CLART EnteroBac castellano V1 Junio 2011

CLART EnteroBac
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE
ENTEROBACTERIAS CAUSANTES DE DIARREA
PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
1
CLART y CLART-Strip son marcas registradas por GENOMICA
Para ampliar la información descrita en este manual puede consultar la www.genomica.es
GENOMICA, S.A.U.
Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain
Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91
Versión 1
Junio 2011
2
ÍNDICE:
1. GLOSARIO DE TÉRMINOS
2. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
3. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
3.1. Reactivos de amplificación
3.2. Reactivos de visualización
3.3. Otros componentes
4. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO
4.1. Reactivos y material
4.2. Equipos
5. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
5.1. Recomendaciones generales
5.2. Precauciones para la extracción
5.3. Precauciones para la visualización
6. MUESTRAS
6.1. Heces
7. PROTOCOLO DE TRABAJO
7.1. Extracción automática del material genético de enterobacterias
7.2. Reacción de amplificación
7.3. Visualización del producto amplificado
8. LECTURA DE RESULTADOS
9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
11. BIBLIOGRAFÍA
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1.-GLOSARIO DE TÉRMINOS
Atención, ver instrucciones de uso
Fecha de caducidad
Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro
Lote
25ºC
Conservar a temperatura ambiente
20ºC
8ºC
Conservar entre 4 ºC y 8 ºC
4ºC
-18ºC
Conservar entre –30 ºC y –18 ºC
- 30ºC
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2.-DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
CLART EnteroBac detecta la presencia en muestras fecales de los principales tipos de
bacterias que secretan enterotoxinas y producen diarrea. Los microorganismos cuyo
diagnóstico es posible realizar con este kit son los siguientes:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Salmonella spp.(todas las especies descritas)
Shigella spp. (S. dysenteriae, S. Sonnei, S. boydii and S. flexneri)
Yersinia enterocolitica
Yersinia spp. (Y. pestis, Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolítica)
Campylobacter spp. (C.lari, C.laridis, C.upsaliensis, C.jejuni, C.coli)
Campylobacter jejuni
Campylobacter coli
Escherichia coli enteropatógena: (E.coli enterohemorrágica, E.coli enteroinvasiva,
E.coli enterotoxigénica y E.coli enteropatógenica)
Clostridium difficile B
Aeromonas productoras de aerolisina
La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de genes codificantes para
enterotoxinas y factores de virulencia en general, y de genes constitutivos para
Campylobacter spp. y Salmonella spp..
La amplificación se realiza en dos tubos de PCR. Los tubos de la Mix 1 son blancos y
posibilitan la amplificación de Shigella spp, Yersinia enterocolitica, Yersinia spp.,
Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Escherichia coli enteropatógena, Clostridium
difficile B y Aeromonas productoras de aerolisina. Los tubos de la Mix 2 son de color
verde y contienen todo lo necesario para la amplificación de Salmonella spp, y
Campylobacter spp.
La detección del producto amplificado por PCR se lleva a cabo mediante una plataforma
tecnológica basada en microarrays de baja densidad: CLART® (Clinical Array
Technology). La plataforma se fundamenta en un principio muy sencillo pero a la vez muy
cómodo y eficaz que consiste en incluir un microarray en el fondo de un pocillo de placa
microtiter (CLART® Strip-CS) (Figura 1), lo que simplifica todo el proceso de hibridación y
visualización frente a los sistemas de arrays clásicos.
®
Figura 1. Plataforma CLART Strip-CS en forma de tira de 8 pocillos.
5
El sistema de detección de CLART EnteroBac se basa en la precipitación de un
producto insoluble en aquellas zonas del array en las que se produce la hibridación de los
productos amplificados con las sondas específicas. Durante la PCR, los productos
amplificados se marcan con biotina. Después de la amplificación, estos productos se
hibridan con sus respectivas sondas específicas que están inmovilizadas en zonas
concretas y conocidas del microarray, tras lo que se incuba con un conjugado de
estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a través de la estreptavidina con la biotina
presente en los productos amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus sondas
específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto insoluble en
presencia del sustrato o-dianisidina, que precipita sobre las zonas del microarray en las
que ocurre la hibridación (Figura 2).
Producto marcado
Sondas sobre array
biotina
Hibridación
Conjugado
Incubación
con el conjugado
Reacción de revelado
Precipitación
del sustrato
Figura
2….2:
Figura
Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la
superficie, capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A
través de la biotina, se une el conjugado, en este caso estreptavidina-HRP (peroxidasa de
rábano, HorseRadish Peroxidase). El sustrato o-dianisidina por la acción de la HRP, produce
un precipitado sobre la zona en la que se produce la hibridación.
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3.-COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
El kit CLART Enterobac contiene suficientes reactivos para el análisis de 48
muestras clínicas. Los reactivos incluidos en el kit se han agrupado en varias cajas,
dependiendo de la temperatura a la que se han de conservar. Todos los reactivos son
estables en las condiciones indicadas de conservación hasta la fecha de caducidad del
kit.
3.1. Reactivos de amplificación
Se envían y se conservan a -20 ºC.
•
Tubos de Amplificación listos para su uso. Contienen 45 µl de mezcla de
reacción. Sólo se deben descongelar sobre hielo el número preciso de
tubos de amplificación que se vayan a procesar en ese momento,
conservando el resto de los tubos a -20ºC.
Se envían dos tipos de tubos de amplificación:
-Mix 1: Tubo blanco. Amplificación de Shigella spp, Yersinia enterocolitica,
Yersinia spp., Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Escherichia coli,
Clostridium difficile y Aeromonas aerolisina positiva. En este tubo se incluye
un control interno de amplificación y un control de extracción.
-Mix 2: Tubo verde. Amplificación de Salmonella spp, y Campylobacter
spp. En este tubo se incluye un control interno de amplificación distinto del
que tiene el tubo 1.
•
DNA CE (Control de extracción). Este control es DNA genómico humano.
Nota: En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de
temperatura; la aparición de un color rojizo en la ventana de visualización
indica que en algún momento los productos han sobrepasado la temperatura
de conservación de –20oC y no deben utilizarse.
3.2. Reactivos de visualización
El kit de visualización se envía a 4 ºC.
¡ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, las tiras CS deben conservarse a
temperatura ambiente.
•
•
Tiras CS (incluyendo las sondas específicas). Se suministran en un sobre
termosellado. Conservar siempre cerrado, a temperatura ambiente y
protegido de la luz.
SH (Solución de Hibridación). Conservar a 4ºC
7
•
•
•
•
•
DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC.
CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC. Dar un pulso en la centrífuga antes de
usar.
RE (Solución de Revelado). Conservar a 4 ºC.
TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4 ºC.
Soporte y tapa para tiras de 8 pocillos.
3.3 Otros componentes
Para la captura y posterior procesamiento de la imagen se necesita un equipo o
lector, un adaptador, y un software, capaces de generar de manera automática
un informe por cada muestra analizada:
•
Lector CAR (Clinical Array Reader): permite la lectura e interpretación
automática de hasta 12 CS, es decir, de hasta un máximo de 96 muestras.
Está fabricado y distribuido por GENOMICA para su uso exclusivo con los kits
de diagnóstico.
•
Soporte adaptador que se coloca sobre la bandeja del CAR, sobre el cual se
acopla la placa antes de la lectura.
•
Software: específico para CLART® EnteroBac, diseñado y validado por
GENOMICA.
CAR
(Clinical Array Reader)
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4.
MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO.
A continuación enumeramos todo el material requerido y que no es
suministrado.
4.1. Reactivos y material
- Agua destilada.
- Guantes desechables.
- Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo.
- Recipiente con hielo picado.
- Tubos Eppendorf de 1,5 ml autoclavados.
- Gradillas para tubos de 1,5 ml.
- Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.
- Suero salino 0.9% NaCl
4.2. Equipos
- Microcentrífuga.
- Termociclador.
- Cabina de flujo laminar para el laboratorio de extracción.
- Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl
para el laboratorio de extracción.
- Una micropipeta ajustable entre 1-20 µl, para añadir la mezcla de
enzimas a los tubos de amplificación.
- Una micropipeta ajustable entre 1-20 µl, para añadir el material
genético a los tubos de amplificación.
- Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl , 20-200 µl y 200-1000 µl
para el laboratorio de visualización.
- Termobloque con agitación ajustable a 25°C, 30°C y 59 ºC.
Compatible con placas de 96 pocillos.
- Vórtex.
- Sistema de vacío.
5.- RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
¡Muy importante para evitar contaminaciones!. Leer detenidamente antes de
comenzar la técnica.
5.1. Recomendaciones generales
1. La técnica se debe realizar en dos áreas separadas físicamente, para evitar
la contaminación de las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada
una de las áreas debe tener su propio material de trabajo identificado (pipetas,
puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de cada una de ellas.
1. Área pre-PCR: En esta área se hace la extracción del ADN y
preparación de las muestras. La preparación de las muestras para su
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extracción debe realizarse dentro de una cabina adecuada y con las
medidas de esterilización más amplias posibles para evitar
contaminaciones.
2. Área post-PCR: En esta área se lleva a cabo la amplificación y la
visualización del producto amplificado. El material de esta área nunca ha
de entrar en contacto con el del área de extracción. Evitar ir al área de
pre-PCR después de haber estado trabajando en el área de visualización.
2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes con
cierta frecuencia y obligatoriamente cada vez que se empieza a trabajar en las
áreas antes descritas. Siempre hay que utilizar guantes nuevos cuando se
preparen los tubos de amplificación y cuando se añada el ADN a esos tubos.
3. Limpiar las zonas de trabajo (poyatas, campanas, gradillas, pipetas)
profundidad con lejía diluida al 10% cada vez que se procese una tanda
muestras, y obligatoriamente después de una contaminación. En el caso
termocicladores y termomixers, se recomienda limpiarlos antes y después de
uso, en estas mismas condiciones.
en
de
de
su
4. Emplear siempre puntas con filtro y pipetas de desplazamiento positivo para
evitar contaminaciones debidas a la micropipeta. Se debe trabajar con un juego de
pipetas para cada área.
5. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado.
6. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes, aunque sean del mismo lote.
7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente después de su uso para evitar
contaminaciones.
8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo.
9. Separar los tubos unos de otros en todo momento durante la manipulación, con
especial precaución durante la extracción.
10. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el kit si
se emplean otras muestras distintas a las indicadas o ADN/ARN extraído por un
protocolo distinto al indicado.
5.2. Precauciones para la extracción
Muchos de los microorganismos incluidos en CLART® EnteroBac se encuentran
formando parte del tracto digestivo humano, por lo que hay que extremar las
precauciones a la hora de la extracción.
•
Utilizar guantes en todo momento.
10
•
•
•
•
•
Evitar tocar la superficie de la palma de los guantes así como los dedos al
colocárselos.
Limpiar las superficies de trabajo de la cabina con lejía diluida al 10%.
Esterilizar la cabina con UV antes de la extracción.
Encender el flujo laminar al menos 20 minutos antes de comenzar la
extracción
No trabajar fuera del flujo laminar ni abrir las puntas fuera del mismo.
5.3 Precauciones para la visualización
1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el fondo del pocillo,
ya que podría dañarse el microarray situado en el fondo/pocillo.
2. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del pocillo CS, nunca
directamente sobre el fondo.
3. Es conveniente no añadir la solución SH hasta que se vayan a añadir los
productos desnaturalizados de PCR.
4. El array no debe quedar mucho tiempo seco.
5. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el
microarray para evitar que queden restos de éste y que reaccionen con la solución
RE, produciendo un precipitado inespecífico que pueda dar lugar a
interpretaciones erróneas del resultado.
6. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de las
distintas soluciones.
7. Mantener limpia la base del pocillo para evitar posibles interferencias en la
lectura de resultados.
8. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores
de posición y de que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En
caso contrario, limpiar el fondo del pocillo con un papel de celulosa.
6. MUESTRAS
6.1. Heces
El kit CLART EnteroBac ha sido diseñado y validado para su uso a partir de
muestras de HECES(1). GENOMICA no se responsabiliza de los resultados si se utilizan
otro tipo de muestras.
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7. PROTOCOLO DE TRABAJO
7.1. Extracción automática del material genético de enterobacterias
Se recomienda realizar el método siguiente:
1. Preparación de la muestra antes de la extracción. Recomendado para todos los
equipos automáticos.
•
Tomar 1 gramo de muestra fecal y resuspender en 2 ml de suero salino
(cloruro sódico 0,9%). Centrifugar durante 2 min a 1500rpm.
Nota: La toma de 1 gramo de muestra fecal debe realizarse en campana apropiada
para la extracción y mediante material estéril.
•
Descartar el pellet y transferir el sobrenadante a un tubo de 1.5ml estéril. Nota:
en este paso se elimina, principalmente, el exceso de muestra fecal.
•
Centrifugar a 13000 rpm durante 5 min para concentrar el pellet bacteriano.
•
Desechar el sobrenadante y resuspender en 1.5 ml de suero salino (cloruro
sódico 0,9%). Resuspender vigorosamente.
•
Coger 275 µl de sobrenadante y añadir 25 µl de DNA CE (control de
extracción).
•
Transferir la mezcla (300 µl) a las cubetas del extractor automático
2. Lisis interna y extracción en el equipo NucliSENSTM EasyMag DNA de Biomerieux,
seguir la guía de usuario del equipo para el protocolo “Específico B”. En caso de
que el aparato tenga varios programas de lavados de las muestras seleccionar el
más exhaustivo. Hay que identificar en el programa el volumen de elución, 110 µl.
Este volumen puede variar en función del extractor automático utilizado.
3. Una vez finalizada la extracción se toman con micropipeta los 110 µl de ADN
eluido y se introducen en tubos eppendorf de 1,5 ml. Utilizar 5 µl para cada tubo de
amplificación y guardar el resto a –20°C.
El rendimiento mínimo estimado de la extracción de ADN de muestras fecales para una
correcta amplificación es de 5 ng/µ
µl.
7.2. Reacción de amplificación
Recomendaciones específicas para la amplificación:
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• Trabajar en el área pre-PCR de preparación de los tubos de
amplificación, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del
punto 5.1.
• Añadir el ADN, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del
punto 5.1. Durante el proceso mantener los tubos separados y en hielo.
1. Descongelar un tubo de Mix 1 y un tubo de Mix 2 por cada muestra que se va a
procesar, y mantenerlos en hielo. No usar temperaturas superiores a 37ºC para la
descongelación.
2. Centrifugar unos segundos los tubos de amplificación en la microcentrífuga para
que quede todo el líquido en el fondo del tubo (si no se dispone de adaptadores de
microcentrífuga para los tubos, se pueden utilizar en su lugar tubos de un tamaño
mayor a los que se les haya cortado la tapa).
3. Añadir 5 µl del ADN extraído de las muestras a cada tubo de Mix 1 y Mix 2 y
resuspender varias veces con la micropipeta. Dejar los tubos en el hielo.
4. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas:
1 ciclo
45 ciclos
95ºC 5 min
95ºC 30 seg
53ºC 30 seg
72ºC 1 min
1 ciclo
72ºC 10 min
4ºC continuo hasta la recogida de tubos
5. Arrancar el programa y colocar los Tubos de Reacción en el termociclador
cuando el bloque haya sobrepasado los 90 ºC. De este modo se minimizan las
posibles amplificaciones inespecíficas debidas a incubación por debajo de la
temperatura de hibridación. La duración de la amplificación es de unas tres horas y
media, aunque puede variar ligeramente dependiendo del termociclador.
7.3. Visualización del producto amplificado en CLART Strip (CS)
Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización:
EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE
EN EL ÁREA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL
ÁREA DE PRE-PCR.
1. Encender el CAR (Clinical Arrays Reader) al comienzo del proceso. La
autocalibración del equipo tarda unos minutos y es necesario además introducir el
nombre de las muestras de cada pocillo en el programa antes de la lectura. El
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aparato debe estar listo en el momento de la lectura para evitar esperas
innecesarias que produzcan un exceso de revelado.
2. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridación el termomixer de placas ha
estado a 56ºC al menos durante 30 min. o 1 hora.
3. Atemperar la SH (solución de hibridación) a temperatura ambiente.
4. PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO, NO
REUTILIZAR SOLUCIONES O RESTOS PREPARADAS CON ANTERIORIDAD.
5. Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de poner en
marcha el programa de desnaturalización. Colocar los tubos de amplificación
separados en el termociclador durante el proceso y nunca sobrepasar los 10 min.
de desnaturalización.
6. Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro pero sí es necesario
usar una punta diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez que se añada un
reactivo, aunque se trate de TL. Sí es necesario utilizar puntas con filtro durante la
adición de amplificados al tubo CS.
7. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas para
aspirar las soluciones, desechar los peines después de cada uso o
descontaminarlos con una solución de lejía diluida al 10% tras cada ensayo.
Asegurarse de que la bomba aspira adecuadamente y no deja restos en el fondo
del pocillo.
8. Aspirar completamente las diferentes soluciones dentro de los pocillos sin tocar el
array.
VISUALIZACIÓN:
1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de
PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar
a 95ºC durante 10 minutos. Programar en el termociclador 15 minutos para que
una vez transcurridos los 10 minutos los amplificados sigan a 95ºC. Sacar los
tubos de la incubación a 95ºC y colocarlos inmediatamente en un recipiente con
hielo. Se recomienda no sobrepasar los 10 min.
2. Preparación de la Solución TL diluida:
Por cada tira CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado diluida,
añadiendo 1 ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada.
3 Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los CS
añadiendo 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo. Resuspender de 10 a 15
veces con la pipeta multicanal, teniendo en cuenta que no se debe tocar la
superficie del array. Se recomienda realizar este lavado mientras se están
desnaturalizando los amplificados y mantener la solución de lavado en la tira
hasta que se vaya a proceder a la adición de los mismos. Desechar la
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Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío.
El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer seco
durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución inmediatamente.
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Hibridación: Antes de usar la Solución SH, ésta debe estar a Tª ambiente y sin
cristales. Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de
solución SH (evitar que se forme espuma) a cada pocillo de los CS. A
continuación, añadir 5 µl de producto de PCR desnaturalizado tanto de mix 1 como
de mix 2. Resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de
hibridación SH, con cuidado de no tocar el fondo del pocillo. Se recomienda
cargar cada tira de manera independiente y separada del resto para evitar
contaminaciones. Incubar la tira cubierta con la tapa de plástico transparente en el
termomixer de placa tapado durante 30 min a 56º C, agitando a 550 rpm. Es
condición indispensable para la correcta interpretación de los resultados
visualizar ambos tubos (mix 1 y 2) en el mismo pocillo.
Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la Solución SH de los CS con
pipeta o bomba de vacío: El array debe quedar sin restos de solución, aunque
nunca debe permanecer seco durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución
inmediatamente. (Dejamos programado el termomixer de placa a 30º C y en
movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para
que baje antes la temperatura).
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Doble Lavado: añadir 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS,
resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal. Desechar la Solución TL
diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío multicanal sin dejar
remanente. Repetir la operación. Este paso se debe realizar con puntas
diferentes para cada pocillo en ambos lavados. Si llegado a este paso, el
termomixer no hubiera llegado a los 30º C, se dejan los pocillos con esta solución
hasta que el termomixer alcance la temperatura.
6 Bloqueo y conjugado: se recomienda centrifugar la solución CJ de alta afinidad
durante 10 segundos antes de usarla. A continuación, preparar la solución CJ
diluida. Por cada tira CS, se añade 1 ml de solución DC y 9 µl de Solución CJ de
alta afinidad.
Desechar la Solución TL diluida sin dejar restos de solución y añadir a cada pocillo
del CS 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos en el
termomixer de placa a 30º C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la
placa y desechar la solución rápidamente con pipeta o bomba de vacío multicanal.
(Dejar programado el termomixer de placa a 25º C y en movimiento para su
utilización posterior en el paso 8. Podemos quitar la tapa para que baje antes la
temperatura).
7 Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de Solución TL diluida a cada
pocillo del CS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal y desechar
completamente la solución con la pipeta o vacío. Repetir la operación dos veces
más.
Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta
reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica.
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8 Revelado con Solución RE: quitar la solución TL diluida completamente y añadir
100 µl de solución RE a cada pocillo del CS e incubar 10 minutos a 25 º C en el
termomixer de placa sin agitación.
¡Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación
9 Desechar la Solución RE completamente con pipeta o vacío. El array debe quedar
seco.
10 CAR (Clinical Array Reader): Se coloca en el CAR el adaptador y encima la placa
para tomar las imágenes de todos los pocillos para posteriormente ser analizadas
automáticamente.
8. LECTURA DE RESULTADOS
El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se realiza de
forma automática. El equipo de lectura y análisis presentará un informe en el que se
indican los resultados.
En la pantalla del equipo aparecerá una tabla con tres columnas, en la columna de la
izquierda aparecerán las especies que se caracterizan en el array. En la columna del
centro aparece el resultado de positivo o negativo para cada especie, y en la de la
derecha aparecerá la conformidad del control de ADN de la extracción y de la
amplificación.
9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los falsos
negativos debidos, bien a una calidad inadecuada extracción del ADN de la muestra (por
toma de cantidad insuficiente de muestra, por degradación del ADN debida a una
incorrecta conservación o por pérdida del ADN de la muestra durante su extracción), o
bien a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa en las heces.
Con el kit CLART EnteroBac se han eliminado estos falsos negativos añadiendo a los
tubos de Mix 1 y Mix 2 un control interno diferente, indicativo de la eficiencia de la
reacción de amplificación.
Se ha incluido en el tubo de Mix 1 oligos específicos que amplifican el control de
extracción de ADN genómico humano (DNA CE), el cual se añade a la muestra antes de
su extracción. La presencia en el array de ADN genómico indica que el proceso de
extracción ha sido adecuado, de esta manera, se eliminan los falsos negativos debidos a
fallos en la extracción.
Para la interpretación correcta de los resultados, la muestra debe ser procesada en
los tubos de Mix 1 y Mix 2 y los amplificados visualizados en el mismo array.
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A su vez, se debe incluir un control negativo de extracción para comprobar que las
muestras no hayan sufrido contaminaciones durante los procesos de extracción,
amplificación y visualización; lo que daría lugar a un falso positivo.
Cada tubo de amplificación contiene los siguientes oligos:
Mix 1
• Un par de oligonucleótidos que amplifican el control de extracción.
• Un par de oligonucleótidos que amplifican un plásmido modificado incluido en el
tubo de amplificación y que se usa como control de amplificación de la reacción de
PCR.
• Oligonucleótidos específicos de las dianas indicadas para los patógenos a
detectar.
Mix 2:
•
•
Un par de oligonucleótidos que amplifican un plásmido modificado incluido en el
tubo de amplificación y que se usa como control de amplificación de la reacción de
PCR. Esté plásmido es diferente del que se ha incluido en el tubo de mix 1.
Oligonucleótidos específicos de las dianas indicadas para los patógenos a
detectar.
El tubo de PCR se ha diseñado para favorecer la amplificación de las dianas indicadas
para los patógenos a detectar frente a la de los dos controles (de extracción y
amplificación). En relación a estos últimos, la amplificación del control de extracción está
favorecida sobre la del control de la reacción de amplificación.
La razón de este diseño es:
El control externo de extracción es necesario para la confirmación de que el proceso de
extracción de ADN de la muestra fecal se ha llevado a cabo de manera adecuada.
El control interno de amplificación nos permitirá distinguir entre los casos de inhibición
de la reacción de PCR y aquéllos en los que no se encontró ADN en la muestra.
En ciertas condiciones (ej. cuando hay una elevada cantidad de DNA microbiano) puede
suceder que no se amplifiquen los dos controles o alguno de ellos, y aparezca una lectura
de: SIN SEÑAL.
Existen dos posibilidades que dan lugar a un resultado de NO VÁLIDO:
•
Extracción no válida: La presencia de inhibidores o un fallo mecánico en la
extracción de la muestra, no permite la amplificación del target microbiano y/o
de los controles de amplificación y de extracción. Para resolverlo es necesario
repetir todo el proceso.
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•
Amplificación no válida: La ausencia de amplificación en uno de los tubos y
presencia de DNA microbiano y/o humano en el otro tubo, indica que se ha
realizado una correcta extracción pero que ha habido un fallo en la
amplificación, para resolverlo se deben amplificar de nuevo los dos tubos y
continuar el proceso.
Existen tres posibilidades que dan lugar a un resultado de NO CONCLUYENTE:
•
En aquellos casos en que las réplicas de una sonda del array sean muy
distintas entre sí.
•
En coinfecciones de más de 3 microorganismos.
•
Cuando la intensidad de la señal de absorbancia no normalizada se encuentre
en el límite de detección de la técnica, cuyo rango está establecido por el
software para cada tipo de microorganismo.
10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
10.1 Control de interferencias conocidas:
Existen sustancias que pueden interferir en la detección del Kit CLART
EnteroBac. Principalmente, son sustancias que inhiben la reacción de
amplificación. Las interferencias más conocidas son:
• Utilización de muestras no adecuadas. El análisis de cualquier otro tipo de
muestra clínica distinta a las indicadas en el manual del kit CLART EnteroBac, así
como una toma incorrecta de las muestras, puede conllevar que el resultado del
análisis no sea concluyente o no conforme debido a una falta de amplificación por
falta de muestra o por reacción inhibida.
• La conservación inadecuada de las muestras puede influir en el resultado
del análisis. Si las muestras se someten a condiciones que den lugar a una
degradación del ADN que contienen, el resultado del análisis será erróneo.
10.2 Especificaciones técnicas:
Parámetros Analíticos:
• Sensibilidad analítica. La sensibilidad analítica se ha determinado mediante la
amplificación de diluciones seriadas de ADN de plásmidos recombinantes para
cada uno de los microorganismos detectados en el kit (2). Cada uno de ellos lleva
inserto el producto amplificado (incluyendo la parte complementaria a las sondas
específicas de detección). La visualización se realizó en CS dando lugar a los
siguientes resultados (Tabla 1):
18
MICROORGANISMO
Nº copias de plásmido
recombinante por reacción de PCR
Yersinia enterocolítica
Escherichia coli enteropatógena
100
Campylobacter jejuni
Shigella
Salmonella
Clostridium difficile
1000
Campylobacter coli
Aeromonas aerolisina +
Tabla 1. Relación del número de copias de plásmido recombinante necesarias para obtener una
sensibilidad del 100% en la detección de cada uno de los microorganismos.
• Especificidad analítica. Se llevaron a cabo experimentos de especificidad con
los 8 plásmidos recombinantes, observándose que no se produce detección
inespecífica de otros microorganismos diferentes al que se quiere determinar (2).
Por tanto, se considera que la técnica alcanza una especificidad analítica del
100%.
Parámetros de utilidad diagnóstica:
Para determinar los parámetros diagnósticos del kit, se realizó una evaluación
comparativa de la técnica CLART EnteroBac con la técnica de referencia
coprocultivo (1, 2). Para esta evaluación se colaboró con los centros siguientes:
•
•
Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Ramón y Cajal de
Madrid.
Servicio de Microbiología del Hospital Universitari Germans Trías i Pujol de
Badalona.
A partir de 334 muestras fecales se extrajo el material genético y se analizó la
presencia de cada uno de los microorganismos descritos en la Tabla 2.
Para cada muestra se asume como verdadero el resultado concordante entre la
técnica de referencia y CLART® EnteroBac. En el caso de existir discordancias
entre ambas técnicas, se considera como verdadero el resultado de la
secuenciación; y en el caso de no disponer de este dato, se analiza las
discrepancias mediante una Nested PCR de desarrollo propio y su posterior
secuenciación (2).
N = 334
Campylobacter
Salmonella
Sensibilidad Especificidad
VPP
VPN
90,0
100,0
100,0 94,0
83,2
99,0
98,3
19
89,4
Clostridium difficile
83,0
100,0
100,0 97,7
Escherichia coli enteropatógena
100,0
100,0
100,0 100,0
Shigella
94.4
100,0
100,0 99,7
®
Tabla 2. Sensibilidad y Especificidad diagnósticas de la técnica CLART EnteroBac para cada
microorganismo.VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo.
•
•
Se han analizado 15 muestras de Aeromonas pero ninguna de ellas ha sido
positiva para aerolisina (toxina detectada con este kit), por lo que no se han podido
determinar los parámetros diagnósticos para este microorganismo.
Para Yersinia el N=5 es demasiado pequeño para poder establecer parámetros
diagnósticos fiables.
-Especificidad diagnóstica.
La especificidad se ha determinado utilizando muestras de heces negativas y
muestras positivas para los microorganismos incluidos en el kit. Se ha obtenido
una especificidad del 99%, lo que significa que no hay reconocimiento inespecífico
de otras bacterias diferentes a las que están presentes en la muestra.
-Reproducibilidad y repetibilidad diagnóstica.
Los datos obtenidos son los siguientes:
•
•
Reproducibilidad: 91,8 % (49 muestras ensayadas)
Repetibidad: 97,2 % (48 muestras ensayadas)
Las tandas de reproducibilidad y repetibilidad se han procesado desde la
extracción de muestra fecal hasta la visualización en el array del material
amplificado.
-Detección de infecciones múltiples.
Usando el kit CLART®EnteroBac se ha detectado la presencia de infecciones
múltiples (dos o más microorganismos objeto del kit) en el 15,9% de las muestras
fecales analizadas, frente al 2,4% de muestras fecales con infecciones múltiples
identificadas por caracterización del coprocultivo, apoyando la mayor sensibilidad
en la detección de coinfecciones de CLART®EnteroBac frente a los métodos
clásicos de identificación del cultivos.
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BIBLIOGRAFIA
1. Alvarez, M., Buesa, J., Castillo. J. y J. Vila. ”Diagnóstico microbiológico de las
infecciones gastrointestinales”. 2007. 2ª Edicion (24). Eds. Cercenado E. y Cantón,
R. Procedimientos en microbiología clínica. Sociedad Española de Microbiología
Clínica, (SEIMC).
2. Manjón, N., Moscoso, J., Margolles, Y., García, M., Morosini, M. I., Salazar, O.,
Cospedal R., Cantón, R., y M. L. Villahermosa. 2011. “Diseño y optimización de un
sistema de detección molecular por hibridación en microarrays para la
identificación rápida de patógenos bacterianos intestinales presentes en pacientes
con diarrea”. 2011. Enfermedades infecciosas y Microbiología Clínica. Vol 29, 3334. XV Congreso de de la Sociedad Española de Microbiología Clínica (SEIMC).
Málaga, 1-4 Junio 2011.
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