nuevos aislados de bacillus thuringiensis activos en

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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2 162 799
kInt. Cl. : A01N 63/00
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
A01N 63/02
C12N 15/32
C12N 1/20
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 92925087.6
kFecha de presentación: 06.11.1992
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 612 218
kFecha de publicación de la solicitud: 31.08.1994
T3
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54 Tı́tulo: Nuevos aislados de Bacillus thuringiensis activos en coleópteros y genes que codifican
toxinas activas para coleópteros.
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73 Titular/es: MYCOGEN CORPORATION
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72 Inventor/es: Payne, Jewel M. y
30 Prioridad: 06.11.1991 US 788638
5501 Oberlin Drive
San Diego, California 92121, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.01.2002
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45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 162 799 T3
16.01.2002
Aviso:
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Fu, Jenny M.
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74 Agente: Carpintero López, Francisco
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 162 799 T3
DESCRIPCION
Nuevos aislados de Bacillus thuringiensis activos en coleópteros y genes que codifican toxinas activas
para coleópteros.
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Antecedentes de la invención
El microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria formadora de esporas, Grampositiva, caracterizada por inclusiones proteicas cristalinas de parasporas. A menudo, éstas pueden
observarse con un microscopio como cristales con formas caracterı́sticas. Las proteı́nas son muy tóxicas
para las plagas y especı́ficas en su actividad. Se han aislado y secuenciado ciertos genes de toxinas de
B.t., y se han producido y aprobado productos de B.t. basados en ADN recombinante. Además, con el
uso de técnicas de ingenierı́a genética, se están desarrollando nuevos enfoques para liberar endotoxinas
de B.t. en medios agrı́colas, incluyendo el uso de plantas modificadas por ingenierı́a genética con genes
de endotoxinas para la resistencia a insectos y el uso de células microbianas intactas estabilizadas, tales
como vehı́culos de liberación de endotoxinas de B.t. (Gaertner, F.H., L. Kim [1988] TIBTECH 6:S4-S7).
De esta manera, están adquiriendo valor comercial los genes de endotoxinas de B.t. aisladas.
Bacillus thuringiensis produce un cristal o paraspora proteica que es tóxica cuando se ingiere por
un insecto huésped susceptible. Desde hace más de 30 años, el uso comercial de pesticidas de B.t. se
ha restringido en gran medida a un intervalo estrecho de plagas de lepidópteros (orugas). Durante muchos años se han usado preparaciones de las esporas y cristales de B. thuringiensis subespecie kurstaki
como insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, B. thuringiensis var. kurstaki
HD-1 produce un cristal denominado endotoxina delta que es tóxico para las larvas de varios insectos
lepidópteros.
Sin embargo, durante los últimos años, los investigadores han descubierto pesticidas de B.t. con especificidades por una serie mucho más amplia de plagas. Por ejemplo, otras especies de B.t., particularmente
israelensis y san diego (a.k.a. B.t. tenebrionis), se han usado comercialmente para combatir insectos de
los órdenes Diptera y Coleoptera, respectivamente (Gaertner, F.H. [1989] “Cellular Delivery Systems
for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms,” en Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, ed., Taylor y Francis, Nueva York y Londres, 1990, páginas 245-255).
Véase también Couch, T.L. (1980) “Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. israelensis,”
Developments in Industrial Microbiology 22:61-76; Beegle, C.C., (1978) “Use of Entomogenous Bacteria
in Agroecosystems,” Developments in Industrial Microbiology 20:97-104. Krieg, A., A.M. Huger, G.A.
Langenbruch, W. Schnetter (1983) Z. ang. Ent. 96:500-508, describe un aislado de B.t. denominado
Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, que, según se informa, es activo contra dos escarabajos del orden
Coleoptera. Éstos son el escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, y Agelastica
alni.
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Recientemente se han identificado muchas nuevas subespecies de B.t., y se han aislado muchos genes
responsables de proteı́nas de δ-endotoxinas activas (Höfte, H., H.R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52(2):242-255). Höfte y Whiteley clasificaron 42 genes de proteı́nas cristalinas de B.t. en 14 genes
distintos, agrupados en 4 clases principales basándose en la secuencia de aminoácidos y en la serie de
huéspedes. Las clases fueron CryI (especı́fica para lepidópteros), CryII (especı́fica para lepidópteros y
dı́pteros), CryIII (especı́fica para coleópteros) y CryIV (especı́fica para dı́pteros). El descubrimiento de
cepas tóxicas especı́ficamente para patógenos protozoarios, trematodos parasitarios del hı́gado de animales (Trematoda) o ácaros (Acari) ha ampliado aún más el espectro potencial del producto de B.t. (véase
Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992] Bio/Technology 10:271-275). Con actividades contra dianas
únicas, estas nuevas cepas retienen su alta especificidad biológica; sin que se vean afectados los organismos no diana. La disponibilidad de un gran número de toxinas de B.t. diversas también puede permitir
que los agricultores adopten estrategias de uso de productos que minimizan el riesgo de que aparezcan
plagas resistentes a B.t.
La clonación y expresión de un gen de proteı́na cristalina de B.t. en Escherichia coli se ha descrito en
la bibliografı́a publicada (véase, por ejemplo, Schnepf, H.E., H.R. Whitely [1981] Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78:2893-2897). Tanto la Patente de Estados Unidos 4.448.885 como la Patente de Estados Unidos
4.467.036 describen la expresión de la proteı́na cristalina de B.t. en E. coli. La Patente de Estados Unidos
4.853.331 describe la cepa de B. thuringiensis san diego (a.k.a. B.t. tenebrionis) que puede usarse para
combatir plagas de coleópteros en diversos medios.
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El documento EP-A-0382990 describe una toxina cristalina activa para coleópteros. También se describen toxinas de B.t. en los documentos WO-A-90/13651, WO-A-91/16433 y US-A-4996155.
Breve Resumen de la invención
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La presente invención se refiere al descubrimiento de que ciertas cepas conocidas y disponibles para
el público de Bacillus thuringiensis (B.t.) son activas contra plagas de coleópteros. Éste es un descubrimiento sorprendente, ya que no se sabı́a que estos microbios de B.t. tuvieran ninguna actividad
insecticida.
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Los microbios de la presente invención se obtuvieron a partir de la colección Howard Dalmage mantenida por el cultivo NRRL depositado en Peoria, Illinois y se denominan B.t. HD511 y B.t. HD867.
Estos microbios, y variantes de estos microbios, ası́ como genes y toxinas que se pueden obtener a partir
de los mismos, pueden usarse para combatir plagas de coleópteros. Los procedimientos para usar estos
microbios son similares a los procedimientos conocidos para usar los microbios de la especie B.t. para
combatir plagas de coleópteros.
Además, la invención también incluye el tratamiento de células de B.t. sustancialmente intactas, y de
células recombinantes que contienen un gen de la invención, para prolongar la actividad pesticida cuando
las células sustancialmente intactas se aplican al medio de una plaga diana. Tal tratamiento puede realizarse por medios quı́micos o fı́sicos, o por una combinación de medios quı́micos o fı́sicos, siempre que
la técnica no afecte perjudicialmente a las propiedades del pesticida ni disminuya la capacidad celular de
proteger al pesticida. Las células tratadas actúan como recubrimiento protector para la toxina pesticida.
La toxina se vuelve disponible para actuar como tal tras ser ingerida por un insecto diana.
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En este documento se describen toxinas especı́ficas, y secuencias de nucleótidos que codifican estas
toxinas, que se pueden obtener a partir de los aislados ilustrados. Ventajosamente, estas secuencias de
nucleótidos pueden usarse para transformar otros microbios o plantas y crear composiciones y plantas
insecticidas.
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Breve Descripción de las Secuencias
La SEC ID NO. 1 es la secuencia de nucleótidos que codifica la toxina HD511.
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La SEC ID NO. 2 es la secuencia de aminoácidos de la toxina HD511.
La SEC ID NO. 3 es la secuencia de nucleótidos que codifica la toxina HD867.
La SEC ID NO. 4 es la secuencia de aminoácidos de la toxina HD867.
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Descripción detallada de la invención
En la Tabla 1 se muestra un resumen de las caracterı́sticas de los microbios B. thuringiensis de la
presente invención.
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TABLA 1
Una comparación de las nuevas cepas activas para coleópteros con B.t.s.d
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Cepa
Tipo de Cristal
Peso Molecular Aprox. de Proteı́na*
Serotipo
HD511
HD867
Bipiramidal
Bipiramidal
130, 143
130
15, dakota
18, kumamotoensis
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∗ como se muestra en un gel de poliacrilamida convencional.
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Los cultivos descritos en esta solicitud están en depósito en el Agricultural Research Service Patent
Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria,
Illinois 61604, Estados Unidos.
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En una realización preferida, la información de la secuencia de nucleótidos proporcionada en este documento puede usarse para fabricar cebadores que, cuando usan procedimientos de PCR convencionales,
pueden usarse para obtener los genes deseables a partir de los aislados descritos. Estos procedimientos
son bien conocidos y se usan comúnmente en esta técnica. Como alternativa, pueden fabricarse genes
sintéticos o porciones de los mismos usando una “máquina de genes” y la información de la secuencia
proporcionada en este documento.
La presente invención se refiere no sólo a los genes especı́ficos y toxinas ilustrados en este documento,
sino también a genes y toxinas que se pueden obtener a partir de variantes de los aislados descritos.
Estas variantes tendrı́an esencialmente la misma actividad contra coleópteros que los aislados ilustrados. Además, usando la secuencia de ADN y de aminoácidos proporcionada en este documento, una
persona especialista en la técnica podrı́a construir fácilmente fragmentos o mutaciones de los genes y
toxinas descritos en este documento. Estos fragmentos y mutaciones que retienen la actividad contra
los coleópteros de las toxinas ilustradas, estarı́an dentro del alcance de la presente invención. Además,
a causa de la redundancia del código genético, una diversidad de secuencias de ADN diferentes pueden
codificar las secuencias de aminoácidos descritas en este documento. Está bien dentro de la experiencia
de una persona formada en la técnica la creación de estas secuencias de ADN alternativas que codifican
la misma toxina o toxinas similares. Estas secuencias de ADN están dentro del alcance de la presente
invención. Como se usa en este documento, “esencialmente la misma” secuencia se refiere a secuencias
que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan materialmente
a la actividad contra los coleópteros. En esta definición también se incluyen fragmentos que retienen la
actividad contra los coleópteros.
Los genes de toxinas activas contra coleópteros de la presente invención pueden aislarse por procedimientos conocidos y pueden introducirse en una amplia diversidad de huéspedes microbianos. La
expresión del gen de la toxina ocasiona, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. Con huéspedes adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden
aplicarse al sitio de los insectos coleópteros donde proliferarán y serán ingeridos por los insectos. El
resultado es un control de los insectos indeseados. Como alternativa, el microbio que hospeda al gen de
la toxina puede tratarse en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula.
La célula tratada después puede aplicarse al medio de la plaga o plagas diana. El producto resultante
retiene la toxicidad de la toxina de B.t.
Cuando el gen de la toxina de B.t. se introduce por medio de un vector adecuado en un huésped
microbiano y dicho huésped se aplica al medio en un estado vivo, es importante usar ciertos microbios
huésped. Se seleccionan microorganismos huéspedes que se sabe que ocupan la “fitosfera” (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de
manera que sean capaces de competir satisfactoriamente en el medio particular (cultivos y otros hábitats
de insectos) con los microorganismos de tipo silvestre, proporcionando un mantenimiento y expresión
estables del gen que expresa el pesticida polipeptı́dico y, deseablemente, mejorando la protección del
pesticida de la degradación e inactivación ambiental.
Se sabe que un gran número de microorganismos habitan en el filoplano (la superficie de las hojas de
las plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea a las raı́ces de las plantas) de una amplia diversidad de
cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de un interés particular microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia,
Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium,
Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, particularmente
levaduras, por ejemplo, los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de un interés particular especies bacterianas de la fitosfera tales como
Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophusy Azotobacter vinlandii; y especies de levadura de la fitosfera tales como Rhodotorula
rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y
Aureobasidium pollulans. Son de un interés particular los microorganismos pigmentados.
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Se dispone una amplia diversidad de formas para introducir el gen de B.t. que expresa la toxina en
el microorganismo huésped en condiciones que permitan el mantenimiento y la expresión estable del gen.
Se pueden proporcionar construcciones de ADN que incluyan las señales reguladoras de la transcripción
y la traducción para la expresión del gen de la toxina, el gen de la toxina bajo su control regulador y
una secuencia de ADN homóloga a la secuencia en el organismo huésped, con lo que se producirá la
integración, y/o un sistema de replicación que sea funcional en el huésped, con lo que se producirá una
integración o mantenimiento estable.
Las señales de inicio de la transcripción incluirán un promotor y un sitio de inicio de la transcripción.
En algunos casos, puede ser deseable proporcionar la expresión reguladora de la toxina, produciéndose la
expresión de la toxina sólo después de la liberación en el medio. Esto puede conseguirse con operadores
o con una región de unión a un activador o a potenciadores que sean capaces de inducirse tras un cambio
en el medio fı́sico o quı́mico de los microorganismos. Por ejemplo, puede emplearse una región reguladora
sensible a la temperatura, donde los organismos pueden crecer en el laboratorio sin expresión de la toxina,
pero que tras la liberación en el medio, comienza la expresión. Otras técnicas pueden emplear un medio
nutriente especı́fico en el laboratorio que inhiba la expresión de la toxina, permitiendo el medio nutriente
en el medio la expresión de la toxina. Para el inicio de la traducción, estarán presentes un sitio de unión
a ribosomas y un codón de iniciación.
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Para aumentar la expresión del mensajero pueden emplearse diversas manipulaciones, particularmente
usando un promotor activo, ası́ como empleando secuencias que aumenten la estabilidad del ARN mensajero. Las regiones de iniciación y de terminación de la traducción incluirán un codón o codones de
parada, una región terminadora y, opcionalmente, una señal de poliadenilación.
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En la dirección de la transcripción, particularmente en la dirección 5’ a 3’ de la secuencia codificante
o con sentido, la construcción puede incluir la región reguladora de la transcripción, si es el caso, y el
promotor, pudiendo estar la región reguladora en posición 5’ o 3’ con respecto al promotor, el sitio de
unión a ribosomas, el codón de iniciación, el gen estructural que tiene una fase de lectura abierta en fase
con el codón de iniciación, el codón stop, la secuencia señal de poliadenilación, si es el caso, y la región de
terminación. Esta secuencia, en forma de doble cadena puede usarse por sı́ misma para la transformación
de un microorganismo huésped, pero normalmente se incluirá con una secuencia de ADN que incluya
un marcador, pudiendo unirse la segunda secuencia de ADN a la construcción de expresión de la toxina
durante la introducción del ADN en el huésped.
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Por marcador se entiende un gen estructural que permite la selección de los huéspedes que se han
modificado o transformado. El marcador normalmente proporcionará una ventaja selectiva, por ejemplo, proporcionando resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos o a metales pesados;
complementación, proporcionando prototrofia a un huésped auxotrófico, o similares. Preferiblemente
se emplea complementación, de forma que el huésped modificado no sólo pueda seleccionarse, sino que
también pueda ser competitivo en el campo. En el desarrollo de las construcciones pueden emplearse
uno o más marcadores, ası́ como para modificar al huésped. Los organismos pueden modificarse adicionalmente proporcionando una ventaja competitiva contra otros microorganismos de tipo silvestre en el
campo. Por ejemplo, en el huésped pueden introducirse genes que expresan agentes quelantes metálicos,
por ejemplo, sideróforos, junto con el gen estructural que expresa la toxina. De esta manera, la expresión
potenciada del sideróforo puede proporcionar una ventaja competitiva para el huésped que produce la
toxina, de forma que pueda competir eficazmente con los microorganismos de tipo silvestre y ocupar de
forma estable un nicho en el medio.
Cuando se desee un mantenimiento o integración episomal estable, se empleará un plásmido que tenga
un sistema de replicación funcional en el huésped. El sistema de replicación puede proceder del cromosoma, un elemento episomal normalmente presente en el huésped o en un huésped diferente, o un sistema
de replicación procedente de un virus que es estable en el huésped. Se dispone de un gran número de
plásmidos, tales como pBR322, pACYC184, RSF1010, pRO1614 y similares. Véase, por ejemplo, Olson
y col. (1982) J. Bacteriol. 150:6069 y Bagdasarian y col., (1981) Gene 16:237, y las Patentes de Estados
Unidos Nos. 4.356.270, 4.362.817 y 4.371.625.
Cuando no esté presente ningún sistema de replicación funcional, la construcción también incluirá
una secuencia de al menos 50 pares de bases (pb), preferiblemente al menos aproximadamente 100 pb y
normalmente no más de aproximadamente 1000 pb de una secuencia homóloga con una secuencia del
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huésped. De esta forma, se aumenta la probabilidad de recombinación legı́tima, de forma que el gen
se integrará en el huésped y se mantendrá de forma estable por el huésped. Deseablemente, el gen de
la toxina estará próximo al gen que proporciona complementación, ası́ como al gen que proporciona la
ventaja competitiva. Por lo tanto, en caso de que se pierda el gen de la toxina, el organismo resultante
probablemente también perderá el gen de complementación y/o el gen que proporciona la ventaja competitiva, de forma que no podrá competir en el medio con el gen que retiene la construcción intacta.
Se dispone de un gran número de regiones reguladoras de la transcripción de una amplia diversidad
de microorganismos huéspedes, tales como bacterias, bacteriófagos, cianobacterias, algas, hongos y similares. Varias regiones reguladoras de la transcripción incluyen las regiones asociadas con el gen trp, el
gen lac, el gen gal, los promotores izquierdo y derecho de lambda, el promotor tac y los promotores que
se producen de forma natural asociados con el gen de la toxina, cuando sean funcionales en el huésped.
Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.332.898, 4.342.832 y 4.356.270. La región de
terminación puede ser la región de terminación asociada normalmente con la región de iniciación de la
transcripción o una región de iniciación de la transcripción diferente, siempre que las dos regiones sean
compatibles y funcionales en el huésped.
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El gen de B.t. puede introducirse entre la región de iniciación de la transcripción y la traducción y
la región de terminación de la transcripción y la traducción, de forma que esté bajo el control regulador
de la región de iniciación. Esta construcción puede incluirse en un plásmido, que podrı́a incluir al menos
un sistema de replicación, pero puede incluir más de uno cuando se emplea un sistema de replicación
para la clonación durante el desarrollo del plásmido y se necesita un segundo sistema de replicación para
el funcionamiento de la construcción en el huésped final. Además, pueden estar presentes uno o más
marcadores, que se han descrito previamente. Cuando se desee la integración, el plásmido deseablemente
incluirá una secuencia homóloga con el genoma del huésped.
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Los transformantes pueden aislarse de acuerdo con formas convencionales, normalmente empleando
una técnica de selección que permita la selección del organismo deseado frente a los organismos no modificados u organismos de transferencia, cuando estén presentes. Los transformantes después pueden
ensayarse con respecto a la actividad pesticida.
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Las células huésped adecuadas, donde las células que contienen el pesticida se tratarán para prolongar la actividad de la toxina en la célula cuando la célula tratada se aplique al medio de la plaga
diana, pueden incluir procariotas y eucariotas, limitándose normalmente a las células que no producen
sustancias tóxicas para los organismos superiores, tales como mamı́feros. Sin embargo, podrı́an usarse
organismos que producen sustancias tóxicas para organismos superiores en los que la toxina es inestable
o el nivel de aplicación suficientemente bajo como para evitar cualquier posibilidad de toxicidad para un
huésped mamı́fero. Como huéspedes, serán de interés particular los procariotas y los eucariotas inferiores,
tales como hongos. Los procariotas ilustrativos, tanto Gram-negativos como Gram-positivos, incluyen
organismos de la familia Enterobacteriaceae tales como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tales como Rhizobium; Spirillaceae, tales como fotobacterias, Zymomonas,
Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirilum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como
Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae. Entre los eucariotas se encuentran
hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluyen levaduras, tales como Saccharomyces y
Schizosaccharomyces; y levaduras Basidiomycetes, tales como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces y similares.
La célula normalmente estará intacta y estará sustancialmente en forma proliferativa cuando se trate,
en lugar de en forma de espora, aunque en algunos casos pueden emplearse esporas.
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El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo, un microbio que contiene el gen de la toxina de
B.t. puede realizarse por medios quı́micos o fı́sicos o por una combinación de medios quı́micos y/o fı́sicos,
siempre que la técnica no afecte perjudicialmente a las propiedades de la toxina ni disminuya la capacidad
celular de proteger a la toxina. Son ejemplos de reactivos quı́micos agentes halogenantes, particularmente
halógenos de número atómico 17-80. Más particularmente, puede usarse yodo en condiciones suaves y
durante un tiempo suficiente como para conseguir los resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el tratamiento con aldehı́dos, tales como formaldehı́do y glutaraldehı́do; anti-infecciosos tales como
cloruro de cefirán y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes tales como isopropilo y etanol; diversos fijadores
histológicos tales como fijador de Bouin y fijador de Helly (véase: Humason, Gretchen L. [1967] Animal
Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company); o una combinación de agentes fı́sicos (calor) y quı́micos
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que conservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se administra
al animal huésped. Son ejemplos de medios fı́sicos la radicación de longitud de onda corta, tales como la
radiación gamma y la radiación X, la congelación, la irradiación UV, la liofilización y similares.
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Las células generalmente tendrán una mayor estabilidad estructural que aumentará la resistencia a las
condiciones ambientales. Cuando el pesticida está en una proforma, el procedimiento de inactivación debe
seleccionarse de manera que no inhiba el procesamiento de la proforma a la forma madura del pesticida
por el patógeno de la plaga diana. Por ejemplo, el formaldehı́do formará enlaces cruzados con proteı́nas
y podrı́a inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida polipeptı́dico. El procedimiento de
inactivación o destrucción retiene al menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad
de la toxina.
Las caracterı́sticas de interés particular en la selección de una célula huésped para la producción
incluyen la facilidad de introducción del gen de B.t. en el huésped, la disponibilidad de sistemas de expresión, la eficacia de la expresión, la estabilidad del pesticida en el huésped y la presencia de capacidades
genéticas auxiliares. Las caracterı́sticas de interés para uso como una microcápsula pesticida incluyen
calidades protectoras para el pesticida, tales como paredes celulares espesas, pigmentación y empaquetamiento intracelular o formación de cuerpos de inclusión; afinidad por las hojas; ausencia de toxicidad para
los mamı́feros; atractivo para ser ingeridas por las plagas; facilidad de destrucción y fijación sin daños
para la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen la facilidad de formulación y manipulación,
aspectos económicos, estabilidad durante el almacenamiento, y similares.
Los organismos huésped de interés particular incluyen levaduras, tales como Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp., y Sporobolomyces sp; organismos del filoplano tales comoPseudomonas
sp., Erwinia sp. y Flavobacterium sp.; u otros organismos tales como Escherichia, Lactobacillus sp.,
Bacillus sp., y similares. Los organismos especı́ficos incluyen Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis y similares.
La célula huésped que contiene el gen de B.t. puede desarrollarse en cualquier medio nutriente conveniente en el que la construcción de ADN proporciona una ventaja selectiva, proporcionando un medio
selectivo, de forma que sustancialmente todas o todas las células retengan el gen de B.t. Estas células
después pueden recogerse por medios convencionales. Como alternativa, las células pueden tratarse antes
de la recolección.
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Las células B.t. pueden formularse de varias formas. Pueden emplearse como polvos humectables,
gránulos o polvo fino, mezclándose con diversos materiales inertes tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maı́z en polvo,
cáscara de arroz, cáscaras de nuez y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes adherentes
de extensión, agentes estabilizantes, otros aditivos pesticidas o tensoactivos. Las formulaciones lı́quidas
pueden ser acuosas o no acuosas y pueden emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados
emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, tensoactivos, emulsionantes,
dispersantes o polı́meros.
La concentración pesticida variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un concentrado o se va a usar directamente. El pesticida estará presente en
una proporción de al menos aproximadamente un 1 % en peso y puede estar presente en una proporción
de aproximadamente un 100 % en peso. Las formulaciones secas tendrán de aproximadamente un 1 a un
95 % en peso del pesticida, mientras que las formulaciones lı́quidas generalmente tendrán de un 1 a un
60 % en peso de los sólidos en la fase lı́quida. Las formulaciones generalmente tendrán de aproximadamente 102 a aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones se administrarán en una cantidad de
aproximadamente 50 mg (lı́quido o seco) a 1 kg o más por hectárea.
55
Las formulaciones pueden aplicarse al medio de la plaga de coleópteros, por ejemplo, plantas, suelo o
agua, por pulverización, espolvoreo, aspersión o similares.
60
A continuación se proporcionan ejemplos que ilustran procedimientos, incluyendo el mejor modo para
poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deben considerarse limitantes. Todos los porcentajes
son en peso y todas las proporciones de mezclas de disolventes son en volumen a menos que se indique
otra cosa.
7
ES 2 162 799 T3
Ejemplo 1
Cultivo de microbios B.t.
5
10
15
20
Puede usarse un subcultivo de un microbio B.t. como se describe en este documento para inocular el
siguiente medio, una peptona, glucosa o medio de sales.
Bacto Peptona
Glucosa
KH2 PO4
K2 HPO4
Solución salina
Solución de CaCl2
7,5 g/l
1,0 g/l
3,4 g/l
4,35 g/l
5,0 ml/l
5,0 ml/l
Solución de Sales (100 ml)
MgSO4 ·7H2 O
MnSO4 ·H2 O
ZnSO4 ·7H2 O
FeSO4 ·7H2 O
2,46
0,04
0,28
0,40
g
g
g
g
Solución de CaCl2 (100 ml)
CaCl2 ·2H2 O
3,66 g
pH 7,2
25
La solución de sales y la solución de CaCl2 se esterilizan por filtración y se añaden al autoclave y
al caldo calentado en el momento de la inoculación. Los matraces se incuban a 30◦ C en un agitador
rotatorio a 200 rpm durante 64 horas.
30
35
El procedimiento anterior puede aumentarse fácilmente a escala en fermentadores grandes por procedimientos bien conocidos en la técnica.
Las esporas y los cristales de B.t. obtenidos en la fermentación anterior pueden aislarse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Un procedimiento usado frecuentemente es someter el caldo de
fermentación recogido a técnicas de separación, por ejemplo, centrifugación.
Ejemplo 2
Ensayo de Esporas y Cristales de Microbios B.t.
40
45
50
Las cepas B.t. se ensayaron contra Leptinotarsa rubiginosa, un sustituto de Leptinotarsa decemlineata,
el escarabajo de la patata de Colorado.
El bioensayo se realizó en dos preparaciones diferentes de Bacillus thuringiensis (1). Los gránulos
de esporas/cristales se resuspendieron en agua. (2) Los gránulos de esporas/cristales se trataron con
Na2 CO3 0,1 M, pH 11,5, con 2-mercaptoetanol al 0,5 % durante dos horas a temperatura ambiente. La
Prep. No. 2 se dializó frente a Tris 0,1 M pH 8 durante tres horas con tres cambios de 15 veces el volumen
de la muestra. La prep. No. 1 y la Prep. No. 2 contenı́an cantidades iguales de ingrediente activo.
Las hojas se sumergieron en las preparaciones de B.t. y se pusieron larvas en la primera fase larvaria
en las hojas. Las larvas se incubaron a 25◦ C durante 4 dı́as antes de determinar la mortalidad.
TABLA 2
Porcentaje de Mortalidad
55
60
Cepa
Prep. No. 1
Prep. No. 2
HD511
HD867
HD1011
Control
52 %
92 %
36 %
0%
92 %
100 %
92 %
0%
8
ES 2 162 799 T3
Ejemplo 3
Inserción del Gen de la Toxina en Plantas
5
10
15
20
Un aspecto de la presente invención es la transformación de plantas con genes que codifican una toxina
para coleópteros. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por los coleópteros.
Pueden insertarse genes que codifican toxinas activas para lepidópteros, como se describe en este
documento, en células vegetales, usando una diversidad de técnicas bien conocidas en la técnica. Por
ejemplo, se dispone de un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas, para la inserción
de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, las series de
pUC, las series de M13mp, pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la toxina de B.t.
puede insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para la
transformación de E. coli. Las células E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, después se
recogen y se lisan. El plásmido se recupera. Como procedimientos de análisis generalmente se realizan el
análisis de la secuencia, el análisis de restricción, la electroforesis y otros procedimientos bioquı́micos-de
biologı́a molecular. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada puede escindirse y unirse
a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo o en otros
plásmidos. Dependiendo del procedimiento de inserción de los genes deseados en la planta, pueden ser
necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación
de la célula vegetal, entonces al menos el borde derecho, pero más a menudo el borde derecho e izquierdo
del T-ADN del plásmido Ti o Ri, tiene que unirse como región flanqueante de los genes a insertar.
25
El uso de T-ADN para la transformación de células vegetales se ha investigado intensivamente y se
ha descrito suficientemente en el documento EP 120 516; Hoekema (1985) En: The Binary Plant Vector
System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Capı́tulo 5; Fraley y col., Crit. Rev. Plant Sci,
4:1-46; y An y col., (1985) EMBO J. 4:277-287.
30
Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma, es relativamente estable y, en principio,
no sale de nuevo. Normalmente contiene un marcador de selección que confiere a las células vegetales
transformadas resistencia a un biocida o a un antibiótico, tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o cloramfenicol, entre otros. Por consiguiente, el marcador empleado individualmente debe
permitir la selección de las células transformadas en lugar de las células que no contienen el ADN insertado.
35
40
45
50
55
Se dispone de un gran número de técnicas para insertar el ADN en una célula huésped vegetal. Estas técnicas incluyen la transformación con T-ADN usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección o electroporación, ası́ como otros procedimientos posibles. Si se usan agrobacterias para la transformación, el ADN a insertar tiene que clonarse
en plásmidos especiales, particularmente en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores
intermedios pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri por recombinación homóloga debido a la secuencias
que son homólogas a las secuencias del T-ADN. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir
necesaria para la transferencia del T-ADN. Los vectores intermedios no pueden replicarse por sı́ mismos
en agrobacterias. El vector intermedio puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens por medio de un
plásmido adyuvante (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse por sı́ mismos tanto en E.
coli como en agrobacterias. Comprenden un gen marcador selectivo y un engarce o poliengarce que están
enmarcados por las regiones de borde izquierda y derecha del T-ADN. Pueden transformarse directamente en agrobacterias (Holsters y col. [1978] Mol. Gen. Genet. 163:181-187). La agrobacteria usada
como célula huésped debe comprender un plásmido que lleve una región vir. La región vir es necesaria
para la transferencia del T-ADN a la célula vegetal. Puede estar contenido un T-ADN adicional. La
bacteria transformada de esta forma se usa para la transformación de células vegetales. Ventajosamente,
pueden cultivarse explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la
transferencia del ADN a la célula vegetal. Después, las plantas enteras pueden regenerarse a partir del
material vegetal infectado (por ejemplo, piezas de hojas, segmentos de tallo, pero también protoplastos o
células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para
la selección. Las plantas obtenidas de esta forma después pueden ensayarse con respecto a la presencia
del ADN insertado. No se requieren plásmidos especiales en caso de inyección y electroporación. Es
posible usar plásmidos normales, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.
60
9
ES 2 162 799 T3
5
Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la forma habitual. Pueden formar células
germinales y transmitir el rasgo transformado a las plantas de la progenie. Tales plantas pueden desarrollarse de la forma normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados
u otros factores hereditarios. Los individuos hı́bridos resultantes tienen las correspondientes propiedades
fenotı́picas.
Ejemplo 4
Clonación de Nuevos Genes B.t. en Virus de Insectos
10
15
Se conocen varios virus que infectan insectos. Estos virus incluyen, por ejemplo, baculovirus y entomopoxvirus. En una realización de la presente invención, pueden ponerse genes activos para lepidópteros,
como se han descrito en este documento, con el genoma del virus del insecto, aumentando de esta forma
la patogenicidad del virus. Los procedimientos para construir virus de insectos que comprenden genes de
toxina de B.t. son bien conocidos y se ponen en práctica fácilmente por los especialistas en la técnica.
Estos procedimientos se describen, por ejemplo, en Merryweather y col. (Merryweather, A.T., U. Weyer,
M.P.G. Harris, M. Hirst, T. Booth, R.D. Possee [1990] J. Gen. Virol 71:1535-1544) y Martens y col.
(Martens, J.W.M., G. Honee, D. Zuidema, J.W.M. van Lent, B. Visser, J.M. Vlak [1990] Appl. Environmental Microbiol. 56(9):2764-2770).
20
Lista de secuencias
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
25
(i) SOLICITANTE: Payne, Jewel M.
Fu, Jenny M.
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos aislados de Bacillus thuringiensis activos en coleópteros y
genes que codifican toxinas activas para coleópteros
30
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
35
40
(A)
(B)
(C)
(D)
DESTINATARIO: David R. Saliwanchik
CALLE: 2421 N.W. 41st Street, Suite A-1
CIUDAD: Gainesville
ESTADO: FL
(E) PAÍS: Estados Unidos
(F) CÓDIGO POSTAL: 32606
45
50
(v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
(A)
(B)
(C)
(D)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
ORDENADOR: IBM PC compatible
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
SOFTWARE: Patentin Release No. 1.0, Versión No. 1.25
(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
55
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US
(B) FECHA DE PRESENTACIÓN:
(C) CLASIFICACIÓN:
60
10
ES 2 162 799 T3
(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/788.638
5
(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 de noviembre de 1991
(C) CLASIFICACIÓN:
(viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
10
(A) NOMBRE: Saliwanchik, David R.
(B) NÚMERO DE REGISTRO: 31.794
(C) NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: MA68.c1
15
(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
20
(A) TELÉFONO: 904-375-8100
(B) TELEFAX: 904-372-5800
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
25
30
(A) LONGITUD: 3414 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: doble
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
35
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv) ANTI-SENTIDO: NO
(vi) FUENTE ORIGINAL:
40
45
(A) ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
(B) CEPA: dakota
(C) AISLADO INDIVIDUAL: HD511
(vii) FUENTE INMEDIATA:
(A) BIBLIOTECA: Lamdagem (TM)-11 biblioteca de J.M. Fu
(B) CLON: 511
50
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
55
60
11
ES 2 162 799 T3
5
10
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20
25
30
35
40
45
50
55
60
12
ES 2 162 799 T3
5
10
15
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
20
(A) LONGITUD: 1138 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
25
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteı́na
(iii) HIPOTÉTICA: SÍ
(iv) ANTI-SENTIDO: NO
(vi) FUENTE ORIGINAL:
30
(A) ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
(B) CEPA: dakota
(C) AISLADO INDIVIDUAL: HD511
(vii) FUENTE INMEDIATA:
35
(A) BIBLIOTECA: Lamdagem (TM)-11 biblioteca de J.M. Fu
(B) CLON: 511
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
40
45
50
55
60
13
ES 2 162 799 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
14
ES 2 162 799 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
15
ES 2 162 799 T3
5
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:
10
15
20
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
(B)
(C)
(D)
LONGITUD: 3414 pares de bases
TIPO: ácido nucleico
CADENA: doble
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv) ANTI-SENTIDO: NO
(vi) FUENTE ORIGINAL:
25
(A) ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
(B) CEPA: kumamotoensis
(C) AISLADO INDIVIDUAL: HD867
(vii) FUENTE INMEDIATA:
30
(A) BIBLIOTECA: Lamdagem (TM)-11 biblioteca de J.M. Fu
(B) CLON: 867
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
35
40
45
50
55
60
16
ES 2 162 799 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
50
(A) LONGITUD: 1138 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
55
60
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteı́na
(iii) HIPOTÉTICA: SÍ
(iv) ANTI-SENTIDO: NO
(vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
17
ES 2 162 799 T3
(B) CEPA: kumamotoensis
(C) AISLADO INDIVIDUAL: HD867
(vii) FUENTE INMEDIATA:
5
(A) BIBLIOTECA: Lamdagem (TM)-11 biblioteca de J.M. Fu
(B) CLON: 867
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
10
15
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25
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55
60
18
ES 2 162 799 T3
5
10
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20
25
30
35
40
45
50
55
60
19
ES 2 162 799 T3
5
10
15
20
25
30
35
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55
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ES 2 162 799 T3
REIVINDICACIONES
5
1. Un procedimiento para combatir una plaga de insectos coleópteros, que comprende poner en contacto la plaga con un microbio Bacillus thuringiensis seleccionado entre B.t. HD511 y B.t. HD867, o con
una toxina que se puede obtener a partir de cualquiera de estos microbios.
2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microbio es B.t. HD511.
3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microbio es B.t. HD867.
10
15
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la plaga es el
escarabajo de la patata de Colorado.
5. Una composición que comprende un microbio o toxina de Bacillus thuringiensis como se define en
la reivindicación 1, junto con un vehı́culo inerte y en forma de un polvo humectable, gránulos, un polvo
fino o un lı́quido pulverizable.
6. Una composición que comprende un microbio o toxina como se define en la reivindicación 1, y un
fagoestimulante o atrayente para escarabajos.
20
25
7. Una toxina activa contra una plaga de coleópteros, que se puede obtener a partir de un microbio
como se define en la reivindicación 1, o comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 2
(procedente de B.t. HD511) o de la SEC ID NO. 4 (procedente de B.t. HD867).
8. Una toxina de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO. 2 (procedente de B.t. HD511).
9. Una toxina de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO. 4 (procedente de B.t. HD867).
30
35
10. Una molécula de nucleótidos que comprende ADN que codifica una toxina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11. Una molécula de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el ADN tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO. 1 (procedente de B.t. HD511).
12. Una molécula de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el ADN tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO. 3 (procedente de B.t. HD867).
40
45
13. Un huésped bacteriano o vegetal transformado para expresar una toxina de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 7 a 9.
14. Un huésped bacteriano de acuerdo con la reivindicación 13, que es una especie de Pseudomonas,
Azotobacter, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Rhizobium, Bacillus, Streptomyces, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter o Alcaligenes.
15. Un huésped de acuerdo con la reivindicación 14, que está pigmentado y es adherente al filoplano.
50
55
60
16. Un procedimiento para combatir una plaga de insectos coleópteros, que comprende exponer la
plaga a una planta de acuerdo con la reivindicación 13.
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
21