Ana´lisis PCR cuantitativo de ADN, ARN y

Clinical Chemistry 58:12
1682–1683 (2012)
Medicina basada en la evidencia y la utilización de prueba
Análisis PCR cuantitativo de ADN, ARN y proteı́nas en la
misma célula única
Anders Ståhlberg,1,2* Christer Thomsen,1 David Ruff,3 y Pierre Åman1
ANTECEDENTES: La célula única representa la unidad
básica de todos los organismos. Si bien se han realizado
diversas investigaciones en grandes poblaciones celulares, para entender la dinámica y la heterogeneidad de
las células es preciso analizar la célula única. Los métodos actuales para el análisis de células únicas generalmente pueden detectar solo una clase de analitos.
La transcripción inversa y la prueba de ligadura de proximidad se complementaron con el análisis
PCR cuantitativo y se usaron para cuantificar cualquier
combinación de ADN, mARN, micro ARN (miARN),
ARN no codificantes (ncARN) y proteı́nas de la misma
célula única. El método se usó en células humanas
transfectadas transitoriamente para determinar las
concentraciones intracelulares de plásmidos, sus
mARN transcritos, proteı́nas traducidas y objetivos de
ARN en la circulación.
nera resultados para el mismo parámetro de todos los
analitos medidos, una caracterı́stica que facilita el
análisis comparativo de datos. Este enfoque podrı́a ofrecer nuevas opciones en el diagnóstico molecular de estudios de correlación detallados sobre diferentes y diversas clases de analitos al nivel de la célula única.
© 2012 American Association for Clinical Chemistry
MÉTODOS:
RESULTADOS: Desarrollamos una solución amortiguadora de lisis en células completas para liberar proteı́nas,
ARN y ADN no fragmentados que no pudieran degradar ningún analito detectable ni inhibir el ensayo. El
rango dinámico, la sensibilidad analı́tica y la especificidad para la cuantificación de ADN, mARN, miARN,
ncARN demostraron precisión al nivel de la célula
única. Los estudios de correlación demostraron que las
concentraciones intracelulares de plásmidos y sus
mARN transcritos se correlacionaron solo en forma
moderada con concentraciones de proteı́na traducida
(coeficiente de correlación de Spearman, 0.37 y 0.31,
respectivamente; P ⬍ 0.01). Además, un gen expresado
ectópicamente afectó las correlaciones entre analitos y
este gen, lo que está relacionado con la regulación de
genes.
CONCLUSIONES: Este método es compatible con la
mayorı́a de los enfoques de muestreo de células y ge-
1
Departamento de Patologı́a, Centro Sahlgrenska de Cáncer, Universidad de
Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia (Department of Pathology, Sahlgrenska Cancer Center, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden); 2 Biocentro
TATAA, Gotemburgo, Suecia (TATAA Biocenter, Gothenburg, Sweden); 3 Biosistemas Aplicados, Tecnologı́as como Parte de la Vida, (Applied Biosystems, Part
of Life Technologies) Foster City, CA.
* Dirigir correspondencia para el autor a: Sahlgrenska Cancer Center, Department
of Pathology, University of Gothenburg, Box 425, SE-40530 Gothenburg, Sweden. Fax ⫹46-31-828733; correo electrónico: [email protected].
1682
Las células de órganos y tejidos actúan en estrecha relación entre ellas. Si bien pueden ser idénticas morfológica y genéticamente, las células pueden responder
a estı́mulos en conjunto o individualmente. Hay estudios que demuestran que las células individuales exhiben diferentes perfiles de expresión de transcripciones
y proteı́nas, aún en poblaciones aparentemente homogéneas (1–3 ). Las cantidades moleculares fluctúan en
células individuales para producir respuestas únicas a
señales moleculares que conducen a distintos caminos
de desarrollo y diferenciación celular (2, 3 ). Los flujos
de trabajo experimental para la caracterización de respuestas celulares habitualmente usan grandes cantidades de células para alcanzar los umbrales de detección de sistemas analı́ticos. Dichos experimentos solo
brindan información sobre el comportamiento común
de células en las poblaciones. Se necesitan nuevos métodos analı́ticamente sensibles que puedan detectar y
cuantificar las pocas moléculas presentes en las células
únicas para comprender las funciones de las células
únicas y su interacción en tejidos y organismos.
Los informes recientes han destacado nuevos enfoques para el análisis de diferentes analitos al nivel de
célula única in vivo, in situ y en solución (4, 5 ). Por
ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (RTqPCR)4 se aplicó correctamente para medir mARN (6 –
11 ) y micro ARN) (12 ) al nivel de célula única. Las
Recibido para su publicación: 19 de junio de 2012. Aceptado para publicación: 30
de agosto de 2012.
4
Abreviaturas no estándar: RT-qPCR, reacción en cadena de la polimerasa
cuantitativa con transcripción inversa; miARN, microARN; PLA, prueba de
ligadura de proximidad; PLA-qPCR, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con prueba de ligadura de proximidad; ncARN, ARN no codificante; GFP,
proteı́na fluorescente verde mejorada; FACS, clasificación de células activadas
por fluorescencia; AR, liberación de analitos; Cq, ciclo de cuantificación.
Evaluación de LMPGs NACB con AGREE II
células individuales por lo general se recolectan por
microaspiración (6, 7 ), citometrı́a de flujo (9, 10 ) o
microdisección con captura láser (11, 13 ). Luego se
realiza el lisado y análisis de las células capturadas por
RT-qPCR. El uso de lisados no fragmentados es ventajoso para evitar pérdidas de ARN (14 ). Los análisis de
diversos genes requieren preamplificación para asegurar la presencia de suficientes moléculas en el tubo de
reacción después de la dilución de la muestra. La
mayorı́a de los protocolos de preamplificación son
compatibles con RT-qPCR, pero generalmente se
prefieren los protocolos de preamplificación basados en PCR debido a que son fáciles de implementar
en el flujo de trabajo, generan altos rendimientos y son
especı́ficos al objetivo. Además, el uso de qPCR y la
prueba de ligadura de proximidad (PLA) combinados
(PLA-qPCR) son capaces de cuantificar proteı́nas en
lisados celulares, pero el método aún no ha sido aplicado en células únicas (15 ). Sin embargo, todos estos
flujos de trabajo cuestionan una clase de molécula por
vez. Para obtener una comprensión más profunda de
los procesos biológicos complejos, resulta altamente
ventajoso medir diferentes tipos de analitos en la
misma célula única.
Describimos un método para cuantificar ADN,
mARN, miARN, ARN no codificante (ncARN) y
proteı́nas con qPCR en la misma célula (Fig. 1). Al aplicar qPCR para medir todas estas clases de analitos, hemos logrado una alta sensibilidad analı́tica y un gran
rango dinámico, y eliminamos la necesidad de combinar diferentes plataformas tecnológicas. El enfoque fue
usado con células humanas transfectadas de forma
transitoria que expresan de forma ectópica el gen FUS5
(fusionado en sarcoma). El FUS es una proteı́na multifuncional que regula la actividad genética a través de
la interacción con otras proteı́nas, ARN y ADN (16 ).
Además, el FUS está involucrado en la regulación de la
actividad genética promotora (17 ), participa en el empalme pre-mARN (18 ) y los traslados entre el núcleo y
la unión del citoplasma al ARN (19 ). El gen CCND1
(ciclina D1), que participa en la regulación del ciclo
celular, es un gen diana bien caracterizado de FUS (17 ).
El FUS se encuentra en oncogenes de fusión que se
presentan en algunos sarcomas y leucemias (20 ). Recientemente, las mutaciones FUS también se han implicado en formas familiares de trastornos neurodegenerativos, esclerosis lateral amiotrófica y degeneración del
lóbulo frontotemporal (21, 22 ).
5
Genes humanos: FUS, fusionado en sarcoma; GAPDH, gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa; CCND1, ciclina D1; MIR31, microARN 31; SNORD48, ARN
nucleolar pequeño, C/D box 48.
Figura 1. Configuración experimental.
Panorama general del flujo de trabajo para la medición de
ADN, ARN y proteı́nas en la misma célula única. Usamos el
40% de cada célula para el análisis proteico, el 40% para
ARN y el 20% para análisis de ADN.
Materiales y métodos
CULTIVOS CELULARES Y TRANSFECCIONES
La lı́nea celular HT 1080 del fibrosarcoma humano se
cultivó a 37 °C con aire que incluı́a CO2 al 5% y en el
medio RPMI 1640 GlutaMAX complementado con
100 U/mL de penicilina, 100 ␮g/mL de estreptomicina
y 100 mL/L de suero fetal bovino (todos de Life Technologies). Las células HT 1080 fueron sembradas en 6
pocillos (Nunc) a una densidad de 150 000 células por
pocillo y transfectadas después de 18 a 24 hs. Cada pocillo fue transfectado con una mezcla que contenı́a 1 ␮g
de un plásmido de expresión que codifica el FUS marcado con proteı́na verde fluorescente mejorada (FUSGFP) (23 ) y 3 ␮L de reactivo para transfección FuGENE 6 (Roche) preparado en RPMI 1640 libre de
suero de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los medios de cultivo se cambiaron 6 horas después de
la transfección y se recopilaron las células para su análisis 24 horas después de la transfección. La eficiencia de
la transfección se estimó aproximadamente en 60 y
80% de acuerdo con el análisis de clasificación de céluClinical Chemistry 58:12 (2012) 1683
las activadas por fluorescencia (FACS) o la inspección
visual.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Y ANÁLISIS POR INMUNOBLOT
Las células fueron lavadas con PBS helado (tabletas
PBS, Life Techcnologies) y separadas con un raspador
de células en 100 ␮L/pocillo de solución amortiguadora RIPA (50 mmol/L Tris-HCL, pH 8.0, 150 mmol/L
de NaCl, 10 mL/L de IGEPAL® CA-630, 5 g/L de desoxicolato de sodio, 1 g/L de SDS; todos de SigmaAldrich) complementado con 1⫻ cóctel de inhibidores
de proteasas y fosfatasas Halt (Thermo Scientific). Las
muestras se incubaron en hielo por 10 min y clarificaron por centrifugación a 14 000 g por 10 min a 4 °C. La
inmunotransferencia se realizó con el sistema de gel
NuPAGE Novex 4%–12% Bis-Tris (Life Technologies)
de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
En pocas palabras, los extractos de proteı́na se mezclaron con una solución amortiguadora de muestras
NuPAGE LDS y un agente reductor de muestras NuPAGE, desnaturalizados a 70 °C por 10 min, separados en geles NuPAGE de 4 a 12% Bis-Tris y transferidos
a membranas Invitrolon de difluoruro de polivinilideno (Life Technologies) por mancha húmeda. Las
membranas se bloquearon con 50 g/L de leche desnatada (Merck Chemicals) (para análisis de FUS y GFP) o
con 50 g/L de BSA (Sigma-Aldrich) [para análisis de
gliceraldehı́do-3-fosfato deshidrogenasa (GAPHD)]
preparado en solución amortiguadora TBS (50
mmol/L Tris-HCl, pH 6.8, 50 mmol/L de NaCl, 0.5
mL/L de interpolación 20; todos de Sigma-Aldrich).
Luego, se incubaron las membranas por 90 min. con
0.4 ␮g/mL de anticuerpos anti-FUS [Anticuerpo
FUS/TLS (4H11); Santa Cruz Biotechnology], 0.5
␮g/mL de anticuerpo anti-GFP [Living Colors® A.v.
Anticuerpo monoclonal (JL-8); Clontech], o 1 ␮g/mL
de anticuerpo anti-GAPDH [Anticuerpo AntiGAPDH (mAbcam 9484) – Control de Carga; Abcam].
La incubación con un anticuerpo anti-ratón de cabra
conjugado con peroxidasa [IgG anti-ratón de cabra estabilizado (H⫹L), Conjugado con peroxidasa;
Thermo-Scientific) se usó para detectar bandas de
proteı́nas. Se usó un sistema de imágenes LAS-4000
para capturar las señales de luminiscencia.
AISLAMIENTO DE CÉLULAS ÚNICAS
Las células HT1080 fueron disociadas con un medio
RPMI 1640 GlutaMAX que contiene 2.5 g/L de tripsina
(ambos de Life Technologies) y 0.5 mmol/L de EDTA
(Merck Chemicals). La tripsina fue inactivada con un
medio celular que contiene suero fetal bovino. Las células disociadas se lavaron una vez y después se mantuvieron en un medio celular con 20 mL/L de suero fetal
bovino. Los agregados celulares se quitaron mediante
filtrado con un filtro celular de 70-␮m (BD Bios1684 Clinical Chemistry 58:12 (2012)
ciences). Usamos una clasificación de células BD
FACSAria 2 (BD Biosciences) para clasificar las células
únicas en placas PCR de 96 pocillos (Life Technologies)
con 5 ␮L de solución amortiguadora de lisis de liberación de analitos (AR) (Life Technologies). La solución
amortiguadora de lisis de AR es un reactivo de lisis
hipotónico amortiguado de baja concentración iónica
(1g/L de sulfobetaı́na no detergente 201, 50 mmol/L de
L Tris-HCl, pH 8.0 y 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) mezclado en un porcentaje 1:1 con PBS (Tabletas PBS; Life
Technologies). Las muestras se congelaron en hielo
seco y se conservaron a -80 °C hasta los posteriores
análisis. En otro documento se describe un protocolo
detallado para la clasificación de células únicas (24 ).
Usamos un 40% de las células lisadas (equivalente a 2
␮L) para RT-qPCR, un 40% para PLA-qPCR y el 20%
restante para cuantificación de ADN genómico con
RT-qPCR. La PLA, la transcripción inversa y la qPCR
para ADN genómico se realizaron simultáneamente en
placas de reacción paralelas.
Se usaron kits QIAshredder (Qiagen) para homogeneizar lisados y el ARN total se aisló con un kit Exiqon (miRCURY RNA Isolation Kit - Cell and Plant).
El ARN total se midió con un espectrofotómetro Nano
Drop ND-1000 (NanoDrop Technologies).
PRUEBAS DE LIGADURA DE PROXIMIDAD
Las sondas de proximidad FUS-GFP PLA se construyeron
con anticuerpos anti-GFP policlonales prebiotinilados de
conejo [Anticuerpo Anti-GFP (Biotina); Abcam], de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (TaqMan®
Protein Assays Oligo Probe Kit; Life Technologies). En
pocas palabras, las sondas de proximidad GFP PLA se
prepararon al mezclar 5 ␮L de anticuerpo GFP biotinilado (200 nmol/L) con 5 ␮L de oligonucleótido conjugado con estreptavidina con extremo libre de 3⬘ o 5⬘ (200
nmol/L) en dos tubos plásticos independientes de 200␮L. Después de permitir la fijación total de biotinaestreptavidina mediante la incubación a temperatura ambiente durante 60 min, la mezcla se diluyó con 90 ␮L de la
solución amortiguadora de almacenamiento por sonda
de PLA para crear cada reserva de almacenamiento por
sonda de PLA de 10-nmol/L. Inmediatamente antes de
comenzar la reacción de PLA, tanto la sonda de proximidad de PLA de 3’ de extremo libre como la de 5’ se combinaron y diluyeron en conjunto 130 veces en una solución amortiguadora de dilución por sonda de PLA para
crear una solución de 77-pmol/L 2⫻ de sonda activa. La
concentración óptima de la sonda activa se obtuvo por
valoración (ver Fig. 1 en el anexo de datos que acompaña la versión en lı́nea de este artı́culo en: http://www.
clinchem.org/content/vol58/issue12). La PLA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(TaqMan® Protein Assays Core Reagents Kit with Master Mix, Life Technologies). Primero, se mezclaron 2
Evaluación de LMPGs NACB con AGREE II
␮L de la solución de la sonda activa de PLA con 2 ␮L de
células únicas lisadas e incubadas a 37 °C por 60 min.
Luego, agregamos la mezcla de la reacción de la ligadura a un volumen final de 50 ␮L e incubado a 37 °C
por 10 min. La mezcla de la reacción de la ligadura
incluı́a 1 ⫻ de solución amortiguadora de la reacción
de la ligadura y 1⫻ de ADN ligasa. La ADN ligasa se
diluyó recientemente con solución amortiguadora de
dilución de ligasa a partir de una solución de reserva de
almacenamiento a largo plazo de 500 ⫻ a una solución
activa 1 ⫻. Finalmente, se agregó una solución de
porteasa 1 ⫻ para terminar la reacción de ligadura. El
perfil de temperatura para inactivación de la ligasa fue
de 37 °C por 10 minutos y 95 °C por 5 minutos. Las
muestras se conservaron frı́as (4 °C a – 8°C) entre todos
los pasos de incubación y todos los pasos subsiguientes
se realizaron de inmediato. La ligadura de respaldo se
midió en controles de la solución amortiguadora de
lisis de AR sin contenido proteico. La especificidad de
PLA-qPCR (Fig. 2) se revisó con células de control sin
transfección carentes de proteı́na FUS-GFP. Se usaron
diluciones en serie de un lisado de célula con proteı́na
FUS-GFP para generar una curva de calibración para la
prueba de PLA (ver Fig. 2 en el Anexo de datos en
lı́nea). La relativa eficiencia de lisis en las mediciones de
proteı́na se evaluó midiendo la misma cantidad de
proteı́na lisada en cada solución amortiguadora de lisis
de AR o solución amortiguadora de lisis de células PLA
estándar complementado con 1⫻ cóctel de inhibidores
de proteasas y fosfatasas Halt (Ver Fig. 3A en el Anexo
de datos en lı́nea).
TRANSCRIPCIÓN INVERSA
Se utilizó una transcriptasa inversa SuperScript® III (Life
Technologies) para la transcripción inversa de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Se incubaron partes
alı́cuotas de células únicas lisadas (2 ␮L) con 5 ␮L de agua
que contenı́an 0.5 mmol/L de una mezcla de dNTP (desoxinucleótido trifosfato) (Sigma-Aldrich), 2.5 ␮mol/L de
cebador Oligo(dT)12–18 (Life Technologies), 2.5 ␮mol/L
de hexámeros al azar y 05 ⫻ de cebador especı́fico de
transcripción inversa para MIR31 (microRNA 31) (TaqMan MicroRNA Assay, 002279) y SNORD48 (ARN nucleolar pequeño, C/D box 48) (TaqMan MicroRNA Assay, 001006). Cada reacción fue realizada a 65 °C por 5
minutos. Luego agregamos 50 mmol/L de Tris-HCl (pH
8.3), 75 mmol/L de KCl, 3 mmol/L de MgCl2, 5 mmol/L
de ditiotreitol, 10 U de RNaseOut y 50 U de SuperScript
III con un volumen total de 10 ␮L (todos los reactivos de
Life Technologies). La transcripción inversa se realizó con
una temperatura/perfil de tiempo de 16 °C por 5 min, 50
°C por 60 minutos, 55 °C por 15 minutos y un paso final
de calentamiento a 70 °C por 15 minutos. Todas las muestras se diluyeron a 20 ␮L con agua antes de la qPCR.
PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL
Para todas las mediciones de PCR en tiempo real se utilizó
el sistema 7500 Fast Real-Time PCR System de Applied
Biosystems (Life Technologies). Todos los experimentos
de RT-qPCR se realizaron para obtener al menos la
mı́nima información requerida para la publicación de experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real (25 ). Para
los análisis de cADN, cada reacción (10 ␮L) contenı́a una
mezcla maestra TaqMan Fast Universal PCR Master Mix,
ya sea 1⫻ TaqMan Gene Expression Assay o 1⫻ TaqMan
MicroRNA Assay (todos de Life Technologies) y 2 ␮L de
cADN diluido. Se realizaron perfiles de expresión de ADN
y cADN de las secuencias que codifican FUS-GFP con un
ensayo TaqMan huésped diseñado especialmente (para
obtener más detalles de estos ensayos, ver Tabla 1 en el
Anexo de datos en lı́nea). La qPCR realizada después de la
PLA contenı́a TaqMan Protein Assay Fast Master Mix,
1⫻ Ensayo Universal PCR (todos de Life Technologies) y
9 ␮L de patrón de PLA en un volumen total de 20 ␮L. El
perfil de temperatura de todos los ensayos fue de 95 °C por
20 segundos seguido de 50 ciclos de amplificación de 95
°C por 3 segundos y 60 °C por 30 segundos. La formación
de productos PCR de longitudes correctas se confirmó
por electroforesis en gel de agarosa. El desarrollo del ensayo fue revisado con curvas de calibración para todos los
ensayos. La determinación de valores para el ciclo de cuantificación (Cq) fue realizado con lı́neas de umbral estándar. Los análisis de datos de células únicas fueron realizados como se describe en otros documentos (9, 14, 24 ).
ANÁLISIS DE DATOS
Los datos FACS se analizaron con el software FACSDIVA
(BD Biosciences). Se usaron células de control no transfectadas sin FUS-GFP como entrada a “no GFP” (ver Fig.
3A). Tener en cuenta que algunas de estas células expresaron ADN y mARN que codifican FUS-GFP (ver Tabla 2
en el Anexo de datos en lı́nea). El análisis estadı́stico se
realizó con los programas GenEX (MultiD Analyses),
SPSS 19 (IBM/SPSS) y OriginPro 7.5 (OriginLab Corporation). Se calcularon diferencias de aproximación en la
expresión relativa entre mARN y ADN que codifican
FUS-GFP y entre mARN que codifica mRNA endógeno y
mARN que codifica FUS-GFP ectópico a partir de los datos en la Fig. 2. Estos cálculos incluyeron correcciones
para todos los pasos de dilución.
Resultados
Se utilizó la transfección transitoria de la lı́nea celular
HT1080 de fibrosarcoma humano para expresar ectópicamente el FUS-GFP. Las concentraciones de FUS-GFP y
de proteı́na FUS endógena fueron de magnitudes similares a aquellas obtenidas con el análisis por inmunoblot
al nivel de población celular (ver Fig. 4 en el Anexo de
datos en lı́nea). Cuantificamos el número de plásmidos
Clinical Chemistry 58:12 (2012) 1685
Figura 2. Ejecución del ensayo.
Sensibilidad analı́tica y rango dinámico para la medición de 32 células hasta una célula única. Se recolectaron células HT1080
fluorescentes de GFP transfectadas transitoriamente con plásmido codificado con FUS-GFP (GFP⫹, cuadrados abiertos) y células
de control no transfectadas sin FUS-GFP (GFP-, cı́rculos cerrados) con FACS y los datos se adaptaron mediante regresión lineal.
La señal de fondo de unión de sonda PLA no especificada se determinó con controles negativos de proteı́na (NPC, diamante
gris). Los datos se trazan como la media y SD (n ⫽ 6). FUS-GFP ADN indica ADN que codifica FUS-GFP; FUS-GFP ARN indica
ARN que codifica FUS-GFP.
1686 Clinical Chemistry 58:12 (2012)
Evaluación de LMPGs NACB con AGREE II
Figura 3. Análisis de concentraciones de proteı́na en células únicas con producción variable de proteı́na FUS-GFP.
(A), Células individuales con diferentes niveles de fluorescencia GFP (sin, baja, intermedia, alta) medidas y ordenadas por FACS.
(B), análisis PLA-qPCR de concentraciones de proteı́na FUS-GFP correlacionadas con fluorescencia GFP medidas por FACS
(Coeficiente de correlación de Spearman, 0.86; P ⬍ 0.001). Notar que algunas células sin fluorescencia GFP medidas por FACS
mostraron producción de proteı́na FUS-GFP por encima del control de proteı́na activa (NPC). FSC-H, dispersión frontal-altura;
GFP-A, área de fluorescencia GFP.
transfectados (ADN que codifica FUS-GFP), se transcribieron los mARN (mARN que codifica FUS-GFP) y se
tradujo la proteı́na FUS-GFP en células individuales. El
ensayo PLA-qPCR se dirigió a la proteı́na marcada con
GFP producida ectópicamente pero no a la proteı́na FUS
expresada endógenamente. Además, se midieron: la
ciclina D1 (CCND1) mARN, ARN nucleolar pequeño,
C/D box 48 (SNORD48) y miARN 31 (MIR31) al nivel de
la célula única. Elegimos incluir SNORD MIR31 en
nuestro diseño experimental debido a que SNORD48
(ncARN) y MIR31 (miARN) codifican tipos de
moléculas de ARN además de mARN. Además, la expresión de estos genes fue correlacionada con FUS
mARN al nivel de célula única (ver abajo).
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO COMÚN LIBRE DE
PURIFICACIÓN PARA ANÁLISIS DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS DE
CÉLULAS ÚNICAS
Las células únicas HT 1080 fueron ordenadas por
FACS, lisadas en una solución amortiguadora de lisis
Tabla 1. Correlaciones de Spearman entre todos los analitos para todas las células únicas con incremento en la
intensidad de fluorescencia de GFP.a
Proteı́na
FUS-GFP
ADNb
FUS-GFP
Proteı́na FUS-GFP
1
ADN FUS-GFP
0.37*
1
mARN FUS-GFP
0.31**
0.41**
ADN/ARN FUS-GFP
0.36**
0.44**
mARN CCND1
⫺0.11
⫺0.29*
miARN MIR31
⫺0.10
ncARN SNORD48
⫺0.10
mARN
FUS-GFP
ADN/ARN
FUS-GFP
mARN
CCND1
miARN
MIR31
ncARN
SNORD48
1
0.92**
1
⫺0.29
0.10
1
⫺0.11
0.02
0.17
0.59**
1
⫺0.21
0.07
0.24
0.71**
0.66**
1
Los coeficientes de la correlación de Spearman estadı́sticamente significativos (P ⬍ 0.01 y P ⬍ 0.05) están marcados (** y *, respectivamente). Las distribuciones
y parámetros estadı́sticos para todos los analitos se muestran en la Fig. 6 y la Tabla 1 en el Anexo de datos en lı́nea. Los números de las células únicas analizadas
fueron los siguientes: nno GFP ⫽ 24; nGFP alto ⫽ 24; nGFP intermedio⫽ 24; nGFP bajo⫽ 19; y nNPC ⫽ 3. NPC, control de proteı́na negativa.
b
ADN FUS-GFP indica ADN que codifica FUS-GFP; ARN FUS-GFP indica ARN que codifica FUS-GFP.
a
Clinical Chemistry 58:12 (2012) 1687
datos en lı́nea). El procedimiento de la solución amortiguadora de lisis de AR fue comparado en el nivel de
población celular con los procedimientos de soluciones
amortiguadoras de lisis estándar para la preparación de
ARN y proteı́na. Las moléculas ncRNA (SNORD48) se
localizan en el núcleo, mientras que las moléculas procesadas de miARN 31 (MIR31) se localizan en el citoplasma; ambas fueron liberadas de la misma manera en
comparación con la lisis de control, lo que indica que
ambos compartimentos fueron eficientemente lisados
con la solución amortiguadora de lisis de AR (ver Fig. 3
en el Anexo de datos en lı́nea).
CUANTIFICACIÓN DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS AL NIVEL DE
CÉLULA ÚNICA
Figura 4. Mapas de calor de correlaciones.
(A), Correlaciones de Spearman entre analitos al nivel de
célula única solamente con expresión FUS endógena. (B),
Correlaciones de Spearman entre analitos al nivel de célula
única con expresión FUS ectópica agrupada de manera
diferente, comparada con células únicas con expresión FUS
endógena solamente.
AR y divididas en pequeños flujos de trabajo en
paralelo para facilitar el análisis especı́fico de ADN,
ARN y moléculas de proteı́na con qPCR, RT-qPCR y
PLA-qPCR, respectivamente (Fig. 1). Para minimizar
la pérdida de analitos durante el proceso experimental,
usamos el procedimiento de lisis de células completas
para preparar plantillas de ARN, ADN y proteı́na no
fraccionadas de células individuales. La solución amortiguadora de lisis de AR es una solución amortiguadora
hipotónica de baja fuerza iónica que lisa eficientemente
la célula, mantiene la integridad del ADN, ARN y
proteı́na sin degradación notable y es compatible con
las reacciones enzimáticas de la corriente sin ninguna
inhibición detectable (ver Figs. 3 y 5 en el Anexo de
1688 Clinical Chemistry 58:12 (2012)
Para evaluar la sensibilidad analı́tica y el rango dinámico de todos los ensayos, realizamos una calibración
basada en el análisis del material obtenido de 32 células
clasificadas por FACS hasta una célula única clasificada
por FACS recolectada en pasos de 2 (Fig. 2). Todos los
ensayos pudieron detectar sus respectivas moléculas
objetivo al nivel de célula única. El parámetro de
medición, Cq, que es inversamente proporcional al
número de moléculas en la escala log2, se correlacionó
linealmente con el logaritmo del número de células
analizadas. La variación observada en el número de
moléculas se incrementó en tanto el número de células
analizadas descendió (Fig. 2). Al comparar la variación
entre las células únicas y las curvas de calibración generadas a partir de las series de dilución de los analitos
respectivos (ver Fig. 2 en el Anexo de datos en lı́nea),
detectamos que la variación biológica es mayor que la
variación técnica en todos los ensayos (Fig. 2; ver las
Tablas 2 y 3 en el Anexo de datos en lı́nea). Estos resultados coinciden con aquellos descritos en nuestro informe previo (14 ), que demuestran que la variación
biológica célula a célula es considerablemente mayor
que el ruido técnico producido cuando se cuantifican
cantidades bajas de mARN con RT-qPCR.
Posteriormente, demostramos que la PLA-qPCR
puede aplicarse de manera precisa para cuantificar las
proteı́nas en células individuales (Fig. 2). En contraste
con las mediciones de qPCR de ADN y ARN, las mediciones de proteı́nas con PLA-qPCR producen señales
de fondo. Para el ensayo FUS-GFP PLA-qPCR, inferimos que la señal de fondo se debı́a a la ligadura
inespecı́fica entre las dos sondas PLA, debido a que la
señal de los controles sin proteı́na no se distinguı́a de la
de los lisados de células sin proteı́na FUS-GFP (Fig. 2).
La sensibilidad analı́tica de PLA-qPCR para detectar y
cuantificar las moléculas de la proteı́na FUS-GFP a bajas concentraciones dependı́a de la concentración de la
sonda PLA (ver Fig. 1 en el Anexo de datos en lı́nea). Al
reducir la concentración de la sonda PLA, se incrementó la sensibilidad analı́tica para permitir la
Evaluación de LMPGs NACB con AGREE II
medición de algunas moléculas de la proteı́na FUSGFP, pero esta sensibilidad llegó a expensas de la precisión cuando se midieron grandes números de
moléculas de proteı́na FUS-GFP.
El ADN en el plásmido que codifica FUS-GFP y el
cADN generado por mRNA que codifica FUS-GFP
tienen una secuencia idéntica. Para permitir la cuantificación de ADN y mARN que codifican FUS-GFP, dividimos las muestras de célula única antes de la sı́ntesis
de cADN para los respectivos análisis de ADN y ARN
(Fig. 1). La cantidad de mRNA que codifica FUS-GFP
era aproximadamente 5 veces mayor que la de ADN
que codifica FUS-GFP (Fig. 2). Por lo tanto, la mayorı́a
de las moléculas de cADN medidas que codifican FUSGFP se originaban a partir de mARN y no tenı́an ADN
plásmido. El ensayo FUS tomaba como objetivo la cantidad total de ADN que codifica FUS-GFP, mARN que
codifica FUS-GFP y FUS expresado de forma endógena. El hecho de que el ensayo FUS produjo una señal
de fluorescencia en células que producen FUS-GFP 10
veces mayor que las células de control demostró que la
mayorı́a de las moléculas se originaron en el plásmido
expresado de forma transitoria (Fig. 2).
ESTUDIOS DE CORRELACIÓN ENTRE DIFERENTES ANALITOS AL
NIVEL DE CÉLULA ÚNICA
La capacidad de cuantificar varios analitos diferentes
en una sola célula ofrece posibilidades para estudiar
cadenas de interacción en detalle. Para estudiar dichas
correlaciones, transfectamos de forma transitoria células HT 1080 con plásmido codificador FUS-GFP y células únicas recolectadas con intensidad de la fluorescencia de GFP en aumento según medición por FACS.
Se espera que la intensidad de la fluorescencia sea
linealmente proporcional al número de moléculas
fluorescentes. Confirmamos esta relación al correlacionar la creciente intensidad de la fluorescencia de GFP
FACTS con el número de moléculas de proteı́na FUSGFP medidas por PLA-qPCR (Coeficiente de correlación de Spearman, 0.86; P ⬍ 0.01) (Fig. 3). Este alto
coeficiente de correlación indica que la mayorı́a de
moléculas de proteı́na FUS-GFP estuvieron disponibles para el análisis PLA-qPCR.
Las mismas células únicas también se analizaron
para detectar los otros analitos (ver y Tabla 2 en el
Anexo de datos en lı́nea). Como se esperaba, se correlacionaron las concentraciones de proteı́na FUS-GFP,
ADN que codifica FUS-GFP y mRNA que codifica
FUS-GFP dentro de células individuales (Tabla 1; correlaciones de Spearman con valores P ⬍ 0.01), pero se
observó una gran variación entre células individuales
(ver Fig. 6 y Tabla 2 en el Anexo de datos en lı́nea). Las
distribuciones de ADN que codifica FUS-GFP y mARN
que codifica FUS-GFP fueron grandes, abarcaban 4
órdenes de magnitud y la distribución de proteı́na
FUS-GFP abarcaba 2 órdenes de magnitud. La correlación observada entre ADN que codifica FUS-GFP y
proteı́na FUS-GFP (Correlación de Spearman de 0.37;
P ⬍ 0.01) demostró que una alta concentración
plásmida intracelular era favorable para la producción
de proteı́na pero no el único parámetro que determinó
de forma correcta la traducción plásmido a proteı́na.
La variación observada en la eficiencia para la transcripción y traducción pudo deberse a la agregación de
plásmido y la heterogeneidad de célula a célula causada
por dichos factores como microambiente local,
tamaño de célula, densidad celular y estado del ciclo
celular (26, 27 ). La transcripción y traducción se realizan de modo intermitente, lo que ocasiona variación
con el tiempo (28 –30 ). Las escalas de tiempo son de
minutos a horas para pulsación de transcripción (30 –
32 ) y horas a dı́as para pulsación de traducción (1, 33 ),
pero las diferentes moléculas varı́an ampliamente con
respecto a estos tiempos. El modelado matemático y los
datos experimentales han demostrado que la variación
en ARN y proteı́na junto con células individuales en un
punto de tiempo determinado coinciden con la variación observada en ARN y proteı́na con el tiempo (1,
32 ). Nuestros datos coinciden con estos informes.
La expresión medida con el ensayo FUS, que se
enfoca en el FUS endógeno, ADN que codifica FUSGFP y mARN que codifica FUS-GFP, se correlacionó
moderadamente con las cantidades de ADN que codifica FUS-GFP (Coeficiente de correlación de Spearman, 0.44; P ⬍ 0.01) y proteı́na FUS-GFP (Coeficiente
de correlación de Spearman, 0.36; P ⬍ 0.01) y esta expresión se correlacionó fuertemente con la expresión
de mRNA que codifica FUS-GFP (Coeficiente de correlación de Spearman 0.92; P ⬍ 0.01), y se confirmó
que la mayorı́a de las moléculas objetivo del ensayo
FUS se originaron en el cADN de plásmidos expresados
en forma provisoria y no en el gen endógeno FUS
(Fig. 2).
LA EXPRESIÓN GENÉTICA ECTÓPICA MODULA LAS
CORRELACIONES ENTRE ANALITOS
Para estudiar la heterogeneidad de la población celular
y las correlaciones entre analitos, recolectamos células
únicas al azar, independientemente de su fluorescencia
GFP. El efecto de la expresión FUS ectópica se evaluó
mediante la comparación de células positivas y negativas con proteı́na FUS-GFP. Se consideró a una célula
como positiva con proteı́na FUS-GFP si mostraba una
señal significativamente mayor que la de la señal de
fondo PLA-qPCR (p. ej., P ⬍ 0.05; ver Fig. 7 y Tabla 3
en el Anexo de datos en lı́nea). Detectamos que los
niveles de expresión de FUS, CCND1, MIR31 Y
SNORD48 fueron todos correlacionados en células sin
FUS ectópico (Coeficientes de correlación de Spearman ⬎0.66; P ⬍ 0.01) (Fig. 4A; ver Tabla 4A en el
Clinical Chemistry 58:12 (2012) 1689
Anexo de datos en lı́nea). Por el contrario, las células
con expresión FUS ectópica demostraron la reducción
o falta de correlación entre FUS y MIR31, CCND1 o
SNORD48 (Fig. 4B; ver Tabla 4 en el Anexo de datos en
lı́nea). Esta observación puede explicarse por el hecho
de que la transcripción de plásmidos se dirige por el
promotor de citomegalovirus y no por el promotor
FUS endógeno (ver en el Anexo de datos en lı́nea).
Consecuentemente, las correlaciones de FUS para
MIR31, CCND1 y SNORD48 se perdieron en las células
de producción de proteı́na FUS-GFP, debido a que la
mayorı́a de los mARN FUS se originaron en el
plásmido. Los cambios observados en los valores de
correlación de FUS ectópico (mientras que las otras
correlaciones entre MIR31, CCND1 y SNORD48 no se
vieron afectadas) también indicaron que nuestra lisis
aplicada de células totales fue reprodusible y uniforme.
Se podrı́a esperar que la existencia de variación en la
eficiencia de la lisis celular generara una inclinación
sistemática a las correlaciones, no un cambio especı́fico
para una correlación manipulada especı́fica.
realizan en tubos separados debido a sus diferentes
condiciones de reacción óptima, un hecho que impide
la multiplexión entre proteı́nas y ARN. Asimismo, la
reacción PLA requiere una dilución considerable
después de la dirección de la sonda PLA inicial al paso
de unión de proteı́nas a fin de reducir los eventos de
ligadura de fondo. El uso de qPCR permite la medición
de las secuencias corta y larga de ARN, mientras que
muchas otras técnicas no pueden analizar los ARN cortos. En principio, el transcriptoma completo puede
analizarse mediante la aplicación de técnicas de preamplificación y se han medido exitosamente más de 24
proteı́nas mediante PLA multiplex (38 ). Esto también puede ser posible para integrar dispositivos de
microfluı́dos en el método descrito para cuantificar
ADN, ARN y proteı́nas con qPCR y PLA (39 ). El enfoque descrito ofrece nuevas posibilidades para investigaciones de unificación genómica y proteómica. La
capacidad para cuantificar y correlacionar diferentes
clases de analitos en la misma célula única puede presentar posibilidades de diagnóstico de biologı́a celular y
molecular.
Análisis
Se han publicado varios métodos analı́ticos de alta
resolución capaces de detectar, visualizar y cuantificar
analitos al nivel de célula única (4, 5 ). Sin embargo,
pocos de estos métodos pueden usarse en forma conjunta o para medir múltiples clase de biomoléculas en
la misma célula. El análisis FACS es un método aplicado exitosamente que ha sido usado para analizar células únicas con un alto rendimiento (3, 4, 34 –36 ).
Pueden analizarse simultáneamente aproximadamente 18 proteı́nas diferentes en un instrumento
FACS. Además, los tintes de unión de ADN pueden
usarse para cuantificar ácidos nucleicos en combinación con proteı́nas (4, 37 ).
Hemos demostrado cómo las células individuales
pueden lisarse de forma eficiente con una solución
amortiguadora de lisis de células completas que también es compatible con reacciones enzimáticas en la
corriente usadas para medir ADN, mARN, miARN,
ncARN y proteı́nas. Este método también es compatible con la mayorı́a de los métodos de recolección de
células únicas, incluido FACS, lo que también permite el análisis de varios marcadores adicionales al
nivel de la célula única (4, 34 –36 ). El enfoque descrito
solo requiere un instrumento PCR estándar en tiempo
real y todas las mediciones generan resultados para el
mismo parámetro (Cq), lo que facilita el análisis comparativo de datos. La PLA y la transcripción inversa se
1690 Clinical Chemistry 58:12 (2012)
Contribuciones de autor: Todos los autores confirmaron que han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con
los 3 siguientes requerimientos: (a) contribuciones significativas para la
concepción y diseño, adquisición de datos o análisis e interpretación de
estos; (b) redacción o revisión del artı́culo en relación con su contenido
intelectual; y (c) aprobación final del artı́culo publicado.
Declaración de los autores sobre posibles conflictos de interés: Al
momento de la presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de deslinde de autor. Declaraciones o posibles conflictos de interés:
Empleo o liderazgo: D. Ruff, Life Technologies.
Papel del consultor o asesor: A. Ståhlberg, TATAA Biocenter.
Posesión de acciones: A. Ståhlberg, TATAA Biocenter; D. Ruff, Life
Technologies.
Honoraros: No se declaran.
Fondos de investigación: A. Ståhlberg, Swedish Research Council
(2367), Swedish Society for Medical Research, Johan Jansson Foundation for Cancer Research, Assar Gabrielssons Research Foundation, and Wilhelm and Martina Lundgren Foundation for Scientific
Research; P. Åman, Swedish Cancer Society.
Testimonio de expertos: No se declara.
Patentes: D. Ruff, Patente de los Estados Unidos US 8,012,685.
Papel del patrocinador: Las organizaciones patrocinadoras no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la elección de pacientes
reclutados, la revisión e interpretación de datos ni la preparación o
aprobación del manuscrito.
Reconocimientos: Agradecemos a M. Bengtsson, M. Hemberg y M.
Kubista por la lectura crı́tica del manuscrito.
Evaluación de LMPGs NACB con AGREE II
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