Producción de bioinoculantes eficientes para el cultivo de
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Construyendo la Nueva Universidad Producción de bioinoculantes eficientes para el cultivo de leguminosas, gramíneas y solanáceas: mediante la utilización de cepas nativas de microorganismos diazotróficos Investigador: Ing. Iván Granda Mora Resumen H asta la fecha se han obtenido resultados muy positivos del proyecto en mención, tanto a nivel de laboratorio, invernadero y de campo, los mismos que están siendo escritos para su publicación en revistas indexadas, por lo que en esta sección solo nos remitiremos a los resultados iniciales obtenidos del estudio de la determinación de la variabilidad de aislados diazotróficos simbióticos procedentes del cultivo de frejol común (Phaseolus vulgaris L.) en diferentes zonas agroecológicas de la provincia de Loja, Ecuador. Para el efecto se muestrea- ron un total de 12 cantones con diferentes zonas agroclimáticas, las cuales se geo-referenciaron mediante el Sistema de Posicionamiento Global. La determinación de la variabilidad de los aislados se realizó mediante la caracterización morfológica de las colonias obtenidas, donde se evaluó la tinción al Gram, crecimiento, color, producción de mucus, bordes y elevación. La caracterización bioquímica se llevó a cabo mediante el crecimiento de los aislados en medios selectivos: Mac Conkey, Agar Kligler, Extracto de Levadura Manitol Agar-Rojo Congo y Pepto- na Glucosa Agar. De un total de 50 aislados iniciales, 34 de ellos presentaron diferencias en al menos un parámetro evaluado en los análisis morfológicos. Los resultados de las pruebas bioquímicas demostraron la pureza de las cepas aisladas, las cuales corresponden con las características pertenecientes al género Rhizobium, lo que demuestra la variabilidad morfológica y bioquímica de estas especies para este género al sur del Ecuador, las cuales pueden ser la base para obtención de cepas eficientes en la realización de inoculantes para este cultivo. paces de realizar este proceso se encuentran los denominados fijadores simbióticos, los cuales fijan N2 atmosférico en interacción con organismos superiores, siendo la familia Rhizobiaceae la que agrupa los géneros más importantes utilizados en la biofertilización en diferentes cultivos, conociéndose genéricamente como rizobia (Bauer, 2001). Entre los diferentes sistemas biológicos capaces de fijar N2 atmosférico, la simbiosis Rhizobium-leguminosa constituye con la mayor cantidad de N aportada al ecosistema y a la producción de alimentos (Lindström, 2010). Se estima que esta puede oscilar entre 200 y 250 kg N ha-1 año (Cerón et al., 2012) constituyendo la asociación más elaborada y eficiente entre plantas y microorganismos (Olivares et al., 2013). mento básico para el consumo humano directo, no solamente por el aporte de proteínas y minerales, sino a la vez por la superficie cultivada que garantiza la seguridad y soberanía alimentaria. El área cultivada de este grano en el país supera las 400 000 ha año-1 (INEC, 2012). A pesar de la importancia de este cultivo para el país, los estudios relacionados con la interacción Rhizobium-frejol común para incrementar los rendimientos agrícolas mediante esta asociación son muy escasos (Bernal, 2004). Según Michiels et al., (1998), el frejol común es una leguminosa promiscua, la cual interacciona con diferentes especies del género Rhizobium, disminuyendo de forma sustancial la eficiencia del proceso simbiótico. Estos aspectos ponen en evidencia que se hace imprescindible el conocimiento de los géneros y especies de microsimbiontes en diferentes condiciones agroecológicas del Sur del Ecuador. Introducción Los procesos naturales de fijación biológica del nitrógeno (FBN) juegan un importante rol en la activación de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio ambiental (Beever, 2007). El incremento de su aplicación puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su consiguiente efecto benéfico al ciclo del nitrógeno (N), el calentamiento global y el saneamiento de las aguas subterráneas y superficiales (Cerón et al., 2012). Este proceso depende básicamente de la acción de los microorganismos en conjunto con las plantas. Existen algunas especies de microorganismos que poseen la habilidad de convertir el dinitrógeno (N2) atmosférico a amonio (NH4+) mediante la acción del complejo enzimático nitrogenasa (Martínez, 2000). Estas especies son denominados diazótrofos y requieren de energía para realizar su metabolismo (Martínez-Romero, 2003). Dentro de los diazótrofos ca- En Ecuador, leguminosas como el frejol común (Phaseolus vulgaris), constituyen un ali- Materiales y Métodos Se colectaron de forma aleatoria muestras de plantas de fréjol común con presencia de nódulos en sus raíces en diferentes zonas agroclimáticas de la provincia de Loja. No se tuvo en cuenta la edad de los cultivos de frejol ni el tipo de suelo, solo la presencia de nódulos en sus raíces. Los puntos de muestreos se ubicaron según las zonas más productoras de esta leguminosa (ver figura 1). Estas áreas fueron geo-referenciadas mediante la utilización del Sistema de Posicionamiento Global (GPS). Luego de la obtención de las muestras, estas se acondicionaron en bolsas ziploc y llevadas al laboratorio para su 10 Unidad de Difusión y Transferencia de Conocimiento e Innovación procesamiento antes de las 24 horas. En todos los casos se comprobó la actividad de los nódulos mediante la escisión de los mismos con el objetivo de observar la pigmentación de la leghemoglobina, lo cual indica la viabilidad de los bacteroides dentro del nódulo y por consiguiente la vitalidad de estos para su posterior aislamiento. Preparación de las muestras y aislamiento de colonias bacterianas Las muestras se procesaron mediante el método de siembra en placas Construyendo la Nueva Universidad Petri y agotamiento por estrías (Torres-Gutiérrez, 2008). Se tomaron entre 15-20 nódulos por cada muestra para realizar la esterilización de los mismos mediante la inmersión 1 minuto en etanol 70% y 3 minutos en hipoclorito de sodio (NaOCl) al 3 %. Posteriormente se procedió al lavado intenso de los nódulos (hasta 10 veces) con agua destilada estéril, con el propósito de eliminar todo resto de sustancia tóxica a las bacterias. Luego del lavado se realizó la maceración de los nódulos en 500 µl de agua destilada estéril en microtubos de 2ml. De la suspensión obtenida del macerado en cada muestra se sembró por estrías en placas Petri conteniendo medio Agar Triptona Extracto de Levadura (ATEL) e incubadas a 28°C durante 3 días. Al finalizar el periodo de incubación todas las colonias crecidas se purificaron mediante la siembra repetida en medio Extracto de Levadura Manitol Agar (ELMA) e incubadas a 28°C durante 72 horas (Remans et al., 2007). Luego del periodo de incubación las cepas se conservaron a -80°C en glicerol (50 % v/v). Caracterización morfológica y bioquímica de los aislados Todos los aislados obtenidos mediante el proceso de aislamiento se caracterizaron morfológicamente mediante la diferenciación de las colonias respecto a: tinción al Gram, tipo de crecimiento, color, producción de mucus, bordes y elevación de las colonias (Granda-Mora et al., 2009). La caracterización bioquímica consistió en determinar el crecimiento de los aislados en los medios selectivos Peptona Glucosa Agar (PGA), Mc Conkey, Agar Kligler y ELMA con adición de Rojo Congo (ELMA-RC). Resultados Geo-localización de las zonas muestreadas Un amplio muestreo se llevó a cabo en la investigación para obtener la mayor representatividad de localidades de la provincia de Loja. El muestreo se realizó en 50 localidades abarcando 12 cantones (Loja, Calvas, Gonzanamá, Catamayo, Espíndola, Olmedo, Paltas, Célica, Macará, Saraguro, Pindal, Sosoranga) repartidos entre las áreas de mayor producción de frejol común a nivel de la provincia de Loja (ver figura 1) con alturas que se encontraron entre los 700 hasta 2060 msnm. Figura 1. Zonas muestreadas ( ) para el aislamiento de cepas de Rhizobium, en diferentes condiciones agroclimáticas de la provincia de Loja. Caracterización morfológica Un total de 50 aislados se obtuvieron luego del procesamiento de las muestras. De ellos treinta y cuatro contaron con características morfológicas pertenecientes al género Rhizobium. La variabilidad de los caracteres morfológicos de las bacterias diazotróficas se evidenció teniendo en cuenta que de los treinta y cuatro aislados seleccionados, todos presentaron características diferentes en al menos un parámetro morfológico evaluado. El resto de aislados analizados presentaron características en su crecimiento colonial que no corresponden a las descritas para el género Rhizobium. Estos aislados por no ser parte de nuestros estudios no se presentan en resultados. En la figura 2, se muestran algunos ejemplos de imágenes de las tinciones de Gram y el crecimiento de las colonias purificadas. Unidad de Difusión y Transferencia de Conocimiento e Innovación 11 Construyendo la Nueva Universidad Tabla 1. Caracterización morfológica de los aislados de nódulos de frejol común con diferencia en al menos un parámetro morfológico evaluado. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Aislado Crec.a Colorb Mucusc Bordesd Elevac.e Gramf Morfol.g VP1 + 4 ++ 2 ++ - BC VP2 +++ 4 +++ 3 + - BC RC1 + 5 +++ 2 ++ - BC Tur1 ++ 5 ++ 2 ++ - BC Cañ1 +++ 5 + 3 ++ - BC Rai1 ++ 4 ++ 3 ++ - BC Tabl1 ++ 4 ++ 1 ++ - BC Namb1 +++ 3 ++ 2 ++ - BC Tamb1 ++ 4 ++ 1 ++ - BC CB1 +++ 4 + 2 ++ - BC Nar1 +++ 4 +++ 2 ++ - BC LP1 ++ 4 +++ 2 ++ - BC VP3 ++ 2 +++ 1 ++ - BC VP4 ++ 4 ++ 1 ++ - BC RC2 ++ 4 + 2 ++ - CB Tur2 +++ 2 + 3 + - BC Cañ2 +++ 4 ++ 2 ++ - BC Rai2 +++ 4 ++ 3 ++ - BC Tabl2 +++ 4 ++ 2 ++ - BC Namb2 +++ 4 +++ 2 ++ - BC Tamb2 ++ 4 +++ 2 ++ - BC CB2 +++ 4 +++ 3 ++ - BC Nar2 ++ 2 ++ 1 ++ - BC LP2 ++ 4 +++ 2 ++ - BC Q4 + 4 ++ 2 ++ - BC Z1 + 2 ++ 3 ++ - BC Z3 ++ 4 ++ 2 ++ - BC Z4 ++ 4 ++ 3 ++ - BC Pindal1 +++ 4 +++ 2 ++ - BC Pindal 3.2 ++ 4 +++ 2 ++ - BC Col 1 +++ 4 +++ 2 ++ - BC Col 6.2 +++ 4 +++ 3 ++ - BC Soso 1.1 +++ 2 +++ 1 ++ - BC Soso 4.2 +++ 4 +++ 2 ++ - BC a: Crecimiento: (+) ligero, (++) moderado; (+++) abundante; b: Color: (2) traslucido, (3) opaco, (4) blanco opaco, (5) crema; c: Mucosidad: (+) ligero, (++) moderado, (+++) abundante; d: Bordes: (1) liso, (2) ondulado, (3) lobulado; e: Elevación: (+) plana, (++) elevado f: Gram: (-) negativo; g: Morfología: BC (bacilo corto), BL (bacilo largo), CB (coco-bacilo); h: Forma de crecimiento en siembra por estrías: (1) Continua en línea recta, (2) Continua con bordes filiforme, (3) Espinoso, (4) Punteado, (5) rizoide. Abreviaturas de las localidades de aislamientos: V.P: Virgen Pamba, R.C: Reina del Cisne, Tur: Turupamba, Cañ: Cañaro, Rai: Raiminche, Tabl: Tabloncillo, Namb: Nambacola, Tamb: El Tambo, C.B: Capilla Baja, Nar: Naranjo, L.P: Los Pinos. Q: Quiskinchir, Z: Zhindar, Pindal, Col: Colaisaca, Soso: Sosoranga. 12 Unidad de Difusión y Transferencia de Conocimiento e Innovación Construyendo la Nueva Universidad Figura 2. Representación de la tinción al Gram y caracterización morfológica de los aislados. Con excepción de la localidad de Virgen Pamba, donde se obtuvieron cuatro aislados, en el resto de las localidades se obtuvo dos y tres aislados. Se destaca de las características morfológicas la producción de mucus de los aislados obtenidos. En un total de 15 cepas la producción de mucus es abundante, aspecto que se pudo corroborar en el crecimiento al cabo de las 72 h de incubación. Caracterización bioquímica En el Tabla 1 y la Figura 3 se presentan los resultados de las pruebas bioquímicas para determinar la pureza de los aislados de Rhizobium. En este análisis se determinó el crecimiento de las bacterias en los medios PGA, Agar Mac Conkey, Agar Kligler y ELMA-RC. La Figura 3 muestra el crecimiento de algunos de los aislados en los medios Mc Conkey (Fig. 3-A) y PGA (Fig. 3-B), donde no se observa crecimiento colonial de los aislados diazotróficos. En el panel C se observa el crecimiento en estrías de las colonias bacterianas en medio ELMA-Rojo Congo. Los tubos del crecimiento en Agar Kligler no muestran cambio de coloración en el medio, evidenciando que no se fermenta glucosa ni lactosa. Figura 3. Pruebas bioquímica de los aislados. A: Cultivo en medio Mac Conkey. B: Cultivo en medio PGA. C: Cultivo en medio ELMA-Rojo Congo. D: Cultivo en medio Kliger. Unidad de Difusión y Transferencia de Conocimiento e Innovación 13 Construyendo la Nueva Universidad Tabla 2. Caracterización bioquímica de los aislados obtenidos de Rhizobium Aislados PGA Mac Conkey ELMA-RC Crecimiento Agar Kligler Glucosa Lactosa Sulfhídrico VP1 - - + - - - VP2 - - + - - - RC1 - - + - - - Tur1 - - + - - - Cañ1 - - + - - - Rai1 - - + - - - Tabl1 - - + - - - Namb1 - - + - - - Tamb1 - - + - - - CB1 - - + - - - Nar1 + + - + + - LP1 + + - + + - VP3 - - + - - - VP4 - - + - - - RC2 - - + - - - Tur2 - - + - - - Cañ2 - - + - - - Rai2 - - + - - - Tabl2 - - + - - - Namb2 - - + - - - Tamb2 + + - + - - CB2 - - + + - - Nar2 - - + - - - LP2 - - + - - - Q4 - - + - - - Z1 - - + - - - Z3 - - + - - - Z4 - - + - - - Pindal1 - - + - - - Pindal 3.2 - + + - - - Col 1 - - + - - - Col 6.2 - - + - - - Soso 1.1 - + + - - - Soso 4.2 - - + - - - Leyenda: Crecimiento en medio PGA (peptona-glucosa-agar): - (negativo), + (positivo). Crecimiento en medio Mac Conkey: - (negativo), + (positivo). Crecimiento en medio ELMA suplementado con Rojo Congo: - (negativo), + (positivo). Crecimiento en medio Klligler (fermentación de glucosa, lactosa o producción de ácido sulfhídrico): - (negativo), + (positivo). Abreviaturas de las localidades de aislamientos: V.P: Virgen Pamba, R.C: Reina del Cisne, Tur: Turupamba, Cañ: Cañaro, Rai: Raiminche, Tabl: Tabloncillo, Namb: Nambacola, Tamb: El Tambo, C.B: Capilla Baja, Nar: Naranjo, L.P: Los Pinos. Q: Quiskinchir, Z: Zhindar, Pindal, Col: Colaisaca, Soso: Sosoranga. Como se aprecia en la tabla 2, con excepción de los aislados de la localidad de Naranjo 1, Los Pinos 1, Tambo 2, Capilla baja 2, Pindal 3.2 y Sosoranga 1.1 todas las demás bacterias diazotróficas tuvieron comportamientos según su crecimiento en los medios de cultivos que corroboran las características del desarrollo del género Rhizobium. Al analizar estos resultados nos encontramos con poca variabilidad entre los aislados, aspecto este de gran importancia, ya que demuestra que la gran mayoría de los aislados diazotróficos obtenidos concuerdan con las características deseadas para este tipo de estudio. Conclusiones •Un total de 50 aislados se obtuvieron del procesamiento de las muestras. De ellos treinta y cuatro contaron con características morfológicas pertenecientes al género Rhizobium. •Losanálisismorfológicosybioquímicosdemuestranladiversidad de especies pertenecientes al género Rhizobium en los suelos de esta región Sur del Ecuador. Palabras claves: aislamientos, morfología, pruebas bioquímicas, Rhizobium 14 Unidad de Difusión y Transferencia de Conocimiento e Innovación
