IMPLEMENTACIÓN DE LA AGROTRANSFORMACIÓN EN CEPAS

IMPLEMENTACIÓN DE LA AGROTRANSFORMACIÓN EN CEPAS NATIVAS MEXICANAS DEL
ENTOMOPATÓGENO METARHIZIUM ANISOPLIAE
Ruth Araceli Ruiz Martínez1, Gloria Angélica González Hernández2
1
División de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Guanajuato, Ap. Postal 187, Noria Alta s/n,
Guanajuato, Guanajuato., México, E-mail: [email protected]. 2 Departamento de Biología de
la División de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Guanajuato, Ap. Postal 187, Noria Alta
s/n, Guanajuato, Guanajuato., México, E-mail: [email protected]
RESUMEN
Para conocer la participación de nuevos genes en el proceso infectivo del hongo entomopatógeno M.
anisopliae, es importante contar con un método alternativo de transformación. Por esta razón, en el
laboratorio se implementó la transformación de cepas nativas del hongo mediante Agrobacterium
tumefaciens empleando dos plásmidos: pGG622 y pGG623 los cuales llevan el gen BAR quien
confiere resistencia a glufosinato flanqueado por las regiones derecha e izquierda del tDNA del
plásmido pTi, esperando se facilite la transferencia de DNA de la bacteria al hongo.
PALABRAS CLAVE: Metarhizium, Agrotransformación,
INTRODUCCIÓN
En la actualidad existen diferentes tipos de organismos que afectan la calidad y tiempo de cosecha de
diversos productos agrícolas como la remolacha, la caña de azúcar, el maíz, etc. Entre ellos se
encuentran insectos plaga que pueden atacar los cultivos en cualquier etapa de su desarrollo [1]. En
el estado de Guanajuato los cultivos destinados a la producción de maíz se ven afectados,
principalmente, por el complejo “gallina ciega” (Phyllophaga spp). La especie P. ravida presenta la
distribución más amplia en el estado [2]. El ciclo de vida de este insecto se desarrolla de tal manera,
que la larva se mantiene viva a expensas de los nutrientes del suelo, sobreviviendo un considerable
periodo de tiempo.
Para erradicar este problema se han utilizado distintos plaguicidas, que además de provocar cierta
resistencia en los insectos, son dañinos para la salud humana y el medio ambiente. Debido a esto, a
mediados del siglo XIX se comenzó a proponer el uso de microorganismos para el control de plagas.
De las bacterias, virus y hongos entomopatógenos, éstos últimos han adquirido importancia, ya que
su mecanismo de interacción con su hospedero es muy específico al igual que su proceso infectivo
[3], a este tipo de microorganismos se les denomina biopesticidas. Uno de estos biopesticidas es
Metarhizium anisopliae, el cual es un hongo entomopatógeno que infecta más de 200 especies de
insectos. Está ampliamente distribuido en la naturaleza y se encuentra en el suelo, en la rizósfera de
las plantas o en cadáveres de artrópodos como saprófito. Su ciclo infectivo comienza cuando el
conidio se adhiere a la cutícula del insecto hospedero, después germina y forma un apresorio que le
permite adherirse y de éste emerge la hifa infectiva que es capaz de penetrar la cutícula y llegar al
hemocele del hospedero. Una vez en el hemocele forma hifas, que pueden o no desarrollar
blastosporas, las cuales terminan de invadir al hospedero. Una vez agotados los nutrientes el micelio
emerge y crece cubriendo la cutícula del insecto, cerrando su ciclo de vida al formar nuevos conidios
los cuales a su vez podrán infectar un nuevo insecto reiniciando el ciclo de vida del hongo.
Son varios los genes implicados en el proceso infectivo del hongo, algunos de ellos se conocen y
muchos otros no. Por lo que el aislamiento de éstos y el análisis de su participación en el ciclo de vida
del hongo y su papel durante el proceso patogénico, proporcionarán herramientas de genética
molecular para el mejoramiento de la patogenicidad. Por ejemplo, disminuir el tiempo en el cual el
hongo provoca la muerte del insecto [4]. Para este tipo de estudios es importante contar con un buen
proceso de transformación.
En los últimos 30 años se han desarrollado diversas técnicas de transformación, tales como
transformación mediada por polietilenglicol, electroporación (electropermeabilización), bombardeo de
partículas y, más recientemente, transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens
(Agrotransformación). Ésta última, permite la transformación de células intactas como los conidios,
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disminuyendo la manipulación de las células y por tanto disminuyendo las probabilidades de
contaminación.
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria gram-negativa fitopatógena que tiene la capacidad de
integrar establemente parte de su material genético dentro del genoma de su hospedero, habilidad
que ha sido explotada para introducir DNA no solo a plantas, sino también a otros organismos que no
son hospederos naturales de la bacteria. Durante el proceso de infección A. tumefaciens introduce en
la célula vegetal un fragmento de DNA contenido en el plásmido pTi (plásmido inductor de tumor),
denominado T-DNA (DNA de transferencia) el cual es integrado dentro del genoma de la planta. Los
genes contenidos en el T-DNA son expresados en su hospedero e inducen la formación de tumores y
la síntesis de compuestos fenólicos que son aprovechados por la bacteria. El T-DNA está localizado
en el plásmido pTi, que además contiene los genes vir que son necesarios para la transferencia e
incorporación del fragmento de DNA en el genoma de la planta [5]. El T-DNA está delimitado por
secuencias repetitivas en su extremo izquierdo LB (left border) y en su extremo derecho RB (right
border). El descubrimiento de que el rango de hospederos de A. tumefaciens se podría extender
incluyendo hongos, provee una herramienta alternativa de transformación para especies en donde es
complicado dirigir experimentos genético-moleculares [6]. Se cree que el mecanismo de transferencia
del DNA en hongos se lleva a cabo de manera similar que en las plantas, por lo que se han
desarrollado vectores con genes foráneos a los de Metarhizium anisopliae para llevar a cabo la
introducción de los mismos dentro del genoma del hongo. Esto es posible ya que sólo las secuencias
borde del T-DNA son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo, lo que permitirá realizar
interrupciones mutagénicas al azar y posiblemente la integración dirigida en caso de usar información
genética del propio Metarhizium.
Por lo que en este trabajo nos enfocaremos a realizar la Agrotransformación de M. anisopliae,
utilizando los plásmidos pGG622 y pGG623 los cuales contienen al gen BAR, quien confiere
resistencia a glufosinato, flanqueado por los bordes Derecho RB e Izquierdo LB del T-DNA.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos y plásmidos empleados:
Metarhizium anisopliae, cepas CARO4 y CARO19; Escherichia coli MATCH1 (Invitrogen) y
Agrobacterium tumefaciens (donada por el Dr. Augusto Schrank).
pGG622 y pGG623 se consideran plásmidos binarios debido a que: contienen la secuencia ORIC y el
gen de resistencia a Kanamicina para su amplificación y selección en E. coli, y además contienen una
región de T-DNA delimitada por las regiones RB y LB y dentro de esta región está el gen BAR de
resistencia a Glufosinato para su transferencia y selección en Metarhizium anisopliae.
Células competentes de Agrobacterium tumefaciens
Se preparó un preinóculo de Agrobacterium en medio YPS conteniendo Carbenicilina, incubando a 28
ºC durante 48 h. Se inocularon 2 mL de este cultivo en caldo YPS fresco y se incubó por 3 horas,
hasta lograr una D.O. (660nm)≈0,5. Luego se incubaron a 30 ºC y se centrifugaron a 8000 rpm
durante 10 min a 4ºC. La pastilla se resuspendió en NaCl frío y se centrifugó de nuevo a 8000 rpm
por 10 min a 4ºC. La pastilla se resuspendió en CaCl2 frío y glicerol. Las células fueron alicuotadas y
almacenadas a -80°C
Transformación Bacteriana:
Se transformaron células químicamente competentes de E. coli como sigue: A 20µL de células
competentes se le adicionó 1µL de plásmido, seguido de incubación en hielo durante 20 min, otra a
42 ºC por 2 min y una última en hielo por 2 min. Se añadieron 500 µL de medio LB al tubo, mezclando
suavemente y se incubaron a 37 ºC por 1 hora. Las células contenidas en el tubo se sembraron en
cajas con medio LB-Kanamicina, las cuales se dejaron incubando a 37 ºC por 24 horas.
Transformación de A. tumefaciens. A las células competentes se les adicionó 5 µL de DNA
plasmídico, seguido de una incubación en hielo por 30 min. Posteriormente la suspensión se congeló
en nitrógeno líquido y enseguida se sometió a un choque térmico a 37ºC y después a un choque frío
en hielo. Se añadió 1mL de caldo YPS a la suspensión y se incubó a 28ºC en agitación constante.
Enseguida las células se colectaron por centrifugación y la pastilla obtenida al final se resuspendió en
caldo YPS. Las células se sembraron en agar YPS conteniendo Carbenicilina y Kanamicina. Las
colonias transformantes se recuperaron a las 48 h de incubación.
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Agrotransformación de Metarhizium anisopliae:
Se inoculó una colonia de la Agrobacterium, previamente transformada con el plásmido de interés,
en caldo LB con Carbenicilina y Kanamicina. Se incubó a 28 ºC en agitación constante hasta alcanzar
una D.O.660nm de 0,6 y se diluyó una D.O. de 0,15 empleando medio de inducción IMAS adicionado de
acetosiringona. Se incubó 4 horas en agitación constante. Por otra parte se prepararon alícuotas de
conidios o blastosporas de M. ansiopliae a una concentración de 5X105 células/mL, se centrifugaron a
5000 rpm 5 min, y a la pastilla se le adicionó Agrobacterium previamente inducidas. Se mezclaron y
después se esparcieron sobre celofán depositado sobre cajas Petri con agar IMAS. Después de 2
días de co-cultivación a 28 ºC, el celofán con las células se trasfirieron a cajas Petri con agar M-100
fresco con cefotaxima y glufosinato de amonio. Después de 1 día de incubación a 28 ºC, se
transfirieron nuevamente a medios M-100 frescos con cefotaxima y glufosinato de amonio y se
volvieron a incubar a 28 ºC. A los 3 días de incubación se recogieron las recombinantes cada día
sembrándolas en medio selectivo MDS-glufosinato.
Restricción de DNA con nucleasas específicas
Aproximadamente a 1 µg de DNA plasmídico se le adicionó 2-3 U de cada enzima de restricción y
1/10 de volumen de regulador en un volumen final de 10 µL. La mezcla de reacción se incubó durante
2-3 h a la temperatura adecuada siguiendo las instrucciones del fabricante (Biolabs). Los productos
de restricción se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% tiñendo el DNA con
SiberSafe (Invitrogen) observando el gel en el transiluminador. En uno de los pocillos del gel se cargó
un alícuota del GeneRulerTM DNA Ladder Mix de Invitrogen para ser usado como referencia y estimar
el tamaño en pb de los fragmentos de DNA observados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Preparación de Agrobacterium con el vector binario:
Para realizar la Agrotransformación de Metarhizium anisopliae, primero fue necesario amplificar y
comprobar el patrón de restricción de los plásmidos binarios pGG622 y pGG623. Para ello, una
alícuota de cada plásmido se utilizó para transformar células químicamente competentes de E. coli
como se indica en Material y métodos. Cinco colonias de cada transformante fueron inoculadas en
LB-kanamicina líquido durante toda la noche y se procesaron para rescatar el plásmido mediante el
protocolo de lisis alcalina descrito por Sambrook y Russell [7]. Una alícuota de estos plásmidos se
sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1% para estimar la cantidad necesaria para la
restricción (ver Fig.1A). Para comprobar la identidad de los plásmidos, estos se sometieron a
restricción simultánea con las enzimas EcoRI y HindIII como se indica en Material y métodos. Los
productos de la restricción se observan en la figura 1B los cuales coinciden con los tamaños
esperados.
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Figura 1. Plásmidos binarios pGG622 y pGG623. A. Electroforesis en gel de agarosa de los
plásmidos pGG622 (carril 1-5) y pGG623 (carril 6-10). B patrón electroforético de los plásmidos
cortados con las enzimas EcoRI y HindIII: carriles 2-6, pGG623; carriles 7-11, pGG622; carril 1,
marcador de tamaño en pb.
Una vez comprobada la identidad de los plásmidos pGG622 y pGG623 mediante patrón de
restricción, se introdujeron por transformación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens
como se indica en Material y métodos, seleccionando los transformantes por su resistencia a
carbenicilina y kanamicina, obteniéndose colonias aisladas como se observa en la Figura 2.
A
B
Figura 2. Transformantes de Agrobacterium tumefaciens con los plásmidos binarios pGG622
(A) y pGG623 (B).
Agrotransformación de Metarhizium anisopliae:
Se seleccionó una colonia de Agrobacterium portadora de cada uno de los dos plásmidos, estas
bacterias se denominaron AGLp622 y AGLp623. Cada una de estas bacterias se creció en el medio
selectivo líquido como preinóculo para inducir en ellas el estado de competencia mediante la adición
de acetosiringona. La acetosiringona es una hormona secretada por las plantas la cual dispara en
Agrobacterium la expresión de los genes vir preparando a las células para conjugar y transferir el TDNA a una célula receptora. Usamos como células receptoras conidios y blastosporas de M.
anisopliae como se indica en Material y métodos. Seleccionando como transformantes las células del
hongo M. anisopliae resistentes a glufosinato, eliminando las bacterias por su sensibilidad al
antibiótico cefotaxima. En la figura 3 se muestra como ejemplo algunos de los transformantes de M.
anisopliae obtenidos por conjugación con AGLpGG622. Colonias individuales de estos
transformantes fueron transferidas a medio Mínimo-Glufosinato para permitir su conidiación.
Posteriormente en un futuro inmediato se pretende realizar al menos 4 pases monospóricos para
asegurar la recuperación de transformantes eliminando los escapes y realizar su caracterización
molecular.
A
B
C
D
Figura 3. Transformantes de Metarhizium anisopliae resistentes a glufosinato. A partir de: A;
conidios de CARO4; B, blastosporas de CARO4; C, conidios de CARO19; D, blastosporas de
CARO19.
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CONCLUSIONES
Los resultados hasta ahora obtenidos sugieren fuertemente que se consiguió la transformación del
hongo Metarhizium anisopliae mediante la técnica de Agrotransformación, ya que las colonias
recuperadas mostraron resistencia a Glufosinato utilizado como marcador de selección en
Metarhizium.
Con los transformantes obtenidos se puede continuar la caracterización de los transformantes para
verificar mediante amplificación en cadena de la polimerasa la presencia del gen BAR, así como
determinar el lugar de integración para determinar si es posible usarlo para realizar mutagénesis
dirigida o al azar en este hongo entomopatógeno.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se realizó con financiamiento de proyecto específico de SEP-CONACYT Ciencia Básica,
y de la Universidad de Guanajuato, Convocatoria Institucional. La estudiante participante del Verano,
Ruth Araceli Ruiz Martínez recibió beca como estudiante del Verano del Investigación Científica UG
2012.
REFERENCIAS
[1] Omar Huici Rojas, (2004), Plagas agrícolas: Fundamentos técnicos para el uso y manejo de
plaguicidas, Plaguicidas Bolivia., pp. 2.
[2] Marín Jarillo Antonio; Bujanos Muñiz Rafael, (2008), Especies del complejo "gallina ciega" del
género Phyllophaga en Guanajuato, México, Agricultura Técnica en México, Vol. 34, Núm. 3, pp. 349355.
[3] Augusto Schrank, Marilene Henning Vainstein, (2010), Metarhizium anisopliae enzymes and
toxins, Toxicon 56, pp.1267-1274.
[4] Juan Carlos Torres Guzmán; Eduardo Salazar Solís; Angélia González Hernández, (2008),
Búsqueda de alternativas ecológicamente amables para el control de plagas en la agricultura
moderna: Metarhizium anisopliae como modelo de estudio, Ide@s CONCYTEG, Año 3, Núm. 37, pp.
3-9.
[5] Ana Milena Valderrama Fonseca; Rafael Arango Isaza; Lucia Afanador Kafuri, (2005),
TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS MEDIADA POR Agrobacterium: “INGENIERÍA GENÉTICA
NATURAL APLICADA”, Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.58, No.1, pp. 2569-2585.
[6] Rasmus John Normand Frandsen, (2011), A guide to binary vectors and strategies for targeted
genome modification in fungi using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, Journal of
Microbiological Methods 87, pp. 247–262.
[7] Sambrook J. and Russell D, (2001) Molecular Cloning, a Laboratory Manual. 3° Ed. Cold Spring
Harbor Laboratories. Press.
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