E-043 - Universidad Nacional del Nordeste

Resumen: E-043
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Respuesta de bacterias lácticas autóctonas de Corrientes
a residuos de detergentes y desinfectantes.
Gioia, L. Marino - Vasek, Olga M.
Laboratorio de Bromatología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura - UNNE.
Av. Libertad 5600 (Campus), 3400 Corrientes. [email protected]. T.E.: 03783-457996, int. 110
Antecedentes
Las cepas constituyentes de un fermento láctico, deben ser capaces de multiplicarse rápidamente en el sustrato
utilizado a nivel industrial durante la producción, a fin de generar suficiente ácido láctico y diversos metabolitos que
influyen en la elaboración y maduración de quesos.
Esta actividad de los cultivos lácticos puede ser inhibida total o parcialmente, dando lugar a productos lácteos
de escasa calidad o provocar fermentaciones fallidas, con la consiguiente pérdida económica. Los factores de mayor
importancia involucrados en esta inhibición pueden ser: condiciones de fabricación del producto, composición de la
leche y agentes inhibidores presentes en la misma (bacteriófagos, antibióticos, peróxido de hidrógeno, residuos de
detergentes y/o desinfectantes por enjuagues inadecuados).
Además de los efectos tóxicos que derivan de la presencia de estos compuestos en la leche, éstos pueden dar
lugar, al desarrollo de olores y sabores extraños en la misma e interferir en la actividad de los cultivos iniciadores
durante los procesos de fermentación, muchas células pueden ser inhibidas a bajas concentraciones y otras ser muy
resistentes (Winniczuk, P. P. and M. E. Parish, 1997; Shidgu et al., 2001, Langsruda et al., 2003; Beltrán et al., 2005;
Patton et al., 2005; Herrerosa, M. A. et al., 2005).
Las Instituciones de investigación láctea proporcionan manuales de limpieza y desinfección, especificando que,
con que, cuando lavar o desinfectar y las condiciones de uso (concentración, temperatura, tiempo de contacto) de cada
agente particular para cada empresa también particular, pero no las condiciones de enjuague, temperatura del agua,
cantidad de agua, tiempo de contacto.
Si bien existe importante material bibliográfico directamente relacionado con el tema, la sensibilidad a estos
agentes es “cepa-dependiente”. Por estas razones, y en virtud de que no existen datos propios al respecto, surge la
inquietud de estudiar la acción de residuos de estos compuestos químicos en cepas salvajes de Corrientes.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la sensibilidad de las bacterias lácticas constituyentes del fermento “Gaucho” a
residuos de detergentes y desinfectantes usados en las producciones artesanales queseras de Corrientes.
Materiales y Métodos
Microorganismos. Las bacterias lácticas (BAL) utilizadas en este estudio, constituyentes del Fermento “Gaucho”,
pertenecen a la Colección biológica de bacterias lácticas autóctonas de Corrientes, FACENA, UNNE: Lactobacillus
(Lb.) plantarum 77bVCOR, Lactococcus (Lc.) lactis subsp. lactis 35cVCOR, 138cVCOR, 199cVCOR y 207cVCOR.
Reactivación y purificación de las cepas. Los microorganismos conservados originalmente en crioviales a -20ºC en
medio LELg (leche, extracto de levadura, lactosa, glicerol) se descongelaron, se transfirieron a caldo MRS (Merck) o
medio LAPTg (extracto de levadura, 10g; peptona, 15g; triptona, 10g; glucosa, 10g; twen 80, 1mL; agua destilada,
1000mL) según corresponda para lactobacilos y lactococos respectivamente, y se activaron “overnight” a 30 °C.
A fin de obtener clones jóvenes y puros del organismo en estudio, se realizaron tres pasajes sucesivos en los respectivos
medios sólidos y líquidos, y la pureza se verificó mediante microscopía directa.
Relación entre el tiempo de incubación, el número de microorganismos y su absorción de luz visible. Cada cepa pura y
activa, se incubó a 30 ºC durante 4 tiempos diferentes como mínimo. A cada tiempo, se determinaron:
a) el número de microorganismos. Inóculos apropiados de las diluciones antes mencionadas, se sembraron por
duplicado utilizando el método de inoculación y vertido. Las placas sembradas se incubaron a 30 ºC durante 48 h.
b) absorción de luz visible a 560 nm mediante espectrofotometría.
Soluciones de los detergentes y/o desinfectantes. Se utilizaron cinco compuestos que generalmente se integran a la
formulación de detergentes y/o desinfectantes y un detergente comercial de base lauril eter sulfonato/alquil bencen
sulfonato. El tipo de compuesto se seleccionó teniendo en cuenta cuales son los corrientemente adquiribles y utilizables
en nuestro medio, y las concentraciones de ensayo de acuerdo con las usadas frecuentemente en industrias lácteas o
propuestas por los fabricantes, según el detalle adjunto:
soluciones stock de hidróxido de sodio, ácido fosfórico, ácido nítrico, compuestos de amonio cuaternario
(QAC: cloruro de benzalconio) y detergente comercial de uso doméstico: 2 % (p/v), valoradas por
alcalimetría/acidimetría (excepto el detergente). Concentraciones finales de ensayo: 2.0, 1.5, 1.0 y 0.5 %,
respectivamente,
solución stock de hipoclorito de sodio: 6 % (v/v), valorada por determinación de cloro activo según el método
yodimétrico. Concentraciones finales de ensayo: 6.0, 4.0, 2.0, 1.0 y 0.5 %, respectivamente.
Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) según el método de microdifusión. Las células se
incubaron hasta alcanzar la fase de crecimiento exponencial, se cosecharon por centrifugación (2600 rpm, 15 min), se
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lavaron tres veces con solución fisiológica (0.9 % NaCl p/v) y se resuspendieron en igual solución al volumen original.
Una alícuota (1 mL) de la suspensión celular se sembró por inoculación y vertido usando agar duro (1.5 % agar), por
duplicado para cada desinfectante. Sobre el agar duro inoculado sólido, se agregó el medio semisólido (0.6 % agar) que
a su vez se dejó solidificar a temperatura ambiente y se realizaron los pocillos con un sacabocados. Una alícuota (15 µl)
de cada dilución de cada compuesto químico a ensayar se colocó en un pocillo, y luego de incubar las placas durante 24
h a 30 ºC, se procedió a la lectura de los halos de inhibición y cuantificación mediante vernier.
Reproducibilidad. Las experiencias se realizaron por triplicado.
Discusión de resultados
Considerando que los microorganismos constituyentes del Fermento “Gaucho” pertenecen a distintos Géneros
microbianos (Lactococcus, Leuconostoc y Lactobacillus) o diferentes subespecies de una misma especie (Lc. lactis
subsp. lactis y Lc. lactis subsp. diacetylactis), se debió tener en cuenta que los mismos poseen velocidades de
crecimiento diferentes, y en consecuencia presentarán recuentos diversos a un mismo tiempo de incubación.
Con el objetivo de estandarizar el número de células a utilizar en los ensayos en el orden de 108 ufc/mL, se
determinó la relación entre la absorbancia a 560 nm y el recuento de microorganismos a distintos (al menos cuatro)
tiempos de incubación. La tabla 1 muestra los tiempos de incubación correspondientes a la carga microbiana pretendida,
para cada una de las cepas ensayadas. La correspondencia de la carga microbiana generada por cada tiempo de
incubación y la absorbancia permitió disponer de una medida necesaria de modo rápido para establecer el recuento total
previo a cada ensayo de concentración inhibitoria mínima.
Tabla 1. Relación entre absorbancia, número de microorganismos y tiempo de incubación de BAL constituyentes del
Fermento “Gaucho”. Los datos corresponden al valor promedio de tres experiencias.
Cepas
Tiempo incubación (h)
Absorbancia 560 nm
Lb. plantarum 77bVCOR
Lc. lactis subsp. lactis
35cVCOR
Lc. lactis subsp. lactis
138cVCOR
Lc. lactis subsp. lactis
199cVCOR
Lc. lactis subsp. lactis
207cVCOR
16.00
7.00
0.969
1.030
Número de
microorganismos (ufc/mL)
9.7 108
1.95 108
7.00
1.105
1.07 108
15.00
1.064
1.06 109
15.00
1.095
9.80 108
Los tiempos de incubación mostrados en la tabla precedente fueron los utilizados para realizar las experiencias
de sensibilidad.
En las tablas 2-6 se presentan los resultados de los ensayos de concentración inhibitoria mínima para las
diferentes cepas ensayadas. Con la observación de los datos obtenidos en forma global, se corrobora el carácter “cepadependiente” de la sensibilidad a los compuestos químicos empleados en la constitución de detergentes/desinfectantes.
La cepa de Lb. plantarum mostró una marcada sensibilidad (Tabla 2) a todas las concentraciones de cloruro de
benzalconio ensayadas, mediana resistencia a los restantes compuestos químicos y su crecimiento no fue afectado por el
detergente comercial.
Tabla 2. Sensibilidad de Lb. plantarum 77bVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se expresan como
x ½ longitud transversal (mm) del halo de inhibición.
NaOH
HNO3
CC
HI
CC
HI
(%)a
(mm)b
(%)a
(mm)b
2.0
0.46
2.0
1.90
1.5
0
1.5
0.56
1.0
0
1.0
0
0.5
0
0.5
0
a
: Concentración
b
: Ancho del halo de inhibición
H3PO4
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
1.88
1.5
0.50
1.0
0
0.5
0
-
QAC
CC
(%)a
2.0
1.5
1.0
0.5
-
HI
(mm)b
12.56
12.25
12.00
11.69
-
Detergente
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
0
1.5
0
1.0
0
0.5
0
-
NaOCl
CC
HI
(%)a
(mm)b
6.0
1.75
4.0
0
2.0
0
1.0
0
0.5
0
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Las cepas de Lc. lactis subsp. lactis ensayadas, presentaron dos tipos de respuestas. Dos de ellas (199cVCOR y
207cVCOR) mostraron ser altamente resistentes (Tablas 5 y 6) al hidróxido de sodio y detergente, tolerantes a los
ácidos nítrico y fosfórico e hipoclorito de sodio, y altamente sensibles a cloruro de benzalconio, en las condiciones de
ensayo. Las dos restantes (35cVCOR y 138cVCOR) presentaron diferencias en la respuesta al hipoclorito de sodio
(Tablas 3 y 4) frente al cual mostraron elevada resistencia.
Tabla 3. Sensibilidad de Lc. lactis 35cVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se expresan como x ½
longitud transversal (mm) del halo de inhibición.
NaOH
HNO3
CC
HI
CC
HI
(%)a
(mm)b
(%)a
(mm)b
2.0
0
2.0
6.87
1.5
0
1.5
0.76
1.0
0
1.0
0
0.5
0
0.5
0
a
: Concentración
b
: Ancho del halo de inhibición
H3PO4
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
2.13
1.5
1.90
1.0
0.54
0.5
0
-
QAC
CC
(%)a
2.0
1.5
1.0
0.5
-
HI
(mm)b
5.58
5.13
4.50
4.22
-
Detergente
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
0
1.5
0
1.0
0
0.5
0
-
NaOCl
CC
HI
(%)a
(mm)b
6.0
0
4.0
0
2.0
0
1.0
0
0.5
0
Tabla 4. Sensibilidad de Lc. lactis 138cVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se expresan como x ½
longitud transversal (mm) del halo de inhibición.
NaOH
HNO3
CC
HI
CC
HI
(%)a
(mm)b
(%)a
(mm)b
2.0
0
2.0
1.81
1.5
0
1.5
1.00
1.0
0
1.0
0.54
0.5
0
0.5
0
a
: Concentración
b
: Ancho del halo de inhibición
H3PO4
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
2.24
1.5
1.66
1.0
0.38
0.5
0
-
QAC
CC
(%)a
2.0
1.5
1.0
0.5
-
HI
(mm)b
5.87
5.52
5.37
3.92
-
Detergente
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
0
1.5
0
1.0
0
0.5
0
-
NaOCl
CC
HI
(%)a
(mm)b
6.0
0
4.0
0
2.0
0
1.0
0
0.5
0
Tabla 5. Sensibilidad de Lc. lactis subsp. lactis 199cVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se
expresan como x ½ longitud transversal (mm) del halo de inhibición.
NaOH
HNO3
CC
HI
CC
HI
(%)a
(mm)b
(%)a
(mm)b
2.0
0
2.0
0.62
1.5
0
1.5
0.50
1.0
0
1.0
0
0.5
0
0.5
0
a
: Concentración
b
: Ancho del halo de inhibición
H3PO4
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
1.67
1.5
0.67
1.0
0.60
0.5
0
-
QAC
CC
(%)a
2.0
1.5
1.0
0.5
-
HI
(mm)b
2.75
2.58
2.00
1.54
-
Detergente
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
0
1.5
0
1.0
0
0.5
0
-
NaOCl
CC
HI
(%)a
(mm)b
6.0
0.33
4.0
0
2.0
0
1.0
0
0.5
0
La elevada sensibilidad de todas las cepas componentes del fermento evaluadas hasta el momento de esta
presentación al compuesto de amonio cuaternario ensayado (cloruro de benzalconio), manifiesta que residuos de este
compuesto químico afectan marcadamente al crecimiento de las mismas. Sidhu et al. (2001) también detectaron una
elevada sensibilidad de bacteria lácticas a los QACs, particularmente en cepas de Lc lactis y Leuconostoc
mesenteroides, aisladas a partir de superficies de equipos en plantas procesadoras después de una desinfección con estos
compuestos. Informando además, en las bacterias lácticas resistentes, niveles de resistencia superior a la exhibida por
algunas bacterias patógenas (Listeria y Staphylococcus aureus) debida a genes de resistencia desconocidos.
Esta respuesta permitiría eliminar a los QACs de la lista de compuestos recomendados a los elaboradores queseros de
Corrientes, dado que podrían desequilibrar la composición del cultivo iniciador y en consecuencia la actividad
metabólica del mismo.
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Tabla 6. Sensibilidad de Lc. lactis subsp. lactis 207cVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se
expresan como x ½ longitud transversal (mm) del halo de inhibición.
NaOH
HNO3
CC
HI
CC
HI
(%)a
(mm)b
(%)a
(mm)b
2.0
0
2.0
0.37
1.5
0
1.5
0.25
1.0
0
1.0
0
0.5
0
0.5
0
a
: Concentración
b
: Ancho del halo de inhibición
H3PO4
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
2.68
1.5
1.07
1.0
0
0.5
0
-
QAC
CC
(%)a
2.0
1.5
1.0
0.5
-
HI
(mm)b
2.72
2.40
2.00
1.75
-
Detergente
CC
HI
(%)a
(mm)b
2.0
0
1.5
0
1.0
0
0.5
0
-
NaOCl
CC
HI
(%)a
(mm)b
6.0
0.33
4.0
0
2.0
0
1.0
0
0.5
0
Conclusiones
Los resultados obtenidos hasta el momento con las cepas constituyentes del Fermento “Gaucho” ensayadas
permiten concluir que:
las 5 cepas evaluadas presentan una definida y fuerte sensibilidad al cloruro de benzalconio,
el efecto inhibitorio del QAC en la cepa 77bVCOR (Lb plantarum) es superior al ocasionado en las cepas de Lc.
lactis subsp. lactis,
el detergente comercial de base lauril eter sulfonato/alquil bencen sulfonato no ejerce efectos adversos,
el hidróxido de sodio afecta solamente al crecimiento de Lb. plantarum,
la tolerancia a los ácidos nítrico y fosfórico, y al hipoclorito de sodio es de grado diverso.
Referencias
Beltrán, D., M. V. Selma, J. A. Tudela, M. I. Gil. 2005. Effect of different sanitizers on microbial and sensory quality of
fresh-cut potato strips stored under modified atmosphere or vacuum packaging. Postharvest Biol. Technol., 37:37–46.
Herrerosa, M. A., H. Sandoval, L. Gonzáleza, J.M. Castro, J.M. Fresno, M.E. Tornadijo. 2005. Antimicrobial activity
and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a Spanish goats’ milk cheese). Food
Microbiol. 22:455–459
Langsruda, S., M. S. Sidhua, E. Heirb, A. L. Holcka. 2003. Bacterial disinfectant resistance—a challenge for the food
industry. International Biodeterioration & Biodegradation, 51:283 – 290.
Patton T., J. Barrett, J. Brennan, and N. Moran. 2005. Use of a spectrophotometric bioassay for determination of
microbial sensitivity to manuka honey. J. Microbiol. Methods, (article in press).
Sidhu, M., S. Langsrud, and S. Holck. 2001. Disinfectant and antibiotic resistence of lactic acid bacteria isolated from
food industry. Microbial Drug Resistance, 7:73-83.
Winniczuk, P. P., and M. E. Parish. 1997. Minimum inhibitory concentrations of antimicrobials against microorganisms related to citrus juice. Food Microbiol., 14:373–381.