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Fisiogenética Vegetal USO DE MARCADORES MOLECULARES, aplicaciones y ejemplos Cecilia Baginsky - Tradicionalmente los marcadores moleculares utilizados en estudios genéticos y de mejoramiento eran aquellos controlados por genes asociados a caracteres morfológicos, en general fenotipos de fácil identificación -La mejora genética dependía de: - variabilidad genética, - heredabilidad del carácter que se quería aislar, - eficacia en la intensidad de la selección aplicada, - tiempo necesario para realizar un ciclo de selección. Problemas: Desconocimiento ¾ Número y efecto de los genes implicados en la expresión de un carácter ¾ Localización de estos genes ¾ Función fisiológica MARCADORES MOLECULARES Definición: Definición Son todos aquellas moléculas (proteínas o ADN) que se pueden identificar y caracterizar para definir un genotipo determinado. Muchos de ellos permiten la asociación de genotipos con fenotipos específicos. Definición Es cualquier fenotipo molecular, oriundo de la expresión de un gen, como es el caso de las isoenzimas o de segmentos específicos de DNA (correpondiente a regiones expresadas o no del genoma), que puede ser detectado y su herencia monitoreada (Ferreira y Gattapaglia, 1998) Polimorfismos de DNA - Variaciones, más o menos complejas en la secuencia de ADN. - Varios eventos pueden producir poliformismo: - Mutuaciones puntuales - Inserciones o delecciones - Nuevos arreglos - Un marcador es polimorfico cuando existen distintas variantes o “alelos” del marcador dentro de la población bajo estudio MARCADORES MOLECULARES PROTEINAS • Isoenzimas ADN • RFLP (Random Fragments Length Polimorphism) • PCR- RAPDs (Random Amplified Polimorphic DNA) • AFLPs (Amplified Fragment Length Polimorphism) • Minisatélites o VNTR • Microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeats) CLASIFICACIÓN DE LOS MARCADORES MOLECULARES • Basados en electroforesis de proteínas (Alozímas). • Basados en hibridación de sondas “Southern Blot” (RFLP y MINIsatelites o VNTR). • Basados en PCR (PCR-RFLP, RAPD, AFLP, SSR o MICROsatelites). CONCEPTOS CLAVES DE LA GENÉTICA GENOTIPO ADN 5’ 3’ genes ARNm proteínas células FENOTIPO + AMBIENTE organismo tejidos, órganos BASE MOLECULAR DE LA A A a a GENETICA MENDELIANA Genealogía para un gen recesivo ¼ ½ ¼ A A a A a a mutación que produce una proteina corta E L E C T R O F O R E S I S Marcadores Moleculares en base a electroforésis de proteínas ISOENZIMAS ISOENZIMAS Definición: Grupo de múltiples formas moleculares de la misma enzima presentes en una especie, como resultado de la presencia de más de un gen codificado para cada una de las enzimas (Moss, 1982) Desempeñan la misma actividad catalítica pero pueden tener diferentes propiedades cinéticas. Su diferente estructura y carga eléctrica hace que presenten distinta movilidad electroforética en geles de almidón Modo de herencia CODOMINANTE. Se corta el gel en láminas delgadas Tinción enzimática específica para distintas láminas Shikimato Ácido Shikímico Deshidrogenasa NADP + 3 Deshidro Shikimato Precipitado Azul NADPH + MTT Variantes isoenzimaticas de la enzima Shikimato deshidrogenada SKHD en poblaciones de arroz silvestre brasileñas. Ventajas de las isoenzimas • Simplicidad • Mínima cantidad de material en estudio • Altamente reproducible • Bajo costo • Codominante, lo que permite hacer comparaciones entre especies, poblaciones de una misma especie y detectar la presencia de híbridos Deventajas de las isoenzimas • No es capaz de detectar suficiente polimorfismo al presentar pocos alelos por locus, especialmente cuando la base genética es estrecha (entre variedades o especies próximas) • Pueden no reflejar los cambios genéticos que ocurren en el DNA, además sólo un set de genes estructurales están representados en estas proteínas, es decir, sólo parte del genoma se puede evaluar Marcadores basados en hibridación de sondas RFLP = Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. • En este método el DNA genómico es digerido con endonucleasas de restricción. • Posteriormente este material es transferido a una membrana e hibridado con sondas homólogas marcadas con radioactividad o quimioluminiscencia. • El polimorfismo es detectado en el tamaño de los fragmentos obtenidos al digerir DNA genómico. • Modo de herencia CODOMINANTE. RFLP Digestión con enzimas de restricción y electroforesis La hibridación es necesaria para detectar fragmentos específicos Hibridación del DNA: Procedimiento Bandas de DNA en la membrana Hibridación con una sonda Sonda hibridada Lavado del filtro Expuesto a una película de rayos-X Autorradigrafia de marcadores RFLP revelados por medio de una sonda radioactiva Segregación mendeliana de marcadores RFLP en Brassica napus Hind III 3´- T T C G A A – 5´ 5´- A A G C T T – 3´ INDIVIDUO 1 SONDA H H 4 kb H 2 kb Hind III 4 kb INDIVIDUO 2 Electroforésis en agarosa 4 kb + 2 kb H 2 kb H 4 kb 2 kb falta ! Hind III 6 kb “LOCUS POLIMÓRFICO” 6 kb Interpretación de bandas de RFLP Una mutación crea un nuevo sitio de restricción dentro del ADN objetivo. Se detectan por lo tanto dos nuevas bandas sobre la membrana Sitio de restricción Sonda Nuevo sitio de restricción Interpretación de bandas de RFLP Una mutación crea un nuevo sitio de restricción entre los sitios de restrición flanqueantes, creando un fragmento de restricción más pequeño Sitio de restricción Sonda Nuevo sitio de restricción Interpretación de bandas de RFLP Una inserción de una secuencia de ADN entre los sitios de restricción flanqueantes crea un fragmento más grande de restricción Sitio de restricción Sonda Evento de inserción Interpretación de bandas de RFLP Una delección de una secuencia de ADN entre los sitios de restricción flanqueantes crea un fragmento más pequeño de restricción Sitio de restricción Sonda Evento de delección Marcadores basados en hibridación de sondas VNTR = Número variable repetidos en tandem. minisatélites Secuencias de DNA repetidas una al lado de la otra (motivo repetido de 15 a 100 pb). Técnicamente es muy similar a los marcadores RFLP, sin embargo, difiere en la naturaleza de la sonda. En este caso se hibrida una sonda que es homóloga a la secuencia del motivo central del minisatelite. El polimorfismo detectado se debe a diferencias en el número de repeticiones. Es una metodología MULTI-LOCUS (DNA fingerprint) Analisis de segregación por DNA fingerprint en 13 hijos de Gallus gallus. El DNA fue digerido con HaeIII. Los ciculos blancos indican bandas maternas F y los negros paternas M. Aplicaciones Agronómicas Debido a que en general es una técnica mutilocus, su uso esta restringido a la identificación de variedades o “accesiones” en bancos de germoplasma. Muy útiles para asignación de paternidad entre individuos o entre variedades comerciales de algunos cultivares. Se han utilizado para confirmar el origen clonal de algunas variedades de animales y plantas. VENTAJAS • Muchas de las sondas son “universales” y se pueden utilizar en una amplia gama de organismos. • Se puede lograr amplia cobertura del genoma. DESVENTAJAS • Es una metodología laboriosa de desarrollar. • Debe tenerse algún conocimiento previo del genoma del organismo bajo estudio para la construcción de sondas. • Se puede desarrollar un número ilimitado de marcadores. • Requiere personal altamente entrenado. • Es posible reutilizar las membranas de hibridación abaratando los costos. • Instalaciones adecuadas para manipular y disponer del material radioactivo. Marcadores basados en PCR PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Atributos de los marcadores basados en PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) (Sunnucks 2000) • Para la PCR se puede usar bajas cantidades de ADN (incluso se puede usar ADN degradado) y se pueden selecciónar regiones específicas de ADN • Los primer usados para la PCR que amplifican regiones homólogas sobre un amplio rango taxonómico generan datos comparables directamente, facilitando de este modo el análisis . El DNA se puede extraer desde material viejo, se pueden coleccionar y almacenar las muestas. Test de reacción de PCR a través de un gradiente de temperatura sobre un termociclador 51°C Producto buscado Producto no buscado 59°C Amplificación de ADN en forma Aleatórea (RAPD, Random Ampliphied Polymorphic DNA) •Para el PCR se utiliza un sólo partidor corto (10 bases) y temperatura de unión de los partidores de 35 ºC . Estos partidores se unen al azar a sitios complementarios en el ADN genómico. Si dos partidores se unen en sentido opuesto dentro de una distancia de ~ 3000 pb se obtiene la amplificación de un fragmento de ADN. •El polimorfismo detectado se debe a presencia o ausencia del fragmento amplificado. Los marcadores son de tipo DOMINANTE y la técnica es MULTILOCUS Amplificación de ADN en forma Aleatórea (RAPD, Random Ampliphied Polymorphic DNA) Muestras de ADN Transiluminador Termociclador Gel de Agarosa Detección del producto de RAPD Electroforesis en geles de agarosa y visualización con bromuro de etidio Los RAPDs pueden detectarse corriendo el producto del PCR a través de una electroforesis en un gel de agarosa o acrilamida. En ambos casos el gel se tiñe con bromuro de etidio Las diferencias obtenidas al correr los productos de RAPD en acrilamida versus agarosa se deben básicamente al grado deresolución de las bandas. En la mayoría de los casos la electroforesis en geles de agarosa dan una buena resolución Interpretacíón del patrón de bandas de RAPD Ejemplo de un mal gel de RAPD Interpretacíón del patrón de bandas de RAPD Ejemplo de un buen gel de RAPD El cuadro muestra una imagen de una mala calidad de un gel de RAPD. Las bandas están borrosas. En la parte superior hay una mancha donde el producto de PCR fue cargado y algunas bandas no se pueden ver bien. El total de bandas está medio difuso y hace difícil la observación. En algunas partes se ven como dos bandas por sitio. Todo ello hace difícil su interpretación y se podría cometer errores de alto riesgo. El cuadro muestra una imagen de una muy buena calidad de un gel de RAPD. Tanto la presencia como la ausencia de la mayoría de las bandas son muy claras y el background en transparente. Los investigadores pueden no tener dudas en la selección de bandas u colección de datos desde este gel. Por lo tanto, la interpretación de los resultados puede ser muy segura. MICROSATÉLITES (secuencia repetidas simple) (SSR, Simple Sequence Repeat) • Son secuencias repetidas en tandem en la que le motivo repetido fluctúa entre 1 y 4 nucleótidos. • Para el PCR se utilizan partidores específicos que son complementarios a las secuencias que flanquean el microsatélite, normalmente son especie específicos. • El polimorfismo detectado se debe a diferencias en el número de repeticiones. • Los marcadores son de tipo CODOMINANTE y la técnica es de LOCUS UNICO. Secuencia únicas repetidas (STRs) Microsatélites AATG 7 repeats 8 repeats las regiones repetidas son variables entre las muetras mientras que las regiones flanqueantes donde los primer de la PCR se unen son constantes 195 195bp bp 170 170bp bp TCAT TCATunidad unidadrepetida repetida Diferentes set de primer producen distintos tamaños de productos de PCR para un mismo alelo de STR Amplificación de secuencias repetidas Partidores específicos Genotipo 1 Genotipo 2 GTGTGT CACACA GTGTGTGTGTGT CACACACACACA 1 2 Diagrama que muestra el polimorfismo de los microsatélites debido a las diferencias en su longitud. En un individuo diploide el cromosoma A contiene el alelo (ACC)8 mientras que el cromosoma A’ en el locus homólogo presenta el alelo (ACC)6. Mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), utilizando primer diseñados en las regiones flanqueantes, los alelos son amplificados para luego ser separados mediante una corrida electroforética. El diagrama muetra el patrón de bandas que deben determinar tanto los homocigotos como el heterocigoto para los mencionados alelos. Por qué se prefieren los STRs como marcadores genéticos • Son altamente variables dentro de varias poblaciones • Son los que contienen el más elevado contenido de información polimorfica • Son muy frecuentes y están distribuidos al azar, lo que permite la cobertura total de cualquier genoma • El PCR permite el uso de pequeñas cantidades de ADN (1 ng de ADN total) • Son CODOMINANTES Métodos de Visualización de Microsatélites Genotipos microsatélites visualizados en un gel de agarosa y teñidos con Bromuro de Etidio. Genotipos microsatélites visualizados en un gel de poliacrilamida y teñidos con plata AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism (Amplificación de ADN de largo polimórfico) Tecnología del AFPL: Paso a paso Principales caracetrísticas ♦ Una combinación de RFLP y la técnica de PCR ♦ Basada en una selectiva amplificación por PCR fragmentos de restricción obtenidos de un DNA digerido de ♦ Elevado número de polimorfismo y gran poder de detección de variabilidad genética ♦ No requiere de un conocimiento genético previo del organismo o especie a estudiar ♦ Requiere muy poca cantidad de DNA ♦ Es un método altamente sensible para huellas dactilares de DNA de cualquier origen y complejidad. Se utiliza para visualizar polimorfismo de DNA entre las diferentes muestras de un germoplasma, para generar mapas de ligamiento. Cuatro pasos • El DNA se digiere con dos enzimas de restricción • Se incorporan adaptadores de oligonucleótidos específicos a los extremos de los fragmentos genómicos generados por la digestión enzimática • Una fracción de los fragmentos de DNA generados se amplifica selectivamente vía PCR utilizando primer específicos diseñados para reconocer la secuencias en los adaptadores. • La detección del pólimorfismo se puede verificar en geles de poliacrilamida los cuales pueden ser directamente visulizados con nitrato de plata. También se pueden marcar radioactivamente los productos amplificados y luego visualizarlos en un gel de poliacrilamida mediante autoradiografía AMPLIFICACIÓN DE ADN DE LARGO POLIMÓRFICO (AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism) Parte 1 ➨ Digestión del DNA con enzimas de restricción Parte 2 ➨ Ligar adaptadores específicos Mse I TTAA CTTAAG Eco RI AFLP Parte 3 ➨ Amplificación de fragmentos de DNA con partidores específicos TTAA CTTAAG G1 Separación de fragmentos en gel de secuenciación G2 Desde el manual Invitrogen AFLP Gel de AFPL que corrió con una tinción fluorescente Esta imagen muestra un gel de AFLP que corrió en un secuenciador automático. Antes de cargar el gel las muestras se pueden marcar con 2 o 3 tinciones fluorescente (amarillo, azul y verde). Detectar la presencia o ausencia de una banda en particular es casi imposible debido al alto número de bandas obtenidas a través de esta técnica y además por que las tinciones fluorescentes no deben verse por lo ojos. Las bandas se determinan con un laser y la interpretación se debe realizar con un programa adecuado. Comparación de Marcadores moleculares PRINCIPIO RFLP SSR RAPD AFLP Corte Amplif. (PCR) Amplif. (PCR) Corte y (ER) amplif. (ER-PCR) POLIMORF. Moderado Alto Moderado Modrado # LOCI 1-3 1 1-10 Muchos DOMIN. Codom. Codom. Dom. Dom. DETEC. Radiact. Nit.Plata Br. Etidio Br. Etidio Si No Si Alto Medio Alto CONOCIM. GENOMA COSTO Ninguno Medio Aplicaciones de corto plazo • Identificación de parentales o test de paternidad • Identificación y protección de variedades • Certificación de pureza genética en la producción de híbridos • Monitoreo de fecundación cruzada y autofecundación • Evaluación de germoplasma y poblaciones de mejoramiento (variabilidad, diversidad, clasificación distancia genética y filogenia) Aplicaciones de mediano y largo plazo • Construcción de mapas genéticos de ligamiento • Mapeo genético de QTL (Quantitative Trait Loci) • Exploración de locus homólogos en otras especies, a través de mapeo comparativo • Introgresión de características vía retrocruzamiento asistido por marcadores • Selección temprana en cultivos perennes Filogenia para accesiones de Fragaria Contulmo1 Contulmo2 Contulmo3 Contulmo4 Contulmo5 MarBrava1 MarBrava2 MarBrava3 MarBrava4 MarBrava10 MarBrava5 MarBrava6 MarBrava9 MarBrava7 MarBrava8 Chepu1 Chepu4 Chepu3 Chepu5 Chepu6 Carelmapu1 Carelmapu2 Carelmapu3 Carelmapu5 Carelmapu6 Futrono3 Futrono1 Futrono2 Futrono5 Futrono4 Quellón1 Quellón2 Quellón3 Quellón5 Mocopulli1 Mocopulli2 Mocopulli4 Mocopulli5 Butalcura1 Butalcura3 Butalcura4 Butalcura5 Butalcura2 Quemchi9 Quemchi22 Quemchi6 Quemchi1 Quemchi5 Quemchi11 Quemchi19 Quemchi17 Quemchi23 Quemchi10 Quemchi21 Quemchi20 Quemchi16 Quemchi18 Quemchi14 Quemchi12 Quemchi13 Quemchi24 Quellón4 Cucao2 Mocopulli3 Cucao1 Chepu2 Carelmapu4 Manzanar1 Manzanar3 Manzanar5 Manzanar8 Selva Chandler 0.49 0.61 0.74 Coefficient 0.87 1.00 Type I Type III Type IV Type II Type I F.ananassa Mapa cromosomal Griffit et al 2000
