Tesis - Universidad de Colima

Universidad de Colima
Facultad de Medicina
EFECTO DE ANTI-INFLAMATORIOS SOBRE LA ENTRADA DE
VECTORES ADENOVIRALES DE TERAPIA GÉNICA EN CÉLULAS
DE CÁNCER CÉRVICO-UTERINO
Tesis que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias Médicas
Presenta
Héctor Rafael Galván Salazar
Asesor Básico
Dr. Iván Delgado Enciso
SNI I, Profesor Investigador Titular A
Universidad de Colima
Asesor Clínico
Dr. Augusto Rojas Martínez
SNI II, Profesor Investigador
UANL
Colima, Col. febrero de 2009
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el apoyo financiero otorgado
durante el periodo 2007-2009.
A los asesores de la presente tesis:
Dr. Iván Delgado Enciso
Dr. Augusto Rojas Martínez
Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Médica de la Facultad de Medicina,
Universidad de Colima.
IBQ. Alejandro David Soriano Hernández
QFB. Daniel Alberto Montes
Dr. Oscar Newton Sánchez
MCP. Fabián Rojas Larios
Laboratorio de Genética y Biología Molecular (Centro universitario de Investigaciones
Biomédicas -CUIB-), Universidad de Colima.
Dra. Luz Margarita Baltasar Rodríguez
M. en C. Mario Ramírez Flores
M. en C. Luis Angel Chávez
Dedicatoria
A Dios, por acompañarme en cada etapa de la vida y permitirme alcanzar una más de mis
metas.
A mi esposa Nely, por su apoyo y aliento en cada momento.
A mis padres, por todo ese esfuerzo y consejo que me brindan y demostrarme que todo es
posible teniendo Fe.
A mi asesor, Dr. Iván Delgado Enciso por su amistad, enseñanzas y lecciones de vida.
Productos Obtenidos
Durante la realización de la maestría (periodo 2007-2009), se obtuvieron las siguientes publicaciones:
J Gene Med. 2007 Oct;9(10):852-61.
A potent replicative delta-24 adenoviral vector driven by the promoter of human
papillomavirus 16 that is highly selective for associated neoplasms.
Delgado-Enciso I, Cervantes-García D, Martínez-Dávila IA, Ortiz-López R, AlemanyBonastre R, Silva-Platas CI, Lugo-Trampe A, Barrera-Saldaña HA, Galván-Salazar HR,
Coronel-Tene CG, Sánchez-Santillán CF, Rojas-Martínez A.
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Nuevo León,
Monterrey, Nuevo León, Mexico.
BACKGROUND: Several human epithelial neoplasms are associated with high-risk strains of
human papillomavirus (HPV) such as cervical, anorectal, and other carcinomas. For some
tumor types the current therapeutic tools are only palliative. Conditionally replicative
adenoviruses (CRAds) are promising antineoplastic agents, which also can trigger confined
antitumor effects.
METHODS: We constructed a series of CRAds driven by the upstream regulatory promoter
region (URR) of an Asian-American variant of HPV-16, which contained different mutations
at the E1A region (dl1015 and/or Delta24) and wild-type. All vectors were tested in vitro for
viral replication and cytotoxicity. Viral DNA replication and E1A expression were also
assessed by quantitative PCR. Finally, we confirmed the antitumoral efficacy of this vector in
injected and non-injected xenotransplanted cervical tumors in a murine model for tumor
regression and survival studies.
RESULTS: A vector denominated Ad-URR/E1ADelta24 displayed a potent cytopathic effect
associated with high selectivity for HPV+ cell lines. We found that the oncolytic effect of this
CRAd was comparable to Ad-wt or Ad-Delta24, but this efficacy was significantly attenuated
in HPV- cell lines, an effect that was contributed by the URR promoter. Ad-URR/E1ADelta24
was very effective to control tumor growth, in both, injected and non-injected tumors
generated with two different HPV+ cell lines.
CONCLUSIONS: CRAd Ad-URR/E1ADelta24 is a highly selective vector for HPV+ cell
lines and tumors that preserves the oncolytic efficacy of Ad-wt and Ad-Delta24. Our
preclinical data suggest that this vector may be useful and safe for the treatment of tumors
induced by HPV, like cervical cancers. Copyright 2007 John Wiley & Sons, Ltd.
PMID: 17729237 [PubMed - indexed for MEDLINE]
Delgado Enciso Iván,
Galván Salazar Héctor
Sánchez Santillán Carlos
F,
R,
Enriquez Maldonado Irma
Coronel Tene Christian
G,
G,
Rojas Martínez Augusto,
Ortiz López Rocío, et al.
Evaluación preclínica del efecto terapéutico de vectores adenovirales en neoplasias
dependientes del papilomavirus humano
Rev Invest Clin 2008; 60(2) : 101-106
Resumen
Los adenovirus (vectores adenovirales) usados en la terapia génica pueden eliminar a las
células neoplásicas mediante una replicación selectiva y/o a través de la expresión de genes
pro-apoptóticos, inmunogénicos o tóxicos. Sin embargo, un vector adenoviral puede provocar
efectos anticancerosos aun en ausencia de replicación o de la expresión de un gen terapéutico.
El presente estudio evalúa la eficacia terapéutica de los vectores adenovirales, por si solos (sin
efecto por replicación o por un gen terapéutico), en neoplasias dependientes del papilomavirus
humano (N-PVH). Los ensayos in vivo fueron realizados en dos modelos murinos (ratones) de
N-PVH, un modelo fue inmunocompetente y otro inmunodeficiente. En ellos se comparó el
efecto de la administración intratumoral de solución salina (PBS) con la administración de un
vector adenoviral sin capacidad replicativa ni gen terapéutico (Ad-BGal). En ratones
inmunocompetentes,
la
administración
del
vector
adenoviral
Ad-BGal
redujo
significativamente el crecimiento tumoral en comparación con PBS, en tanto que en ratones
inmunodeficientes no se observaron diferencias. En conclusión, el presente trabajo apoya el
uso de vectores adenovirales en el tratamiento de N-PVH, pues son capaces de generar un
efecto antitumoral en individuos inmunocompetentes, aun en ausencia de gen terapéutico o
replicación del vector viral.
Palabras clave: Neoplasias, papilomavirus humano, adenovirus, terapia génica, replicación
selectiva.
ÍNDICE
Contenido
Página
Resumen
1
Abstract
2
I.
INTRODUCCIÓN
3
II.
MARCO TEÓRICO
II. I
Terapia Génica. Panorama General
5
II. II
Estrategias para hacer Terapia Génica
6
II. III
Vectores adenovirales: Descripción, genoma y propiedades
7
II. IV
El gen E1A.
8
II. V
Entrada de adenovirus a la célula
8
II. VI
TNF-alfa
10
II.VII Efecto de la dexametasona sobre la entrada de adenovirus a la célula
11
II. VII. I
Dexametasona. Generalidades
12
II. VII. II
Mecanismo de acción
13
II. VIII
Anti-inflamatorios de uso común
13
II. VIII. I
Paracetamol. Generalidades
14
II. VIII. I. I
Mecanismo de acción
14
II. VIII. II
Ketorolaco. Generalidades
15
II. VIII. II. I
Mecanismo de acción
15
II. VIII. III
Diclofenaco. Generalidades
15
II. VIII. III. I Mecanismo de acción
16
III.
JUSTIFICACIÓN
17
IV.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
18
V.
HIPÓTESIS
VI.
V. I
De Trabajo
19
V II.
Nula
19
OBJETIVOS
VI. I
Objetivo General
20
VI. II
Objetivos Específicos
20
VII.
METODOLOGÍA
VII . I
Diseño
21
VII. II
Descripción de Variables
21
VII. III
Purificación y propagación del vector Ad-BGal.
22
VII.IV Células SiHa y administración de los fármacos anti-inflamatorios
23
VII. V
Exposición del vector Ad-BGal.
23
VII. VI
Tinción X-Gal
24
VII. VII
Cuantificación (entrada de adenovirus)
24
VII. VIII Análisis estadístico
25
VIII.
RESULTADOS
26
IX.
DISCUSIÓN
29
X.
CONCLUSIÓN
32
XI.
PERSPECTIVAS
33
GLOSARIO
34
BIBLIOGRAFÍA
38
ANEXOS
44
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
1. Entrada de adenovirus a la célula
13
2. Plan de trabajo general.
29
3. Células SiHa control (Aumento 50X).
31
4. Células SiHa tratadas con ketorolaco (Aumento 50X).
31
5. Células SiHa tratadas con paracetamol (Aumento 50X).
31
6. Células SiHa tratadas con dexametasona (Aumento 50X).
31
7. Células SiHa tratadas con diclofenaco (Aumento 50X).
31
8. Porcentaje de entrada adenoviral en células SiHa de los diferentes grupos
32
Resumen
Antecedentes. Los vectores adenovirales de terapia génica, pueden ser vistos como un
fármaco. Sin embargo, las interacciones farmacológicas de estos vectores con otros
medicamentos han sido escasamente estudiadas. Se ha reportado que un anti-inflamatorio
(dexametasona) es capaz de influir sobre la entrada de adenovirus en la célula in vitro.
Objetivo. Determinar si los anti-inflamatorios dexametasona, paracetamol, ketorolaco o
diclofenaco alteran la entrada de vectores adenovirales de terapia génica en células de cáncer
cérvico-uterino.
Materiales y Métodos. Células SiHa fueron agrupadas y tratadas con los anti-inflamatorios
anteriormente mencionados. La propagación y purificación del vector Ad-BGal así como su
exposición a las células y ensayos de entrada adenoviral se realizaron de acuerdo a las
especificaciones del manual AdeasyTM Vector System.
El análisis estadístico se realizó empleando la prueba ANOVA (resultado estadísticamente
significativo cuando p<0.05).
Resultados. Existe una alteración (aumento) en la entrada adenoviral en las células SiHa
tratadas con dexametasona (45.24% entrada adenoviral), paracetamol (40.22% entrada
adenoviral) y diclofenaco (54.78% entrada adenoviral).
Palabras Clave: Entrada adenoviral, anti-inflamatorios, terapia génica, vectores
adenovirales, Célula.
1
Abstract
Background. The adenoviral vectors for genetherapy, can be viewed as a drug. However,
these vectors drug interactions with other medicines have been poorly studied. It has been
reported that an anti-inflammatory (dexamethasone) is capable of influencing the entry of
Adenovirus in the cell in vitro.
Objective. To determine whether anti-inflammatory dexamethasone, paracetamol, ketorolac
or diclofenac alter the entry of adenoviral vectors for gene therapy in cervical cancer cells.
Materials and Methods. SiHa cells were grouped and treated with anti-inflammatory drugs
mentioned above. The propagation and purification of the vector Ad-BGal well as their
exposure to cells and adenoviral entrance tests were conducted according to the specifications
of the manual AdeasyTM Vector System. Statistical analysis was performed using the
ANOVA test (statistically significant when p <0.05p).
Results. Our results indicate a change in the entry of adenovirus into the cells after treatment
with dexamethasone, diclofenac and paracetamol.
Key Words: Adenoviral entry, anti-inflammatories, genetherapy, adenoviral vector, cell.
2
I.
INTRODUCCIÓN
Los adenovirus son agentes infecciosos que en el humano causan comúnmente enfermedades
de vías respiratorias, principalmente superiores. Sin embargo, también puede afectar múltiples
tejidos epiteliales, como las conjuntivas de los ojos. Estos virus, además de ser importantes
como patógenos que se encuentran en el ambiente, también toman relevancia por ser uno de
los vehículos mas usados en una nueva modalidad de terapia biotecnológica, la terapia
génica.1,2
La terapia génica se puede definir como la modalidad de tratamiento en la cual se introduce
material genético en la célula para añadir o modificar sus funciones3. De forma muy general,
se puede decir que la terapia génica requiere: un gen terapéutico, un método para introducir
éste a las células blanco y la expresión subsecuente del mismo en dichas células4. Existe una
enorme variedad de posibles aplicaciones de este tipo de terapia, pues ésta tiene el potencial de
corregir defectos genéticos, combatir infecciones o destruir tumores5.
Las secuencias génicas funcionales son colocadas en vectores, los cuales sirven como
vehículos que transportarán estas secuencias al interior de la célula. Los adenovirus son uno de
los vectores más usados en la actualidad, sobre todo en la lucha contra el cáncer6.
Cuando un vector adenoviral es introducido en el organismo para tratar una neoplasia, su
tropismo natural tiende a concentrarlo en hígado, aunque su distribución es muy amplia en los
diferentes órganos y tejidos del cuerpo7.
Los vectores adenovirales de terapia génica, pueden ser vistos como un fármaco. Sin embargo,
las interacciones farmacológicas de estos vectores con otros medicamentos han sido
escasamente estudiadas. Recientemente, dos reportes han mencionado que un antiinflamatorio esteroideo (dexametasona) es capaz de influir in vitro en la entrada de los
vectores adenovirales a células de cáncer cérvico-uterino. Sin embargo, los resultados de estos
dos reportes son contradictorios, pues un reporte dice que incrementa la entrada de estos
vectores a las células41, en tanto que otro menciona que la disminuye40.
3
A pesar de que los anti-inflamatorios son ampliamente usados para tratar la sintomatología de
infecciones naturales de adenovirus o dentro de protocolos de terapia génica, no existen otros
estudios que arrojen información sobre el efecto que tienen los anti-inflamatorios en la entrada
adenoviral a la célula.
Por lo anterior, en el presente proyecto nos propusimos estudiar el efecto que tienen sobre la
entrada adenoviral, en la célula, varios anti-inflamatorios de uso común en la práctica clínica
(paracetamol, diclofenaco, ketorolaco y dexametasona). Para ello usamos un vector adenoviral
no replicativo, portador de un gen reportero (que facilita el rastreo del virus) en un modelo
similar a los previamente reportados, células de cáncer cérvico-uterino (CaCU) 40,41.
4
II.
II . I
MARCO TEÓRICO
Terapia Génica: Panorama General
Desde la antigüedad la humanidad ha buscado distintas formas de combatir la enfermedad. La
terapia génica se ha desarrollado como un método de acercamiento al tratamiento de las
enfermedades humanas basado en la transferencia de material genético a las células de un
individuo. Habitualmente la finalidad de esta transferencia de material genético es restablecer
una función celular que estaba abolida o defectuosa, introducir una nueva función o bien
interferir con una función existente. La única modalidad de terapia génica en desarrollo es la
dirigida a células somáticas, no germinales, lo que asegura que la transferencia sólo afecte al
individuo en tratamiento y no a su descendencia. Las distintas estrategias de la terapia génica
se basan en la combinación de tres elementos clave, el material genético a transferir, el método
de transferencia y el tipo celular que incorporará dicho material genético1.
Tras el descubrimiento de la estructura del ADN por Watson y Crick, en los años 70 se
desarrolló la tecnología del ADN recombinante, que dio lugar a unos conocimientos básicos y
unas herramientas que permitían transferir genes al interior de las células. Inicialmente esta
tecnología fue empleada en el campo de las ciencias básicas para investigar funciones
biológicas, tanto in vivo como in vitro, pero pronto se vio que la transferencia génica tenía un
gran potencial en el tratamiento de enfermedades humanas. En 1990, la terapia génica fue
usada por primera vez con intención terapéutica en un paciente que padecía una
inmunodeficiencia severa por un déficit de adenosina desaminasa. El error genético de sus
linfocitos se corrigió ex vivo por transferencia génica y estos linfocitos ya corregidos se le
reinfundieron1. A partir de este momento la terapia génica presentó un enorme desarrollo
durante la década de los 90, con más de 400 ensayos clínicos en todo el mundo. Aunque
inicialmente la atención se centró en el tratamiento de las enfermedades hereditarias
monogénicas, posteriormente la mayor parte de los ensayos clínicos de terapia génica se
enfocaron al tratamiento del cáncer. La trágica muerte de un joven de 18 años que participaba
en uno de estos ensayos clínicos supuso un duro golpe que generó alarma en todo el mundo.
Sin embargo, la terapia génica continuó y a finales de los 90 se produjo el primer éxito
terapéutico: un grupo de niños con inmunodeficiencia combinada severa (causada por la
5
mutación en el gen que codifica la cadena gamma común), fueron tratados en Francia
mediante la transferencia ex vivo a células de su médula ósea de la versión correcta del gen
alterado. Todos los pacientes mejoraron su capacidad inmune, lo que les permitió vivir en un
ambiente normal2. Poco después se observó que el éxito no había sido completo puesto que
dos de estos niños desarrollaron leucemia aguda por la activación de un oncogén debido a la
inserción aleatoria del material genético terapéutico en el genoma de las células corregidas.
Fue otro duro golpe que endureció las reglas para realizar terapia génica, pero se había dado
un paso definitivo: la terapia génica humana es factible y puede ser útil3.
II . II
Estrategias para hacer Terapia Génica
La terapia génica se define como el tratamiento o prevención de una enfermedad a través de la
incorporación a la célula de secuencias nucleotídicas (generalmente genes) que corrigen o
incorporan una función. Las secuencias génicas funcionales son colocadas en vectores, los
cuales sirven como vehículos que transportarán estas secuencias al interior de la célula. Los
vectores pueden ser no virales (ADN desnudo, ADN envuelto en lípidos catiónicos, ADN
condensado en partículas) o pueden ser virus modificados y sin capacidad replicativa (herpes,
adenovirus, adeno-asociados, lentivirus, retrovirus, etc)4. Cada vector
tiene diferentes
características, variando en su tropismo, duración de la expresión génica (integración o no a
cromosomas celulares), inmunogenicidad, entre otras, lo cual permite seleccionar al vector que
mejor cumpla las metas terapéuticas en una enfermedad en particular5. Sin embargo, los
vectores más utilizados en terapia génica son los adenovirus6.
Los adenovirus son una familia de virus de DNA capaces de infectar tanto a células que están
en división como a las que no lo están. Son causa frecuente de las infecciones de las vías
respiratorias superiores conocidas comúnmente como resfriados, así como también en
conjuntivas de ojos. Además, provocan también otras infecciones que originan enfermedades
gastrointestinales pero, en general, se consideran poco patógenos para el hombre. Estos virus
fueron aislados por primera vez en 1953 por investigadores que trataban de establecer líneas
celulares a partir de tejidos provenientes de adenoides de niños7,8.
Se han identificado más de 40 diferentes serotipos de adenovirus en seres humanos, de los
cuales los serotipos 2 (Ad2) y 5 (Ad5) son los más estudiados y utilizados como vectores de
6
terapia génica, ya que son fáciles de trabajar y su manejo no representa un riesgo para la
salud9.
La terapia génica contra el cáncer generalmente utiliza vectores virales que transportan genes
para re-convertir las células neoplásicas a un fenotipo no maligno (corrección fenotípica)10, o
para estimular su eliminación por el sistema inmune (inmunoterapia)11, o inhibir la
neoangiogénesis tumoral, o para eliminarlas por un efecto directo producido por genes tóxicos
o pro-apoptóticos.
Sin embargo, inicialmente la terapia génica en contra del cáncer presentó varios
inconvenientes en su eficiencia terapéutica. Una de sus principales limitantes fue la poca
diseminación intratumoral de los vectores virales no replicantes. Con el objetivo de superar
esta limitación, en la última década ha tomado auge una nueva estrategia terapéutica,
denominada viroterapia o terapia viral oncolítica. La viroterapia usa una gran variedad de
vectores virales, pero a diferencia de la terapia génica con vectores de primera generación, en
donde los vectores virales no se replican, en la viroterapia se emplean vectores virales con
capacidad replicativa y la muerte de la célula neoplásica sobreviene por efecto de la propia
replicación viral12.
II . III
Vectores adenovirales: Descripción, genoma y propiedades.
El genoma viral es lineal y tiene una longitud de aproximadamente 36 kpb, conteniendo cinco
genes de transcripción temprana (E1A, E1B, E2, E3 y E4), dos unidades tempranas retrasadas
(IX y IVa2) y cinco genes tardíos (L1 a L5). Todos los productos de estos genes tienen una
función dentro del ciclo replicativo, pero sin duda el gen E1A es el más importante en el
contexto de la terapia viral, ya que son los que tienen una función reguladora sobre el ciclo
lítico adenoviral13.
7
II . IV El gen E1A
Los dos procesos más importantes en la replicación adenoviral son la progresión hacia la fase
S del ciclo celular y la síntesis de productos virales que intervienen en la replicación. Para que
estos dos procesos se lleven a cabo, se requiere que la proteína E1A active a la mayoría de los
genes adenovirales. La expresión del gen E1A es controlada por un promotor constitutivo muy
activo denominado “repetición invertida terminal”, localizado en el extremo 5´ del genoma
adenoviral (ITR-5’, por sus siglas en inglés). La falta de expresión o la deleción del gen E1A
hacen que un adenovirus sea incompetente para la replicación14.
II. V
Entrada de Adenovirus a la Célula
Los adenovirus se unen a las células por medio de sus fibras proteínicas, las cuales reconocen
a unos receptores de 46 kDa llamados CAR (del inglés, coxsackie-virus and adenovirus
receptor). Así se internalizan en la célula. Los mecanismos por los cuales se regula la
expresión de CAR en diferentes tipos de células así como su interacción en las funciones
normales de éstas no han sido determinadas15.
El dominio extracelular de CAR contiene dos dominios de tipo inmunoglobulina (Ig) pero sólo
el dominio N-terminal es el que se necesita para que interactúe con el adenovirus16. Se han
realizado estudios en varias líneas celulares que evidencian que CAR es el principal
determinante en la infección adenoviral in vivo. Por ejemplo, la expresión de CAR es
particularmente alta en tejido cardiaco17 que se correlaciona con una eficiente transducción
adenoviral en el corazón in vivo18-19. En contraste, la expresión de CAR es baja o ausente en
fibroblastos humano primarios así como en la mayoría de células hematopoyéticas20-21 en la
que es difícil la infección por adenovirus22. Otros investigadores han reportado que en ciertas
condiciones de cultivo celular se puede alterar la expresión de CAR y por ende esto puede
influir en la transducción adenoviral.
Además, los adenovirus también interactúan de manera secundaria a través de las bases
pentonas con las integrinas células alfavbeta3 y alfavbeta5, que facilitan la internalización del
virus (figura 1).
8
Esta entrada de adenovirus también requiere la participación de moléculas de señalización de
la célula, como el fosfatidilinositol 3-OH quinasa23. Estas proteínas de señalización forman un
complejo que promueve la polimerización de filamentos de actina necesarios para que la
entrada adenoviral sea eficiente. Resumiendo, se puede decir que la entrada de los adenovirus
a la célula depende principalmente de la presencia del CAR en la membrana de la célula,
aunque las integrinas también influyen en este proceso.
Figura 1. Entrada de adenovirus a la célula. (Tomada de Juan L. Contreras)24 Inicialmente, el
adenovirus se une a receptores de membrana específicos de la célula, CAR, mediante sus fibras
proteicas. En esta interacción también participan las integrinas de la célula, las cuales se adhieren a las
pentonas del adenovirus. Luego, mediante endocitosis, el adenovirus logra su internalización para
posteriormente ingresar al núcleo celular e iniciar su expresión.
CAR está expresado en muchos tejidos y su abundancia determina la vulnerabilidad de los
órganos a las infecciones virales25. Como ejemplo podemos mencionar que el corazón tiene
una gran cantidad de CAR. Estudios recientes sugieren que ciertos padecimientos, como la
cardiomiopatía dilatada, pueden ser consecuencia de infecciones por virus que utilizan a CAR
como puerto de entrada a los miocitos cardiacos. Como los coxsackievirus y adenovirus
comparten a CAR como su receptor, son considerados agentes infecciosos importantes de
cardiomiopatía dilatada y miocarditis crónica. En dichas enfermedades existe una sobreexpresión de CAR, lo cual podría estar relacionada con una infección viral persistente del
miocardio26,27. Por el contrario, las células hematopoyéticas tienen una muy baja expresión de
CAR, lo cual concuerda con la pobre capacidad de los adenovirus para infectar a estas células.
Como se menciona, la cantidad de CAR es muy variada en diversos tejidos. En cáncer, por lo
general CAR esta sobre-expresado, aunque también hay excepciones28,29,30,31,32. El control de
la expresión de CAR en células neoplásicas puede deberse a cambios epigenéticos, como la
acetilación de histona33. Sin embargo, citoquinas inflamatorias, abundantes en cáncer, también
sobre-regulan la expresión de CAR en células de carcinoma. Entre estas citoquinas
inflamatorias destaca el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa)34.
II. VI
TNF-alfa
Es un importante mediador de las reacciones inflamatorias y parece jugar un rol central en la
patogénesis de varias enfermedades inflamatorias crónicas35.
TNF-alfa o Caquexina es una de las dos formas del factor de necrosis tumoral (TNF), éste es
una citoquina proinflamatoria, descubierta inicialmente en el suero de ratones luego de la
infección con endotoxinas bacterianas. Más tarde, esta misma citoquina fue encontrada
igualmente en ratas, conejos y en el hombre36,37.
TNF-alfa tiene una importante actividad proinflamatoria38. Esta citoquina es secretada
principalmente por células del sistema inmune, como los monocitos, macrófagos, neutrófilos,
células NK y linfocitos T CD4+. Otras células, tales como astrocitos, microglías, miocitos y
fibroblastos pueden producirlo como respuesta a un estímulo36,37.
La síntesis del TNF-alfa puede ser inducida por virus, parásitos, bacterias, células tumorales,
isquemia, trauma e irradiación, así como por citoquinas tales como el interferón-gamma (IFNg), la interleuquina (IL)-1, IL-2, IL-12, el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF), el factor activador de plaquetas (PAF) y el mismo TNF-alfa,36,38. El
efecto pleitrópico del TNF-alfa tiene como resultado la síntesis de citoquinas [IL-1, IL-2, IL-4,
IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN-g, factor de crecimiento y trasformación-beta (TGF-b)], PAF,
leucotrienos, proteínas de fase aguda y hormonas (cortisol, epinefrina, glucagón, insulina,
9
norepinefrina). Muchos de los mediadores inducidos por el TNF-alfa actúan a su vez como
inhibidores de su expresión, tales como la IL-6, IL-10, la prostaglandina E2 y el cortisol36-38.
Además, TNF-alfa ha sido reconocido como un factor fisiopatogénico importante en la
iniciación y persistencia de cardiomiopatías inflamatorias. Estudios experimentales en
humanos han demostrado que TNF-alfa juega un papel crucial en la miocarditis inducida por
infección viral de cualquier etiología39.
Como lo demuestra la literatura, TNF-alfa incrementa la expresión de CAR en la línea celular
HeLa y en células de cáncer de ovario40. Luego entonces, si TNF-alfa aumenta los niveles de
expresión de CAR (e integrinas), y siendo éste el receptor responsable de unión y consecuente
internalización de adenovirus a la célula, la entrada de adenovirus a la célula sería mayor. En
este sentido, la alteración en los niveles de TNF-alfa puede ser propiciada por una interacción
farmacológica. Los anti-inflamatorios, como la dexametasona, son capaces de alterar la
expresión de TNF-alfa o de los metabolitos, como citoquinas, que influyen en su expresión.
Tomando en cuenta lo anterior, es probable que los anti-inflamatorios puedan influir en la
expresión de CAR a través de esta vía, y por ende influir sobre la entrada de virus a la célula.
Sin embargo, esta hipótesis solo ha sido comprobada en el caso de la dexametasona, donde
existen reportes contradictorios al respecto40,41.
II. VII
Efecto de la dexametasona sobre la entrada de adenovirus a la célula
En un estudio realizado en 200140 se describió que el tratamiento en las líneas celulares de
cáncer cérvico-uterino, cáncer ovárico y glioblastoma con dexametasona produce una
disminución de la entrada de adenovirus a las células. Se demostró que la dexametasona fue
capaz de alterar los niveles celulares de TNF-alfa y TNF-beta y, que éstos a su vez alteran los
niveles de los diferentes receptores necesarios para la entrada de adenovirus, como CAR e
integrinas de unión adenoviral. Sin embargo, el efecto de la dexametasona sobre los niveles de
TNF-alfa o TNF-beta, CAR e integrinas varío según la línea celular estudiada. Este reporte
dejó claro que un anti-inflamatorio, como la dexametasona y los niveles de TNF son capaces
de alterar la entrada de adenovirus a las células.
10
Otro estudio aun más reciente (2008)41, retoma el tema y encuentra un resultado contradictorio
con lo previamente reportado. Estudiando cuatro líneas celulares de cáncer cérvico-uterino,
encontraron de manera consistente que la dexametasona incrementa la entrada adenoviral a las
células para vectores carentes de replicación. Este estudio vuelve a evidenciar que la
dexametasona puede influir sobre la eficacia de tratamientos con vectores adenovirales de
terapia génica. Más aun, aunque sólo se realizaron experimentos con dexametasona, se sugiere
que los anti-inflamatorios en general podrían alterar la eficacia de tratamientos de terapia
génica. Sin embargo, hasta la fecha no existen reportes sobre la influencia de otros antiinflamatorios sobre la entrada adenoviral sobre células de cáncer cérvcio-uterino (CaCU) o
cualquier otro tipo celular.
En general, existen pocos reportes que han estudiado cualquier aspecto relacionado entre antiinflamatorios e infecciones adenovirales. Aunque ya hemos mencionado que no existe nada
adicional a lo mencionado sobre la entrada adenoviral y anti-inflamatorios, es pertinente
mencionar que la prednisona, pero no el ketorolaco y diclofenaco, prolonga el tiempo de
diseminación adenoviral en keratoconjuntivitis, probablemente por disminuir una respuesta
inmunológica. También se ha reportado que el ketorolaco y diclofenaco no interfieren con la
terapia antiadenoviral con cidofovir en keraoconjuntivitis. Aunque pareciera que el ketorolaco
y diclofenaco no interfirieran con la infección adenoviral, es importante mencionar que estos
estudios se hicieron en infecciones leves y no se podría extrapolar su poca o nula intervención
en la infección adenoviral en el contexto de una infección grave o en presencia de las masivas
dosis de vectores adenovirales (hasta 2x1012 partículas virales) aplicadas rutinariamente en
protocolos de terapia génica42.
II. VII. I
Dexametasona. Generalidades
La dexametasona es un glucocorticoide 25 veces más potente que la hidrocortisona; tiene
menor efecto sobre la retención de sodio que ésta y sus derivados. Se absorbe efectivamente
cuando se administra por vía intramuscular (I.M.), con una disponibilidad casi inmediata y se
excreta por la orina. Se liga a las proteínas del plasma el 68% con una vida media de 3-4 horas
y vida media biológica de 36 a 54 horas. El volumen de distribución es 0.75 L/Kg; se liga
linealmente a la albúmina, pero no se liga a la transcortina. Inhibe la producción de
11
interleucinas 1 y 2, y el mediador de proliferación de linfocitos-T que normalmente se produce
en la exposición de mitógenos. Estos efectos se consideran la base de su efecto antiinflamatorio y bloqueador de la respuesta inmune. Se alcanzan concentraciones plasmáticas
máximas medias de 1.25 ng/mL43.
II. VII. II
Mecanismo de Acción
Los glucocorticoides son hormonas naturales que previenen o suprimen las respuestas
inmunes e inflamatorias cuando se administran en dosis farmacológicas. Los glucocorticoides
libres cruzan fácilmente las membranas de las células y se unen a unos receptores
citoplasmáticos específicos, induciendo una serie de respuestas que modifican la transcripción
y, por tanto, la síntesis de proteínas. Estas respuestas son la inhibición de la infiltración
leucocitaria en el lugar de la inflamación, la interferencia con los mediadores de la
inflamación y la supresión de las respuestas inmunológicas. La acción antiinflamatoria de los
glucocorticoides implica proteínas inhibidoras de la fosfolipasa A2, las llamadas lipocortinas.
A su vez, las lipocortinas controlan la biosíntesis de una serie de potentes mediadores de la
inflamación como son las prostaglandinas y los leucotrienos. Algunas de las respuestas de los
glucocorticoides son la reducción del edema y una supresión general de la respuesta
inmunológica. Los glucocorticoides inhalados disminuyen la síntesis de la IgE, aumentan el
número de receptores beta-adrenérgicos en los leucocitos y disminuyen la síntesis del ácido
araquidónico. En consecuencia, son eficaces en el tratamiento del asma bronquial crónico y las
reacciones alérgicas44.
II. VIII
Anti-inflmatorios de uso común
Además de la dexametasona hay otros fármacos, entre ellos los anti-inflamatorios no
esteroideos (AINEs), responsables también de alteraciones en los niveles de TNF-alfa46-48,51.
Estos fármacos son ampliamente usados en la práctica clínica y poco o nada se ha estudiado de
su interacción con adenovirus. Los AINEs y el paracetamol incluyen un grupo de fármacos
con estructuras químicas diferentes que son, junto a la medicación coadyuvante, el primer
escalón del tratamiento del dolor (según la Organización Mundial de la Salud – OMS –) o que
complementa la analgesia en los demás escalones. Estos medicamentos poseen un mecanismo
de acción periférico sobre el proceso inflamatorio y doloroso45.
12
Varios autores han reportado que el paracetamol incrementa significativamente los niveles de
TNF-alfa46-48. De aquí la importancia que podrían tener éste y otros fármacos, de uso muy
común en la clínica (como el diclofenaco y ketorolaco), y su influencia en la alteración de los
niveles de TNF-alfa y, esto a su vez sobre la expresión de CAR.
II. VIII. I
Paracetamol. Generalidades
El paracetamol es un analgésico-antipirético perteneciente al grupo de las fenacetinas. Es
absorbido rápidamente por el tracto gastrointestinal, alcanzando su máxima concentración
plasmática de 30 a 120 minutos después de su administración oral. Tiene una vida media de 1
a 4 horas y la duración de su efecto es entre 3 y 4 horas; se metaboliza en el hígado,
conjugándose primariamente con el ácido glucurónido; se elimina por excreción urinaria en
forma de metabolitos y cerca de 3% como paracetamol inalterado. La bibliografía y los
estudios clínicos revelan un efecto aditivo y potenciador entre ambas sales, con lo que se logra
un efecto analgésico, anti-inflamatorio y antipirético más prolongado, que se presenta en
menor tiempo43. Alcanza concentraciones plasmáticas máximas medias de 20 µg/mL49.
II. VIII. I. I
Mecanismo de acción
El paracetamol aumenta el umbral al dolor inhibiendo las ciclooxigenasas en el sistema
nervioso central, enzimas que participan en la síntesis de las prostaglandinas. Sin embargo, el
paracetamol no inhibe las ciclooxigenasas en los tejidos periféricos, razón por la cual carece
de actividad antiinflamatoria. El paracetamol también parece inhibir la síntesis y/o los efectos
de varios mediadores químicos que sensibilizan los receptores del dolor a los estímulos
mecánicos o químicos50.
Además, dentro de esta amplia gama de anti-inflamatorios usados ampliamente en la práctica
clínica se encuentran el ketorolaco y diclofenaco, que han estado en el mercado durante
muchos años, y los cuales son inhibidores de la ciclooxigenasa (COX) y se ha comprobado
que son capaces de aumentar el TNF-alfa51.
13
II. VIII. II
Ketorolaco. Generalidades
Ketorolaco trometamina es un agente anti-inflamatorio no esteroideo, que muestra actividad
analgésica y débil actividad antiinflamatoria y antipirética. Su mecanismo de acción consiste
en la inhibición de la síntesis de ciclooxigenasa y por consiguiente de la síntesis de
prostaglandinas y, no tiene ningún efecto sobre los receptores de los opiáceos. Se absorbe en
forma rápida y completa después de la administración oral. La vida media plasmática es de 5.3
horas en los adultos jóvenes y de 6.1 horas, en sujetos de edad avanzada (promedio 72 años).
La farmacocinética es semejante en niños. Más del 99% del fármaco en plasma está unido a
proteínas. Una dieta alta en grasas disminuye la velocidad, pero no el grado de absorción,
mientras que los antiácidos no tuvieron efecto sobre la absorción de ketorolaco. La
administración intravenosa (I.V.) de 10 mg de ketorolaco, tiene una concentración máxima
(Cmáx) de 2.4 µg/ml, con una vida media de eliminación, volumen de distribución y
depuración plasmática muy similares a los producidos por otras formas farmacéuticas. La
farmacocinética de ketorolaco es lineal. Los niveles plasmáticos en estado de equilibrio se
alcanzan después de 24 horas de aplicarlo cada 6 horas. No se presentan cambios en la
depuración con la administración crónica. La principal vía de excreción de ketorolaco y sus
metabolitos (conjugados y un metabolito parahidroxi), es la orina (61%); el resto es excretado
por la bilis. Ketorolaco atraviesa muy poco la barrera hematoencefálica43.
II. VIII. II. I
Mecanismo de acción
Inhibe la actividad de la ciclooxigenasa, y por tanto la síntesis de prostaglandinas. A dosis
analgésicas, efecto anti-inflamatorio menor que el de otros AINEs52.
II. VIII. III
Diclofenaco. Generalidades
Tras la administración de 75 mg de diclofenaco por vía intramuscular, la absorción se produce
de inmediato y se alcanzan concentraciones plasmáticas máximas medias de unos 2.5 µg/mL
(8 µmol/L) al cabo de unos 20 minutos. La cantidad absorbida es directamente proporcional a
la dosis. Diclofenaco un anti-inflamatorio no esteroideo con notables propiedades
antirreumáticas, antiinflamatorias, analgésicas y antipiréticas. Se considera que el mecanismo
de acción fundamental es la inhibición de la síntesis de prostaglandinas, que se ha demostrado
de forma experimentalmente. Las prostaglandinas desempeñan una función importante en la
patogenia de la inflamación, el dolor y la fiebre. In vitro, el diclofenaco sódico no suprime la
biosíntesis de proteoglucanos en el cartílago en concentraciones equivalentes a las que se
alcanzan en humanos43.
II. VIII. III. I
Mecanismo de acción
Diclofenaco sódico es un anti-inflamatorio no esteroideo con notables propiedades
antirreumáticas, antiinflamatorias, analgésicas y antipiréticas. Se considera que el mecanismo
de acción fundamental es la inhibición de la enzima ciclooxigenasa, inhibiendo la síntesis de
prostaglandinas (PGE2, PGF2 y G-KETOPGF1), responsables de los cambios vasculares y
celulares en el tejido inflamado. Esto se ha demostrado de forma experimentalmente. Las
prostaglandinas desempeñan una función importante en la patogenia de la inflamación, el
dolor y la fiebre. In vitro, el diclofenaco sódico no suprime la biosíntesis de proteoglucanos en
el cartílago en concentraciones equivalentes a las que se alcanzan en humanos53.
Lo anteriormente expuesto refleja una oportunidad para probar los mencionados antiinflamatorios, de uso común en la clínica, en células y ver su respectiva interacción con la
entrada adenoviral en las mismas.
14
III.
JUSTIFICACIÓN
La viroterapia ha contribuido enormemente en el campo de la medicina al implementarse
como una nueva herramienta para tratar graves padecimientos, principalmente en el caso del
cáncer6 y enfermedades degenerativas, observándose
importantes resultados empleando
vectores adenovirales7-9. El mecanismo de acción ideal de un vector es su replicación
adenoviral en la célula blanco, causando así una lisis celular. Para que esto suceda,
inicialmente el vector adenoviral debe introducirse a la célula, lo cual se logra mediante la
interacción de las fibras de proteína (o pentonas) del vector con los receptores CAR
(coxsackie-virus and adenovirus receptor) de la célula. Los receptores CAR son indispensables
para una transducción e infectividad eficaz adenoviral17.
Los vectores adenovirales de terapia génica, pueden ser vistos como un fármaco. Sin embargo,
las interacciones farmacológicas de estos vectores con otros medicamentos han sido
escasamente estudiadas. Recientemente, dos reportes han indicado que un anti-inflamatorio
esteroideo (dexametasona) es capaz de influir in vitro en la entrada de los vectores
adenovirales a células de cáncer cérvico-uterino40,41. Sin embargo, los resultados de estos dos
reportes son contradictorios, pues uno dice que incrementa la entrada, en tanto que otro
menciona que disminuye la entrada de estos vectores a la célula. A pesar de que los antiinflamatorios son ampliamente usados en infecciones naturales de adenovirus o dentro de
protocolos de terapia génica, no existen otros estudios que arrojen información sobre el efecto
que tienen anti-inflamatorios en la entrada adenoviral.
Por lo anterior en el presente proyecto nos propusimos estudiar el efecto que varios antiinflamatorios de uso común en la práctica clínica (paracetamol, diclofenaco, ketorolaco y
dexametasona) tienen sobre la entrada celular de adenovirus. Para ello usamos un vector
adenoviral no replicativo Ad-BGal, portador de un gen reportero (que facilita el rastreo del
virus) en modelos similares a los previamente reportados, en células de cáncer cérvico-uterino.
15
IV. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿Los anti-inflamatorios dexametasona, paracetamol, ketorolaco o diclofenaco son capaces de
alterar la entrada de vectores adenovirales de terapia génica en células de cáncer cérvicouterino?
16
V. HIPÓTESIS
V.I
De trabajo:
Los anti-inflamatorios dexametasona, paracetamol, ketorolaco o diclofenaco son capaces de
alterar la entrada de vectores adenovirales de terapia génica en células de cáncer cérvicouterino
V . II
Nula:
Los anti-inflamatorios dexametasona, paracetamol, ketorolaco o diclofenaco no son capaces
de alterar la entrada de vectores adenovirales de terapia génica en células de cáncer cérvicouterino
17
VI. OBJETIVOS
VI . I
Objetivo General: Establecer si los anti-inflamatorios dexametasona, paracetamol,
ketorolaco o diclofenaco alteran la entrada de vectores adenovirales de terapia génica en
células de cáncer cérvico-uterino
VI . II Objetivos Específicos:
-
Comparar la entrada de vector adenoviral entre células de cáncer cérvico-uterino
(SiHa) pre-tratadas con dexametasona y células no expuestas al fármaco.
-
Comparar la entrada de vector adenoviral entre células de cáncer cérvico-uterino
(SiHa) pre-tratadas con paracetamol y células no expuestas al fármaco.
-
Comparar la entrada de vector adenoviral entre células de cáncer cérvico-uterino
(SiHa) pre-tratadas con ketorolaco y células no expuestas al fármaco.
-
Comparar la entrada de vector adenoviral en células de cáncer cérvico-uterino (SiHa)
pre-tratadas con diclofenaco y células no expuestas al fármaco.
18
VII. METODOLOGÍA
VII . I Diseño
Estudio experimental.
VII . II
Descripción de variables
Variable
Entrada de vector
Adenoviral
Relación
Dependiente
Naturaleza
Cuantitativa
Nivel de
medición
Indicador
Continua
Porcentaje de
células con vector
adenoviral
(% X-gal positivo)
Tratamiento con
Dexametasona
Independiente
Cualitativa
Nominal
Dicotómica
Si / No
Tratamiento con
Paracetamol
Independiente
Cualitativa
Nominal
Dicotómica
Si / No
Tratamiento con
Ketorolaco
Independiente
Cualitativa
Nominal
Dicotómica
Si / No
Independiente
Cualitativa
Nominal
Dicotómica
Si / No
Tratamiento con
Diclofenaco
19
VII. III
Purificación y propagación del vector Ad-BGal.
En esta primera etapa del experimento, para la producción de los adenovirus se emplearon las
células HEK-293 (células embrionarias de riñón humano), a 95-100% de confluencia. Estas
células se sembraron en frascos de cultivo conteniendo aproximadamente de 4 a 6x104 células
por cm2 en medio de cultivo DMEM, con alta glucosa, glutamina (4 mM), suero de ternera
fetal (10%) y antibiótico. Una vez que las células alcanzaron 95-100% de confluencia (de 2-4
días, aproximadamente), se procedió a exponerles el adenovirus para su consecuente
infección.
La completa infección celular por el adenovirus se hace evidente al observar grupos de células
flotantes en el medio (efecto citopático). El cultivo se recogió cuando todas las células tenían
forma redonda y había pocas flotantes. Esto sucedió al tercer día luego de exponer el
adenovirus a las células.
Una vez levantadas las células, en su medio de cultivo (todas fueron separadas mediante
agitación con ayuda de la pipeta), se pusieron en un tubo estéril de 50 mL, el cual fue
centrifugado a 1250 rpm durante 10 minutos. Después, se tomaron 10 mL de sobrenadante y el
resto se desechó. Se resuspendió el pelet en los 10 ml de sobrenadante que se tomaron
inicialmente. Luego, se realizaron tres ciclos de congelación/descongelación para lisar las
células y liberar el adenovirus.
NOTA: un ciclo consta en mantener las células a -70°C hasta que estén totalmente congeladas
y luego pasarlas a baño maría a 37°C hasta descongelar.
Después de la última descongelación, se centrifugó el lisado a 2000 rpm durante 10 minutos
para clarificar la solución para luego pasar el sobrenadante a otro tubo nuevo de 50 mL.
Luego, se añadieron 10mL de nucleasa benzonasa a la solución de adenovirus y se incubó a
37°C durante 30 minutos. Esto para digerir los ácidos nucleicos celulares.
A continuación, se agregaron 10 mL de buffer de dilución A al sobrenadante y se mezcló, e
inmediatamente después se realizó una filtración a través de un acrodisco utilizando una
jeringa para clarificar y eliminar los desechos.
20
Después, esta solución se sometió a una segunda filtración a través del filtro de purificación,
donde las partículas adenovirales son retenidas por dicho filtro, el cual posteriormente se lavó
con buffer B y luego el virus se separó del filtro mediante una jeringa que contenía buffer C.
Finalmente, se añadió glicerol al 10% de la concentración final y se conservaron a -70°C para
su posterior utilización61.
VII. IV
Células SiHa y administración de los fármacos anti-inflamatorios.
En placas de 24 pozos se colocaron 1x105 células SiHa por mL, en medio DMEM (1% suero
bovino fetal). Seis horas después, ya adheridas las células a la superficie del pozo, fueron
expuestas a un fármaco a las concentraciones plasmáticas máximas promedio en humanos
reportadas en la literatura:
Dexametasona43: 1.25 ng/mL
Paracetamol49: 20 µg/mL
Ketorolaco43: 2.4 µg/mL
Diclofenaco43: 5 µg/mL
Control: sin fármaco.
Se emplearon estas concentraciones debido a que se simuló un modelo que fuera lo más
parecido en el campo clínico. Las concentraciones seleccionadas para los ensayos in vitro son
similares a las concentraciones plasmáticas máximas alcanzadas a la dosis terapéuticas en
humanos. El grupo control, que no contenía ningún fármaco, sirvió como referencia de la
entrada adenoviral en la línea celular estudiada. Esta fase experimental se realizó por
triplicado.
Las células se mantuvieron en medio de cultivo DEMEM, 1% de suero bovino fetal (FBS) y
suplementado con L-glutamina, penicilina y estreptomicina a 37°C y 5% de CO2 en un
ambiente húmedo (95%) por 48 horas.
VII. V
Exposición del vector Ad-BGal.
Al cabo de las 36 horas de incubación con el fármaco (o sin él, en el caso del control), se les
retiró el medio de cultivo a cada pozo de células e inmediatamente después se agregó 1x107
21
partículas formadoras de unidades por mililitro (pfu/mL) de vector no replicativo Ad-BGal. Se
dejó en incubación por un periodo de 2 horas.
En seguida, se retiró el medio de cada pozo y se realizaron 3 enjuagues con 600 µL de medio
DMEM. Luego, se agregó a cada pozo 600 µL de DMEM 1% suero bovino fetal. Se
mantuvieron a 37°C y 5% de CO2 en un ambiente húmedo (95%) por 24 horas. De igual
manera, como en el apartado anterior, esta fase se realizó por triplicado.
VII. VI
Tinción X-Gal61
Luego de las 24 horas de incubación, se descartó el medio que contenía cada pozo e
inmediatamente después se procedió a enjuagar una vez con 300 µL de solución PBS 1X
(anexo 1). Después se agregó a cada pozo un volumen de 300 µL de la solución fijadora
glutaraldehído 0.05% (anexo 2). Se dejaron a temperatura ambiente por 10 minutos.
Se retiró la solución fijadora y se hicieron tres enjuagues por cada pozo con solución PBS 1X.
En cada enjuague, la solución se dejó reposando por 5 minutos para después ser retirado.
Inmediatamente después, se agregaron en cada pozo 380 µL de la solución X-gal. Se
incubaron durante toda la noche a 37°C. Las células positivas se tiñeron de azul (anexo 3).
Una vez teñidas, las placas se cubrieron con papel aluminio y se almacenaron a 4°C. Estos
ensayos se realizaron por triplicado.
VII. VII
Cuantificación (entrada de adenovirus)
Para determinar el porcentaje de entrada del vector Ad-Bgal, en las células SiHa tratadas, se
llevó a cabo un conteo celular microscópico con un aumento de 400X empleando la siguiente
fórmula:
% Entrada adenovirus =
Células positivas por campo
(100)
Total de células
Se contó con 15 campos visuales microscópicos de cada uno de los pozos tratados con los
respectivos fármacos (dexametasona, diclofenaco, paracetamol y ketorolaco) y el del grupo
control (sin medicamento). Estos 15 campos provinieron de tres experimentos independientes.
22
En cada campo visual se contó de manera directa a las células positivas y negativas (células
sin tinción) a X-Gal, obteniendo así un porcentaje de positividad a X-Gal para cada campo.
Así, se obtuvieron 15 datos (porcentajes) por cada grupo de tratamiento.
VII. VIII
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se empleó el programa computacional SPSS versión 12. Para
determinar la normalidad de los datos se empleó el test de Kolmogorov-Smirnov. Luego, para
calcular las diferencias intergrupales se empleó la prueba paramétrica ANOVA para el análisis
estadístico de los datos con ajuste de Tukey. Nivel de significancia p<0.05.
La figura 2 muestra de manera general la secuencia del trabajo desarrollado para culminar el
presente proyecto.
Estrategia General
Placas P24. Cien mil
células SiHa/pozo
6h
Administración de
fármaco:
dexametasona,
paracetamol,
ketorolaco,
diclofenaco y
grupo control (sin
fármaco)
48 h
2 hr
24h
Cuantificación y
análisis de resultados
12 h
Exposición vector
1x107 pfu/mL
Fijación y tinción
Eliminar vector
restante. Enjuagues
Incubación
Incubación
Figura 2. Plan de trabajo general.
23
VIII. RESULTADOS
En la figura 3 se muestra, un campo con 50 aumentos, donde se observan las células SiHa
positivas (azul) correspondientes al grupo control (no expuesto a ningún anti-inflamatorio),
que evidencian que en su interior hay vector adenoviral. Entrada adenoviral: 30.79%
En la figura 4 se muestra, con 50 aumentos, un campo donde se observan las células SiHa
positivas (azul) correspondientes al grupo tratado con ketorolaco, que evidencian que en su
interior hay vector adenoviral, en cantidad similar al grupo control. Entrada adenoviral:
33.30%.
En la figura 5 se muestra, con 50 aumentos, un campo donde se observan las células SiHa
positivas (azul) correspondientes al grupo tratado con paracetamol, que evidencian que en su
interior hay vector adenoviral. Entrada adenoviral: 40.22%.
En la figura 6 se muestra, con 50 aumentos, un campo donde se observan las células SiHa
positivas (azul) correspondientes al grupo tratado con dexametasona, que evidencian que en su
interior hay vector adenoviral. Entrada adenoviral: 45.24%.
En la figura 7 se muestra, con 50 aumentos, un campo donde se observan las células SiHa
positivas (azul) correspondientes al grupo tratado con diclofenaco, que evidencian que en su
interior hay vector adenoviral. Entrada adenoviral: 54.78%.
Estos porcentajes de la entrada adenoviral se obtuvieron a partir de la media del total de las
observaciones porcentuales de entrada adenoviral de cada grupo.
24
Figura 3. Células SiHa control (50
aumentos).
Figura 5. Células SiHa tratadas con
paracetamol (50 aumentos)
Figura 4. Células SiHa tratadas con
ketorolaco (50 aumentos).
Figura 6. Células SiHa tratadas con dexametasona
(50 aumentos).
Figura 7. Células SiHa tratadas con diclofenaco
(50 aumentos).
25
Sí hubo diferencia estadísticamente significativa en la comparación de los distintos grupos
(p<0.05); excepto al comparar el grupo pre-tratado con ketorolaco con el control (p=0.404)
(cuadro 1).
Comparación de Grupos
P
Dexametasona vs Control
0,000
Paracetamol vs Control
0,000
Diclofenaco vs Control
0,000
Ketorolaco vs Control
0,404
Cuadro 1. Comparación Múltiple. Existe diferencia estadísticamente significativa entre los grupos
dexametasona, paracetamol y diclofenaco con respecto al grupo control (p<0.05); no hay diferencia
estadísticamente entre el grupo ketorolaco y el grupo control (p=0.404).
En la figura 8 se observa los distintos niveles de entrada de adenovirus a las células SiHa pretratadas con su respectivo anti-inflamatorio en comparación con el grupo control.
Figura 8. Porcentaje de entrada adenoviral en células SiHa de los diferentes grupos comparados con el
grupo control. Se muestra promedio y error estándar. Para=paracetamol; Dexa=dexametasona;
Keto=ketorolaco; Diclo=Diclofenaco. *Diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo
control p<0.05. (n=15).
26
IX. DISCUSIÓN
El presente trabajo indica que existe una alteración (aumento) de la entrada de adenovirus en
las células tratadas con dexametasona, paracetamol y diclofenaco. Esto coincide, en parte, con
los experimentos realizados por Kanerva41 et al., demostrando que en células SiHa se
incrementan los niveles de entrada de adenovirus previo tratamiento con dexametasona. Sin
embargo, los resultados son contrarios a los señalados por Brüning y Runnebaum, quienes
reportan que la dexametasona inhibe la entrada de vectores adenovirales, atribuido a una
reducción en los niveles de expresión de CAR e integrinas alfa5beta1 en células HeLa y
U87MG después de un tratamiento con dexametasona40.
La dexametasona ya ha demostrado que incrementa el tiempo de eliminación del adenovirus
en mucosas nasales y conjuntivales. Sin embargo, trabajos previos sugieren que esto es debido
a una disminución de la respuesta inmune en contra de la infección63. Sin embargo, aquí se
demostró que la dexametasona propicia una mayor entrada de adenovirus a la célula, por lo
que probablemente esto pueda ser otra causa que alargue la infección. Sobre el diclofenaco
paracetamol y ketorolaco no existen reportes previos sobre su efecto en la entrada de los
adenovirus a las células.
Los grupos celulares tratados con los AINEs: paracetamol y diclofenaco, presentaron un
incremento de la entrada adenoviral. Es sabido que el mecanismo de acción de los AINEs se
basa en la inhibición de ciclooxigenasas, impidiendo la formación de prostaglandinas; mas sin
embargo, de manera directa o indirecta estos aintiinflamatorios producen un incremento en
otros mediadores de la inflamación, como lo es TNF-alfa. Este aumento propiciado por los
AINEs podría traer a su vez un incremento en la expresión de CAR y por ende, una mayor
entrada de adenovirus en la célula 42,56,61. Aunque el presente trabajo concuerda con esta última
idea, para el caso del paracetamol, dexametasona y diclofenaco, es una hipótesis que faltaría
por comprobar en futuros estudios. Por otra parte, a pesar de que el ketorolaco puede influir en
los niveles de TNF-alfa51, este no alteró la entrada de adenovirius a las células, por lo que
otras rutas metabólicas pueden intervenir en los complejos procesos que propician la entrada
de los adenovirus las células.
27
Adicionalmente, reportes previos indican que TNF-alfa incrementa la expresión de CAR en
células HeLa y en células de cáncer de ovario; pero la presencia de TNF-alfa en células de
glioma U87MG propicia la disminución de CAR. Esto demostró que TNF-alfa puede influir
de diferente manera sobre los niveles de expresión de CAR según el tipo célular40
Son pocos los estudios que tratan las interacciones farmacológicas de los adenovirus. Por tal
motivo hacen falta más ensayos que permitan observar el comportamiento de los adenovirus
en presencia de fármacos comunes, como los anti-inflamatorios Según el presente trabajo, se
puede generar la idea de que la mayoría de anti-inflamatorios podrían ser perjudiciales cuando
se combinan con altas concentraciones de adenovirus circulante, pues se estaría incrementando
la entrada de adenovirus en célula. Afortunadamente, la gran mayoría de infecciones
adenovirales son autolimitadas y quizás no presentan grandes cantidades de virus circulante
como para alterar el curso clínico de manera importante tras administrar algún AINE. Sin
embargo, la posibilidad podría existir en algunos pacientes. Lo anterior necesita ser
comprobado en futuros estudios. Existe un reporte que señala que infecciones adenovirales
graves, como encefalitis, ocurrieron en paciente tratados con paracetamol62. Sin embargo, el
paracetamol es tan comúnmente usado en infecciones adenovirales y las encefalitis por este
virus son tan escasas, que establecer una relación de causalidad entre paracetamol y encefalitis
sería muy difícil. En el presente trabajo se establece un precedente respecto a la posible
interacción entre AINEs y adenovirus en un tipo de células de CaCU, pero una gran cantidad
de estudios serían necesarios para poder establecer si los AINEs influyen en el mismo sentido
en otros tipos de células y si son capaces de modificar el curso clínico de una infección
adenoviral.
Por otra parte, estos resultados toman relevancia en el campo de la terapia génica contra el
cáncer, pues si se administra diclofenaco, paracetamol o dexametasona, de manera simultánea
a la terapia génica adenoviral en pacientes con neoplasias, hipotéticamente podría verse
potenciada su eficacia al aumentar la internalización a la célula de los vectores adenovirales.
Actualmente no existen ensayos reportados de terapia génica que prueben tal interacción
farmacológica con vectores adenovirales en cáncer. Esto representa una oportunidad para
28
explorar tal interacción farmacológica, que podría ser una herramienta factible para lograr una
mayor entrada, y por ende mayor infección de adenovirus terapéuticos en la célula.
El que más vectores ingresen a una célula también podría favorecer una toxicidad de manera
paralela. Como se mencionó anteriormente se tendrían que realizar estudios de toxicidad. Para
ello se emplearían líneas celulares sanas, por ejemplo, hepáticas para determinar si su
tropismo hacia el hígado se incrementa previo tratamiento con dichos fármacos. El presente
trabajo en el campo de la terapia génica deja dos vertientes en cuanto al uso de dexametasona,
paracetamol y diclofenaco; un posible aumento de la eficacia de la terapia, o bien, un aumento
de la toxicidad, ambos fenómenos como consecuencia de una mayor entrada de adenovirus a
la célula. Ambas hipótesis necesitan ser comprobadas en futuras investigaciones.
Finalmente, es importante mencionar, que el ketorolaco no alteró la entrada de adenovirus, por
lo que también se estaría reportando a un AINE que podría ser usado sin consecuencias
adversas durante las infecciones adenovirales, en caso de que en un futuro se compruebe que
los AINEs alteran el curso clínico de algún tipo de infección causada por estos virus.
29
X. CONCLUSIÓN
Se demostró que los anti-inflamatorios dexametasona, paracetamol y diclofenaco incrementan
los niveles de entrada de adenovirus en células SiHa, en tanto que el ketorolaco no ocasiona
cambios en este sentido.
30
XI. PERSPECTIVAS
Estos resultados sugieren que podría ser útil realizar ensayos similares en líneas celulares
sanas para determinar las posibles toxicidades e implicaciones clínicas.
Además, habría que considerar el uso de dexametasona, paracetamol y diclofenaco cuando
esté presente un padecimiento a causa de una infección adenoviral, pues no sería una
alternativa segura, ya que dichos fármacos podrían aumentar la entrada adenoviral a la célula;
en tanto que el ketorolaco podría ser una mejor alternativa. Sin embargo, más estudios son
necesarios para asegurar lo antes mencionado.
Otro aspecto importante a considerar es realizar ensayos en el campo de la terapia génica, ya
que interacciones farmacológicas podrían potenciar su eficacia o aumentar su toxicidad.
Otro aspecto a estudiar sería el mecanismo por el cual los anti-inflamatorios influyen sobre la
entrada de los adenovirus a las células.
31
GLOSARIO
ADN = Ácido Desoxirribonucleico: ácido nucleico formado por nucleótidos en los que el
azúcar es desoxirribosa, y las bases nitrogenadas son adenina, timina, citosina y guanina.
Excepto en los retrovirus que tienen ARN, el ADN codifica la información para la
reproducción y funcionamiento de las células y para la replicación de la propia molécula de
ADN. Representa la copia de seguridad o depósito de la información genética primaria, que en
las células eucarióticas está confinada en la caja fuerte del núcleo.
ADN desnudo: ADN desprovisto de cubierta proteínica o lipídica. Para la transferencia de
genes, suele estar constituida por un plásmido bacteriano que contiene el gen a transferir. Se
inyecta directamente en el tejido objetivo donde se expresa generalmente sin integrarse en el
genoma de las células huésped.
ADNr = ADN recombinante: molécula de ADN formado por recombinación de fragmentos
de ADN de orígenes diferentes. La (o las) proteína que codifica es una proteína recombinante.
Se construye mediante la unión de un fragmento de ADN de origen diverso a un vector, como,
por ejemplo, un plásmido circular bacteriano. El vector se abre por un sitio específico, se le
inserta entonces el fragmento de ADN de origen diverso y se cierra de nuevo. El ADN
recombinante se multiplica en una célula huésped en la que puede replicarse el vector.
Anti-inflamatorios No Esteroideos (AINEs): Son fármacos con efecto anti-inflamatorio,
analgésico y antipirético por lo que reducen los síntomas de la inflamación, el dolor y la fiebre
respectivamente. Los anti-inflamatorios naturales, segregados por el propio organismo, son los
corticoides, sustancias de origen esteroideo, de potente acción antiinflamatoria, pero de
importantes efectos secundarios. El término "no esteroideo" se aplica a los AINE para recalcar
su estructura química no esteroidea y la menor cantidad de efectos secundarios. Como
analgésicos se caracterizan por no pertenecer a la clase de los narcóticos y actúan bloqueando
la síntesis de prostaglandinas.
ARN = Ácido Ribonucleico: ácido nucleico formado por nucleótidos en los que el azúcar es
ribosa, y las bases nitrogenadas son adenina, uracilo, citosina y guanina. Actúa como
intermediario y complemento de las instrucciones genéticas codificadas en el ADN. Existen
32
varios tipos diferentes de ARN, relacionados con la síntesis de proteínas. Así, existe ARN
mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt) y un ARN
heterogéneo nuclear (ARN Hn). El ARN es normalmente el producto de la transcripción de un
molde de ADN, aunque en los retrovirus el ARN actúa de plantilla y el ADN de copia.
ARNm = ARN mensajero: molécula de ARN que representa una copia en negativo de las
secuencias de aminoácidos de un gen. Las secuencias no codificantes (intrones) han sido ya
extraídas. Con pocas excepciones el ARNm posee una secuencia de cerca de 200 adeninas
(cola de poli A), unida a su extremo 3' que no es codificada por el ADN.
Adenovirus: virus con ADN desprovistos de cubierta, que comprende 47 subtipos la mayoría
de los cuales atacan preferentemente las vías respiratorias aunque no son muchos los que
resultan patógenos para el hombre. Los vectores derivados de los serotipos 2 y 5 se utilizan
para la terapia génica in vivo.
Entrada Adenoviral: es el proceso por el cual los adenovirus son capaces de internalizar en
las células huésped, mediante la unión de sus fibras proteínicas y bases pentonas con los
receptores CAR e integrinas de membrana celular, respectivamente.
Expresión génica: es un proceso altamente específico en el cual un gen se "enciende" en un
momento determinado y comienza la producción de su proteína.
Factor de necrosis tumoral alfa (TNFα): sustancia química, miembro de un grupo de
citoquinas que estimulan la fase aguda de la reacción inflamatoria. Es una hormona
glicopéptida formada por 185 aminoácidos, que procede de un propéptido formado por 212
aminoácidos. Algunas células sintetizan isoformas más cortas de la molécula. Genéticamente
el TNF está relacionado con el cromosoma 7p21.
Gen: unidad física y funcional del material hereditario que determina un carácter del individuo
y que se transmite de generación en generación. Su base material la constituye una porción de
cromosoma (locus) que codifica la información mediante secuencias de ADN.
Glucocorticoide: Compuesto que pertenece al tipo de los llamados corticosteroides
(esteroides). Los glucocorticoides afectan el metabolismo y tienen efectos anti-inflamatorios e
33
inmunodepresores. Pueden ser producidos naturalmente (hormonas) o sintéticamente
(medicamentos).
Ingeniería genética: conjunto de técnicas utilizadas para introducir un gen extraño
(heterólogo) en un organismo con el fin de modificar su material genético y los productos de
expresión.
Inmunoglobulina (Ig). O anticuerpos, son glucoproteínas del tipo gamma globulina. Pueden
encontrarse de forma soluble en la sangre o en otros fluidos corporales de los vertebrados,
disponiendo de una forma idéntica que actúa como receptor de los linfocitos B y son
empleados por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraños tales
como bacterias, virus o parásitos.
Oncogén o gen transformante: gen que produce la transformación morfológica de células
hísticas en cultivo o formación tumoral en animales. Se han identificado oncogenes en
retrovirus de transformación aguda o en ensayos de transfección de ADN de tumores. Los
oncogenes están presentes en todas las especies animales e intervienen en los procesos de
diferenciación
y
crecimiento
celular.
En
condiciones
normales
están
inactivos
(protooncogenes) pero pueden activarse como consecuencia de mutaciones o de infecciones
por virus oncogénicos. Las alteraciones cromosómicas, como roturas y deleciones, pueden
activar los oncogenes.
Terapia génica: conjunto de los procesos destinados a la introducción in vitro o in vivo de un
gen normal en células, germinales o somáticas, en las que el mismo gen, anormal, provoca una
deficiencia funcional, origen de una enfermedad, o la de un gen codificador de una proteína,
por ejemplo, con una acción antitumoral en las células cancerosas, o antivírica en células
infectadas por un virus patógeno.
Vector: portador, que transfiere un agente de un huésped a otro. Sistema que permite la
transferencia, la expresión y la replicación de un ADN extraño en células huésped para una
posterior clonación o transgénesis. Se trata de una molécula de ADN (plásmido bacteriano,
microsoma artificial de levadura o de bacteria) o de un virus defectuoso. Por extensión, un
34
vector designa todo sistema de transferencia del gen, por ejemplo, un sistema sintético como el
de los liposomas.
35
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Acta
Oto-Laryngologica,
Volume
http://www.informaworld.com/smpp/title~content=t713690940~db=all~tab=issueslist~
branches=125 - v125125, Issue 12 December 2005, pages 1301 – 1306.
ANEXOS
41
Anexo 1
Solución PBS 1x
8g
NaCl
0.2 g
KCl
1.44 g Na2HPO4
0.24 g KH2PO4
pH =7.3. Esterilizar y aforar a 1 L
Anexo 2
Se diluyó la solución de glutaraldehído 25% en PBS estéril. Concentración final de
glutaraldehído = 0.05%.
Para obtener la concentración final se tomaron 0.2mL de la solución de glutaraldehído al 25%
y aforó a 100 ml con PBS.
Anexo 3
42
Reacción X-gal.
El vector Ad-Βgal contiene el gen lacZ. Este gen codifica para la enzima β-galactosidasa (Bgal) que degrada la lactosa y otros β-galactósidos como el 5-Bromo-4-Cloro-3-Indol-β-Dgalactósido (X-gal). La B-galactosidasa es el gen reportero clásico en histoquímica (Beckwith,
1980).
Varios sustratos proporcionan productos solubles coloreados o fluorescentes, los cuales son
útiles para la cuantificación de actividad de B-gal (McCaman and Robins, 1959, Miller 1972)
o vizualizar la transducción en células vivo (Krasnow et al. 1991, Nirenberg and Cepko, 1993,
Lin et al. 1994). El sustrato más comúnmente empleado es el x-gal (Holt and Sadler, 1958).
Cuando B-gal se une mediante enlace glucosídico a X-gal, se produce un monomero soluble
indoxílico. Subsecuentemente, dos de las mitades indoxílicas liberadas forman un dímero, el
cual es oxidado no enzimaticamente. El halogenado índigo resultante es un compuesto azul
muy estable e insoluble (Holt and Sadler, 1958).
43