SE07_RJaramillo_Ensayos peróxido_En

Ensayos para el control de la Caligidosis: impacto del peróxido de hidrόgeno en
la ultraestructura de la cápsula ovígera de C. rogercresseyi
R. Jaramillo1, O. Garrido1, G. Asencio2 K. Saez1 P. Barria3 y J. Mancilla3, 4
1Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas, Universidad Austral de Chile; 2Centro de
Investigaciones I-Mar, Universidad de Los Lagos; 3Unidad Caligus, Laboratorio Central, Marine
Harvest Chile. 4Programa de Doctorado en Acuicultura UACH. [email protected]
Introducción
La caligidosis en Chile, es causada por Caligus rogercresseyi (Boxhall y Bravo 2000),
un parásito del robalo Eleginops maclovinus (Cuvier) (Carvajal y col., 1998). La
literatura sugiere que este parásito fue transmitido desde la especie nativa a la
trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss W.) y al salmón Atlántico (Salmo salar L.), las
cuales son más susceptibles de ser infectadas. Sin embargo, desde hace algunos
años también se han encontrado estadios juveniles de este parásito infectando
smolts de salmón coho (Oncorhynchus kisutch W.) después de que éstos han sido
transferidos desde agua dulce (González y col., 2012).
El aumento de los volúmenes de producción de salmonídeos junto con las altas
densidades de cultivo y la proximidad entre centros, ha facilitado el desarrollo y
expansión de la caligidosis en las áreas geográficas en donde se desarrolla esta
actividad, contribuyendo a elevar la carga parasitaria de los peces y promoviendo
el contagio y la prevalencia de esta epidemia (Rozas y Asencio, 2007; Bravo y col.,
2008).
Con la finalidad de mitigar o eliminar los efectos de este ectoparásito, se ha
probado una serie de productos y metodologías, entre las que se incluyen el uso de
desinfectantes, antiparasitarios, fármacos, vacunas, productos naturales,
depredadores, peces biocontroladores , baños térmicos, agua dulce, ultrasonido,
electricidad, láser óptico, cercos o faldones, cebos, trampas, etc. (Asencio, 2014).
La literatura reporta que el tratamiento más comúnmente usado para controlar la
proliferación del piojo del salmón en el hemisferio norte (Lepeophtheirus salmonis;
Krøyer, 1837), son los baños de peróxido de hidrógeno en concentraciones que van
entre 1,5 a 2 g L-1 por 20 minutos (Pike y Wadsworth, 1999). Dicho procedimiento
ha mostrado ser efectivo para remover entre el 85% y el 100% de los estadios
adultos y pre-adultos de esta especie de piojo, presentes en ejemplares del salmón
Atlántico (Johnson y col., 1993). Sin embargo, este tratamiento no parece tener un
efecto significativo en reducir el número individuos en estado de chalimus (Johnson
y col., 1993; Pike y Wadsworth, 1999).
A pesar de lo ampliamente conocido del tratamiento con peróxido de hidrógeno,
hasta el momento se desconoce la forma en que éste actúa sobre el piojo del
salmón. Algunos autores como Thomassen, 1993; Bruno y Raynard, 1994; Treasurer
y col., 2000, sugieren que el peróxido podría generar burbujas de aire en la
hemolinfa del parásito, aumentando con ello la flotabilidad del piojo obligándolo a
subir a la superficie y de paso liberando al pez del parásito. Estudios in vitro
reportan que el peróxido de hidrógeno sería capaz de producir una alteración en el
color de la pigmentación de las cápsulas ovígeras, el cual pareciera tener efectos
nocivos sobre la viabilidad del huevo, no así sobre el estado chalimus (Mc Andrew y
col., 1998).
Desconociéndose el mecanismo de acción del peróxido sobre el piojo del salmón, y
considerando los antecedentes previamente reportados que indican un cambio de
coloración que sufriría la cápsula ovígera de Caligus y su potencial efecto sobre la
viabilidad de las larvas en desarrollo, resulta interesante obtener información que
contribuya a entender la forma en que el peróxido de hidrogeno actúa sobre la
pared de la cápsula ovígera de esta especie.
En consecuencia, el propósito del presente trabajo fue investigar los cambios
ultraestructurales de la pared de la cápsula ovígera de C. rogercresseyi, frente a
los baños de peróxido de hidrógeno, en diferentes concentraciones
Material y métodos
Ultraestructura de las cápsulas ovígeras de C. rogercresseyi
Cápsulas ovígeras de C. rogercresseyi se obtuvieron a partir de hembras maduras
parasitando ejemplares de salmón Atlántico en balsas jaulas de centros de engorda
de la empresa Marine Harvest Chile, ubicados en Lincay y Llinhua, Isla de Chiloé,
en campañas realizadas durante agosto y septiembre del 2014. Las hembras
ovígeras de este parásito fueron sometidas a dos ensayos in vitro para evaluar su
sensibilidad a este químico (Fig. 1), utilizándose el protocolo recomendado por los
proveedores del producto, el cual consiste en aplicar baños de peróxido de
hidrogeno al 50% por 20 minutos, a 12 °C (Thomassen, 1993), en concentraciones
experimentales de 0 ppm (control), 750 ppm, 1.000 ppm y 1.500 ppm.
Para cada dilución experimental, se utilizaron las cápsulas ovigeras de tres hembras
maduras y por cada dilución se realizaron tres réplicas. Transcurrido el tiempo de
exposición al peróxido, se procedió a separar las hembras de las cápsulas ovígeras
mediante el uso de pinzas, guardando solamente las cápsulas, las que fueron
fijadas en una solución de glutaraldehido al 3%.
Las cápsulas así fijadas, fueron procesadas para su estudio a la Microscopia
Electrónica de Barrido (MEB) para lo cual fueron lavadas en buffer fosfato de sodio,
pH 7,2-7,4 (0,2 M), posteriormente post-fijadas en una solución de OsO4 al 1% en el
mismo buffer durante 2 h a 4 °C y, más tarde, deshidratadas en soluciones de
concentración creciente de alcohol y acetona, seguido del proceso de secado al
punto crítico del CO2. Las muestras fueron montadas en un portaespécimen para
MEB, recubiertas con una película de oro de aproximadamente 10 a 15 nm de
espesor (Ion coater IB-2) y luego observadas en un microscopio electrónico de
barrido LEO-420.
Las fotografías obtenidas a la MEB fueron analizadas mediante el uso del software
de análisis de imágenes SigmaScan pro5 (SPSS - Inc.).
Resultados del Impacto del peróxido de hidrógeno
El análisis de las imágenes de MEB reveló que la cápsula corresponde a una
estructura tubular con extremos redondeados y de 2,75 mm (± 5,2 n=20) de
longitud promedio; el diámetro promedio de las cápsulas normales fue de 325 µm ±
26,50 µm (n=20) mientras que el diámetro de las tratadas con peróxido de
hidrógeno (independiente del tratamiento) registraron un valor promedio de 280
µm ± 20,18 µm (n= 20). En el interior de la cápsula se dispone un número variable
de huevos en desarrollo, que presentan un diámetro promedio de 260 µm (n=80),
rodeados de un fluido extracelular.
La observación a la MEB, de cápsulas recién ovopositadas y utilizadas como control
(0 ppm), permitió establecer que la superficie de éstas corresponde a una
envoltura lisa, con una serie de surcos leves, distribuidos a intervalos de
aproximadamente 68 µm, que corresponden a los huevos en desarrollo en su
interior (Fig. 2).
Las cápsulas tratadas con 750 ppm de peróxido mostraron una modificación externa
muy evidente, que se traduce en la aparición de una serie de constricciones (que
recuerdan la forma de las cuentas de un collar) en donde se produce la agregación
de tres a cinco huevos por constricción (Fig. 3). Esta modificación ocurre a lo largo
de toda la cápsula y se extiende incluso hasta los extremos, tal como se observa en
la Figura 4. Entre cada una de las constricciones se produce la liberación de un
pequeño espacio, de extensión variable, pero que permite observar la pared de la
cápsula de manera muy tensionada y con una serie de pliegues (Fig. 3). Los
extremos proximal y distal de la cápsula muestran una serie de perforaciones y
rugosidades que no se observan en el resto de esta estructura (Figs. 4, 5).
Externamente, las cápsulas tratadas con 1.000 y 1.500 ppm de peróxido, se ven
más tensionadas como resultado de la reducción de su diámetro (Fig. 6) y que se
manifiesta por la aparición de los bordes que limitan cada uno de los huevos,
mientras que la pared de las regiones extremas muestra un alto grado de rugosidad
y una serie de poros que indican la ruptura o desgaste de la pared por acciόn del
perόxido, adicionalmente, se observan una notable proliferación de hongos y
bacterias en superficie (Fig. 7).
Discusión
La literatura indica que, en Chile, entre el 2000 y 2007, el único tratamiento
contra C. rogercresseyi fue el benzoato de emamectina, el cual perdió efectividad
tras ser utilizado por esos siete años consecutivos. En su reemplazo, ese año se
introdujo el tratamiento más comúnmente usado para controlar la proliferación del
piojo del salmón en el hemisferio norte (L. salmonis), y que corresponde a baños
de peróxido de hidrógeno en concentraciones que van entre 1,5 a 2 g L-1 durante 20
minutos (Bravo y col., 2010, Pike y Wadsworth, 1999). Este producto continúa en
uso, en forma esporádica, para reducir esta parasitosis, recomendándose la
aplicación en sistemas cerrados (wellboats o jaulas cerradas por lonas), y
resguardando las exigencias de las normativas sanitarias y ambientales vigentes
para la salmonicultura.
La implementación de este tipo de tratamiento farmacológico sobre caligidos tiene
tres niveles de acción, los cuales no han sido completamente dimensionados; el
primer nivel, que es el más conocido y estudiado, se relaciona con el efecto sobre
el parásito adulto; un segundo nivel se relaciona con el efecto sobre el desarrollo
avanzado (desde nauplios a chalimus), el cual ha sido parcialmente estudiado por
Toovey y Lyndon, (2000) y Aaen y col. (2014); y el tercer nivel corresponde al
efecto sobre el desarrollo temprano (formación de la cápsula y el posterior
desarrollo de los huevos hasta la formación del nauplio) sobre el cual existen
escasos antecedentes.
Bravo y col. (2015) realizaron ensayos con diferentes productos farmacológicos,
incluyendo el peróxido de hidrógeno en concentraciones por debajo de los valores
regularmente usados en los tratamientos habituales para el control de C.
rogercresseyi y han logrado demostrar que todos ellos impactan la sobrevivencia de
los huevos, disminuyendo el número de las larvas que eclosionaron desde las
cápsulas. En el caso particular del tratamiento con peróxido, se reporta la
liberación de huevos abortivos a partir de las 24 horas post tratamiento y hasta el
quinto dia post-tratamiento, sin que se haya logrado observar estadios de nauplios
vivos.
Los resultados de nuestro estudio indican que los baños de peróxido de hidrógeno
en concentración de 750 ppm producen ruptura de algunas de las siete capas que
conforman la pared de la cápsula de C. rogercresseyi (Jaramillo y col., 2015),
alterando la permeabilidad de ésta (Mc Andrew y col. 1998) y causando la muerte
temprana de los huevos en desarrollo. Junto con ello, la aparición de rugosidades
que reducen el diámetro promedio de la pared capsular contribuirían a facilitar la
liberación de los huevos. Estos cambios en la pared capsular podrían explicar la
liberación de huevos abortados a las primeras 24 horas post tratamiento, como se
reporta en las experiencias de Bravo y col. (2015), asumiendo que algunas de las
cápsulas utilizadas en dichas experiencias hayan estado en un estado temprano de
desarrollo.
Por el contrario, la apariciόn de estrangulaciones (cuentas de collar) y
deformaciones en la pared capsular podrían postergar, por algun tiempo, la
liberación de huevos en desarrollo hasta que se produce la degradaciόn parcial o
total de la pared capsular por las bacterias y hongos que predominan en la
superficie capsular. Estas alteraciones estructurales de la cápsula podrian explicar,
por ejemplo, la liberación de huevos abortivos en los siete dias posteriores al
tratamiento (Bravo y col. 2015). En este caso es posible que los huevos hayan
muerto al inicio del tratamiento, pero por factores físicos no fue posible su
liberación inmediata.
Una variable a tener presente al recomendar el peróxido de hidrógeno en el control
de los caligidos, es la resistencia que adquieren éstos parásitos por el uso contínuo
de un único fármaco, como describen Helgesen y col. (2015) para L. salmonis. Por
ende, garantizar un número menor de tratamientos que controlen efectivamente y
de forma permanente las poblaciones de este parásito, podría transformarse en una
alternativa de manejo de esta enfermedad, resguardando con ello la viabilidad de
éste fármaco.
Al reducir o limitar la diseminación de larvas de caligidos se lograría dicho control,
ya que se minimizaría la tasa de infección entre centros, así como la autoinfección.
Adicional a esto, la potencial disminución de la fecundidad de las hembras ovígeras
de este parásito se puede convertir en una herramienta factible de explorar en los
futuros programas de control para esta enfermedad.
Referencias
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Figuras
!
Figura 1. A. Laboratorio donde se realizó la experiencia, B. placas experimentales y
cámara de incubación, C. imagen de los sacos ovígeros previo al ensayo.
Figura 2. Imagen de una hembra de Caligus rogercresseyi a la MEB con cápsulas
ovigeras no sometidas a tratamiento con perόxido
Figura 3. Imagen a la MEB de la región media de una cápsula de Caligus
rogercresseyi tratada con 750 ppm de peróxido de hidrógeno: se observan dos
protuberancias tipo cuenta de collar, separadas por una constricción entre ellas.
Las flechas indican las rugosidades que sufre la pared de la cápsula.
Figura 4. Imagen a la MEB de la región proximal de una cápsula de Caligus
rogercresseyi tratada con 750 ppm de peróxido de hidrógeno mostrando
perforaciones y rugosidades presentes sobre la pared de la cápsula.
Figura 5. Imagen a la MEB de la región distal de una cápsula de Caligus
rogercresseyi tratada con 750 ppm de peróxido de hidrógeno: es posible apreciar
perforaciones y rugosidades sobre la pared de la cápsula.
Figura 6. Imagen a la MEB de cápsulas de Caligus rogercresseyi tratada con 1.000
ppm de peróxido de hidrógeno: es posible observar la clara delimitación de cada
uno de los huevos en incubación.
Figura 7. Imagen a la MEB de la región distal de una cápsula de Caligus
rogercresseyi tratada con 1.500 ppm de peróxido de hidrógeno, donde es posible
apreciar perforaciones y pequeñas poblaciones de hongos.