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Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste Manual de Técnicas y Procedimientos Año 2014 Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología –Anatomía del Desarrollo- 1 Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste Índice Técnica 1 para deshidratación de embriones pequeños Menos de 10 mm CR Pasos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Procedimiento Fijación en formol neutro Alcohol 50º (cuanto más pequeño, más bajo el primer alcohol) Añadir unas gotas de 60º y luego poco a poco se pasa a 60º 70º gota a gota y luego 70º 80º gota a gota y luego 80º 90º gota a gota y luego 90º 96º gota a gota y luego 96º 100º gota a gota y luego 100º 100º gota a gota y luego 100º 100º gota a gota y luego 100º Xilol Xilol Xilol Parafina (57º - 60º fusión) Parafina II Parafina III Tiempo 20 min 25 min 30 min. 35 min 40 min 50 min 60 min 30 min 30 min 30 min 60 min 30 min 2,5 hs. Técnica 2 para deshidratación de embriones pequeños Pasos 1 2 3 4 5 6 7 Material Alcohol 50% Alcohol 60% Alcohol 70% Alcohol 80% Alcohol 90% Alcohol 100% Butanol 8 Parafina Tiempo 1 hora 1 hora 1 hora 30 min 30 min Se puede dejar unas horas 3 o 4 días Sólo horas si el embrión es muy pequeño. Cambiar 3 o 4 butanoles. 2 horas y 30 min. Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología –Anatomía del Desarrollo- 2 Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste Mezcla descalcificadora Embriones de más de 30 mm CR Solución Hidrato de cloral Formol 15% Mezcla descalcificadora Acido Nítrico Alcohol 96º Pasos Procedimiento 1 Colocar en mezcla descalcificadora hasta que se ablande la pieza 2 Bicarbonato de Sodio 5% 3 Lavado en agua y seguir luego el proceso normal Cantidad 1g 60 cm3 5 cm3 40 cm3 Tiempo 3 a 7 días 1 día Tratamiento de cabeza de feto de 144 mm CR Pasos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 * Practicado en el Laboratorio del Prof. Orts Llorca Procedimiento Tiempo Fijación en formol al 10%. Descalcificación en solución de: 34 días ácido tricloroacético 5% formol 10% Alcohol 96% 4 días Butanol 1 6 días Butanol 2 13 días Butanol 3 7 días Parafina 1 8 días Parafina 2 8 días Parafina 3 1 día Inclusión Cortes con micrótomo de deslizamiento a 15 y 10 micras Técnica de Bielchovsky para cabeza de embrión de pollo Pasos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Procedimiento Piridina Agua corriente Agua destilada Nitrato de Plata al 3% Lavado en agua destilada mientras se prepara la plata amoniacal Plata amoniacal Formol Neutro al 10% Lavado en agua Deshidratación e inclusión Tiempo 4 días 1 día 1 día 5 días 1 día 1 día Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología –Anatomía del Desarrollo- 3 Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste Técnica 1. Descalcificación para inclusión Pasos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Procedimiento Tiempo 5 ml de formol al 40% Renovar cada 2 Fijación en solución de: 10 ml de Ácido Nítrico D=1,41 o 3 días 100 ml de Agua destilada Controlar la descalcificación con: Solución de oxalato sódico o amoniaco al 5%. A 5 ml exactos del descalcificante neutralizar con hidroxido de sodio 2N frente a solución de fenolftaleina. A 5 ml de descalcificante añadir NaOH 2N en cantidad determinada por el procedimiento de neutralización y de ellos se toman 2 ml a los que se añade1 ml de oxalato sódico al 5% esperando 5 minutos. En tanto aparezca turbidez se sustituye el descalcificante Lavar, una vez descalcificada, en agua corriente 30 minutos Pasar por solución de sulfato de sodio al 5% 12 horas Lavar en agua corriente 24 horas Deshidratar según los siguientes parámetros 30º 12 hs 40º 12 hs 50º 12 hs 60º 12 hs 70º 12 hs 80º 24 hs 90º 12 hs 90º 12 hs (repetido) 100º 24 hs 100º 24 hs 100º 12 hs Incluir en parafina Técnica 2. Descalcificación de embriones de más de 30 mm o fetos Sustancia Cantidad Hidrato Cloral 1g Formula 1º variante Formol al 15% 60 ml Ácido Nítrico 5 ml Alcohol 96º 40 ml Formula 2º variante Formol al 15% 95 ml Ácido Nítrico 5 ml Pasos Procedimiento Tiempo 1 Colocar la pieza fijada en el descalcificador Cambiar el líquido controlando con aguja en las partes óseas accesibles cada dos días 2 Lavado en sol. de bicarbonato de sodio al 5% 24 hs Nota: Lavar mucho en agua destilada para que se pierda el amarillo en los cortes de parafina (después de desparafinar). Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología –Anatomía del Desarrollo- 4 Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste Técnica para quitar el aire en embriones mayores Previo a la aclaración con benxol o xilol los embriones (luego del alcohol absoluto) deben sumergirse en benzoato de metilo con 1% de celoidina. Al contener aire al embrión flota y luego de un tiempo variable se hunde en el líquido. No dejarlo demasiado porque lo reseca y pasarlo al Benzol o Xilol (menos tiempo que el normal). Soluciones. Fórmulas Preparación del formol neutro. Solución de formol oficinal puro con carbonato de magnesio a saturación o creta. Alcoholes 50º 60º 70º 80º 90º Agua destilada Alcohol 96º c.s.p Agua destilada Alcohol 96º c.s.p Agua destilada Alcohol 96º c.s.p Agua destilada Alcohol 96º c.s.p Agua destilada Alcohol 96º c.s.p 48 ml 100 ml 38,4 ml 100 ml 28,8 ml 100 ml 19,2 ml 100 ml 9 ml 100 ml Preparación del carbol-xilol (10% de fenol en Xilol) Fenol 10 ml Xilol 100 ml Fijadores utilizados Fijador de Carnoy Alcohol 100º Cloroformo Ac. Acético 12 vol. 6 vol. 2 vol. Fijador de Bouin Sos. Acido pícrico a saturación Formol al 40% Ácido Acético 15 vol (150 ml) 4 vol (40 ml) 1 vol (10 ml) Fijador de Rossman (Optimo para el PAS) Alcohol de 90º saturado de ácido pícrico 8 vol Formol (Merck) 1.5 vol Procedimiento: Ambos componentes se enfrían en frigorífico a unos 7ºC. Se mezclan en el momento de usarlos. La fijación se inicia en frío (7ºC) durante 6 o 7 hs. Después de 12 hs a temperatura ambiente. Luego: alcohol 95º; 100º; Benzol. Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología –Anatomía del Desarrollo- 5 Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste Método de Born Para determinar el espesor de las láminas de cera multiplicar el aumento del dibujo por el espesor de micras del corte. Ejemplo: 125 aumentos x 8 micras = 1000 micras = 1 mm. El aumento del dibujo o proyección se determina por la cámara con la rejilla especial o por la colación en el lugar del porta de un papel milimetrado cuando falta la primera. Hacer fabricar flejes de bronce de 0, 5, 1, 1.5 y 2 mm. Elementos necesarios: Plancha de hierro fundido. Rodillo de acero y tener gas suficiente. También cucharones para el volcado y espátulas tipo pintor de tamaño diverso. Lugar amplio. Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología –Anatomía del Desarrollo- 6
