ESTUDIO DE INTERACCIONES PROTEÍNA

Profesor Patrocinante
Dr. Alejandro Claude
Instituto de Bioquímica
Facultad de Ciencias
ESTUDIO DE INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA DEL
ARF-GEF GBF1 MEDIANTE EL SISTEMA DE DOBLE HÍBRIDO
EN Saccharomyces cerevisiae, ESTABILIZACIÓN DE COMPLEJOS
POR ENTRECRUZAMIENTO Y PRECIPITACIÓN POR
AFINIDAD CON GST
Tesis de Grado presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
ANDREA GEMITA VARGAS PARRA
VALDIVIA – CHILE
2008
COMISIÓN EVALUADORA
Profesor Patrocinante: Dr. Alejandro Claude
Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Instituto de Bioquímica
Profesor Informante: Dra. Ilona Concha
Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Instituto de Bioquímica
Profesor Informante: Dr. Juan Guillermo Cárcamo
Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Instituto de Bioquímica
Esta tesis fue realizada en el laboratorio de Biología celular y Secreción de Proteínas,
dirigido por el Dr. Alejandro Claude, en el instituto de Bioquímica de la Facultad de
Ciencias de la Universidad Austral de Chile. La tesis fue financiada por el proyecto
Fondecyt Nº 1030346.
AGRADECIMIENTOS
Mis más sinceros agradecimientos al Dr. Alejandro Claude, mi profesor
patrocinante, por toda su ayuda, apoyo, guía, orientación, enseñanza y conocimiento
brindado durante este período. A los profesores informantes, la Dra. Ilona Concha y el
Dr. Juan Guillermo Cárcamo por su abierta disposición para integrar la comisión,
corregir y evaluar esta tesis. Al director de escuela, Dr Alejandro Reyes por su siempre
cordial orientación y apoyo.
Gracias a todos quienes en algún momento integraron el laboratorio de Biología
Celular y Secreción de Proteínas por su especial dedicación y ayuda en el inicio de mis
actividades prácticas, desde el taller de investigación, como por su constante
colaboración durante el transcurso de mi tesis. A la profesora Cecilia Rauch, por su gran
apoyo, confianza, consejos y cariño. A quienes fueron mis compañeros de laboratorio
Javier Rosas y Alejandro San Martín por su cooperación, apoyo y ayuda constante. A la
srta Karina por su dedicación y guía inicial en el trabajo con levaduras, y a Tatiana
Pérez por su colaboración y amistad. A mis compañeros de carrera y buenos amigos
Lorena Abarzúa, Ella Matamala, Catherinne Jaramillo, Marco Negrón, Sharin Valdivia
y Marco Vidal.
Mis agradecimientos finales a mi familia, mis padres Juan Antonio y Olvia, a
mis hermanos Jenny, Carola y Antony, a Willow, Horacio, y a mis sobrinitas Tanya,
Agatha, y Katy por su cariño y apoyo incondicional.
“ Everything that is or was… began with a dream”
ÍNDICE DE CONTENIDOS
i
1. RESUMEN………………………………………………………...…………………1
Summary…………………………………………………………………………..…..2
2. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………...……3
2.1 La vía secretoria……………………………………………………….……..3
2.2 Transporte vesicular y cubiertas tipo COPI, COPII y de Clatrina……….…..7
2.3 Familia Arf…………………………….………………………..………......11
2.4 Familia Arf-GEF………………………………………………..…………..14
2.5 Dominio Sec7………………………………………………………………17
2.6 Familia Arf- GAP....…………………………………………...……….......18
2.7 Tráfico vesicular y BFA……………………………………………………20
2.8 GBF1………………………………………………………………....….....22
3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………….28
3.1 Amplificación por PCR de fragmentos de GBF1 carnadas por PCR.……...28
3.2 Cultivo microbiológico……………………………………………………..29
3.3 Clonamiento a pGEM-T Easy…………………………………...……….....29
3.4 Clonamiento de carnadas en el vector de expresión pGBKT7…………..…30
3.5 Medios de cultivo de levaduras………...…………………………………..30
3.6 Cepas de Saccharomyces cerevisiae………………………………………..30
3.7 Vectores utilizados en el sistema Doble Híbrido………………………...…32
3.8 Ensayo de Beta- galactosidasa en filtro…………………………………….32
ii
3.9 Preparación de extractos de proteína de levaduras…………………………32
3.10 Transformación de levaduras por el método de acetato de litio…….…….33
3.11 Extracción de pDNA desde levaduras…………………………………….34
3.12 Extracción de pDNA por el método de ebullición………………………...34
3.13 Apareamiento de levaduras………………………………………..............35
3.14 Entrecruzamiento de proteínas con DTBP................……………………...35
3.15 Preparación de extractos proteicos de células EBNA……………………..36
3.16 SDS-PAGE………………………………………………………………..36
3.17 Western Blot………………………………………………………………37
3.18 Anticuerpos………………………………………………………………..37
3.19 Stripping de membranas…………………………………………………..38
3.20 Purificación por afinidad con GST...........................……………………...38
3.21 Tinción de geles de poliacrilamida con sales de plata…………………….39
4. RESULTADOS……...……………………………………………………………...40
4.1 Doble Híbrido………………………………………………………………40
4.1.1 Amplificación por PCR de fragmentos de GBF1
para posterior construcción de híbridos carnadas………………..40
4.1.2 Clonamiento de los fragmentos de PCR carnadas
en pGEMT- easy… …………………………………………..….47
4.1.3 Clonamiento de los fragmentos carnadas en el vector
de expresión pGBKT………………….……..……….…………..50
4.1.4 Transformación de construcciones GBF1 carnadas en la cepa
AH109 de Saccharomyces cerevisiae.............................................52
iii
4.1.5 Detección de construcciones híbridas en Saccharomyces
cerevisiae…………………………………………….………...….53
4.1.6 Análisis de expresión de carnadas por Western Blot……………..55
4.1.7 Construcciones presas…………………………………………….56
4.1.8 Apareamiento de levaduras…………………………………..…...58
4.1.9 Ensayo de Beta-galactosidasa en filtro…………………….……..59
4.1.10 Controles de interacción………………………………………...59
4.1.11 Análisis estructural de las carnadas positivas en la
búsqueda de clones de interacción para GBF1 en el sistema
Doble Híbrido…………………………………………………….62
4.2 Estabilización de complejos proteicos expresados en célula de mamífero
por entrecruzamiento con DTBP…………….………………………………………64
4.2.1 Procedimiento A………………………………………………….64
4.2.2. Control de entrecruzamiento: interacción GBF1-p115………….66
4.2.3 Procedimiento B…………………………………………………..66
4.2.4 Aproximación a una posible interacción GBF1- Snapin
mediante estabilización de complejos proteicos………….………..68
4.3 Detección de interacciones proteicas de GBF1 mediante
purificación por afinidad de fusiones con GST.........................................................70
4.3.1 Construcciones GST- GBF1...........................................................70
4.3.2 Transfección y análisis de expresión construcciones
GST-GBF1……………………………………………………….72
iv
4.3.3 Ensayos de purificación de complejos proteicos por
afinidad con GST………………………………………………...72
5. DISCUSIÓN.........………………………………………..…………………….…...74
5.1 El modelo propuesto……………………………………………….……….74
5.2 Sobre las técnicas empleadas………………………………………….……78
5.3 Sobre los resultados obtenidos………………………………………….…..86
5.4 Experimentos y análisis pendientes…………………………………….…..88
5.5 Publicaciones paralelas de interacción proteína-proteína con GBF1………91
6. BIBLIOGRAFÍA...................................……………………………...……………95
7. ANEXO……………..……………………………………………………………...129
7.1 Análisis del marco de lectura de GBF1 en construcciones
híbridas carnadas……………………………………………………………129
7.2 Secuencia de GBF1 utilizada para el análisis de las construcciones
carnadas…………………………………………………………….….…...131
7.3 Construcciones reporteras del sistema doble híbrido………………….…...133
7.4 Genes reporteros y marcadores de selección utilizados en el sistema
de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae…………………………......134
ÍNDICE DE FIGURAS
v
Página
Figura 1. Esquema utilizado para la construcción de las carnadas de GBF1
en el sistema de Doble Híbrido en Saccharomyces cerevisiae……………….41
Figura 2. Amplificación por PCR de fragmentos carnadas………………….. …..........46
de los fragmentos de GBF1 a ser utilizados como “carnadas” 3 y 7.
Figura 3. Clonamiento a pGEM-T Easy………………………………………………..49
Figura 4. Clonamiento de carnadas al vector pGBKT7………………………………...51
Figura 5. Extracción de pDNA de levaduras..…..…………...…………………………54
Figura 6. Construcciones presas………………………………………………………..57
Figura 7. Selección de clones de interacción para GBF1………………………………61
Figura 8. Carcterísticas de las carnadas positivas en la selección de clones de
interacción para GBF1 mediante el screening de la librería de cDNA
de cerebro fetal humano……………………………………………………..63
vi
Figura 9. Estabilización de complejos proteicos con DTBP…………………………...65
Figura 10. Control de interacción GBF1-p115 y entrecruzamiento por
procedimiento B…………………………………………………………...67
Figura 11. Esquema de interacciones proteicas necesarias para la detección
de la posible interacción GBF1-Snapin………….………………………….69
Figura 12. Construcciones GST-GBF1………………………………………………...71
Figura 13. Expresión de construcciones GST-hGBF1 en células 293 EBNA………….73
Figura 14. Esquema de las interacciones proteicas de GBF1 publicadas de forma
paralela a esta tesis………………………………………………………….94
Figura 15. Construcciones reporteras de las cepas AH109 e Y187…………………..133
ÍNDICE DE TABLAS
vii
Página
Tabla I. Características genotípicas de de las cepas AH109 e Y187…………………..31
Tabla II. Características de los fragmentos de GBF1 amplificados
por PCR para ser utilizados como carnadas en el sistema
doble híbrido…………………………………………………………………43
LISTA DE ABREVIACIONES
ARF
ADP- ribosylation factor
ARF- GEF
ARF-specific guanine nucleotide exchange activity
BFA
Brefeldin A
BIG
Brefeldin A-inhibited Guanine nucleotide exchange factor
BME
Beta- mercaptoethanol
Bp
Base pair
CCVs
Clathrin- coated vesicles
COP
Coat protein
COPI
Coat protein complex I
COPII
Coat protein complex II
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DTT
Dithiothreitol
DTBP
Dimethyl 3,3´-dithiobispropionimidate•2 HCl
ERES
ER exit sites
ERGIC
ER- Golgi intermediate compartament
EBNA
Epstein- Barr nuclear antigen
FBS
Fetal bovine serum
Gal4 AD
Gal4 activation domain
Gal4 DNA BD
Gal4 DNA binding domain
GAP
GTPase -activating protein
GBF
Golgi- specific Brefeldin A resistance factor
GDP
Guanosine diphosphate
GEF
Guanine nucleotide exchange factor
viii
ix
GGA
Golgi- localizing, γ-adaptin ear homology domain, ARF-binding
GST
Gutathione S- transferase
GTPasa
Guanosín trifosfatasa
HA (epitope)
Hemagglutitin
HDS
Homology Downstream of Sec7
HUS
Homology Upstream of Sec7
LB
Luria-Bertani medium
NEM
N- ethylmaleimide
NLS
Nuclear localization signal
NSF
NEM- sensitive factor
ORF
Open reading frame
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerase chain reaction
PMSF
Phenylmethylsulphonyl fluoride
SD
Synthetic defined
SDS- PAGE
SDS- Polyacrilamide gel electrophoresis
siRNA
Small interfering RNA
SNAP
Soluble NSF attachment protein
SNARE
SNAP receptor
TGN
Trans- Golgi network
UAS
Upstream activating sequence
VSV-G
Vesicular stomatitis virus glycoprotein
X-gal
5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-b-D- galactopyranoside
YPD medio
Yeast extract, Peptone, Dextrose
1
1. RESUMEN
GBF1 es un Arf GEF que mediante la activación de Arf1 regula el ensamblaje de las
cubiertas proteicas de tipo COPI, las cuales median el tráfico vesicular retrógrado desde
el complejo de Golgi hacia el retículo endoplasmático. La activación de Arf1 es
dependiente del intercambio de GDP por GTP, catalizado por el dominio Sec7 de
GBF1, esto produce un cambio conformacional que desplaza la región N-terminal
miristoilada de Arf1,
promoviendo el anclaje a membranas por interacción con
fosfolípidos. GBF1 es una proteína de alto peso molecular, y el dominio catálitico Sec7
representa solo aproximadamente el 10 % de la proteína. Del resto de la estructura
proteica no se conocen funciones específicas. Para lograr entender los mecanismos que
regulan la actividad de este Arf GEF, se realizó la búsqueda de interacciones proteínaproteína a través del sistema de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae,
estabilización de complejos por entrecruzamiento y ensayos de purificación por afinidad
al expresar fusiones con GST en células de mamíferos. Para el sistema de doble híbrido
fueron amplificados por PCR ocho fragmentos estratégicos de las regiones N-terminal,
Sec7, C-terminal y regiones intermedias de GBF1. Estos fragmentos fueron clonados en
el vector de expresión en levaduras pGBKT7, para expresar fusiones con el dominio de
unión al DNA de GAL4. Cada carnada fue utilizada para realizar el screening de una
biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano, logrando aislar clones de interacción para
las carnadas 1, 4 y 7, pero la caracterización de estos clones no fue completada. Para la
estabilización de complejos proteicos fue utilizado el agente de entrecruzamiento
amino-reactivo DTBP, permitiendo detectar a GBF1 formando complejos de alto peso
molecular por análisis en Western Blot. Para los ensayos de precipitación por afinidad
se utilizaron fusiones GST- GBF1 (total, N- terminal, sec7 y C-terminal), construidas
previamente. Estas construcciones fueron transfectadas en la línea celular 293 EBNA, y
analizadas por Western Blot. En los primeros ensayos no fue posible obtener alguna
banda de interés, pero la estabilización de los complejos era una nueva estrategia, que
también quedó sin completar.
2
SUMMARY
GBF1 is an Arf GEF that through Arf1 activation regulates the assembly of the coat
proteins COPI, which mediate the retrograde vesicular trafficking from the Golgi
complex towards the endoplasmic reticulum. Arf1 activation is dependent upon the
exchange of GDP for GTP, catalyzed by the sec7 domain of GBF1. This generates a
conformational change that displaces the myristoylated N-terminus region of Arf1,
promoting the anchorage to membranes by interaction with phospholipids. GBF1 is a
high molecular weight protein, and the catalytic Sec7 domain represents only 10% of
the protein, the rest of the protein structure has no known specific functions. In this
work to achieve understanding the mechanisms that regulate the activity of this Arf
GEF, a protein-protein interaction screen was attempted through two hybrid system in
Saccharomyces cerevisiae, complex stabilization by crosslinking and affinity
purification with GST-fusion proteins expression in mammalian cells. In the two hybrid
system eight strategic fragments from N-terminal, Sec7, C-terminal and intermediate
regions of GBF1 were amplified by PCR. These fragments were cloned into the yeast
expression vector pGBKT7 to express fusion proteins with GAL4 DNA-binding
domain. Each bait was used for the screening of a human fetal brain cDNA library,
positives clones were isolated by the bait 1, 4 and 7, but the characterization of these
clones was not completed. To stabilize the protein complexes was used the aminoreactive crosslinking agent DTBP, GBF1 was detected forming high molecular weight
complexes by Western Blot analysis. For affinity precipitation assay were used GSTGBF1 fusion protein (Full length, N-terminal, sec7 and C-terminal), built previously.
These constructs were transfected in 293 EBNA cells, and analyzed by Western Blot. In
the first test was not possible to obtain any band of interest, but the stabilization of the
complex was a untested strategy, which was not completed.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1 La vía secretoria
Para mantener la integridad y organización de sus diversas estructuras, rutas
metabólicas, vías de señalización y otros procesos, las células eucarióticas requieren una
constante síntesis y tráfico de biomoléculas. En la vía secretoria el movimiento de
proteínas y lípidos entre diferentes compartimentos membranosos es un proceso
altamente dinámico y mediado por el tráfico de vesículas secretorias. Los principales
sistemas membranosos que en la célula eucariótica conforman la ruta secretoria
corresponden al retículo endoplásmatico, los compartimentos intermedios ERGIC
/VTC, el Complejo de Golgi, la red trans- Golgi, el sistema endo- lisosomal y la
membrana plasmática (Bonifacino and Glick, 2004; Appenzeller-Herzog and Hauri,
2006).
Las proteínas que ingresarán a la vía secretoria son reconocidas por una
secuencia señal en la cadena polipeptídica naciente (Walter et al., 1981; Pool et al.,
2002). Esta señal consiste de una estructura canónica caracterizada por residuos
aminoacídicos cargados positivamente (1-5aa) y un núcleo hidrofóbico (7-15 aa)
seguido de una región más polar (Nothwehr and Gordon, 1989). Luego son reconocidas
por el complejo de reconocimiento de señal (SRP) y dirigidas a las membranas del RE
(Walter and Johnson 1994; Wilkinson et al., 1997). La interacción entre el SRP y el
receptor de SRP, media la entrega del complejo ribosoma/cadena polipepetídica
naciente al complejo de translocación (Gilmore et al., 1982).
Las proteínas son
translocadas cotraduccionalmente hacia el lumen del retículo endoplásmico (Walter and
Johnson, 1994). Según la naturaleza de éstas comienzan las modificaciones y
4
clasificación que determinarán el destino a través de la vía secretoria, ya sea como
proteínas residentes del RE, del complejo de Golgi, de los lisosomas, endosomas,
membrana plasmática o medio extracelular. La modificación por N- glicosilación se
inicia por la adición de una unidad del oligosacárido compuesta de 3 glucosas, 9
manosas y 2 moléculas de N- acetilglucosamina (Glc3Man9Nac2) sobre el residuo de
asparagina en la secuencia consenso Asn-X-Ser/Thr (Kornfeld and Kornfeld, 1985).
Las proteínas integrales de membrana son retenidas en la membrana del retículo
endoplásmico o dirigidas hacia la membrana plasmática de otros organelos (Hegde and
Lingappa, 1997; Matlack et al., 1998). Las proteínas solubles luego de ser translocadas
se mantienen en el lumen del RE o son transportadas al lumen de otros compartimentos.
Algunas proteínas de la superficie celular luego de ser liberadas al lumen del RE son
unidas a membrana mediante anclajes de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Lisanti et al.,
1990). En el retículo endoplásmico las proteínas son modificadas para adquirir su
correcto plegamiento y oligomerización, lo cual es ayudado por las proteínas accesorias
de la familia de chaperonas y enzimas de plegamiento (Helenius et al., 1992).
El tráfico vesicular entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi
requiere de los compartimentos intermedios ERGIC (ER- Golgi intermediate
compartment) o también llamados VTCs (vesicular tubular clusters) (Hauri and
Schweizer, 1992; Balch et al., 1994). En estos compartimentos se regula y organiza el
movimiento en sentido anterógrado hacia las cisternas cis-Golgi, y recuperación de
proteínas hacia el RE por movimiento retrógrado. La vía de recuperación de proteínas
residentes del retículo endoplásmico desde los compartimentos post-RE es mediada por
secuencias del tipo KDEL para las proteínas solubles (Munro and Pelham, 1987; Lewis
et al., 1990) o por el motivo KKXX del extremo C-terminal de las proteínas de
membrana residentes del RE (Jackson et al., 1990).
5
El movimiento hacia el complejo de Golgi permite continuar las sucesivas
modificaciones en las proteína transportadas, las que incluyen procesamiento de las Nglicosilaciones (Farquhar, 1985) y extensión de los O-glicanos (Schweitzer et al., 1994;
Roth et al., 1994). Estas modificaciones pueden cumplir roles estructurales, funcionales
y de señalización. El complejo de Golgi está organizado por apilamientos membranosos
en forma de cisternas, las que se caracterizan por su composición diferencial en cuanto
al contenido de lípidos y tipo de enzimas residentes, esto origina un sistema polarizado
de membranas donde el contenido de colesterol aumenta desde la cara cis hacia la cara
trans del Golgi (Bretscher and Munro, 1993; Farquhar and Palade, 1998). Estas
propiedades han permitido aislar y caracterizar las diversas regiones del complejo de
Golgi por fraccionamiento en gradientes sacarosa. Al final del tráfico a través del
complejo de Golgi, en la red trans- Golgi (TGN),
las proteínas son ordenadas,
clasificadas y empaquetadas para ser transportadas hacia las membranas diana (Traub
and Kornfeld, 1997; Keller and Simons, 1997).
El proceso de formación de vesículas secretoras requiere una serie de
modificaciones a nivel de la membrana donante, los cuales incluyen el reclutamiento de
los mantos proteicos, proteínas modificadoras de lípidos, proteínas accesorias y
proteínas reguladoras, implicadas en la selección de la carga, direccionamiento y fusión
de las vesículas con las membranas dianas (Rothman and Wieland, 1996; Schekman and
Orci, 1996). Se conocen tres tipos de cubiertas proteicas de vesículas secretoras, las que
dirigen los distintos pasos de la vía secretoria: vesículas con cubiertas de clatrina
(Schmid, 1997; Nakatsu, 2003), vesículas con cubiertas de tipo COPI (Barlowe, 2000 )
y vesículas con cubiertas tipo COPII (Hughes H, Stephens DJ, 2008). Las vesículas con
cubierta de clatrina median el transporte desde la red trans- Golgi hacia los endosomas y
la endocitosis de receptores de transmembrana. Las vesículas de cubierta tipo COPII
6
controlan el transporte desde el retículo endoplásmico hacia el complejo de Golgi,
conocido como transporte anterógrado. Las vesículas con cubierta tipo COPI median el
transporte desde el Complejo de Golgi al retículo endoplásmico y también el transporte
intra Golgi, y es denominado transporte retrógrado.
El direccionamiento y fusión de las vesículas secretoras con sus membranas
dianas permite entregar la carga transportada de forma selectiva, a través de los eventos
de reconocimiento, apareamiento, anclaje y fusión de membranas. La especificidad de la
fusión en este proceso está controlada por la complementariedad entre los pares de
proteínas SNARE (soluble NSF attachment protein (SNAP) receptores) presentes en la
superficie de las vesículas y membranas blanco (Hunt et al., 1994; Weber et al., 1998;
Litteton et al., 1998). Las proteínas SNARE que se encuentran en las membranas de las
vesículas secretoras se denominan v-SNARE y las presentes en la membrana blanco se
denominan t-SNARE (Soellner et al., 1993). La interacción entre v-SNARE y t-SNARE
es el primer paso de regulación en la selectividad del reconocimiento entre membranas
(Rothman and Warren, 1994). El punto de interacción entre v-t SNARE está localizado
en los dominios helicoidales de estas proteínas (Skehel and Wiley, 1998), los que
forman un complejo trans- SNARE que permite el anclaje a la membrana blanco, previo
al evento de fusión. Existe una gran variedad de isoformas de proteínas SNARE (Linial,
1997) las que se localizan en distintos estructuras membranosas, y donde la gran
posibilidad de combinaciones entre v/t-SNARE explica la alta especificidad del
transporte vesicular con los distintos organelos. Para los posteriores eventos de fusión
los complejos SNARE deben ser disociados a través del reclutamiento de SNAP / NSF
(NEM (N-ethylmaleimide) sensitive factor) (Clary et al., 1990; Weidman et al., 1989).
(Barnard et al., 1997; Nagiec et al., 1995). NSF (Block et al., 1988) es una proteína
oligomérica compuesta por tres subunidades de 76 KDa, presenta actividad ATPasa y se
7
une a SNAP a través del extremo N-terminal, permitiendo así la interacción con los
complejos SNARE de membrana (Whiteheart et al., 1993), que a su vez interaccionan
con SNAP. Existen tres isoformas de SNAPs; α- SNAP, β- SNAP y γ-SNAP. Las
formas α y γ SNAP son ubicuas, mientras que la forma β- SNAP se expresa sólo en
cerebro (Whiteheart et al., 1993). La actividad ATPasa de NSF está concentrada en el
dominio C-terminal. La fusión entre la vesícula y la membrana objetivo requiere el
previo desprendimiento de la cubierta proteica de la vesícula de transporte, para así
permitir el contacto directo de las bicapas lipídicas en proximidad.
Otra familia de proteínas implicadas en la especificidad de la fusión vesicular
son las GTPasas de direccionamiento Rab, las cuales también presentan localización
específica en los distintos organelos de membrana (Novick & Zerial 1997). A través de
sus múltiples efectores, las proteínas Rab permiten
mantener el contacto entre v-
SNARE y t-SNARE (Bourne 1988; Søgaard et al., 1994).
2.2 Transporte vesicular con cubiertas tipo COPI, COPII y de clatrina.
El transporte retrógrado está mediado por vesículas de cubierta proteica tipo
COPI. Para el ensamblaje de las vesículas de tipo COPI se requiere de la proteína Arf1
(ADP- ribosylation factor 1) y un complejo proteico hetero- heptamérico, el coatómero
(Serafini et al., 1991; Waters et al., 1991). La caracterización de este tipo de vesículas
fue realizada por ensayos in vitro con vesículas aisladas de las membranas del complejo
de Golgi (Ostermann et al., Serafini et al., 1991). El coatómero está formado por las
subunidades α-COP, β-COP, β`-COP, γ-COP, δ-COP, ε-COP y ζ-COP. Las subunidades
de este complejo se encuentran en el citosol formando parte del coatómero y también en
8
la forma unida a membrana. Para la formación de vesículas secretoras tipo COPI es
necesaria la activación de una familia de GTPasas denominada factores de ADPribosilación, Arf. Los Arf en la forma unida a GDP se encuentran en un estado inactivo,
solubles en el citoplasma. La activación de estas proteínas es realizada por la familia de
los Arf- GEF (factores de intercambio de nucleótidos de guanina), los cuales promueven
el intercambio de GDP por GTP. En la forma activa Arf es anclado a membrana para
reclutar las cubiertas proteicas COPI. Inicialmente uno de los dilemas sobre la actividad
de Arf fue si éste formaba parte de la estructura de las vesículas COPI o si solamente
actuaba como un catalizador en el proceso de inicio del reclutamiento de los mantos
proteicos a membrana (Ktistakis et al., 1996). Posteriormente se logó demostrar que Arf
sí formaba parte del ensamblaje de las cubiertas COPI, esto a través de la determinación
de Arf1 en cantidades estequiométricas al coatómero (Stamnes et al., 1998.). Luego por
experimentos de foto-entrecruzamiento sitio específico se demostró la interacción de
Arf1-GTP con el coatómero, la interacción fue dependiente de una fenilalanina
fotoreactiva de la posición 82, siendo también encontrada en la fracción vesicular (Zhao
et al., 1997). En otro estudio se logró identificar que las subunidades β y δ COP eran
reclutadas a membrana dependiendo de Arf1 y GTP (Pavel et al, 1998).
Otro punto para la estabilización y ensamblaje de las cubiertas COPI es la
interacción
de algunos miembros del coatómero con determinadas proteínas de
membrana. La participación de las proteínas de transmembrana durante el proceso de
gemación se ha sugerido como una plataforma para la formación de los complejos
proteicos de las cubiertas tipo COPI (Springer et al., 1999). A través de los dominios
citoplasmáticos de los miembros de la familia p24 se ha logrado demostrar la
estabilización del coatómero con las membranas donantes (Stamnes et al., 1995;
Bremser et al., 1999).
9
Los miembros de la familia de proteínas p24 ciclan continuamente entre el
retículo endoplásmico y el complejo de Golgi, y son ensambladas en complejos
heteroméricos (Sohn et al., 1996; Rojo et al., 1997). En levaduras se ha demostrado que
en las vesículas derivadas del retículo endoplásmico los complejos de p24 participan en
la selección y reclutamiento de carga (Muñiz et al., 2000). En los complejos p24 de
levaduras se ha descrito la presencia de los miembros Emp24, Erv25p, Erp1p y Erp2p
(Marzioch et al., 1997). La participación de p24 en la formación de vesículas de tipo
COPI fue originalmente definida por la capacidad de unión a las proteínas de COPI
(Stamnes et al., 1995).
En base a la homología de secuencia la familia p24 en mamíferos ha sido dividida
en 4 subfamilias (Dominguez et al., 1998), denominadas subfamilia p23, subfamilia
p24, subfamilia p25 y subfamilia p26. Los estudios de la familia p24 en mamíferos han
identificado a la proteína p23 como un receptor de las cubiertas proteicas COPI
(Bremser et al., 1999). Una interacción entre la subunidad γ-COP del coatómero y el
extremo citoplamático de p23 fue determinada por ensayos de entrecruzamiento (Harter
and Wieland, 1998). Trabajos con cepas de levaduras depletadas de los miembros de la
familia p24 no demostraron ser críticos en los eventos de tráfico vesicular (Springer et
al., 2000). Sin embargo, experimentos análogos en mamíferos revelaron la importancia
de la actividad de p23 durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de ratones
(Denzel et al., 2000). Posteriormente mutaciones en uno de los alelos de p23
evidenciaron modificaciones estructurales del complejo de Golgi, reafirmando la
relevancia de p23 en los eventos de transporte vesicular en este organelo.
De este modo el reclutamiento de las cubiertas proteicas COPI en mamíferos está
regulada de un forma bivalente a través de las interacciones entre las subunidades βCOP y γ- COP con Arf1 y, por las interacciones entre la subunidad γ- COP con p23.
10
El transporte de vesículas COPII regula el tráfico desde el RE al complejo de
Golgi. La formación de vesículas de tipo COPII requiere, de forma análoga a COPI, el
reclutamiento de una serie de proteínas solubles (Barlowe et al., 1994) que a través de la
generación de mutantes en Saccharomyces cerevisiae resultaron ser esenciales en el
transporte intracelular (Kaiser and Schekman, 1990). Las cubiertas proteicas COPII
están formadas por la proteína Sar1p y los complejos Sec23p-Sec24p y Sec13p-Sec31p.
La activación de Sar1p es mediada por Sec12p, una glicoproteína integral de membrana
del RE (Barlowe and Schekman, 1993), que promueve el intercambio de GDP/GTP.
Luego Sar1p inicia el ensamblaje de las cubiertas de tipo COPII (Futai et al., 2004),
mediando el reclutamiento sucesivo de los complejos Sec23p/Sec24p y Sec13p/Sec31p
(Matsuoka et al., 1998). En la formación de estas vesículas secretorias se requiere
además de las cubiertas proteicas COPII, los SNAREs ER- GOLGI Sed5, Bos1, Sec22
y Bet1, y algunas proteínas integrales de membrana como miembros de la familia p24 y
de los complejos Erv41/46 (Otte et al., 2001; Miller et al., 2002).
Las vesículas con cubierta de clatrina participan en distintas etapas del transporte
vesicular post- Golgi de la vía secretoría y endocítica (Hirst and Robinson, 1998; Smith
and Pearse, 1999) y están formadas de clatrina y de complejos de proteínas adaptadoras
tetraméricas APs y monoméricas GGAs (Golgi- localizad, gamma ear-containing, ADP
ribosylation factor (Arf)- binding protein). En estas cubiertas clatrina es ensamblada en
forma de una red tridimensional de triskelion, compuesta de tres cadenas pesadas y tres
cadenas livianas (Ungewickell and Branton, 1981). Los complejos APs funcionan de
forma específica en distintos compartimentos intracelulares (Kirchhausen, 1999) y están
relacionados a la formación de las vesículas secretoras y selección de carga. Se han
descrito cuatro tipo de complejos APs, denominados AP-1, AP-2, AP-3 y AP-4 (Boehm
and Bonifacino, 2001). Por medio de la interacción con fosfoinosítidos o pequeñas
11
proteínas G de la familia Arf los adaptadores son reclutados a membrana. Los
adaptadores AP1 y AP2 actúan a nivel de la red trans- Golgi y membrana plasmática.
AP3 funciona en el sistema endosomal, interaccionando con clatrina, o de forma
independiente. La actividad de AP4 ha sido asociada al sistema endosomal y de modo
independiente a clatrina (Boehm and Bonifacino, 2001; Robinson, 2004). Las proteínas
GGA1, GGA2 y GGA3 median en tráfico desde el TGN y del sistema endosomal
(Boman et al., 2000; Dellʼ Angelica et al., 2000; Hisrt et al., 2000).
2.3 Familia ARF
Los factores de ADP- ribosilación (Arf) pertenecen a la familia de proteínas Arf,
de la que también forman parte los grupos Sar y Arl (Arf-like), con representantes
ortólogos en distintas especies. A su vez, la familia de proteínas Arf pertenece a la
superfamilia de proteínas Ras de bajo peso molecular, cuyos miembros ciclan y
dependen de los estados unidos a GDP ó GTP. Los estudios filogenéticos de la familia
Arf demuestran un alto nivel de conservación evolutiva en muchos de sus miembros
eucarióticos. La historia de las proteínas Arf está ligada a la actividad de la toxina del
cólera, donde Arf fue identificado como un cofactor para la ADP- ribosilación en la
subunidad Gs de adenil ciclasa (Enomoto and Gill, 1980; Kahn and Gilman, 1984). Las
propiedades de Arf regulan el tráfico vesicular, la organización de los organelos de
membrana y también el metabolismo de algunos fosfolípidos, lo cual es mediado por la
interacción con sus diversos efectores (Nie et al., 2003; Burd et al., 2004; Kahn et al,
2004). Dentro de estos efectores se encuentran los componentes de las cubiertas
vesiculares proteicas COPI, AP-1 y AP-3; las enzimas modificadoras de lípidos PLD1,
12
fosfatidilinositol 4- kinasa y fosfatidilinositol 4,5 kinasa; y las proteínas adaptadoras
GGAs (Golgi- associated γ- adaptin homologi Arf- binding protein)1-3 y MINT13/X11α-γ/ APBA1-3) (Bonifacino, 2004; Robinson 2004).
Los Arf se encuentran ciclando entre los estados inactivos unidos a GDP y la
forma unida a GTP que constituye la forma activa. La activación de Arf es mediada por
la familia Arf-GEF y la actividad catalítica de estos GEF es realizada por el dominio
sec7, denominado así en homología al Arf-GEF de levaduras sec7p. El estado inactivo
de Arf1 humano fue la primera estructura de un Arf descrito (Amor et al., 1994), y la
estructura del estado activo fue descrita con la mutante humana de Arf1 (Arf1∆17) que
perdía la región N-termianal necesaria para la asociación a membrana (Golderberg,
1998).
Los Arf unidos a GTP sufren un cambio conformacional que permite el
desplazamiento y exposición de la región N-terminal, la cual posee una secuencia
hidrofóbica miristoilada, modificación cotraduccional
que media el anclaje a las
membranas por asociación con la bicapa lipídica (Huang et al., 2001). En la activación
están involucrados los siguientes componentes estructurales de Arf: la hélice NH2
terminal que se asocia con la forma retraída del sitio de unión a GDP; las regiones
denominadas “switch 1” y “switch 2”, un conector interno o “interswitch” que es
desplazado durante la unión a GTP; y los residuos aminoacídicos involucrados en la
flexibilidad del movimiento (GG) como también en la estabilización de la nueva forma
conformacional activa (R/W) (Pasqualato et al., 2001). Los cambios conformacionales
en la estructura de ARF están localizados entre la región de los denominados switch 1 y
switch 2, donde se une con alta afinidad el nucleótido de GTP, y débilmente la forma
GDP. El extremo N-terminal de Arf en la forma unida a GDP se conecta con una
cavidad hidrofóbica localizada entre la región “interswitch” y el extremo del “switch1”
13
(Amor et al., 1994). Al estar unidos a membranas los Arf inician el proceso de
reclutamiento de los mantos proteicos necesarios para la formación de las vesículas
secretoras.
Otra función de los Arf es la activación de enzimas involucradas en las
modificaciones lipídicas a nivel de las membranas donantes. Arf ha demostrado ser un
activador de fosfolipasa D (Brown et al., 1993), la cual hidroliza fosfatidilcolina para
generar ácido fosfatídico y colina. El aumento de los niveles de fosfolípidos acídicos
conduciría en un incremento de la carga negativa en superficie lo que a su vez induciría
modificaciones estructurales a nivel de membrana, mediando así el anclaje de las
cubiertas proteicas (Bi et al., 1997). Además los fosfolípidos acídicos estarían
involucrados directamente en el proceso de curvatura de la membrana y gemación de la
vesícula secretora (Ktistakis et al., 1996).
En base a la similitud de secuencias los Arf han sido clasificados en tres grupos;
la clase I formada por Arf1, Arf2 y Arf3, la clase II compuesta por Arf4 yArf5, y la
clase III con Arf6. Los Arf se localizan de forma diferencial en distintos superficies de
membranas, luego la activación y regulación de los ciclos en la forma unida a
GDP/GTP son determinados por la presencia también específica de los miembros de las
familias Arf-GEFs / Arf-GAPs. Arf1 ha sido localizado en ERGIC, en las caras cis y
tras del complejo de Golgi y en TGN. En la región cis- Golgi Arf1 regula el
reclutamiento de las cubiertas COPI y en el TGN y sistema endosomal regula el
reclutamiento de los adaptadores AP1, AP3 y AP4 (Bonifacino et al., 2004) En la
región cis-Golgi y ERGIC Arf1 se une a la proteína membrina, y luego es activado por
el Arf-GEF GBF1 para controlar el reclutamiento del manto proteico COPI. Estudios en
levadura demostraron que Arf1 en el estado inactivo podía unirse a las proteínas
SNARE del sistema ER- Golgi Sec22, Bet1 y Bos1 (Rein et al., 2002). Membrina es el
14
homólogo de Bos1 en mamíferos, y a través de experimentos in vitro se ha demostrado
la capacidad de unión con Arf1 (Donaldson, 2004; Honda et al., 2005). En la cara transGolgi y TGN Arf1 es activado por los Arf-GEF BIG1/BIG2, lo que gatilla el
reclutamiento de AP1, AP3, AP4 y GGAs. Arf6 se localiza en la membrana plasmática
regulando el tráfico vesicular hacia los endosomas y organización del citoesqueleto
(Donaldson et al., 2003), cuya actividad ha sido asociada a la activación de fosfolipasa
D y PIP5K.
La actividad reguladora de Arf es a su vez controlada por los Arf- GEF que
promueven el intercambio GDP/GTP y por la hidrólisis de GTP catalizada por la familia
de proteínas Arf-GAPs (GTPase activating proteins).
2.4 Familia ARF-GEF.
En base a la organización estructural y tipo de dominios, los Arf- GEF
eucarióticos han sido agrupados en las siguientes familias: familia GBF/BIG, familia
ARNO/ cytohesin, familia EFA6, familia BRAG y familia FBX8 (Casanova, 2007). De
la familia Arf-GEF GBF/ BIG en mamíferos se expresan GBF1, BIG1 y BIG2. En
levaduras se encuentran dos ortólogos de GBF1, Gea1p y Gea2p y un ortólogo de
BIG1/BIG2, la proteína Sec7p. GBF1 y BIG1/BIG2 se localizan de forma diferencial en
el complejo de Golgi (Manolea et al., 2008), regulando distintos procesos del tráfico
vesicular a través de la activación de Arfs de clase I y II. GBF1 se localiza en los
“cluster” vesículo- tubulares (VTCs) del sistema RE-Golgi, y en la cara cis- Golgi.
BIG1 y BIG2 localizan en los compartimentos tardíos del complejo de Golgi (Zhao et
al., 2002), BIG2 ha demostrado regular el reclutamiento de AP-1 y de GGA en el TGN
15
(Shinotsuka et al., 2002) lo cual es mediado por la activación de Arf. Además, BIG2
también ha sido asociado al reciclamiento endosomal perinuclear (Shin et al., 2004). El
análisis de secuencia de los miembros de esta familia revela la presencia de 6 regiones
características con distinto grado de homología, y corresponden a: (1) un dominio DCB
(dimerization and cyclophilin binding), localizado en la región N- terminal, de una
longitud de aproximadamente 150 aminoácidos. (2) Un dominio HUS (Homology
Upstream of Sec7), se localiza luego del dominio DCB y aún no se le ha asignado
función específica. (3) Un dominio Sec7, que es donde se localiza la actividad catalítica
Arf- GEF. (4)Tres dominios HDS (Homology Downstream of Sec7) de los que
igualmente no se tiene mayor conocimiento (Casanova, 2007).
En la familia ARNO/ cytohesins
de vertebrados se expresan las isoformas
cytohesin-1, citohesin-2 /ARNO, cytohesin-3/Grp1/ARNO3 y cytohesin-4. Se
caracterizan por una organización estructural compuesta de un dominio N- terminal de
tipo “coiled- coil”, el dominio Sec7, un dominio PH y una región C- terminal con carga
positiva. Se localizan en la periferia celular cumpliendo diversas funciones (Frank et al.,
1998). ARNO / cytohesin-2 han demostrado activar Arf6 (Santy et al., 2001). Por su
parte ARNO ha sido también identificado en los procesos de “docking” y fusión de
gránulos secretorios, y en el tráfico postendocítico (Caumont et al., 2000; HurtadoLorenzo et al., 2006; Maranda et al., 2001)
La familia EFA6 tiene los representantes de mamíferos EFA6A, EFA6B, EFA6C
y EFA6D (Franco et al., 1999; Derrien et al., 2002), con una organización estructural
caracterizada por un dominio N-terminal variable, un dominio sec7, un dominio PH y
un C-terminal con un motivo “coiled- coil”. Activan Arf6 (Franco et al., 1999), se
caracterizan por un dominio PH que interacciona con Ptdlns(4,5)P2, se localizan en la
16
membrana plasmática y promueven la reorganización cortical de actina en estructuras
semejantes a microvellos (Derrien et al., 2002).
La familia BRAGs (Brefeldin- resistant Arf- GEF) en mamíferos está representada
por IQsec2 (gen BRAG1), IQsec1/Arf GEP100 (gen BRAG2) y IQsec3/synArfGEF (gen
BRAG3). Se caracterizan por un dominio de tipo IQ, el dominio sec7, un dominio PH y
por uno o más dominios “coiled- coil”. BRAG1 y BRAG3 de mamíferos son
expresados principalmente en cerebro asociados a densidades postsinápticas de las
sinapsis exitatorias (Murphy et al., 2006; Inaba et al., 2004). BRAG2 se expresa en
diversos tejidos (Someya et al., 2001)
La familia FBX8 se caracteriza por presentar cajas- F, correspondientes a
secuencias de aproximadamente 40 aminoácidos, que les permite unir proteínas que
regulan la unión a los complejos ubiquitín- ligasa. FBX8 presenta un motivo caja- F en
el extremo N- terminal y el dominio sec7 localizado hacia el extremo C-terminal.
Otro tipo de clasificación de los Arf GEF basada en los pesos moleculares y
sensibilidad a BFA los divide en las clases de Arf- GEF de alto peso molecular y los
Arf- GEF de bajo peso molecular (Donaldson et al., 2000; Jackson et al.,2000). En la
clase de Arf- GEF de alto peso molecular, comprendida por proteínas de sobre 100
KDa, se encuentran las proteínas de levaduras Gea1p, Gea2p y Sec7p, el Arf- GEF de
Arabidopsis GNOM, y los representantes de mamíferos GBF1, BIG1 y BIG2.
GNOM es un Arf- GEF involucrado en el tráfico vesicular de Arabidopsis, con
efectos reguladores sobre los procesos de polaridad celular, lo que a su vez origina un
sistema de transporte polarizado para el flujo de auxina (Steinmann et al., 1999).
GNOM fue originalmente identificado mediante selección de alelos mutantes en
Arabidopsis que afectan la organización estructural de estos embriones (Mayer et al.,
1991). Auxina es una hormona vegetal que es transportada de forma polarizada a través
17
del eje tallo- raíz de Arabidopsis, regulando los procesos de dominancia apical,
formación de raíces y tejidos vasculares, fototropismo y gravitropismo (Went, 1929;
Sachs, 1991). Este sistema de transporte vectorial depende de la correcta localización
del transportador de eflujo para auxina PIN1, siendo alterada en los mutantes gnom
(Steinmann et al., 1999).
Los Arf- GEF de bajo peso molecular o pequeños Arf- GEF, presentan un tamaño
de aproximadamente 45- 50 KDa y se caracterizan por ser resistentes al tratamiento con
Brefeldina A (Donaldson and Jackson, 2000). En este grupo se incluye el representante
de mamíferos ARNO (Chardin et al., 1996), cytohesin-1 (Meacci et al., 1997),
GRP1/ARNO3 (Klarlund et al., 1997), EFA6 (Franco et al., 1999) y cytohesin-4
(Ogasawara et al., 2000). Los Arf- GEF de bajo peso molecular presentan actividad
principalmente asociada al reciclamiento endosomal, y también en la reorganización del
citoesqueleto, a través de la activación de Arf6. La actividad de Arf6 regula distintos
eventos en el sistema endosomal, de forma dependiente o independiende de clatrina
(Sakagami, 2008). Dentro de estos se encuentran el reciclamiento de proteínas de
membrana como el receptor de transferrina (DʼSouzaSchorey et al., 1995), de proteínas
del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (Naslavsky et al., 2003), de la
subunidad alfa del receptor de interleuquina-2 (Naslavskt et al., 2003), de E- caderina
(Palacios et al., 2003) y receptores acoplados a proteína G (Claing et al., 2001).
2.5 El dominio Sec7.
Todos los ARF- GEF tienen en común el dominio catalítico central sec7, esta es
una región de aproximadamente 200 aminoácidos (Cox et al., 2004; Jackson et al.,
2000; Liu and Pohajdak, 1992; Shevell et al., 1994). Se caracteriza por una estructura
18
cilíndrica elongada de 10 alfa- hélices transversas, las que están separadas en dos
subdominios por medio de un loop hidrofóbico expuesto a solvente (Goldberg et al.,
1998; Cherfilis et al., 1998). En la actividad catalítica Arf- GEF ha resultado ser clave
un residuo de glutamato en el extremo del loop hidrofílico, localizado entre las hélices 6
y 7. El residuo de glutamato compite electrostáticamente con el fosfato beta del
nucleótido de guanina, ya que este residuo queda inserto en la cavidad de unión (Beraud
et al., 1998). En el proceso de intercambio GDP/GTP el dominio Sec7 gatilla la apertura
de los denominados “switch 1 y 2” de Arf, lo que produce una reorientación en el
núcleo de Arf. Este movimiento produce el plegamiento del nucleótido hacia el
denominado “dedo glutámico”, con el siguiente desplazamiento de GDP (BeraudDufour et al., 1998). Paralelamente la reorganización interna en el núcleo de Arf
también afecta la región “interswitch”, traspasando el movimiento al extremo Nterminal de Arf, el cual es desplazado y expuesto hacia la superficie de la proteína
(Renault et al., 2003), entonces a través del residuo miristoilado Arf es anclado a
membrana para iniciar el reclutamiento de sus efectores (Antonny et al., 1997)
2.6 Familia de Arf-GAP
En la regulación del ciclo de Arf la hidrólisis de GTP es catalizada por las
proteínas Arf GAP (GTPase –activating proteins). La actividad GAP ha sido asociada a
la capacidad de interaccionar con componentes de las cubiertas vesiculares y la unión a
las proteínas de carga. Además ha sido propuesta la participación directa de los Arf
GAP en el proceso de formación de las vesículas, donde actuarían como parte de las
proteínas de la cubierta (Nie and Randazzo, 2006). La actividad GTPasa de GAPs
ocurre antes de que las vesículas se formen y también se ha descrito como un punto de
19
regulación en la clasificación de las vesículas. Un rasgo común a los miembros de la
familia Arf GAPs es el dominio Arf GAP, el cual contiene un motivo de unión a zinc
(Cukierman et al., 1995). De acuerdo a la organización estructural de los dominios los
Arf GAP han sido divididos en los grupos ArfGAP y AZAP (Randazzo et al., 2004).
ArfGAP1 regula la dinámica del complejo de Golgi, el primer fenómeno asociado a esta
actividad GAP fue el desamblaje de las cubiertas de las vesículas de transporte en el
complejo de Golgi, esto debido a la inactivación de Arf1 (Lanoix et al., 1999, Tanigawa
et al., 1993). Algunos reportes señalaban la participación de ArfGAP1 como
componente estructural de los complejos de las cubiertas vesiculares, promoviendo la
clasificación de la carga transportada y formación de las vesículas (Yang et al., 2002;
Nie and Randazzo, 2005). Los miembros SMAP1 y SMAP2 presentan un dominio de
unión a clatrina y demuestran actividad GAP con especificidad para Arf6 y Arf1,
respectivamente (Tanabe et al., 2005; Natsume et al., 2006). Los Arf GAP de tipo
AZAPs a su vez han sido divididos en los subtipos ASAPs, ACAPs, ARAPs y AGAPs.
Estudios de actividad in vitro muestran preferencia de los miembros ASAP1 y ASAP2
por Arf1 y Arf5 sobre Arf6 (Brown et al., 1998; Andreev et al., 1999). La
sobreexpresión de ASAP1 conducía a una disminución de los niveles de Arf1-GTP e
incremento de Arf6-GTP (Furman et al., 2002; Liu et al., 2005). En ASAP1, uno de los
Arf GAPs mas estudiados, la actividad GAP ha sido descrita ser estimulada sobre 10000
veces por PI(4,5)P2 y por ácido fosfatídico (Brown et al., 1998; Kam et al., 2000). Los
efectos producidos por estos agentes serían debido a un cambio conformacional en
ASAP1 cuando a través del dominio PH une PI(4,5)P2 (Kam et al., 2000; Che et al.,
2005). Algunas referencias postulan que Arf1 y ASAP1 formarían un complejo binario
induciendo así la hidrólisis de GTP (Luo et al., 2007).
20
ArfGAP1 y ACAP1 pueden unirse a proteínas de membrana relacionadas a la
selección de la carga durante la formación de vesículas. ArfGAP1 se une a las proteínas
cargo p24 y al receptor ERD2, que reconoce las proteínas portadoras de la señal KDEL
(Aoe et al., 1997). Además, se ha demostrado que las proteínas de la familia p24
inhiben la actividad Arf GAP (Goldberg et al., 2000). Se ha descrito que ArfGAP puede
unirse al coatómero y a AP1 (Watson et al., 2004; Hirst et al., 2003).
2.7 Tráfico vesicular y BFA
Muchas de las propiedades del tráfico de membranas en células eucarióticas han
sido estudiadas gracias al uso de la droga de origen fúngico Brefeldina A, la cual inhibe
los procesos secretorios al bloquear la formación de las cubiertas proteicas vesiculares.
BFA es una lactona heterocíclica, que fue descrita por primera vez en 1958 (Singleton
et al., 1958). Sus efectos son variados y localizados sobre distintos organelos de
membrana, pero uno de los rasgos más dramáticos es observado sobre la organización y
estructura del complejo de Golgi (Doms et al., 1989). El tratamiento con BFA conduce
al desamblaje del Golgi, lo que ocurre por reabsorción de éste hacia
el retículo
endoplásmico. Las primeras observaciones en torno a este proceso revelaron que
durante el tratamiento con BFA, las enzimas residentes del complejo de Golgi, como
también aquellas proteínas secretadas, eran localizadas en el retículo endoplásmico
(Doms et al., 1989). BFA conduce a la formación de estructuras membranosas tubulares
únicas, como una consecuencia indirecta de la alteración en la dinámica del tráfico
vesicular de membranas. Los primeros estudios sobre los mecanismos de acción de
BFA demostraron la inhibición de la actividad de Arf1 en el complejo de Golgi
(Donalson et al., 1992). De forma complementaria a estos resultados, la expresión de
una forma inactiva de Arf1 (T31N) conducía a los mismos efectos que producía el uso
21
de BFA (Dascher and Balch, 1994). Posteriormente se logró demostrar que el blanco
primario de BFA es el dominio sec7 de los Arf- GEF (Peyroche et al., 1999). BFA
bloquea la activación de Arf, ya que inhibe la actividad de los Arf- GEF al formar
complejos de tipo Arf-GDP- Sec7d (Peyroche et al., 1999). Estos complejos quedan
atrapados en un estado intermedio abortivo. La inhibición es específica del proceso de
secreción sin alterar la síntesis de proteínas (Misumi et al., 1986). BFA actúa de forma
no competitiva, estudios cristalográficos demuestran que en una cavidad hidrofóbica
presente en el complejo Arf-GDP-Sec7 se inserta BFA, durante un período previo a la
actividad catalítica que promueve el intercambio de GDP por GTP (Mossessova et al.,
2003; Renault et al., 2003).
BFA afecta las primeras etapas del tráfico vesicular en el sistema ER-Golgi,
mientras que los eventos de transporte tardíos no suelen ser afectados. Ensayos de
transporte de células BHK infectadas con el virus de la estomatitis vesicular (VSV)
revelaron que el tratamiento con BFA bloqueba la localización de la proteína VSV-G en
la membrana celular, pero era retenida intracelularmente (Takatsuki and Tamura, 1985).
Mediante técnicas de inmunoflorescencia se ha observado que durante el proceso de
fusión del complejo de Golgi hacia el RE, luego del tratamiento con BFA, las
membranas del Golgi sufren tubulación y enseguida ocurre un rápido vaciamiento del
contenido de éste hacia el interior del RE (Sciaky et al., 1997). Los efectos de BFA
pueden variar de acuerdo al tipo celular que se emplee, como también del estado inicial.
La sensibilidad a BFA en los distintos Arf- GEF también es variable, en los
ensayos in vitro los miembros de la familia de Arf- GEF de alto peso molecular Gea1p
(Peyroche et al., 1996), el dominio Sec7 purificado de E. coli (Sata et al., 1998) y p200
bovino purificado de baccolavirus (Morinaga et al., 1999), han demostrado ser sensibles
a BFA. Los miembros Arf- GEF de bajo peso molecular de la familia de ARNO
22
/cytohesin/GRP son resistentes al tratamiento con la droga (Chardin et al., 1996; Meacci
et al., 1997).
Esta diferencia en la sensibilidad a BFA es determinada por una secuencia interna
del dominio catalítico Sec7 (Peyroche et al., 1999). A través de la selección de mutantes
resistentes a la acción de BFA en el gen GEA1 se localizó una secuencia de 40
aminoácidos dentro del dominio sec7, la cual se sobreponía con el sitio de unión a BFA
(Peyroche et al., 1999). Posteriormente estudios mutacionales en las secuencias de
Gea1p y ARNO modificando dos residuos de la previamente delimitada secuencia de
sensibilidad a BFA, produjeron un cambio del fenotipo de sensibilidad al tratamiento
con BFA (Peyroche et al., 1999). Dado que esta secuencia estaba contenida dentro del
dominio sec7 se creyó en un principio que el mecanismo de acción de BFA podría ser
como inhibidor competitivo de la actividad Arf- GEF, más tarde se demostró que BFA
actuaba de forma no competitiva y que el blanco era el complejo Arf- Sec7.
Los ensayos de sensibilidad a BFA in vivo / in vitro pueden variar
significativamente en ciertos sistemas de mamíferos, es así como se ha determinado que
para inhibir el reclutamiento de los mantos proteicos de tipo COPI hacia las membranas
del complejo de Golgi, e iniciar el proceso de tubulación, en los ensayos in vitro se
requiere de una concentración aproximadamente 10 veces más alta que la determinada
en los procesos in vivo (Orci et al., 1991)
2.8 GBF1
GBF1 (Golgi- specific Brefeldin A-resistance guanine nucleotide exchange factor
1) es un Arf- GEF de mamíferos de alto peso molecular (206 KDa) que muestra
especificidad por Arf1 y Arf5. GBF1 participa en el trasporte retrogrado regulando el
reclutamiento de los mantos proteicos de cubierta tipo COPI. Se ha descrito que GBF1
23
in vitro presenta actividad Arf- GEF con las clases I y II de ARF (Claude et al., 1999).
Los estudios de sobreexpresión de GBF1 han revelado que éste activa Arf1, Arf3 y Arf5
(Kawamoto et al., 2002). La sobreexpresión de GBF1 en células tratadas con BFA
mantiene las características morfológicas típicas del complejo de Golgi (Claude et al.,
1999). En esta publicación, GBF1 fue aislado por expresión y selección de una
biblioteca de cDNA de una línea mutante derivada de células CHO, la cual presentaba
resistencia al tratamiento con la droga BFA (Claude et al., 1999).
GBF1 se localiza en las membranas cis del complejo de golgi, en los clusters
vesículo- tubular (VTC) y como una fracción soluble presente en el citoplasma (Zhao et
al., 2002; Kawamoto et al., 2002, Claude et al., 1999).
Mediante
ensayos
FRAP
(Flurescence recovery after photobleaching) se evaluó la dinámica de asociación de
GBF1 con las membranas de Golgi utilizando construcciones YPF-GBF1. Los
resultados indicaron que GBF1 cicla rápidamente entre la forma unida a membrana y el
estado soluble (Niu et al., 2005), y que la actividad Arf1- GEF es inhibida por BFA.
Además se demostró que BFA estabilizaba la asociación de GBF1 con las membranas
del Golgi.
A través de la generación y expresión de una proteína mutante de GBF1, E794K,
se pudo observar que los efectos obtenidos eran como los producidos por BFA, debido a
la disociación de COPI (García-Mata et al., 2003). Mediante la inhibición de la
expresión de GBF1 por siRNA, se evidenció que COPI se localizaba de forma dispersa,
pero que la estructura del Golgi no era colapsada, aunque producía tubulación de la
región cis- Golgi (Szul et al., 2007). Luego estas estructuras tubulares eran dirigidas a
los sitios ERGIC. Los efectos primarios de la depleción de GBF1 resultaron en la
detención del tráfico de proteínas de transmembrana, pero no alteraban la secreción de
proteínas solubles. En base a estos resultados propusieron la existencia de una vía de
24
secreción que puede dirigir el tráfico de las proteínas solubles pero no así las de
transmembrana, que requerirían el ensamblaje de las cubiertas COPI, mediado por la
actividad de ARF que a su vez depende de la activación por GBF1.
Por técnicas de siRNA y knockdown de GBF1 Manolea e investigadores
analizaron la especificidad de GBF1 en el tráfico vesicular, sus resultados indican que
GBF1 es requerido para el ensamblaje de las vesículas de secreción tipo COPI y
mantenimiento de las estructuras de la cara cis- Golgi, además con efectos en la
subcompartimentalización del complejo de Golgi y movimiento de las cargas
transportadas hacia la membrana celular (Manolea et al., 2008).
La interacción de GBF1 con el factor de transporte de membranas p115, ha sido
descrita previamente (García -Mata et al., 2003). p115 a su vez interacciona con las
proteínas de la matriz del Golgi GM130 y giantina (Linstedt et al., 2000; Nelson et al.,
1998), con Rab1b (Allan et al., 2000) y con varios miembros de la familia SNAREs
(Shorter et al., 2002). La actividad de p115 ha sido asociada al transporte vesicular
desde el retículo endoplásmico hacia el complejo de Golgi, en el transporte intra Golgi y
también en el proceso de reensamblaje del complejo de Golgi luego de la mitosis
(Álvarez et al., 1999). En esta misma publicación se evidenció la colocalización de
GBF1 y p115 en el complejo Golgi y en los clusters vesículo-tubulares.
Publicaciones realizadas durante el desarrollo de esta tesis dieron a conocer
nuevas interacciones de GBF1 con Rab1b, con GGA y con la proteína 3A de
picornavirus. Rab1b es una GTPasa que está involucrada en el reclutamiento de los
mantos proteicos de tipo COPI (Monetta et al., 2007). Por medio de siRNA se lograba
evidenciar la importancia de Rab1b en el reclutamiento de GBF1 a membranas, y
postularon que Rab1b regula el reclutamiento de GBF1 en los sitios ERES y en el
complejo de Golgi.
25
Otra interacción de GBF1 descrita recientemente es con la proteína 3A de
Picornavirus (Wessels et al., 2007). La proteína 3A de coxsackievirus ha demostrado
inhibir el tráfico entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi, específicamente
al nivel del reclutamiento de los mantos proteicos de tipo COPI dependiente de Arf1. El
verdadero blanco de CVB3 3A es GBF1.
La interacción entre GBF1 con GGAs (Golgi- localized, gamma ear-containing,
ADP ribosylation factor (Arf)- binding protein) demostró mediar el reclutamiento a
membranas de GGAs (Lefrançois and McCormick, 2007). Esta interacción fue
requerida para el tráfico lisosomal, donde GGAs participan en el reclutamiento de
clatrina. Las proteínas GGAs interaccionan con Arf1 en la forma activa, unida a GTP
(Puertollano et al., 2001), pero el Arf- GEF requerido para este etapa no había sido
identificado aún. Como posibles candidatos fueron postulados los Arf GEF GBF1,
BIG1 y BIG2 por su localización en el Golgi y asociación con Arf1. Por
inmunofluorescencia se detectó colocalización de GBF1 con GGA1, GGA2, GGA3,
parcialmente con AP1 y no con AP3.
Una característica importante de GBF1 para el estudio de las interacciones
proteicas es que posee, como los demás miembros de la familia GBF/BIG, un dominio
DCB que interaccionaría con ciclofilinas. Las ciclofilinas son proteínas que catalizan las
reacciones de isomerización de tipo cis/trans de los enlaces peptidil-prolil (Fischer et
al., 1989). Este proceso de isomerización es un evento clave en el plegamiento proteico
y es inhibido en distintos grados por el tratamiento con la droga inmunosupresora
Ciclosporina A (CyA). Las ciclofilinas se encuentran tanto en procariontes como en
eucariontes, y se localizan en diversos compartimentos celulares. En humanos se
conocen 6 tipos de ciclofilinas, en Saccharomyces 8 y en Arabidopsis hasta 29. La
actividad de las ciclofilinas está asociada a diversas rutas de señalización, dentro de las
26
que se destacan la activación de células T y la transducción de señal dependiente de la
proteína de shock térmico Hsp90 (Mattila et al., 1990). La dimerización y
oligomerización fueron nuevos roles estudiados en ciclofilinas, dentro de este contexto
se demostró la interacción de Cyp40 con el dominio de dimerización de Hsp90 (Carrello
et al., 1999). Así como también se demostró que Cpr6, un homólogo de Cyp40 era
capaz de reactivar la actividad ATPasa de Hsp90 (Prodromou et al., 1999). Por ensayos
in vitro y doble híbrido en levaduras se demostró que el Arf- GEF de Arabidopsis,
GNOM, interacciona con ciclofilina 5 (Grebe et al., 2000). Esta interacción resultó ser
clave durante el período de desarrollo embrionario en Arabidopsis. Sobre la interacción
específica entre GBF1 y ciclofilinas hasta el momento no existen referencias publicadas.
Una interacción entre homodímeros de GBF1, BIG1 y BIG2 fue identificada
(Ramaen et al., 2007). Las interacciones descritas fueron mediadas por los dominios
DCB y HUS de estos Arf GEF, con estructuras de tipo DCB/DCB y DCB/HUS.
Investigaciones a nivel celular de los efectos producidos en la inhibición de GBF1
por tratamiento con BFA han demostrado estrés del RE por acumulación de proteínas
no plegadas o mal plegadas (Citterio et al., 2008). Como consecuencia de esto las
células acumulan los productos génicos de los elementos de respuesta al estrés del RE,
lo que produce muerte celular por apoptosis.
Los múltiples y relevantes aspectos de la caracterización de GBF1 reportados
hasta el inicio de esta tesis, revelan fundamentalmente antecedentes de localización,
nivel de regulación en la vía secretoria, preferencia por substrato y sensibilidad a
Brefeldina A. El enfoque general se basa en la actividad Arf GEF catalizada por el
dominio sec7 de GBF1 que permite la activación de Arf1, necesaria para el
reclutamiento de los mantos proteicos de las vesículas COPI. De esto destaca de forma
especial el que GBF1 sea una proteína de alto peso molecular (206 KDa) y el dominio
27
Sec7 sólo represente aproximadamente el 10 % de la proteína, desconociéndose
funciones específicas para otras regiones o dominios.
Los determinantes moleculares que regulan la actividad de GBF1 en el transporte
vesicular retrógrado permanecen desconocidos, y para intentar dilucidarlos se realizó
aquí la búsqueda de interacciones proteína-proteína, bajo la hipótesis y objetivos que se
señalan a continuación.
Hipótesis de trabajo:
“El nuevo Arf- GEF de mamíferos, GBF1, es más que un activador de los factores
de ADP-ribosilación (Arf), actuando como un andamiaje molecular que regula las
interacciones entre las proteínas necesarias para el tráfico de vesículas de tipo COPI.”
Objetivos generales:
Estudiar e identificar algunas de las interacciones entre GBF1 y otras proteínas
que modulan la actividad de este ARF- GEF de mamífero.
Objetivos específicos:
Identificar interacciones de GBF1 con otras proteínas a través de las técnicas de
doble híbrido y co-Inmunoprecipitación”
Caracterizar de aquellas regiones críticas de GBF1 que median las interacciones
de tipo proteína- proteína cuando son empleadas diversas mutantes de GBF1.
28
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Amplificación de fragmentos de GBF1 “Carnadas” por PCR. Mediante PCR se
amplificaron 8 fragmentos de GBF1 clonado en pCEP4. Se utilizaron partidores
diseñados para generar fusiones entre el dominio de unión al DNA de Gal4 y la carnada
correspondiente. Las reacciones de PCR fueron realizadas empleando una mezcla de las
enzimas Pfu Turbo (Invitrogen) y DNA Taq polimerasa (Fermentas) en una relación 1:3
y de acuerdo a la siguiente reacción: Tampón de reacción con MgSO4 1X, dNTPs 2mM
c/u, partidor sentido 1 µM, partidor antisentido 1µM, templado 50ng (GBF1 clonado en
el vector pCEP4), mezcla Pfu Turbo/Taq DNA polimerasa 1:3 (1.5 unidades). Para cada
reacción de PCR se llevó a cabo el siguiente programa: 1) calentamiento inicial a 95 ºC
por 1 minuto, 2) 30 ciclos de PCR: a) denaturación por 1 minuto a 95ºC, b) hibridación
de partidores por 1 minuto a 55 ó 60 ºC, y c) extensión por 1-2 minutos a 72 º C, 3)
extensión final por 2 minutos a 72ºC. Los fragmentos amplificados fueron preparados
con tampón de carga para DNA 6X y cargados en geles de agarosa al 1%, corridos a
70 volts en tampón TAE 1X (TAE 50X:Tris base 242 g/l, acido acético 57.1 ml/l,
EDTA 0.5 M 100ml/l) y teñidos con bromuro de Etidio. Carnada 1: 5`TTT GCC ACC
ATG GTG GAT AAG 3`(NcoI) y 5`ACC AGA CAC AGG GAC TGC AGT CTT
3`(PstI), Carnada 2: 5`GAG GCC ATG GTG CAG CTC TGG 3`(NcoI), 5`AAG GAA
GCA GAA TTC TTG TGC 3`(EcoRI), Carnada 3: 5`GCA CAA GAA TTC TGC TTC
CTT 3` (EcoRI), 5`GCC TTA GTG GAT CCC AGA GGT 3`(BamHI), Carnada 4:
5`TTT GCC ACC ATG GTG GAT AAG 3`(NcoI), 5`AGA GGG ACT GAC CAC TGC
AGA GGC 3` (PtsI), Carnada 5: 5`CCC ACT CCC ATG GCC TCT GCA 3` (NcoI),
5`ACC AGA CAC AGG GAC TGC AGT CTT 3`(PstI), Carnada 6: 5`GCA CAA GAA
TTC TGC TTC CTT 3`(EcoRI), 5` ATC AGC TTG GAT CCT CTG GCC (BamHI),
29
Carnada 7: 5`GAC GAA TTC GTG CCT GCC AGC 3`(EcoRI), 5`GCC TTA GTG
GAT CCC AGA GGT 3`(BamHI), Carnada 8: 5`CCC ACT CCC ATG GCC TCT
GCA 3` (NcoI) ,5`GAA TAC TGT CTT GGC TGC AGT ATG 3`(PstI)
3.2 Cultivo microbiológico. Para el clonamiento de las construcciones carnadas y para
la preparación de DNA plasmidial se utilizaron las cepas de E.coli XL1 – Blue y
JM109. Se empleó el medio de cultivo LB (peptona 10g/L, extracto de levadura 5g/L y
cloruro de sodio 10 g/L) con los antibióticos correspondientes; ampicilina (100 µg/ml) y
kanamicina (50 µg/ml), tetraciclina (30 µg/ml). Para los medios sólidos se agregó agar
(15 g/l). Las células competentes químicas se prepararon por el procedimiento estándar
de tratamiento con cloruro de calcio, fueron alicuotadas y almacenadas a -70ºC.
3.3 Clonamiento en pGEM-T-Easy. Los productos de PCR fueron purificados
utilizando el Kit Clean up PCR (Promega) y se realizó el procedimiento estándar de Atailing (4 µl del fragmento de PCR purificado, 1 µl de tampón 10X de Taq DNA
Polimerasa, 1 µl de MgCl2 25 mM, 1µl de dATP 2mM y 5U de Taq DNA Polimerasa,
incubando a 72 ºC por minutos. Los fragmentos fueron ligados a pGEM-T Easy
(Promega) de acuerdo a la siguiente reacción: 5 µl de tampón de T4 DNA ligasa 2x, 1
µl del vector pGEM-T Easy, 3 µl del producto de PCR y 1 µl de T4 DNA ligasa (3
U/µl), las reacciones fueron incubadas por 1.5 horas a temperatura ambiente y 4 horas a
4ºC. Con las ligaciones se transformó en la cepa XL1- Blue de E.coli plaquendo en
medio LB/ampicilina/ previamente preparadas con IPTG 100 mM (100 µl) y X-GAL 50
mg/ml (20 µl). Las placas fueron incubadas a 37º C por 20 horas.
30
3.4 Clonamiento de carnadas en el vector de expresión pGBKT7. Los fragmentos
clonados en pGEM-T Easy fueron preparados para el subclonamiento en pGBKT7 por
extracción de DNA plasmidial desde los clones recombinantes (por el método de
ebullición) y posterior digestión con las enzimas de restricción seleccionadas para cada
construcción carnada. Carnadas 1, 4, 5 y 8 (Digestión NcoI/PstI): 5 µl Tampón 3 10X,
0,5 µl de BSA 100X, 0.5 µl de NcoI (10 U), 0.5 µl de PstI (10U), 28,5 µl de H20 grado
biología molecular. Carnadas 3, 6 y 7: EcoRI y BamHI. Carnada 2: NcoI y EcoRI.
Paralelamente se realizó la preparación del vector pGBKT7 por doble digestión con las
enzimas indicadas. Los fragmentos doblemente digeridos fueron ligados a pGBKT7 y
transformados en la cepa XL1- Blue. Los transformantes fueron seleccionados en medio
LB/kanamicina/agar incubando a 37 º C por 20 horas. Las colonias obtenidas fueron
inoculadas en medio líquido LB/kanamicina para realizar extracción de DNA plasmidial
y digestión enzimática que permita comprobar la liberación de los fragmentos carnadas
clonados.
3.5 Medios de cultivo de levaduras. Medio YPD (peptona 20 g/L, extracto de
levaduras 10 g/L, pH 6.5, glucosa al 2 %). Medio YPDA (peptona 20 g/L, extracto de
levaduras 10 g/l, hemisulfato de adenina 15 ml/L de una solución al 0.2 %, pH 6.5,
glucosa al 2 %). Medio YPD 2X. Medio YPD 0.5X. Medios SD (Base nitrogenada de
levaduras sin aminoácidos 6.7 g/L, SD Dropout según indicación, pH 5.8, glucosa al 2
%). Medios SD: SD –Trp, SD –Leu, SD/-His, SD/-Ura,SD- Trp/-Leu, SD- Ade/- His/Leu/-Trp.
3.6 Cepas de Saccharomyces cerevisiae. Para el sistema de doble híbrido se utilizaron
las cepas AH109 e Y187 con el genotipo descrito en la tabla I.
31
Tabla I. Características genotípicas de las cepas AH109 e Y187
Cepa
Genotipo
Genes
Marcadores
reporteros
AH109
MATa, Trp 1- 901, leu2-3,112,
HIS3,ADE2
ura3-52, his 3-200, gal4∆, gal80∆,
, MEL1,
LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-
LacZ
Trp, leu2
HIS3,GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2
URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-LacZ
MEL1
Y187
MATα, ura3-52, his3-200,ade2101,trp1-901,leu2-3,112,
Gal4∆, gal80∆,met-,
URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-LacZ
MEL1
MEL1,LacZ
Trp, leu2
32
3.7 Vectores utilizados en el sistema doble híbrido. pGBKT7, pGADT7, pCL1,
pGADT7- T, pGBKT7- 53, pGBKT7- Lam. Todos los vectores fueron preparados por
DNA miniprep (Promega) y DNA midipreps (Quiagen) y cuantificados por medición de
la absorbancia a 260.
3.8 Ensayo de Beta galactosidasa en filtro. Tampón Z (Na2HPO4-7 H2O 16.1 g/L,
NaH2PO4-H2O 5.50 g/L, KCl 0.75g /L, MgSO4- 7H2O 0.246 g/L, pH7.0). Solución Xgal stock (20 mg/ml en DMF). Solución tampón Z/ X- gal (tampón Z 100 ml, Bmercaptoetanol 0.27 ml, solución X- gal stock 1.67 ml). Placas con colonias frescas de
los clones a evaluar fueron presionadas y transferidas a papel Whatman Nº 5 estéril, con
las colonias hacia el interior los filtros fueron sumergidos en nitrógeno líquido por un
período de 10 segundos. Se dejó descongelar a temperatura ambiente y luego cada filtro
fue puesto sobre un filtro previamente sumergido en tampón Z/X- gal en una placa de
100 mm. Se incubó a 30 º C controlando la aparición de colonias azules indicadoras de
reacción beta-galactosidasa positiva.
3.9 Preparación de extractos de proteínas de levadura. Solución inhibidora de
proteasas 100 X, PMSF 100 X (0.01742 g/ml de isopropanol), Glass Beads 425- 600
µm (Sigma). Solución Stock de tampón Cracking (Urea 8 M, SDS 5 % p/v, Tris- HCl
pH 6,8 40 mM, EDTA 0.1 mM, azul de bromofenol 0.4 mg/ml). Tampón Cracking
(solución stock de tampón Cracking 1ml, B-mercaptoetanol 10 µl, solución inhibidora
de proteasas 70 µl, PMSF 50µl de una solución stock 100 X). Desde cultivos ON de la
cepa transformada con las construcciones carnadas en medio SD/-Trp se inoculó 50 ml
de medio YPD, incubando a 30ºC y 250 rpm hasta lograr un OD600 de 0.4- 0.6, se
calcularon las unidades totales y el cultivo fue enfriado y centrifugado a 1000xg por 5
33
minutos a 4ºC. El pellet fue resuspendido en 50 ml de H2O estéril fría, el pellet fue
centrifugado a 1000xg y guardado a -70ºC. Los pellets fueron descongelados
resuspendiendo en tampón Cracking precalentado (100 µl /7,5 unidades de OD600),
cada 7 minutos se añadió PMSF 100X, las suspensiones fueron transferidas a tubos
eppendorf conteniendo 80 µl de glass beads por cada 7,5 unidades. Las muestras
fueron calentadas por 10 minutos a 70ºC. Las muestras fueron vortexeadas
vigorosamente por 1 minuto, se centrifugó 5 minutos a 16000xg a 4ºC, el sobrenadante
fue transferido y mantenido en hielo. Los pellets fueron tratados para recuperar una
nueva fracción soluble que fue añadida al sobrenadante anterior, finalmente las muestras
fueron prepara con tampón de carga de proteínas 5X (Tris- HCl 0.313 M, pH 6.8, SDS
10 %, azul de bromofenol 0.05%, glicerol 50 %) para cargar en geles de SDS- PAGE
o almacenadas a – 70ºC.
3.10 Transformación de levaduras por el método de acetato de litio. Varias colonias
frescas de la cepa AH109 fueron inoculadas en 50 ml de medio YPD, incubando por 1618 horas a 30 ºC y 250 rpm, hasta obtener una OD600 ˃1.5. Desde este cultivo se
transfirieron 30 ml de cultivo a 300 ml de medio YPD y se incubó hasta obtener una
OD600 de 0.2- 0.3. Se incubó por 3 horas más para lograr una OD600 de 0.4- 0.6, el
cultivo fue centrifugado por 5 minutos a 1000xg a temperatura a ambiente. El pellet fue
resuspendido en 1.5 ml de tampón TE 1x/LiAc (300 µl de acetato de litio 10x +2,7 ml
de tampón TE).0,1 ml de cada plásmido fue mezclado con 0.1 mg de DNA de espermio
de salmón (Sigma), se agregó 100 µl de las células competentes, se mezcló y se añadió
0.6 ml de la solución PEG/ LiAc (PEG 3350 50% 800 µl/ml, tampón TE 10X 100
µl/ml, LiAc 10 X 100 µl /ml). Las mezclas fueron incubadas a 30ºC por 3 minutos a 200
rpm. Se agregó 70 µl de DMSO y se sometió a shock térmico en un baño a 42º C por 15
34
minutos. Las células fueron enfriadas en hielo y se centrifugó por 3 minutos a 1000xg,
el pellet fue resuspendido en tampón TE 1X, plaqueando en el respectivo medio SD.
3.11 Extracción de pDNA desde levaduras (método modificado). Desde colonias
frescas de AH109 transformadas con las construcciones carnadas se inoculó 5 ml de
medio YPD con 100 µl de un cultivo en medio SD saturado. Se centrifugó a 1000xg por
5 minutos, el pellet total fue resuspendido en el medio residual y se agregó 10 µl de
liticasa (5U/µl en tampón TE), incubando por 1 hora a 37º C. Se agregó 10 µl de SDS al
20%, la muestras fueron vortexeadas y congeladas a -20 º C. Se descongeló y se agregó
150 µl de glass beads acidificadas (glass beads obtenidas de Sigma fueron acidificadas
por tratamiento con ácido nítrico concentrado), iniciando un ciclo de congelado,
descongelado y vortexeo por 3 veces. Las muestras fueron diluidas con tampón
Breacking y vortexeadas. Se añadió 200 µl de una mezcla fenol: cloroformo: alcohol
isoamílico (25:24:1), vortexeando vigorosamente. La mezcla fue centrifugada por 10
minutos y se extrajo la fase acuosa. Se lavó dos veces con 200 µl de cloroformo, se
centrifugó por 5 minutos y se extrajo la fase acuosa cada vez. El pDNA fue precipitado
agregando 12, 5 ml de acetato de amonio 6 M y 500 µl de etanol frío. Se mantuvo por 1
hora a – 70ºC y luego se centrifugó por 30 minutos a 4º C y 16000xg. El pellet fue
lavado con 500 µl de etanol 70 % frío y se centrifugó nuevamente por 10 minutos. El
pellet fue dejado secar a temperatura ambiente y se resuspendió en 25 µl de tampón TE.
3.12 Extracción de pDNA por el método de ebullición. Solución STET (sacarosa 8
%, Tris-HCl 50 mM pH8.0, EDTA, Triton X-100 5 %). Lizosima 50 mg/ml,
isopropanol, etanol 70%, tampón TE. Este procedimiento fue realizado de acuerdo a los
protocolos estándares.
35
3.13 Apareamiento de levaduras. Desde una colonia fresca de la cepa AH109
transformada con las construcciones carnadas se inoculó 50 ml del medio SD/-Trp
incubando por 16- 24 horas a 30 ºC y con agitación de 250 rpm. Cuando se obtuvo una
densidad de 0.6- 0.8 se procedió a centrifugar el cultivo por 5 minutos a 1000x g. El
pellet fue resuspendido y se mezcló con una alícuota de 1ml de la biblioteca de cerebro
fetal humano (Clontech), recién descongelada en un baño a temperatura ambiente. La
mezcla fue llevada a un matraz de 2 L adicionando 45 ml de medio YPDA
2X/kanamicina. Se incubó por 24 horas a 30 ºC con agitación de 50 rpm. Los productos
del mating fueron centrifugados por 10 minutos a 1000xg y el pellet se resuspendió en 4
ml de medio YPDA 0.5 X/Kanamicina plaqueando en medio SD /-Ade/-His/-Leu/-Trp.
Las placas fueron incubadas a 30 ºC hasta la aparición de colonias.
3.14 Entrecruzamiento de proteínas con DTBP.
Procedimiento A. Células EBNA 293 fueron cultivadas en medio DMEM,
suplementado con 10 % suero fetal bovino y cultivadas a 37º C y 5 % de CO2 hasta
obtener una confluencia de 70-80%. Se eliminó el medio de cultivo y las células fueron
lavadas en PBS y luego incubadas con 1mg/ml de DTBP en DMEM sin suplementar,
se incubó a 37 ºC por 30 minutos. La reacción de entrecruzamiento fue detenida por
adición de glicina a una concentración final de 50 mM, incubando 15 minutos a
temperatura ambiente. La células fueron centrifugadas y lisadas en tampón PBS/mix
antiproteasas por pasaje 6 veces a través de una aguja calibre 28. Se centrifugó a
16000xg durante 30 minutos a 4 ºC para separar las fracciones solubles y de membrana.
36
La fracción de membrana fue solubilizada por tratamiento con PBS/ Tritón X-100 1%.
Las muestras fueron cargadas en SDS- PAGE al 8 % y analizadas por Western Blot.
Procedimiento B. Las células 293 EBNA fueron lavadas con PBS, resuspendidas en
tampón de lisis y pasadas 8 veces a través de una aguja calibre 28. Se agregó DTBP a
una concentración final de 1mg/ml, incubando por 1 hora en hielo. La reacción fue
detenida agregando glicina a una concentración final de 50 mM, por 15 minutos. Se
centrifugó a 16000xg por 30 minutos a 4º C, separando las fracciones de proteínas
solubles y asociadas a membrana. La fracción asociada a membrana fue solubilizada
con PBS – Triton X- 100 1%. Las muestras fueron cargadas en SDS- PAGE al 8% y
analizadas por Western blot.
3.15 Preparación de extractos proteicos de células 293 EBNA. Células 293 EBNA
fueron cultivadas en medio DMEM/ 10 % suero fetal bovino, a 37º y 5% CO2 hasta
obtener la densidad deseada y transfectadas con Perfectin incubando por 24 horas más.
Se eliminó el medio de cultivo, las placas fueron puestas en hielo y se añadió el tampón
de lisis (PBS-T 1%, mezcla de antiproteasas, PMSF 0.1 M (10 µl/ml en PBS-T),
incubando por10 minutos. Se pasó 6 veces suavemente a través de una aguja de calibre
28 y se centrifugó por 10 minutos a 4ºC y 1000xg. Las muestras fueron preparadas con
tampón de carga 5 X y guardadas a -20º C.
3.16 SDS PAGE. Gel separador al 8 % (8 ml): 2,75 ml Acrilamida-bisacrilamida 30%,
2,0 ml de tampón Tris/ HCl 1.5 M, pH 8.8/SDS 0.4 %, 3.2 ml de agua destilada, 60 µl
de persulfato de amonio al 10%, 5 µl de TEMED. Gel espaciador al 6% (4ml):0, 8 ml
de acrilamida-bisacrilamida al 30 %, 1.3 ml de tampón Tris- HCl 0.5 M, pH 6.8 /SDS
37
0.4 %, 1.9 ml de agua destilada, 30 µl de persulfato de amonio al 10 %, 7.5 µl de
TEMED. Tampón de corrida. Tampón de transferencia. Los soportes de los geles fueron
montados en la cámara de electroforesis cubriendo con tampón de corrida para geles de
SDS- PAGE 1X (tampón de corrida 5X: Tris base 15.1 g/L, glicina 72 g/L, SDS 5 g/L).
Las muestras fueron precalentadas por 5 minutos a 95 ºC y luego cargadas, se cargó
también 5 ul del estándar de proteínas Protein Plus dual color (BioRad). La
transferencia fue realizada a membranas de nitrocelulosa (BioRad) en tampón de
transferencia con aplicación de 12 volts por un periodo de 16 horas.
3.17 Western Blot. Las membranas de nitrocelulosa fueron bloquedas con PBS- T/ 5%
leche descremada por 1.5 horas agitando suavemente. Se lavó en PBS-T 1% leche
descremada y se incubó con el anticuerpo primario correspondiente diluido en PBS- T/1
% leche descremada por 1.5 horas y agitación suave. El anticuerpo primario fue lavado
en PBS T / 1% leche descremada 4 veces por 10 minutos cada uno. Se incubó con el
anticuerpo secundario diluido en PBS-T 1% leche descremada por 1.5 horas. El lavado
del anticuerpo secundario fue realizado en PBS- T 1% leche descremada y agitación
durante 10 minutos repitiendo 4 veces. Finalmente las membranas fueron lavadas en
PBS-T y luego en PBS. El revelado fue realizado usando el sistema ECL Western
Blotting (BioRad) y films CL-Xposure (BioRad).
3.18 Anticuerpos. Anticuerpos primarios: Para la detección de GBF1 se utilizaron los
anticuerpos 9D4 (conejo, dilución 1:10000), 9D2 (conejo, dilución 1:10000) y H154
(conejo, dilución 1:10000). Anti c-myc (ratón, dilución 1:5000, Santa Cruz). Anti p115.
Anti α-SNAP (Dilución 1:1000, Santa Cruz). Anticuerpos secundarios: anti- conejo
38
HRP conjugado (cabra, dilución 1:5000,) y anti-mouse HRP conjugado (cabra, dilución
1:5000).
3.19 Stripping de membranas. Las membranas fueron incubadas en tampón de
stripping (2-mercaptoetanol 100 mM, SDS 2 %, Tris- HCl 62.5 mM pH6.7) por 30
minutos a 50º C y agitación ocasional. Se lavó dos veces con PBS-T por 10 minutos.
Las membranas fueron bloqueadas con PBS-T 5 % leche descremada durante 1 hora a
temperatura ambiente.
3.20 Purificación por afinidad con GST. Construcciones GST- GBF1 clonadas en el
vector de expresión en mamíferos pEBG fueron transfectadas en la línea celular 293
EBNA empleando el kit comercial de transfección con lípidos catiónicos Perfectin. Se
prepararon extractos proteicos de GST- hGBF1 por lisis mecánica en tampón PBS/ Mix
antiproteasas/ NP40 0.1 %, pasando 6 veces a través de una aguja de calibre 28.
Previamente la resina Glutatión sefarosa 4B (Bioworld) fue lavada y equilibrada en
tampón PBS/DTT para obtener glutation –sefarosa al 50 %. 400 µl de los extractos
fueron incubados con 50 µl de la resina glutatión-sefarosa 4B (Bioworld) que había sido
bloqueada por incubación con DMEM y equilibrada en PBS /DTT. Se incubó por un
periodo de 6 horas a 4 ºC con agitación. Las muestras fueron centrifugadas por 2
minutos a 1000xg a 4º C guardando la fracción eluida. La resina fue lavada cuatro veces
y las construcciones GST fueron eluidas por incubación con tampón PBS/glutatión
reducido 50 mM durante 10 minutos, se centrifugó por 1 minuto a 1000xg a 4ºC. Las
muestras fueron preparadas con tampón de carga para proteínas 5X y fueron cargadas
en geles de SDS- PAGE al 8 %. Los geles fueron teñidos usando el kit para tinción de
proteínas con sales de plata (Winkler).
39
3.21 Tinción de geles de poliacrilamida con sales de plata. Los geles de
poliacrilamida fueron lavados en agua destilada y fijados en una solución metanol 40%
/ácido acético 10 %, luego fueron teñidos con el kit de tinción para proteínas con sales
de plata (Winkler) de acuerdo al protocolo proporcionado por el manufactor.
40
4. RESULTADOS
4.1 Doble híbrido
4.1.1 Amplificación por PCR de fragmentos estratégicos de GBF1 para posterior
construcción de “Carnadas”.
GBF1 es una proteína de alto peso molecular (206 kDa aproximadamente). El gen
se localiza en el brazo largo del cromosoma 10, en la banda 10q24.32 (PubMED id
9828135), con un tamaño de 137.341 bases que se inicia en la posición 103.995.299 y
termina en la posición 104.132.639. El ORF del mRNA tiene un tamaño de 5577 pb
que permite expresar una proteína de 1859 aminoácidos. Sobre la funcionalidad y
estructura de GBF1 al inicio de esta tesis sólo había sido analizado el dominio catalítico
Sec7, donde, al igual que el resto de los miembros de la familia Arf- GEF se concentra
la actividad de intercambio de nucleótidos de guanina, mediando la activación de Arf.
El dominio Sec7 de GBF1 representa aproximadamente el 10 % de la proteína, y
al resto de la secuencia no se habían asignado funciones específicas. En la búsqueda de
interacciones proteína- proteína por el sistema de doble híbrido en Saccharomyces
cerevisiae, se realizó la construcción de 9 carnadas mediante amplificación por PCR de
fragmentos estratégicos de las regiones N-terminal, del dominio catalítico Sec7, de la
región C-terminal y fragmentos intermedios de GBF1 (Figura 1). La actividad Arf- GEF
de GBF1 es catalizada por el dominio sec7, un fragmento de 191 aminoácidos
localizado entre los residuos 692 y 882, correspondiente al fragmento 2074- 2646 del
ORF del mRNA de GBF1. Dentro de las modificaciones post-traduccionales en GBF1
se tiene referencia de fosforilaciones en distintos sitios, en el residuo 507 se ha descrito
un sitio fosfotreonina, y en los residuos 1318, 1773 y 1784 sitios fosfoserina.
41
GBF1
1
5577
DCB
Sec7
pro
Carnada 1
1-1716
Carnada 2
1579-3577
Carnada 3
3577-5577
Carnada 4
1-853
Carnada 6
Carnada 5
820-1716
3577-4599
Carnada 7
Carnada 8
4446-5577
820-3051
Carnada 9
2998-4434
Figura 1. Esquema utilizado para la construcción de las carnadas de GBF1 en el
sistema de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae. Para la búsqueda de
interacciones proteína- proteína por el sistema de doble híbrido se diseñaron 9
fragmentos estratégicos de GBF1 para ser amplificados por PCR y luego utilizados
como carnadas en el screening de una biblioteca de cerebro fetal humano. Los
fragmentos diseñados permiten el clonamiento en el vector de expresión en levaduras
pGBKT7 para así expresar proteínas de fusión Gal4 DNA BD- carnada.
42
La región entre los residuos aminoacídicos 1751 y 1854 corresponde a una zona
rica en prolina. Como otro antecedente previo se ha descrito la interacción de GBF1 con
la proteína factor de transporte de membranas p115 (Garcia Mata et al., 2003), la cual
fue confinada en región rica en prolina de GBF1. Los partidores utilizados para la
amplificación de estos fragmentos habían sido diseñados previamente y contienen
incorporados sitios de restricción que permiten mantener el marco de lectura de GBF1,
al ser clonados en el vector de expresión de levaduras pGBKT7. Este vector permite
expresar proteínas de fusión entre el dominio de unión al DNA de Gal4 (DNA BD) y las
carnadas. Los fragmentos diseñados varían entre los 853 y 2232 pb (Tabla I).
La carnada 1, carnada 4 y carnada 5 representan distintos fragmentos de la región
amino-terminal de GBF1. La carnada 2 amplifica un fragmento que contiene el dominio
Sec7 de GBF1. La carnada3, carnada 6 y carnada 7 amplifican regiones del extremo
carboxilo terminal de GBF1. Las carnadas 8 y 9 representan regiones intermedias de
GBF1. El vector pGBKT7 posee codones de término en los 3 marcos de lectura, por lo
que no fue necesario incluirlos en los partidores.
De acuerdo a la compatibilidad entre los sitios de restricción únicos de pGBKT7 y
el análisis de restricción de la secuencia de GBF1 se utilizaron los siguientes sitios de
restricción por carnada: NcoI / PstI (Carnadas 1, 4, 5 y 8), NcoI/EcoRI (carnada 2),
EcoRI/BamHI (carnadas 3, 6 y 7) y EcoRI/SmaI (carnada 9).
El sitio de restricción para NcoI C´CATG_G está contenido 2 veces en la
secuencia del ORF del mRNA de GBF1, en las posiciones 3975 y 5180. El sitio de
restricción de PstI C_TGCA´G está presente 10 veces en el ORF del mRNA de GBF1,
en la posiciones 3107, 3851, 4640, 4706, 4821, 4886, 5432, 5453, 5830 y 5884. Las
carnadas 1, 4, 5 y 8 fueron diseñadas con los sitios NcoI (sense)/PstI (antisense) ya que
representan la región nucleotídica 1-3051 del ORF del mRNA de GBF1.
43
Tabla II. Características de los fragmentos de GBF1 amplificados por PCR para ser
utilizados como carnadas en el sistema doble híbrido.
Carnada Fragmento Tamaño
(pb)
Tamaño
( aa)
Partidor
Partidor
sentido
Antisentido
1
1-1716
1716
572
NcoI
PstI
2
1579-3577
1998
666
NcoI
EcoRI
3
3577-5577
2006
668
EcoRI
BamHI
4
1-853
853
284
NcoI
PstI
5
820-1716
896
299
NcoI
PstI
6
3577-4599
1023
341
EcoRI
BamHI
7
4446-5777
1138
379
EcoRI
BamHI
8
820-3051
2232
744
NcoI
PstI
9
2998-4434
1436
478
EcoRI
SmaI
44
La carnada1 (1-1716), carnada 4 (1-853) y la carnada 5 (820-1716) amplifican
fragmentos del dominio N-terminal de GBF1 y la carnada 8 (820-3051) amplifica una
fragmento de la región N-terminal más la región del dominio Sec7. EcoRI (G´AAT_C)
corta una vez en la posición 883 del ORF del mRNA de GBF1.
La carnada 2 fue construida con los sitios de restricción NcoI/EcoRI amplificando
el fragmento 1579- 3577 del mRNA de GBF1, conteniendo la secuencia codificante
para el dominio catalítico sec7 donde se concentra la actividad Arf-GEF de GBF1. La
secuencia de reconocimiento de BamHI G´GATC_C está presente 3 veces en las
posiciones 108, 372 y 3162 del ORF del mRNA, es decir en las regiones codificantes
para el dominio N-terminal y Sec7 de GBF1, por lo que se utilizó para el clonamiento
de las carnada3, carnada6 y carnada7, que representan la región C-terminal de GBF1
(nucleótido 3577- 5577).
La carnada 9 amplifica el fragmento 2998 – 4434 del ORF del mRNA de GBF1,
lo cual representa una fracción del extremo C-terminal, y fue construida con los sitios
EcoRI y SmaI. La secuencia de corte para SmaI, CCC´_GGG está presente una vez en
el ORF del mRNA de GBF1, en la posición 1141.
La estrategia utilizada para el diseño de estas carnadas permitió seccionar GBF1
en fragmentos que facilitan el clonamiento y expresión en levaduras, y principalmente,
permitiría asignar las interacciones proteína- proteína a una región específica de la
secuencia de GBF1. La secuencia de GBF1 fue analizada utilizando el programa
pDRAW32 (Acaclone).
Para la amplificación por PCR de los fragmentos “carnadas” de GBF1 se utilizó
como templado cDNA de GBF1 clonado el vector pCEP4, y una mezcla de las enzimas
Taq DNA polimerasa y Pfu Turbo DNA polimerasa , en una relación 3:1. La
45
programación de los ciclos de PCR fue realizada de acuerdo a las condiciones de
reacción establecidas para cada carnada.
Los productos de amplificación por PCR fueron preparados con tampón de carga
para DNA, visualizados por separación electroforética en geles de agarosa al 1% y
teñidos con bromuro de etidio. Los productos de PCR fueron analizados para determinar
la pureza de los fragmentos y verificar si los tamaños obtenidos corresponden a lo
esperado para cada carnada. Como referencia de tamaño se utilizó el estándar de DNA
1Kb y Lambda /HindIII.
De las nueve carnadas diseñadas originalmente para el clonamiento se
amplificaron 8 fragmentos, correspondientes a la carnada 1, carnada 2, carnada 3,
carnada 4, carnada 5, carnada 6, carnada 7 y carnada 8. La carnada 9 fue amplificada
pero no fue clonada debido a una mala elección en los sitios de restriccíon empleados.
En la figura 2 A se observa la amplificación de la carnada 3 y de la carnada 7,
correspondientes a fragmentos de 2006 y 1178 pb respectivamente. Los fragmentos de
PCR obtenidos fueron purificados con el sistema SV Gel and PCR Clean -Up (Wizard,
Promega), para su posterior clonamiento en el vector pGEM-T Easy.
Los fragmentos carnadas 1 y 4 fueron amplificados utilizando el mismo partidor
sentido ya que representan los fragmentos 1-1716 y 1- 853 respectivamente. Las
carnadas 3 y 6 fueron amplificadas utilizando el mismo partidor sentido ya que
amplifican los fragmentos 3577- 5583 y 3577- 4599 respectivamente. En la figura 2 B
se observa la amplificación de los fragmentos de PCR de las carnadas 2, 6 y 9.
46
A
pb
1
2
3
4
5
10.000
2000
Carnada 3
(2006 pb)
1500
1000
Carnada 7
(1178 pb)
B
Figura 2. Amplificación por PCR de fragmentos carnadas. (A). Amplificación de
los fragmentos de GBF1 a ser utilizados como “carnadas” 3 y 7. Carril 1: Estándar de
DNA 1kb, carril 2 y 3: carnada 3, carril 4 y 5: carnada 7. Gel de agarosa al 1%, tinción
con bromuro de etidio. (B) Amplificación mediante PCR de los fragmentos carnada 2,
6 y 9 de GBF1. Carril 1: Estándar de DNA 1kb, carril 2-3: carnada9, carril 4-5: carnada
6 carril 4 y 5: carnada 9. Gel de agarosa al 1%, tinción con bromuro de etidio.
47
4.1.2 Clonamiento de los fragmentos de PCR (carnadas) en pGEM-T Easy
El preclonamiento en pGEM-T Easy fue realizado con el fin de aumentar la
eficiencia de digestión en los sitios de restricción incorporados en los partidores, y así
facilitar el clonamiento de las carnadas en el vector de expresión pGBKT7. pGEM-T
Easy es un sistema de clonamiento basado en un vector linealizado que posee en los
extremos 3’ un residuo de timidina, originando un sitio compatible con la adenosina del
extremo 3` de los productos de PCR , el cual es añadido por algunas polimerasas
termoestables. La enzima Pfu Turbo posee actividad editora por lo que previo a la
ligación se realizó el procedimiento estándar de A-tailing, de acuerdo a las indicaciones
del manual.
Los productos de amplificación fueron ligados a pGEM-T Easy y
transformados en la cepa XL1- Blue de E .coli, seleccionando en medio LB/AMP/Xgal / IPTG.
La identificación de clones recombinantes fue realizado mediante el ensayo de Bgalactosidasa, por un screening de colonias azules-blancas, ya que la inserción de un
fragmento en pGEM-T Easy interrumpe el marco de lectura de B- galactosidasa. Por lo
tanto los clones que efectivamente contienen el producto de PCR se observaron como
colonias de color blanco, ya que por la ausencia de B- galactosidasa no degradan el
sustrato X- gal.
Los clones seleccionados en el screening de colonias blancas-azules, fueron
inoculados en medio LB con ampicilina para luego realizar extracción de DNA
plasmidial por el método de ebullición. Para comprobar la ligación de los fragmentos de
PCR “carnadas” al vector pGEM-T Easy, el DNA plasmidial fue digerido con las
enzimas de sitios de restricción únicos, que producen la liberación de los insertos
carnadas según corresponda a cada fragmento. Los clones fueron analizados por
48
electroforesis en geles de agarosa al 1%. En la figura 3B se comprueba el clonamiento
de la carnada 2 en pGEM-T Easy.
pGEM-T Easy linealizado tiene un tamaño de 3019 pb y la carnada 2 de1998 pb.
La carnada 2, amplificando el fragmento 1579- 3577 del ORF de GBF1 fue creada con
los sitios de restricción NcoI/ EcoRI. pGEM-T Easy posee los sitios de restricción NcoI
en la posición 37 y EcoRI en las posiciones 52 y 70. Los fragmentos de PCR son
clonados en pGEM-T Easy entre las posiciones 52 y 64.Ya que los fragmentos de PCR
pueden ser clonados en las dos orientaciones posibles con una probabilidad del 50 %
cada una, fue necesario asegurarse que el sitio EcoRI del extremo 5` de la hebra
codificante fuese realmente el sitio incorporado en el diseño del partidor sentido y no el
sitio del vector. Esta situación fue resuelta determinando la orientación requerida: 5`EcoRI (vector)- 3´/5´-EcoRI hebra no codificante 3´/5´ (SpeI-EcoRI) vector3´, para esto
se digirió con NcoI, ya que solo esta orientación permitía visualizar la liberación del
fragmento con esta enzima. Luego de seleccionar estos clones se procedió con la doble
digestión NcoI /EcoRI. El mismo análisis se hizo para los otros clones.
Aunque la liberación de los fragmentos de GBF1 carnadas clonados en pGEM-T
Easy requirió de estos procedimientos adicionales, siguió siendo éste el método de
elección. Esto debido a alta eficiencia de ligación que se obtiene en el siguiente paso de
clonamiento de los fragmentos en pGBKT7 al compararlo con la tradicional ligación
directa. Sin embargo cabe destacar que el preclonamiento de los productos de PCR en el
sistema pGEM-T Easy no fue contemplado inicialmente como estrategia de
construcción de los híbridos carnadas. Afortunadamente aún así fue posible modificar la
estrategia; clonarlos, seleccionar la orientación del clonamiento y luego realizar las
digestiones requeridas para cada carnada. En la figura 3C se evidencia el clonamiento a
pGEM-T Easy de los productos de PCR a ser utilizados como carnada 3.
49
A
B
C
Figura 3. Clonamiento en pGEM- T easy. (A) Mapa del vector pGEM-T Easy (B)
Clonamiento de carnada 2 a pGEM-T Easy. Liberación del inserto mediante restricción
con EcoRI. Carril 1: Estándar de DNA Lambda / HindIII, Carril 2-5: digestiones clones
de “carnada 2”. (C) Clonamiento de carnada 3 pGEM-T Easy. Digestíon con EcoRI para
verificar la liberación del inserto (2006 pb). Carril 1: estándar de DNA 1 Kb, carril 2- 4:
clones recombinantes conteniendo el fragmento carnada 3, carril 5: clon sin inserto.
Geles de agarosa al 1%, tinción con bromuro de etidio.
50
4.1.3 Clonamiento de los fragmentos “carnadas” en el vector de expresión
pGBKT7
Los fragmentos “carnadas”de GBF1, preclonados en pGEM-T Easy fueron
liberados por digestión enzimática, separados y extraídos desde geles preparativos de
agarosa y luego purificados usando un kit para extracción de bandas. Paralelamente se
prepararon las dobles digestiones del vector pGBKT7 con los sitios complemetarios a
cada carnada.
pGBKT7 es un vector de 7.3 kb, que permite expresar en levaduras, bajo la
regulación del promotor ADH1, proteínas de fusión con el dominio de unión al DNA de
Gal4. pGBKT7 posee el marcador de selección para la transformación en E.coli KANr,
y el marcador nutricional TRP1 para la transformación en Saccharomyces cerevisiae, el
vector también posee el tag c-Myc, localizado entre la región codificante del dominio
GAL4-BD y el sitio de múltiple clonamiento (figura 4 A).
Los productos de ligación fueron transformadas en células químicamente
competentes de la cepa XL1- Blue de E. coli y se seleccionó en medio LB agar/
kanamicina. Las colonias obtenidas fueron crecidas en medio líquido LB /kanamicina y
se extrajo el DNA plasmidial por el método de ebullición. El DNA plasmidial fue
sometido a doble digestión según los pares correspondientes a cada construcción, las
muestras separadas por electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de
etidio. El clonamiento fue comprobado por la liberación del inserto “carnada”.
De este modo se logró clonar en pGBKT7 los ocho fragmentos del cDNA de
GBF1 amplificados por PCR, y preclonados en pGEM-T Easy, para ser transformados y
expresados en la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae. En la figura 4B se
comprueba el clonamiento de la “carnada 2” a pGBKT7, las imágenes del clonamiento
de las demás carnadas se destruyeron
51
A
B
Figura 4. Clonamiento de carnadas al vector pGBKT7. (A) Mapa de restricción y
sitio de múltiple clonamiento del vector de expresión pGBKT7.pGBKT7 es un vector
de expresión en levaduras, que permite expresar proteínas de fusión entre los residuos 1147 del dominio de unión al DNA del factor de transcripción Gal4 (Gal4 DNA-BD) y
una proteína de interés (carnada). (B) Clonamiento de la carnada 2 de GBF1 a pGBKT7.
52
4.1.4 Transformación de construcciones carnadas de GBF1 en la cepa AH109 de
Saccharomyces cerevisiae
Desde las carnadas 1-8 de GBF1 clonadas en pGBKT7 y transformadas en XL1Blue, se preparó DNA plasmidial por medio de un kit de “MINI prep” (Promega), para
luego transformar en la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae. El proceso de
transformación fue realizado a través del método mediado por acetato de litio de
acuerdo al procedimiento indicado en materiales y métodos.
Se prepararon células competentes de la cepa AH109 de Saccharomyces
cerevisiae, las que fueron transformadas con una mezcla de las construcciones GBF1
“carnadas” y carrier de DNA de espermio de salmón. El tratamiento con litio ayuda a
permeabilizar las membranas para facilitar el proceso de transformación.
La cepa reportera AH109 es un haploide de tipo MAT_a y posee las mutaciones
de los genes que serán empleados como reporteros, la mutación en el gen marcador de
selección nutricional para la transformación, mutaciones en el gen GAL4 y GAL80, y
lleva las construcciones reporteras en forma de casettes UASGAL-TATA-gen reportero
(HIS3, ADE2, LacZ y MEL1, ver anexo).
Para la identificación de los clones AH109 transformantes se seleccionó
nutricionalmente en medio SD agar/- Trp, ya que la cepa AH109 es deficiente en la
síntesis de triptófano por la mutación TRP 1-901 y TRP1 es el gen marcador de
selección del vector pGBKT7.
Las placas fueron incubandas a 30 º C hasta la aparición de colonias, lo que se
obtuvo entre los 3-5 días. Pequeñas colonias se observaron desde el tercer día pero sólo
en el 4-5 día se obtuvo el tamaño adecuado para los análisis requeridos.
53
4.1.5 Detección de construcciones híbridas en Saccharomyces cerevisiae
Para comprobar la efectiva incorporación de las construcciones carnadas GAL4
DNA BD/GBF1 en la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae se realizó extracción
de DNA plasmidial por el Método modificado. Este punto es importante ya que en la
etapa siguiente se determinará si las construcciones transformadas son expresadas
correctamente en la cepa AH109, a través de análisis de western blot, por lo que
previamente se debe constatar la presencia de los plásmidos.
Aunque la selección nutricional SD/- Trp selecciona un marcador de pGBKT7, de
igual forma el procedimiento de extracción de DNA plasmidial desde levaduras es
requerido para la caracterización de los clones de interacción que se obtienen durante el
proceso de mating.
La cantidad de pDNA obtenido desde levaduras empleando este procedimiento, o
incluso con los kit de extracción, es muy baja como para ser visualizada directamente
en geles de agarosa. Por esto, y de acuerdo a los protocolos estándar, el pDNA obtenido
se transformó en la cepa XL1 blue de E. coli, seleccionado con el marcador de
transformación del vector de expresión pGBKT7, kanamicina. Las colonias obtenidas
fueron inoculas en medio LB/kanamicina para realizar extracción de DNA plasmidial y
análisis de restricción para la liberación de los fragmentos carnadas.
La incorporación de la construcción carnada 2 clonada en pGBKT7 en la cepa
AH109 es confirmada en la figura 5, donde luego de la extracción de pDNA desde ésta
cepa, se transformó en XL1- Blue, y el pDNA obtenido fue sometido a análisis de
restricción enzimática con EcoRI, verificándose la liberación del fragmento de 1998 pb
correspondiente al fragmento amplificado por PCR de la carnada 2, y el fragmento de
7.3 kb correspondiente a pGBKT7.
54
1
2
3
4
5
6
7
pb
10000
pGBKT7
4000
3000
2000
Carnada2
Figura 5. Extracción de pDNA de levaduras. pDNA extraído de la cepa AH109
transformada con la carnada 2 fue transformado en la cepa bacteriana XL1- blue, éste
DNA plasmidial fue luego sometído a análsis de restricción con NcoI/EcoRI. Carril 1:
Estándar 1Kb. Carril 2-7: clones obtenidos de la carnada 2 digerida con NcoI/ EcoRI.
55
4.1.6 Análisis de expresión de “carnadas” por Western Blot
Por el método urea/SDS se realizó la extracción de proteínas de los clones de
AH109 transformados con las construcciones GBF1 “carnadas”.La correcta expresión
de estas construcciones en Saccharomyces cerevisiae fue evaluada por SDS- PAGE al 8
% y posterior análisis de Western Blot utilizando los anticuerpos primarios anti c- Myc
( tag incorporado en el vector pGBKT7) y anti GBF1.
Se utilizaron los siguientes anticuerpos anti- GBF1: 9D2, que reconoce la región
N- terminal de GBF1; 9D4, que reconoce el dominio Sec7 de GBF1 y H154, que
reconoce el dominio C-terminal de GBF1. Las membranas y films de los Western blot
fueron destruidos por lo que no se tienen las correspondientes imágenes.
De las ocho construcciones GAL4 BD-GBF1 transformadas en la cepa AH109
solo se expresaron las siguientes: carnada 1, carnada 2, carnada 3, carnada 4, carnada 6
y carnada 7. Las carnadas 5 y 8 no fueron expresadas. El dominio Gal4 DNA- BD
representa la región aminoácidica 1-147 del extremo N-terminal de Gal4, con un
tamaño de aproximadamente de 16. 29 KDa. Entre el dominio Gal4- BD y el sitio de
múltiple clonamiento hay una pequeña secuencia del promotor T7 y el tag anti c- myc.
La fusión Gal4 BD /carnada1 tiene un peso molecular de aproximadamente 82.7
KDa, y contiene la región aminoacídica 1-572 de GBF1. La proteína de fusión GAL4
BD/carnada2 tiene un tamaño de aproximadamente 93.3 KDa, y representa la región
aminoacídica 527-1192 de GBF1. La fusión Gal4 BD/ carnada 3 tiene una tamaño de
93.3 KDa, aproximadamente, y representa la región aminoacídica 1193-1859 de GBF1.
La fusión Gal4 BD/ Carnada 4 tiene una peso molecular aproximado de 50.8 KDa,
conteniendo la secuencia aminoacídica 1- 284 de GBF1. La proteína de fusión Gal4 BD
/carnada 6 tiene un peso molecular de aproximadamente 57.1 KDa, esta construcción
56
contiene el fragmento aminoacídico 1193- 1533 de GBF1. La construcción híbrida Gal4
BD/ carnada7 tiene un peso molecular aproximado de 61 KDa, y contiene la región
aminoacídica 1482-1877 de GBF1. La construcción híbrida Gal4 BD /carnada 5, que
contiene la secuencia aminoacídica 274- 572 de GBF1, y la fusión Gal4 BD/carnada 8,
conteniendo la región aminoacídica 274- 1017 de GBF1, no fueron detectadas por
western blot.
4.1.7 Construcciones “presa”
La búsqueda de putativos clones de interacción para GBF1 fue realizada por el
screening de una biblioteca comercial de cerebro fetal humano (Clontech)
pretransformada en la cepa Y187 de saccharomyces cerevisiae (Matα). La biblioteca
fue construida utilizando el método modificado de Gubler & Hoffman. En esta
biblioteca los clones aislados del cDNA fueron utilizados para la construcción de
fusiones con el dominio de activación de la transcripción de Gal4 (Gal4 AD), en el
vector de expresión en levaduras pACT2 (figura 6 B). Luego es amplificada en E.coli,
purificada y luego transformada en la cepa Y187 de Saccharomyces cerevisiae. Cada
uno de los clones permite expresar, bajo la regulación del promotor de levaduras PADH1, fusiones con el dominio de activación de la transcripción de Gal4. El vector
pACT2 (figura 6 A) posee el marcador de selección con antibióticos Amp/R para
transformación en E. coli y el marcador de selección nutricional LEU2, para
transformación en la cepa Y187 de Saccharomyces cerevisiae. La cepa Y187 lleva la
mutación leu 2-3,112 por lo que la ruta de biosíntesis de leucina se encuentra bloqueada.
Debido a que el dominio GAL4 AD no posee secuencia de señalización nuclear, y que
en la forma nativa de Gal4 está contenida en la región N- terminal dentro del dominio
Gal4 DNA-BD, en el vector pACT2 se ha incorporado la secuencia señal de SV40- T.
57
A
B
Figura 6. Construcciones presas. (A) Mapa del vector de expresión pACT2 para
clonamiento de las construcciones “presa” de la bibliotecade cDNA de cerebro fetal
humano en el sistema de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae. (B) Esquema
utilizado para la construcción de la biblioteca.
58
4.1.8 Apareamiento de levaduras
Para la búsqueda de interacciones proteína- proteína en las cuales participe GBF1,
por el sistema de doble híbrido se realizaron “matings” o apareamientos de levaduras
entre la cepa AH109 (MATa), transformada con las construcciones carnadas y la cepa
Y187 (MATα), transformada con las construcciones “presas”. Las construcciones presas
corresponden a los clones de la biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano (Clontech)
pretransformada en la cepa Y187.
Para cada construcción de GBF1 “carnada” se utilizó una alícuota de la biblioteca,
el apareamiento entre las cepas AH109 e Y187 ocurrió porque estas son de identidad
sexual opuesta y liberan al medio las feromonas factor a /factor α respectivamente, lo
que inicia la vía de señalización par el apareamiento. Las células diploides son entonces
portadoras de las construcciones de GBF1 carnada clonadas en el plásmido pGBKT7, y
de las construcciones presas de cada clon independiente clonado en el vector pACT2.
Completado el período de apareamiento los diploides fueron seleccionados
nutricionalmente en medio
cuádruple dropout SD agar/- Ade/ -His/-Leu/-Trp. La
depleción de triptófano y leucina seleccionó los marcadores de transformación TRP1 y
LEU2 de los vectores carnada y presa respectivamente. La depleción de adenina e
histidina permitió evaluar la expresión de los genes reporteros ADE2 e HIS3, ya que la
presunta interacción entre GBF1 y cada clon “presa” positivo permitió reconstituir la
actividad transcripcional reguladora de GAL4. Los diploides obtenidos fueron
replicados para ensayar la actividad de los genes reporteros LacZ y Mel1, y
almacenados como glicerol stock para luego completar la caracterización de los clones.
59
4.1.9 Ensayo de beta galactosidasa en filtro para evaluación del gen repotero LacZ
Los clones obtenidos en el screening de la biblioteca de cerebro fetal humano por
el procedimiento de apareamiento de levaduras, fueron almacenados para ser
posteriormente evaluados a través de la expresión del gen reportero LacZ, empleando el
ensayo de Beta- galactosidasa en filtro según el procedimiento estándar.
Para la validación del ensayo se utilizaron las cepas diploides controles, donde el
100% de los clones obtenidos fueron positivos, identificados por manchas de color azul
en el papel filtro. Éstas correspondían a las réplicas de las colonias seleccionadas
inicialmente por la expresión de los genes reporteros ADE2 e HIS3. Los ensayos para
los clones diploides obtenidos con las carnadas de GBF1 no pudieron ser completados.
4.1.10 Controles de interacción
Para realizar un control positivo de interacción en el sistema de doble híbrido, se
utilizaron los vectores pGBKT7- 53 y pGADT7-T. El vector pGBKT7- 53 permite
expresar la fusión entre el dominio de unión al DNA de GAL4 y la proteína p53. El
vector pGAD7-T permite expresar la fusión entre el dominio de activación de la
transcripción de Gal4 y el gran antígeno T de SV40. pGBKT7- 53 fue transformado en
la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae, y pGADT7-T fue trasformado en la cepa
Y187.
La interacción entre la proteína p53 y el gran antígeno T de SV40 fue ensayada
por el sistema de doble híbrido a través del apareamiento entre estas cepas y posterior
60
selección nutricional en medio SD- /-Trp /-Ade/-Leu/- His y por el ensayo de Beta
galactosidasa en filtro.
Efectivamente, luego de tres días de incubación en medio QDO, y debido a la
interacción entre p53 y el antígeno T de SV40, se observaron las colonias diploides con
una alta tasa de eficiencia de apareamiento y el 100% de las colonias ensayadas fueron
positivas en el ensayo de beta galactosidasa.
Para el control negativo de interacción se utilizaron los vectores pGBKT7- Lam
y pGADT7- T. El vector pGBKT7- Lam permite expresar la fusión entre el dominio de
unión al DNA de Gal4 y la proteína Laminina C humana. El vector pGADT7- T fue
transformado en la cepa AH109 y pGBKT7-Lam fue transformado en la cepa Y187,
luego del aparemiento y selección nutricional no se observó crecimiento de colonias.
El screening de la biblioteca de cerebro fetal humano permitío obtener clones
diploides con las carnadas 1, 4 y 7, seleccionados por los genes reporteros ADE2 e
HIS3 en el medio cuádruple dropout, cada carnada fue evaluada 3 veces (figura 7).
Con la carnada 1 en el primer screening se obtuvieron 10 clones, 15 clones en el
segundo y 12 clones en el tercero, con un total de 37 clones.
Con la carnada 4 se obtuvieron 8 clones en el primer screening, 10 en el segundo
y 12 en el tercero, con un total de 30 clones.
Con la carnada 7 se obtuvieron 6 clones en el primer screening, 12 clones en el
segundo, y 10 en el tercero, con un total de 28 clones.
Todos los clones obtenidos fueron almacenados a -70 º C y se inició la
caracterización de ellos.
61
Ensayo de Beta-galactosidasa
en filtro
Figura 7. Selección de clones de interacción para GBF1. Las construcciones carnadas
GAL4 BD- GBF1, transformadas en la cepa AH109 y las construcciones presas de la
biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano fueron evaluadas por apareamiento de
levaduras. Los diploides fueron seleccionados en medio SD QDO para evaluar la
expresión de los genes reporteros ADE2 e HIS3. Putativos clones de interacción para
GBF1 fueron obtenidos con las carnadas 1, 4 y 7.
62
4.1.11 Análisis estructural de las carnadas positivas en la búsqueda de clones de
interacción para GBF1 en el sistema de doble híbrido
A través del screening de la biblioteca de cerebro fetal humano se logró aislar
clones de interacción presa
con la carnada 1, carnada 4 y carnada 7 de las
construcciones GAL4 BD- GBF1 (figura 8 A), seleccionadas nutricionalmente y por el
ensayo de beta galactosidasa en filtro (figura 8 B)
La carnada 1 fue construida por el clonamiento en pGBKT7 del fragmento 11716 del cDNA de GFB1 amplificado por PCR. Esta construcción permitió expresar en
la cepa AH109, la fusión entre GAL4 BD y la región aminoacídica 1-572 del extremo
N-terminal de GBF1.
La carnada 4 fue creada por el clonamiento del fragmento 1-853 del cDNA de
GBF1 en pGBKT7 para expresar la fusión entre el dominio GAL4 BD y la región
aminoacídica 1-284 del extremo N-terminal de GBF1.
La carnada 7 fue construida por el clonamiento del fragmento 4446- 5577 del
cDNA de GBF1 en pGBKT7. Al transformar en la cepa AH109 se expresa la fusión
entre el dominio GAL4 BD y la región aminoacídica 1488- 1859 del extremo Cterminal de GBF1.
Por lo tanto, el screening de la biblioteca de cerebro fetal humano podría indicar
una interacción de tipo proteína- proteína con la región N-terminal de GBF1 (carnada 1
y 4). Los resultados con la carnada 7 indicarían interacción dependiente del dominio Cterminal de GBF1. Debido a que el estudio de caracterización de los clones de
interacción no fue completado no es posible hacer mayor inferencia sobre la naturaleza
de éstos.
63
A
B
Figura 8. Características de las carnadas positivas en la selección de clones de
interacción para GBF1 mediante el screening de la biblioteca de cDNA de cerebro
fetal humano. (A). Representación estructural de las construcciones carnadas GAL4
BD-GBF1 1, 4 y 7 con las que se aislaron clones de interacción positiva. (B)
Características fenotípicas de de las cepas transformadas con las construcciones
carnadas, clones de la biblioteca y controles por selección en los distintos medios SD.
64
4.2 Estabilización de complejos proteicos expresados en células de mamífero por
entrecruzamiento con DTBP.
La búsqueda de interacciones proteína- proteína para GBF1 fue también realizada
por precipitación por afinidad con expresión en células de mamífero de formas
marcadas con GST. Para estabilizar las interacciones se utilizó el agente entrecruzador
homobifuncional DTBP, el cual posee dos grupo imidoester- amino reactivo que
interaccionan con grupos amino primarios para formar enlaces amidina (figura 9 A).
DTBP es permeable a la membrana plasmática y la reacción es reversible al ser
tratado con un agente reductor como DTT. Para estos experimentos se utilizó la línea
celular 293 EBNA que expresa GBF1 endógenamente. En la estandarización inicial se
evaluaron dos procedimientos en los que DTBP fue empleado de forma previa o
posterior al lisado celular, con detección de complejos proteicos de GBF1 endógeno.
4.2.1 Procedimiento A
Células 293 EBNA fueron tratadas con DTBP (1mg/ml) previo al lisado celular,
de acuerdo al protocolo establecido, separando las fracciones de proteínas solubles y de
membrana. Durante los primeros experimentos, y para facilitar el manejo de las
fracciones se trabajó con muestras de proteínas totales. Las muestras fueron cargadas en
SDS- PAGE al 8 %y analizadas por Western Blot Los resultados obtenidos permitieron
identificar a GBF1 formando parte de complejos de alto peso molecular, estabilizados
por el agente de entrecruzamiento DTBP (Figura 9 B). Se observó solo un tipo de
banda, en el extremo superior de gel concentrador, de aspecto muy definido. Los
complejos fueron disociados al tratar las muestras con el agente reductor DTT (figura 9
C), identificando la banda de GBF1 (206 KDa aprox.)
65
A
B
DTT
Figura 9.
Estabilización de complejos proteicos con DTBP. (A) Estructura de
DTBP. (B) Estabilización de complejos con DTBP (1mg/ml) por el procedimiento A.
Carril 1: Estándar de proteínas Precision Plus Protein Dual Color (BioRad), Carril 2:
Control, extractos totales de 293 EBNA sin tratar. Carril 3- 6: extractos totales en
células 293 EBNA tratadas con DTBP. (C) Disociación de complejos por tratamiento
con DTT, carriles en el mismo orden que en figura B.
66
4.2.2 Control de entrecruzamiento: interacción GBF1-p115
Es conocida la interacción de GBF1 con el factor de transporte de membranas
p115 (Garcia-Mata et al., 2003), por esta razón se utilizó esta interacción como control
de los experimentos de entrecruzamiento con DTBP. Las membranas utilizadas para la
detección de complejos con GBF1 fueron tratadas para la remoción de los anticuerpos
por stripping y luego utilizadas para la detección de complejos de p115.
p115 es una proteína de 115 KDa y en las reacciones de entrecruzamiento de los
extractos de células 293 EBNA se le identificó formando complejos de alto peso
molecular (figura 10 A-1). Los complejos fueron disociados al tratar con DTT (figura
10 A-2). Las bandas obtenidas en estos complejos se superponen con las obtenidos en
los complejos de GBF1, indicando que el factor de transporte p115 y GBF1 forman
parte de un mismo complejo proteico. Es sabido que GBF1 y P115 interaccionan
directamente, y de este modo se valida el procedimiento y las condiciones que se
utilizaron para lograr estabilizar las interacciones proteína- proteína.
4.2.3 Procedimiento B
Las células 293 EBNA incubadas en DMEM-10% suero fueron lisadas
mecánicamente y luego tratadas con DTBP (1mg/ml) de acuerdo al protocolo
establecido. Al igual que en el procedimiento A al principio se trabajó con las
fracciones de proteínas totales. Las muestras fueron cargadas en SDS- PAGE al 8% y
analizadas por Western blot. Los resultados obtenidos también permiten observar la
formación de complejos de alto peso molecular (figura 10 B-1), pero a diferencia del
procediemiento A, la interacción con p115 no fue comprobada (imágenes no
mostradas), por lo que se optó por el primer procedimiento para los posteriores
experimentos.
67
A
A-1
A-2
+DTT
1
2
3
4
5
1
6
2
3
4
5
Complejos
p115
Complejos
p115
250
150
100
75
50
B
p115
B-1
6
250
150
100
75
50
p115
B-2
+DTT
Figura 10. Control de interacción GBF1- p115 y entrecruzamiento por
procedimiento B. (A) Formación de complejos de p115, estabilización
de
interacciones con DTBP 1mg/ml. (A-1) Carril 1: Estándar de proteínas, carril 2: control,
carril 3-6: extractos proteicos totales tratados con DTBP. (A-2) Reducción con DTT.
Carril 1: estándar de proteínas, carril 2: control, carril 3-6: muestras de entrecruzamiento
tratadas con DTT. (B) Estabilización de complejos con DTBP por procedimiento B. (B1) Carril 1: Estándar de proteínas. Carril 2: Control, extractos totales de 293 EBNA sin
tratar. Carril 3- 6: extractos totales de células 293 EBNA tratadas con DTBP.(B-2)
Muestras tratadas con DTT, carriles en el mismo orden que en B-1.
68
4.2.4
Aproximación
a
una
posible
interacción
GBF1-Snapin
mediante
estabilización de complejos proteicos
En un estudio previamente realizado en el laboratorio, para la búsqueda de
interacciones proteína- proteína de GBF1 con el sistema doble híbrido, durante el
screening de una genoteca de testículo humano, se logró aislar como clones de
interacción a Snapin y Hrs. Snapin interacciona con el complejo SNARE y fue
originalmente identificada como una proteína de unión a SNAP- 25 (Illardy et al.,
1999). Snapin es una proteína de 15 KDa, se expresa en muchos tejidos y se localiza
como una fracción unida a membranas y como una fracción soluble. Muchas de las
publicaciones en torno a Snapin hacen referencia al rol que tendría en neurosecreción,
la actividad de Snapin ayuda en la unión de Sinaptotagmina a los complejos SNAREs.
SNAP- 25 interacciona a su vez con alfa SNAP, por esta razón se realizaron los
experimentos de entrecruzamiento con DTBP para estudiar una posible participación de
GBF1 en este complejo por interacción con Snapin, lo cual sería un indentificación de
tipo indirecta. Esto debido a que alfa –SNAP interacciona con SNAP- 25, SNAP- 25
interacciona con Snapin, y si GBF1 interaccionara con Snapin podría ser parte de este
complejo, al ser detectado con el anticuerpo anti-alfa SNAP (figura 11). Células 293
EBNA fueron tratadas mediante el procedimiento A de entrecruzamiento con DTBP, las
muestras fueron cargadas en SDS- PAGE y analizadas por western blot.
Las muestras con DTBP revelaron la presencia de complejos de alfa- SNAP en
una banda de tamaño de aproximadamente 150 KDa, que evidentemente no se
corresponde con los tipos de complejos observados con GBF1. Pero esta forma de
detectar una interacción de GBF1 con Snapin está bajo un contexto de interacción ideal,
óptimo para el sistema propuesto, con una condición espacial y temporal dada, y aunque
este resultado es negativo no es una prueba de que esta interacción no exista.
69
Figura 11. Esquema de interacciones proteicas necesarias para la detección de la
posible interacción GBF1- Snapin.Un estudio previo permitió aislar a Snapin como
putativo par de interacción para GBF1. Snapin interacciona con el complejo SNARE y
fue originalmente identificada como una proteína de unión a SNAP- 25. Alfa –SNAP
interacciona con SNAP- 25, SNAP- 25 interacciona con Snapin, y si GBF1
interaccionara con Snapin, en la estabilización de complejos proteicos con DTBP y al
utilizar el anticuerpo anti alfa- SNAP, podría ser detectado como parte de este complejo.
70
4.3 Detección de interacciones proteicas en GBF1 mediante purificación por
afinidad de fusiones con GST
4.3.1 Construcciones GST- GBF1
La búsqueda de interacciones proteína- proteína mediante purificación por
afinidad con GST fue realizada por expresión de construcciones GST- GBF1 en células
de mamífero 293 EBNA. Para estos fines se utilizaron las construcciones GST con
fusiones a la forma total de GBF1, con la región N-terminal, con el dominio Sec7 y con
la región C-terminal, las que habían sido construidas en el laboratorio con anterioridad
(figura 12 A, B).
GST- GBF1 total, correspondiente a los nucleótidos 1-5577 del ORF de GBF1,
expresando el fragmento aminoácido 1-1859. La construcción GST/N-terminal de
GBF1 contiene los nucléotidos 1- 2073 del ORF de GBF1, para expresar el fragmento
aminoacídico 1- 691. La construcción GST- Sec7 contiene el fragmento nucleotídico
2074- 2646 del ORF de GBF1, lo que permite expresar la región aminoacídica 692882. La construcción GST/C-terminal de GBF1 contiene el fragmento 2647- 5577 del
ORF de GBF1, para expresar la región aminoacídica 882- 1859.
Originalmente estos fragmentos de GBF1 fueron clonados en el vector de
expresión en mamíferos pEBG, el cual, bajo la regulación del promotor EF- 1 Alfa
permite expresar fusiones con la región N-terminal de GST. La región N-terminal de
GST tiene un tamaño aproximadamente de 26 KDa. Por lo tanto la la proteína de fusión
GST- GBF1 (total) tendrá un tamaño aproximado de 232 KDa, la fusión GST /Nterminal un tamaño de 102 KDa, la fusión GST- Sec7 un tamaño de 50 KDa y la fusión
GST/C-terminal un tamaño también aproximado de 120 KDa.
71
A
GST
GBF1- total
GST
N- terminal
GST
GST
Sec-7
C-terminal
B
1
2
3
4
5
6
pb
8000
6000
5000
4000
Figura 12. Construcciones GST-GBF1. (A) Esquema de las construcciones GSThGBF1 utilizadas para los ensayos de purificación por afinidad con fusiones GST. (B)
Construcciones GST- hGBF1. (Muestras sin digerir).Carril 1: estándar de DNA 1Kb,
carril 2: GST- hGBF1 total, carril 3; GST/N-terminal de GBF1, carril 4: GST-sec 7 de
GBF1 (clon 2D), carril 5: GST- sec7 de GBF1 (clon 2E), carril 6: GST/ C-terminal de
GBF1. Gel de agarosa al 1 %, tinción con bromuro de etidio.
72
4.3.2 Transfección y análisis de expresión de construcciones GST- GBF1
Células 293 EBNA fueron cultivadas en DMEM- 10% suero e incubadas a 37 º C,
5% CO2, hasta obtener una confluencia de 70- 80%. Las células fueron transfectadas con
las construcciones GST-GBF1 empleando el sistema de transfección Pefectin. Después
de 24 horas se realizó la extracción de proteínas y análisis de expresión por Western
Blot, utilizando los anticuerpos primarios 9D2 que detecta la región N-terminal de
GBF1, 9D4 que detecta la región Sec7 de GBF1 y H154 que reconoce la región Cterminal de GBF1. Todas las construcciones se expresaron de acuerdo a los tamaños
esperados (figura 13), por lo que quedaron en condiciones de ser utilizadas para los
experimentos de purificación de complejos por afinidad.
4.3.3 Ensayos de purificación de complejos proteicos por afinidad con GST
Los extractos proteicos de 293 EBNA con las fusiones GST- hGBF1 fueron
incubados con glutatión-sefarosa 4B al 50 %, previamente bloqueada y equilibrada.
Después de separar la fracción no unida, la resina fue lavada varias veces y entonces
incubada con glutatión reducido para liberar los posibles complejos con la fusión GSThGBF1. Las muestras fueron cargadas en geles de SDS- PAGE al 8 %. Los geles fueron
fijados y luego teñidos usando un kit comercial para tinción de proteínas con sales de
plata (Winkler). Con los patrones de tinción obtenidos no se logró identificar alguna
banda de interés
que indicase una posible interacción de GBF1 (datos no
mostrados).Ya que las construcciones GST- hGBF1 fueron expresadas correctamente en
la línea celular 293 EBNA, próximamente éstas hubiesen sido utilizadas para los
experimentos de entrecruzamiento con DTBP y purificación por afinidad con GST.
.
73
1
2
3
4
5
6
KDa
250
GST- GBF1
GBF1 wild type
150
GST/C-terminal
100
GST/N-terminal
75
50
GST- Sec7
Figura 13. Expresión de construcciones GST- hGBF1 en células 293 EBNA
(esquema). Carril 1: Estándar de proteínas Presicion Plus Protein Dual Color (BioRad),
carril 2: GBF1 wild type, carril 2: GST- GBF1, Carril 3: GST/N-terminal, carril 4: GSTSec7, carril 5: GST/C- terminal
74
5. DISCUSIÓN
5.1 El modelo propuesto
Las principales líneas de investigación en torno a GBF1 han sido enfocadas en
determinar como este Arf GEF otorga especificidad al tráfico vesicular. Esto a través
de estudios de localización, preferencia por substrato, dinámicas de asociación a
membranas, análisis de sobreexpresión y efectos producidos por el tratamiento con
Brefeldina A (Zhao et al., 2006; Szul et al., 2005; Niu et al., 2005; García-Mata et al.,
2003; Kawamoto et al., 2002; Claude et al., 1999). También han sido analizadas las
variantes de splicing, niveles de expresión en tejidos, efectos por generación de
mutantes y supresión mediante siRNA (Mansour et al., 1998, Claude et al., 2003;
Manolea et al., 2008). La propiedades Arf GEF de GBF1 permiten que active los
factores de ADP- ribosilación de tipo I y II mediante el intercambio de GDP por GTP, y
su localización en las membranas de la cara cis del complejo de Golgi regula el tráfico
retrógrado hacia el retículo endoplásmatico.
La hipótesis de este trabajo fue que GBF1 debería tener más funciones que solo la
activación de Arf para el intercambio GDP/GTP, esto considerando que GBF1 es una
proteína de alto peso molecular (206 KDa), y la actividad ARF- GEF está localizada en
el dominio Sec7, que solo representa aproximadamente el 10 % de la proteína. Sobre
funciones y actividades específicas para el otro 90 % de GBF1 no se tenía mayor
información. Además, la mayoría de las proteínas de alto peso molecular se encuentran
formando parte de grandes complejos que actúan como maquinarias moleculares. Los
análisis estructurales en base a la secuencia de GBF1, al igual que los miembros de la
familia de ARF-GEF de mamíferos GBF/BIG, revelan una organización en sentido N-C
75
terminal compuesta por un dominio DCB, un dominio HUS1, el dominio catalítico Sec7
y tres dominios HDS. Además un rasgo característico es la región rica en prolina
localizada en el extremo C-terminal.
Por lo tanto, en consecuencia al alto peso molecular de GBF1, con la mayor parte
de sus dominios de propiedades desconocidas, es probable que la actividad de GBF1 sea
modulada por la interacción con los demás componentes de la maquinaría de transporte
de membranas o proteínas accesorias. Luego el mismo GBF1 actuaría como un
andamiaje molecular, en el que las interacciones proteína- proteína son determinantes de
los eventos reguladores que otorgan la especificidad en este proceso. GBF1 y
BIG1/BIG2 son Arf GEF de mamíferos de alto peso molecular del complejo de Golgi,
que comparten un dominio catalítico Sec7, pero se localizan de forma diferencial en las
caras cis y trans respectivamente (Manolea et al., 2008). GBF1 regula el reclutamiento
de los mantos COPI y el ensamblaje y organización del complejo de Golgi. BIGs
regulan el reclutamiento de los adaptadores de clatrina y ayudan a mantener la
estructura del TGN. La preferencia por sus sustratos y etapas de regulación del tráfico
vesicular son también específicas en cada uno. Estas propiedades distintivas de cada Arf
GEF están ciertamente determinadas en primera instancia por las secuencias proteicas y
modificaciones respectivas a cada GEF, pero el detalle de cuales regiones o dominios
estaban involucrados permanecían sin definir, siendo la propia asociación con
membranas otro proceso no bien detallado. Los Arf GEF de bajo peso molecular se
asocian a membrana por medio de la interacción con fosfoinosítidos, la que es
localizada en los dominios de homología a pleckstrina (PH) de estos GEFs (Cullen and
Chardin, 2000). Para los Arf GEF de alto peso molecular GBF1 y BIGs no existían
referencias de homología con este tipo de dominio, que mediaran la asociación con
76
membranas por interacción con lípidos, por interacción con proteínas asociadas a
membranas, o receptores de membrana específicos.
De GBF1 se sabe que cicla de forma altamente dinámica entre el estado soluble y
asociado a membrana (Niu et al., 2005), pero los mecanismos de regulación aun no son
totalmente dilucidados. La interacciones de GBF1 con Arf1 y Arf5 hacen referencia a la
actividad catalítica intrínseca del dominio sec7, pero la interacción con la proteína
factor de transporte de membranas p115, fue la primera interacción descrita para el
resto de la estructura proteica (Garcia- Mata and Sztul 2003). En los reportes de GarcíaMata y colaboradores, a través de estudios de mutagénesis, se concluye que la
interacción GBF1-p115 no es requerida para la localización de cada uno de ellos hacia
las membranas. Pero la disrupción de esta interacción mediante la sobreexpresión de la
región rica en prolina de GBF1, condujo al desamblaje del complejo de Golgi. Con
estos resultados propusieron que la interacción podría regular la activación de Arf
dependiente del intercambio GDP/GTP catalizado por GBF1. Recientemente algunas
publicaciones hacen referencia a esta interacción y se le han asignado posibles roles en
el reclutamiento a membranas de GBF1. Es así como también la interacción GBF1p115 ha sido contextualizada dentro de un nuevo modelo en la regulación del tráfico
vesicular en donde a través de un proceso en dos etapas ocurre la activación secuencial
de Sar1 para la formación de vesículas de tipo COPII, y Arfs para la formación de
vesículas de tipo COPI. En este modelo la activación de Sar1 permite reclutar los
mantos de tipo COPII, los SNARE correspondientes, Rab1 y p115. Luego GBF1 sería
reclutado a membranas a través de la interacción con p115 para organizar el
reclutamiento de los mantos en el ERGIC. La localización en membranas de GBF1 es
estabilizada por el tratamiento con BFA (Niu et al., 2005), lo que se debe a la formación
del complejo abortivo Arf- GDP / BFA /Sec7d (Peyroche et al., 1999). El mecanismo
77
general de la explicación para la activación de Arfs, mediada por los Arf GEF, se basa
en el cambio conformacional producto del intercambio GDP/ GTP. Esto conlleva a la
exposición de la región N- terminal miristoilada de los Arfs, lo que a su vez permite que
los Arfs se asocien a membrana por medio de interacción con los lípidos de la bicapa.
Pero en este complejo abortivo, estabilizado por BFA y fuertemente asociado a las
membranas del complejo de Golgi, Arf1 está en la forma unida a GDP. También se
propone que Arf1 y GBF1 son asociados individualmente a membranas, se sabe que
Arf1 interacciona con la proteína transmembrana p23, además en levaduras se ha
demostrado que Arf1 interacciona también con SNAREs, siendo este un posible
mecanismo para el reclutamiento
a
membranas (Rein et al., 2002). Niu y
colaboradores proponen que GBF1 podría ser reclutado en membranas mediante la
interacción con hGmh1 (Niu et al., 2005). hGmh1 es una proteína de membrana que fue
identificada como compañero de interacción para los Arf Gef Gea1 y Gea2 (Chantalat et
al., 2003), y se localiza en compartimentos tempranos del complejo de Golgi en
levaduras y células humanas.
Una nueva interacción entre GBF1 y Rab1b (Monetta et al., 2007) ha sido
descrita, sugiriendo regular el reclutamiento de GBF1 y a través de éste la activación de
Arf1, lo cual es seguido por la asociación de los mantos proteicos COPI. Los resultados
obtenidos demostraron que el patrón de localización de GBF1 es afectado por la
depleción de Rab1b, donde GBF1 es redistribuido desde las membranas del Golgi al
citosol. Esto es también respaldado por la expresión de una mutante negativa de Rab1b
que conduce al mismo patrón de disociación en GBF1. En esta publicación se describe
que Rab1b regula el reclutamiento de GBF1 en los sitios ERES para mediar el
intercambio de las cubiertas proteicas COPII/ COPI y en el complejo de Golgi para la
78
formación de las vesículas COPI. Además, Rab1b también interacciona con p115 (Allan
et al., 2000)
Bajo este contexto la búsqueda de interacciones proteína- proteína se convirtió en
un medio para llegar a conocer y entender las propiedades reguladoras de este ArfGEF, del proceso de formación de vesículas de tipo COPI y de la vía secretoria en
general. Las interacciones están enfocadas en varios de los procesos que determinan
especificidad en la actividad de GBF1. Dentro de éstas se encuentran interacciones que
regulen el reclutamiento a membranas, interacciones que controlen y permitan concretar
la activación de Arf, o interacciones que permiten establecer una plataforma para los
posteriores eventos en la formación de las cubiertas proteicas COPI.
5.2 Sobre las técnicas empleadas
El amplio espectro de sistemas para el estudio de las interacciones proteínaproteína que existen en la actualidad tienen sensibilidades y especificidades variables,
ventajas y limitaciones (Berggard, 2007). La elección de un sistema en particular está
sujeta a las consideraciones y posibilidades de cada investigador en base a las
propiedades del modelo en estudio. Las propias características de una interacción en
particular pueden favorecer la detección por un método u otro, dependiendo por ejemplo
de si forman complejos proteicos estables o temporales, si es una interacción débil o
fuerte, del tipo de estructura, naturaleza de la interacción y dependencia de factores
como pH, fuerza iónica, temperatura, modificaciones enzimáticas, etc. (Archakov,
2003). En los complejos proteicos temporales las características de las interfaces son
propias de cada par de interacción, y el hallazgo de estás es mas difícil que en los
79
complejos proteicos estables, especialmente en el caso de interacciones de carácter
débil.
Algunas de las técnicas tradicionales en la búsqueda de interacciones proteínaproteína corresponden a : (1) métodos físicos,
como cromatografía por afinidad,
afinidad por blotting, inmunoprecipitación, coinmunoprecipitación y entrecruzamiento;
(2) métodos basados en interacciones genéticas dentro de los que se encuentran las
sondas de proteínas, bibliotecas de fagos, el sistema de doble híbrido y otros sistemas
derivados de éste; (3) métodos genéticos tales como supresión extragénica, mutaciones
con efectos sintéticos letales, sobreproducción de proteínas silvestres y sobreproducción
de proteínas mutantes (Phizicky and Fields, 1995). Otros técnicas con nuevas
aplicaciones al estudio de interacciones proteicas incluyen espectrometría de masas
(Brymora, 2004; Vasilescu, 2006), complementación bimolecular fluorescente BiFC
(Kerppola, 2008), FRET (fluorescente resonante energy transfer (Hallworth, 2006)),
SPR (surface plasmon resonante (Torreri, 2005)), DPI (Dual polarisation interferometry
(Swann et al., 2004)), inmunoprecipitación cuantitativa combinada con knock down
(QUICK), y técnicas con dispersión de luz estática y dinámica (Geerlof, 2006). Algunas
de estas últimas técnicas requieren de implementación y equipos de uso no masificado,
por lo que se requiere de una mayor inversión de recursos.
Los avances de la proteómica han desarrollado un nuevo campo en el área de la
bioinformática para el estudio de las interacciones proteína-proteína. Diversos
programas analizan diversas propiedades de los complejos proteicos y permiten predecir
o validar una interacción. Dentro de las herramientas para la predicción de interacciones
proteicas se encuentran los análisis en base perfiles filogenéticos, predicción de
interacciones por similitud de árboles genéticos, mapeo en base a vías metabólicas,
creación de bases de datos y asociación por similitud de secuencias, formación de
80
patrones estructurales y modelamiento por redes Bayesianas (Droit, 2005; Archakov,
2003). Otra rama para los análisis de interacciones proteicas en base a programas
conforma los denominados métodos de “docking”, donde se encuentran los programas
de modelamiento en base a los refinamientos conformacionales de los ensamblajes
proteicos por algoritmos, desarrollo de gráficas moleculares para estudiar las estructuras
e interacciones, programas para estudiar las superficies de interacción mediante
complementación geométrica y química, análisis de la energía potencial electrostática,
entre otros. Algunos de estos programas para este tipo de análisis son 3D- Dock Suite,
3D- Garden, Bielefeld Protein Docking, BiGGER, ClusPro, DOT, ESCHER NG,
FireDock, HADDOCK, HEX, RosettaDock Server, etc.
La búsqueda de interacciones proteína- proteína de GBF1 en este trabajo fueron
realizadas por medio de las técnicas tradicionales de doble híbrido en Saccharomyces
cerevisiae, estabilización de complejos proteicos con el agente de entrecruzamiento
DTBP y purificación por afinidad mediante precipitación por afinidad con GST y
expresión en células de mamífero. Desde un punto de vista comparativo el sistema de
doble híbrido representa uno de los métodos más utilizados para estos fines por la
simpleza, rapidez, sensibilidad para la detección de interacciones mediadas por
proteínas de baja abundancia o de tipo transiente y disponibilidad para continuar los
estudios de los clones de interacción seleccionados. También es importante y una
ventaja frente a los métodos bioquímicos tradicionales el hecho de detectar las
interacciones directamente en las células diploides de levadura, eliminando también la
necesidad de posteriores pasos de purificación. La principal desventaja descrita para
esta técnica es la presencia de falsos positivos, ya que algunas proteínas sin estar
involucradas en la trasncripción al ser fusionadas a un dominio de unión a DNA pueden
activar factores de transcripción. Proteínas carnadas con dominios acídicos han sido
81
identificadas como autoactivadoras de genes reporteros, y se cree que justamente esos
residuos acídicos estarían involucrados con regiones activadoras de los factores de
transcripción. Previo al screeening de las bibliotecas las construcciones carnadas son
analizadas mediante las pruebas de autoactivación de los genes reporteros, donde éstas
son transformadas en la cepa AH109 y seleccionadas en medio cuádruple dropout SD /Ade/-His/- Leu/- Trp. Con esto se permite evaluar que las proteínas carnadas no
contengan una secuencia de activación que conduzca a expresar los genes reporteros y
ocasionar falsos positivos.
Se ha descrito que durante el screening de una biblioteca alrededor del 70% de las
construcciones híbridas carnadas permiten identificar verdaderos pares de interacción,
pero también típicamente se identifica por lo menos un clon de interacción falso
positivo. Es por esta razón que los clones seleccionados deben ser sometidos a varias
pruebas y luego confirmar la interacción por otras técnicas. El sistema comercial de
Clontech
aquí
utilizado,
Matchmaker
Two-Hybrid
System3
posee
algunas
modificaciones que ayudan a aumentar la fidelidad del ensayo, principalmente en base
al uso de las cuatro construcciones reporteras bajo la regulación de tres promotores
distintos, con lo que se consigue eliminar
muchos de los clones falsos positivos
producto de la autoactivación por parte de las proteínas híbridas de la biblioteca.
Los principales falsos negativos en el sistema de doble híbrido pueden ser
originados cuando las proteínas de fusíon no se pliegan adecuadamente o no se realizan
las modificaciones postraduccionales necesarias, alterando así los requrimientos de
interacción. Falsos negativos pueden deberse también a interacciones de carácter débil.
En el sistema de doble híbrido uno de los puntos determinantes para el éxito en el
descubrimiento de interacciones proteína- proteínas mediante el screening de las
bibliotecas es justamente la elección de una biblioteca decuada. Dentro de los criterios
82
para la elección de la biblioteca a utilizar es necesario analizar varios parámetros, como
la fuente de origen, el tipo de tejido, el método de preparación y la representabilidad de
los clones. La biblioteca comercial aquí utilizada (Clontech), es preparada desde mRNA
de cerebros fetales completos correspondientes a abortos espontáneos de 20- 25
semanas de edad. La biblioteca fue construida por clonamiento direccional mediante uso
de oligo XhoI- (dT)15 y la secuencia adaptadora con los sitios EcoRI-NotI-SalI por
métodos tradicionales. En este contexto la elección de una biblioteca de cDNA de
cerebro fetal humano fue debido a que las primeras referencias indicaban al cerebro
como uno de los tejidos con más altos niveles de expresión de GBF1. Por lo tanto se
esperaría en estos tejidos tener mayor probabilidad de detectar pares de interacción para
GBF1 con relevancia funcional. Otro aspecto para considerar en la construcción de las
bibliotecas de eucariontes superiores por lo métodos tradicionales pueden contener
principalmente los clones de cDNA más redundantes y baja bajos niveles de cDNA de
gran tamaño (Ohara et al., 1997). Luego las regiones N-terminal de las proteínas de
gran tamaño, o la totalidad de estas proteínas no son bien representadas, y por lo tanto la
identificación de ciertas interacciones dependientes de estas regiones no será lograda.
En la actualidad existen variadas estrategias para la construcción de bibliotecas de
cDNA normalizadas (Nakayama et al., 2002).
Otro factor clave en la búsqueda de interacciones en doble híbrido es el diseño de
las construcciones utilizadas como carnadas, especialmente cuando se usan fragmentos
de una proteína. Tradicionalmente en la búsqueda de interacciones proteína- proteína
por doble híbrido se utiliza como carnada el dominio GAL4 BD fusionado a la proteína
de interés en su longitud total. Luego cuando es detectada una interacción se construyen
nuevas carnadas con fragmentos de la proteína en estudio para localizar el dominio o
región de interacción. Pero lo más importante es que efectivamente las proteínas de
83
fusión puedan ser expresadas correctamente en las cepas de Saccharomyces cerevisiae,
y las proteínas de alto peso molecular provenientes de otra especie tienen muy baja
probabilidad de ser expresadas establemente. Por esta razón para GBF1 se trabajó
directamente con fragmentos para ser usados como carnadas. La elección de estos
fragmentos carnadas de GBF1 puede eventualmente afectar los requerimientos para el
plegamiento, que a su vez podría ser determinante para algunas interacciones.
GBF1 no ha sido cristalizado y tampoco se tiene la información de los perfiles de
plegamiento. Las construcciones carnadas de GBF1 utilizadas para el screening de la
biblioteca fueron diseñadas en base a información manejada en el laboratorio de datos
no publicados sobre el plegamiento de este GEF. En esta aproximación se
cotransfectaron 3 plámidos que permitían expresar 3 grandes fragmentos de GBF1,
reconstituyendo la actividad ARF- GEF, lo que llevó a inferir complementación y
correcto plegamiento de cada uno de estos fragmentos.
También es importante considerar que talvez el sistema utilizado de doble híbrido
clásico pudo no ser el más adecuado, pero ya que los análisis no fueron completados,
esto como una especulación. La posible no idoneidad del sistema es debido a que éste se
basa en la detección de interacción entre proteínas solubles que deben ser translocadas
al núcleo. Aunque el sistema de doble híbrido permite en teoría estudiar cualquier tipo
de interacción, y ha permitido detectar muchas interacciones entre proteínas asociadas a
membranas, proteínas residentes del núcleo, proteínas mitocondriales, extracelulares y
solubles, tiene también ciertas limitaciones. Debido a esto se han desarrollado sistemas
específicos para otro tipo de interacciones como el sistema de reclutamiento SOS (SRS)
y el sistema basado en la fragmentación de ubiquitina.
El sistema SRS se basa en la vía de señalización Ras de levaduras (Aronheimn et
al., 1997). La activación de Ras es regulada por el intercambio GDP/GTP estimulado
84
en la membrana plasmática por el factor de intercambio de guanil nucleótidos de Ras
(RGEF), cdc25. Las cepas mutantes del alelo cdc25 son sensibles a la temperatura,
pueden crecer a 25 º C, pero no a 36ºC, sin embargo a esta temperatura la mutación es
complementada por el direccionamiento a membrana de hSOS, el RGEF humano. En el
sistema SRS la unión a membranas de hSOS es dependiente de las interacciones
proteína- proteína, puesto que las construcciones carnadas contienen la fusión de la
proteína de interés con hSOS truncada a nivel C- terminal, que es aun activa pero no
puede ser dirigida a membrana. Las proteínas presas son proteínas integrales de
membrana o proteínas solubles con señales de miristoilación. Por lo tanto sólo la
interacción entre dos proteínas dadas permite reactivar la actividad de hSOS.
Otro sistema derivado de doble híbrido para la búsqueda de interacciones de
proteínas asociadas a membrana está basado en la fragmentación de ubiquitina (Johnson
and Varshavsky, 1998). Para esto el extremo N-terminal mutado de ubiquitina es
fusionado con una proteína carnada, la proteína presa es fusionada al extremo Cterminal de ubiquitina, que a su vez está fusionada con una proteína reportera. Luego,
solo la interacción específica entre carnada y presa permite reconstruir a ubiquitina,
permitiendo la liberación de la proteína reportera mediado por las proteasas específicas
de ubiquitina.
Para la búsqueda de interacciones mediante precipitación por afinidad con GST
fueron expresadas las construcciones GST- GBF1 en células 293 EBNA. Con esta
técnica la mayor dificultad es el hallazgo de interacciones de tipo transiente,
especialmente las interacciones débiles con constantes de disociación altas, ya que es
muy fácil que los complejos se disocien durante el procedimiento de extracción de
proteínas, durante la incubación o en los lavados. Y se requiere optimizar el sistema en
85
base al tipo de sales, a la concentración de éstas, períodos de incubación y al pH en los
tampones de unión y lavado.
Las interacciones de naturaleza estable son generalmente fáciles de detectar y
además los falsos positivos, producto de interacciones no específicas pueden ser
eliminados por lavados con tampones de alta fuerza iónica. La estabilización de este
tipo de interacciones puede ser lograda mediante el uso de cofactores o análogos de
nucleótidos trifosfatos no hidrolizables. También los complejos proteicos pueden ser
estabilizados por distintos tipos de agentes de entrecruzamiento. Aquí fue utilizado el
agente imidoester homobifuncional DTBP. Este es permeable a la membrana, y por lo
tanto permite realizar las reacciones de entrecruzamiento en células intactas.
Actualmente se han desarrollado nuevos agentes de entrecruzamiento que otorgan
mayor especificidad en la estabilización de los complejos, como los fotoreactivos. Esto
es debido a que en el uso tradicional de entrecruzamiento químico con agentes
homobifuncionales o heterobifuncionales pueden detectarse conjugados proteicos no
dependientes de una interacción proteína- proteína real, lo que es eliminado con el uso
de agentes fotoreactivos. Sin embargo, en el uso de estos reactivos el nivel de
conjugados que se forma suele ser bajo.
La forma mas común de expresión de proteínas fusionadas a GST es en E. coli,
debido a los altos niveles de expresión, controlada por inducción, y rapidez, que
conducen a la más alta producción de proteínas de fusión con GST. Pero la expresión de
las construcciones GST-GBF1 en células eucarióticas, específicamente en células de
mamífero, aumenta la posibilidad de que las proteínas sean plegadas adecuadamente y
se realicen las modificaciones postraduccionales correspondientes, las que pueden ser
críticas para una interacción dada, con un también buen nivel de expresión. Pero al igual
que las construcciones para las fusiones de doble híbrido está la posibilidad que la
86
propia fusión, o el hecho de expresar fragmentos proteicos, puede afectar el plegamiento
o alguna interfaz requerida para una interacción en particular.
También al expresar fusiones con GST en células de mamífero es determinante
tener un buen sistema de transfección para asegurar obtener suficiente cantidad de
proteína de fusión, considerando además que luego la detección de los posibles pares de
interacción es aquí realizada por tinción de proteínas con sales de plata. Al usar las
células 293 EBNA, en las que GBF1 se expresa endógenamente, los extractos proteicos
contienen tanto las fusiones GST- GBF1 como las proteínas presas, y luego el uso de
DTBP se utilizó para la estabilización de los complejos.
5.3 Sobre los resultados obtenidos
Las primeras etapas para la búsqueda de interacciones proteína- proteína en GBF1
por el sistema de doble híbrido fueron logradas satisfactoriamente. Los ocho fragmentos
estratégicos de las regiones N-terminal, del dominio catalítico sec7, C- terminal y
regiones intermedias de GBF1 fueron amplificados por PCR y clonados en pGEM-T
Easy. Cada fragmento fue subclonado en el vector de expresión en levaduras pGBKT7.
Las construcciones carnadas GAL4 BD- carnadas fueron transformadas en la cepa
AH109 y la correcta expresión de estas proteínas híbridas fue analizada por western
blot. De las ocho construcciones solo se expresaron 6 de éstas, correspondientes a las
fusiones del dominio de unión al DNA de GAL4 con las carnada 1 (1-572 aa), carnada 2
(527- 1192 aa), carnada3 (1193-1859 aa), carnada 4 (1-284 aa), carnada 6 (1193-1533
aa) y carnada 7 (1482-1877 aa). La selección de estas carnadas transformadas en la cepa
AH109 en medio SD cuádruple dropout permitió verificar que no producían
autoactivación de los genes reporteros y por esto fue posible emplearlas para el
screening de la biblioteca de cerebro fetal humano. Las carnadas 5 y 8 no fueron
87
expresadas en Saccharomyces cerevisiae, esto podría ser debido a algún efecto de
toxicidad producida por estas proteínas híbridas, o por algún problema en la
construcción o clonamiento de éstas, cómo por ejemplo la aparición de algún codón de
término.
Estas 6 construcciones fueron utilizadas como carnadas para el screening de la
biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano, lo que permitió aislar clones con señal de
interacción positiva para las carnada 1, carnada 4 y carnada 7 al evaluar la expresión de
los genes reporteros por selección en medio QDO SD /-Ade/-Leu/-His/-Trp. El utilizar
un medio de alta exigencia permite disminuir la presencia de clones falsos positivos,
pero a la vez hace mas difícil identificar aquellas interacciones débiles. El screening por
apareamiento de levaduras fue realizado 3 veces para las carnadas 1 y 4 y dos veces
con las carnada 7. El total de clones obtenidos para el screening con la carnada 1 fueron
37, 30 para la carnada 4 y 28 para la carnada 7. Los clones seleccionados fueron
almacenados en glicerol Stock a -70 º C para la posterior caracterización y
secuenciación.
El uso de los agentes de entrecruzamiento para la estabilización de interacciones
proteína- proteína resulta ser una buena estrategia y con DTBP permitió detectar a
GBF1 formando complejos de alto peso molecular, en bandas muy limpias, definidas y
únicas. Estos ensayos preliminares fueron realizados en células 293 EBNA, donde
GBF1 es expresado endógenamente, y por entrecruzamiento sobre células intactas ya
que DTBP es permeable a membranas. En los experimentos iniciales de precipitación
por afinidad con las construcciones GST- hGBF1 bajo las condiciones utilizadas no se
logró identificar bandas de interés como posibles proteínas de interacción con GBF1. En
los primeros ensayos se detectaban muchas bandas inespecíficas y productos de
degradación proteolítica, pero luego no fue posible obtener indicios de alguna banda de
88
interés como señal de interacción. Por lo que la combinación de estabilización con
DTBP y precipitación por afinidad con GST era la siguiente metodología a evaluar.
5.4 Experimentos y análisis pendientes
Desafortunadamente la etapa final de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae
no pudo ser terminada. Los clones seleccionados durante el proceso de mating para el
screening de la biblioteca deberían haber sido caracterizados para obtener patrones o
perfiles del tamaño y sitios de restricción del inserto, y así agruparlos y poder
finalmente secuenciar para obtener la identidad del par de interacción. Inicialmente el
proceso requería verificar los putativos clones seleccionados durante el screening,
volviendo a comprobar los fenotipos en los medios selectivos cuádruple dropout SD/ Ade/-His/-Leu/-Trp/ y repetir también los ensayos de beta galactosidasa en filtro. Con
las colonias diploides verificadas el paso siguiente debía ser realizar la extracción de
DNA plasmidial para poder transformar en E.coli o para amplificar por PCR, y luego
obtener patrones de digestión que permitiesen ir clasificando los clones para seleccionar
representantes de cada grupo y estos enviarlos a secuenciar. Esta etapa que parece ser
bastante simple tiene la limitación técnica que al no utilizarse el Kit con columnas para
la extracción de DNA plasmidial desde levaduras, y usar como en este trabajo el método
modificado la cantidad obtenida de DNA es bastante baja, no puede analizarse
directamente en geles de agarosa y se requiere de transformación en E. coli por
electroporación o células químicamente competentes de alta calidad. El método aquí
utilizado para el procedimiento de lisis utiliza la enzima liticasa y bolitas de vidrio
acidificadas en combinación con ciclos de congelamiento/ descongelamiento, seguido
de extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Luego que se extrae el DNA
plasmidial desde bacterias, se realizan las digestiones enzimáticas adecuadas y se
89
comparan entonces los patrones obtenidos en cada clon por tinción con bromuro de
etidio de los geles de agarosa. Este técnica produjo buenos resultados y el DNA
plasmidial de todas las carnadas GAL4 BD- GBF1 que fueron transformadas en la cepa
AH109 de S. cerevisiae fueron obtenidos y analizadas correctamente.
Los siguientes pasos en el análisis de los putativos clones de interacción
contemplaban volver a transformar en S. cerevisiae, y al tener los clones aislados
comprobar la activación de los genes reporteros por selección nutricional en medio
triple y/ o cuádruple dropout y en los ensayos de beta galactosidasa en filtro. Esto ya
que eventualmente existía la posibilidad que los diploides seleccionados como
productos de la interacción carnada-presa pudiesen ser un falso positivo causado por los
clones de la biblioteca. La autoactivación
de estos clones, a diferencia de las
construcciones carnadas de GBF1, no logró ser analizada. Si efectivamente en medio
QDO los clones de la biblioteca no producían autoactivación de los genes reporteros, y
luego volvían a detectarse como positivos por complementación con las construcciones
carnadas, estaban en condiciones ser secuenciados.
Posteriormente cuando luego de secuenciar se ha logrado identificar al par de
interacción se sugiere realizar algunas pruebas adicionales en el mismo sistema de doble
híbrido, como intercambio de vectores o mutaciones sitio-específicas. Adicionalmente
la interacción debería ser confirmada por otras técnicas, y también empleando el modelo
de doble híbrido en mamíferos. Finalmente, aunque en pocas oportunidades, existe la
posibilidad que luego de secuenciar se encuentren dos inesperados resultados con los
ORF (Open Reading Frame). Uno de estos corresponde a que simplemente no se
encuentre un ORF fusionado al domino de activación del GAL4. Lo que puede ocurrir
en estos casos es que en la hebra antisentido exista un ORF cuya transcripción podría
estar regulada por un promotor críptico localizado dentro de la secuencia de terminación
90
del promotor de ADH1 (Chien et al., 1991). La activación de los genes reporteros por
este tipo de transcrito puede ser lograda cuando la proteína codificada tenga actividad
transcripcional y además interaccione con la proteína carnada, de esta forma no sería
necesaria la fusión con el dominio de activación de GAL4. Otra posibilidad que puede
ocurrir ocasionalmente es que en el análisis de los ORF los putativos clones positivos
del screening de la biblioteca presenten codificación para pequeños péptidos. Esto
podría deberse a que realmente pueda existir una interacción con tal péptido, pero en
doble híbrido no se tiene registro de cual ha sido el tamaño más pequeño identificado.
Además también es posible que la señal de interacción positiva esté siendo obtenida
producto de un segundo ORF localizado “rio abajo” y con un mayor tamaño, el cual
puede ser fusionado al dominio de activación de GAL4. La solución que se tiene para
identificar cual de los dos ORF es el que media la interacción, estos deben ser clonados
independientemente para expresar fusiones con el dominio de activación de GAL4 y
luego volver a realizar los ensayos.
Con respecto a los experimentos de precipitación por afinidad con GST quedó
pendiente realizar los ensayos con previa estabilización de los complejos proteicos
mediante entrecruzamiento con DTBP. Esto parecía ser una buena estrategia y una
posibilidad para detectar interacciones de GBF1, por los resultados obtenidos durante la
directa detección de complejos por entrecruzamiento y visualización en geles de SDS
PAGE. También quedaron pendientes los experimentos precipitación por afinidad con
la mutante ∆ NAP de GBF1, la cual fue construida previamente en otro trabajo de tesis
del laboratorio. Esta mutante atrapa a GBF1 en complejo abortivos, y se encontraba
marcada con Hisx6.
Además, y aunque no estaba originalmente contemplado podría haberse realizado
la búsqueda dirigida para comprobar la interacción de GBF1 con Snapin y Hrs.
91
5.5 Publicaciones paralelas de interacción proteína- proteína con GBF1
Previamente fue mencionada la interacción de GBF1 con el factor de
transporte de membranas p115 (Garcia- Mata et al., 2003), y también la nueva
interacción con Rab1b, esto en el contexto de los mecanismos de asociación a
membranas de GBF1. La interacción entre GBF1/ p115 fue descubierta utilizando el
sistema de doble híbrido en levaduras, en el cual se empleó a p115 de ratón como
carnada para el screening de una biblioteca de cDNA de riñón de ratón (Garcia-Mata et
al., 2003). Esta interacción también fue comprobada por pruebas de purificación por
afinidad con GST y coinmunoprecipitación. La interacción con p115 fue mediada por
la región rica en prolina de GBF1.
La GTPasa Rab1b está involucrada en el reclutamiento de los mantos proteicos
de tipo COPI y la interacción con GBF1 fue confinada en la región N-terminal de éste
(Monetta et al., 2007). Para los ensayos de purificación por afinidad utilizaron las
fusiones GST- GBF1 (1-380 aa), GST-GBF1 (1430-1859 aa) y GST- Rab1b, las que
fueron expresadas y purificadas en la cepa de E. coli BL21. En estos ensayos primero
observaron la unión de GBF1 a GST- Rab1b cuando se cargaba con el análogo no
hidrolizable GSTγS, y débilmente con GDP. Luego realizaron los ensayos con las
fusiones GST- GBF1 de la región N-terminal 1-380 y con los últimos 429 aminoácidos
de la región C-terminal de GBF1, donde Rab1b fue recuperado solo con la fusión Nterminal de GBF1, comprobando la interacción y determinando la región de interacción.
Adicionalmente fueron publicadas nuevas interacciones de GBF1 con las
proteínas GGAs, con la proteína 3A de piccornavirus y una interacción por
homodimerización de los dominios de GBF1 DCB (Dimerization and CyclophilinBinding) y HUS (Homology Upstream of Sec7). Para la interacción con GGAs
(Lefrançois et al., 2007), realizaron ensayos de coinmunoprecipitación con fusiones
92
GFP- GGA1, GFP-GGA2 y GFP-GGA3 expresadas en células Hela, y utilizando
anticuerpos anti GFP detectaron la unión de GBF1 a estas tres formas de GGAs. Luego
realizaron los ensayos
de coinmunoprecipitación con la fusión YFP- GBF1, con
interacción positiva para GGA1, GGA2 y GGA3. Luego mediante doble híbrido
utilizaron como carnada GAL4 BD- GGA1 y como presas las fusiones del dominio
GAL4 AD con el dominio N-terminal y C-terminal de GBF1 (que excluían el dominio
catalítico Sec7), resultando en una interacción positiva entre GGA1 y el dominio Nterminal de GBF1.
Las interacciones por homodimerización (Ramaen et al., 2007) en GBF1 fueron
descritas a través de los dominio DCB y HUS, localizados en la región N-terminal sobre
el dominio Sec7, identificando interacciones de tipo DCB- DCB y DCB- HUS. Para
esto se emplearon técnicas bioquímicas y doble híbrido. En los ensayos de
coinmunoprecipitación emplearon la forma marcada HA-GBF1, GBF1∆ DCB (deleción
de los primeros 297 aa) y GBF1 ∆DCB-HUS (deleción de los primeros 710 aa). Este
tipo de interacciones también fueron identificadas para BIG1 y BIG2, proponiendo una
posible regulación para la activación de Arfs.
La interacción de GBF1 con la proteína 3A de enterovirus fue localizada en la
región N-terminal de éste (Wessels et al., 2006). La proteína 3A inhibe el proceso de
secreción entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi. La proteína 3A es una
pequeña proteína de membrana no estructural e hidrofóbica, varias mutaciones en ella
producen defectos en la replicación viral de RNA, pero el proceso de inhibición ha sido
descrito no ser necesariamente requerido para la replicación en cultivos de tejidos
celular, sino que tendría importancia en la evasión de la respuesta inmune.
Los resultados de este trabajo de tesis no pudieron concluir en la identificación de
una nueva interacción proteína- proteína para GBF1, no por resultados negativos en
93
base a la hipótesis de trabajo, estrategias, metodología o el desarrollo de trabajo
práctico, sino por imposibilidad de continuar los últimos experimentos. No es posible
afirmar que en los clones obtenidos en doble híbrido realmente existía un par de
interacción real, o que dicha interacción tendría importancia funcional, porque estos
debían ser confirmados, lo mismo es aplicado para los experimentos precipitación por
afinidad con GST. Tampoco es posible ahora saber si realmente ante la eventual
posibilidad de haber continuado se hubiese tenido finalmente éxito en la búsqueda de
interacciones proteicas. Independientemente, este trabajo de tesis fue finalizado,
respaldado y defendido con el análisis de estos resultados parciales, y la especulación de
un hipotético resultado positivo o negativo.
Paralelamente la hipótesis planteada es de cierto modo apoyada por las últimas
interacciones. Estas nuevas interacciones permiten otorgan nuevas funciones a otras
regiones de GBF1 distintas al dominio catalítico Sec7 de GBF1, que originalmente eran
totalmente desconocidas. Pero aún no es totalmente entendido ni conocido todo el
entorno de interacciones proteicas a través de las cuales GBF1 modula su actividad
como Arf- GEF, y eventualmente aún pueden existir varias interacciones sin descubrir o
confirmar, con especial interés en la putativa interacción con SNAPIN y Hrs.
94
Figura 14. Esquema de las interacciones proteicas de GBF1 publicadas de forma
paralela a esta tesis.
95
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129
7.0 ANEXO
7.1 Análisis del marco de lectura de GBF1 en construcciones híbridas carnadas
•
Carnadas 1 y 4: amplifican los fragmentos 1-1716 y 1-853 del ORF del mRNA
de GBF1 respectivamente, por lo que se utilizó el mismo partidor sense con el
sitio de restricción NcoI para construir fusiones con GAL4 BD.
Secuencia mRNA de GBF1:TTTGCCAAG ATG GTG GAT AAG AAT ATT TAC
M
V
D K N
I Y
Secuencia pGBKT-7: 5` CAT ATG GCC ATG GAC GCC GAA TTC 3`
NcoI
Secuencia primer sense:
5`TTT GCC ACC ATG GTG GAT AAG 3`(Nco I)
NcoI
Fusión GAL4 BD- Carnada 1: Gal4 BD- CAT ATG GCC ATG GTG GAT AAG ....3`
M
V D K
•
Carnada 2: Amplifica el fragmento 1576-3577 del ORF del mRNA de GBF1.
Secuencia mRNA de GBF1: ..GAG GCC ATT GTG CAG CTC TGG CGC ATC
E
A
I
V
Q
L W
R
I
Secuencia pGBKT-7: 5` CAT ATG GCC ATG GAC GCC GAA TTC 3`
NcoI
Secuencia partidor sense: 5`GAG GCC ATG GTG CAG CTC TGG 3`(Nco I)
NcoI
Fusión GAL4 BD- Carnada 2: ...5` CAT ATG GCC ATG GTG CAG CTC TGG 3
V
Q
L W
130
•
Carnada 3 y 6: amplifican los fragmentos 3577-5577 y 3577-4599 del ORF del
mRNA de GBF1 respectivamente.
Secuencia mRNA GBF1: ... GCA CAA GAT TTC TGC TTC CTT GTG
A Q D
F
C
F
L V
Secuencia pGBKT-7: 5´…ATG GAG GCC GAA TTC CCG GGG 3`
EcoRI
Secuencia primer sense: 5`GCA CAA GAA TTC TGC TTC CTT 3` (Eco RI)
EcoRI
Secuencia fusión: ´…ATG GAG GCC GAA TTC TGC TTC CTT …3`
C
F
L
•
Carnada 5 y 8: amplifica el fragmento 820- 1716 del ORF de GBF1
Secuencia mRNA GBF1: CCC ACT CCC ATC TCC TCT GCA
P
T
P
I S
S
A
Secuencia pGBKT-7: 5` CAT ATG GCC ATG GAC GCC GAA TTC 3`
NcoI
Secuencia primer sense: 5`CCC ACT CCC ATG GCC TCT GCA 3` (NcoI)
NcoI
Secuencia fusión: 5` CAT ATG GCC ATG GCC TCT GCA 3`
S A
•
Carnada 7: amplifica el fragmento 4446 – 5577 del ORF de GBF1
Secuencia mRNA GBF1: GAC GAA GGC GTG CCT GCC AGC TAC CAT
D
E G V
P
A
S
Y H
Secuencia pGBKT-7: 5´…ATG GAG GCC GAA TTC CCG GGG 3`
EcoRI
Secuencia partidor sense: 5`GAC GAA TTC GTG CCT GCC AGC 3` (Eco RI)
EcoRI
Secuencia fusión: GAL4 BD-ATG GAG GCC GAA TTC GTG CCT GCC AGC 3`
V P
A
S
131
7.2 Secuencia de GBF1 utilizada para análisis de construcciones carnadas
(Homo
sapiens golgi-specific brefeldin A resistance factor 1 (GBF1), mRNA.Accession
NM_004193, PubMed.)
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
3001
3061
3121
3181
3241
3301
3361
3421
3481
3541
gacagggaag
agtcccaccc
gctaccagag
gcggctgccg
atggtggata
aaacgaaatg
catagtttcg
cccaatgtat
atcactggac
acccatgagg
tttgtgggca
cggactctgc
atgcagtctt
gcagagcaca
gaagaaccca
atgagtgatt
accaaagtca
ctcactggtg
gctgcctcag
acttccaagg
acagagcctg
catgtggaaa
acgtcccctg
cggggcgtgc
cttccctgca
cataactcag
gcccctgtag
ttattccagc
ttcctactgt
aagcttatgg
gcactggagg
aactatgatt
aagaatgcct
ctattgacag
acccagcaag
gaagctagca
atcccaggcc
tgcagtgatc
ccccgatttt
aagctgctaa
ctgcaagaga
cgagagaacc
attgacctgt
gccctccgcc
ttgctggagg
gatgcctgct
aatgttcgta
gtgaatggag
aatgaggaaa
aatgtgctgc
agctatgatc
gtctttgaca
tgcgccatga
ctatgcaaat
agcaacccta
gacatcctgc
caactactgc
tctctacagc
agctggctaa
caagaggcca
gtacccggct
tgacttcagc
ccgggagagc
gtcctgggac
agaatattta
cccgatggag
gtcatctaaa
tccttcgacc
tggcactcac
gcacagcaga
cggatcctgc
tgctaacccc
gcttccggat
ctctcgtaga
agaactatgt
catccaaatg
caccaggttc
gcatgccctt
cagtggtcag
aagaccttac
gaagcagtga
agtcccagtc
ccgaccactc
gctttacaca
tccgcgagct
aggttatgat
cccagtgcca
tactcagcat
ttgagagcat
agatcatcac
ccattgtgca
gtgactacta
tccctgtgtc
tgattgacag
agaagaagga
atactgagag
tgcatctgcc
tggaggaagc
cctgtctcct
tcactggcac
aaggcctcct
ctcggctgga
tggagagctt
tctacctgga
cattcacaga
tttccctggc
aacagaatgc
gcaaggactt
ttgtaatgcc
ttcatcgagg
ttgacctctt
aaagccttga
tctccgccca
tcacagctct
aagcccatat
gggagggctg
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132
3601
3661
3721
3781
3841
3901
3961
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4861
4921
4981
5041
5101
5161
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5281
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5401
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5521
5581
5641
5701
5761
5821
5881
5941
6001
6061
6121
6181
6241
6301
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tgttcgagac
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ctgggcccac
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gcaaaagcta
taccaagctc
gagggcttcc
ctctaccttt
aggctccagc
gatggacaca
ctgggagatc
caagcagacc
ctcagcccac
agagattcca
cagcagcagc
cgacgggcct
gcaggtgggc
cacctcacca
ggtcaactaa
accccacttc
gctgccactt
atcagctgtg
gaactcagct
gtgccggccc
cactttgttt
aattagttgg
ggtgggggac
tatgatataa
133
7.3 Construcciones reporteras del sistema doble híbrido
En levaduras la expresión de todos los genes estructurales está controlada por la
región promotora mínima TATA box, y por elementos reguladores- cis. En levaduras
las secuencias TATA determinan el sitio de inicio de la transcripción como también el
nivel basal de trascripción. Las secuencias TATA son poco conservadas y se encuentran
a 25 pb río arriba del sitio de inicio de la transcripción, aproximadamente. Las
secuencias reguladoras UAS (upstream activating sequences) son un tipo de elementos
reguladores actuando en –cis, estas secuencias son reconocidas por los factores
activadores de la transcripción y de este modo potencian la actividad de las cajas
TATA. En el sistema de doble híbrido se utilizan construcciones reporteras en forma de
casettes transcripcionales que contienen la secuencia UAS, la región promotora mínima
TATA y el gen reportero. Los genes reporteros utilizados son ADE2/HIS3, LacZ y
MEL1. Estas construcciones han sido insertadas en el genoma de las cepas de
Saccharomyces cerevisiae AH109 e Y187 que serán utilizadas para la transformación
de las construcciones híbridas “carnadas” y “presas”. Luego por cotransformación o por
apareamiento de levaduras (mating) las construcciones híbridas GAL4 BD-carnada y
GAL4 AD- presa serán expresadas en la misma cepa reportera o diploide.
• Construcciones reporteras en AH109
GAL1 UAS
GAL1 TATA
HIS3
GAL2 UAS
GAL2 TATA
ADE2
MEL1 UAS
MEL1 TATA
lacZ
MEL1 UAS
MEL1 TATA
MEL1
• Construcciones reporteras en Y187
GAL1 UAS
GAL1 TATA
lacZ
Figura 15. Construcciones reporteras de las cepas AH109 e Y187
134
7.4 Genes reporteros y marcadores de selección utilizados en el sistema doble
híbrido en Saccharomyces cerevisiae
El sistema de doble híbrido Matchmaker Gal4 two Hybrid System3 utiliza los
genes reporteros ADE2, HIS3, LacZ y MEL1, y los marcadores de selección nutricional
para transformación en las cepas de Saccharomyces cerevisiae Trp1 y Leu2.
TRP1 gen que codifica para la enzima Fosforibosilantramilato isomerasa que
cataliza el tercer paso en la biosíntesis del triptófano. Las cepas mutantes Trp− (trp1901) requieren la suplementación de triptófano en el medio de cultivo. Este gen es
utilizado como marcador nutricional para la selección de trasformantes en
Saccharomyces cerevisiae que portan el plásmido pGBKT7 con los clones de las
construcciones “carnadas”.
LEU2 codifica para la enzima Beta-isopropilmalato deshidrogenada que cataliza el
tercer paso en la vía de biosíntesis de la leucina. Las cepas mutantes Leu− (leu2-3, 112)
requieren leucina en el medio de crecimiento y LEU2 en utilizado como el marcador de
selección nutricional para la trasformación en Saccharomyces cerevisiae con el vector
pACT2 que contiene las construcciones “presa” de la biblioteca de cDNA de cerebro
fetal humano.
HIS3 gen que codifica para la enzima Imidazolglicerol fosfato dehidratasa, la
cual cataliza el sexto paso en la biosíntesis de histidina. Las cepas mutantes His− (his 3200) requieren de histidina como suplemento en el medio de cultivo. HIS3 es utilizado
como un gen reportero para la selección de clones de interacción bajo la regulación de
la secuencias GAL1UAS y GAL1 TATA.
ADE2 Fosforibosilaminoimidazol carboxilasa, cataliza un paso en la síntesis de
novo de nucléotido de purina, un pigmento rojo es acumulado en células deprivadas de
adenina. Los mutantes Ade− (ade2-101) requieren de adenina en el medio de cultivo.
135
ADE2 es empleado como un gen reportero en el sistema de doble híbrido al ser
insertado como un casette de regulación bajo las secuencias GAL2 UAS y GAL2
TATA. En la cepa AH109, la mutación ade2-101 fue realizada en la cepa precursora
PJ69-2A, donde fue reemplaza con la construcción reportera GAL2-ADE2 por
recombinación.
MEL1 codifica para la enzima alfa- galactosidasa, la cual es secretada. MEL1 es
utilizado como un gen reportero que se encuentra bajo la regulación de las secuencias
MEL1 UAS y MEL1 TATA. La expresión de este gen es detectada por el ensayo de alfa
galactosidasa en placas con el sustrato X- α-Gal.
LacZ permite expresar la enzima beta- galactosidasa. Es utilizado como un gen
reportero controlado por las secuencias MEL1 UAS Y MEL1 TATA. La construcción
reportera de LacZ fue integrada al genoma de Saccharomyces cerevisiae por
recombinación homóloga en la mutación ura3-52. La actividad de la enzima beta
galactosidasa es ensayada por la capacidad de actuar sobre el sustrato cromagénico Xgal. Ya que la enzima B- galactosidasa no es secretada, los ensayos para determinar la
actividad son realizados en filtro por permeabilización a través de un ciclo
congelamiento /descongelamiento en nitrógeno líquido, las cepas de Saccharomyces
cerevisiae LacZ+ producirán colonias de color azul, mientras que las cepas LacZ− se
mantendrán como colonias blancas.
URA3 codifica para la enzima 5- fosfato decarboxilasa, la cual participa en la vía
de síntesis de ribonucleótidos de pirimidina.