aLos medios de cultivo en microbiología

aLos medios de cultivo en
microbiología
Uno de los sistemas más importantes para la identificación
de
microorganismos
sustancias
es
alimenticias
observar
artif iciales
su
crecimiento
preparadas
en
en
el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los
microorganismos es el Medio de C ultivo y el crecimiento
de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
más de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en
composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de
muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que
se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la
preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la
temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enf riarse a 40
grados.
Con
mínimas
excepciones
no
tiene
efecto
sobre
el
crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que
crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidif icante pero se emplea mucho
menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiale s de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar
el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorga nismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se
añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH
básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que
impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram- positivas).
Condiciones generales para el cultivo de
microorganismos
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve
afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por complet o al propio medio.
1- disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,
como mínimo, carbono, nitrógeno, azuf re, fósforo y sales inorgánicas. En muchos
casos
serán necesarias
ciertas
vitaminas
y
otras
sustancia
inductoras
del
crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer
de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan
lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de
carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de
estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida
de los factores nutritivos lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es
utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de
nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen
utilizar directamente las proteínas naturales, t ienen capacidad de atacar los
aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la
peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a
muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente
pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio,
magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,
generalmente de naturaleza vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
2- consiste ncia adecuada de l medio
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido o sólido.
Los medios solidif icados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al
punto de fusión de este solidif icante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.
3- prese ncia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una at mósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustra tos.
Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente
en
una
at mósfera
microorganismos
parcialmente
sin
oxígeno
microaerófilos
anaerobias
ambiental.
crecen
(tensión
de
mejor
oxígeno
En
un
punto
intermedio,
en
condiciones
muy
reducida),
los
at mosféricas
mientras
los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de
las citadas condiciones.
4- condiciones adec uadas de humeda d
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la at mósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las
estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que
se deseque el medio.
5- Luz ambiental
La mayoría de los mic roorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en
presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.
6- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los
microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe
olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metabólicos normales.
7- Temperatura
Los microorganismos mesóf ilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y
43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temóf ilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos
humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC,
y los saprofítos tienen rangos más amplios.
8- Esterilidad de l medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos
medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que
utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)
La evolución de los medios de cultivo
Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia
en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los
primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios
de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes
puntos de inf lexión en su evolución.
La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo
Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos
realizados a base de gelatina.
Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor
tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado
al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.
Koc h realizó sus investigaciones utilizando en un primer mo mento rodajas de
patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne
líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añad ió gelatina, logrando un medio
sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las
colonias microbianas.
En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en
relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el
agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidif icante.
En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal
planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas
bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.
Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre
las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azuf re sobre todo)
tuvieron gran importancia en el desarrollo de
los
medios selectivos y de
enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial
composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos
que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar
para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.
En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores
de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la
produc ción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.
Tipos básicos de medios de cultivo
atendiendo a su estado físico:
líquidos
semisólidos
sólidos
atendiendo a su utilidad práctica:
Medios para aislamientos primarios:
Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia
variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están
enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX,
FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las
bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)
selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se
añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de
bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las
sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac
Conkey, Kanamicina-Vancomicina)
enriquecidos:
ralentizan/suprimen
el
crecimiento
de
la
flora
competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado
(Selenito, medio con Vitamina K).
Para
aislamientos
especializados:
formulaciones
nutritivas
especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de
bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).
Medios para ide ntificac ión:
diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las
peculiaridades
fisiológicas
(nutrición
y
respiración
sobre
todo)
específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se
puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (OxidaciónFermentación)
PREPARACIÓN DEL MEDIO DE
CULTIVO
Una vez escogida la formulación del medio de cultivo, se procede a su
preparación.
Se podrían pesar las cantidades necesarias de todos y cada uno de los
componentes del medio. Ello, no obstante, sería una operación larga y
tediosa, además de muy imprecisa puesto que obligaría a pesar algunas
cantidades muy pequeñas. Por todas esas razones, acostumbra a ser una
práctica habitual en todos los laboratorios preparar soluc iones stoc k
concentradas de los distintos componentes, agrupados de forma que no se
produzcan fenómenos de precipitación. Es habitual trabajar con una
solución stock de macronutrientes, una de micronutrientes, una de hierro
con un agente quelante, otra de vitaminas y mio-inositol, así como con
soluciones específicas para los demás componentes del medio
(reguladores, ...).
Proceder de esa forma simplifica la preparación del medio: un medio como
el MS, que contiene un total de 20 substancias diferentes, requeriría otras
tantas pesadas, mientras que a partir de soluciones stock su preparación
Diagrama de flujo del
se reduciría a cuatro medidas de volumen y una pesada (sacarosa). Las
proceso de preparación
soluciones stock pueden mantenerse durante un cierto tiempo en la
de un medio de cultivo a
nevera o en el congelador. Una vez obtenido el volumen de medio
partir de soluciones
deseado se procede a ajustar su pH al valor prefijado mediante la adición
stock.
de OHNa y/o HCl 0.1-1 N. A continuación, dependiendo de que se vaya a
preparar un medio sólido o líquido, se añadirá en el primer caso el agente
solidificante, se fundirá por calentamiento breve para, finalmente, ser
dosificado en los contenedores adecuados. En el caso de tratarse de un
medio líquido se procederá a dosificar directamente en los contenedores
escogidos. Tanto si es un medio sólido como líquido se procederá a
continuación a autoclavar los contenedores con el medio (generalmente a
121 0C durante 20 minutos). Conviene tener en cuenta que algunos de los
componentes del medio de cultivo pueden ser termolábiles (algunas
vitaminas, algunos reguladores,...). En este caso, la esterilización de la
solución que contienen la substancia termolábil debe hacerse por filtración
y añadirse una vez esterilizada al medio de cultivo previamente
esterilizado y parcialmente (en medios sólidos) o totalmente (en medios
líquidos) enfriado.
Técnicas de la microbiología
4.1
Cultivos:
Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en la
superficie de un medio s ólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrient es que
van, desde azúc ares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de
carne. P ara aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos
tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican
no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por
escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por dec enas de millones de células
similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá
como
cultivo
puro
de
un
solo
tipo
de
bacteria.
Muchas especies bacterianas son tan parecid as morfológicamente que es imposible diferenciarlas
sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian
sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos
medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies
bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente. Otras veces el medio
de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas ba cterias.
En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los
nutrientes del medio es fermentado y se generan c atabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces
de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza
en
un
tubo
cerrado.
Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que
digieren los nut rient es: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los
glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de
agar-sangre. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de
microbiología de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de la s
enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.
4.2
Esterilización:
La esterilización es un proc eso esencial para el funcionamiento de un hospital, en el cual se
deben utilizar todos los instrumentos quirúrgicos, implantes y muc hos ot ros dispositivos
absolutament e esterilizados. La desecación y la congelación eliminan muchas especies de
bacterias, pero ot ras simplement e permanec en en estado veget ativo. El c alor seco o húmedo
elimina todas las bacterias combinando adecuadamente factores como la temperatura a la que se
someten y el tiempo de exposición. Se puede esterilizar por calor seco en estufas a más de 160
°C durant e media hora, o por calor húmedo en autoclaves a 120 °C durante 20 minutos y a
presión superior a la atmosférica. La ebullición a 100 °C no elimina todos los gérmenes pat ógenos
(entre los que no sólo están incluidas las bacterias sino también virus y levaduras). Otro medio
habitual de esterilización, utilizado para objetos no resistentes al calor, son los medios químic os:
el ácido fénico, iniciador de la era de la antisepsia (véase Fenol), el ácido cianhídrico, el óxido de
etileno, la clorhexidina, los derivados mercuriales, los derivados del yodo (especialmente la
povidona yodada) y muchas otras sustancias. El alcohol etílico no produc e esterilización
completa. Otro medio de esterilización actual son las radiaciones ionizantes (beta, gamma).
4.3
Pasteurización:
Pasteurización, proceso de calentamiento de un líquido, en particular de la leche, hasta una
temperatura que oscila entre 55 y 70 °C para destruir las bacterias perjudiciales, sin producir
cambios materiales en la composición, en el sabor, o en el valor nutritivo del líquido. El proceso se
llama as í en honor del químico francés Louis Pasteur, quien lo ideó en 1865 con el fin de inhibir la
fermentación del vino y de la leche. La leche se pasteuriza al calentarla a 63 °C durante 30
minutos, luego se enfría con rapidez, y se envasa a una temperatura de 10 °C. La cerveza y el
vino se pasteurizan al s er calentados a unos 60 °C durante unos 20 minutos; también se hace,
según un método más reciente, calentando a 70 °C durante 30 segundos y envasando en
condiciones
estériles.
4.4
De sinfectantes:
Son sustancias usadas por sus propiedades antisépticas, es decir, por su facultad de matar
microbio o gérmenes nocivos a los animales y a las plantas, las enfermedades cont agiosas, las
pestes y las infecciones se producen por la acción de algunos microbios que en medicina son
llamados gérmenes patógenos, estos gérmenes se encuentran en el aire, en el polvo y en los
objetos. Las sustancias desinfectantes realizan una función destructora de estos seres no vivos y
por esta razón la desinfección es una medida higiénica y preventiva que debe realizarse
periódicamente
para
prevenir
enfermedades.
Los desinfectantes son una arma clave para protegernos de los microorganismos ya que estos se
encuentran en casi todas partes por eso los desinfectantes van destruyendo los mic roorganismos
o impidiendo su des arrollo y asimismo protegen el área donde actúan durante un lapso de tiempo.
Basado en los hallazgos del fisiólogo alemán Theodor Schwann y del bioquímic o francés Louis
Pasteur, Lister desinfectaba las heridas quirúrgicas y accidentales con una solución de ácido
carbólico, y en cinco años redujo la tasa de mortalidad de las amputaciones importantes de un 45
por ciento a un 12 por ciento. Los desinfectantes cumplen un papel muy importante en el campo
de la salud ya que si no fuera por estos por una simple herida podrían amputar cualquiera de
nuestros
miembros.
4.5
Anti sépticos:
Agentes físicos o químicos que evitan la putrefacción, infección o cambios similares, de los
alimentos y tejidos vivos, destruyendo los microorganismos o impidiendo su desarrollo. Desde la
antigüedad los alimentos se han conservado gracias al empleo de agentes antisépticos como el
calor durante la cocción, la sal y el vinagre en la salazón y adobo, y el humo de la madera (que
contiene c reos ota, un compuesto similar al ácido carbólico) en el ahumado de las carnes. En la
actualidad, los principales agentes antisépticos en la conservación de los alimentos son el calor y
el frío utilizados en proces os como el enlatado, la pasteurización y la refrigeración. La irradiación
es
otro
medio
de
conservación
de
los
aliment os.
El uso de antisépticos en el cuidado y tratamient o de las heridas fue introducido por el cirujano
inglés Joseph Lister en 1865. Basado en los hallaz gos del fisiólogo alemán Theodor Schwann y
del bioquímico francés Louis Pasteur, Lister desinfect aba las heridas quirúrgicas y accidentales
con una solución de ácido carbólico, y en cinco años redujo la tasa de mortalidad de las
amputaciones importantes de un 45 por ciento a un 12 por cient o. Se han introducido otros
muchos antisépticos, entre los cuales los más importantes son el bicloruro de merc urio, el yodo, el
ácido bórico, los hipocloritos, el mercurocromo y el mertiolato. El cloro se utiliza en la esterilización
del agua, en especial en los sistemas públicos de suministro de agua y en las piscin as.
4.6
Tinción:
Tinción de Gram, método de identificación de bacterias mediante una tinción específica.
Desarrollado por el médico danés Hans Christian Joac him Gram, es un procedimiento utilizado
universalmente. E n un primer momento las bacterias se tiñ en con violeta de genciana (derivado
metilado anilínico) y después se tratan con la solución de Gram (1 parte de yodo, 2 partes de
yoduro potásico y 300 partes de agua); por último s e lavan con alcohol etílico, y unas bacterias
retienen el fuerte color az ul de la violeta de genciana y otras se decoloran por completo. A veces
se añade una contratinción con fucsina o eosina para teñir las bacterias decoloradas de color rojo
y
hacerlas
más
visibles.
Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul y bacterias Gram
negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de
tinción de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas típicas son los
estafilococos que producen forúnculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de
la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la
tuberculosis.