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Esteban Barila - Informe BENTRI4
Informe Beca de Entrenamiento para alumnos universitarios (BENTR14)
Esteban Barila
A) Tareas realizadas
El principa! conjunto de tareas fue subordinado al objetivo de producir mutaciones
puntuales sobre el ÁDNc para ei canal KCNQx subcionado en plasmidos. Para ello
comencé a familiarizarme con la técnica de la PGR {Polymerase Chain Reaction),
diseñando la reacción para ¡os distintos plantillas de ADN, cebadores y enzimas. Me
instruí en la gran diversidad de estrategias que tiene ia técnica y llevamos a cabo fa
mutagénesis de sitio dirigido (Site-directed mutagenesis).
Adquirí competencia en ía preparación de ia reacción de PCR, el pipeteo y las buenas
prácticas de laboratorio. Aprendí el uso del termociclador, generando programas propios,
y establecí una planilla para la disposición ordenada de su uso en el laboratorio común.
Con eí propósito de hacer una evaluación cualitativa de ia reacción de PCR, y obtener los
productos purificados realicé corridas electroforéticas en gel de agarosa.
Empleando un transiíuminador UV para revelar las bandas de ADN marcadas con
bromuro de etidio y recortar aquellas que se iban a destinar a su procesamiento.
Para lograr muestras purificadas, limpias de ADN (libres de componentes de la reacción
de PCR, geíes, etc) realicé protocolos de limpieza con distintas marcas de reactivos con
una metodología basada en cromatografía en columna.
Con eí propósito de cuaníificar y estudiar la calidad del material obtenido, aprendí a usar
un dispositivo de cuantificación óptica (picodrop) asociado a un software.
Otra de las tareas cruciales en el desarrollo del proyecto fue ensayar Sas reacciones para
lograr la ligación del ADN al vector plasmídico empleado. Para lograr esto estudié un
modelo digital empleando un software (SnapGene) cargado con la secuencia del ADN a
insertar que fue producido y aquella del vector. Con esta información se eligieron las
enzimas de restricción a emplear teniendo en cuenta sus diversos parámetros.
Realicé cortes con enzimas de restricción bacterianas. Durante el proceso fui interiorizado
en cuanto a ¡a provisión del laboratorio, los catálogos disponibles, marcas y compras.
Realicé ligaciones de fragmentos de ADN cortados con enzimas de restricción utilizando
la enzima T4 DNA ligasa.
Por otro ¡ado aprendí a producir medios de cultivo sólido para bacterias (agar LB para E.
coii) con antibióticos de selección (ampicilina), los cuales se emplearon en la
transformación bacteriana de los plasmidos insertados.
Ensayé transformaciones con un protocolo de shock térmico.
E! laboratorio posee lineas celulares en cultivo y fui entrenado en su amplificación y
mantenimiento. Además recibí la instrucción para realizar estas tareas y otras más en una
cabina de flujo laminar.
Llevé a cabo protocolos para la extracción y purificación de ADN plasmídico proveniente
de colonias transformadas (plasmid preparation).
Participé del relevo bibliográfico del laboratorio en cuanto al tema que nos incumbe y
desarrollamos el pian de trabajo para mi solicitud de beca a! CONICET.
Participé en el desarrollo de los artículos, resúmenes y posters presentados por e!
laboratorio en el 9no Congreso Mundial de IBRO (Internationai Brain Research
Organization) en Rio de Janeiro, Brasil. Julio 2015. En el mismo ful co-autor de 2 trabajos
presentados en modalidad de poster. Además, este trabajo voy a presentarlo en la
Reunión Anua! de Is Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología
Molecular (SAIB). Mar del Plata, 3 al 6 de noviembre de 2015.
Trabajos presentados en Reuniones Científicas:
1
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1} Spitzmau!, G. ; German, O.L, ; Carignano, C, ; Barilá, E, and Jentsch, T.J,
« Expression of voltage-activated poatssium KCNQ channels in mouse
retina». Poster: 0248, 9th World Congress of the International Brain
Research Organization (IBRO), Río de Janeiro, Brasil, 7 at 11 de julio, 2015,
2) Carignano, C.; Barilá, E. and Spitzmaul, G, "Analysis of neuronal nicotinic
acetylcholine receptors a4p2 activation and modulation by iypd'6 at the
single-channel level” Poster: 1181. 9th World Congress of the International
Brain Research Organization (IBRO), Rio de Janeiro, Brasil, 7 a! 11 de iuiio,
2015.
3) Esteban Barila, Camila Carignano and Guillermo Spitzmaul. “Single-channel
analysis of nicotinic acetylcholine receptor a 4p2 activation and modulation by
Lypd6”. Poster NS-P10. Li Reunión Anua! de SAIB. Mar del Plata, 3 al 6 de
noviembre de 2015.
B) Resúmen de métodos y técnicas empleados:
PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica empleada para hacer
múltiples copias de un segmento de ADN. La PCR es muy precisa y puede ser usada
para amplificar o copiar una región blanco del ADN de una mezcla de distintas moléculas
de ADN. En primer lugar, dos secuencias cortas llamadas cebadores (primers) son
diseñados para unirse al inicio y al final de la secuencia destinada a amplificar. Para la
reacción, el ADN que contiene ia región deseada se agrega a un tubo que contiene ¡os
cebadores, nudeotidos libres y una enzima, la ADN poiimerasa. El tubo es introducido en
un termociclador, el cual aumenta y disminuye la temperatura de ¡a reacción en una
secuencia automática y programada. Iniciaímente, ia mezcla se calienta para
desnaturalizar, o separar la doble hélice del ADN en cadenas simples. Luego la muestra
se enfria para lograr ia hibridación, o unión de los cebadores a sus secuencias dentro de
la molécula diana de ADN. Entonces la ADN polimerasa comienza a sintetizar nuevas
cadenas de ADN a partir de los cebadores. Luego de cada síntesis, la doble hélice de
ADN consiste de una cadena antigua y una nuevamente sintetizada. Luego de la primer
síntesis, la PCR continua reiniciando el ciclo y repitiendo ios pasos anteriormente
mencionados. Las nuevas cadenas sintetizadas servirán de molde para las siguientes
rondas de síntesis, permitiendo amplificar la región deseada millones de veces.
Muta génesis de sitio dirigido
Consiste de una reacción de PCR que requiere ia síntesis de un cebador de ADN corto.
Éste contiene la mutación deseada y es complementario al ADN de! gen de interés en
ambos lados del sillo de mutación. La mutación introducida puede ser de una sola base
(mutación puntual), bases múltiples, deleciones o inserciones. El cebador es extendido
usando una ADN poiimerasa, copiando el resto de! gen. El producto copiado incluye ahora
el sitio mutado.
Células competentes
Las células competentes son células bacterianas que poseen paredes celulares alteradas
para permitir un ingreso facilitado a ADN externo. Para lograr esto, se realiza un
tratamiento con cloruro de calcio (CaCh) en frío.
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Transformación bacteriana
La transformación es eí proceso por el cua! ADN ajeno es introducido en una célula. Las
bacterias son empleadas como un medio para almacenar y replicar plásmidos, es por eiio
que casi todos los plásmidos, incluso aquellos diseñados para usarse sobre células de
mamíferos, contienen un origen de replicación bacteriano y un gen de resistencia a
antibióticos, ei cual se usa como un marcador de selección. En el procedimiento se
emplean estirpes de bacterias creadas en el laboratorio que son más susceptibles a ser
transformadas (bacterias competentes), y consiste en mezclar ei ADN que se desea
introducir (subclonado en plasmidos) junto con las células. La mezcla es sometida a un
protocolo de shock térmico y posteriormente se cultiva en agar con ei antibiótico de
selección. De este modo aseguramos e! crecimiento selectivo de las bacterias
transformadas.
Electroforesis en gei de agarosa
Técnica analítica empleada para separar fragmentos de ADN o ARN por tamaño y carga
eléctrica. Las moléculas de ácidos nucleicos a ser analizadas son introducidas en e!
extremo de un ge! de agarosa. La aplicación de un campo eléctrico induce ia migración de
las moléculas a! ánodo debido a la carga neta negativa de pentosa-fosfato de su
estructura. La separación de ios fragmentos se logra explotando ¡a movilidad diferencial
de moléculas de distinto peso al atravesar el gel. Aquellas de mayor tamaño migran más
lentamente por experimentar mayor resistencia de! ge!. Por ello, los fragmentos más
pequeños culminan más próximos al ánodo.
Cortes con enzimas de restricción
Comprende el uso de enzimas bacterianas que catalizan la ruptura de enlaces
fosfodiesíer en el interior de una cadena de ADN (endonucleasas). Cada enzima reconoce
una secuencia característica (sitio de restricción) y produce cortes dejando extremos
adhesivos o extremos romos. Es una técnica ampliamente usada en biología molecular
para manipular ácidos nucleicos en el laboratorio. Es por ello que los diversos plásmidos o
vectores de clonación disponibles para transferir los genes en estudio contienen una gran
diversidad de sitios de restricción.
Dra. MARTA i. AVELDAÑO
DIRECTORA
tísnarro de ¡nvests* ck»¡es bíoquímícas
DE BAHIA BLANCA UNS - CONICET