clonado del adn de virus de anemia de los pollos.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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2 144 399
kInt. Cl. : C12N 15/35,C12N 7/01
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
A61K 39/13,C12N 1/21
C12N 5/10,C12Q 1/70
C07K 14/00
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 91917088.6
kFecha de presentación : 11.09.1991
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 548 234
kFecha de publicación de la solicitud: 30.06.1993
T3
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54 Tı́tulo: Clonado del ADN de virus de anemia de los pollos.
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73 Titular/es: Leadd B.V.
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72 Inventor/es:
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74 Agente: Durán Moya, Carlos
30 Prioridad: 12.09.1990 NL 9002008
Wassenaarseweg 72
2333 Al Leiden, NL
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.06.2000
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 144 399 T3
16.06.2000
Aviso:
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k
Noteborn, Matheus, Hubertus, Maria y
De Boer, Gerben, Foppe
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 144 399 T3
DESCRIPCION
Clonado del ADN de virus de anemia de los pollos
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Sector técnico al que pertenece la invención
La presente invención pertenece al sector de la ingenierı́a genética (manipulación de genes) por medio
de tecnologı́a de ADN (y ARN) recombinantes, diagnóstico e inmunización/vacunación. Más en particular, la invención se refiere a la detección, clonado y análisis de secuencia del genoma del ADN del Virus
de Anemia de Pollos (CAV) y aplicaciones posibles de la invención.
Antecedentes de la invención
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El virus CAV, que no ha sido clasificado hasta el momento provoca anemia infecciosa en los pollos.
El virus fue aislado en primer lugar en Japón en 1979 y recibió su nombre a causa de la grave anemia
provocada en polluelos (Yuasa y otros, 1979). Los otros sı́ntomas de infección CAV son la atrofia del
tuétano de los huesos y la destrucción de linfocitos en el timo. También se producen lesiones en el bazo
y en el hı́gado.
Los polluelos de un dı́a de edad son los más susceptibles. En estos animales se observa letargia, anorexia y una anemia transitoria desde los 4 a los 7 dı́as después de inoculación de CAV y aproximadamente la
mitad de los animales mueren entre 2 y 3 semanas después de la infección. Al aumentar la edad también
aumenta la resistencia natural. Cuando tiene lugar la infección a la edad de siete dı́as, los polluelos
solamente desarrollan anemia transitoria después de la infección, y cuando tiene lugar la infección con
animales de 14 dı́as de edad no aparece anemia.
La protección contra la infección CAV y los sı́ntomas de la enfermedad CAV se basa principalmente en
los mecanismos de defensa inmunológica humoral. Vielitz (1989) desarrolló un método práctico, bastante
efectivo, de prevención por medio de “exposición controlada” con suspensiones de hı́gado infectado por
CAV en capas, adquiriendo ası́ los animales descendientes inmunidad materna. En Alemania este método
de inmunización es utilizado en la práctica, pero no parece estar completamente libre de riesgos.
Experimentos llevados a cabo con animales en granjas de aves aisladas por el Centraal Diergeneeskundig Instituut (CDI) de Lelystad han confirmado el valor de la protección de los anticuerpos maternos.
En este caso, se llevó a cabo “exposición controlada” con CAV multiplicado en cultivos de tejidos. La
presencia de anticuerpos maternos contra CAV impidió por completo la replicación del CAV después de
la infección de polluelos de un dı́a de edad procedentes de madres vacunadas de esta forma. Los sı́ntomas
de CAV no tuvieron lugar tampoco. La protección pasiva fue obtenida también en descendientes de capas
inmunizadas y, asimismo, después de inyección de polluelos especı́ficamente libres de patógenos (SPF)
con extractos de yema de huevo procedentes de huevos de las mismas capas inmunizadas. La protección
pasiva con respecto a la infección CAV por la administración de anticuerpos CAV duró hasta una edad
de 4 semanas. Entonces la protección pasiva se observó que era incompleta. Estos experimentos demostraron que los anticuerpos maternales producidos por vacunación de las madres juegan un importante
papel en la prevención en la práctica.
También se ha demostrado por vı́a experimental que en polluelos que sobreviven la infección CAV
tiene lugar una disminución pasajera de una población especı́fica de linfocitos del timo (Jeurissen y otros,
1989). Esta atrofia del timo es la posible causa del CAV que provoca inmunodepresión, resultando en
que las vacunaciones especı́ficas son menos eficaces, por ejemplo, contra la Enfermedad de Newcastle,
habiéndose aislado CAV varias veces en grupos de aves con fuertes bajas debido a la enfermedad de Marek, enfermedad de Gumboro (Virus de la Enfermedad Bursal Infecciosa, IBDV; Yuasa y otros, 1980) y
en animales con la Enfermedad de Ala Azul (“Blue Wing”), en asociación con reovirus (Engström, 1988a,
Engström y otros, 1988b). Con infecciones dobles experimentales se han demostrado las propiedades de
refuerzo del CAV con respecto a otros virus de pollos (por ejemplo, Virus de la Enfermedad de Marek,
MDV, De Boer y otros, 1989a). Recientemente se ha observado una reacción de inoculación fuertemente
incrementada en nuestros propios experimentos después de vacunación mediante aerosol con vacuna de la
Enfermedad de Newcastle e infección simultánea CAV. Por lo tanto, CAV conduce a efectos aumentativos
e inmunosupresivos de otras infecciones vı́ricas. Estas caracterı́sticas de CAV provocan probablemente
en la práctica una incidencia incrementada de focos de enfermedades virulentas.
El CAV parece que está extendido por todo el mundo. Un considerable tiempo después de que se
habı́an iniciado las investigaciones sobre CAV en Japón, se llevaron a cabo los primeros aislamientos de
CAV en Europa, a saber en Alemania por Von Blow (1983) y más adelante por McNulty y otros (1990)
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en el Reino Unido. En Holanda los primeros aislamientos de CAV procedentes de materiales de USA,
Israel y de Túnez fueron llevados a cabo por De Boer y otros (1988). La literatura disponible indica
que los aislados pertenecen a un serotipo pero varios aislados tienen que ser comprobados en cuanto a su
relación mutua y posibles diferencias de patogenicidad (McNulty y otros, 1990). La extensión del CAV
dentro de un grupo de aves tiene lugar probablemente por infección a través de las heces y del aire. La
transmisión vertical del virus a la descendencia, no obstante, juega también un importante papel en la
epidemiologı́a de CAV. En diferentes paı́ses se ha demostrado la presencia de CAV serológicamente.
En condiciones de cultivo de tejidos el CAV es difı́cil de multiplicar. El CAV provoca hasta el momento solamente un efecto citopatológico (CPE) en lı́neas de células limfoblastoides transformadas MDV
procedentes de linfomas de la enfermedad de Marek (células MDCC-MSB1) o bien lı́neas de células linfoblastoides transformadas del Virus de Leucemia Avian (ALV) procedentes de leucosis linfoide (células
1104-X5; Yuasa, 1983).
Un estudio reciente de Todd y otros (1990) describe partı́culas de virus (en material CAV purificado)
que tienen un diámetro de 23,5 nm que concentran una densidad de 1,33-1,34 g/ml en un gradiente de
CsCl. El virus tiene un polipéptido predominante (Mr: 50.000) y un genoma circular de una sola hebra
de ADN con una longitud de 2,3 kilobases. Dos virus pequeños, el Circovirus Porcino y un virus asociado
con “Psittacine Beak” y Enfermedad de las Plumas (“Feather Disease”), se parecen al CAV en lo que
respecta al ADN circular con una sola hebra, pero tienen un genoma más pequeño y un diámetro de
partı́culas de virus más pequeño (Ritchie y otros, 1989; Tischer y otros, 1982). Se ha aceptado durante
un largo tiempo que el CAV pertenecı́a a los parvovirus. Si bien la mayor parte de los parvovirus son
virus con ADN de una sola hebra, poseen ADN lineal, un genoma más grande y probablemente asimismo
otra composición de polipéptidos vı́ricos.
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Breve descripción de la invención
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Se acepta en general que los componentes celulares involucrados en la replicación y transcripción de
un virus son solamente funcionales si el ADN tiene forma de doble hebra. Un virus que tenga ADN
circular con una sola hebra puede presentarse en una célula en una fase en la que consiste en ADN de
doble hebra. Los presentes inventores han utilizado este hecho.
Los presentes inventores han caracterizado el ADN de doble hilera de CAV con una longitud de 2,3
pares de kilobases en células 1104-X5 y MDCC-MSB1 infectadas con CAV y clonadas en plC-20H. El
ADN fue secuenciado por completo (ver figura 1). En una prueba de diagnóstico por medio de CAVADN clonado y marcado, se pudieron demostrar los ácidos nucleicos de CAV en preparados de cultivos
de virus, de hı́gado y de tejidos. Se observó que el CAV clonado tenı́a todas las caracterı́sticas biológicas
y patogénicas del CAV de tipo salvaje, tanto en cultivos de tejidos como en pruebas de animales.
Los experimentos PCR y de hibridación demostraron que el genoma completo clonado de CAV es
representativo de CAV real. Por medio de análisis Southern con sondas de ADN marcadas 32 P se demostró que todos los aislados reales contenı́an moléculas de ADN de 2,3 kb. Los análisis de enzimas de
restricción demuestran que el ADN de CAV clonado se corresponde con el ADN de los aislados reales. En
un ensayo de transferencia por zonas (“dot blot”) se demostró que con ADN clonado de CAV marcado
con digoxigenina se hibridiza especı́ficamente con ADN de los diferentes aislados reales. En experimentos
PCR utilizando oligonucleótidos cuya secuencia fue derivada de la secuencia de CAV clonado (figura 4)
se amplificó especı́ficamente o se reconoció ADN de CAV.
Descripción detallada de la invención
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La presente invención proporciona en un primer aspecto un método para la producción de Virus de
Anemia de Pollos en forma de doble hebra, comprendiendo las fases de aislar ADN de bajo peso molecular a partir de células infectadas de CAV, fraccionando dicho ADN de bajo peso molecular sobre
agarosa/bromuro de etidio, comparando dicho modelo de fraccionamiento con el modelo de fraccionamiento de la misma célula no infectada, aislando el ADN presente en la célula infectada solamente y
comprobando que se trata de ADN con doble hebra por análisis de enzimas de restricción.
Una realización preferente de la presente invención comprende un ácido nucleico recombinante que
comprende una secuencia nucleótida especı́fica de CAV que corresponde o que es complementaria con
la secuencia nucleótida mostrada en la figura 1, una secuencia nucleótida homóloga de aquélla, como
mı́nimo al 60 %, o una parte de la misma.
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Este aspecto de la invención consiste en un ácido nucleico seleccionado entre ADN y ARN, en cualquier manifestación posible, es decir, tanto en forma de ADN o ARN desnudo o en forma de ADN o ARN
acumulados de cualquier manera (es decir, en proteı́nas o en partı́culas de virus) o conectados con otra
materia (por ejemplo, con un portador o con un material que funcione como marcador). El ADN puede
ser un ADN de hebra única o de doble hebra y puede ser tanto lineal como de forma circular.
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Es caracterı́stica de los ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la invención, la presencia en
ellos de una secuencia nucleótida especı́fica de CAV. Esta secuencia especı́fica de CAV no necesita cubrir
todo el genoma de CAV y, desde un punto de vista práctico, solamente una parte especı́fica será necesaria
y deseable para la mayor parte de las aplicaciones.
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Una primera posibilidad preferente es una secuencia nucleótida especı́fica de CAV que se corresponde
o que es complementaria con una secuencia nucleótida que codifica para una proteı́na CAV y que se presenta en un genoma CAV o una parte del mismo. ADN recombinante que comprende dicha secuencia de
codificación puede ser utilizado, por ejemplo, para detectar el ARN del mensajero de CAV en una muestra
o puede ser utilizado, por ejemplo, dentro del ámbito de un proceso para la producción de proteı́nas de
CAV o partes del mismo. Las palabras “partes de la misma” en principio comprenden cualquier parte
que pueda ser designada como especı́fica de CAV. A nivel de las proteı́nas esto será un epı́topo para la
mayor parte de aplicaciones, es decir, un determinante antigénico reconocible por anticuerpos.
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Los ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la invención pueden comprender también una secuencia nucleótida no derivada de genoma de CAV. Esta “secuencia nucleótida no derivada de genoma de
CAV” puede ser formada, por ejemplo, por una secuencia nucleótida derivada de un vector de expresión
procariótica o eucariótica. De este modo, la invención comprende la posibilidad de una inserción de una
secuencia especı́fica de CAV en un vector (vı́rico o no vı́rico) apropiado para la expresión en organismos
eucarióticos o en un plásmido adecuado para su expresión en bacterias. Además, es también posible que,
como “secuencia nucleótida no derivada de genoma CAV”, los ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo
con la presente invención comprendan una secuencia nucleótida que no se presenta en el genoma CAV,
poseyendo una función reguladora.
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No obstante, los términos “secuencia nucleótida no derivada de genoma de CAV” puede consistir
también en una secuencia nucleótida que codifica para (parte de) una proteı́na distinta de proteı́na de
CAV, si el ADN recombinante se tiene que utilizar para producir una proteı́na hı́brida o proteı́na de
fusión en la que una proteı́na de CAV funciona como portadora para un epı́topo o una proteı́na que no
es CAV o, inversamente, una proteı́na que no es CAV funciona como portadora para un epı́topo de una
proteı́na CAV.
Si un ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención debe ser utilizado dentro del ámbito
de los procesos para detectar ADN o ARN complementarios en una muestra, puede ser necesaria la presencia de una etiqueta. Una etiqueta utilizada para estos propósitos es un marcador adecuado para su
utilización con ADN o ARN que posibilita o facilita la detección del ADN o ARN marcado. Las personas especializadas en la materia conocerán muchos tipos de marcadores adecuados para esta finalidad,
tales como radioisótopos (por ejemplo, 32 P), moléculas de enzimas (por ejemplo, peroxidasas), haptenos
(por ejemplo, biotina), substancias fluorescentes, tintes, pigmentos (por ejemplo, fósforos inorgánicos), y
marcadores en partı́culas (por ejemplo, partı́culas de oro o de selenio).
En un segundo aspecto la invención se refiere a la utilización de ácidos nucleicos recombinantes tal
como se ha definido anteriormente, en particular a efectos de diagnóstico, inmunización o vacunación o
para la producción de proteı́nas CAV o no CAV.
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Más particularmente se refiere, por ejemplo, a la utilización de ácidos nucleicos recombinantes de
acuerdo con la invención tales como sondas especı́ficas CAV o cebador en un proceso de detección de
ADN o ARN de CAV, por ejemplo en un proceso de transferencia por zonas (“slot blotting”) ADN/ARN,
transferencia Southern, transferencia Northern, hibridación in situ, amplificación de ADN por medio de
PCR, mapa S1 y extensión de cebador, extendiéndose asimismo la invención a un conjunto o juego de
diagnóstico para la detección de ADN o ARN de CAV en un proceso tal como transferencia por zonas
ADN/ARN, transferencia Southern, transferencia Northern, hibridación in situ, ampliación de ADN por
medio de PCR, mapa S1 o extensión de cebador, cuyo juego o conjunto de diagnóstico contiene información genética recombinante de acuerdo con la invención en forma de sonda o cebador especı́fico para
CAV.
La invención también se refiere a la utilización de ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la in4
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vención como vacuna de virus vivo para conseguir protección contra CAV u otro patógeno, extendiéndose
asimismo la invención a una preparación de vacuna para inmunización contra CAV u otro patógeno, cuyo
preparado comprende información genética recombinante de acuerdo con la invención y opcionalmente
uno o varios portadores y coadyuvantes adecuados para vacunas de virus vivos.
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La utilización de información genética recombinante de acuerdo con la invención en un proceso para
la producción de una proteı́na CAV, una parte de la misma por traslación in vitro o in vivo, queda
también comprendida en la invención. Lo mismo se puede decir de una célula procariótica o eucariótica
conteniendo información genética recombinante, tal como se ha definido anteriormente y, en particular, células procarióticas o eucarióticas capaces de expresar, como mı́nimo, una proteı́na o una parte de
proteı́na codificada por información genética recombinante de acuerdo con la invención. Estas diferentes
posibilidades se explicarán de manera extensa más adelante en esta descripción.
Un aspecto siguiente de la invención se refiere a una proteı́na de CAV o una parte de la misma obtenida por traslación in vitro de una información genética recombinante de acuerdo con la invención,
comprendiendo una secuencia nucleótida que codifica para la proteı́na de CAV o una parte de la misma,
ası́ como proteı́na CAV o parte de la misma obtenidas por aislamiento de una célula procariótica o eucariótica que contienen información genética recombinante de acuerdo con la invención, comprendiendo
una secuencia nucleótida que codifica para la proteı́na CAV o parte de la misma y que es capaz de su
expresión.
Asimismo, a nivel de proteı́nas, la invención se extiende a las diferentes aplicaciones, en particular,
en la utilización de una proteı́na o parte de proteı́na CAV de acuerdo con la invención a efectos de
diagnóstico, inmunización o vacunación o para la producción de anticuerpos especı́ficos CAV.
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Más en concreto, la presente invención comprende la utilización de una proteı́na CAV o parte de la
misma, tal como se ha definido anteriormente, como reactivo que une los anticuerpos especı́ficos CAV
en un proceso de inmunoensayo para detectar anticuerpos especı́ficos CAV, por ejemplo transferencia
de inmunoperoxidasa, ensayo ELISA o ensayo de inmunofluorescencia y, de manera correspondiente, un
equipo de diagnóstico para detectar anticuerpos especı́ficos de CAV en un proceso de inmunoensayo tal
como transferencia de inmunoperoxidasa, ensayo ELISA o de inmunofluorescencia, cuyo juego o equipo
de diagnóstico contiene una proteı́na o parte de proteı́na CAV de acuerdo con la invención como reactivo
que se une a anticuerpos especı́ficos de CAV.
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La utilización de una proteı́na o parte de proteı́na CAV, tal como se ha definido anteriormente, en
un proceso para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales especı́ficos de CAV, pertenece
también a las posibilidades comprendidas dentro del ámbito de la invención. Todas estas aplicaciones se
explicarán de manera más extensa a continuación, en la descripción.
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Ejemplos
Análisis de ADN de bajo peso molecular aislado de células infectadas por CAV.
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El genoma de CAV aislado a partir de un preparado de virus purificado se demostró que era una
molécula circular de hebra única de ADN con una longitud aproximada de 2300 bases (Todd y otros,
1990). La expectativa de los inventores era que en células infectadas con CAV también se presentaba
además de la molécula circular de hebra única de ADN del virus una molécula circular de doble hebra
de ADN de CAV. El ADN de doble hebra puede ser cortado con enzimas de restricción y, por lo tanto,
puede ser clonado de forma directa en contraste con ADN de hebra única. En vista de ello, se examinó si
en la fracción de bajo peso molecular de células infectadas con CAV se presentaba un producto de ADN
que no existı́a en células no infectadas.
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El ADN de bajo peso molecular fue aislado a partir de células MDCC-MSB1 y 1104-X5 infectadas
con CAV y a partir de células 1104-X5 no infectadas. El ADN fue fraccionado sobre un gel de agarosa/bromuro de etidio. Se apreció en el gel una banda muy débil de ADN con una longitud (medida)
de unos 3 pares de kilobases (kbp). Este producto de ADN especı́fico estaba ausente en el ADN aislado
de células no infectadas.
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En el experimento siguiente se hizo más probable que el ADN especı́fico se encontraba solamente
presente en las células infectadas con CAV. Se separó ADN aislado de células infectadas según longitud por medio de un gel de agarosa. Se aisló ADN con una longitud de 2,7-3,5 kbp. Esta fracción de
ADN tendrá que contener el ADN especı́fico del virus además de otro ADN celular. El ADN aislado fue
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marcado radioactivamente e hibridizado con transferencia Southern de un ADN de bajo peso molecular
procedente de células infectadas con CAV y procedente de células no infectadas. A la altura de 3 kbp
un producto de ADN hibridizó en las manchas de células infectadas con CAV, lo cual no existı́a en las
manchas de ADN de células no infectadas.
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La longitud de 3 kbp fue determinada con marcadores de ADN consistiendo en moléculas lineales de
ADN de doble hilera. El comportamiento de una molécula circular de ADN de doble hilera en un gel
de agarosa es distinto del de los fragmentos de ADN lineales. El ADN de 3 kbp procedente de células
infectadas con CAV podrı́a ser una forma lineal de ADN que, en realidad, tiene una longitud de 2,3 kbp.
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Si el ADN circular de doble hebra es digerido con una enzima de restricción que corta solamente una
vez en la molécula de ADN, se debe formar una molécula lineal de ADN poseyendo una longitud (medida)
de 2,3 kbp.
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Que esta suposición es correcta fue demostrado al incubar separadamente ADN de bajo peso molecular
aislado a partir de células infectadas 1104-X5 con CAV con seis distintas enzimas de restricción (BamHI,
EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, y XbaI). Un ADN de bajo peso molecular de transferencia Southern aislado
de células 1104-X5 infectadas con CAV y cortadas con las enzimas de restricción antes mencionadas fue
hibridizado con la anterior sonda de ADN marcada radioactivamente. Esto demostró que el tratamiento
con enzimas de restricción BamHI, EcoRI, PstI, y XbaI tenı́a como resultado una molécula de ADN con
una longitud medida de 2,3 kbp. El ADN de células no infectadas incubado con BamHI no contenı́a
este producto de ADN. La enzima de restricción HindIII cortó dos veces el ADN, mientras que Kpn1 no
provocó corte.
Se puede llegar a la conclusión de los experimentos anteriores que en células con ADN de bajo peso
molecular, infectadas con CAV, se presenta una molécula circular de ADN de 2,3 kbp que no existe en
células no infectadas y que éste es el genoma de CAV en forma de una molécula circular de ADN de doble
hebra.
El clonado y subclonado de ADN de CAV de doble hebra es un vector bacteriano.
Se incubaron separadamente células 1104-XS infectadas con CAV con ADN de bajo peso molecular,
con BamHI, BcoRI, PstI y XbaI. El ADN fue separado sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión.
De los cuatro preparados de ADN se aisló la molécula de ADN de 2,3 kbp. El vector de clonado plC-20H
fue digerido separadamente con las mismas cuatro enzimas de restricción con las cuales se efectuó el corte
del ADN de bajo peso molecular. El vector lineal fue tratado con “fosfatasa alcalina de intestino de
vaca”. Cada uno de los fragmentos de ADN de 2,3 kbp fue ligado en el correspondiente sitio de la enzima
de restricción de plC-20H. Los productos de ligado fueron transfectados en la cepa HB101 de E. coli. Los
cuatro clonados proporcionaron plásmidos que contenı́an ADN insertado con una longitud aproximada
de 2,3 kbp. Un análisis adicional de enzimas de restricción demostró que, como mı́nimo, 7 plásmidos
contenı́an el mismo fragmento de ADN. El lugar de integración del vector, no obstante, fue diferente a
causa de la utilización de diferentes enzimas para abrir la molécula circular. Por medio de las enzimas
de restricción BamHI EcoRI, PstI y XbaI, se determinó un mapa de enzimas de restricción de los cuatro
clones del ADN de CAV.
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Se marcaron radioactivamente cuatro “distintos” plásmidos de ADN de CAV y se hibridaron con
transferencias Southern de ADN digerido con BamHI aislado de células infectadas y no infectadas con
CAV. Todos los clones comprobados hibridaron solamente con la molécula de ADN de 2,3 kbp presente
en el ADN de las células infectadas con CAV.
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Actividad biológica de dos clones de ADN de CAV.
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Los dos clones plC-20H/CAV-EcoRI y plC-20H/CAV-PstI de CAV fueron digeridos con enzimas de
restricción de manera que el ADN del CAV fue cortado por completo con respecto al vector. Las moléculas
de ADN de CAV lineales fueron tratadas con T4 -ADN ligasa. Los ADN lineales de CAV fueron transformados de esta forma en circulares. El ADN de CAV “clonado” tenı́a ahora la forma circular de doble
hebra poseı́da también por el tipo salvaje de ADN de CAV en células infectadas. Se transfectaron células
MDCC-MSB1 y 1104-X5 con los ADN “clonados” circulares de CAV. Para el clon plC-20H/CAV-EcoRI se
observó un efecto citopatogénico (CPE) muy claro en ambos tipos de células. El clon plC-20H/CAV-PstI
provocó un CPE claro en células MDCC-MSB1 y un CPE menos claro en células 1104-X5. No obstante,
los sobrenadantes de células 1104-X5 transfectadas con plC-20H/CAV-PstI provocaron un CPE claro en
células MDCC-MSB1. Las transfecciones con ADN aislado de células infectadas con CAV provocaron
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también un CPE claro en células MDCC-MSB1, mientras que en células 1104-X5 se pudo apreciar un
CPE menos claro. No se obtuvo CPE después de transfección de células MDCC-MSB1 o 1104-X5 con el
ADN del vector plC-20H.
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Un análisis Southern mostró que en lisados de células MDCC-MSB1 y 1104-XS infectadas con virus
(paso 6), obtenidos por ADN de CAV clonado, se encontraba presente ADN de CAV.
Una prueba de neutralización con células MDCC-MSB1 mostró que el CPE provocado por el ADN
clonado en las células transfectadas era el resultado de infección CAV. Los anticuerpos neutralizantes
dirigidos contra el CAV impidieron el CPE de células MDCC-MSB1 infectadas con progenie CAV de
células transfectadas.
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Se inyectaron polluelos de un dı́a de edad por vı́a intramuscular con sobrenadante de células transfectadas. En el pollo, los sobrenadantes provocaron la misma imagen clı́nica que el CAV de tipo salvaje;
apareciendo crecimiento retardado de las diferencias en el peso corporal total, tuétano óseo pálido y valores reducidos del hematocrito (anemia), atrofia del timo (agotamiento de una población especı́fica de
células T) y mortalidad. Los sobrenadantes de células transfectadas con ADN del vector no provocaron
sı́ntomas de enfermedad en los polluelos de control.
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Análisis de secuencia del genoma de ADN de CAV de doble hebra.
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El genoma completo de doble hebra del ADN de CAV fue secuenciado por completo por medio del
método Sanger (Sanger y otros, 1977) y el método Maxam-Gilbert. Por medio de los cebadores de secuenciado M13 y M13-inverso, se determinó la secuencia ADN de aproximadamente 2100 bases de los
clones 4 plC-20H/CAV (BamHI, EcoRI; PstI; XbaI). A continuación el genoma del CAV fue subclonado.
De los cinco subclones distintos del genoma de ADN de CAV se determinó la secuencia de ADN por el
método de Sanger y por medio de los cebadores M13 y/o el método de Maxam-Gilbert. De este modo se
determinó la secuencia de ADN de ambas hebras del genoma de CAV.
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La longitud del ADN del CAV (doble hebra) es de 2319 bp. La primera base del sitio EcoRI del
genoma circular de CAV se numera +1. La secuencia de la hebra de ADN que contiene la mayor parte
de los marcos de lectura abiertos más grandes se muestra en la figura 1 y se denomina hilera (+). La
composición de las bases de esta hilera es: 25,5 % adenina, 28,7 % citosina; 27,7 % guanina, 18,1 % timina. Los estudios por ordenador de posibles homologı́as del genoma de CAV con secuencias de virus ya
conocidos mostraron que el ADN no habı́a sido descrito anteriormente y que no formaba parte de grupos
de virus descritos anteriormente. La hipótesis inicial de que el CAV es un parvovirus no es aceptable en
lo que respecta a la secuencia y forma del genoma del ADN de CAV (circular).
Por medio de estudios de ordenador se caracterizó la organización del genoma de CAV. Los marcos de
lectura abiertos, elementos promotores/intensificadores, la señal y lugar de poliadenilación y el “origen de
replicación” son objeto de predicción. La figura 2 muestra los marcos de lectura abiertos de predicción,
superando 300 bases, para ambas hebras de ADN del CAV. La figura 2A muestra los marcos de lectura
abiertos empezando con el codon ATG. El codon ATG es el codon de iniciación más frecuentemente
utilizado para las proteı́nas. Es notable que una de ambas hebras de ADN codifica para 3 proteı́nas que
tienen una longitud de 449 aminoácidos (51,6 kDA), 216 aminoácidos (24 kDa), y 121 aminoácidos (13,3
kDa). Todd y otros (1990) demostraron la existencia de una proteı́na de 50-kDa en el CAV purificado.
Si todos los marcos de lectura abiertos son realmente utilizados, aproximadamente el 80 % del genoma
del virus es trasladado a la proteı́na. Algunas regiones, incluso doblan. Es completamente posible que 3
marcos de lectura abiertos sean trasladados desde 1 ARN. El inicio de predicción de la molécula de ARN
se encuentra en la posición (354) y la poli(A) adición en la posición (2317). La única señal poli(A) se
encuentra en la posición (2287) de la hebra más.
55
Es improbable que los marcos de lectura abiertos sean utilizados en otra hebra de ADN porque esta
hebra carece de algunas secuencias de regulación esenciales. Las figuras 2B y 2C muestran marcos de
lectura abiertos utilizando respectivamente CTG y GTG como codon inicial. No obstante, se describe
solamente para algunas proteı́nas que estos codones iniciales son realmente utilizados (Hann y otros,
1988).
60
Los estudios mediante ordenador de similitudes entre las proteı́nas separadas de CAV y proteı́nas
ya conocidas proporcionaron solamente homologı́as limitadas en secuencias presentes en los programas
disponibles. De acuerdo con ello, es difı́cil predecir a que tipo de proteı́na se parecen las proteı́nas de
CAV. Una calificación relativamente alta fue la realizada por las proteı́nas cápsidas vı́ricas, de unión de
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ADN y de coagulación de la sangre. Los resultados no se indican en esta descripción.
5
La expresión de proteı́nas está regulada por elementos promotores/intensificadores (Jones, 1990). Un
promotor eucariótico está posicionado principalmente justamente antes del inicio del transcripto. La
secuencia de CAV contiene más arriba del lugar de terminación los elementos generales: secuencia TATA,
secuencia SP1 y secuencia CAAT. La secuencia y la posición de estas secuencias corresponde de manera
excelente a las descritas en la mayor parte de promotores eucarióticos (Tabla 1). Alrededor de la posición
(285) pueden existir lugares de unión para los diferentes factores de transcripción: CREB, MLTF, GT, y
PEA-1.
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Un gen eucariota contiene también elementos intensificadores que determinan la intensidad del intensificador eucariota. Son posibles elementos intensificadores las cinco repeticiones directas todas las cuales
tienen una longitud de 21 nucleótidos y que están situadas entre las posiciones (144) y (260). Todas
las repeticiones tienen 19 nucleótidos idénticos. Solamente los últimos dos nucleótidos son distintos. La
repetición (1) es idéntica con (2), y (3) es igual a (5). Las repeticiones (1), (2) y (3) están situadas una
al lado de la otra, igual que las (4) y (5). Situado entre las repeticiones (3) y (4) se encuentra una “fractura” de 12 nucleótidos. Un estudio por ordenador muestra que ningún intensificador descrito (eucariota)
contiene todas las secuencias encontradas para los probables elementos intensificadores de CAV. Todas
las repeticiones directas contienen un elemento ATF que puede ser involucrado en el incremento de la
transcripción de los ARN de CAV. Las repeticiones directas contienen dos veces la secuencia CATCC
y dos veces la secuencia CAGCC. La última secuencia se solapa con la secuencia CAAT. Estas cuatro
secuencias tienen solamente 1 falta de correspondencia con la secuencia CACCC descrita por β-globina
(Tabla 1).
La figura 3 muestra que aproximadamente entre las posiciones (55) y (135) y entre las posiciones
(2180) y (2270) de la hebra de ADN más se encuentran presentes estructuras en forma de horquilla del
pelo muy grandes en la forma de ADN (hebra única) de CAV. Las estructuras de horquilla de pelo en
el ADN pueden quedar involucradas en la replicación del ADN del CAV. Las estructuras de horquilla de
pelo entre las posiciones (2180) y (2270) pueden encontrarse presentes no solamente en el ADN del CAV
sino también en el ARN del CAV y es probable que jueguen un papel en la estabilidad del ARN del CAV.
Diferentes formas de ADN de células infectadas con CAV.
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Cuatro diferentes moléculas de ADN de CAV son visibles en una transferencia Northern de un preparado de ADN de células infectadas por CAV. El ADN fue hibridado con ADN marcado radioactivamente
del clon plC-20H/CAV-EcoRI. Las moléculas de ADN de CAV son, teniendo en cuenta sus longitudes
medidas y formas en un gel de agarosa no desnaturalizante y susceptibilidad a (s1) nucleasa, respectivamente cı́rculos abiertos de doble hebra (3 kbp), ADN de doble hebra superarrollado (2 kbp), ADN
de hebra única de forma circular (0,8 kbp) y ADN lineal de hebra única (1,5 kbp). En algunos casos,
el ADN de doble hebra lineal del CAV es también visible (2,3 kbp). Todd y otros (1990) han medido
una longitud de 0,8 kbp para el ADN de hebra única, circular, procedente de CAV aislado en base a la
movilidad electroforética en un gel de agarosa no desnaturalizante.
Detección del ADN de CAV en preparados de virus.
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Se aisló ADN total a partir de CAV y se purificó de acuerdo con el método descrito por Von Blow
(1989). El preparado de ADN fue analizado en un ensayo Southern y fue marcado con una sonda de ADN
de CAV conteniendo la totalidad de la secuencia de CAV clonada. El ADN aislado procedente de CAV
purificado contiene una molécula de ADN que tiene una longitud de 0,8 kbp, medida en un gel de agarosa
no desnaturalizante. En un análisis Southern de ADN aislado de CAV purificado con oligonucleótidos
derivados de la secuencia de ADN de CAV clonada como sondas, se demostró que la hebra de ADN menos
queda comprendida o encerrada en el virus. De esto se puede llegar a la conclusión de que el ADN de
hebra única del CAV de la cápsida es la hebra menos.
Análisis “Southern” de ADN procedente de aislamientos de CAV reales.
Se prepararon preparaciones de ADN procedentes de aislados de CAV obtenidos a partir de pollos
de grupos en los que se presentaba la enfermedad de Marek de modo extenso. Los preparados de ADN
procedentes de aislados de CAV obtenidos en 12 empresas de Holanda fueron recogidos de manera no
selectiva a partir de una colección de 60 muestras. Solamente en el caso de una empresa se informó de
una mortalidad más elevada debido a la enfermedad de Marek. Además, un aislado de CAV se originó
a partir de un grupo de cobayas. Los aislados de CAV examinados por los inventores se obtuvieron
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principalmente después de haber comprobado la atrofia del timo por examen por los Servicios Sanitarios
de Animales.
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Con el objeto de estudiar el grado de similitud entre ADN de CAV clonado (plC-20H/CAV-EcoRI)
y ADN de diferentes aislamientos reales de CAV se infectaron células MDCC-MSB1 con cepas de CAV
aisladas. Se realizó un análisis Southern. Todos los preparados de ADN contenı́an moléculas de ADN que
especı́ficamente hibridaban con ADN de CAV clonado marcado con 32 P. Las moléculas de ADN de los
diferentes aislamientos reales de CAV tienen longitudes que se corresponden con las del CAV clonado y
son de doble hebra o de hebra única. Los análisis de transferencia Southern llevados a cabo directamente
sobre muestras de tejidos de pollos infectados con CAV reales se observó que contenı́an moléculas de
ADN que hibridaban con plC-20H/CAV-EcoRI marcado.
Análisis de enzima de restricción de ADN procedente de aislamientos reales de CAV.
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La similitud de ADN de diferentes aislamientos reales de CAV con el genoma de CAV clonado fue
examinada adicionalmente por medio de análisis de enzima de restricción. Los preparados de ADN de
los aislamientos CAV y de CAV clonado se cortaron separadamente con siete enzimas de restricción. Las
enzimas BamHI, BgII, SstI, y XbaI demostraron el corte de todos los ADN de forma idéntica. El ADN de
la mayor parte de aislamientos reales contenı́a dos sitios AccI y dos sitios HindIII, mientras que el ADN
de solamente unos pocos aislamientos contenı́a el sitio EcoRI. La figura 5 resume los mapas de enzimas de
restricción del CAV clonado y los diferentes aislamientos reales. Para cada sitio de enzima de restricción
el número de aislamientos reales que contienen el sitio relevante se han indicado con corchetes.
Reacción de la cadena de polimerasa (PCR) de ADN de aislamientos reales de CAV.
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Los oligonucleótidos CAV-1 y CAV-2 (figura 4) derivados de la secuencia de ADN de CAV clonada
fueron sintetizados. Se llevó a cabo un PCR utilizando estos oligonucleótidos sintéticos para detectar
especı́ficamente ADN de CAV en la realidad. Se amplificaron ADN aislado de células MDCC-MSB1
infectadas con los diferentes aislamientos de CAV y ADN aislado de diferentes células no infectadas.
Después de la amplificación del ADN, el ADN fue separado electroforéticamente según longitud en un gel
de agarosa/bromuro de etidio. Una banda amplificada de 186 bp (es decir, el valor teórico esperado) era
visible en todas las muestras de ADN de células infectadas con diferentes aislamientos de CAV. La banda
especı́fica no se encontraba presente después de amplificación de ADN aislado procedente de células no
infectadas. Las bandas de ADN amplificadas de todos los aislamientos reales muestran una proporción
idéntica de emigración en el gel de agarosa. Este resultado implica que no hay grandes delecciones o
inserciones en esta parte del genoma de los diferentes aislamientos reales de CAV. Un análisis Southern
con el oligonucleótido CAV-3 (figura 4) marcado con 32 P mostró que el ADN amplificado en 186 bp es
especı́fico de CAV y que ninguna otra banda de ADN hibridiza con la sonda CAV-3.
Se examinó la susceptibilidad de detección del PCR de CAV. Se aisló ADN procedente de células
infectadas con CAV, se diluyó paso a paso, se amplificó y se analizó sobre un gel de agarosa/bromuro
de etidio. Después de amplificación de las muestras conteniendo una cantidad de ADN correspondiente
a la cantidad de ADN aproximadamente en 100 células infectadas con CAV, se detectó un fragmento de
ADN de 186 bp especı́fico de CAV. No obstante, si el ADN amplificado era sometido a análisis Southern
con ADN de CAV-3, marcado con 32 P, se encontraba una cantidad de ADN correspondiente al ADN de
la célula I dando como resultado una banda de ADN especı́fica de CAV claramente visible. El PCR de
CAV es un método de detección muy sensible que es especı́fico para los aislamientos de CAV examinados
hasta este momento.
El análisis de transferencia por ranura (“slot”) de ADN de aislamientos reales de CAV son sondas de
ADN de CAV marcado con digoxigenina.
Además del PCR, se desarrolló un ensayo para la detección de ADN de aislamientos reales de CAV.
Esta prueba no utiliza sondas radioactivas. El inserto de ADN de CAV del clon plC-20H/CAV-EcoRI fue
marcado con preparados de 11-dUTP-dioxigenina. Preparados de ADN procedentes de células MDCCMSB1, infectadas separadamente con los diferentes aislamientos de CAV, fueron transferidos sobre un
filtro y analizados en cuanto a su capacidad de hibridar con la sonda de ADN marcada con digoxigenina.
Los preparados de ADN procedentes de células MDCC-MSB1 infectadas con los diferentes aislamientos
de CAV hibridizan con la sonda de ADN marcada con digoxigenina, mientras que el ADN de cultivos
celulares no infectados no hibridiza. Esta prueba utilizando un ADN de CAV marcado no radioactivamente es apropiado, por lo tanto, para la detección de ADN de aislamientos reales de CAV.
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Aplicaciones
ADN.
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Secuencias de CAV de, por ejemplo, el plásmido plC-20H/CAV-EcoRI ADN o parte del mismo, se
pueden utilizar para demostrar ADN de CAV y/o ARN en preparados a examinar, para objetivos de
investigación y diagnóstico. El ADN puede ser marcado radioactivamente o de otras formas, por ejemplo,
con biotina/digoxigenina. Por medio de transferencias “slot” ADN/ARN, análisis Southern/Northern e
hibridación in vitro, se puede determinar la presencia de ácidos nucleicos de CAV. Partes de las secuencias
de CAV utilizadas en este caso son también oligómeros de ADN.
Los oligómeros derivados de secuencias de CAV del clon plC-20H/CAV-EcoRI se pueden utilizar en
una “Reacción en Cadena de Polimerasa” para localizar concentraciones muy reducidas de ADN/ARN
de CAV. El PCR es un método muy sensible, frecuentemente utilizado para la detección de virus.
15
Son posibles en la práctica juegos de diagnóstico basados en las aplicaciones anteriormente indicadas.
20
Para objetivos de investigación son importantes técnicas tales como mapas (S1) y extensión de cebador con fragmentos de ADN de CAV. Mediante estos dos métodos se puede cuantificar y caracterizar
adicionalmente el ARN del CAV.
Se pueden estudiar oligómeros en configuración antisentido para estudiar las funciones de los genes.
Éstos pueden servir también como modelo para estudiar nuevos métodos de inhibición de la replicación
de virus.
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Se puede utilizar ADN de CAV como portador en la transfectación para pequeños fragmentos de
genes, particularmente si las caracterı́sticas patogénicas han sido eliminadas por delección en el genoma
de CAV.
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Los oligómeros de CAV en configuración antisentido se pueden expresar en vectores del virus, lo cual
posibilita el estudio de la replicación CAV u otras funciones de los genes en animales vivos o in vitro.
ARN
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Fragmentos de ADN de CAV clonados en vectores Sp6/T7 tienen como resultado productos de ARN
de CAV. Los ARN de CAV obtenidos por transcripción in vitro se pueden utilizar para sı́ntesis in vitro/in
vivo de proteı́nas de CAV. De este modo, moléculas de ARN, por ejemplo, en un extracto de germen
de trigo, se pueden trasladar en proteı́nas (traslación in vitro). Las proteı́nas de CAV obtenidas por
una traslación in vitro pueden ser utilizadas a continuación, por ejemplo, para el trazado o detección
de anticuerpos dirigidos contra CAV en el suero de pollos (ver más adelante). Las moléculas de ARN
de CAV pueden asimismo ser forzadas hacia adentro de células por microinyección para su traslación en
su interior en proteı́nas. De este modo, los efectos de las proteı́nas de CAV se pueden estudiar a nivel
celular. También se pueden analizar las interacciones proteı́na/proteı́na y/o proteı́na/ADN.
45
También se pueden utilizar los ARN de CAV como sondas para detectar ácidos nucleicos de CAV
en los preparados. Los análisis pueden ser llevados a cabo por medio de transferencia “slot”, análisis
Southern, Northern e hibridación in situ. Estos métodos pueden ser utilizados para desarrollar pruebas
de diagnóstico para CAV.
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Proteı́nas
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Todas las proteı́nas de CAV pueden ser expresadas en sistemas procariotas o eucariotas. Esto requiere
que los marcos de lectura abiertos que se han encontrado, sean clonados con un vector de expresión adecuado. Para el sistema bacteriano existe un vector de expresión basado en el promotor (T7) adecuado
para la expresión de marcos de lectura abiertos de CAV. El sistema de baculovirus, levadura y el sistema
CHO-dhfr son posibles sistemas de expresión eucariota. También se pueden escoger para ello vectores
virales, tales como vectores de retrovirus.
Las proteı́nas de CAV o epı́topos situados en las mismas pueden ser utilizados para detectar anticuerpos dirigidos contra CAV. Ası́ pues, se pueden detectar pollos infectados con CAV. Las proteı́nas de CAV
o epı́topos situados sobre las mismas se pueden utilizar en inmunoensayos, tales como transferencias por
inmunoperoxidasa, ensayos ELISA y ensayos de inmunofluorescencia.
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Las proteı́nas de CAV o epı́topos situados sobre las mismas pueden ser utilizados para proporcionar
inmunidad humoral y/o relacionada con las células contra CAV. Las proteı́nas de CAV obtenidas por
expresión en sistemas eucariotas y procariotas vector/huésped pueden ser utilizadas para su utilización
en vacunas de subunidades.
Por medio de las proteı́nas de CAV o epı́topos situados sobre aquéllas, se pueden obtener anticuerpos
especı́ficos de CAV que posibilitan el trazado de proteı́nas de CAV en preparados de pollos infectados
con CAV (ver más adelante).
10
Anticuerpos
15
En una serie de pruebas de infección en polluelos se pudo confirmar que algunos anticuerpos maternos
pueden proporcionar una protección pasiva efectiva contra la infección por CAV. Los anticuerpos maternos fueron transmitidos a los polluelos por vı́a natural y también por medio de inyección de polluelos
recién nacidos con anticuerpo de CAV conteniendo extractos de yema de huevo. También se consiguió
protección pasiva contra infección por CAV por inyección de extractos de yema de huevo de huevos procedentes de ponedoras que habı́an sido infectadas por CAV justamente antes del perı́odo de puesta de
huevos.
20
La vacunación de ponedoras con proteı́nas CAV expresada en uno de los sistemas de expresión anteriores tendrá como resultado la formación de anticuerpos maternos. Los pollos jóvenes de estas ponedoras
serán protegidos contra infección por CAV.
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Se pueden desarrollar pruebas de diagnóstico en base a los anticuerpos contra CAV. Se pueden utilizar
tanto cuerpos policlonales como monoclonales para ello. Por medio de los anticuerpos especı́ficos CAV
se pueden examinar preparados para la presencia de proteı́nas de CAV.
Las aplicaciones antes mencionadas de los anticuerpos de CAV son posibles para los anticuerpos de
acuerdo con la invención, obtenidos por procesos tal como se han descrito, de igual manera que para
anticuerpos de CAV naturales.
Vacunas contra virus vivos.
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Dotando al sistema inmune de proteı́nas vı́ricas por medio de un vector de virus vivo, existen probabilidades de una respuesta inmune mejor que una vacuna subunitaria. Uno o varios marcos de lectura
abiertos de CAV (en todo o en parte) pudieron ser clonados en vectores de virus vivos. En las aves se
pueden utilizar solamente vectores de virus vivos que, en sı́ mismos, muestran una buena aplicación en
el sistema aviar. Se pueden escoger como vectores para aplicación en los pollos, por ejemplo, el virus de
la viruela de las aves, vectores retrovı́ricos, vectores de herpesvirus (serotipos de herpesvirus aviares 1,
2 y 3) y virus de la laringotraqueitis infecciosa y posiblemente también adenovirus tales como CELO.
La inmunización con vectores de virus vivos tal como se han indicado protege contra CAV y el virus
portador.
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Por aplicación de una o más deleciones en el genoma de CAV se pueden desarrollar vacunas que
inmunizan contra infección por CAV en polluelos jóvenes. Cuando se aplican las deleciones el carácter
patogénico de la infección por CAV debe ser eliminado pero las caracterı́sticas replicantes y, por lo tanto
inmunizantes, deben ser conservadas.
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55
El genoma de CAV puede ser transformado por sı́ mismo como vector de virus vivo para la expresión
de antı́genos de otros virus. Esto requiere que el genoma de CAV sea cambiado de manera tal que además
o en vez de las proteı́nas CAV se expresen virus de proteı́nas “extraños”. Los vectores de CAV pueden
ser construidos por lo tanto de manera tal que tiene lugar la protección contra virus “extraños” sola o
asimismo contra CAV, dependiendo de la expresión de las proteı́nas vı́ricas por el vector recombinante
en el animal vacunado.
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Las vacunas de CAV producidas en forma de vacuna subunitaria, una vacuna de deleción o un fragmento de gen en otro vector de virus se utilizarán principalmente para la vacunación de ponedoras. No
obstante, la vacunación de pollos de poca edad, por ejemplo en combinación con vacunación contra la
enfermedad de Marek, sigue siendo también una utilización posible de la invención.
Elementos intensificador/promotor.
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Los elementos promotores e intensificadores de CAV pueden ser clonados en vectores de ADN. Bajo
la regulación del promotor/intensificador de CAV, se pueden expresar proteı́nas de CAV o proteı́nas “extrañas” en células de pollos y en otros tipos de células.
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Se puede concebir que el promotor de CAV está constituido por células de tuétano de hueso funcionales (en pollos). Como sistema modelo para terapia de genes las proteı́nas “extrañas” pueden ser
expresadas in vitro en células de tuétano óseo por medio de elementos promotores/intensificadores de
CAV opcionalmente en combinación con vectores retrovı́ricos. Las células genéticamente modificadas de
tuétano de hueso pueden ser entonces transplantadas al tuétano de hueso o, en el caso presente, al pollo.
Para fragmentos de gen muy pequeños, el propio genoma de CAV puede ser utilizado como vector.
Los elementos intensificador/promotor de CAV podı́an ser también activos en otros organismos. Si
éste fuera el caso, los elementos pueden ser también utilizados, por ejemplo, en el sistema de ratón como
modelo para terapia de gen.
Los productos del propio CAV objeto de regulación del promotor de CAV de la propia solicitante u
otro promotor proporcionan asimismo posibilidades para estudiar y desarrollar técnicas para la terapia
de genes.
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La posibilidad de utilizar el genoma completo de CAV de manera entera o substancialmente entera
como vector de clonado, es decir, como un tipo de plásmido eucariota para sistemas aviares, es una posibilidad a considerar de modo real teniendo en cuenta la estructura que se ha descubierto para el genoma
de CAV.
25
Depósito del clon de CAV plC-20H/CAV-EcoRI
30
Un preparado en glicerol de células de HB101 transformadas con el plásmido plC-20H/CAV-EcoRI
fue depositado en el Centraalbureau voor Schimmelcultures de Baarn, Holanda, en 7 de septiembre de
1990, con el número CBS 361.90.
Descripción de las figuras
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La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del ADN de CAV clonado. La longitud total es de
2319 bases, tomándose el primer G del sitio EcoRI como N◦ 1.
La figura 2 muestra los cuadros de lectura abiertos de predicción (ORF) que tienen una longitud de
más de 300 bases para ambas hebras de ADN. Los ORF de predicción para los 3 codones distintos de
inicio ATG, CTG y GTG están indicados en las 3 subfiguras 2A, 2B y 2C, respectivamente.
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La figura 3 muestra algunas estructuras en horquilla de pelo de predicción del genoma de CAV que
consisten en ADN de hebra única.
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La figura 4 muestra los oligonucleótidos utilizados en el PCR. Se han mostrado la secuencia de ADN
y la posición de los oligonucleótidos del genoma de CAV. La posición de los nucleótidos en el genoma de
CAV corresponde al mostrado en la figura 1.
La figura 5 muestra el mapa de enzima de restricción del ADN de CAV clonado. Se han indicado
dentro de corchetes el número de aislamientos de CAV para un total de 21 poseı́dos por lugares de enzima
de restricción relevantes en el genoma.
Materiales y métodos
Cultivos de células y virus.
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Los aislamientos de CAV fueron cultivados en lı́neas celulares linfoblastoides transformadas procedentes de tumores de pollos inducidos por el virus de la leucosis aviar del subgrupo A(1104-X-5) o por el virus
de la enfermedad de Marek (MDCC-MSB1). Los cultivos de células fueron infectados con 0,1-1 TCID50
aproximadamente por célula. Después de dos dı́as las células fueron recogidas. Las células fueron infectadas con una progenie de virus de ADN de CAV clonado o aislamientos reales. El CAV-Cux-1, aislado
originalmente en Alemania a partir de un grupo de pollos que estaban afectados por la enfermedad de
Marek (Von Blow y otros, 1983, 1985), fue proporcionado por Dr. M.S. McNulty, Veterinary Research
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Laboratories, Belfast, Irlanda del Norte. En Enero de 1988, el Dr. J. P. Roseberger, Universidad de
Delaware, Newark, USA, envió a los inventores dos muestras de sangre para la determinación de la virulencia de la enfermedad de Marek cepa T-1704 y su derivada, MDV-Del-S que es el primer paso en
un pollo. Los inventores obtuvieron los aislamientos CAV-T-1704 y CAV-Del-S procedentes de polluelos
SPF infectados con la cepa MDV T-1704 y su derivado MDV-Del-S. Los aislamientos de CAV holandés
fueron seleccionados aselectivamente a partir de una serie de sesenta, todos los cuales fueron cultivados
en cultivos celulares MDCC-MSB1. El material de campo fue suministrado por J.C. van den Wijngaard,
Gezondheidsdienst Brabant en Boxtel y J. Naber, Gezondheidsdienst voor Pluimvee en Doorn, principalmente porque se determinó atrofia del timo durante la autopsia. Se añadieron a la serie los aislamientos
de CAV obtenidos de nuestros propios grupos de aves SPF.
Aislamiento de ADN total.
15
Se resuspendieron virus y preparados de hı́gado en 20 mM Tris HCl-pH 7,5, 2mM EDTA, 0,2 % SDS,
0,6 mg/ml Proteinase-K y se incubó durante 1 hora a 37◦C. Los preparados fueron extraı́dos con fenolcloroformo-alcohol isoamı́lico (25:24:1), y el ADN fue precipitado por medio de etanol. Las pastillas de
ADN fueron resuspendidas en 100 µl 10mM Tris HCl-pH 7,5, 1 mM EDTA.
Extracción y análisis de ADN de bajo peso molecular.
20
25
Se aisló ADN de bajo peso molecular de células infectadas por CAV 1104-X5 y MDCC-MSB1 y células
1104-X5 no infectadas, de acuerdo con el método descrito por Hirt (1967). El ADN fue separado sobre
geles de agarosa y después de tintado con bromuro de etidio, se analizó directamente por medio de luz
UV o fue transferido sobre un filtro Biotrace de acuerdo con el método descrito por Southern (1982). Las
transferencias fueron hibridadas con ADN con cebado al azar marcado con 32 P, aislado a partir de ADN
de bajo peso molecular de células 1104-X5 infectadas por CAV que tienen una longitud de 2,7-3,5 kb.
Clonado del ADN de CAV.
30
La totalidad del genoma de ADN del CAV fue clonado en el vector bacteriano plC-20H. Se clonaron
partes del genoma de ADN de CAV en el vector plC-19R. Todas las fases de clonado de ADN plásmido
fueron llevadas a cabo en principio de acuerdo con los métodos descritos por Maniatis y otros (1982).
Análisis de secuencia de ADN de CAV.
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Se purificaron plásmidos de ADN de CAV por medio de gradiente CsC1 y Sephacryl-S500 (pharmacia)
por cromatografı́a. Se secuenció el ADN de doble hebra por medio de la T7 DNA polimerasa (Pharmacia)
o por medio de Taq DNA polimerasa (Promega). Ambos métodos fueron llevados a cabo de acuerdo con
las instrucciones proporcionadas por Pharmacia o Promega. Los oligonucleótidos fueron quinados con T4
nucleótido quinasa de Pharmacia. Se secuenciaron “paradas bruscas” (“Strong stops”) de acuerdo con el
método descrito por Maxam and Gilbert (1977).
Circularización del genoma del ADN de CAV clonado.
45
10 µg de plásmido de ADN de clones que contienen el genoma completo de ADN de CAV fueron
digeridos con enzima de restricción de manera que se separó la totalidad del inserto de ADN de CAV del
vector ADN. El tratamiento de T4 -ADN ligasa de la molécula de 2,3 pares de kilobases de molécula de
ADN de CAV lineal tuvo como resultado un ADN de CAV circular de doble hebra. Los productos de
ligado fueron analizados sobre 0,8 % de gel de agarosa.
50
Transfección de DEAE-dextrano
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Para la transfección de células 1104-X5 y MDCC-MSB1 se suspendieron 2 µg de ADN de CAV religado dos veces en 25 µl de agua Milli-Q y se mezclaron con 260 µl de tampón TBS. Se añadieron 15 µl 10
mg/ml DEAE-dextrano a la mezcla de ADN, y la mezcla fue incubada durante 30 minutos a temperatura
ambiente.
Células 1104-X5. Una placa de cultivo de tejidos de 50 mm con 1-2x106células 1104-X5 placa fue lavada dos veces con tampón TBS. El tampón TBS fue eliminado por completo de la monocapa de células,
y se añadieron 300 µl de DEAE-dextrano/ADN en forma de dilución. Las células fueron incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla DEAE-dextrano/ADN fue substituida por 2 ml
25 % DMSO/TBS, y la monocapa de células fue incubada durante 2 minutos a temperatura ambiente.
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Las células fueron lavadas dos veces con tampón TBS y, a continuación, se añadió el medio de cultivo de
los tejidos (RPMI 1640 o E-MEM). Las células fueron incubadas a 37◦C-5 % CO2 .
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Células MDCC-MSBI. Se centrifugaron aproximadamente 2x106 células MDCC-MSB1 a 1500 rpm en
una centrı́fuga de mesa. El medio fue substituido por 5 ml de tampón TBS y las células fueron resuspendidas cuidadosamente. La etapa de lavado fue repetida. Todo tampón TBS fue eliminado, la pastilla
de células fue resuspendida cuidadosamente en 300 µl de mezcla de DEAE-dextrano/DNA y se incubó
a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 0,5 ml 25 % DMSO/TBS y la suspensión fue
incubada durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 ml de TBS y las células fueron
centrifugadas a 1500 rpm en una centrifugadora de mesa. El sobrenadante fue eliminado y se añadieron
50 ml del medio de cultivo del tejido. Las células fueron resuspendidas y separadas por centrifugación.
Las células fueron recibidas en 5 ml de medio de cultivo de tejidos e incubadas a 37◦ C-5 % CO2 . A modo
de control se utilizaron para la transfección 2 µg plc-20H plásmido.
Prueba de neutralización in vitro.
Se infectaron células MDCC-MSB1 con sobrenadante de MDCC-MSB1 y se transfectaron células
1104-X5 con “ADN de CAV” clonado. Se infectaron aproximadamente 2 x 104 células. El contenido
de virus de este inóculo no era exactamente conocido. En la mitad de los cultivos de células infectados
se añadieron al medio suero policlonal con una actividad de neutralización dirigida contra CAV, diluido
1:100. A modo de control, una serie de “pozos” con células de MSB1 infectadas con CAV fueron incluidos
en el proceso, no añadiéndose al medio antisuero alguno contra CAV.
Infección por CAV de polluelos de un dı́a de edad.
25
30
35
40
45
Se inyectaron por vı́a intramuscular en polluelos de un dı́a de edad sobrenadantes de ADN de CAV
y células MDCC-MSB1 1104-X5 transfectadas con ADN de control. Seis dı́as después de la infección se
llevó a cabo una autopsia en 5 polluelos por grupo, después de haber determinado en primer lugar el
valor del hematocrito y el peso corporal total. Para aislamiento del virus y para inmunohistoquı́mica,
se recogieron sangre en heparina, timo y tuétano óseo. La investigación de inmunohistoquı́mica tuvo
lugar por medio de tinción de peroxidasa de secciones de timo con, entre otros, el CV1-85.1 monoclonal
especı́fico de CAV. Catorce y veintiocho dı́as después de la infección se llevó a cabo una autopsia de otros
5 polluelos y se llevaron a cabo todas las determinaciones anteriormente indicadas.
Reacción en cadena de polimerasa (PCR).
Los oligonucleótidos fueron sintetizados por medio de un sintetizador de ADN tipo Ciclón (Biosearch
Inc. USA). La secuencia fue derivada de la secuencia de ADN de CAV mostrada en la figura 1. El
PCR fue aislado en ADN procedente de células MDCC-MSB1 infectadas y no infectadas con CAV. La
concentración final de los reactivos fue: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HC` (pH 8,3), 3mM MgCl2 , 0,01 % de
sero albúmina de vaca, 200 µM de cada uno de dNTP, 1 µM de cada uno de los oligonucleótidos y 2
unidades de Tag-ADN polimerasa (CETUS, USA) en un total de 100 µl. Las muestras de ADN fueron
incubadas cı́clicamente 30 veces a 93◦ C durante 1 minuto, a 55◦ C durante 1 minuto y a 72◦ C durante
3 minutos en un ciclizador térmico Perkin Elmer/Cetus. Una decena parte del ADN amplificado fue
directamente analizado sobre un gel al 2 % de agarosa/bromuro de etidio o por análisis de transferencia
Southern. La sonda de ADN utilizada fue el oligonucleótido que se habı́a marcado de forma terminal con
32
P de acuerdo con Maniatis y otros (1982).
Análisis de transferencia por puntos (“dot blot”)
50
55
El inserto de ADN de CAV de plC-20H/CAV-EcoRI fue aislado y marcado con digoxigenina-11-dUTP
(Boehringer, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del suministrador. Se saturaron filtros
Blotrace-RP con 1,5M NaCl y 0,15 M de citrato sódico. Las muestras de ADN fueron resuspendidas en
10 mM Tris HCl (pH 7,5) y 1 mM EDTA, hervidas durante 3 minutos, enfriadas sobre hielo y colocadas
sobre el filtro. El filtro fue secado a temperatura ambiente e incubado durante 30 minutos a 65◦ C. Los
filtros fueron hibridados con ADN marcado con digoxigenina. El ADN marcado con digoxigenina se hizo
visible por medio de tinción inmunológica de acuerdo con el protocolo del suministrador.
60
14
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TABLA 1
Elementos de la secuencia de unión del factor de transcripción conocido en la región
amplificadora/promotora de CAV
5
10
15
20
25
30
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Elemento
Secuencia
de consenso
Secuencia de
CAV
Posición en la
secuencia de CAV
-TATA-#
SP1
CREB
PEA-I(P y)
GT(SV 40)
MLTF
CCAAT-TF
-CACCC-#
ATF
-CACCC-#
ATF
SPI(weak)
ATF
-CACCC-#
ATF
-CACCC-#
ATF
GTATAA/t AA /T
GGGCGG
TGACGTCA
GGAAGTGACTAAC
GG /C TGTGGAAA/T GT
GGCCACGTGACC
AGCCAAT
CACCC
ACGTCA
CACCC
ACGTCA
GTATATAT
GGGCGG
TGACGTTT
GAAAGTGACTTTC
CGTTGCGAAAGT
TGCCACTGTCGA
AGCCAAT
CAGCC
ACGTCA
CAGCC
ACGTCA
GAGGCG
ACGTCA
CATCC
ACGTCA
CATCC
ACGTCA
321-330+
305-310+
290-297
286-298
279-290
274-285
260-266+
259-263
253-258+
236-240
232-237+
209-214
199-204+
182-186
178-183+
161-165
157-162+
ACGTCA
CACCC
ACGTCA
CACCC
ACGTCA
- el sitio CAP se encuentra probablemente a unos 350
+ perfecta homologı́a entre CAV y secuencia de consenso
se ha encontrado secuencia de consenso en varios virus
35
# secuencia de ADN de un elemento
Referencias
40
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50
55
60
16
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REIVINDICACIONES
5
1. Método para la producción de virus de anemia de pollos (CAV) en forma de doble hebra, comprendiendo las fases de aislar ADN de bajo peso molecular procedente de células infectadas por CAV,
fraccionamiento de dicho ADN de bajo peso molecular sobre agarosa/bromuro de etidio, comparación
de dicho modelo de fraccionado con el modelo de fraccionado de la misma célula no infectada, aislando
el ADN presente solamente en la célula infectada y comprobando que este ADN es de doble hilera por
análisis de enzima de restricción.
10
2. Ácido nucleico recombinante en forma de una molécula de ADN de doble hebra, que comprende
una secuencia de nucleótidos especı́fica del virus de anemia del pollo (CAV) que se corresponde con la
secuencia de nucleótido del genoma de CAV o una parte del mismo, que se puede obtener por un método
según la reivindicación 1.
15
3. Ácido nucleico recombinante, que comprende una secuencia de nucleótidos especı́fica de CAV,
que corresponde o es complementaria como mı́nimo a una parte especı́fica de CAV de la secuencia de
nucleótidos mostrada en la figura 1, una secuencia de nucleótidos homóloga de aquélla en un mı́nimo de
60 %, que se puede obtener por un método según la reivindicación 1.
20
4. Ácido nucleico recombinante, según la reivindicación 2 ó 3, que comprende una secuencia de nucleótidos especı́fica de CAV que se corresponde o es complementaria de una secuencia de nucleótidos que
se presenta en un genoma de CAV, de manera que dicha secuencia de nucleótidos codifica para, como
mı́nimo, una parte de una proteı́na de CAV.
25
5. Ácido nucleico recombinante, según las reivindicaciones 2-4, que comprende además una secuencia
de nucleótidos derivada de un vector procariótico o eucariótico.
30
6. Ácido nucleico recombinante, según las reivindicaciones 2 - 5, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteı́na distinta de una proteı́na de CAV o una secuencia de
nucleótidos que codifica para una parte de dicha proteı́na distinta.
7. Ácido nucleico recombinante, según las reivindicaciones 2-6, que comprende una secuencia de nucleótidos que no se presenta en el genoma de CAV que tiene una función reguladora.
35
40
8. Ácido nucleico recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 3-7, marcado
con uno o varios marcadores adecuados para el marcado de ácidos nucleicos tales como radioisótopos,
moléculas de enzimas, haptenos, substancias fluorescentes, tintes, pigmentos y marcadores en partı́culas.
9. Utilización del ácido nucleico recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, como
sonda especı́fica de CAV o cebador en un proceso de detección de ADN o ARN de CAV.
10. Equipo de diagnóstico para detectar ADN o ARN de CAV que contiene ácido nucléico recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 2-3 como sonda o cebador especı́fico de CAV.
45
11. Célula procariótica o eucariótica, que contiene un ácido nucleico recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 2-9.
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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