en dicha
oportunidad fue secuenciado el genoma completo de la bacteria Haemophilus influenzae,
primer ser viviente de vida autónoma cuyo patrimonio genético era totalmente develado
(ya se conocía desde hacía varios años la secuencia completa del material genético de
31
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
algunos virus). Rápidamente fueron apareciendo genomas de otros microorganismos,
entre ellos el genoma del primer eucarionte, el hongo levaduriforme de la cerveza
Saccharomyces cerevisiae. En 1998 era dada a conocer la secuencia completa del primer
organismo multicelular, el nematode Caenorhabditis elegans. El genoma de la mosca de la
fruta Drosophila melanogaster fue publicado en marzo del presente año y la primera
versión del genoma humano apareció el recién pasado mes de junio, abriéndose así una
nueva era para la biología y ciencias médicas del siglo

Genomas de microorganismos patógenos
El genoma de un organismo está definido como el conjunto de todos sus genes.
Cada gen está conformado por una secuencia lineal de bases nucleotídicas cuyas
denominaciones son adenina, timina, citosina y guanina (A, T, C y G, respectivamente). La
secuencia total del genoma corresponde entonces a la secuencia lineal de todos los genes
que constituyen dicho genoma. Actualmente se ha completado la secuencia de alrededor
de 30 genomas de organismos procarióticos, muchos de ellos importantes patógenos
humanos como: Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Haemophilus influenza,
Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia sp., Mycoplasma sp. (tabla1). Muchos genomas de
otros destacados microorganismos patógenos están próximos a ser finalizados. Toda esta
información ha pasado a integrar bases de datos públicas de libre acceso vía Internet y sin
costo alguno para el usuario.
Tabla 1. Microorganismos patógenos cuya secuencia genómica se ha finalizado a fecha
julio del año 2000
Microorganismo
Tamaño genoma (Mbp*)
Año de publicación
Bacillus subtilis
4,20
1997
Borrelia burgdorferi
1,44
1997
Campylobacter pylori
1,64
2000
Chlamydia pneumoniae
1,23
1999
Chlamydia trachomatis
1,05
1998
Escherichia coli
4,60
1997
Haemophilus influenzae
1,83
1995
Helicobacter pylori
1,66
1997
Mycobacterium tuberculosis
4,400,58
1999
Mycoplasma genitalium
0,81
1995
Mycoplasma pneumoniae
2,27
1996
Neisseria meningitidis
1,10
2000
Rickettsia prowazekii
1,14
1998
Treponema pallidum
1999
*Mbp: 106 pares de bases
La información obtenida de esta forma puede ser utilizada para mejorar
sustancialmente el diagnóstico de varias enfermedades infecciosas, por ejemplo,
posibilitará identificar mutaciones o segmentos génicos comunes para cada patógeno o
grupo patógeno (polimorfismos genéticos) y que no se encuentren presentes en otros
32
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
grupos. Tales secuencias serán patognomónicas para indicar infección por dichos
microorganismos. Se podrá entonces diseñar partidores para PCR (reacción en cadena de
la polimerasa) o sondas de hibridación específicas para identificar cada microorganismo
en estudio. Otras técnicas genéticas como el RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar),
RFLP (poliformismo de tamaño de fragmentos de restricción), y campo pulsado, entre
otras, se robustecerán y ampliarán con los nuevos descubrimientos. Particularmente, la
técnica genética de los llamados chips de ADN, en pleno desarrollo actual, tendrá a futuro
un papel preponderante.

ADN chips
Esta técnica se basa esencialmente en un soporte artificial de un tamaño
aproximado entre 2-4 cm2, donde podemos unir ordenada y separadamente moléculas de
ADN de diferentes secuencias nucleotídicas, en un número aproximado entre 10 000-400
000 dependiendo del tipo de chip empleado3-5. Cada uno de estos chips se utiliza
entonces como patrón de hibridación, esto es, como sitio de unión de una sonda
mediante complementaridad de bases (A/T y G/C). El ácido nucleico que se utilizará como
sonda debe marcarse, ya sea por métodos radiactivos o por métodos colorimétricos noradiactivos. La sonda marcada es aplicada entonces al chip, permitiendo la hibridación y
luego se deben realizar varios lavados para eliminar las moléculas de sonda que se
unieron inespecíficamente. Como resultado de tal procedimiento se obtendrán cientos de
manchas de hibridación que revelan que en dicho sitio se unió específicamente la sonda
empleada. La lectura se realiza mediante un dispositivo conectado directamente a un
computador que indica la intensidad de cada mancha de hibridación, y por lo tanto
indirectamente el grado de identidad entre la sonda empleada y las moléculas de ADN
que conforman el chip. Por ejemplo, se puede diseñar un chip que contenga segmentos
de ADN de 25 nucleótidos de largo sintetizados in situ aleatoriamente en un número
aproximado de 50 000 fragmentos diferentes (tecnología Affymetrix). Una muestra clínica
de un paciente con shock endotóxico podrá entonces utilizarse para aislar el agente,
obtener su material genético, marcarlo e hibridar dicho material con el chip anteriormente
descrito. Rápidamente y sin necesidad de secuenciar el genoma completo del
microorganismo podremos obtener un patrón de hibridación genómico característico,
compararlo con una base de datos, e identificar la especie y cepa de microorganismo
involucrado con un alto nivel de confianza. Otros ADN de diferentes microorganismos o
de distintas cepas diferirán en el patrón de hibridación obtenido, indicando así la
existencia de diferencias a nivel de diversos segmentos genéticos. Tales chips de ADN ya
se encuentran disponibles en el comercio para varios microorganismos.
Por otra parte, dado el avance vertiginoso del área genómica ya ha comenzado el
desarrollo paralelo de la llamada área postgenómica o proteómica. Esta área consiste en
identificar primero el conjunto de proteínas que conforman una célula viviente y luego
entender cómo este conjunto de proteínas interaccionan entre sí in vivo, con el fin de
poder desentrañar los mecanismos de respuesta celular frente a variadas condiciones
ambientales, tales como: temperatura, estrés ácido, presencia de sustancias tóxicas, etc. El
conocimiento de proteínas de microorganismos patógenos que sean únicas para él o que
se expresen solo cuando este entra en contacto con su hospedero, será también un gran
aporte al área del diagnóstico molecular. Se podrán diseñar técnicas que detecten
anticuerpos contra proteínas específicas para ciertos microorganismos y que se expresen
únicamente in vivo, con el objetivo de disminuir posibles reacciones cruzadas con otros
antígenos.
33
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Seguramente todas las técnicas de diagnóstico microbiológico basadas en
secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de microorganismos tendrán a corto plazo un
desarrollo explosivo y de consecuencias enormes para el diagnóstico microbiológico
molecular y por ende para el beneficio de la medicina. El siglo 21 le abre sus puertas a una
nueva biología, más globalizante, con una visión holística del fenómeno viviente y con
insospechados fenómenos aún por descubrir.
2.3 Métodos moleculares de tipificación en el laboratorio de
microbiología
Las técnicas moleculares que analizan propiedades o polimorfismos genéticos en
los microorganismos, han ampliado notablemente el campo de la tipificación en
microbiología. Los fundamentos de estas técnicas son variables: estudios de restricción del
ADN cromosómico o extracromosómico, análisis del número de copias de determinadas
secuencias de inserción o repetitivas a lo largo del cromosoma o de las regiones entre
secuencias de inserción o repetitivas adyacentes (REP-PCR; polimorfismo IS6110 en
Mycobacterium tuberculosis) o amplificación arbitraria de fragmentos genéticos (AP-PCR).
La mayor ventaja de estos métodos radica en la estabilidad de los marcadores genéticos
utilizados y en la posibilidad de aplicarlos universalmente a distintos géneros y especies
de microorganismos.
Los marcadores moleculares se han aplicado a diferentes campos y su
disponibilidad ha mejorado nuestro conocimiento sobre:

Patogénesis e historia natural de ciertas infecciones,

Detección de brotes y epidemias, identificación de reservorios y de
mecanismos de transmisión de patógenos,

Diseño de medidas de control de propagación de la infección,

Evolución genética de poblaciones microbianas.
En todas estas aplicaciones el objetivo de los marcadores moleculares es el de
definir la relación existente, clonal o no, entre los aislamientos estudiados. El término clon
o grupo clonal en epidemiología hace referencia al grupo de aislamientos relacionados
por el hecho de descender de un ancestro común, esto es, por formar parte de una
cadena de replicación y transmisión. Las cepas relacionadas provienen, pues, de la
expansión clonal de un precursor único y poseen un nivel de similitud entre sus genotipos
y fenotipos significativamente superior al que se encontraría entre aislamientos no
relacionados de la misma especie seleccionados arbitrariamente.
Merece también especial mención, la diseminación horizontal entre bacterias (del
mismo o distinto taxón) de plásmidos o elementos genéticos potencialmente móviles
(transposones,
integrones,
fagos...)
que
contengan
secuencias
relevantes
epidemiológicamente, como por ejemplo, genes de resistencia antibiótica o de virulencia.
A estos aspectos se ha dedicado también uno de los apartados.
La aplicación de técnicas y marcadores de epidemiología molecular es
indispensable en el estudio de la infección nosocomial, sobre todo en hospitales en los
que se dispone de unidades de vigilancia intensiva, neonatología, quemados, hematología
u oncología, en donde ingresan pacientes susceptibles de adquirir infecciones graves
34
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
intrahospitalarias. Asimismo, existen numerosas referencias relacionadas con la aplicación
de marcadores moleculares al estudio de las infecciones extrahospitalarias, son algunos
ejemplos los estudios de patrones de transmisión de tuberculosis, la identificación de
reservorios de legionelosis y los estudios epidemiológicos de infección por neumococo o
meningococo.
Los métodos moleculares aplicados al estudio epidemiológico pueden
estructurarse en los siguientes apartados: 1) análisis de ADN extracromosómico; 2)
restricción de ADN cromosómico y detección de secuencias por hibridación con sondas; 3)
macrorrestricción de ADN cromosómico, 4) amplificación de secuencias genéticas con o
sin restricción posterior del producto obtenido, 5) análisis de ADN por secuenciación y 6)
perfil de hibridación de múltiples secuencias. La elección de la técnica a aplicar dependerá
de la capacidad técnica y tecnológica de cada laboratorio, de la situación epidemiológica
específica a estudiar y de la rapidez necesaria en la respuesta del laboratorio. La
macrorrestricción de ADN cromosómico, incluye la técnica de PFGE, siendo una de las mas
utilizadas ya que presenta gran versatilidad y permite conocer la clonalidad de diferentes
aislados en situaciones epidémicas con tiempo y espacio definido. Como alternativa se
encuentran las técnicas de amplificación (técnicas de PCR), de mayor rapidez que el PFGE,
que ofrecen las mismas ventajas que el PFGE en situaciones de epidemia, y el análisis por
secuenciación que ofrece ventajas en estudios de grandes grupos clonales pero de escasa
utilidad en la caracterización de epidemias por lo que se utilizan para el análisis y
comparación de aislados de diferentes áreas geográficas y su evolución en el tiempo. El
perfil de hibridación de múltiples secuencias incluye las micromatrices o microarrays,
técnica de escasa aplicación actual pero con gran proyección de futuro.
A continuación se exponen los métodos moleculares que más se han utilizado para
estudios epidemiológicos en bacteriología, clasificados en los 6 apartados mencionados.
En cada uno de ellos se comentan los fundamentos básicos y técnicos de estos métodos,
incluyendo criterios para la interpretación de los resultados e indicaciones sobre cada uno
de los procedimientos. Al final, se ha incluido un capítulo de documentos técnicos, en el
que se detallan 5 procedimientos, representativos de los métodos moleculares expuestos,
en forma de protocolo de trabajo normalizado (PNT) redactado según la normativa ISO,
que puede ser adaptado a las particularidades de cada laboratorio. Previamente se indican
las características que deben reunir los marcadores moleculares para poder utilizarse en el
estudio epidemiológico.
2.4 Características de los marcadores moleculares. Criterios
paralaeleccióndeunbuenmarcadormolecular
La definición de clon es probabilística y el nivel de similitud necesario para su
definición debe tener en cuenta el taxón estudiado, el marcador utilizado y el tiempo que
dure la investigación epidemiológica. Por ello, antes de escoger un marcador molecular
debe formularse de forma clara y precisa aquella pregunta en términos epidemiológicos
cuya respuesta es preciso conocer, definir el nivel de relación genética que es necesario
determinar para responder a la pregunta anterior, escoger los marcadores que son
capaces de discriminar a este nivel de relación y verificar la eficacia de los métodos
seleccionados.
Cuando se analizan brotes epidémicos por taxones muy homogéneos es necesario
utilizar marcadores muy discriminativos para reconocer a los aislamientos no relacionados
35
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
como distintos de la cepa epidémica. Por el contrario, en la vigilancia de las enfermedades
infecciosas, puede interesar monitorizar la diseminación de un clon a nivel mundial de
forma prospectiva (esto es, durante mucho tiempo). En este caso, es posible que este clon
sufra cambios microevolutivos que generen patrones relacionados pero no idénticos. Si
utilizamos marcadores muy discriminativos podemos identificar aislamientos relacionados
como diferentes. Es por ello que se ha recomendado establecer categorías de relación
entre las cepas. En el caso de la electroforesis de campo pulsante (pulsed-field gel
electrophoresis, PFGE), se habla de cepas "idénticas", "probablemente relacionadas",
"posiblemente relacionadas" o "distintas" en función del número de cambios genéticos
que traduce la diferencia existente entre los patrones obtenidos. En cualquier caso,
conviene recordar que estos criterios se han establecido para el estudio de epidemias con
el objeto de diferenciar las cepas incluidas en una cadena de transmisión (relacionadas) de
las que no lo están (no relacionadas). Por otra parte, cuando se utilizan marcadores cuya
capacidad discriminativa se basa en secuencias que se ven influidas por el ambiente o el
estado fisiológico del microorganismo las diferencias que se observan no serán
proporcionales al grado de relación de las cepas. Así, por ejemplo, los plásmidos se ven
muy influidos por las condiciones de crecimiento del microorganismo y las diferencias en
el perfil plasmídico no traducen necesariamente el grado de relación existente entre las
cepas estudiadas.
La capacidad de discriminación de un marcador depende de la variabilidad
genética existente en la región del cromosoma que explora. Así, por ejemplo, el PFGE
explora todo el cromosoma detectando la variabilidad existente en los lugares de
restricción del enzima utilizado para la digestión del ADN o la inserción o deleción de
grandes fragmentos entre dos lugares de restricción. En función de estos factores se
obtendrá un polimorfismo en los tamaños de los fragmentos obtenidos en la digestión. En
general el PFGE es muy discriminativo ya que es muy sensible a la microvariación existente
en una colección de cepas. Por el contrario, el ribotipado basa su capacidad de
discriminación en la variabilidad existente en las regiones cromosómicas adyacentes a las
distintas copias del operón rrn. Este marcador suele ser menos discriminativo y la
variabilidad que detecta suele tener su origen en un momento relativamente lejano en el
tiempo.
Marcador
Tipabilidad
Reproducibilidad
Perfil plasmídico
REA de ADN total
Ribotipado
PFGE
PCR
AFLP
MLST
Variable
Excelente
Excelente
Excelente
Excelente
Excelente
Óptima
Regular
Variable
Excelente
Excelente
Regular
Buena
Excelente
Poder de
discriminación
Variable
Variable
Buena
Excelente
Excelente
Excelente
Excelente
Facilidad
técnica
Regular
Buena
Buena
Buena
Buena
Buena
Difícil
Interpretación
Disponibilidad
Coste
Buena
Regular
Buena
Buena
Regular
Regular
Excelente
Excelente
Variable
Variable
Variable
Buena
Baja
Baja
Medio
Medio
Alto
Alto
Medio
Alto
Alto
Idealmente un marcador debería permitir calcular la distancia genética existente
entre las cepas estudiadas. Su conocimiento permite establecer la relación entre las cepas
y, por lo tanto, conocer con precisión su historia evolutiva. Las diferencias detectadas por
este marcador ideal deberían corresponder a cambios evolutivos "neutros" cuya
acumulación fuera proporcional al tiempo transcurrido. Ello requiere que la estructura
36
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
poblacional del microorganismo estudiado sea fundamentalmente clonal. En aquellas
poblaciones panmíticas en las que los fenómenos de recombinación dan lugar a un
intercambio aleatorio frecuente de genes es más difícil interpretar los resultados de los
marcadores moleculares.En cualquier caso, deben escogerse marcadores que analicen
secuencias con baja recombinación. Debe mencionarse, no obstante, que en determinadas
especies muy homogéneas la única manera de discriminar los aislamientos es analizar
precisamente regiones recombinativas (este es el casopor ejemplo de M. tuberculosis
donde se utiliza el polimorfismo genético asociado a la IS6110 o el tipado por la unidad
repetitiva intercalada de micobacteria: MIRU).
REA: análisis del ADN total con enzimas de restricción de alta frecuencia de corte;
PFGE: digestión del ADN total con enzimas de baja frecuencia de corte y resolución
de los fragmentos generados por electroforesis de campo pulsante; PCR: polimorfismo de
amplificación; AFLP: polimorfismo del tamaño de los fragmentos de amplificación: MLST:
tipado por secuenciación de múltiples loci.
2.5 Evaluacióndelosmarcadoresmoleculares
2.5.1 Criteriosqueevalúansueficacia
2.5.1.1Tipabilidad:
Proporción de cepas que un marcador puede clasificar como pertenecientes a un
tipo determinado. Al conjunto de cepas que no son susceptibles de ser clasificadas se les
conoce como cepas no tipables. Un marcador será tanto más útil cuando más se acerque
su tipabilidad al valor 1.
2.5.1.2Reproducibilidad:
Capacidad de un marcador para clasificar a una cepa en el mismo tipo cuando se
realizan varios ensayos independientes. En aquellos marcadores complejos no debe
tenerse en cuenta la variabilidad que se acepta entre patrones dentro de un mismo tipo.
Los experimentos destinados a valorar la reproducibilidad deben tener en cuenta todas las
variables posibles. Dado que el valor de reproducibilidad de un marcador afecta de
manera muy significativa su capacidad de discriminación, el valor de reproducibilidad
debe ser superior a 0,95. Las situaciones en las que se pretende comparar un número
limitado de cepas (frecuentemente en el mismo experimento) toleran una menor
reproducibilidad; las bases de datos a gran escala (centros de referencia) exigen una
reproducibilidad mayor.
2.5.1.3Estabilidad:
Mide la capacidad de un marcador para reconocer la relación clonal que existe
entre cepas que proceden de un precursor común, a pesar de la variación fenotípica o
genotípica ocurrida durante la diseminación clonal en la naturaleza o en el
almacenamiento y replicación en el laboratorio (epidemias a gran escala, cepas de
archivo). El estudio de la estabilidad in vivo se realiza comparando cepas antes y después
de un número de pases en un modelo animal, aislamientos consecutivos en el mismo
enfermo (colonización o infección persistente) o en sitios anatómicos distintos o en el
curso de epidemias muy bien definidas. El estudio de la estabilidad in vitro se realiza
comparando las cepas antes y después de su almacenamiento durante un periodo
determinado de tiempo, en el que se hacen una serie de resiembras en un medio de
37
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
cultivo concreto (se recomienda incluir un mínimo de 10 cepas que se estudian cada cinco
pases en un experimento de 50 resiembras, lo que da un total de 100).
Poder discriminativo: Probabilidad promedio de que el marcador utilizado
clasifique en 2 tipos distintos a 2 cepas no relacionadas escogidas al azar de la población
de un determinado taxón. El poder discriminativo se cuantifica con el Indice de Diversidad
de Simpson, según la fórmula:
ID= 1-1/N (N-1) sj=1nj (nj-1) N= nº de cepas; S=nº tipos distintos; nj= nº cepas
pertenecientes al tipo J.
El valor de ID depende del número de tipos distintos definidos por el marcador y
de la homogeneidad con la que la población estudiada se distribuye en los "n" tipos.
Idealmente el valor de ID debe ser superior a 0,95. Puede utilizarse una combinación de
marcadores.
2.5.2 Criteriosqueevalúansueficiencia
Antes de escoger un marcador debemos considerar las características de la
investigación que nos proponemos llevar a término. Entre estas características cabe
destacar el tamaño de la muestra a analizar y la premura con la que se necesitan los
resultados. Así, no es lo mismo un estudio de 5 casos que pueden corresponder a una
transmisión nosocomial cuya confirmación puede condicionar una serie de medidas de
control que están en marcha, que un estudio retrospectivo sobre la difusión de una cepa
en una determinada comunidad que puede representar el análisis de centenares de cepas.
Dada por supuesta la capacidad de discriminación, en el primer caso se valorará la rapidez
del marcador y la disponibilidad de los distintos marcadores en el entorno inmediato. En
el segundo serán la reproducibilidad y el coste.
También hay que valorar la versatilidad de un marcador y su facilidad técnica. El
PFGE es un marcador flexible, ya que se puede utilizar para el estudio de la mayor parte de
bacterias, pero el procedimiento técnico es relativamente complejo y exige de una
instrumentación específica que no se encuentra presente en todos los laboratorios de
microbiología clínica. Con la excepción del ribotipado, las técnicas que analizan
polimorfismos o variantes de restricción (restriction fragment length polymorphism o
RFLP) asociados a una secuencia y revelados con una sonda específica, además de
técnicamente complejos, sólo sirven para el estudio de la especie en la que se encuentra
esta secuencia (por ejemplo, RFLP asociado a IS6110 y M. tuberculosis). En los taxones en
los que se han demostrado útiles, los polimorfismos de amplificación son rápidos,
técnicamente sencillos y la mayor parte de laboratorios de microbiología tienen acceso a
un termociclador.
Por último, es importante considerar la facilidad con la que se pueden exportar los
datos generados a bases de datos del propio laboratorio o intercambiar estos con otros
laboratorios o centros de referencia.

¿Con qué colección
epidemiológicos?
de
cepas
deben
evaluarse
los
marcadores
Deben evaluarse con una colección suficientemente numerosa de cepas,
correctamente identificadas al nivel taxonómico indicado, que reflejen al máximo la
diversidad que se espera en este taxón, o como mínimo en la subpoblación que se
pretende estudiar con el marcador. Es conveniente que se incluyan los diferentes grados
38
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
de relación posible, esto es, cepas idénticas, cepas no idénticas pero muy similares, cepas
moderadamente relacionadas y cepas claramente distintas. La relación epidemiológica de
las cepas debe conocerse en función de datos clínicos y epidemiológicos pormenorizados.
Para conocer la tipabilidad y el poder de discriminación se recomienda estudiar
una colección numerosa de cepas no relacionadas epidemiológicamente (>100). Cuando
se quiere conocer la estructura genética de una población se utilizan colecciones incluso
mayores que deben reflejar el conjunto de la población. Por ejemplo, en el caso del
meningococo se han de incluir cepas aisladas de enfermos, pero también de portadores.
Para conocer la eficacia de un marcador en el estudio y control de brotes epidémicos se
han de comparar las cepas supuestamente relacionadas con una colección de cepas
control no relacionadas (de 10 a 30 cepas) aisladas de pacientes similares y en un periodo
de tiempo similar.

Análisis de los datos
La mayoría de los marcadores moleculares se basan en separaciones
electroforéticas que dan lugar a un patrón de bandas. El análisis de los resultados se
basará en el cálculo de los coeficientes de similitud de estos patrones para cada par de
cepas. Estos resultados se expresan en una matriz de similitud que puede representarse
gráficamente como un dendrograma de homologías.
Es extremadamente importante estandarizar las condiciones experimentales a fin
de que los patrones electroforéticos sean reproducibles y puedan compararse los
resultados obtenidos en distintos geles tanto en el mismo laboratorio como en distintos
laboratorios. Este hecho es especialmente importante cuando los datos de tipificación de
un determinado microorganismo se centralizan en un laboratorio dando lugar a grandes
bases de datos. Si bien este esfuerzo de estandarización se ha realizado para algunos
microorganismos (M. tuberculosis y RFLP asociado a IS6110, Staphylococcus aureus y
PFGE) queda mucho por hacer en este sentido.
El primer paso en el análisis de los resultados es la normalización de los geles.
Existen numerosos factores que influyen en el proceso electroforético (protocolo de
trabajo, carga del gel, condiciones de electroforesis, instrumentación. etc.) que pueden dar
lugar a que dos bandas del mismo tamaño tengan una posición en el gel ligeramente
diferente. La normalización consiste en asignar a estas bandas el mismo peso (posición) a
pesar de las diferencias generadas por el proceso analítico. La normalización de los geles
se ha visto facilitada por el desarrollo de programas informáticos (algunos
comercializados), pero en cualquier caso exige una cuidadosa supervisión visual.
Una vez normalizados los geles, para el cálculo de la similitud entre un par de
cepas pueden utilizarse diversos coeficientes. El más utilizado es el coeficiente de Dice que
se basa en la posición de las bandas. Cuando se ha definido la totalidad de bandas
presentes, se determina su presencia o ausencia en cada una de las dos cepas y el
coeficiente de similitud se calcula con la siguiente fórmula:
nAB = número de bandas presentes en las dos cepas
a = número de bandas presentes en la cepa A pero no en la cepa B b = número de
bandas presentes en la cepa B pero no en la cepa A
39
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Otros marcadores basados en la posición de las bandas son el de Jaccard o el
coeficiente de Pearson. Existen otros coeficientes de similitud que también tienen en
cuenta la intensidad de las bandas. Su utilización exige que la intensidad de las bandas sea
reproducible en los diferentes ensayos.
El algoritmo matemático que se utiliza más comúnmente para construir
dendrogramas a partir de la matriz de similitud es el método de agrupación por pares no
ponderado, utilizando promedios (unwweighted pair group method using arithmetic
averages: UPGMA). Este método asume que el "reloj molecular" es idéntico para todas las
cepas y da lugar a un árbol "con raíz" (o punto de partida) a partir del cual tienen lugar las
divisiones. Los dendrogramas generados con los marcadores moleculares no hay que
considerarlos como una representación filogenética de las relaciones entre cepas, sino
como una forma práctica de visualizar el grado de relación entre cepas e identificar
grupos oclades. En un dendrograma, el punto de corte para considerar las cepas como
relacionadas es arbitrario. En algunos casos se exige una identidad de patrones pero
frecuentemente, tal como se ha comentado para el PFGE, se acepta un cierto número de
diferencias. La experiencia, y, tal como se ha comentado, la concordancia de sistemas de
tipado ayudan a seleccionar un punto de corte adecuado.
2.6 ExtraccióndelDNA/RNA
Para cualquier trabajo que deba realizarse con el DNA o RNA de un
microorganismo, en primer lugar deben extraerse los ácidos nucleicos. Esto comporta la
lisis microbiana, la concentración del ácido nucleico, su protección frente a la degradación
química o enzimática y la eliminación de los inhibidores de las reacciones que deban
efectuarse posteriormente (hibridación, replicación del DNA o transcripción inversa de
RNA).
Los sistemas clásicos basados en la lisis y tratamiento con proteinasa K, seguida de
extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol, están siendo sustituidos por
otros con diferentes procedimientos de lisis y concentración de los ácidos nucleicos,
basados en la acción del tiocianato de la guanidina, surfactan-tes catiónicos, resinas
quelantes, la sílice y las fibras de vidrio. Estas sustancias solas o generalmente unidas a
otras, precedidas o no de lisis física de las células (ebullición, sonicación, etc.), enzimática
(lisocima) o mediante detergentes, pueden adsorber restos celulares o inhibidores (resinas
quelantes), precipitar selectivamente DNA o RNA (guanidina, surfactantes) o adsorber los
ácidos nucleicos (sílice, vidrio). La separación magnética o por filtración se efectúa sobre
ácidos nucleicos previamente extraídos o incluso amplificados.
En la actualidad uno de los objetivos de las grandes compañías es la disposición de
sistemas automáticos de extracción seguida de la transferencia automática de DNA o RNA
a los procesos subsecuentes de amplificación u otros.
40
UNIDADDIDÁCTICAIII
TÉCNICASDEHIBRIDACIÓN
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
3.1 Técnicasdehibridación
Una particularidad del DNA consiste en que cuando se calienta por encima de 90°
C, las dos cadenas se separan porque se neutralizan las fuerzas de unión entre las bases
(los puentes de hidrógeno entre G=C yT=A). Este fenómeno se denomina
desnaturalización. Cuando desciende otra vez la temperatura, las bases vuelven a
aparearse de modo que se reenlazan con toda exactitud los fragmentos homólogos,
reconstituyéndose el DNA bicatenario original en un proceso denominado
renaturalización.
Si se conoce una secuencia propia y específica del DNA de un determinado
microorganismo, puede sintetizarse un fragmento de DNA con la secuencia
complementaria, marcándolo con una sustancia radioactiva, con un compuesto
fluorescente o lumínico o con una enzima. Cuando estos pequeños fragmentos
monocatenarios de DNA, de 20 a 40 bases, están marcados y se emplean para la
detección de su secuencia complementaria, se denominan sondas (en inglés, probes). Las
sondas detectan la secuencia complementaria a la suya (diana) en el genoma de un
microorganismo a través de una prueba de hibridación realizada: 1) en solución, 2) sobre
un soporte sólido o 3) in situ.
3.1.1 Marcadodelasondas
Las sondas se marcan con diferentes sustancias para detectarlas cuando hibridan
con su diana. Existen numerosísimas variantes y métodos diferentes de marcado.
Inicialmente, se utilizaron sustancias radioactivas como el 32P o el 35S. En la actualidad se
utilizan sustancias no radioactivas porque su uso no requiere las estrictas normas de
seguridad de aquéllas, tienen una caducidad más larga y algunas son iguales o más
sensibles que las radioactivas.
Unas sustancias lumínicas interesantes son los esteres de acridina, que se unen
químicamente a la sonda marcándola, y permiten detectar la hibridación de la sonda con
su diana en medio líquido, sin lavados, según se describe más abajo (véase Hibridación en
solución).
También se utilizan enzimas como la peroxidasa de rábano, que actúa sobre el
agua oxigenada liberando oxígeno que, al activar el luminol, emite luz, o la fosfatasa
alcalina, que actúa sobre sustratos cromogénicos o lumínicos.
Además del marcado directo, las sondas también pueden marcarse con sustancias
de captura, como la biotina o la digoxigenina, que por sí mismas no producen señal, pero
pueden captar gran número de elementos marcados incrementando la señal. La biotina
capta avidina, que puede ser saturada con varias moléculas de un marcador (enzimático o
lumínico). Los anticuerpos anti-digoxigenina, a los que pueden fijarse diversos
marcadores, se unen con gran eficacia a la digoxigenina.
La utilización de anticuerpos con diferentes marcadores que reconocen el DNA
bicatenario (DNA-DXA; o el híbrido DNA-RNA también permiten detectar y cuantificar el
grado de hibridación.
Las sondas genéticas son pequeños fragmentos de DNA formados in 20-50
nucleótidos (oligonucleótidos), sintetizadas en el laboratorio y casa secuencia es
complementaria de la de un fragmento genómico. Bajo determinadas condiciones la
unión de la sonda a su secuencia complementaria (hibridación) es tan específica que tan
43
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
solo la diferencia en un nucleótido hace que la unión no se produzca. Las sondas pueden
marcarse para detectar su hibridación con la secuencia diana.
Arriba puede observarse el DNA con la secuencia a detectar. Se separan
(desnaturalizan) ambas hebras por calentamiento a 95°C y se incorpora la sonda. Abajo
puede observarse como la hibridación se produce al descender a la temperatura
adecuada, en este caso a 50°C.
Los cebadores (primers) de la reacción en cadena de la polimerasa sor sondas
como ésta que cumplen dos funciones: 1) unirse a los extremos del fragmento específico
que se desea amplificar; 2) permitir que la DNA polimerasa, que necesita fragmentos
bicatenarios para iniciar la polimerización, la inicie.
3.1.2 Hibridaciónensolución
En el comercio algunas pruebas de hibridación están disponibles bajo formatos en
solución, en los que la hibridación se produce rápidamente (una hora o menos). En estas
condiciones, la prueba resulta más práctica y sencilla que las realizadas sobre membrana.
La sonda se puede marcar con un éster de acridina que emite luminiscencia al ser tratado
con agua oxigenada; pero si la acridina se hidroliza mediante un álcali, pierde la capacidad
de emitir luz.
Para desarrollar esta prueba, conocida como prueba de protección por hibridación
(hibridization protection assay), desarrollada por Gen-Probe, Inc. se extrae el DNA del
microorganismo, se desnaturaliza en solución en un tubo y se añade la sonda marcada
con acridina; si encuentra su secuencia complementaria, se une para formar un fragmento
bicatenario. A continuación, se añade un álcali, que inactiva la acridina cuando la sonda
esta libre, pero en las sondas que han hibridado con su diana, y por tanto se hallan en
estado bicatenario, la acridina queda protegida de la hidrólisis, por lo que la luminiscencia
medida por un luminómetro corresponde a la sonda hibridada.
44
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
Digene Corp, utiliza sondas de RNA y una técnica de captura de los híbridos DNARNA formados en solución con anticuerpos fijados a pocillos de placas tipo «microtiter».
Los híbridos fijados se revelan con anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina utilizando
dioxetano como sustrato, que produce quimioluminiscencia.
3.1.3 Hibridaciónsobrefasesólida
Después de lisar los microorganismos de una muestra clínica o de un cultivo, se
extrae el DNA que se desnaturaliza por el calor, depositándose una gota sobre una
pequeña membrana de nilón o nitrocelulosa (4x4 cm); la muestra depositada se adsorbe y
fija a la superficie (aspiración al vacío, UV, etc.). En una membrana pueden depositarse
varias gotas. La membrana se sumerge en una solución de hibridación que contiene la
sonda marcada y, una vez finalizada la hibridación y eliminada mediante lavado la sonda
no unida, se detecta la fijada a través de su marcador. La reacción de hibridación es muy
lenta y suele requerir una noche. Esta técnica se denomina genéricamente en ingles dot
blot o slot blot según se deposite el material sobre la membrana como una gota circular o
alargada.
Este tipo de pruebas sobre soporte sólido se utiliza sobre todo con fines de
investigación. Sin embargo, existen en el comercio kits basados en las técnicas de captura
por hibridación (también denominadas hibridación inversa o hibridación en sandwich), en
las que las sondas se hallan fijadas a una tira de nitrocelulosa y captan de la muestra los
ácidos nucleicos que interesa detectar. Para su revelado, puede utilizarse una segunda
sonda marcada que actúa como señal. Con frecuencia, el DNA a hibridar ha sido
amplificado previamente con cebadores que llevan un captador incorporado, como la
biotina. Esta técnica es utilizada para identificar tanto microorganismos a través de
secuencias específicas como mutaciones que comportan resistencia a los antimicrobianos
(INNO-LiPA; Innogenetics).
3.1.4 Hibridacióninsitu
Una sonda también puede hibridar con su DNA o RNA complementario en un
corte histológico, emitiendo la señal correspondiente, y localizando por tanto al
microorganismo en el contexto de un tejido; esta técnica se conoce como hibridación in
situ.
3.1.5 Utilizacióndelassondas
A pesar de su especificidad, las sondas carecen de suficiente sensibilidad para
detectar los microorganismos de una muestra clínica cuando son escasos, por lo que en la
actualidad son poco empleadas para ese fin. Por el contrario, constituyen un instrumento
excelente para identificar un microorganismo una vez aislado por cultivo, ya que se
dispone de DNA en gran abundancia. Resultan particularmente útiles para los
microorganismos cuya identificación por métodos convencionales (metabólicos,
serológicos) es difícil o compleja. Mediante la utilización de sondas también pueden
detectarse genes de patogenicidad (adhesinas, proteínas relacionadas con la invasión,
toxinas) y genes de resistencia,
Sondas comercializadas para la detección e identificación microbiana:
Detección directa, Identificación.
45
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Estreptococo del grupo A, Estreptococo del grupo A y B, Gonococo, Enterococos,
Chlamydia trachomatis, Staphylococcus aureus, Gardnerella, Neumococo, Candida, Listeria
monocytogenes, Tricomonas, Mycobacterium, M. tuberculosis complex M. avium complex
M. kansasii, Gonococo, Haemophilus influenzae, Campylobacter, C.jejuni, C. coli, C. lari,
Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis.
Se indica algunas de las sondas comercializadas para la detección directa de
microorganismos en muestras clínicas y para la identificación de microorganismos
previamente aislados por cultivo. La mayoría de ellas están comercializadas por Gen-Probe
Inc.y Becton Dickin-son Biosciences.
Tanto cuando ésta se debe a la adquisición de material genético exógeno
(plásmidos o transpones), como cuando se trata de una mutación puntual de un gen
propio del microorganismo.
Cuando se trata de detectar mutaciones, la sonda debe ser capaz de unirse o no a
la diana cuando existe tan solo uno o dos nucleótidos diferentes. Por ello, son de vital
importancia las condiciones de desnaturalización-renaturalización (temperatura,
osmolaridad, etc.) para conseguir hibridaciones muy específicas.
3.2 Análisis del ADN mediante procedimientos de restricción
ehibridación
Con el fin de evitar la contaminación de su genoma por ADN exógeno, las
bacterias han desarrollado un sistema de protección basado en los enzimas de restricción,
que reconocen una secuencia específica de nucleótidos de unos 4 a 8 pares de bases (pb)
dando lugar a un corte en la molécula de ADN a este nivel. A la secuencia específica
reconocida por cada enzima se le conoce como lugar de restricción. Este sistema de
protección se complementa con una metilación del ADN propio de la bacteria a nivel del
lugar de restricción para evitar que sea digerido por su propio enzima de restricción.
Cuando se digiere una molécula de ADN con un enzima de restricción se obtienen
un número de fragmentos equivalentes a las veces que se encuentra repetido el lugar de
restricción a lo largo de la molécula. Esta frecuencia depende del número de pb del lugar
de restricción así como de la proporción relativa de los nucleótidos ATGC del lugar de
restricción en relación con la del ADN digerido. Así, la probabilidad de encontrar un lugar
de restricción de 6 pb en una molécula de ADN es de una vez por cada 4096 pb, mientras
que un lugar de restricción de 4 pb se da cada 256 pb. Por otra parte, el lugar de
restricción del enzima SmaI, CCCGGG, se encuentra menos representado de lo previsible
en el cromosoma de los estafilococos dada la pobreza en GC de su genoma (%GC 38).
El tamaño de los distintos fragmentos de restricción traduce la separación entre
dos lugares de restricción contiguos. Un cambio por mutación o recombinación, en uno
de estos lugares de restricción lo hace irreconocible para el enzima y se traduce en una
variación del perfil de fragmentos de restricción que es el responsable del polimorfismo
existente entre las distintas cepas. Este perfil también variará si existen delecciones o
inserciones de ADN entre dos lugares de restricción. La comparación de cepas para
detectar el polimorfismo del tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP) se consigue
separando los fragmentos obtenidos mediante una electroforesis en un gel de agarosa
que se tiñe con bromuro de etidio. Cada banda corresponde a la suma de todos los
fragmentos generados del tamaño correspondiente a aquella movilidad electroforética.
46
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
Podemos dividir a los enzimas de restricción para una especie concreta, en
aquellos que darán lugar a un gran número de fragmentos (cientos) de pequeño tamaño y
aquellos cuyo lugar de restricción estará poco representado en el genoma y darán pocos
fragmentos (10 a 30) de gran tamaño. Los fragmentos de pequeño tamaño obtenidos con
los enzimas de alta frecuencia de corte pueden separarse por electroforesis convencional
mientras que los fragmentos de gran tamaño (>40 kb) co-emigran en una única banda en
la electroforesis convencional y se deben separar con técnicas electroforéticas especiales
como la electroforesis con alternancia de campos eléctricos o electroforesis de campo
pulsante.
Cuando se separan por electroforesis en un gel los fragmentos de restricción del
ADN total obtenidos con un enzima con alta frecuencia de corte, se obtiene un número
tan elevado de fragmentos que es muy difícil, si no imposible, resolver las bandas
existentes. Ello dificulta enormemente la comparación de los perfiles de las distintas cepas
invalidando, en cierta forma, la utilidad de esta técnica. Una alternativa para simplificar la
interpretación de los RFLP del ADN total, consiste en centrarse en una zona concreta del
genoma en lugar de estudiar todo el cromosoma. Para ello, se realiza una transferencia de
los fragmentos de restricción del ADN total obtenidos a una membrana (Southern-blot)
que se analiza mediante hibridación con una sonda marcada complementaria del
fragmento cuyo polimorfismo se quiere estudiar. El revelado de la hibridación tan solo
pondrá en evidencia aquellos fragmentos que contengan la totalidad o parte de la
secuencia escogida, obteniéndose perfiles con pocas bandas. El número de bandas estará
en relación con el número de copias de la secuencia existentes en el genoma mientras que
su polimorfismo estará en relación con su distribución a lo largo del genoma, así como
con las variaciones en los lugares de restricción dentro de esta secuencia y en las regiones
más próximas. Tanto la transferencia de Southern como la hibridación complican
notablemente los aspectos técnicos del análisis.
3.3Fundamentosyvariantestécnicas
Cuando se quieren utilizar las técnicas de restricción-hibridación para la tipificación
molecular de un determinado microorganismo, el paso más importante es la elección de
la sonda a utilizar. Hay que conocer con precisión el poder de discriminación de la sonda,
esto es, el nivel de relación genética que puede resolver. Además, este conocimiento debe
adquirirse para cada nuevo taxón que se quiera estudiar. Se han utilizado varias
aproximaciones a la hora de diseñar sondas que exploren los fragmentos de restricción
del ADN total. El fragmento analizado (y por consiguiente su sonda complementaria),
puede ser específico de una especie determinada o, en el caso del ribotipado, utilizar una
sonda única para todas las bacterias, complementaria de los operones de 16 y 23S RNA de
E. coli (regiones del cromosoma que codifican el ARN ribosómico). Se aprovecha el hecho
de que en estos operones existen zonas muy conservadas para utilizar la misma sonda
para el análisis de la gran mayoría de especies bacterianas.
3.3.1 Hibridaciónconsondasespecíficas
En el diseño de sondas específicas para un determinado microorganismo se han
utilizado, entre otras, sondas clonadas al azar, sondas complementarias de un gen, o
sondas complementarias de elementos transponibles como las secuencias de inserción. La
clonación al azar de fragmentos de genoma y su uso como sonda exige un trabajo inicial
de cribado importante antes de encontrar un fragmento que explore una zona
47
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
suficientemente estable y discriminativa del genoma. Las sondas que exploran supuestos
genes de patogenicidad o las regiones que los flanquean suelen ser poco discriminativas.
Las secuencias de inserción son elementos repetitivos de ADN que se encuentran en
muchas células procariotas y eucariotas. La presencia de elementos repetitivos facilita las
reorganizaciones cromosómicas y da lugar a diversidad. En algunas bacterias con gran
homología cromosómica, como Mycobacterium tuberculosis, el uso de patrones de
restricción-hibridación asociados a secuencias de inserción es de las pocas técnicas
capaces de diferenciar entre cepas. En este sentido, existe un protocolo estandarizado
para el estudio de los RFLP asociados a IS6110 con el que se han creado bases de datos
locales y en el ámbito internacional que han permitido conocer mejor la difusión de este
microorganismo así como determinados aspectos de su patogenicidad. A fin de aumentar
la reproducibilidad de la técnica, el peso molecular de las bandas de cada patrón se
obtiene por extrapolación a partir de un estándar interno que se incluye en cada canal y
que exige una segunda hibridación con una sonda complementaria del mismo (ver
documento técnico).
3.3.2 Ribotipado
Los genes que codifican para las tres clases de rARN (23S, 16S y 5S) se encuentran
en una unidad de transcripción policistrónica: el operón rrn. El orden de los genes,
después del promotor, es 5’-16S-23S-5S-3’. Un operón típico de E. coli mide 6.0007.000 pb de ADN. En el cromosoma bacteriano se encuentran un número variable de
copias del operón rrn (entre 2 y 11) según la especie, aunque existen especies como
Mycobacterium spp, Mycoplasma o Borrelia burgdorferi en las que solo se encuentra una
copia. Como veremos más adelante, cuanto mayor es el número de copias, mayor es la
capacidad discriminativa del ribotipado.
Las secuencias de nucleótidos que codifican para el ARN 16S y 23S han cambiado
muy poco a lo largo de la evolución. Esto es, estas secuencias están muy conservadas en
las distintas especies bacterianas a pesar de la diversidad que pueda existir en el resto del
genoma. No obstante, entre los genes que codifican para el rARN 16S y 23S existe una
región espaciadora heterogénea que codifica para tARN y secuencias repetidas. También
existen genes que codifican para tARN en la región 3’ del operón. Así pues, la estructura
del operón rrn permite, por una parte, que sea reconocido por una sonda universal
(derivada de E. coli) y, por la otra, que se generen polimorfismos de restricción en función
de la heterogeneidad que se ha comentado para las secuencias espaciadores y el entorno
3’. Algunos de los polimorfismos observados son específicos de especie mientras que
otros permiten discriminar a nivel infraespecífico. En este sentido, el ribotipado puede
tener aplicaciones tanto taxonómicas como epidemiológicas. Es de destacar que existe un
sistema automatizado (Riboprinter. Qualicon Inc. Wilmington. EEUU) que facilita el
proceso y estandariza el sistema lo que favorece la creación de bases de datos.
3.4 Procedimientotécnico
pasos:
En los métodos de restricción-hibridación pueden diferenciarse los siguientes
1) Subcultivo de la cepa.
2) Lisis celular.
3) Preparación del ADN genómico.
48
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
4) Digestión con enzimas de restricción.
5) Electroforesis.
6) Transferencia de los fragmentos de restricción a una membrana.
7) Hibridación con una sonda marcada.
8) Revelado.
9) Análisis de resultados.
El protocolo de trabajo de algunos de ellos dependerá del microorganismo que se
esté analizando por lo que sólo se comentarán los aspectos generales.

Subcultivo de la cepa: Cada vez existen mayores evidencias de que en una
muestra clínica pueden coexistir varias cepas de la misma especie. Por ello es
importante la observación atenta de las placas de aislamiento para la
identificación y subcultivo de los distintos morfotipos e incluso, cuando la
apariencia es homogénea, en determinados estudios es prudente el análisis de
varias colonias del mismo morfotipo. El subcultivo se realiza en un medio
líquido adecuado para el microorganismo estudiado y una vez en la fase
estacionaria (generalmente a las 18 horas) se sedimentan las células
bacterianas por centrifugación procediéndose a su lavado.

Lisis bacteriana: Para obtener el ADN es preciso romper la pared bacteriana.
Para ello, el pellet (sedimento) obtenido se resuspende en un tampón de lisis
adecuado que suele contener lisozima y un detergente (SDS al 1%). También se
incluye proteinasa K que inactiva las nucleasas que podrían dañar el ADN.

Extracción del ADN total: Puede utilizarse el método clásico con fenol. En este
caso se añaden dos volúmenes de fenol tamponado al tampón de lisis
agitándose por inversión del tubo a fin de mezclar las fases acuosas y fenólica.
Posteriormente se separan las dos fases por centrifugación y se transfiere la
fase acuosa a un nuevo tubo, repitiéndose el procedimiento.

Finalmente se añaden dos volúmenes de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)
mezclándose cuidadosamente y, después de centrifugar, se transfiere la fase
acuosa a un nuevo tubo. El ADN obtenido, después de añadir NaCl a una
concentración final de 300 mM, se precipita con 2 volúmenes de etanol al 95%
enfriado a –20ºC. El pellet de ADN obtenido por centrifugación se lava con
etanol al 70%, se seca y se resuspende con el tampón adecuado (generalmente
Tris-HCL 10 mM a pH 7,5 con EDTA 1 mM). Alternativamente, el ADN puede
obtenerse utilizando columnas de extracción comerciales en las que el ADN de
la muestra queda retenido en la matriz y es eluido después de un lavado.
La cuantificación del ADN obtenido se realiza por espectrofotometría o
sometiéndolo a electroforesis junto con otras alícuotas de concentración conocida y
evaluando la intensidad de la banda obtenida. La concentración mínima para poder
digerirlo es de 0,12 µg/µl.

Restricción del ADN: Unos 3 µg de ADN se digerirán en 25 µl de un tampón de
reacción que contenga el enzima de restricción elegido. El tampón de reacción
se elaborará siguiendo las instrucciones del fabricante. Es prudente aumentar la
cantidad de enzima recomendada a fin de conseguir una digestión completa,
que es imprescindible para obtener resultados reproducibles. La elección del
enzima de restricción se hace en función de los datos existentes en la literatura.
49
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Cuando se analiza un taxón del que no existe experiencia previa se deberán
estudiar varios enzimas hasta encontrar el que se adecue a nuestras
necesidades.

Electroforesis: La electroforesis se realizará en un gel de agarosa cuyo
porcentaje dependerá del tamaño de los fragmentos que se han de resolver, lo
que a su vez depende del tamaño del genoma del microorganismo estudiado y
del enzima de restricción utilizado. Antes de cargar el gel se añadirá a cada
ADN digerido 3µl de tampón de carga. El tampón de carga contiene un
colorante de bajo peso como el azul de bromofenol que migra cerca del frente
de la muestra y permite monitorizar la separación electroforética. Uno de los
tampones de electroforesis más utilizados es el TBE (Tris-HCL 89 mM a pH 8,1
con H3BO389 mM y EDTA 2 mM). En cada gel deben incluirse marcadores de
peso molecular con un rango de tamaños que permita extrapolar el peso de las
bandas de hibridación obtenidos. Estos marcadores pueden ser externos, esto
es correr en un canal propio, o internos. En el caso de marcadores externos se
utilizan cepas control con patrones conocidos ya que hibridarán con la sonda
utilizada. Los marcadores internos corren con la muestra en cada carril y deben
evidenciarse con una segunda hibridación que utiliza una sonda
complementaria de los mismos (ver documento técnico). Para visualizar la
separación electroforética de los fragmentos de restricción, el gel se sumerge
durante una hora en una solución de 0,2
g/ml de bromuro de etidio. La
visualización de los fragmentos obtenidos se consigue con luz UV. Esta
visualización permite, por una parte, controlar que la digestión ha sido
completa y, por otra, que la separación electroforética ha sido correcta. Es
importante conseguir una imagen digitalizada del gel.

Transferencia: Los fragmentos de restricción visualizados se encuentran en el
interior de la matriz del gel y no son accesibles para la sonda que se utilizará en
la hibridación. Por ello es necesario primero transferirlos del gel a la superficie
de una membrana en un proceso conocido como transferencia o Southern
blot. Se procede en primer lugar a la depurinación y fragmentación de los
ácidos nucléicos con HCl 0,25 M, a continuación el gel se lava con agua y se
sumerge en una solución de NaOH 0,5 M y ClNa 1,5 M para desnaturalizar el
ADN. A continuación se pueden transferir los fragmentos de restricción a una
membrana mediante diversos procedimientos como la transferencia por
capilaridad o mediante el vacío (figura 4). Puede comprobarse la transferencia
visualizando el gel con luz UV y comprobando que no queda ADN en el mismo.
Figura
4.
Southern
blot
o
transferencia de ADN utilizando un
sistema de vacío: los fragmentos de
ADN contenidos en un gel de
agarosa, previamente tratado, son
transferidos a una membrana, de
nylon o nitrocelulosa, con ayuda de
la presión creada por una cámara
conectada a una bomba de vacío.
Las flechas muestran la dirección
en la que avanzan los fragmentos
de ADN (1), desde el gel a la
membrana, siguiendo la dirección
de la presión generada por el
sistema (2).
50
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular

Hibridación: La sonda que se utilizará en la hibridación es complementaria de la
región cuyo polimorfismo analizamos. Generalmente se obtiene en el propio
laboratorio por técnicas de amplificación (ver documento técnico).
Clásicamente las sondas se marcaban con isótopos radioactivos y los híbridos
resultantes se detectaban mediante autoradiografia. En la actualidad se utiliza,
en general, el marcado con peroxidasa. Se procede en primer lugar a la
desnaturalización de la sonda obteniéndose monocadenas cargadas
negativamente. La peroxidasa formando un complejo con un polímero con
carga positiva se une inicialmente al ADN por carga electrostática y
posteriormente de forma covalente por la acción del glutaraldehído. Los
híbridos resultantes se detectan por la oxidación de luminol por la peroxidasa
que, en presencia de un compuesto intensificador da lugar a la emisión de luz
que se detecta por autoradiografía. Sea cual sea la forma de marcado de la
sonda, antes de la hibridación la membrana debe ser tratada con un tampón
de hibridación que contenga esperma de salmón, timo de ternero u otra fuente
de ADN que bloquee los sitios libres de la membrana e impida la fijación
inespecífica de la sonda.
La hibridación se realiza a continuación añadiendo al mismo tampón la sonda
marcada. Un tampón de hibridación estándar contiene NaH2PO4 50 mM (pH 7,5), EDTA
50 mM, NaCl 0,9 M, sulfato de dextrano al 5% y SDS al 3%. La hibridación tendrá lugar en
tubos de hibridación en el interior de un horno de hibridación a unos 65ºC durante 16-24
h. Una vez finalizada, se lavará la membrana con un tampón de lavado que contiene NaCl
0,3 M, citrato sódico 0,03 M (pH 7,0) y SDS al 2% a 45ºC.

Revelado: El patrón de hibridación se visualiza exponiendo la membrana a una
película fotográfica en el interior de un cassette con pantallas intensificadoras
(autoradiografía). Una vez expuesta, la película se revela y fija con reactivos
fotográficos. En función del tiempo de exposición y de revelado se podrá
modular la intensidad de las imágenes obtenidas.
3.5Criteriosparalainterpretaciónderesultados
El estudio de los RFLP por técnicas de hibridación generalmente da lugar a perfiles
con un número limitado de bandas. El análisis de estos patrones puede hacerse teniendo
en cuenta el número absoluto de las diferencias observadas en las bandas o bien
mediante el porcentaje de similitud de los patrones que suele calcularse mediante el
índice de Dice (apartado 3.1.4).
Pueden existir situaciones en las que, por el bajo número de bandas obtenido, la
técnica no sea discriminativa. Así, por ejemplo, en Mycobacterium tuberculosis, el estudio
de los RFLP asociados a IS6110 no es discriminativo en las cepas con menos de seis
bandas y, en estos casos, deberán utilizarse marcadores alternativos.
Por otra parte, es muy importante la cuidadosa estandarización de la reacción ya
que en distintos experimentos pueden darse diferencias en la cantidad de ADN estudiada,
en la digestión, electroforesis, eficacia de la hibridación o del marcado de la sonda. Esta
falta de estandarización afectará la reproducibilidad del marcador dando lugar a
variaciones en los patrones siendo especialmente difícil la valoración de las bandas
débiles.
51
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Una vez sabemos que el marcador es discriminativo y hemos asegurado la
reproducibilidad de la técnica, suelen considerarse cepas clonales las que comparten el
mismo patrón de hibridación (figura 5). No obstante, hay que tener en cuenta que muchas
de las sondas utilizadas son complementarias de elementos móviles. Por ello, en las cepas
cuyos patrones se diferencian en una única banda se aconseja estudiarlas con un segundo
marcador.
Figura 5. Patrones de restricción-hibridación asociados a IS6110: Línea 1,
cepa control MT1423. Obsérvese como las cepas de las líneas 5, 6, 7 y 8
comparten el mismo patrón constituyendo un cluster. Ello también ocurre
con las cepas en las lineas 10 y 11.
3.6Indicaciones
En general, en las bacterias, no se recomienda la utilización de las técnicas de
restricción-hibridación cuando existen alternativas menos complejas técnicamente y con
capacidad de discriminación similar. Una notable excepción a esta regla es la
epidemiología molecular de la tuberculosis. Existe un protocolo estandarizado para el
estudio de los RFLP asociados a IS6110 en M. tuberculosis (véase documento técnico) y se
han creado bases de datos locales e internacionales con miles de cepas. Este marcador ha
permitido conocer mejor la epidemiología de la enfermedad y seguir la pista de
determinadas cepas caracterizadas por su resistencia o patogenicidad. A pesar de ello,
incluso en este caso y teniendo en cuenta la dificultad de convertir las bases de datos
existentes, existen propuestas para cambiar el marcador.
3.7Inconvenientesdelatécnica
El inconveniente fundamental de la restricción-hibridación es la complejidad
técnica. Como se ha visto, conlleva la realización de numerosos pasos que retrasan varios
días la obtención de resultados. Por otra parte, con la salvedad del ribotipado, cada sonda
suele ser específica de una especie y a menudo no se dispone de sondas que exploren
eficientemente el polimorfismo existente en un determinado taxón. El ribotipado, que
sería una técnica "universal" suele tener una capacidad de discriminación inferior a otras
técnicas como la electroforesis en campo pulsante.
52
UNIDADDIDÁCTICAIV
TECNOLOGÍADELOSCHIPS(ARRAYS)
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
4.1Introducción
Los microchips, microarrays o micromatrices de ADN son una serie de sondas de
ADN unidas a un soporte sólido en una disposición regular y prefijada. Estas sondas
pueden ser oligonucleótidos o productos de PCR. El ácido nucleico diana que será
detectado puede ser ADN o ARN. La principal ventaja con respecto a otras técnicas de
biología molecular como la PCR convencional, la PCR múltiple o la PCR a tiempo real es
que podemos detectar en un único proceso miles de genes. Podríamos considerar las
micromatrices de ADN como dot blots miniaturizados.
Los términos microchips de ADN o microarrays de ADN se utilizan muchas veces
indistintamente. Sin embargo, la diferencia fundamental está en la metodología utilizada
para la preparación de ambos. Los microarrays de ADN consisten en cientos o miles de
productos de PCR u oligonucleótidos específicos de los genes que queremos detectar, los
cuales en una minúscula cantidad (<1nL) se depositan normalmente encima de un
sustrato de cristal (por ejemplo un portaobjetos) mediante la utilización de un robot,
mientras que los microchips se preparan mediante la síntesis de oligonucleotidos "in situ"
sobre un cristal mediante una reacción fotoquímica, parecida a la fotolitografía. Este
sistema fue utilizado por primera vez por Affymetrix, que acuñó el término de Genechip.
El protocolo básico de procesamiento de la muestra es el siguiente:
1. Aislamiento del ARN o ADN que queremos detectar.
2. Marcaje del ARN o ADN. El ARN se marca tras una reacción catalizada por la
transcriptasa reversa que lo convierte en ADNc. El marcaje se realiza normalmente con un
fluorocromo.
3. Hibridación del ácido nucleico diana marcado con el microarray de ADN. Este
paso permite la interacción específica entre el ácido nucleico diana a detectar y las sondas
depositadas en el microarray.
4. Lavados del microarray de ADN con soluciones preparadas a diferentes
concentraciones de sal y detergentes para minimizar la unión inespecífica.
5. Determinación de la intensidad de la fluorescencia emitida por el fluorocromo
mediante un detector que, conectado a un ordenador con un programa determinado, nos
permitirá cuantificar la intensidad en cada posición predeterminada donde conocemos la
sonda específica que se ha depositado.
6. Análisis de los datos.
Hasta la actualidad la aplicación de los microarrays de ADN en el campo de la
microbiología clínica es escasa. En líneas generales se han utilizado para:
1. Investigación de la expresión génica. Los genes que constituyen el genoma
completo de un microorganismo pueden ser fácilmente representados en un único
microarray de ADN, por lo que se dispondrá de una visión global de la expresión de todos
los genes en unas condiciones determinadas.
2. Búsqueda de regiones desconocidas del genoma de un microorganismo.
3. Análisis de la interacción ADN-proteína.
4. Genotipado de un microorganismo.
55
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Dentro de las aplicaciones específicas en el campo de la microbiología cabe
destacar:
1. Determinación de factores de virulencia de ciertos microorganismos.
2. Estudio de la respuesta de la célula hospedadora frente a un microorganismo
patógeno o a microorganismos de la microbiota normal.
3. Análisis de la expresión génica tras el tratamiento de la célula con fármacos,
como pueden ser antibióticos, o compuestos tóxicos.
4. Diagnóstico de enfermedades infecciosas. Existen pocos trabajos que apliquen
los microarrays de ADN para el diagnóstico microbiológico. Los genes más utilizados
como sondas para la detección específica de microorganismos son el 16S ARNr y el 23S
ARNr, y
5. Análisis de la evolución bacteriana y epidemiología.
En el campo concreto de la epidemiología molecular hasta la actualidad la
utilización de los microarrays de ADN ha sido limitada, de hecho el único trabajo en la
literatura que posee un cierto matiz epidemiológico es el de Kato-Maeda y col. en el que
se estudia la evolución de Mycobacterium tuberculosis mediante la utilización de
microarrays de ADN que contienen la totalidad del genoma de este microorganismo. Los
resultados obtenidos demostraban que había habido delecciones importantes en el
genoma de algunas cepas y que estas delecciones se asociaban con una menor
patogenicidad. Los patrones de delecciones detectados eran idénticos en los mismos
clones, pero diferían en los clones diferentes, lo cual sugería que esta metodología podría
ser utilizada en estudios epidemiológicos. No obstante se encuentra todavía en fase
embrionaria por lo que respecta a su aplicación en el campo de la epidemiología
molecular y probablemente su uso no es necesario cuando se pretende definir un brote
epidémico ocasionado por un microorganismo en un área geográfica localizada, pues se
dispone de otros marcadores epidemiológicos para este tipo de estudios. Sin embargo,
para el seguimiento de cepas a nivel mundial probablemente estaría justificado el uso de
microarrays de ADN por la elevada información proporcionada al analizar el genoma en su
totalidad
Es evidente que en un futuro los métodos que permitan el análisis del genoma en
su totalidad mediante micromatrices de ADN, o incluso la secuenciación de la totalidad
del genoma serán imprescindibles para estudios de taxonomía, filogenia, genética de
poblaciones y epidemiología.
56
UNIDADDIDÁCTICAV
MÉTODOSDEAMPLIFICACIÓN
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
5.1Introducción
No es difícil imaginar que la posibilidad de multiplicar in vitro el número de copias
de un fragmento de DNA del genoma de un microorganismo, disponiendo de él en
abundancia, sería de gran utilidad para cualquier tipo de estudio o manipulación de ese
fragmento. Este objetivo puede conseguirse mediante las técnicas de amplificación.
Alguna de estas técnicas también puede amplificar el RNA, a través de su conversión en
DNA complementario (cDNA) mediante una transcriptasa inversa. El fragmento a
amplificar se denomina diana.
Una vez amplificado un fragmento de DNA o RNA, es detectado fácilmente por
una sonda, dada su abundancia y, por tanto, estas técnicas, por su elevada sensibilidad, a
diferencia de las de hibridación señaladas anteriormente, son de elección para la
detección e identificación de microorganismos directamente en muestras clínicas,
especialmente en los casos en que los métodos convencionales son lentos, laboriosos o
inexistentes.
Desde otro punto de vista, la amplificación de un fragmento de DNA puede
efectuarse bajo unas condiciones técnicas que permitan su secuenciación. En la actualidad
existen sistemas automatizados continuos de amplificación-secuenciación.
Por último, la disposición de abundante DNA, en particular de un gen funcional
completo, facilita su clonación; es decir: su introducción en un plásmido o un bacteriófago,
que a su vez se introduce en una célula (generalmente una bacteria o una levadura) en la
que el gen puede expresarse (induciendo la producción de una determinada proteína,
etc.) o estudiarse aislado, fuera de posibles interferencias propias de su contexto natural.
Las técnicas de amplificación copian fragmentos de los ácidos nucleicos, DNA o
RNA, del microorganismo y permiten su detección después mediante sonda; pero también
existen modalidades que permiten detectar un fragmento específico de ácido nucleico
mediante la amplificación del DNA o RNA de la sonda o la amplificación de la señal.
Aunque las tres técnicas son capaces de detectar un microorganismo, sólo la primera
permite obtener fragmentos del genoma para su secuenciación o clonación.
5.2Amplificacióndeladiana
Existen diversas técnicas para la amplificación de los ácidos nucleicos del genoma
del microorganismo. La más utilizada es la reacción en cadena de la polimerasa
(polymerase chain reaction; PCR).
5.2.1Reacciónencadenadelapolimerasa
Para abordar de lleno el tema de la técnica de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) debemos hablar primero de Biología Molecular, esta es una ciencia cuyo
objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares que
contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de uno seres a
otros y se exprese en los nuevos individuos, este conocimiento nos permite cruzar las
barreras naturales que existen entre las especies y "colocar" genes de un organismo otro
llamado hospedero, empleando técnicas de ingeniería genética. Gracias a este avance, se
pueden producir fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo así las puertas a
la secuenciación de los ácidos nucleicos y por ende a nuevas disciplinas como el
59
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diagnóstico molecular, la terapia génica o la obtención de organismos superiores
recombinantes.
Si pudiésemos regresar en el tiempo, nos encontraríamos con hechos que
contribuyeron en forma decisiva en el desarrollo de la biología molecular, por ejemplo:
En 1866 Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de
segregación y clasificación independiente de los genes.
En 1869 Frederick Miescher, científico suizo descubre en el núcleo de las células
una sustancia de carácter ácido a la que llamó nucleína.
En los años veinte el químico alemán Robert Feulgen, utilizando una tinción
específica descubrió que el DNA estaba situado en los cromosomas.
En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban que el DNA es el portador de la
información genética.
En 1953 Watson y Crick deducen la estructura del DNA.
Este último hecho dio la pauta para nuevos descubrimientos que conducirían a lo
que se llama tecnología del DNA Recombinante.
Hablando específicamente de DNA según el modelo de Watson y Crick, la
molécula está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos con polaridad opuesta,
unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido está formado por:
1.- Molécula de azúcar (desoxirribosa)
2.- Base orgánica nitrogenada: bases pirimídicas (Citosina, timina), bases púricas
(Adenina, Guanina).
3.- Grupos fosfato.
Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando cadenas
muy largas, quedando las bases nitrogenadas en la parte central unidas cada una al
carbono 1 del azúcar formando un ángulo recto con su eje.
Las cadenas de poli nucleótido que constituyen una molécula de ADN se
mantienen unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre las bases
nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan enfrentadas.
Estructura primaria del DNA
La estructura primaria viene dada por la secuencia de nucleótidos. Cuando se
quiere representar la secuencia de un oligonucleótido o de un ácido nucleico, se
representa mediante la terminología de cada una de las bases. Por ejemplo:
5 -ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3
Esta secuencia representa un oligonucleótido con veinte bases, de las cuales seis
son Adenina (A), tres son Timina (T), ocho son Citosinas (C) y tres son Guanina (G).
Para ver el grafico seleccione la opción "Descargar" del menú superior
El orden de la secuencia es muy importante, ya que en él reside la información
contenida en el ácido nucleico; la orientación viene dada en el sentido 5 3 o 3 5 ; el 5
representa el extremo terminal del fosfato y el 3 el extremo final del átomo de carbono de
la desoxirribosa.
60
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
5.2.1.1EstructurasecundariadelDNA
Para ver el grafico seleccione la opción "Descargar" del menú superior
El DNA es una doble hélice antiparalela ya que el enfrentamiento entre las bases
nitrogenadas es constante; la Adenina siempre se enfrenta con la timina formando dos
puentes de hidrógeno y la Guanina siempre se enfrenta con la Citosina formando tres
puentes de hidrógeno. Esta característica provoca que las dos cadenas sean
complementarias. Las dos cadenas de la doble hélice tienen sentidos opuestos, mientras
una va en sentido 5 3 y la otra lo hace en sentido 3 5.
5.2.1.2EstructuraterciariaycuaternariadelDNA
Recordemos que la longitud de una hebra de DNA humano es de varios metros,
por necesidad debe adoptar otras estructuras para poder estar en el interior de las células.
Estas estructuras, terciaria y cuarternaria, permiten el empaquetamiento del DNA
formando los cromosomas. En las células eucariotas existen varios cromosomas y en los
procariotas, existe un DNA empaquetado denominado pseudocromosoma.
5.2.1.3AspectosbásicosdelaBiologíaMolecular
La aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de
Ingeniería genética y referidas indistintamente como clonación, DNA recombinante o
manipulación génica han sido la causa de pocas áreas de la biología molecular
permanezcan inalteradas. Antes del desarrollo de la ingeniería genética no era posible
aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el
de su producto.
Una de las sustancias mas importantes y de participación decisiva en distintos
procesos de la Biología Molecular son las enzimas; existen varias que podemos destacar:
Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos
rompiendo enlaces internucleótidos del interior de la cadena. Son producidas
principalemnete por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto del DNA
de doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son
las mas útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta,
tanto para la reacción de unión como para la de ruptura. Estas enzimas se denominan con
tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las dos o tres
primeras letras e la especie del organismo de procedencia. El número señala el orden
cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa generación.
Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de
restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia
en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palíndromes. La rotura se
produce en ambas hebras de DNA siendo esta simétrica respecto al eje binario. Las
endonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3 o 5 de unos
cuatro nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.
Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA "in Vitro". La mayoría
de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula complementaria al molde.
Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: DNA polimerasa I de E. Coli, el
fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para convertirlo en
DNA), la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6,
T7 y T3 y la Taq polimerasa. La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño cebador
61
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o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerización a partir de ese
punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade
nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas
requieren Mg2.
Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), fosfatasas
(eliminan el fosfato de la región 5 de los ácidos nucleicos), quinasas (incorporan fosfatos
en el extremo 5 que han dejado las fosfatasas).
5.2.2Desarrollodelatécnicadereacciónencadenadelapolimerasa
En los años setenta se desarrollaron los métodos que permitieron de manera
simple y relativamente rápida para determinar la secuencia nucleotídica de cualquier
fragmento de DNA. Estos primeros intentos de secuenciar los ácidos nucleicos siguieron
los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las moléculas en pequeños
fragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de
fragmentos solapantes. Este método resulta mas o menos sencillo para proteínas que
resultan de la combinación de hasta veinte aminoácidos distintos, pero constituye un
problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinación
de únicamente cuatro nucleótidos diferentes.
62
UNIDADDIDÁCTICAVI
REACCIÓNENCADENADELAPOLIMERASA
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
6.1Reacciónencadenadelapolimerasa
En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la Técnica de reacción en cadena de la
Polimerasa o PCR que es una técnica para la síntesis "in Vitro" de secuencias específicas de
DNA con la cual la insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los
procedimientos de Biología Molecular ni en los procedimientos de diagnóstico basados en
el estudio de DNA.
La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada
por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria
de DNA en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una
región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados
iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean
complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea
amplificar.
Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la
repetición de un ciclo formado por tres etapas:
1ª Desnaturalización del ADN doble cadena
2ª Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras
3ª Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa
En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos
hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC).
La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.
En el segundo paso (hibridación) los cebadores se unen a las zonas 3´
complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias
a la bajada de la temperatura (50-65º C)
En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla
(produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección
5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleótidos
fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos se pueden
apreciar
gráficamente en la
Figura 1.
Figura 1: Pasos básicos
de la PCR (de Andy
Vierstracte 1999)
65
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Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador (fig.2). Este
aparato realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta.
Figura 2: Termociclador para reacciones de PCR
Observemos en las figuras 3a y 3b, observamos que una vez completado el primer
ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4,
al final del tercero 8...Si los ciclos se producen un número "n" de veces y suponiendo que
el número de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN
de 2n, por lo que la amplificación se realiza en forma de progresión geométrica.
Figura 3a: Amplificación exponencial del PCR (de Andy Vierstracte 2001)
66
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
Figura 3b: Amplificación exponencial del PCR (de M.E. Gilles-González 1997)
Es importante recalcar que los productos obtenidos tras la tercera etapa son de
dos tipos: "producto corto" y "producto largo". El producto corto tiene una longitud
perfectamente definida por los extremos 5´ de los cebadores y contiene exactamente la
secuencia que se desea amplificar. Es el fragmento que se almacena de manera
exponencial durante la reacción. El producto largo es el que incorpora las cadenas de ADN
originales de la muestra y cuyos extremos 3´ no están definidos. Sin embargo, es
importante aclarar que al final de la PCR, la cantidad del producto corto sintetizado es
muy superior en comparación con el producto largo, por lo generalmente para posteriores
estudios, a partir del producto de la PCR, se desestima. (fig. 4)
.Figura 4: Detalle de los cuatro primeros pasos de la PCR (de Andy Vierstracte 2001)
67
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La detección del producto de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza
normalmente mediante corrido electroforético (fig 5) dependiendo del tamaño de la
amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa,
poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualización se puede realizar con
bromuro de estudio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad.
Figura 5: Preparación del corrido electroforético.
En la actualidad se desarrollan métodos para poder cuantificar el producto de la
PCR, visualizando in situ sobre tejidos (Cao, Y. y cols, 2000). Lo que hace prever un
crecimiento, si cabe mayor, del uso de la técnica de la PCR.
A continuación trataremos de profundizar en los componentes y parámetros más
importantes para obtener una amplificación óptima.
6.1.1Componentesyoptimizacióndelareaccióndeamplificación
6.1.1.1MuestradeADN
Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema en
la reacción:
Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en trozos más pequeños de lo
que queremos amplificar.
Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra no debe llevar agentes
quelantes (EDTA) que reducen la concentración de iones de Mg. en la disolución.
Tampoco debe haber determinados factores sanguíneos, fenol, detergentes... que
inhibirían la actividad de la polimerasa.
Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificación
de ADN genómico de copia única se usan cantidades de 100-500 ng. En el caso de zonas
repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng. El mínimo oscila entre 10-100 ng. y el
máximo entre 400-500 ng.
6.1.1.2Diseñodelosiniciadores
Para la elección de los primers, existen una serie de normas que nos pueden
ayudar, aunque hay que indicar también que existen programas de ordenador que nos
facilitan esta tarea (DNAsis, Primer3, etc.).
El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relación máxima de
purinas/pirimidinas será 60%/40%.
68
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base.
No seleccionar cebadores que en su extremo 3´ tenga una importante estructura
secundaria.
Se recomienda que los extremos las últimas bases sean G o C.
Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de iniciadores. Si esta existe
entre los extremos 3´existe la posibilidad de que se formen dímeros de iniciadores.
Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 pb.
La Temperatura de hibridación de los cebadores debe ser similar en ambos y será
variable en función de la secuencia de los mismos. Generalmente oscila entre los 45 y 60 °
C.
Si el primer es menor a 20 pb, la temperatura de fusión (Tm), se calcula en base a
la siguiente fórmula:
Tm= 4 (G+C) + 2(A+T)
Siendo G, C, T y A el número de cada una de las bases que forman cada uno de los
oligos. La temperatura de hibridación debe ser aproximadamente 5º menor que la
temperatura calculada.
6.1.1.3DNAPolimerasa
Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicación del
ADN, siguiendo el mismo método de síntesis. Se pueden clasificar en:
­
Termolábiles: Tª óptima de 37-42ºC. Se desnaturalizan con el calor.
­
Termoestables: Tª óptima de 74 ºC. Resiste durante 40-50´a 96ºC.
DNA
polimerasa
(E. coli)
TIPO
5´->
polimerasa
3´
5´->
exonucleasa
3´
3´->
exonucleasa
5´
3´
DNA
DNA polimerasa
dependiente de RNA
(retrovirus)
Sí (baja)
Sí (baja)
Sí (medio)
Sí
Sí
No
No
Exorribonucleasa
Sí (baja)
Sí (baja)
Sí (alta)
Exorribonucleasa
Taq
DNA
Taq
DNA
polimeras (94 Kda)
polimeras (61 Kda)
Tipo
5´->
polimerasa
Fragmento
Klenow
T4
I de DNA polimerasa polimerasa
I
(E. coli)
(E. coli)
Replicasa
Tth
polimerasa
Sí
Sí
Sí
Sí
5´-> 3´
exonucleasa
Sí
No
?
?
3´-> 5´
exonucleasa
No
No
No
?
Tipos
Taq
Pwo
Pfu
Pfx
Fidelidad
1x
12x
30x
48x
4 Kb
5 Kb
12 Kb
2.5
1.25-5
1.25-5
Amplificación Máxima
U/Reacción
1
Kb
2.5
69
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Inicialmente se usó el fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli (Saiki y
cols., 1985) la cual posee actividad 3´-> 5´ exonucleasa que le proporciona la capacidad de
cambiar el nucleótido que ha sido erróneamente incorporado. La importancia de esta
actividad radica en que aumenta la fidelidad de la replicación del ADN original. Sin
embargo, se trata de una enzima termolábil por lo que no soporta los ciclos y
temperaturas utilizados en una PCR.
Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa (Estivil, 1991). Es una
enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas
temperaturas. La Taq polimerasa ha simplificado enormemente la técnica de la PCR, ya
que ha permitido su automatización (desarrollo del termociclador).
Como se observa en las Tablas anteriormente descritas, las polimerasas
termoestables, como la Taq polimerasa, carecen de actividad 3´-> 5´ exonucleasa, lo que
las hace menos seguras a la hora de comparar las fidelidades. Por ello hay que intentar
conseguir las mejores condiciones para que ésta aumente. Podemos citar:
No usar un alto número de ciclos, ya que la tasa de error es proporcional al
número de estos. Normalmente el número de ciclos utilizado es de 25-30.
La concentración de los deoxinucleótidos (dNTPs) debe ser igual para los 4 y debe
ser la más baja posible para que nos permita conseguir la cantidad de ADN necesaria.
Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.
La concentración de Mg++ en la reacción oscila entre 0,50 y 2,5 mM. Se trata de
un ión necesario, pero su exceso hace que disminuya la especificidad de la PCR.
6.1.1.4Deoxinucleótidostrifosfato(dNTPs)
Son cuatro: dATP, dGTP, dCTP y dTTP. Como hemos señalado anteriormente se
deben añadir en la solución de la reacción en concentraciones iguales que normalmente
oscila entre los 20 y los 200 mbol" > mM. Los dNTPs pueden captar Mg++, por lo que las
concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma relación. No
debemos variar ninguno de ello de manera independiente. Se aconseja (Bradley, 1991)
que la concentración de Mg++ sea de 0.5 – 1.0 mM veces superior a la concentración de
dNTPs.
6.1.1.5Amortiguadordelareacción
Por lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente), 50 mM
KCl, 0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2.
Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudarían en la
práctica a aumentar la especificidad y fidelidad de la reacción en cadena de la polimerasa.
El dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al buffer de la reacción en un 10% contribuye a la
disminución de la estructura secundaria del ADN (Anderson, 1990). También se pueden
usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón x10, que ayudan a
estabilizar la enzima. Existen también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG),
glicerol, formamida, seroalbúmina bovina (BSA), etc, aunque no son en ningún caso
imprescindibles.
70
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
6.1.1.6Sales
Es de gran importancia la concentración de dos cationes que son añadidos en
forma de sales.

Cloruro potásico (KCl). Influye en la desnaturalización del ADN.
Elevadas concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización de secuencias
cortas de ADN. Bajas concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de secuencias
largas de ADN.

Cloruro de magnesio (MgCl2). Aumenta la temperatura de hibridación del
DNA. La concentración de este ion resulta fundamental para la optimización de
la reacción. Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la
reacción.Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la
reacción
6.1.1.7Temperaturasytiemposdelosciclos
Como hemos explicado anteriormente la Reacción en Cadena de la Polimerasa se
realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un número
determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores
determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificándolos podemos
optimizar la reacción.
Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando continuamente los
tubos de un baño María a otro de diferente temperatura (la Tª de desnaturalización, la de
hibridación y la de elongación). El proceso resultaba demasiado tedioso y era difícil
alcanzar las temperaturas y los tiempos correctos, por lo que se desarrolló el
termociclador que lo hacía de manera automática.
A continuación describiremos de forma más detallada el tiempo y la temperatura
de cada una de las etapas de un ciclo.
1.- Desnaturalización
Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el ADN molde se
desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan
temperaturas de 94ºC durante 30 segundos a 1 minuto Tiene alto contenido de G + C
puede aumentar el tiempo o la temperatura.
Sin embargo hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de
manera muy rápida a partir de los 95ºC, por lo que a estas temperaturas o superiores es
aconsejable disminuir el tiempo de incubación.
En la práctica se suele añadir un período de desnaturalización antes de comenzar
los ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de ADN. Esta
etapa suele ser de 5´a 94ºC.
2.- Hibridación
En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados
con los oligonucleótidos: la composición de bases, el tamaño y la concentración.
En la práctica, la temperatura de hibridación puede oscilar entre 45ºC y 65ºC,
durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de
71
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temperatura o del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones
incorrectas de los iniciadores con la hebra molde.
3.- Elongación
En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72ºC.
Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72ºC. El tiempo de extensión
depende del tamaño de la amplificación. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para
elongar 1 Kb
En la práctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una última
elongación de 5´a 72ºC.
6.1.2Númerodeciclos
También adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR el número de
ciclos que se utilizan. Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la
muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera
empírica).
Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que puede dar lugar a la
amplificación de productos no deseados originados por hibridaciones no específicas.
Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una enzima que sufre
el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de la acumulación del producto.
Después de un número determinado de ciclos la amplificación deja producirse de manera
exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente cuando el efecto meseta se
produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilización.
6.1.3ContaminaciónenlaPCR
La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo que es
de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado
(aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un
resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la técnica, se
convierte a la vez en el principal inconveniente (Kwok y Higuchi, 1989).
Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de
trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al máximo:
1. Lugar físico exclusivo para realizar la PCR
2. Uso de instrumental exclusivo para la PCR
3. Utilización de reactivos y tubos estériles
4. Uso de guantes por el manipulador
5. Realización de controles de blanco (se añade agua en lugar de ADN, no hay
amplif.)
En condiciones naturales, el DNA se replica mediante DNA-polimerasas. Para ello,
la doble hélice debe desnaturalizarse (abrirse) para que la DNA-polimerasa pueda iniciar
su actividad copiando sobre cada una de las cadenas separadas una nueva cadena
complementaria. Esto se consigue a medida que la DNA-polimerasa va incorporando
consecutivamente los nuevos nucleótidos frente a los de la cadena molde, según el
72
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
conocido apareamiento G=C; T=A, uniendo covalentemente mediante un enlace fosfato
(5'.3'-P-5'.3') cada nucleótido incorporado a la cadena creciente. Sin embargo,
paradójicamente, la enzima no puede iniciar su actuación sobre un fragmento
monocatenario, sino a partir de un fragmento bicatenario.
La idea de Mullis de aplicar este principio para amplificar el DNA in vitro ha
resultado extraordinariamente fructífera. En un tubo de ensayo se pone el DNA extraído
de una célula, un virus, etc., se desnaturaliza calentando y se añaden dos cortos
fragmentos de DNA monocatenario de unos 20 nucleótidos, sintetizados artificialmente,
llamados cebadores (o iniciadores, del inglés primers), que son complementarios uno de
ellos de un fragmento de una cadena y el otro de un fragmento de la otra cadena situado
entre 100 y 2.000 bases de distancia del primero. Al bajar la temperatura
(renaturalización), los cebadores se fijan a sus dianas, uno en una cadena y el otro en la
otra cadena, delimitando un fragmento entre ellos. Simultáneamente, se añaden los
cuatro nucleótidos (G, C, T, A) y una polimerasa termorresistente, como la Taq-polimerasa,
obtenida de una bacteria termófila, Thermus aquaticus.
La amplificación del fragmento delimitado entre los dos cebadores se consigue
mediante el siguiente proceso:
1) Desnaturalización: las dos cadenas de la molécula original de DNA se separan
por el calor a 95° C durante 15 segundos a un minuto.
2) Hibridación: la mezcla se enfría a una temperatura entre 30 y 65° C durante unos
30 segundos, temperatura que permite la hibridación, por lo que los cebadores se unen a
sus secuencias complementarias, uno en cada hebra, ya que la renaturalización del DNA
original entre sí es mínima porque los cebadores están en gran exceso
3) Polimerización o extensión: se lleva a cabo especificidad durante 30 segundos a
cinco minutos a 72° C, que es la temperatura óptima para la actividad de la Taqpolimerasa que se ha unido a cada uno de los fragmentos bicatenarios DNA-cebador,
produciéndose las copias de ambas cadenas.
Ahora, por cada dos cadenas iniciales, ya existen cuatro. Se inicia un nuevo ciclo
calentado a 95° C, para separar las cadenas recién formadas, bajando la temperatura entre
30 y 65° C para fijar los cebadores (siempre en gran exceso en la solución) y subiendo a
72° C para que actúe de nuevo la Taq-polimerasa.
Este proceso que tiene lugar en un instrumento automático, denominado
termociclador, que va variando la temperatura según el programa señalado, se repite
automáticamente a lo largo de 20 a 30 ciclos durante unas dos o tres horas hasta llegar a
conseguir millones de copias.
Para la optimización de las reacciones de PCR ha de tenerse en cuenta numerosos
factores, entre los que destacan el diseño de los cebadores y la selección de una
temperatura de renaturalización óptima para conseguir una buena de hibridación de los
cebadores con su diana, así como la concentración óptima de determinados elementos
químicos de la solución, como el Cl2Mg, y el pH adecuado.
Cuando el ácido nucleico inicial es RNA, como el genoma de algunos virus, la PCR
requiere un paso previo consistente en la transformación del RNA en su cDNA mediante
una transcriptasa inversa (DNA-polimerasa RNA-dependiente). Después puede aplicarse la
técnica convencional de PCR.
73
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Estas pruebas se desarrollan bajo formatos comercializados, en los que los
fragmentos de DNA o RNA formados (amplicones) se transfieren a pocillos de placas tipo
«microtiter» en los que hay fijadas sondas específicas disponiéndose de sistemas de
revelado de estos híbridos. Estas pruebas comercializadas comportan la utilización de
instrumentos con un elevado nivel de automatización, tanto para la extracción del ácido
nucleico, como para su replicación en el termociclador y la lectura y para la posterior
cuantificación de los amplicones.
La enorme utilidad y versatilidad de la PCR hace que sea también muy utilizada en
forma artesanal («PCR caseras») en los laboratorios de diagnóstico; en este caso, los
cebadores pueden encargarse y obtenerse en el comercio, así como el resto de reactivos.
Los amplicones obtenidos son los fragmentos deseados porque los cebadores son
específicos y se unen al lugar programado, pero puede obtenerse una confirmación
adicional determinando su tamaño después de una electroforesis en gel de agarosa . En
ocasiones, antes de la electroforesis, el DNA amplificado se corta mediante enzimas de
restricción, formándose fragmentos que pueden observarse en el gel, lo que mejora la
identificación del DNA amplificado. Otra alternativa más rigurosa es el Souther blot,
consistente en transferir, tras la electroforesis, el DNA desde el gel a una membrana de
nitrocelulosa, donde el DNA puede hibridarse con sondas marcadas que permiten la
identificación precisa de los amplicones.
Esta técnica es larga y laboriosa; por ello, una alternativa más sencilla es captar el
DNA amplificado mediante una sonda que se ha fijado a los pocillos de una placa de
poliestireno tipo «microtiter» mediante un tampón de fijación, con o sin irradiación.
74
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
Su revelado es inmediato
cuando el DNA se ha amplificado
con cebadores marcados, ya que los
amplicones
quedan
marcados
Marcado
de
los
amplicones.
Alternativamente, si no se utilizan
cebadores marcados, para detectar
los amplicones captados por la
sonda fijada en la placa, puede
utilizarse otra sonda marcada. Hay
compañías (Corning Inc, Science
Products División) que disponen de
micropocillos con estreptavidina
fijada que permite captar sondas o
amplicones marcados con biotina.
6.1.4NestedPCR
Para incrementar la sensibilidad de la reacción en cadena de la polimerasa puede
practicarse una PCR anidada (nested-PCR), consistente en la amplificación de un
fragmento de DNA seguida de la amplificación, mediante otros cebadores, de un
fragmento interior del primer fragmento amplificado. El desarrollo de esta PCR comporta
efectuar una primera PCR en un tubo y pasar el producto de la amplificación a otro tubo
al que se incorporan los nuevos cebadores para el fragmento interno que desea
amplificarse junto al resto de reactivos y se procede a la segunda amplificación. La nested
presenta algunas ventajas, como:
1) Gran sensibilidad.
2) El control de la especificidad de la primera PCR, que se confirma cuando la
segunda amplificación es positiva, ya que los cebadores de ésta actúan como sondas de
identificación de la primera.
3) La dilución de los productos de inhibición que puedan existir en la muestra
inicial. Sin embargo, hay que señalar que este protocolo comporta un gran peligro de
contaminación del laboratorio por los amplicones de la primera PCR al abrir el tubo,.
Por otra parte, una PCR convencional bien optimizada, en muchos casos, presenta
una sensibilidad equivalente a una anidada.
Se han propuesto diferentes protocolos para realizar la PCR anidada en un solo
tubo sin abrir; uno de ellos se basa en la diferencia de temperatura óptima de hibridación
de los dos juegos de cebadores que se incorporan simultáneamente a un único tubo,
desarrollándose el primer ciclo de amplificación a una temperatura de hibridación óptima
para los primeros cebadores, y el segundo ciclo a otra temperatura diferente, óptima para
los segundos cebadores.
6.1.5PCRmúltiple
En algunas ocasiones se introducen simultanéame te en la master mix varios
juegos de cebadores diferentes para distintos fragmentos de DNA, amplificando
simultáneamente diferentes dianas del DNA de un microorganismo.
75
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Por ejemplo, en una bacteria puede detectarse simultáneamente un fragmento
genómico específico de especie y un fragmento del gen de resistencia a un antibiótico
con dos juegos de cebadores, determinando en un sola PCR la especie y la resistencia al
antibiótico del microorganismo. Para realizar este tipo de PCR asegurarse la
compatibilidad de la temperatura de hibridación de los diferentes cebadores, así como la
ausencia de hibridación entre ellos. De todas maneras, ha de tenerse en cuenta que las
reacciones inespecíficas suelen ser más frecuentes que en la PCR simple
Durante la última década, el siempre perseguido diagnóstico rápido, sensible y
fiable de los agentes causales de las enfermedades infecciosas ha empezado a
experimentar una revolucionaria transformación. La aplicación de técnicas microbiológicas
convencionales, que requieren el crecimiento de los microorganismos para su posterior
análisis fenotípico y bioquímico, ha pasado a ser complementada con la aplicación de
métodos moleculares de diagnóstico. En la actualidad, de entre tales metodologías, la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más sensible y la que se aplica más
satisfactoriamente en microbiología clínica. En particular, en el caso de patógenos que son
difíciles de crecer in vitro o que presentan crecimiento lento, así como en el de todas
aquellas infecciones clínicamente atribuibles a diferentes agentes, la PCR ha aportado un
gran valor diagnóstico. En esta revisión, para evitar una exposición demasiado compleja,
sólo se van a considerar las PCR múltiples desarrolladas para el diagnóstico de bacterias y
no se incluirá el diagnóstico de hongos, virus y sitos. A partir de 1990 se han desarrollado
múltiples protocolos que permiten identificar de forma específica y rápida bacterias de
diagnóstico difícil hasta ahora, como Mycobacterium spp., Chlamydia spp., etc., así como
detectar la presencia de genes de relevancia clínica, como los que codifican resistencia a
antibióticos o los que confieren mayor virulencia a los organismos que los porta. Una vez
optimizadas tales aplicaciones individuales de la PCR y comprobada su utilidad clínica,
durante los últimos años ha cobrado gran interés el desarrollo de las denominadas PCR
múltiples, reacciones que consiguen detectar de forma simultánea y en un único tubo
diferentes secuencias diana, permitiendo la detección e identificación simultánea de
distintos genes de interés.
En la actualidad, las posibles aportaciones de la PCR múltiple a la microbiología
clínica son tantas y tan variadas que sería demasiado extenso introducirlas todas en una
misma revisión del tema, por lo que en este capítulo no se ha intentado más que reflejar
cómo la aplicación de esta tecnología puede ser de gran ayuda en la detección e
identificación de bacterias de interés clínico y de sus genes de resistencia y/o virulencia.
En concreto, se abordará su aplicabilidad en el diagnóstico de: Escherichia coli, otras
enterobacterias, Pseudomonas aeruginosa, estafilococos, enterococos, Campylobacter
spp. Mycobacterium spp., agentes causales de la meningitis bacteriana, de las infecciones genitourinarias, de la neumonía, de otitis media.
Por otro lado, durante los últimos años se han empezado a desarrollar protocolos
de PCR múltiple muy prometedores mediante la utilización de PCR en tiempo real. Esta es
una nueva metodología que combina la PCR con el uso de marcadores fluorescentes de
forma que se pueda monitorizar la cinética de la reacción, conocer la cantidad de ADN
molde y detectar la presencia de variaciones genéticas. En este capítulo no se profundizará
en los protocolos de PCR múltiple en tiempo real
76
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
6.1.6LaPCRmúltiple:ventajasydificultades
La PCR es un método engañosamente simple, pero muy versátil, que tiene
aplicación en todas las áreas donde se haga uso de la biología molecular. Expresado de
una manera simple, todo lo que la PCR consigue es fabricar múltiples copias de una
secuencia diana de ADN mediante un proceso de amplificación que llega a permitir la
obtención de microgramos de ADN a partir de cada molécula inicial. Cualquier segmento
de ADN o de ARN puede ser amplificado siempre que se conozcan las secuencias
flanqueantes de la región diana o, lo que es lo mismo, podemos amplificar cualquier
porción de ácido nucleico, conocido o no, siempre que quede comprendido entre dos
secuencias conocidas con las que podrán hibridar oligonucleótidos plementarios que
actuarán como cebadores para que la polimerasa pueda copiar las hebras molde (fig. 1).
Por tanto, para que la reacción tenga lugar, los componentes básicos e indispensables de
la misma son: ADN molde que se de- sea amplificar, ADN polimerasa, cebadores de
secuencia específica, nucleótidos para la síntesis de nuevo ADN y tampón de reacción que
incluye las distintas sales requeridas por la enzima.
La PCR es una reacción que ocurre en un único tubo tras mezclar en él los
componentes necesarios e incubarlos en un termociclador, aparato que permite variar la
temperatura de incubación a lo largo del tiempo de forma pro- gramada. Los protocolos
básicos de PCR constan de los siguientes pasos fundamentales:
1. Desnaturalización térmica del ADN que se va a usar como molde.
2. A una temperatura menor que la de desnaturalización, anillamiento de
cebadores sintéticos cuya secuencia les permite hibridar uno a cada lado de la secuencia
diana.
3. Extensión por parte de la ADN polimerasa de los oligonucleótidos anillados que
actúan como cebadores.
4. Este proceso de tres pasos es entonces repetido un número determinado de
veces (25-35), duplicándose cada vez el número de moléculas de producto. Esta
amplificación exponencial tiene como resultado un gran número de copias de la
secuencia de ADN flanqueada por el par de oligonucleótidos. De esta manera, la
reacción permite obtener una gran sensibilidad al detectar muy bajas cantidades de ADN
molde y especificidad al detectar únicamente la secuencia de ácido nucleico para la que
han sido diseñados los cebadores.
Sin embargo, en este proceso teórico que hemos descrito pueden influir
numerosos factores que hagan que la reacción no sea realmente específica o que su
eficiencia no sea la adecuada, de manera que la amplificación no ocurra en la progresión
esperada y, por tanto, no sea sensible. Entre los muchos factores que pueden influir en el
resultado final de la PCR, son destacables el diseño apropiado de los cebadores, la calidad
y concentración del ADN, la concentración de magnesio, el tipo y la cantidad de ADN
polimerasa y el programa de amplificación.
En el caso de una PCR múltiple, lo que se persigue es amplificar simultáneamente
en un único tubo distintas secuencias específicas, lo cual necesariamente implica que los
reactivos mezclados y el programa utilizado sean suficientes y adecuados para permitir la
detección de cada diana y no inhibir la de las demás. Con este fin, algunos parámetros,
como la concentración de magnesio y de cebadores, y el tipo y la cantidad de ADN
77
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
polimerasa, pueden ajustarse experimentalmente. Para otros, en cambio, debe realizarse
un diseño exhaustivo previo.
En el caso de los cebadores y el programa de temperaturas utilizado, es necesario
tener en cuenta varias premisas:
1. Escoger o diseñar oligonucleótidos que no interaccionen entre sí, es decir, que
no formen oligómeros;
2. Que tengan temperaturas de anillamiento similares; c) que cada pareja
amplifique una única secuencia diana, y d) que generen amplicones de tamaño
suficientemente diferente como para poder ser separados y diferenciados tras la
amplificación. En cuanto a la calidad y cantidad de ADN molde, por supuesto debemos
intentar partir de la concentración menor posible y con ausencia de sustancias inhibidoras
que puedan interferir en la reacción. Para ello, los protocolos de purificación variarán en
función del tipo de muestra clínica de partida.
Durante los últimos años, se han publicado numerosos trabajos en los que se
describen nuevos protocolos para la extracción de ADN en cantidad y calidad adecuadas
para la PCR o para la realización de reacciones de amplificación sensibles y específicas
directamente a partir de muestras clínicas. Por supuesto, por su rapidez y sencillez, esta
última opción es la más deseable, aunque también la más difícil de lograr.
Afortunadamente, disponemos ya de métodos que permiten la detección directa de
microorganismos a partir de: colonia de cultivo, cultivos líquidos, sangre, suero, orina,
líquido pleural, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lavado broncoalveolar, aspirados
nasofaríngeos y traqueales, aspirado transtorácico, aspirado de nódulo linfático, aspirado
de médula ósea, muestras serosas de oído, tejido pulmonar fijado, biopsias de piel,
cerebral, hepática, ósea, pulmonar, de bazo, de tejido vertebral, etc.
Por otro lado, también ha de tenerse en cuenta que, en los casos en que se
detectan genes que codifican toxinas u otros factores de virulencia, la presencia del gen
no implica que la proteína esté siendo producida, por lo que la PCR múltiple debería
aplicarse, siempre que sea posible, en conjunción con métodos bioquímicos y/o
inmunológicos. No obstante, tampoco se debe dejar de considerar la gran utilidad que
puede tener una detección precoz de información genética que puede ser peligrosa si
llega a ser expresada, ya que permite la ejecución de medidas preventivas, tanto de tratamiento como de control. Por último, es conveniente recordar que, tal y como se ha
mencionado antes, la PCR es una técnica que, por su aparente simplicidad y su alta
sensibilidad, es muy susceptible de errores de ejecución y de contaminaciones, por lo que
la introducción de la PCR múltiple en los laboratorios de microbiología clínica requiere
una formación especializada previa del personal que ejecute los análisis.
Escherichiacoli
E. coli constituye el microorganismo más abundante de la microbiota
gastrointestinal humana, desempeñando un importante papel en el funcionamiento
normal del sistema digestivo. Sin embargo, distintas cepas de E. coli son capaces de
causar un amplio rango de enfermedades, y presentan además una alta capacidad de
dispersión vía cadena alimentaria o por transmisión hídrica. Las infecciones por E. coli
pueden afectar al tracto gastrointestinal (este microorganismo es una de las causas
principales de brotes de diarrea, colitis hemorrágica y síndrome hemolítico-urémico) o
pueden localizarse a nivel extraintestinal, causando, entre otros cuadros, meningitis,
78
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
septicemia o infecciones del tracto urinario. Las cepas de E. coli que causan patología
intestinal pueden ser agrupadas en distintos fenotipos: enterotoxigénicas (ETEC),
enteropatogénicas(EPEC),enteroinvasivas,(EIEC),enterohemorrágicas,(EHEC)
y
enteroagregativas (EaggEC). De especial relevancia clínica son las cepas portadoras de la
información genética necesaria para la producción de toxinas Shiga (cepas STEC), de
hemolisina entérica, del factor de adhesión “intimina”, del factor 1 necrótico citotóxico
(CNF1), o de diferentes factores de virulencia como sistemas de captación de hierro (p.
ej.,aerobactina o enterobactina) o di- versos antígenos flagelares, fimbrilares o de
superficie. La detección rápida y precisa de estas variantes génicas de E. coli es
fundamental para evitar el riesgo asociado a tratamientos tardíos y para prevenir la
posible existencia de brotes o epidemias comunitarios o nosocomiales. Durante la última
década, se ha prestado gran atención al desarrollo de métodos inmunológicos y
moleculares rápi- dos, sensibles y específicos para la detección e identificación de
cepas patógenas de E. coli. Con este objetivo, en el año 2002 se publicaron tres nuevos
protocolos de PCR múltiple que permiten la detección simultánea de numerosos genes de
relevancia clínica como son aquellos que codifican toxinas Shiga, la hemolisina entérica, la
intimina, el serotipo de superficie O157 y el serotipo flagelar H7 (tabla 1) Estos protocolos
no sólo posibilitan la detección de los genes de virulencia y toxicidad más importantes
aso- ciados a E. coli, sino que además permiten diferenciar las variedades más patógenas
(p. ej., los serotipos O157:H7). Asimismo, en el año 2003 otros dos nuevos protocolos de
PCR múltiple aportan importantes avances en la detección de cepas EPEC, STEC, EIEC,
ETEC y EaggEC. En el pri- mero de estos protocolos, Cerna et al9 utilizaron la detección
simultánea de tres genes codificados en plásmidos que confieren la denominada
Adherencia de Agregación (AA) a las variantes enteroagregativas. En la segunda de estas
PCR múltiples, Toma et al optimizaron un ensayo que permite la identificación y
clasificación simultánea de los distintos tipos de E. coli causales de diarrea mediante la
detección de genes específicos de cepas enteropatogénicas, de cepas productoras de
toxinas Shiga, de variantes enterotoxigénicas, de cepas enteroinvasivas y de variedades
enteroagregativas (tabla 1). Estos protocolos para diferenciar tipos patógenos pueden,
además, ser complementados con otros protocolos de PCR múltiple que permiten
subtipificar las variantes toxigénicas (p. ej., subtipos de Shigato- xin 2), o variantes
virulentas.
Otrasenterobacterias
Aunque las infecciones causadas por E. coli son las que mayor atención han
recibido a la hora de establecerse nuevos métodos de diagnóstico molecular, debido,
probable- mente, a la gran cantidad de población mundial que se ve afectada por ellas,
muchas otras Enterobacteriaceae spp. tienen un gran impacto sobre la salud humana y
requieren un diagnóstico rápido, sensible y eficaz. De entre la gran variedad de protocolos
de PCR múltiple que han sido desarrollados para el diagnóstico de estas especies, sólo
mencionaremos a continuación algunos ejemplos que hemos seleccionado por su posible
aplicación clínica.
Otras enterobacterias que afectan directamente al hombre son las pertenecientes
al género Salmonella, especial- mente S. enterica. Ésta constituye uno de los grupos más
importantes de patógenos con origen en la cadena alimentaria. Estas enfermedades llevan
a un gran número de hospitalizaciones anuales y pueden llegar a ser fatales. Por tanto, el
control de Salmonella es necesario a lo largo de toda la cadena de producción de
alimentos y en todos los casos de enfermedad relacionados con el género. Los métodos
79
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
tradicionales de detección de Salmonella están basados en cultivos en medios selectivos y
posterior análisis mediante pruebas bioquímicas y serológicas. Con el objetivo de dar
mayor rapidez al proceso de detección, se han optimizado distintos protocolos de PCR. En
el año 2002, se publicó un nuevo protocolo de PCR múltiple que permite
simultáneamente la detección de Salmonella spp. y la identificación específica de
variedades responsables de casos esporádicos o brotes de enteritis.
Por otro lado, aunque ya erradicada en gran parte de Occidente, Yersinia pestis
sigue siendo un importante problema de salud en muchos países. Esto, unido a la alta
posibilidad de diseminación actual a través de viajeros a áreas contaminadas, lo convierte
en un asunto de interés para la Salud Pública Mundial. Por ello, una vez más, es necesario
disponer de métodos rápidos y precisos que posibiliten una intervención rápida durante
posibles brotes y/o diseminación. Con tal fin, Leal y Almeida desarrollaron en 1999 un
protocolo de PCR múltiple que permite la identificación simultánea de distintos
marcadores de cepas virulentas de Y. pestis. En concreto, el método consiste en la
detección de los genes de virulencia más característicos de la especie presentes en tres
plásmidos de virulencia y en una isla de patogenicidad cromosómica.
Por otro lado, las bacterias pertenecientes al género Klebsiella son la causa de un
importante porcentaje de infecciones hospitalarias, particularmente de los tractos
respiratorio y urinario. Recientemente, el género ha sido reanalizado con respecto a su
estructura filogenética y todos los estudios realizados mostraron su heterogeneidad
taxonómica Así, se ha sugerido que el género Klebsiella se divida en dos géneros,
Klebsiella y Raoultella, y que K. oxytoca quede considerado como un taxón monofilético.
Los datos de secuencias disponibles permiten distinguir entre estos grupos de bacterias,
pero es muy difícil diferenciar bioquímicamente los aislados del género Klebsie- lla,
particularmente K. oxytoca, de los del género Raoultella. Por estos motivos, Granier et al
publicaron en el año 2003 un nuevo protocolo de PCR que permite diferenciar Raoultella
sp. de K. oxytoca. Asimismo, van der Zee et al desarrollaron otra PCR múltiple de gran
utilidad para el seguimiento de los brotes de K. pneumoniae y K.oxytoca.
Un problema adicional a la hora de luchar contra infecciones causadas por
bacterias gramnegativas, entre ellas las enterobacterias, es la creciente diseminación de
cepas multirresistentes a antibióticos. En concreto, son muy limitadas las opciones
terapéuticas en el caso de infecciones causadas por bacterias que expresan
betalactamasas tipo AmpC codificadas en plásmidos, ya que estos microorganismos,
normalmente, son resistentes a la mayoría de los betalactámicos, y aunque habitualmente
son sensibles a cefalosporinas de cuarta generación (cefepima, cefpiroma, etc.) y a
carbapenems, ya se han descrito cepas que también son resistentes a ambos grupos. El
seguimiento y control de estas cepas se ve dificultado por el hecho de que se han descrito
varias familias de betalactamasas AmpC codificadas en plásmidos, las cuales no pueden
diferenciarse fenotípicamente y porque su fenotipo de resistencia puede ser similar al de
cepas productoras de betalacta- masas de espectro extendido con alteraciones en la
permeabilidad. Con el fin de ayudar a subsanar esta limitación, Pérez-Pérez y Hanson
desarrollaron una PCR múltiple que permite detectar e identificar las distintas familias de
genes ampC.
Pseudomonasspp.
Pseudomonas aeruginosa ha emergido como una de las bacterias gramnegativas
actualmente más problemáticas a nivel hospitalario, presentando altos grados de
80
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
morbilidad y mortalidad. Los pacientes quemados, aquellos que reciben ventilación
mecánica y los enfermos de fibrosis quística son particularmente susceptibles a la
infección por esta bacteria. El incremento progresivo de cepas multirresistentes a
antibióticos y la gravedad que pueden presentar las infecciones causadas por estas
bacterias, han hecho muy importante y necesario el desarrollo de métodos de diagnóstico
rápidos, sensibles y específicos. Como ejemplo se puede citar la PCR múltiple desarrollada
por de Vos et al que, gracias a la detección de genes que codifican lipoproteínas de la
membrana externa, permite simultáneamente identificar P. aeruginosa y detectar el grupo
de pseudomonas fluorescentes como P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. stutzeri,
etc.
Enterococos
El género Enterococcus es particularmente relevante desde el punto de vista clínico
debido al incremento en su incidencia como agentes responsables de infecciones,
principalmente en el ámbito hospitalario, como endocarditis, bacteriemia e infecciones del
tracto urinario. Además, la aparición de cepas resistentes a la mayoría de antibióticos
disponibles hace que las terapias actualmente emplea- das puedan resultar ineficaces.
Especialmente relevante es el incremento de aislados resistentes a glucopéptidos, de los
que se han descrito siete genotipos de resistencia. Dentro de este género hay un gran
número de especies, de las cuales Enterococcus faecalis y E. faecium represen- tan
aproximadamente el 90% de los aislamientos. La incidencia de otras especies, como E.
gallinarum y E. casseli- flavus podría estar infraestimada debido a errores en la
identificación. Por lo tanto, la identificación correcta a nivel de especie dentro de este
género bacteriano, así como la detección de los genes que confieren resistencias, es de
vital importancia en la práctica clínica para llevar a cabo el tratamiento más apropiado en
cada caso.
Se han desarrollado protocolos de PCR múltiple rápidos y fiables que permiten la
detección de los enterococos en pocas horas. En 1999, Ke et a diseñaron un protocolo
para la detección específica de todos los enterococos de importancia clínica a nivel de
género. Además, la PCR múltiple se ha empleado para discriminar entre diferentes tipos
de genes de resistencia a glucopéptidos en estas bacterias. Uno de estos métodos permite
la detección simultánea de los genes vanA, vanB y vanC1, además de la identificación a
nivel de especie de E. faecium, E. faecalis, E. gallinarum y E. casseliflavu. En el año 2002,
Pérez-Hernández et al desarrollaron un protocolo de PCR múltiple a partir de colonia que
permite la identificación de los enterococos a nivel de género y la detección de los genes
de resistencia a la vancomicina más frecuentes (vanA, vanB, vanC1 y vanC2/C3).
PCRmúltipleeneldiagnósticodeestafilococos
Aunque dentro del género Staphylococcus la especie S. aureus es la causante de
un mayor número de patologías, diversas especies de estafilococos coagulasa negativos
como S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, etc., se han asociado a un número
creciente de infecciones hospitalarias. S. saprophyticus es una causa muy frecuente de las
infecciones del tracto urinario en mujeres jóvenes sexualmente activas.
Cada vez es más frecuente la aparición de cepas de S .aureus resistentes a los
antibióticos, lo cual ha complicado enormemente el tratamiento de las infecciones
producidas por este agente.
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TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
De este modo, se han desarrollado varios protocolos de PCR múltiple que
permiten la detección rápida, específica y especialmente, simultánea, de muchos de estos
genes.
Recientemente, se ha publicado un ensayo que permite la detección simultánea de
genes de resistencia clínicamente relevantes en S. aureus. Especial atención merecen
aquellos protocolos que permiten la discriminación entre S. aureus y estafilococos
coagulasa negativos, simultáneamente a la detección del gen mecA, y, en ocasiones, de
otros genes de resistencia. Estos protocolos normal- mente parten del ADN extraído a
partir de colonias bacterianas o de cultivos líquidos puros. Sin embargo, actualmente el
objetivo es realizar la identificación directamente a partir de las muestras clínicas
Por otro lado, la reciente detección en Estados Unidos de dos aislados clínicos de
S. aureus portadores de genes de origen enterocócico y que confieren alta resistencia a
vancomicina, ha llevado a considerar de gran interés el desarrollo de una PCR múltiple
que permite simultáneamente la identificación S. aureus y la detección de los ge- nes
enterocócicos vanA y vanB y de los genes estafilocócicos.
La capacidad de muchas cepas de S. aureus de producir exotoxinas incrementa su
poder patogénico. Dentro de este grupo se incluyen las enterotoxinas (SE), causantes de
resistencia a meticilina y a mupirocina.
Campylobacter
Las infecciones causadas por distintas especies del género Campylobacter son la
causa de numerosas enfermedades con origen en la cadena alimentaria. Las especies
patógenas pertenecientes al género presentan requerimientos de crecimiento
“fastidiosos”, haciendo problemáticas la detección y la identificación de estas bacterias.
Como consecuencia, el desarrollo de métodos rápidos y fiables de detección ha tomado
gran importancia. Se están usando ya distintos métodos de detección genética de
especies de Campylobacter a partir de muestras clínicas, ambientales y de alimentos. A
finales del año 2002, se publicó un nuevo protocolo de PCR múltiple para la detección
simultánea de las cinco especies clínicamente más relevantes del género: C. jejuni, C. coli,
C. lari, C. Upsaliensis y C. fetus subsp. fetus. El método es rápido y tiene alta sensibilidad y
especificidad para la detección de las distintas especies, incluso a partir de cultivos mixtos,
por lo que puede ser una alternativa efectiva a los métodos bioquímicos tradicionales de
identificación de tales bacterias
Mycobacterium
El diagnóstico clínico de enfermedades causadas por especies pertenecientes al
género Mycobacterium pasa en primer lugar por la diferenciación del “complejo” de M
.tuberculosis (MTC) de micobacterias atípicas. Esa primera distinción sirve para confirmar
el diagnóstico inicial y el tratamiento que va a ser administrado. Pero, al mismo tiempo,
conlleva el problema de que los distintos miembros del MTC no pueden diferenciarse con
facilidad, lo cual dificulta la realización de estudios epidemiológicos detallados que sirvan
para prevenir brotes e identificar orígenes de infección. La identificación tradicional recae
en una batería de pruebas bioquímicas, las cuales son len- tas. Asimismo, existen pruebas
moleculares comerciales para el análisis de cultivos, pero, normalmente, son específicas
para una especie determinada y no son capaces de diferenciar entre miembros del MTC.
Por tanto, se ha percibido la necesidad de desarrollar nuevos métodos sensibles y eficaces.
Como complemento para el diagnóstico de Mycobacterium spp. se han planteado varios
82
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
protocolos diferentes de PCR múltiple. Con el primero de ellos, si bien no quedan
perfectamente diferenciados los distintos miembros del MTC, Kox et al consiguieron
optimizar la identificación de múltiples especies del género: M. tuberculosis, M. avium, M.
kansasii, M. chelonae, M. genavense, M. bovis BCG, M. xenopi y M. marinum. Por el
contrario, en el segundo, Yeboah-Manu et al optimizaron un método que permite
identificar un número menor de especies, pero que distingue el MTC de las micobacterias
no tuberculosas y diferencia los distintos miembros del MTC: M. tuberculosis, M. bovis, M.
bovis BCG y M. africanum subtipos I y II. Este protocolo queda a su vez complementado
con otro, recientemente desarrollado por Motiwala et al, que permite la detección de
dianas específicas de M. avium.
Infeccionesgenitourinarias
La uretritis se puede subclasificar en uretritis gonocócica y uretritis no gonocócica
dependiendo en la presencia o ausencia de Neisseria. El control de estas infecciones es
especialmente relevante en el caso de mujeres, en las que pueden llegar a causar
enfermedad pélvica inflamatoria, embarazos ectópicos e, incluso, infertilidad. En la uretritis
no gonocócica, la infección es atribuida a Chlamydia trachomatis, o a otros patógenos,
como micoplasmas o ureaplasmas. Como para el resto de enfermedades, la necesidad de
una correcta asignación del agente causal ha llevado al desarrollo de métodos sensibles y
específicos entre los que se encuentran varias PCR múltiples. En el año 2002, Gaydos et al
publicaron un protocolo que permite una efectiva detección e identificación de
N.gonorrhoeae y de C.trachomatis a partir de exudados vaginales. Un año más tarde, el
desarrollo de una nueva PCR múltiple permite la detección e identificación de cuatro
importantes agentes implicados en la uretritis no gonocócica como Mycoplasma
genitalium, M. hominis, Ureaplasma parvum y U. urealyticum.
Asimismo, la PCR múltiple también ha resultado una herramienta muy útil en la
identificación del agente etiológico en casos de úlceras genitales y de sífilis. En concreto,
es destacable el protocolo desarrollado por Orle et al que permite la detección específica
y sensible de Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum y herpes simple tipos 1 y 2.
Posteriormente, en el año 2001, este protocolo fue complementado por otro que permite
la detección inequívoca de subespecies patogénicas de T. pallidum aprovechando
características génicas únicas en su gen codificante de la ADN polimerasa I, lo cual
permite diferenciarlas de las no patogénicas o de cualquier otra especie.
6.1.7PCRmúltipleeneldiagnósticodelameningitisbacteriana
Los tres agentes causales de la mayor parte de casos de meningitis bacteriana son
Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae. A ellos hay
que sumar, además, otras bacterias tan diversas como Listeria monocytogenes,
Streptococcus agalactiae, Sta- phylococcus spp., enterobacterias, P. aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, Borrelia burgdorferi, Leptospira interrogans, algunas de las cuales
causar cuadros clínicamente no distinguibles de las meningitis asépticas y encefalitis
producidas por virus. Los métodos de diagnósticos tradicionales, dependientes en gran
medida de cultivo, para la identificación del agente causal de la meningitis suelen requerir
un período de tiempo igual o superior a 36 h. Además, se ha observado la existencia de un
cierto grado de discrepancia entre el número de casos clínica- mente sospechosos de
meningitis bacteriana y de septicemia y el número de casos confirmados por cultivo. Con
el objetivo de solucionar estos problemas, se ha trabajado mucho en la puesta a punto de
métodos moleculares no dependientes de cultivo y, durante los últimos años, se ha ob83
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
tenido resultados muy satisfactorios con el uso de distintos protocolos de PCR múltiple.
Dado que constituyen un am- plio número de métodos, y sería largo y poco clarificador
mencionarlos todos, a continuación se introducen simple- mente aquellos protocolos que,
en su conjunto, permiten descartar un mayor número de agentes causales. En el año
2001, Corless et al desarrollaron un protocolo de detección múltiple que permite la
identificación simultánea de N. meningitidis, H. influenzae y S. pneumoniae a partir de
distintos tipos de muestras clínicas, concretamente, líquido cefalorraquídeo (LCR),
plasma, suero y sangre. La aplicación de este protocolo a un amplio conjunto de muestras,
previamente catalogadas como negativas en virtud de la ausencia de crecimiento el
cultivo, permitió detectar alguna de esas tres bacterias. Si bien éste no es un protocolo de
PCR convencional sino de PCR en tiempo real, su gran aplicabilidad clínica para el
diagnóstico preciso de las afecciones que se discuten en este apartado nos hace creer
necesario el mencionarlo. Un año antes, en 2000, Chesky et al desarrollaron un método
que es destacable por la cantidad y diversidad de agentes infecciosos que permite
detectar simultáneamente. En concreto, a partir de muestras de LCR permitió identificar L.
monocytogenes, Mycobacterium spp., citomegalovirus, enterovirus, virus de Epstein-Barr,
virus del herpes simple, herpesvirus humano tipo 6, virus JC, virus de la varicela-zóster y
Toxoplasma gondii.
Neumonía
Entrados ya en el siglo XXI, las afecciones respiratorias continúan siendo un
problema de salud mundial tanto en niños como en adultos. El problema es tan relevante
que las enfermedades respiratorias han sustituido a las afecciones diarreicas como la
causa mayor de muerte en niños menores de 5 años en todo el mundo. Uno de los
patógenos más importantes implicados en esta situación es S.pneumoniae, pero no es
el único. Distintos agentes bacterianos pueden desencadenar neumonía, siendo los más
relevantes entre ellos Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma
pneumoniae, K. pneumoniae A todos ellos se unen, además, diversos grupos de virus que
pueden causar complicaciones respiratorias similares. Una vez más, la multiplicidad de
posibles agentes causales y la gran similitud de sintomatologías clínicas, han hecho
necesaria la búsqueda de nuevos métodos de diagnóstico que permitan la identificación
sensible, eficaz y lo más rápida posible del agente infeccioso. Con tal fin, se han
optimizado distintos protocolos de PCR múltiple.
En el año 2003, se han desarrollado dos nuevos protocolos para la determinación
de serogrupos y serotipos de S.pneumoniae que pueden tener gran utilidad en los
laboratorios de diagnóstico. A nivel mundial, S.pneumoniae es uno de los principales
agentes causales de mortalidad y morbilidad asociadas a neumonía en niños y ancianos.
La capacidad de los neumococos de producir enfermedad está directamente relacionada
con la producción de cápsula, recubrimiento polisacarídico que confiere resistencia a la
fagocitosis y facilita la evasión del sistema inmunitario. Se han identificado al menos 90
tipos capsulares inmunológicamente diferentes, pero la mayoría de los cuadros
infecciosos están producidos por un reducido número de serotipos. Los métodos
recientemente descritos por Brito et al y Lawrence et al permiten determinar mediante
PCR múltiple los serotipos y serogrupos más relevantes, de manera que, si bien no
sustituyen completamente los métodos serológicos, sí reducen drásticamente el número
de cepas que tienen que ser analizadas inmunológicamente para poder clasificarlas con
fines clinicoepidemiológicos. Las infecciones causadas por distintas especies del género
Streptococcus (p. ej., S. pneumoniae, S. pyogenes y Streptococcus del grupo viridans)
84
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
pueden ser muy complicadas de erradicar cuando son producidas por cepas
multirresistentes a antibióticos. Por tal motivo, en los últimos años también se han
optimizado distintos protocolos de PCR múltiple para la detección de distintos genes de
resistencia a macrólidos, codificando bien bombas de expulsión activa (genes mef), bien
metilasas que modifican la diana del antibiótico (genes erm)
Distintos estudios han mostrado la aplicabilidad de la PCR múltiple en la
identificación precisa del agente causal de la neumonía cuando se sospecha que se trate
de C. pneumoniae, C. psittaci o M. pneumoniae. Además, otra aportación derivada de
estos métodos ha sido la opti- mización de la detección de secuencias de interés a partir
de muestras clínicas como esputos, exudados faríngeos, aspirados nasofaríngeos y
traqueales, lavados broncoalveolares, aspirados transtorácicos, tejidos pulmonares fijados
y biopsias pulmonares.
Patógenosdeloídomedio
En pacientes con otitis media la identificación de los agentes causales a partir de
muestras clínicas empleando métodos tradicionales es difícil, laborioso y lento. Por ese
motivo, en la última década fueron optimizados distintos protocolos de PCR para la
detección individual de los agentes más habituales. La utilidad clínica de estos métodos
quedó reducida por la laboriosidad de aplicar una detección para cada posible bacteria.
Sin embargo, Hendolin et al desarrollaron una PCR múltiple que podría tener una mayor
utilidad en el diagnóstico rutinario, ya que permite detectar e identificar simultáneamente
a partir de muestras serosas los patógenos más frecuentemente aislados a par- tir de
muestras del oído medio: S. pneumoniae, H. influen- zae, Moraxella catarrhalis y
Alloiococcus otitidis.
Por tanto, al igual que antes de 1950, la humanidad se encuentra en una situación
en la que es prioritaria la optimización de la lucha contra las enfermedades infecciosas.
Como parte de este gran objetivo global, la microbiología clínica necesita
optimizar a nivel de especificidad, sensibilidad y rapidez, la detección de agentes
infecciosos y de sus genes de virulencia y de resistencia, lo cual permitirá ejecutar
programas adecuados de prevención y tratamiento de estas enfermedades. Para lograr
este propósito, la constante optimización de la PCR múltiple se plantea como una gran
alternativa que permitirá la detección simultánea de un número cada vez mayor de dianas,
a partir de un número también creciente de tipos de muestras clínicas y necesitando una
cantidad menor de ácido nucleico molde. Además, la reciente introducción de la PCR en
tiempo real en el diagnóstico clínico, permitirá el desarrollo de nuevos y eficientes
protocolos de PCR múltiple.
6.1.8Marcadodelosamplicones
Un aspecto interesante de la PCR es que la parte inicial de un amplicón es el
cebador, que ha sido expandido por acción de la polimerasa. Por tanto, si los cebadores se
marcan con una enzima, una sustancia luminiscente, biotina u otro marcador, los
amplicones portarán en su extremo ese marcador. Un ejemplo de su utilidad, entre
muchos otros, es el que se ha señalado anteriormente en la hibridación inversa o de
captura y para el revelado de las «PCR caseras».
85
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
6.1.9LimitacionesdelaPCR
Entre los problemas que plantea la técnica de la reacción en cadena de la
polimerasa, está la presencia de inhibidores en las muestras. Diversos productos orgánicos
que se hallan naturalmente en las muestras clínicas puedan inhibir la reacción. Entre ellos
cabe destacar la sangre (heme), los ácidos biliares, polisacáridos del esputo e incluso
sustancias como la heparina, el dodecil sulfato sódico el cloruro de guanidina, que se
utilizan en diferentes procesos de manipulación de los ácidos nucleicos; sin embargo,
muchos inhibidores no han sido identificados.
También hay que tener en cuenta que sólo se pueden amplificar fragmentos de
DNA de una determinada longitud más allá de la cual la polimerasa deja de actuar. El tipo
de polimerasa, entre otros parámetros condiciona la longitud del fragmento que puede
sintetizarse eficazmente.
Otro problema importante son las contaminantes, que pueden ser de dos tipos
diferentes: la contaminación puntual de una muestra negativa por otra positiva durante el
proceso inicial de extracción del DNA y la contaminación general del laboratorio con los
amplícones de una PCR previa.
Para evitar el primer tipo de contaminación, que sólo suele afectar a una muestra,
basta con manipular las muestras con cuidado en la fase inicial de extracción de los ácidos
nucleicos.
Para evitar el segundo tipo de contaminación, la PCR debe realizarse en dos áreas
diferentes del laboratorio que estén alejadas entre sí. En la primera, el área de pre-PCR, se
efectúa la extracción de los ácidos nucleicos de las muestras y se prepara la master mix, y
en la otra, la de post-PCR, se realiza la amplificación en el termociclador y se leen los
resultados.
Existen otros métodos complementarios para evitar las contaminaciones, entre los
que destaca la utilización de la uracil-N-glicosidasa, que no excluye la recomendación de
utilizar dos áreas diferenciadas (pre y post-PCR) para desarrollar la reacción. El método
consiste en emplear una mezcla de nucleótidos (T, C, G, A) en la que el desoxitimidintrifosfato (dTTP) se substituye por el desoxiuridin-trifosfato (dUTP), conservándose los
otros nucleótidos, dCTP, dGTP y dATP, añadiéndose una cantidad adecuada de la enzima
uracil-N-glicosidasa antes de la reacción. Durante la amplificación se irán agregando los
nucleótidos adecuados; sin embargo, en lugar del dTTP, se insertará el dUTP, que no se
halla en ningún DNA de forma natural. Si de manera fortuita este DNA amplificado llegara
a la zona de pre-PCR y contaminara algún tubo o reactivo de una nueva prueba en el que
se ha añadido la uracil-N-glicosidasa, este enzima reconocería las cadenas del DNA
contaminante con uracilo de la amplificación previa, pero no el DNA natural con timina
que va a amplificarse, de forma que a 50° C la enzima cataliza la escisión del uracilo,
degradando el DNA contaminante sintetizado con dUTP impidiendo que actúe como
molde para una nueva amplificación. A continuación, la enzima se inactiva con la
temperatura de desnaturalización a 95° C del primer ciclo, de forma que no puede actuar
sobre las nuevas cadenas amplificadas. Con este método se han podido inactivar hasta
106 moléculas de DNA.
También se pueden inactivar los amplicones mediante radiaciones ultravioletas o
por acción fotoquímica con isopsoralen.
86
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
6.1.10PCRcuantitativa
En ocasiones no sólo interesa la detección específica del DNA o el RNA amplificado
de forma cualitativa, sino también cuantificar el número de copias que existía inicialmente
en la muestra clínica. Para la cuantificación suele utilizarse una técnica competitiva que
consiste en incorporar a la reacción un DNA o RNA competidor, según el tipo de ácido
nucleico diana a amplificar, que tenga la misma longitud y utilice los mismos cebadores
que el DNA o RNA diana (problema). La cantidad del competidor incorporada debe ser
conocida, de modo que puedan determinarse al final de la amplificación las cantidades
respectivas de amplicones producidos por el competidor y el problema. Dada la igualdad
de condiciones de reactivos y del proceso de amplificación, así como la relación lineal
entre los cocientes competidor/problema iniciales y finales, puede determinarse la
cantidad inicial de ácido nucleico problema en la muestra. En las infecciones por
citomegalovirus, en el sida o la hepatitis C, la determinación del numero de viriones
existente (número de copias del genoma) permite efectuar un seguimiento secuencial de
la concentración plasmática de virus, lo que ayuda a establecer un pronóstico sobre la
enfermedad, determinar la eficacia de la terapéutica o sospechar la aparición de
resistencias a los antivíricos a lo largo del tratamiento, según incremente o disminuya el
número de copias en los sucesivos controles.
6.1.11PCRatiemporeal
Esta clase de PCR permite la ejecución de la técnica en un tiempo muy reducido,
alrededor de 30 minutos, y la cuantificación precisa y continua del DNA que se va
formando, ya que, tal como indica su nombre, al mismo tiempo que va teniendo lugar la
PCR, se va detectando una señal que aumenta en proporción directa a la cantidad de
producto formado en cada ciclo de la reacción.
El sistema utiliza los mismos ingredientes que una PCR convencional; sin embargo,
a diferencia de aquélla, la muestra no se coloca en un tubo convencional, sino en un tubo
o un capilar, que permiten cambiar de temperatura en un tiempo muy inferior al de los
instrumentos convencionales. El fragmento amplificado suele ser más corto que en la
técnica convencional. Todo ello acelera la reacción. El termociclador y el lector han de ser
específicos para esta prueba.
Existen diversos métodos para la detección en cada ciclo de los amplicones
formados. Uno de ellos se basa en la utilización de colorantes intercalados, como el SYBR
Green I, que es una molécula fluorescente que se une al DNA bicatenario (no al
monocatenario, al igual que el bromuro de etidio). Este colorante no emite fluorescencia
cuando se encuentra en solución, pero sí cuando se une al DNA de doble cadena,
evaluándose en cada ciclo, al final de la elongación, la intensidad de la fluorescencia, que
será mayor cuanto más producto de amplificación se haya formado .
Otro método de marcado son las sondas fluorescentes tipo «molecular beacons»,
TaqMan y otras basadas en la tecnología FRET (fluorescente resonance energy transfer
system). Esta tecnología se basa en la interacción entre sustancias fluorescentes,
estimulando una la producción de luz por la otra o bloqueando la emisión lumínica de la
otra.
En las sondas denominadas «molecular beacons», su extremo 5' está unido a un
compuesto fluorescente (marcador, repórter), y el 3' a una molécula denominada extintora
(quencher).
87
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Cuando la sonda está libre, la molécula hibrida con ella misma formando una
estructura de plegamiento en horquilla que acerca el extremo 5' al 3', por lo que la
molécula extintora bloquea la fluorescencia del marcador situado en 5'. En el momento
del ciclo de PCR en que se produce la hibridación de los cebadores a sus secuencias
complementarias, la sonda también hibrida en una región central de DNA adoptando una
forma alargada que aleja su extremo 5'del 3'. Entonces la fluorescencia no es bloqueada
por la molécula extintora y es captada por la unidad óptica del aparato con un filtro de
longitud de onda adecuada. La fluorescencia se irá incrementado con el número de ciclos
y será proporcional al número de copias específicas que se vayan formando.
Otro tipo de sondas son las TaqMan, que consisten en un oligonucleótido similar a
las «molecular beacon», aunque su forma natural es lineal, sin plegamiento, pero, al ser
más corta, la molécula extintora actúa continuamente sobre el marcador bloqueando la
fluorescencia. Durante el desarrollo de la PCR en el estadio de unión de los cebadores,
esta sonda se unirá a las cadenas de DNA sin emitir fluorescencia. Durante el período de
elongación, la Taq polimerasa, al alcanzar la sonda, elimina los nucleótidos uno a uno
(acción exonucleasa) para incorporar los nuevos, por lo que el nucleótido marcado queda
libre en solución. Entonces el marcador libre de la acción del extintor emite la señal que es
captada por la unidad óptica del aparato de forma similar a las sondas «molecular
beacons».
Otra variación del sistema FRET se basa en el empleo de dos sondas para detectar
los amplicones. Una de ellas está marcada en su extremo 3' con fluoróforo, y la otra en 5'
por un marcador fluorescente, excitable por el fluoróforo. Ambas sondas son
complementarias al DNA molde e hibridan con éste muy cerca una de otra, separadas
como máximo por 5 bases. Al hallarse tan próximas entre sí, el fluoróforo excitado por luz
azul excita a su vez al marcador de la segunda sonda, que emite a una longitud de onda
más larga, captada por el filtro adecuado.
El SYBR Green FRET es un sistema sencillo. Este producto (SYBR Green) se intercala
en el fragmento bicatenario formado por el DNA y la sonda, la cual lleva un marcador
fluorescente que se excita por el SYBR Green, que se activa al unirse a la doble cadena
DNA/sonda. Las moléculas que se unen a la pareja sonda-diana, al estar próximas al
marcador, lo excitan.
Al igual que en los otros diseños de la técnica, la intensidad de la fluorescencia es
directamente proporcional a la amplificación producida. La computadora del instrumento
registra en un gráfico la dinámica de la reacción en relación al número de ciclos, y un
programa informático traduce la cinética de la emisión de fluorescencia en copias de
DNA/ml tras compararla con patrones estándar.
En resumen, las características de la PCR en tiempo real son: la rapidez, la precisión
de la cuantificación al monitorizar continuamente todo el proceso y, por tanto, la zona
exponencial y la ausencia de contaminaciones, porque no ha de abrirse el capilar o tubo
con los amplicones en ningún momento.
La competencia comercial limitada por las patentes y el objetivo de amplificar el
genoma de algunos virus RNA de gran interés, como el VIH o el de la hepatitis C, han
promovido una intensa investigación para el desarrollo de métodos de amplificación de
ácidos nucleicos alternativos a la PCR, entre los que destacan los de amplificación basada
en la transcripción (TAM, NASBA y otras) o en el desplazamiento de la cadena (SDA).
88
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
6.1.12Amplificaciónbasadaenlatrascripción
Ha sido una de las técnicas alternativas a la PCR para amplificar la diana,
generalmente RNA. Existen diferentes variedades de esta técnica, como NASBA, TMA y
3SR. La técnica utiliza varias enzimas y se basa en la síntesis de cDNA mediante una
transcriptasa inversa (TI) copiando el RNA diana, al que previamente se ha unido un
cebador, dando lugar a un híbrido RNA-cDNA. El RNA es degradado por una RNAasa
quedando una única cadena de cDNA, a la que se une un segundo cebador y sobre la que
la TI copia su complementaria de DNA, formándose una doble cadena de DNA que es
apta para que el tercer enzima, que es la T7 RNA-polimerasa (obtenida del bacteriófago
T7), reconociendo una señal iniciadora de los cebadores transcriba numerosísimas copias
de RNA, que podrán reiniciar el ciclo. La reacción comporta dos cebadores que marcan el
inicio de la acción de la TI y uno de ellos, además de laT7 RNA-polimerasa. Esta reacción
se desarrolla a T entre 37 y 42 º de modo isotérmico, por lo que no requiere
termocicladores.
A continuación, la detección del material amplificado se puede efectuar de muy
distintas maneras mediante un sistema de protección de la hibridación(HPA) o sondas
específicas marcadas con diferentes sustancias.También se están utilizando las sondas
empleadas en la PCR a tiempo real, especialmente los “molecular beacons”, con el fin
de realizar una amplificación isotérmica con lectura en tiempo real
6.1.12.1AmplificacióndelaseñalbDNA
Los métodos de amplificación de señal se basan en el hecho de captar varias
sondas marcadas; como el sistema de sondas compuestas o el que utiliza sondas
ramificadas. Este último (branched DNA; bDNA) ha sido comercializado, y probablemente
es el más utilizado dentro de esta categoría.
Otras técnicas de amplificación de la diana
La técnica se basa en fijar sobre un soporte unas sondas de captura del DNA diana.
Cuando éste ha sido capturado (si está presente), a él se unen otras sondas, y a estas,
otras que están ramificadas, uniéndose finalmente a cada una de las ramas una pequeña
sonda marcada con una enzima como la fosfatasa alcalina, que activará la
quimioluminiscencia de un sustrato añadido, como el dioxietano (soporte = sonda = DNA
diana = sonda = sonda ramificada = sondas con el marcador > sustrato —* señal). En
estas condiciones pueden llegar a fijarse hasta 3.000 sondas marcadas por diana. Este
89
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
sistema, que se basa en el empleo de una larga serie de sondas, incrementa la
especificidad de la prueba, ya que exige la hibridación específica de todas ellas
6.1.12.2Técnicascomercializadas
Las técnicas de amplificación comercializadas se aplican en el contexto de las
infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana, tanto para su diagnóstico como
para estudios cuantitativos con fines pronósticos y de control de tratamiento.
También son muy utilizadas en el diagnóstico de las hepatitis B y C, infección por
citomegalovirus y virus de Epstein-Barr, tanto para la detección del virus como para
estudios cuantitativos.
Otros virus detectados por métodos comercializados son el herpes simple, varicela,
enterovirus o HTLVI y II, para alguno de los cuales existen métodos que permiten su
cuantificación.
Entre las bacterias se hallan sistemas comercializados para el diagnóstico de las
infecciones por Mycobacterium tuberculosis, Neissería gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis.
El paso progresivo de los métodos tradicionales de amplificación a los de tiempo
real se acompaña de la oferta de
equipos
y
reactivos
para
la
amplificación y cuantificación del
genoma de nuevos microorganismos,
como citomegalovirus, virus de
Epstein-Barr y otros.
Es previsible la inmediata
oferta de reactivos para PCR en
tiempo real, para la detección de muy
diversos microorganismos, genes de
virulencia y de resistencia.
En la tabla se muestran algunas
pruebas de amplificación comercializadas
90
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
6.2AnálisisdelADNmedianteamplificaciónconPCR
En los últimos años las técnicas basadas en reacciones de amplificación de ADN,
especialmente la de PCR, han sido ampliamente utilizadas para la tipificación bacteriana.
En general existen tres grupos de variantes de la PCR: 1) Aquellas en las que utilizando
cebadores arbitrarios o con cierta especificidad, se amplifican regiones del genoma
localizadas entre dos cebadores adyacentes separados por una distancia no superior a la
que la Taq polimerasa puede amplificar. Estas variantes suelen dar patrones de
amplificación constituidos por un número variable de bandas de ADN, 2) Variantes en las
que previa o posterior a la amplificación génica se somete el genoma o producto
amplificado a digestión con enzimas de restricción, y 3) Aquellas que amplifican regiones
internas de ciertos genes y posterior secuenciación (Tabla 4).
A. PCR sin digestión posterior con enzimas de restricción (ER) (Amplificación múltiple)
-Amplificación múltiple arbitraria:
B.
-PCR mediante cebadores arbitrarios (AP-PCR, RA.)
C.
-Amplificación múltiple definida:
D.
-PCR utilizando como cebadores secuencias repetidas encontradas a lo largo del
genoma (REP-PCR; ERIC-PCR, tRNA-PCR; BOX-PCR, IS.......).
E.
B. PCR con digestión posterior con ER y comparación de los fragmentos de
restricción generados (PCR-RFLP).
F.
- PCR con digestión posterior con ER.
G.
- PCR-RFLP de genes específicos.
H.
- PCR con digestión con ER previa a la amplificación.
I.
- Amplificación secuencias de ADN que flanquean lugares de restricción infrecuentes
(IRS).
J.
K.
- Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción amplificados (AFLP).
C. PCR y posterior secuenciación
- Amplificación y secuenciación de varios loci genéticos (Multilocus sequence typing).
Tabla 4. Variantes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizadas en
epidemiología para la tipificación bacteriana.
En los genomas de todos los organismos se encuentran secuencias de ADN
repetidas que pueden ser utilizadas para el diseño de cebadores que amplifiquen la región
entre secuencias repetitivas consecutivas. En las células procariotas, las secuencias de ADN
repetidas son cortas (<200 pb), no son codificantes, son intragénicas y ampliamente
distribuidas a lo largo del genoma. Una de las primeras secuencias de este tipo descritas y
estudiadas fue REP (repetitive extragenic palindrome) o PU (palindromic unit), descritas
inicialmente en Salmonella y E. coli. Otras secuencias repetidas identificadas en
enterobacterias, son las secuencias denominadas ERIC (enterobacterial repetitive
intragenic consensus), también conocidas como IRU (intergenic repit units).
También se ha utilizado para estudios epidemiológicos la amplificación de
secuencias arbitrarias, en las que los cebadores no están dirigidos a ninguna región
específica. La técnica RAPD (Random amplified polymorphic DNA) se basa en la utilización
92
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
de cebadores de 9 a 10 bases de longitud, que hibridan con suficiente afinidad con ciertas
regiones del cromosoma bacteriano a bajas temperaturas, permitiendo amplificar las
regiones que se encuentran localizadas entre dos cebadores consecutivos. Si dos
cebadores hibridan a una distancia óptima uno de otro y en la dirección apropiada, se
obtendrá un producto de PCR con un tamaño correspondiente a la distancia entre los dos
cebadores. El número y localización de las regiones reconocidas por los cebadores varía
para las cepas de una misma especie bacteriana. Como los cebadores no están dirigidos
frente a un locus genético determinado, pueden tener lugar hibridaciones inespecíficas
entre los cebadores y el genoma motivo de estudio, por lo que la amplificación es
extremadamente sensible a ligeros cambios en la temperatura de hibridación lo que
puede conducir a variabilidad en el patrón de bandas. Según la concentración, longitud de
los cebadores, así como las condiciones de electroforesis, se han descrito tres variantes: i)
DAF (DNA amplification fingerprinting); ii) AP-PCR (arbitrary primed PCR); iii) RAPD
(random amplified polymorphic DNA). Aunque estas tres variantes son fáciles de realizar y
no es necesario conocer el genoma de la bacteria, la reproducibilidad es normalmente
baja.
En el segundo grupo de técnicas (amplificación y posterior digestión con enzimas
de restricción) se encuentran aquellas que analizan el polimorfismo de los fragmentos
generados. Por lo general posee un bajo poder de discriminación para utilizarse como
marcador epidemiológico. Sin embargo, en algunos casos se utilizan para definir especies
dentro de un género determinado, por ejemplo para la identificación de las diversas
especies del género Acinetobacter. También dentro de este grupo se encuentra la PCR
con digestión con enzimas de restricción de baja (IRS) o alta (AFLP) frecuencia de corte
previa a la amplificación. Finalmente, el tercer grupo incluye la amplificación y posterior
secuenciación de genes que codifican enzimas involucradas en el metabolismo bacteriano.
Las técnicas de PCR con digestión con enzimas de restricción previa a la amplificación
(AFLP y IRS), así como la PCR y posterior secuenciación (Multilocus Sequence Typing –
MLST) se desarrollarán en los apartados correspondientes.
6.3Tratamientopreviodelosmicroorganismos
Se recomienda que la cepa de estudio proceda de un cultivo reciente. Para la
obtención del ADN cromosómico podemos partir de un cultivo bacteriano líquido o
sólido. Existe un procedimiento muy sencillo que consiste en resuspender una colonia de
la cepa a estudiar en un volumen (25 µl) de agua destilada estéril y someter dicha
suspensión a calentamiento en baño maría a 100ºC durante 10 minutos. Como alternativa
puede utilizarse el propio termociclador. En este caso, la suspensión se realiza en tubo de
PCR y se somete 10 minutos a 95ºC. Transcurrido el tiempo necesario para la lisis de la
bacteria se centrifuga brevemente la suspensión (1 minuto a máxima velocidad en una
centrifuga para tubos eppendorf). El principal inconveniente de la utilización de esta
metodología de extracción del ADN es que puede generar variabilidad en la intensidad de
las bandas que constituyen los patrones de ADN entre cepas pues no ha habido
cuantificación previa del ADN.
Un sistema más preciso es la extracción del ADN mediante alguno de los equipos
comercializados o mediante un método no comercial, seguido de la cuantificación
posterior de este mediante determinación espectrofotométrica a 260 nm.
93
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
6.4Fundamentosyvariantestécnicas
Solo se mencionará el fundamento de la REP-PCR, incluida posteriormente en el
documento técnico. Sin embargo la sistemática de las metodologías de amplificación
múltiple es muy similar y consiste en: 1. Crecimiento en medio líquido o sólido de las
células que deben ser analizadas; 2. Lisis celular y extracción del ADN; 3. Amplificación
génica utilizando los cebadores y condiciones específicas para cada reacción; y 4.
Separación de los productos de PCR y visualización mediante tinción con bromuro de
etidio. Las diferencias entre las variantes anteriormente citadas las encontramos en la
secuencia de los cebadores utilizados y en las condiciones de amplificación.
La REP-PCR utiliza cebadores cuya secuencia se ha diseñado en función de las
secuencias cromosómicas repetidas. Estas secuencias están presentes en diferentes
localizaciones a lo largo del cromosoma bacteriano. Cuando dos secuencias están situadas
lo suficientemente cerca, el fragmento de ADN que hay entre ambas es amplificado. Dado
que el número y localización de estas secuencias repetidas entre cepas es variable, el
número y tamaño de los fragmentos de ADN generados también
6.5Criteriosparalainterpretacióndelosresultados
En principio los patrones que se obtienen están constituidos por un número de
bandas de ADN que permiten una interpretación y comparación fácil entre cepas (figura
8). Sin embargo, puede ocurrir que se observen bandas de ADN de menor intensidad y
dado que estas bandas no son muy reproducibles, incluso en experimentos repetidos en
el mismo laboratorio, muchos autores no las consideran. Su presencia es probablemente
el resultado de la baja temperatura de hibridación utilizada.
6.6Indicaciones
La REP-PCR ha sido extensamente utilizada para la tipificación bacteriana, sobre
todo en casos en los que se necesita disponer de resultados con cierta rapidez. Esta
técnica es más sencilla y rápida que otras que probablemente poseen un mayor poder de
discriminación. Por ello, suele utilizarse como primer paso ante la sospecha de un brote
epidémico. Sin embargo, se aconseja realizar de manera complementaria otra técnica con
un poder de discriminación superior.
6.7Inconvenientesdelatécnica
El principal inconveniente de esta técnica es la falta de reproducibilidad que puede
presentar. Puede ser debida a la presencia de bandas de ADN de baja densidad
ocasionada por diferencias en la relación
de la concentración del ADN molde y del
cebador. Algunos estudios demuestran
que
la
reproducibilidad
puede
incrementarse utilizando concentraciones
definidas de ADN purificado en lugar de
una suspensión bacteriana hervida.
Figura 8. Patrones obtenidos mediante REP-PCR en
cepas de Acinetobacter baumannii.
Línea M, Marcadores moleculares de ADN.
94
UNIDADDIDÁCTICAVII
ANÁLISISDELADNMEDIANTEPROCEDIMIENTOS
DERESTRICCIÓNEHIBRIDACIÓN
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
7.1Aspectosdelanálisis
Con el fin de evitar la contaminación de su genoma por ADN exógeno, las
bacterias han desarrollado un sistema de protección basado en los enzimas de restricción,
que reconocen una secuencia específica de nucleótidos de unos 4 a 8 pares de bases (pb)
dando lugar a un corte en la molécula de ADN a este nivel. A la secuencia específica
reconocida por cada enzima se le conoce como lugar de restricción. Este sistema de
protección se complementa con una metilación del ADN propio de la bacteria a nivel del
lugar de restricción para evitar que sea digerido por su propio enzima de restricción.
Cuando se digiere una molécula de ADN con un enzima de restricción se obtienen
un número de fragmentos equivalentes a las veces que se encuentra repetido el lugar de
restricción a lo largo de la molécula. Esta frecuencia depende del número de pb del lugar
de restricción así como de la proporción relativa de los nucleótidos ATGC del lugar de
restricción en relación con la del ADN digerido. Así, la probabilidad de encontrar un lugar
de restricción de 6 pb en una molécula de ADN es de una vez por cada 4096 pb, mientras
que un lugar de restricción de 4 pb se da cada 256 pb. Por otra parte, el lugar de
restricción del enzima SmaI, CCCGGG, se encuentra menos representado de lo previsible
en el cromosoma de los estafilococos dada la pobreza en GC de su genoma (%GC 38).
El tamaño de los distintos fragmentos de restricción traduce la separación entre
dos lugares de restricción contiguos. Un cambio por mutación o recombinación, en uno
de estos lugares de restricción lo hace irreconocible para el enzima y se traduce en una
variación del perfil de fragmentos de restricción que es el responsable del polimorfismo
existente entre las distintas cepas.
Este perfil también variará si existen delecciones o inserciones de ADN entre dos
lugares de restricción.
La comparación de cepas para detectar el polimorfismo del tamaño de los
fragmentos de restricción (RFLP) se consigue separando los fragmentos obtenidos
mediante una electroforesis en un gel de agarosa que se tiñe con bromuro de etidio. Cada
banda corresponde a la suma de todos los fragmentos generados del tamaño
correspondiente a aquella movilidad electroforética.
Podemos dividir a los enzimas de restricción para una especie concreta, en
aquellos que darán lugar a un gran número de fragmentos (cientos) de pequeño tamaño y
aquellos cuyo lugar de restricción estará poco representado en el genoma y darán pocos
fragmentos (10 a 30) de gran tamaño. Los fragmentos de pequeño tamaño obtenidos con
los enzimas de alta frecuencia de corte pueden separarse por electroforesis convencional
mientras que los fragmentos de gran tamaño (>40 kb) co-emigran en una única banda en
la electroforesis convencional y se deben separar con técnicas electroforéticas especiales
como la electroforesis con alternancia de campos eléctricos o electroforesis de campo
pulsante.
Cuando se separan por electroforesis en un gel los fragmentos de restricción del
ADN total obtenidos con un enzima con alta frecuencia de corte, se obtiene un número
tan elevado de fragmentos que es muy difícil, si no imposible, resolver las bandas
existentes. Ello dificulta enormemente la comparación de los perfiles de las distintas cepas
invalidando, en cierta forma, la utilidad de esta técnica. Una alternativa para simplificar la
interpretación de los RFLP del ADN total, consiste en centrarse en una zona concreta del
genoma en lugar de estudiar todo el cromosoma. Para ello, se realiza una transferencia de
97
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
los fragmentos de restricción del ADN total obtenidos a una membrana (Southern-blot)
que se analiza mediante hibridación con una sonda marcada complementaria del
fragmento cuyo polimorfismo se quiere estudiar. El revelado de la hibridación tan solo
pondrá en evidencia aquellos fragmentos que contengan la totalidad o parte de la
secuencia escogida, obteniéndose perfiles con pocas bandas. El número de bandas estará
en relación con el número de copias de la secuencia existentes en el genoma mientras que
su polimorfismo estará en relación con su distribución a lo largo del genoma, así como
con las variaciones en los lugares de restricción dentro de esta secuencia y en las regiones
más próximas. Tanto la transferencia de Southern como la hibridación complican
notablemente los aspectos técnicos del análisis.
98
UNIDADDIDÁCTICAVIII
ANÁLISISDELADNCROMOSÓMICO
MEDIANTEMACRORRESTRICCIÓN:
ELECTROFORESISENCAMPOPULSANTE(PFGE)
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
8.1Introducción
Como se ha expuesto en el apartado 5 (procedimientos de restricción e hibridación
de ADN) para una especie bacteriana concreta, podemos encontrar enzimas de restricción
de baja frecuencia de corte, es decir, enzimas cuyo lugar de restricción, por su longitud y
secuencia, se encuentran raramente a lo largo del ADN cromosómico de la especie
bacteriana en cuestión. El uso de este tipo de enzimas permite la macrorrestricción del
ADN de la bacteria y la división del ADN en pocos fragmentos (entre 10 y 30). Muchos de
estos fragmentos son de gran tamaño, más de 40 kb, y no pueden separarse por técnicas
de electroforesis convencional, en las que se aplica un campo eléctrico constante ó
estático, sino que requieren técnicas en las que la orientación del campo eléctrico es
variable periódicamente, son las denominadas técnicas de electroforesis en campo
pulsante o pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).
La combinación de estas dos técnicas, macrorrestricción del ADN y separación de
los fragmentos por PFGE, se ha aplicado con mucha frecuencia en estudios
epidemiológicos en bacteriología. Se obtienen así, patrones de restricción sencillos que
representan el ADN cromosómico bacteriano distribuido en unas pocas bandas con
movilidades electroforéticas distintas. Sin embargo, las características de estas técnicas
determinan una serie de cambios a tener en cuenta en las distintas fases en las que se
divide el proceso de macrorrestricción y PFGE: 1) el procedimiento de extracción de ADN,
obliga a inmovilizar las células bacterianas en bloques de agarosa, en los que se llevará a
cabo la lisis, de manera que el ADN cromosómico también quede embebido en agarosa,
el objetivo es que el ADN permanezca íntegro y no se fracture accidentalmente (al
pipetear, agitar ...) lo cual desvirtuaría los patrones de restricción y afectaría a la
reproducibilidad de la técnica, 2) la restricción del ADN debe hacerse tal y como éste está
preparado, es decir, inmovilizado en los bloques de agarosa, utilizando enzimas de baja
frecuencia de corte, y 3) la técnica de electroforesis utilizada para la separación de
fragmentos debe ser una PFGE, con las características diferenciales propias de ésta.
8.2Tratamientopreviodelosmicroorganismos
Como se ha apuntado previamente, para poder obtener patrones de restricción
reproducibles por PFGE que permitan la comparación de los genotipos de una serie de
microorganismos, el objetivo es aislar el ADN cromosómico íntegro, sin fracturas y, a la
vez, en las mejores condiciones de pureza para que los enzimas de restricción puedan
cortar correctamente, evitando restricciones incompletas. Para ello deben observarse una
serie de precauciones con relación al procesamiento y tratamiento previo de los
microorganismos:
8.2.1Crecimientobacteriano.
Los microorganismos se pueden obtener a partir de un cultivo en medio líquido o
bien realizar una suspensión procedente de un medio sólido. En cualquier caso se debe
tratar de cultivos puros, en medios no selectivos, de no más de 18-24 horas de incubación.
Es conveniente estandarizar el inóculo mediante espectrofotometría (ver documento
técnico correspondiente), ésta será una medida indirecta de la concentración de ADN que
se obtendrá durante el procedimiento. Seguidamente, se mezcla parte del inóculo con el
mismo volumen de agarosa de bajo punto de fusión fundida, y se deja solidificar en un
molde especialmente diseñado para ello. De esta manera conseguimos inmovilizar un
101
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
número de células bacterianas equivalente para cada cepa que incluimos en el estudio. A
partir de este momento, el resto del procesamiento se realizará utilizando el bloque
completo. La agarosa en la que se encuentran embebidas las células permite fluir a su
través las soluciones de lisis o restricción en las que vamos a sumergir el bloque, y a la vez
va a proteger las moléculas de ADN de la rotura mecánica y de la degradación
nucleolítica.
8.2.2Lisis.
Para conseguir la lisis de los microorganismos, los bloques se sumergen en una
solución de lisis que contenga los enzimas precisos para romper las células. La
composición de la solución de lisis es variable en función de la especie bacteriana con la
que estemos trabajando (ver documento técnico correspondiente). Como los enzimas
deben actuar en el interior de la malla de agarosa en que están embebidas las células, se
precisan enzimas más concentrados e incubaciones prolongadas.
8.2.3Lavados.
Una vez que las células están lisadas es preciso someter a los bloques a sucesivos
lavados con una solución TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ). Los lavados consisten en
introducir los bloques en TE y agitarlos durante, al menos, 30 minutos, esta operación se
repite cuatro o cinco veces. El objetivo de los lavados es arrastrar fuera del bloque de
agarosa restos celulares procedentes de la lisis, así como eliminar componentes que
puedan inhibir la restricción posterior (proteinasa K, detergente o EDTA). Algunos
protocolos publicados para el procesamiento rápido de ciertas bacterias por PFGE,
prescinden de los lavados y para ello se eliminan ciertos compuestos del procesamiento
previo, como el tratamiento con proteinasa K.
8.2.4Restricción.
La actividad de los enzimas de restricción viene definida sobre ADN en ausencia de
agarosa. En general, la presencia de agarosa conlleva cierto grado de inhibición de la
reacción de digestión, por tanto es preciso aumentar el número de unidades de enzima
por reacción. El tiempo de incubación de la reacción de restricción también debe
incrementarse, teniendo en cuenta, no obstante, que algunos enzimas pierden su
actividad tras las primeras horas de incubación. En este caso, se debería añadir a la
reacción una segunda alícuota del enzima. En relación a la selección del enzima de
restricción más adecuado, en estos momentos se pueden encontrar en la bibliografía
científica especializada publicaciones sobre prácticamente cualquier especie bacteriana
estudiada por PFGE (en el anexo 3 del documento técnico correspondiente, se incluye una
tabla con los microorganismos y enzimas más frecuentes para su estudio). A la hora de
seleccionar un enzima de restricción para PFGE que genere pocos fragmentos de ADN y
estos sean de gran tamaño, debe tenerse en cuenta que ello depende de la longitud y de
la secuencia del lugar de restricción del enzima. En general, los enzimas con un lugar de
restricción rico en G+C, son adecuados para tratar el ADN bacteriano de especies con
genoma rico en A+T y, a la inversa, enzimas que reconocen secuencias A+T, son
adecuados para digerir ADN rico en G+C. Sin embargo, en la práctica, es difícil predecir la
utilidad de un enzima para estudiar por PFGE una determinada especie bacteriana. Por
último, destacar que el estudio por PFGE de un grupo de cepas con un enzima de
102
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
restricción primero, y con un segundo enzima distinto después, puede mejorar la
capacidad de discriminación de la técnica.
8.3Fundamentosyvariantestécnicas
Durante los años 70, se observó que bajo la acción de un campo eléctrico, las
moléculas de ADN se reorientaban y se desplegaban avanzando en dirección al polo
positivo. Cuando el campo eléctrico cesaba, las moléculas de ADN se relajaban
recuperando su estado inicial. La aplicación de un segundo campo eléctrico, con una
orientación distinta del primero, obligaba al ADN a cambiar su conformación y
reorientarse de nuevo para poder avanzar en la dirección del segundo campo eléctrico. El
tiempo requerido para esta reorientación era dependiente de la longitud de la molécula,
esto es de su peso molecular. Tras el cambio de orientación del campo eléctrico, las
moléculas grandes tardan más tiempo en alinearse y poder comenzar el avance a través
del gel de lo que tardan las moléculas de ADN más pequeñas. Mientras los campos
eléctricos que se alternen tengan la misma intensidad y voltaje, la migración final del ADN
se recogerá en forma de línea recta, aunque el patrón final de separación de los
fragmentos revelará la suma de todos los avances cortos en "zig-zag" que el ADN ha
realizado. Este principio fue el que llevó a Schwartz y Cantor en 1984 a la descripción de
las técnicas de PFGE y su utilidad en la separación de moléculas grandes de ADN, del
orden de varios cientos de kb.
Desde la descripción original del sistema, se diseñaron distintos aparatos con
diferencias en la geometría de los electrodos o en la trayectoria migratoria del ADN.
Todos los sistemas eran capaces de separar un amplio rango de moléculas de ADN de
diferentes tamaños (entre 1 y 7000 kb), aunque diferían en la velocidad de separación y en
la resolución obtenida en un rango de peso molecular dado. De todos los sistemas
desarrollados, el más extendido ha sido el CHEF (clamped homogeneous electric field
electrophoresis). Sus mayores ventajas son la facilidad de manejo y la capacidad de
separar múltiples muestras generando patrones de bandas rectos, que hacen mucho más
fácil la comparación entre ellos. Este sistema dispone de veinticuatro electrodos
dispuestos periféricamente y fijos a un contorno hexagonal (figura 6).
Figura 6. Esquema de la
distribución de electrodos en el
sistema CHEF de electroforesis
en campo pulsante. El ángulo
señalado (120º) es el ángulo de
reorientación entre el campo
eléctrico A y el B.
103
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
El voltaje generado por la fuente de electroforesis o generador de corriente se
divide entre los electrodos, de manera que se crea un gradiente constante a lo largo de
todo el gel. El ángulo de reorientación debe ser superior a 90º, habitualmente se trabaja
con ángulos de 120º aunque existen modelos del sistema en el mercado que permiten
modificar este parámetro. Por ángulo de reorientación, se entiende el ángulo que forman
los vectores correspondientes a los dos campos eléctricos que se alternan y que refleja los
grados de reorientación de una molécula de ADN para poder avanzar en la dirección de
los campos eléctricos que se apliquen al gel.
8.3.1ComponentesdeunsistemadePFGE.
Las técnicas de PFGE normalmente requieren voltajes elevados durante muchas
horas, lo cual hace necesaria la recirculación y refrigeración del tampón de electroforesis.
Así los cuatro componentes básicos de un sistema de PFGE son los siguientes:
8.3.1.1Unidaddecontroldepulsos‐generadordecorriente.
Normalmente, en la misma unidad se reúnen la fuente de electroforesis (generador
de 350 V) y el dispositivo que controla los 24 electrodos y la duración de la alternancia de
los pulsos eléctricos.
8.3.1.2Cubetadeelectroforesis.
Es una cubeta acrílica en la que se encuentran los 24 electrodos distribuidos en
forma hexagonal y en cuyo centro se coloca el gel de agarosa, sumergido en el tampón de
electroforesis correspondiente. La recirculación del tampón de electroforesis es esencial
por dos motivos:
a) para refrigerar y mantener una temperatura constante en la cubeta y en toda la
superficie del gel y
b) para mantener la capacidad de tampón de la solución, alterada por el proceso
de electrolisis. Por tanto desde la cubeta hay un tubo de salida del tampón hacia
una unidad de refrigeración y desde ésta un tubo que conecta de nuevo con la
cubeta. La recirculación se lleva a cabo con una bomba.
8.3.1.3Bombaderecirculacióndeltampón.
Aspira el tampón de electroforesis de la cubeta, lo empuja a través de la unidad de
refrigeración y lo devuelve a la cubeta. Es preferible que sea de flujo regulable,
recomendándose un flujo de 0,5-1 litro/min.
8.3.1.4Unidadderefrigeración.
Suele ser un aparato de refrigeración portátil. El tampón de PFGE circula a través
de un único tubo de aluminio que se encuentra en contacto con la solución de
refrigeración. La refrigeración del tampón de electroforesis permite mantener constante la
temperatura de la cubeta (generalmente se recomienda 14ºC), utilizar voltajes superiores y
por tanto electroforesis más rápidas.
8.3.2VariablesqueafectanalaresolucióndelPFGE.
Los resultados de las técnicas de PFGE son muy sensibles a variaciones en
prácticamente todos los parámetros electroforéticos. Las condiciones para obtener la
mejor resolución por PFGE están, por supuesto, en función del rango de tamaño de las
104
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
moléculas a separar y del enzima de restricción seleccionado, pero también intervienen
variables técnicas como la duración y alternancia de los pulsos eléctricos, el voltaje, la
temperatura de la cubeta, el tiempo de electroforesis, el tampón utilizado o el ángulo de
reorientación.
8.3.2.1Pulsos
Duración y alternancia. Los sistemas de PFGE consiguen separar fragmentos
grandes de ADN al inducir la reorientación de las moléculas mediante cambios periódicos
en el campo eléctrico. La duración de los campos eléctricos que se alternan determina el
tamaño del ADN que puede separarse. Así pues, denominamos pulso al campo eléctrico
alternante, y su duración o intervalo hace referencia a cuánto tiempo está actuando en
una dirección u otra. Los pulsos pueden durar fracciones de segundo, para separar
moléculas de pocas kb, o pueden durar algo más de una hora para separar moléculas
mayores de 5 Mb. Puesto que nos estamos refiriendo a la aplicación de PFGE en la
tipificación bacteriana, el rango de peso molecular que interesa separar suele oscilar entre
las 20 kb y las 600-800 kb, lo cual se consigue con tiempos que oscilan entre los 0,5
segundos y los 50-60 segundos. En general, cuanto mayor es la molécula de ADN, mayor
tiempo de reorientación se requiere; las moléculas pequeñas, que pueden reorientarse
con rapidez invierten gran parte del tiempo del intervalo de pulso en avanzar a lo largo
del gel. Como habitualmente interesa separar un rango amplio de fragmentos de ADN
con distintos tamaños, los sistemas de PFGE, permiten establecer un incremento
progresivo en la duración de los pulsos a lo largo de la duración total de la electroforesis.
Por ejemplo, en una electroforesis de 14 horas los pulsos pueden alternarse cada 5
segundos al principio del gel y acabar en la hora 14 con alternancias cada 30 segundos.
Los sistemas comerciales de PFGE más utilizados actualmente, establecen una distribución
lineal de la duración de los pulsos durante el tiempo de electroforesis. La aplicación de
esta distribución lineal mejora la resolución en la separación de fragmentos, pero no
garantiza una relación lineal constante entre tamaño y movilidad, de hecho, si se separan
las mismas muestras con distintos intervalos de pulsos se obtienen patrones con
movilidades muy distintas. Por esta razón es muy importante, colocar en todos los geles
de PFGE controles de peso molecular adecuados que faciliten la comparación entre
patrones y la identificación de determinados fragmentos de ADN.
8.3.2.2Voltaje
El gradiente de voltaje es la diferencia entre el potencial eléctrico de los electrodos,
este valor representa la fuerza que conduce el ADN a través del gel. Por tanto, el gradiente
de voltaje debe expresarse en unidades de voltaje por distancia. Por ejemplo, si la fuente
de electroforesis genera un voltaje de 180 V a una cubeta en la que los electrodos están
separados 30 cm, el gradiente de voltaje será de 6 V/cm. El tamaño del gel utilizado no
modifica este parámetro, siempre que la distancia entre los electrodos o el voltaje
aplicado no varíe. El uso de distintos voltajes afecta no sólo la distancia de migración sino
también el rango de tamaños que pueden separarse. Así, para obtener una resolución
comparable en geles procesados a diferentes voltajes, debe modificarse no sólo el tiempo
de electroforesis, sino los intervalos de pulsos para compensar las diferencias en la
migración de ADN. Utilizar un voltaje inferior requiere intervalos de pulso más largos para
obtener resultados similares. A voltajes bajos, las moléculas de ADN requieren más tiempo
para reorientarse y avanzar tras la alternancia del pulso eléctrico.
105
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
8.3.2.3Temperaturadeelectroforesis:
Como se ha mencionado previamente, la recirculación del tampón de
electroforesis y el mantenimiento de una temperatura constante son condiciones
indispensables para obtener resultados reproducibles. Temperaturas entre 12ºC y 15ºC
son las más habituales. A medida que la temperatura aumenta, el ADN avanza más rápido
pero disminuye la resolución de las bandas en el gel. Por ejemplo, a 24ºC el ADN avanza
un 50% más rápido de lo que lo haría a 13ºC, sin embargo la disminución en la calidad de
los patrones de bandas no justifica la reducción del tiempo de electroforesis.
Temperaturas más bajas, 8ºC-10ºC, pueden ser recomendables para microorganismos
cuyo ADN se degrada con facilidad (por ejemplo Streptococcus pneumoniae o Clostridium
difficile), de este modo se obtienen patrones con bandas mejor definidas, para compensar
el enlentecimiento de la electroforesis deben, entonces, modificarse otros parámetros
como voltaje, duración de la electroforesis, etc.
8.3.2.4Tiempodeelectroforesis.
Debe intentarse mantener el tiempo mínimo de electroforesis necesario para
obtener una resolución adecuada. En electroforesis largas la presencia de nucleasas
residuales puede contribuir a la degradación del ADN, además, las bandas pierden
definición en la zona más distal del gel. Para mejorar la resolución de una PFGE, deben
intentar ajustarse otras variables, como el intervalo de los pulsos, aumentar el tiempo de
electroforesis sólo aumentará el espacio entre las bandas que ya se hubieran separado, no
ayudará a separar bandas que migran conjuntamente al inicio del gel.
8.3.2.5Tampóndeelectroforesis.
En general se recomienda el uso de TBE (x0,5; ver composición en documento
técnico correspondiente). En el caso de necesitar separar moléculas de gran tamaño (>2
Mb), se recomienda utilizar TAE (x1), puesto que es más rápido al generar una corriente
eléctrica más potente.
8.3.2.6Ángulodereorientación.
Como se ha mencionado, por ángulo de reorientación, se entiende el ángulo que
forman los vectores correspondientes a los dos campos eléctricos que se alternan. Para
obtener una resolución adecuada por PFGE se requieren ángulos de reorientación de más
de 90º. El estándar, cuando el sistema de PFGE tiene este parámetro fijo, es de 120º. En la
actualidad existen modelos que permiten modificar este ángulo, disminuyéndolo, lo cual
es útil para separar moléculas de ADN de gran tamaño (> 2 Mb).
8.4Criteriosparalainterpretaciónderesultados
El objetivo final de las técnicas de tipificación molecular aplicadas al análisis de
brotes de infección, es el poner de manifiesto que los aislamientos relacionados
epidemiológicamente, lo están también genéticamente. Es imprescindible conocer los
fundamentos de las técnicas de PFGE y cómo ciertos cambios genéticos pueden alterar los
patrones de bandas obtenidos por PFGE, para interpretar correctamente los resultados. En
una situación ideal, los patrones de PFGE de los aislamientos que representan una cepa
epidémica deberían ser idénticos y fácilmente diferenciables de los aislamientos
epidemiológicamente no relacionados. Sin embargo, con frecuencia cambios genéticos,
que ocurren muchas veces de forma aleatoria, alteran el perfil de los patrones de la cepa
106
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
epidémica en el curso de un brote. A pesar de todo, la comparación e interpretación de
los patrones de restricción tiene un importante componente de subjetividad por parte del
observador.
Es importante tener en cuenta la naturaleza de la colección de aislamientos que
nos proponemos estudiar. Son más fáciles de interpretar los patrones obtenidos de cepas
aisladas en un periodo de tiempo corto y que han dado lugar a un brote de infección
recortado. En ocasiones, aislamientos no relacionados epidemiológicamente pueden
presentar un genotipo idéntico o muy parecido, particularmente si pertenecen a una
especie o subtipo con una diversidad genética limitada. Este es el caso de ciertos
microorganismos multirresistentes, endémicos en ciertos hospitales o áreas sanitarias (por
ejemplo, S. aureus resistente a meticilina) o de ciertos subtipos bacterianos que, en una
especie dada, se han hecho más prevalentes en todo el mundo (por ejemplo, ciertos
serotipos de Streptococcus pneumoniae). En estos casos puede ser difícil discernir si las
cepas que estamos estudiando pertenecen a un brote, especialmente si la cepa endémica
o el genotipo más prevalente son los responsables.
A la hora de interpretar los patrones de PFGE, debe examinarse la colección
completa de cepas a estudiar en busca de un patrón epidémico, que sería el más común
entre los aislamientos. A continuación todos los otros patrones deben compararse con
éste y a la vez entre sí. Es preciso contabilizar el número de fragmentos distintos de cada
cepa con todas las demás, fragmento a fragmento (figura 7).
Figura 7. Electroforesis en campo pulsante del ADN cromosómico, tras
restricción con SmaI, de 15 cepas de Acinetobacter baumannii. Las cepas en las
líneas 1 al 4 están genéticamente relacionadas y pertenecen al tipo clonal "A".
Las cepas de los clones "B", "C" o "D" sonidénticas entre ellas; (kb, kilobases).
En función del número de diferencias entre dos patrones clasificaremos a los
aislamientos en:
8.4.1Idénticos.
Cuando los dos aislamientos presentan el mismo número de bandas y éstas tienen
aparentemente el mismo tamaño. En este caso ambos aislamientos representan la misma
cepa.
107
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
8.4.2Genéticamenterelacionados.
Cuando el número de diferencias entre los dos aislamientos sea inferior o igual a 3.
Esto es debido a que un único cambio genético, en el más desfavorable de los casos
(mutación espontánea que afecte a un lugar de restricción: creando uno nuevo o haciendo
desaparecer uno ya existente), se traduce en un máximo de tres diferencias entre los
patrones de un aislamiento y su ancestro. En este caso, las dos cepas pueden considerarse
genéticamente relacionadas (una subtipo de la otra o ambas derivadas de un ancestro
común) y sus diferencias pueden ser la consecuencia de los cambios genéticos que se
acumulan en las sucesivas generaciones bacterianas.
8.4.3Posiblementerelacionados.
Cuando los cambios entre los dos patrones pueden ser atribuidos a dos hechos
genéticos independientes, el número de cambios puede llegar a ser hasta de 6
(inserciones o delecciones de ADN; o ganancia o pérdida de lugares de restricción).
Aunque estos aislamientos puedan también corresponder a una línea evolutiva común, su
relación genética no es tan cercana y por tanto, es menos probable su relación
epidemiológica. Este número de variaciones puede verse entre aislamientos separados por
largos periodos de tiempo (> 6 meses), entre aislamientos que proceden de brotes que
han afectado a un gran número de personas o entre aislamientos que proceden de
situaciones endémicas prolongadas. En estos casos, antes de llegar a una conclusión seria
interesante analizar las características fenotípicas de los aislamientos, su sensibilidad
antibiótica y aplicar otros marcadores genotípicos si fuera necesario.
8.4.4Norelacionados.
Cuando los cambios entre los dos patrones son atribuibles a tres o más cambios
genéticos independientes, lo cual se traduce en un número de diferencias entre los dos
patrones superior a 6. En este caso interpretaremos que las dos cepas pertenecen a clones
distintos, sin relación epidemiológica.
Esta clasificación de la relación genética entre microorganismos, pretende ser sólo
orientativa. Es preciso individualizar cada situación, tener en cuenta otras características de
los microorganismos y sobre todo, la información epidemiológica que deriva de una
investigación clínica cuidadosa.
Se pueden también analizar los patrones de PFGE mediante sistemas informáticos
que objetivan el número de diferencias entre dos aislamientos y les asignan una "distancia
genética". En estos sistemas, se precisa captar la imagen del gel primero, normalizarlo e
identificar las bandas que quieren ser incluidas en el análisis. Son sistemas muy útiles para
analizar colecciones que incluyen muchos microorganismos.
8.5Indicaciones
Las técnicas de macrorrestricción y PFGE se han utilizado para la tipificación
molecular de un gran número de especies bacterianas. Son técnicas que exploran la
organización del ADN cromosómico bacteriano bajo la acción de la digestión por un
enzima, por tanto dan información general sobre el genotipo bacteriano y sus cambios
más recientes. En general, sus resultados han demostrado ser suficientemente
discriminativos, con excelente reproducibilidad y fáciles de interpretar cuando se estudian
108
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
colecciones de microorganismos aisladas en un periodo de tiempo corto. Al aplicar estas
técnicas al estudio de brotes de infección nosocomial endémicos, hay que tener en cuenta
que la rentabilidad de la técnica variará en función del momento del brote. Por ejemplo, al
principio del brote es probable que la diversidad genética sea baja, mientras que más
tarde, al irse acumulando cambios genéticos en las cepas epidémicas/endémicas, se
incrementará la diversidad de los patrones de PFGE.
8.6Inconvenientesdelatécnica
Como se ha mencionado previamente, las técnicas de macrorrestricción y PFGE son
de utilidad en la mayoría de especies bacterianas, sin embargo en algún caso carecen del
suficiente poder de discriminación (por ejemplo para Salmonella enterica). Por esta razón,
al emplear la técnica sobre alguna especie sobre la que no hay experiencia previa, es
necesario elegir cuidadosamente las cepas que utilizaremos como controles (aislamientos
no relacionados epidemiológicamente con las cepas a estudiar). También existen algunas
especies bacterianas en las que la degradación del ADN cromosómico hace que muchas
de sus cepas sean "no tipables" por PFGE. Este es el caso de algunas subespecies de
Salmonella, algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa, Clostridium difficile o algunos
patógenos entéricos (E. coli). Se han publicado algunas modificaciones para disminuir la
degradación del ADN y mejorar la resolución de la electroforesis, como por ejemplo,
añadir tiourea al tampón de electroforesis o utilizar una formulación que contenga HEPES
en lugar de Tris (en este caso es necesario reducir el voltaje a 4 V/cm). Asimismo, se han
publicado procedimientos técnicos que permiten obtener resultados en 24-48 h,
mejorando otro de los inconvenientes de la técnica.
Un inconveniente importante es el derivado de la interpretación de los patrones de
bandas obtenidos, que es subjetiva en la mayoría de los casos, y de la ausencia de un
sistema normalizado que permita cuantificar uniformemente la distancia genética.
Finalmente, debe recordarse que las técnicas de macrorrestricción y PFGE no
detectan cambios puntuales en genes ni permiten la observación detallada de ciertos
elementos genéticos (plásmidos, transposones, secuencias de inserción, etc.). Por tanto,
para abordar algunos problemas epidemiológicos en los que intervengan estas
secuencias, se requiere la combinación con otras técnicas.
109
UNIDADDIDÁCTICAIX
ANÁLISISDELADNPORSECUENCIACIÓN.
MULTILOCUSSEQUENCETYPING(MLST)
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
9.1Introducción
El MLST es una técnica desarrollada y diseñada para identificar clones y/o líneas
clonales, fundamentalmente en poblaciones bacterianas. Es un marcador molecular de
aplicación en epidemiología global o a largo plazo (identificación de grupos poblacionales
con independencia de pequeñas variaciones que puedan surgir geográfica y/o
temporalmente), aunque ha sido ocasionalmente utilizado para dar respuesta a
interrogantes planteados en epidemiología local o a corto plazo (caracterización de
brotes, diferenciación de recidivas, reinfecciones y/o fallos terapéuticos, etc).
El método está basado en el principio desarrollado en el análisis de isoenzimas
(multilocus enzyme electrophoresis -MLEE-), en el que se estudia la movilidad
electroforética de un número concreto (generalmente entre 15 y 20) de enzimas
metabólicos en geles de almidón o poliacrilamida. Las variaciones observadas en dichas
movilidades se corresponden con variaciones en el locus o gen codificante de cada
enzima. Cada variante es definida como "variante alélica" y los diferentes alelos de cada
uno de los genes conforman el perfil alélico que a su vez define el tipo electroforético.
Esta medición "indirecta" del polimorfismo genético se convierte en una medición directa
en MLST, donde el análisis se basa en la secuencia del ADN de fragmentos internos de
genes "housekeeping" que codifican enzimas metabólicos. El hecho de utilizar enzimas
metabólicos, no sometidos a presión selectiva, permite detectar variaciones neutras que
definen líneas clonales relativamente estables.
9.2Tratamientopreviodelosmicroorganismos
El método fue en principio desarrollado para caracterización de aislados
bacterianos. Al ser un método basado en amplificación y secuenciación específica de
fragmentos internos de ADN en determinados genes, los elementos críticos van a ser la
extracción del ADN cromosómico y la amplificación específica de los fragmentos
seleccionados. No es determinante el medio de cultivo y/o las condiciones de incubación
de la cepa en cuestión. Desgraciadamente el proceso de selección de los genes, así como
de los fragmentos internos de estos no es universal, es decir, este proceso debe ser
realizado para cada especie bacteriana de forma individual. El método es de aplicación
universal pero no su desarrollo. El método de extracción del material genético, así como
los genes seleccionados y por lo tanto los protocolos de amplificación de los fragmentos
de estos se adaptan a cada especie de forma individualizada y están accesibles en la
página web http://mlst.net con un acceso específico para cada una de las especies. En
general, se utilizan métodos comerciales de extracción y purificación de ADN.
9.3Fundamentosyvariantestécnicas
La técnica MLST caracteriza los aislados detectando polimorfismo de forma directa
por secuenciación del ADN en los diferentes genes seleccionados. Esto permite identificar
todas las variaciones, no sólo aquellas que produzcan un cambio en la movilidad
electroforética del enzima codificante, como sucedía en MLEE.
En general, regiones específicas de los genes son responsables de la mayor parte
de la variabilidad observada, mientras que el resto del locus presenta un alto grado de
conservación. Este hecho ha permitido definir en el desarrollo del MLST que sería
suficiente analizar, de cada gen, solo un fragmento interno de entre 450-500 pb. Así, el
113
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
nivel de variabilidad combinado entre los genes analizados proporciona un alto grado de
discriminación y permite reducir el número de loci o genes analizados. Asimismo, la
secuenciación permite detectar variantes que supongan tan sólo un cambio en una base
en el gen analizado, de forma que se calcula que encontrando una media de 30 alelos
diferentes por locus, y estudiando tan sólo 7 genes, se podrían distinguir hasta 307
genotipos diferentes. Esta circunstancia ha llevado a consensuar 7 cómo el número de
genes que se considera adecuado para el análisis por secuenciación de los fragmentos
seleccionados.
Desde su desarrollo inicial para Neisseria meningitidis, han aparecido básicamente
dos variantes de la técnica, y una tercera que tendrá un desarrollo paralelo al de las
micromatrices o microarrays:
9.3.1Aplicacióndirectasobremuestrasclínicasenausenciadecultivo.
Al ser un método basado en amplificación y secuenciación de material genético, ha
sido adaptado en algunos microorganismos para poder ser aplicado en muestras
biológicas (LCR, sangre, suero, exudados, etc.) en ausencia de cultivo. En este caso, la
estrategia precisa la realización de una Nested-PCR con iniciadores diseñados en las
regiones flanqueantes de los fragmentos amplificados en el esquema normal de MLST
para cultivos. Los resultados obtenidos muestran como esta estrategia funciona bien en
muestras clínicas con neumococo o meningococo. Lógicamente debe funcionar también
para el resto de especies en las que se ha desarrollado MLST.
9.3.2MultilocusRestrictionType(MLRT).
En algunas de las especies para las que se ha desarrollado MLST se ha aplicado con
aparente eficacia una variante que no requiere secuenciación y consiste en la
amplificación inicial de los mismos fragmentos que se utilizan en MLST (utilizando los
mismos iniciadores), para digerir posteriormente dichos fragmentos con endonucleasas.
Los fragmentos producidos tras la digestión son posteriormente resueltos mediante
electroforesis en geles de agarosa. Desde el punto de vista de compartir datos entre
diferentes laboratorios adolece de los mismos problemas que se observan con la
utilización de todos los marcadores moleculares basados en la generación de patrones de
bandas y comparación en formato de imagen: compartir información es un proceso
complejo que implica la formación de amplias redes que permitan la estandarización del
método y la implantación de idéntica metodología para el análisis e intercambio de
imágenes, lo que complica mucho todo el procedimiento. Sin embargo esta variante se
muestra muy útil en el contexto de ondas epidémicas. Una vez identificado el perfil de
MLRT con el correspondiente de MLST, el seguimiento de la onda desde el laboratorio
central puede ser llevado a cabo sin recurrir a la secuenciación. Sólo en caso de aparición
de variantes próximas por MLRT se procedería a la comprobación por secuenciación.
9.3.3AplicacióndeMLSTmediantetecnologíademicromatrices.
El desarrollo de micromatrices para la detección rápida de polimorfismo genético
en segmentos de ADN ha permitido su aplicación como variante metodológica del MLST.
En este caso, y brevemente, los alelos conocidos de los fragmentos seleccionados en los 7
genes housekeeping permiten diseñar las sondas que se van a inmovilizar en la matriz (o
chip). En este caso, las sondas se diseñan para detectar específicamente el cambio en una
sola base, por lo que cada alelo va a venir definido por una reacción positiva en una sola
114
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
sonda, o bien, por una combinación de reacciones positivas con diversas sondas. La
actuación con cada cepa problema vuelve a empezar por la amplificación de los 7
fragmentos con los mismos iniciadores que se utilizan en MLST. Los fragmentos
amplificados se marcan con la incorporación de d-UTP marcado con fluoresceína, aunque
pueden utilizarse igualmente otras modalidades de marcaje. Se procede posterior- mente
a la hibridación de los fragmentos marcados y al posterior revelado con estreptavidina. La
intensidad de la señal emitida se analiza mediante un scanner y de aquí se deduce la
secuencia de cada fragmento. Así, el proceso es bastante sencillo una vez desarrollada la
matriz. En este momento, la tecnología de secuenciación es bastante más asequible que
las micromatrices, especialmente si el laboratorio tiene que diseñar y desarrollar su propia
matriz. Si en el futuro las matrices son asequibles comercialmente, esta variante
tecnológica podría sustituir rápidamente a la utilización de secuencias de ADN.
9.4Criteriosparalainterpretaciónderesultados
El proceso de análisis (figura 9) por MLST se inicia con la amplificación y posterior
secuenciación de los fragmentos variables de los 7 genes seleccionados.
La secuencia de cada uno de los loci se alinea con las ya existentes en una base de
datos centralizada, asignándose un número que identifica a cada alelo. Si la secuencia
coincide, el programa asigna uno de los alelos ya identificados; en caso contrario asigna
un nuevo número a ese nuevo alelo.
Figura 9. Análisis mediante la técnica de MLST
La secuenciación de ambas hebras de ADN permite autentificar las variaciones
encontradas en la secuencia. La identificación de cada uno de los 7 alelos genera un "perfil
115
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
alélico" que consiste en una secuencia de 7 números. A partir de este momento la
comparación entre aislados es sencilla, comprobando con facilidad el grado de
proximidad entre los aislados, mediante el simple análisis del número de alelos
compartidos entre perfiles diferentes. Cada perfil alélico define lo que se conoce como
"tipo de secuencia" o "sequence type" (ST).
Las características propias de Internet permiten la existencia de bases de datos
MLST específicas para cada microorganismo, accesibles mediante página web
(http://mlst.net), realizándose todo el proceso de consultas y análisis así como envío de las
propias cepas para inclusión en las bases de datos, con conexión posible desde cualquier
lugar del mundo.
Desgraciadamente, el proceso de selección de los genes, así como de los
fragmentos internos de estos no es universal, es decir este proceso debe ser realizado
para cada especie bacteriana de forma individual, de forma que aunque el método es de
aplicación universal, su desarrollo no. Este proceso es lento y laborioso, limitando la
aplicación de MLST a aquellas especies en las que ya ha sido desarrollado. El método ya
ha sido desarrollado para 11 diferentes especies de bacterias y 1 levadura (ver información
en http://www.mlst.net/databases/default.asp), y están en proceso de desarrollo un buen
número de patógenos de interés en salud pública.
(http://www.mlst.net/misc/new_schemes.asp).
Cuando se completa el proceso de desarrollo de MLST para una nueva especie
bacteriana, es preciso organizar una base de datos. La organización y gestión de estas
bases de datos se realiza mediante programas informáticos diseñados al efecto que
recogen una serie mínima de datos de cada uno de los aislados que forman parte de la
misma. Esa serie de datos, clínicos, epidemiológicos y microbiológicos, la definen el grupo
o grupos responsables del desarrollo del método en la especie en cuestión.
El sistema está diseñado de forma dinámica, para poder mandar los STs de nuevos
aislados, solicitar la inclusión de nuevos alelos y/o perfiles, etc., todo ello gestionado por
un administrador especialista en bioinformática, que supervisa los datos suministrados por
el usuario. Así, si se envían datos de aislados que corresponden a perfiles ya descritos, sólo
es preciso enviar un formato Excel con los datos correspondientes. Si se trata de un alelo
nuevo, no incluido en la base de datos, entonces es preciso enviar el archivo en formato
"Chromas" generado por el secuenciador automático, para poder proceder a su
verificación.
El programa de gestión de la base de datos permite al usuario realizar consultas de
alelos, de perfiles alélicos, de aislados específicos con objeto de conocer su relación con
otros aislados incluidos en la base, etc. Adicionalmente, la página web ofrece enlaces con
un buen número de programas que permiten el análisis de datos generados por MLST
mediante la utilización de diversos algoritmos. Un ejemplo de ello sería la página web
correspondiente a Neisseria meningitidis.(http://neisseria.org/nm/typing/mlst/), que
permite de manera interactiva realizar consulta sobre protocolos de extracción del ADN,
así como protocolos de amplificación y secuenciación de los fragmentos seleccionados
(Information), adicionalmente a las consultas ya reseñadas anteriormente.
116
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
9.5Indicaciones
Como ya se ha mencionado, MLST es una técnica diseñada para el seguimiento de
clones y/o líneas clonales, fundamentalmente en poblaciones bacterianas. MLST consigue
trazar procesos de dispersión, identificando con gran precisión grupos poblacionales
específicos con independencia de pequeñas variaciones que puedan surgir geográfica y/o
temporalmente. Por tanto, es un marcador molecular indicado en lo que se conoce como
epidemiología global a largo plazo. Ofrece resultados de gran precisión y puede, como en
el caso Neisseria meningitidis, identificar la presencia de líneas clonales hipervirulentas,
prediciendo con cierta antelación la llegada de ondas epidémicas. Asimismo, es un
marcador que permite el seguimiento de clones resistentes prediciendo igual que en el
caso anterior la evolución a medio plazo de los niveles de resistencia en el
microorganismo analizado. Este análisis ha ofrecido buenos resultados en el caso de
Staphylococcus aureus resistente a meticilina y Streptococcus pneumoniae resistente a
penicilina o con un patrón de multirresistencia a varios antimicrobianos.
Tanto en meningococo como en neumococo, se ha detectado la posibilidad de
fenómenos de recombinación genética que afectan a genes del polisacárido capsular,
conocidos como "switching capsular". Las cepas resultantes expresan un polisacárido
diferente al que se expresaba en la cepa original. La aplicación masiva de vacunas
conjugadas altamente eficaces frente a estos dos microorganismos, podría ejercer una
selección positiva para las cepas que expresen, por recombinación, un polisacárido no
incluido en la vacuna ya que las vacunas desarrolladas protegen sólo frente a un número
limitado de serogrupos o serotipos, en dos especies que tienen un alto número de cepas
de diferentes serogrupos/serotipos causando enfermedad. La aparición y frecuencia de
estos fenómenos debe ser investigada en todo momento, y para ello, MLST se ha
mostrado como una herramienta de gran eficacia.
9.6Inconvenientesdelatécnica
MLST ha sido ocasionalmente utilizado para dar respuesta a los típicos
interrogantes planteados en epidemiología local o a corto plazo (caracterización de
brotes, diferenciación de recidivas, reinfecciones y/o fallos terapéuticos, etc). Sin embargo,
su poder de discriminación es muy inferior al que se obtiene con la aplicación de otros
marcadores como el análisis del ADN mediante electroforesis en campo pulsante, técnicas
de tipificación por PCR, AFLP, etc.
Para cada cepa deben realizarse 7 reacciones de amplificación y 14 reacciones de
secuenciación, lo que hace que sea una técnica costosa, laboriosa y que precisa de
tecnología de secuenciación automática. Su aplicación queda, por el momento restringida
a laboratorios de referencia. En estos, el análisis de un alto número de cepas, racionaliza
su aplicación.
117
UNIDADDIDÁCTICAX
OTRASTÉCNICASDETIPIFICACIÓNMOLECULAR.
AMPLIFICATIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM
(AFLP)
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
10.1Amplificationfragmentlengthpolymorphism(AFLP)
AFLP es un marcador molecular que combina dos estrategias diferentes: digestión
del ADN con enzimas de restricción y amplificación selectiva mediante PCR selectiva.
Básicamente, se basa en la utilización de adaptadores que "reparan" los fragmentos de
ADN obtenidos en la digestión, con una posterior amplificación mediante iniciadores
complementarios de la secuencia diseñada en los adaptadores.
Este método, originalmente descrito en 1995, fue diseñado para analizar ADN de
cualquier origen y complejidad, aunque posteriormente se han desarrollado variante
técnicas más sencillas para su aplicación en genomas bacterianos.
El método original comienza con la extracción y purificación del ADN mediante la
utilización de cualquier método comercial asequible. A continuación el ADN bacteriano se
somete a una primera digestión, generalmente con un enzima que reconozca un número
intermedio de secuencias de corte, tal como EcoRI, y seguidamente a una segunda
digestión con otro enzima que reconozca un alto número de puntos de corte, como MseI
o TaqI. Este proceso va a originar fragmentos de ADN cortados en ambos extremos por el
mismo enzima, y fragmentos mixtos, cortados en un extremo por EcoRI y en el otro por
MseI o TaqI.
El paso siguiente consiste en la unión mediante la acción de ADN-ligasa, de unos
oligonucleotidos de doble cadena llamados adaptadores, en los extremos de los
fragmentos de ADN. Dichos adaptadores se diseñan de tal forma que van a unirse
selectivamente en los fragmentos mixtos, dejando pues al margen todos los fragmentos
digeridos en ambos extremos por el mismo enzima. El diseño de los adaptadores incluye
algún cambio de base para impedir una nueva digestión tras la acción de la ligasa ya que
las reacciones de digestión y de unión de los adaptadores se realizan de forma simultánea.
La presencia entonces de los adaptadores permite la utilización de iniciadores
diseñados para reconocer e hibridar en parte de la secuencia de dichos adaptadores. La
amplificación se realiza en condiciones de alta selectividad, de forma que una extensión
en el extremo 3’ de entre 1 y 3 nucleótidos permite obtener un resultado de un menor
número de amplicones y simplificar por lo tanto el número de bandas final.
Si el número final de bandas es muy elevado y con tamaños pequeños, el análisis
se realizará en geles de poliacrilamida, generalmente con ayuda de un secuenciador
automático, que generará patrones exportables y analizables con programas informáticos
específicos. La utilización de patrones "digitalizados" y de programas informáticos de
análisis comunes permite compartir datos entre diferentes laboratorios con mayor
facilidad. En este caso, uno de los iniciadores se marca con un fluorocromo.
Para genomas sencillos, como son los cromosomas bacterianos, se han
desarrollado variantes con una sola digestión inicial y una resolución del gel final en
agarosa.
Con este método, la variabilidad obtenida se origina por alguna de las siguientes
causas:
-Mutaciones en las dianas de restricción de los enzimas utilizados.
-Mutaciones en las secuencias adyacentes a las dianas de restricción y que son
complementarias de una parte de los iniciadores
-Inserciones y/o delecciones dentro de los fragmentos amplificados.
121
UNIDADDIDÁCTICAXI
ANÁLISISDELADNEXTRACROMOSÓMICOYDELOS
ELEMENTOSGENÉTICOSDETRANSMISIÓNHORIZONTAL
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
11.1Introducción
La resistencia a agentes antimicrobianos se produce por mutación o por la
adquisición de genes localizados en diferentes elementos de transmisión horizontal (ETH)
como plásmidos, transposones o integrones, capaces de transmitirse entre
microorganismos de la misma o de distinta especie. El aumento de la resistencia a un
determinado antibiótico puede ser debido a la diseminación de un clon o de un ETH entre
distintas cepas. La diferenciación entre "epidemias" debidas a clones o a ETH puede ser
relevante ya que las políticas de control pueden varían según las diferentes situaciones
epidemiológicas. El análisis y caracterización de los ETH permite la monitorización de
elementos genéticos específicos de los microorganismos o de áreas geográficas que
pueden ser importantes en la evolución y diseminación de las bacterias que los albergan.
En este apartado analizaremos los fundamentos e importancia del análisis de
diferente ETH implicados en la diseminación de la resistencia a los antimicrobianos con
especial énfasis en los plásmidos.
11.2Plásmidos
Los plásmidos son elementos de ADN extracromosómico que constituyen entre el
1% y >10% del genoma de muchas especies bacterianas. Se replican intracelularmente de
manera autónoma y, aunque en la mayoría de las ocasiones no son esenciales para la
viabilidad de la célula, contienen genes que confieren distintas propiedades como la
resistencia a antibióticos, virulencia o actividades metabólicas. Los plásmidos se clasifican
según sus características, algunas de ellas con importancia epidemiológica: tamaño, rango
de hospedador (presencia en una o diferentes especies y géneros), número de copias por
célula, capacidad de transferirse por conjugación y grupo de incompatibilidad.
Tradicionalmente, el número de plásmidos por célula se ha utilizado como marcador
fenotípico. Hoy en día tiene escasa utilidad y el análisis plasmídico está enfocado a dirimir
la transmisibilidad de los genes que albergan y por tanto su valor epidemiológico.
Los plásmidos están constituidos por una región constante que incluye
determinantes genéticos para sus funciones esenciales (replicación, mantenimiento y
transferencia) y una región variable de ADN heterólogo (ej., genes de resistencia). La
relación epidemiológica entre distintos plásmidos se realiza en función de su región
constante. La caracterización del ADN heterólogo es útil para determinar la ecología y la
epidemiología de los mismos en respuesta a distintas presiones selectivas, en el caso de
los determinantes de resistencia a la utilización de antimicrobianos.
Los plásmidos suelen existir como moléculas circulares de ADN de doble hebra
(dsADN) cerradas covalentemente (conocidas como formas CCC, Covalently Closed
Circular). Las alteraciones por rotura de la dsADN dan lugar a las configuraciones
plasmídicas abierta circulares (formas OC, Open Circular) o lineal (formas L) según se
afecte una o las dos hebras. Estas tres configuraciones migran a distinta velocidad en los
geles de agarosa: la forma CCC más rápidamente que la OC y ésta más rápidamente que
la L. Todas ellas se encuentran frecuentemente en una misma célula por lo que
normalmente se observan 3 bandas correspondientes al mismo plásmido. Con frecuencia
también se detectan dímeros o multímeros de las formas CCC y OC (figura)
125
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
Los plásmidos se han encontrado en la mayoría de las
bacterias conocidas. En algunos géneros como Borrelia y
Streptomyces existen los llamados "plásmidos lineales" de
extremos covalentemente cerrados y estructura similar a la
de algunos virus.
11.2.1Fundamentosyvariantestécnicas.
El análisis de plásmidos tiene como objetivos detectar su presencia y/o establecer
la relación entre ellos. Para ello es necesario partir de un cultivo bacteriano adecuado,
centrifugar el cultivo, aplicar un método de extracción y purificar el ADN plasmídico
obtenido. Posteriormente podremos medir el tamaño de los plásmidos y establecer las
relaciones epidemiológicas.
11.2.2Crecimientodelcultivobacteriano.
La cantidad y calidad de ADN plasmídico final obtenido vienen determinadas por
diferentes factores como el número de copias, el tamaño del ADN heterólogo y la cepa
hospedadora. Los plásmidos de alto peso molecular o con grandes secuencias en su
región variable suelen estar en bajo número de copias y el rendimiento de su extracción
puede optimizarse modificando el volumen, el medio de cultivo y la técnica de lisis.
11.2.3Centrifugación,lisisbacterianayextraccióndelADNplasmídico.
El contenido celular de los cultivos bacterianos se concentra por centrifugación y
se lisa por diferentes métodos que incluyen tratamiento con álcalis o calor, detergentes
iónicos o no iónicos y disolventes orgánicos. La elección del método de extracción
depende de la especie bacteriana que contiene el plásmido, su tamaño molecular y el tipo
de análisis que se planee realizar:
Los plásmidos de alto peso molecular han de extraerse con una lisis suave que
evite su fragmentación. Normalmente se resuspenden en soluciones de sacarosa y se
tratan con lisozima y EDTA para romper la membrana, procediendo a la lisis de los
esferoplastos resultantes del tratamiento previo con detergentes como dodecil sulfato de
sodio (SDS). Los plásmidos de bajo o medio peso molecular (los más frecuentemente
analizados) se extraen con métodos más agresivos que incluyen tratamiento con EDTA y
lisozima y exposición posterior al calor o a álcalis.
126
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
El tratamiento debe modificarse según la cepa hospedadora (especie bacteriana o
estirpe, debido a la diferente composición de la pared celular de distintos
microorganismos).
Se han descrito numerosos protocolos para la separación de ADN plasmídico del
cromosómico. Los protocolos actuales permiten el análisis de un gran número de
muestras (métodos "a pequeña escala"). Se basan mayoritariamente en el método de lisis
alcalina de Birnboim y Doly y son aplicables a un gran número de bacterias grampositivas
y gramnegativas. Este método se basa en la diferente resistencia a valores de pH elevados
del ADN plasmídico y cromosómico. La aplicación de una solución de SDS y NaOH
provoca la lisis celular y la desnaturalización del ADN plasmídico y cromosómico. La
neutralización con acetato potásico permite que el ADN plasmídico vuelva a su
configuración CCC y por tanto permanezca soluble mientras el ADN cromosómico y las
proteínas precipitan en un complejo formado por potasio y SDS que se elimina por
centrifugación. El ADN plasmídico en el sobrenadante se concentra por precipitación con
etanol. Los métodos se modifican en el caso de microorganismos grampositivos con el fin
de digerir la pared celular (por adición de lisozima o de lisozima y lisostafina) o para
posterior restricción añadiendo RNAsa.
Este método está limitado a la obtención de plásmidos en alto o medio número de
copias y de peso molecular <50 kb. Algunos microorganismos grampositivos como
estreptococos, actinomicetos, rodococos o nocardias pueden resultar difíciles de lisar,
empleándose en estos casos el método de Chassy que incluye un pretratamiento con
lisozima y PEG para hacer a las células sensibles a la acción de los detergentes.
Un método rápido que permite la extracción de plásmidos CCC de grampositivos y
gramnegativos con un amplio rango de peso molecular es el método de Kado y Liu que
combina tratamiento a elevado pH con una elevada temperatura (55ºC) lo cual tiene el
efecto de reducir la obtención de ADN cromosómico en la preparación final. Las proteínas
residuales obtenidas en el proceso se eliminan por extracción con fenol: cloroformo lo
cual puede inhibir la digestión posterior con enzimas de restricción.
La extracción de plásmidos por calor (método de "boiling" o de Holmes y Quigley)
se utiliza para extraer ADN plasmídico de un gran número de muestras empleando
pequeños volúmenes (minipreps). El ADN suele ser de calidad inferior al obtenido con
otros métodos. Las bacterias se lisan tras tratamiento con lisozima, tritón y calor. El ADN
cromosómico queda en la pared celular y se elimina por centrifugación. El ADN plasmídico
queda en el sobrenadante y se precipita con isopropanol.
Para la extracción de plásmidos de mayor peso molecular se utilizan
modificaciones de los métodos de lisis alcalina o de "boiling" con un paso de purificación
posterior (ver apartado 5.1.1.3) o distintos métodos a gran escala que incluyen una lisis
suave y purificación posterior del ADN con CsCl (tabla 2). La detección y determinación del
peso molecular de megaplásmidos se realiza por el método de Barton que permite la
separación de plásmidos de hasta 600 kb y consiste en el análisis del ADN por PFGE tras
digestión con S1 nucleasa.
11.2.4PurificacióndelADN.
La mayoría de los plásmidos obtenidos con minipreps no requieren purificación
posterior ya que permiten obtener una cantidad de ADN suficiente para la digestión
enzimática, transformación, aislamiento de fragmentos específicos y/o generación de
127
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
sondas. Sin embargo, los plásmidos de elevado peso molecular (>20 kb) siempre deben
purificarse. El método de elección es la centrifugación en gradiente de cloruro de cesiobromuro de etidio (ClCs-BrEt). Debido a su excesivo coste y duración y la imposibilidad de
aplicación a un elevado número de muestras se han desarrollado otros métodos que
incluyen el uso de resinas de intercambio iónico, HPLC o precipitación diferencial con
polietilenglicol (PEG). Las resinas están disponibles comercialmente (equipos QIAGEN
Plasmid Midi, Maxi, Mega y Giga, distribuidos por IZASA) y permiten la extracción y
purificación de plásmidos de hasta 150 kb.
11.2.5DigestióndelADNplasmídico.
El estudio de las relaciones epidemiológicas entre diferentes plásmidos se lleva a
cabo por comparación de sus patrones de huella dactilar ("plasmid fingerprinting")
generados tras la digestión del dsADN plasmídico (formas CCC) con enzimas de
restricción (ER). Para que los resultados puedan ser interpretables, los patrones deben
tener entre 5 y 10 bandas. Dado que en la mayoría de los casos la secuencia de los
plásmidos se desconoce, la elección del/los ER ha de realizarse inicialmente de forma
empírica.
11.2.6Determinacióndelpesomoleculardeplásmidos.
La estimación del tamaño molecular de un plásmido se realiza por comparación de
la movilidad electroforética en geles de agarosa de sus formas CCC con la de plásmidos
de tamaño molecular conocido o por la suma del tamaño de los fragmentos de ADN
obtenidos tras digestión enzimática. La determinación del tamaño de plásmidos lineales
ha de realizarse por electroforesis de campo pulsante. En general, es necesario:
- Calcular la movilidad electroforética:
Se define midiendo las distancias de migración de los fragmentos de ADN (en mm)
sobre la fotografía de los geles o de las imágenes.
- Construir una curva de calibración en la que se representa la distancia
recorrida (en mm) de los controles utilizados frente a sus pesos moleculares (en
kbp).
La curva ha de ser una línea recta para permitir una correcta determinación de los
valores objeto de estudio por interpolación. Existen distintos métodos matemáticos
lineales que incluyen el log10 del tamaño molecular versus la movilidad, el log10 del
tamaño molecular versus el log10 de la movilidad, y el tamaño molecular versus el valor
recíproco de la movilidad. Este último es uno de los más precisos, especialmente cuando
se aplica con el método de mínimos cuadrados adaptado a los ordenadores personales.
Finalmente, el tamaño molecular de los fragmentos correspondientes se determina por
interpolación de las distancias recorridas sobre la curva de calibración obtenida con los
valores de los controles.
- Los nuevos sistemas de captación y análisis de imágenes digitalizadas
Son utilizados en la actualidad como el PhoretixTM gel análisis software package
(NonLinear Dynamics USA, Newcastle, UK) o el Applied Mathemathics (BioRad,
Birmingham, UK) permiten el cálculo computerizado de los pesos moleculares, el análisis
de gran número de muestras y la comparación de muestras en distintos geles de forma
directa.
128
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
11.2.7Criteriosparalainterpretacióndelosresultados.
Análisis de plásmidos sin restricción. La obtención de perfiles plasmídicos idénticos
o muy similares en diferentes aislados debe ser interpretada con precaución ya que no
siempre refleja una relación epidemiológica entre los mismos. Hay que tener presente que
especies bacterianas próximas evolutivamente adquieren con frecuencia plásmidos
similares y que determinados patrones plasmídicos pueden ser muy estables en
determinadas especies como Salmonella spp. y Shigella spp.
Análisis de perfiles de plásmidos tras restricción. Se realiza por comparación de los
polimorfismos genéticos obtenidos tras la digestión enzimática del ADN plasmídico. A
diferencia de lo que sucede con el ADN genómico, no existen criterios que establezcan el
número de bandas que deben compartir dos plásmidos para ser considerados idénticos o
posiblemente relacionados. En general, consideramos que dos plásmidos están
genéticamente relacionados cuando comparten > 3 sitios de restricción para un ER
determinado y generan el mismo número de bandas de igual peso molecular. Esto suele
confirmarse al menos para 2 ER diferentes (figura).
11.2.8Esimportantetenerencuentaque:
- La obtención de patrones de bandas similares no siempre indica una relación
epidemiológica entre plásmidos; y que diferentes plásmidos portadores de los mismos
transposones y/o integrones pueden tener fragmentos comunes. Por ello, es importante
considerar siempre la posible presencia de otros elementos de transmisión horizontal
"epidémicos".
- La hibridación cruzada de un plásmido con otro es el método de elección para
determinar la homología entre los mismos. No obstante, ha de interpretarse con
precaución ya que una hibridación positiva en fragmentos de alto peso molecular puede
deberse a una homología en regiones mucho más pequeñas contenidas en los mismos.
Para evitar interpretaciones erróneas, es conveniente realizar la hibridación cruzada sobre
ADN plasmídico digerido con enzimas que generen un gran número de fragmentos.
11.2.9Indicacionesparalaaplicacióndelanálisisdeplásmidos.
El análisis del contenido total plasmídico fue una de las técnicas epidemiológicas
moleculares más utilizadas en los años 70 y 80 para la investigación de brotes epidémicos.
En la actualidad apenas se utiliza con este fin, debido a la introducción de otras técnicas y
a las limitaciones que presenta. En la actualidad las indicaciones de mayor utilidad serían:
establecer la relación epidemiológica entre plásmidos diferentes aislados de la misma o
diferente especie bacteriana y ayudar a la localización de otros elementos
extracromosómicos (transposones, integrones).
11.2.10Inconvenientesdelatécnica.
El análisis plasmídico puede presentar una serie de inconvenientes prácticos y de
interpretación de los resultados obtenidos.
1-Su utilidad está restringida a aislados que contengan plásmidos.
2-Los plásmidos son inestables en determinadas especies o clones.
129
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
3-El análisis de plásmidos de elevado peso molecular precisa técnicas que
requieren tiempo (sólo permiten el análisis de un limitado número de muestras por
jornada de trabajo) y personal especializado.
4-La presencia de diferentes formas plasmídicas en una preparación puede
dificultar la identificación de sus correspondientes bandas. Las formas OC suelen ser muy
frecuentes en preparaciones almacenadas durante largo tiempo y en plásmidos de alto
peso molecular. En numerosas ocasiones es difícil establecer si una banda corresponde a
una forma CCC o OC, lo cual puede complicarse al comparar preparaciones de plásmidos
diferentes (figura 1-vista anteriormente).
11.3FUENTES
PROTOCOLOS SEIMC
Microbiología Clínica.G. Prats.Ed. Panamericana.Madrid 2006
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real
Josep Costa
Servicio de Microbiología. Hospital Clínic i Provincial. Barcelona. España.
Secuenciación automática de ADN
Dra. Gemma Rodríguez Tarduchy y María Concepción Santiago Martínez
Servicio de Secuenciación automática de ADN. Instituto de Investigaciones
Biomédicas (IIB - CSIC)
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CUESTIONARIO
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
Cuestionario
1. La unidad funcional de la herencia es:
a. El ADN.
b. El ARN
c. El gen
2. El proceso de duplicación de ADN se denomina:
a. Trascripción.
b. Replicación.
c. Traducción
3. Las ventajas del uso de sondas de ADN son:
a. Alta sensibilidad, alta especificidad, elevado coste.
b. Alta sensibilidad, alta especificidad, rapidez y relativo bajo coste.
c. Alta sensibilidad, rapidez y coste medio-bajo
4. Con la técnica ADN chips, el ADN utilizado como sonda:
a. Debe marcarse por métodos radioactivos o colorimétricos radiactivos.
b. Debe marcarse por métodos radiactivos o colorimétricos no radiactivos.
c. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta
5. ¿Qué prueba se basa en la digestión del ADN total con encimas de baja frecuencia
de corte y resolución de los fragmentos generados por electroforesis de un campo
pulsante?
a. MLST
b. AFLP.
c. PFGE.
6. En los métodos de restricción – hibridación se diferencian los siguientes pasos.
a. Subcultivo de la cepa, lisis, preparación del ADN genómico, digestión con enzimas
de restricción, transferencia de los fragmentos de restricción, revelado y análisis.
b. Subcultivo celular, lisis, preparación ADN genómico, digestión con enzimas de
restricción, electroforesis, transferencia de los fragmentos de restricción, hibridación
con una sonda marcada, revelado y análisis de resultados.
c. Subcultivo celular, lisis, preparación ADN genómico, digestión con enzimas de
restricción, electroforesis, hibridación con una sonda marcada, revelado y análisis de
resultados
7. El uso de transcriptasa inversa permite:
a. Amplificar el ARN a través de su conversión en ARNm.
b. Amplificar el ARN a través de su conversión en ARN
c. Amplificar el ARN a través de su conversión en cDNA.
133
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
8. Cada nucleótido de la cadena de ADN, está formado por:
a. Una molécula de azúcar (pentosa), base orgánica nitrogenada y grupos fosfatos.
b. Una molécula de azúcar, base orgánica nitrogenada y grupos fosfato.
c. Una molécula de azúcar, base inorgánica nitrogenada y grupos fosfato
9. La cadena de la polimerasa se basa en la repetición de un ciclo constituido por las
siguientes etapas:
a. Desnaturalización de ADN, hibridación de los iniciadores a la zona 3, especifica de
cada hebra y, extensión del cebador por actuación de DNA polimerasa.
b. Desnaturalización por acción de la DNA polimerasa e hibridación de los indicadores
a la zona 3
c. Desnaturalización de ADN, hibridación de los indicadores a la zona 3 y extensión del
cebador por el ADN polimerasa
10. Un termociclador es usado para realizar:
a. prueba de microarrys.
b. PCR.
c. las 2 respuestas anteriores son correctas
11. Durante el procedimiento de una prueba por PCR, es fundamental el uso de
estas sales:
a. Cloruro sódico y cloruro potásico
b. Cloruro potásico y cloruro de magnesio.
c. Cloruro cálcico y cloruro sódico.
12. La fase de desnaturalización, se aconseja sea:
a. a tª de 94º C y de 30” a 1 min.
b. a tª de 100º C y de 60” a 2 min.
c. a tª de 94º C y de 60” a 1 min.
13. El número de ciclos en el desarrollo de la prueba de PCR, depende de:
a. Cuanto menos mejor, pues dañamos menos el ADN
b. Cuantos más ciclos mejor, pues obtenemos más replicaciones
c. De la cantidad de ADN que exista en la muestra.
14. La transferencia tras electroforesis de ADN desde el gel a la membrana de
nitrocelulosa, se llama:
a. Southern blot.
b. Shut blot.
c. Shoot blot
15. En la prueba de PCR a tiempo real:
a. El termociclador y el lector son los convencionales.
b. El termociclador y el lector han de ser específicos para esta prueba
c. El termociclador y el lector pueden ser convencionales o específicos
134
IdentificaciónMicrobiológicamedianteTécnicasdeBiologíaMolecular
16. Caracteristicas de la PCR a tiempo real:
a. Precisión cualitativa, rapidez y ausencia de contaminantes.
b. Precisión cualitativa y cuantitativa y ausencia de contaminantes
c. Precisión de la cuantificación, rapidez y ausencia de contaminantes.
17. Cuando la prueba a realizar se basa en la trascripción, la prueba se basa en:
a. La síntesis de DNA por la actuación de una transcriptasa copiando ARN diana
b. La síntesis gracias a la actuación de una transcriptasa inversa copiando ARN diana,
sin necesidad de usar un cebador.
c. La síntesis de DNA, gracias a la actuación de una transcriptasa inversa copiando ARN
diana, al que previamente se le ha unido un cebador.
18. Con la PFGE, la lisis se leva a cabo:
a. Inmovilizando las bacterias en bloques de agarosa.
b. Sin inmovilización de las bacterias
c. Poniendo los tubos de caldo de cultivo en un baño maría.
19. Los lavados con la técnica de PFGE, se realizan:
a. Introduciendo los bloques en soluciones a determinadas concentraciones de sales
con detergentes.
b. Introduciendo los bloques de agarosa en una solución TE y agitarlos, 30 min.
c. Introduciendo los bloques de agarosa en soluciones de TE y agitarlos 60min
20. Señale los componentes básicos para la realización de una prueba de PFGE:
a. Unidad de control de corriente, bomba de recirculación del tampón y unidad de
refrigeración
b. Unidad de control de corriente, cubeta de electroforesis, bomba de recirculación del
tampón y, unidad de refrigeración.
c. Unidad de control corriente, cubeta de electroforesis y bomba de recirculación del
tampón, además de análisis de resultados
21. MLST es una técnica diseñada fundamentalmente para:
a. Identificar clones y genes
b. Identificar genes.
c. Identificar clones.
22. 22. La MSTL puede aplicarse en:
a. Sólo sobre muestras cultivadas.
b. Puede aplicarse en muestras biológicas como LCR.
c. Puede aplicarse en ambos casos
23. La AFLP combina:
a. Digestión de ADN con enzimas y amplificación mediante PCR selectiva.
b. Hibridación de ADN y replicación de ARN.
c. Digestión e hibridación de ADN con enzimas y replicación del mismo
135
TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico
24. ¿Qué método nos permite evaluar un gran número de plásmidos en un espacio
corto de tiempo?
a. Kado
b. Colmes y Quigley
c. Barton.
25. El método de Kado y LIU combina, señale lo verdadero:
a. El tratamiento a un pH elevado con baja temperatura.
b. El tratamiento a un pH elevado con altas temperaturas.
c. El tratamiento a un pH elevado indistintamente de la temperatura.
26. Los alelos son.
a. Formas alternativas de un gen resultado de una mutación.
b. Dos genes idénticamente iguales.
c. Cromátidas de ADN que resultan de la mitosis
27. El B-DNA:
a. Aparece cuando la concentración de agua es inferior al 75% o cuando se forman
híbridos ADNARN. Se trata de una doble hélice más corta pero más ancha
b. Es la conformación cuyas características se asemejan a las descritas por Watson y
Crack
c. Aparece in Vitro en soluciones de alta concentración e in-vivo en tractos de purinaspirimidinas alternadas o en secuencias de citosina metilada.
28. El objetivo de los marcadores moleculares es.
a. Definir la relación existente, clonal o no, entre los aislamientos estudiados.
b. Identificar mutaciones genéticas de elevado potencial patógeno.
c. Dar a conocer los diferentes tipos de patologías y sus posibles soluciones.
29. La probabilidad promedio de que un marcador clasifique en 2 tipos distintos a 2
cepas no relacionadas escogidas al azar, se le denomina como:
a. Azar
b. Tipabilidad.
c. Poder discriminativo.
30. Las sondas también pueden marcarse con sustancias como la biotina o
digoxigena, denominadas:
a. Sustancias de captura.
b. Sustancias de unión
c. Sustancias de enlace.
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