TIPOS DE MÉTODOS ESPECTROMETRICOS ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN La espectrometría de absorción se refiere a una variedad de técnicas que emplean la interacción de la radiación electromagnética con la materia. En la espectrometría de absorción, se compara la intensidad de un haz de luz medida antes y después de la interacción con una muestra. Las palabras transmisión y remisión se refieren a la dirección de viaje de los haces de luz medidos antes y después de la absorción. Las descripciones experimentales por lo general asumen que hay una única dirección de incidencia de la luz sobre la muestra, y que un plano perpendicular a esta dirección pasa por la muestra. En la transmisión, la luz es dispersada desde la muestra hacia un detector en el lado opuesto de la muestra. En la remisión, la luz es dispersada desde la muestra hacia un detector en el mismo lado de la muestra. La radiación remitida puede estar formada por dos clases de radiación: reflexión especular (cuando el ángulo de reflexión es igual al ángulo del frecuencia) y reflexión difusa (en todos los demás ángulos). Otro descriptor asociado con la espectrometría de absorción es la variedad de longitudes de onda de radiación que se usa en el haz de luz incidente. Por ejemplo, se habla de espectrometría infrarroja o de microondas, que son a su vez ejemplos de espectrometría de absorción. Por otra parte, también se encuentran referencias a otros rangos de longitud de onda, como la espectrometría de rayos X, que por lo general denotan una espectrometría de emisión. Este artículo trata principalmente de la espectrometría ultravioleta-visible. La espectrometría UV-visible se refiere a técnicas donde se mide cuánta luz de una longitud de onda particular (color) es absorbida por una muestra. Ya que el color a menudo puede correlacionarse con la presencia y/o la estructura de una sustancia química particular, y ya que la absorbancia es una medida fácil y barata de hacer, la espectrometría de absorbancia se usa ampliamente en cálculos cualitativos, cuantitativos y estructurales. Por ejemplo, el ADN absorbe luz en el rango ultravioleta (por eso la luz del sol es peligrosa), y por tanto la cantidad de ADN en una muestra puede ser determinarse midiendo la absorbancia de la luz ultravioleta. La relación entre el color visible y el color de absorbancia es complicada; una muestra que parece roja no absorbe en el rojo, sino que absorbe en otras longitudes de onda (colores) de modo que la luz que pasa por la muestra se enriquece en rojo. La palabra "color" se usa para indicar que la espectrometría de absorbancia no sólo trata con la luz en rango visible (fotones con una longitud de onda de aproximadamente 400 a 700 nanómetros), sino también con longitudes de onda que están fuera del rango de la visión humana (infrarrojo, ultravioleta, rayos X). Sin embargo, los principios son bastante similares tanto para la luz visible como para la no visible. Técnicamente, la espectrometría de absorción se basa en la absorción de fotones por una o más sustancias presentes en una muestra (que puede ser un sólido, líquido, o gas), y la promoción subsiguiente del electrón (o electrones) desde un nivel de energía a otro en esa sustancia. La muestra puede ser una sustancia pura, homogénea o una mezcla compleja. La longitud de onda en la cual el fotón incidente se absorbe es determinada por la diferencia en los niveles de energía disponibles de las diferentes sustancias presentes en la muestra. Esta es la selectividad de la espectrometría de absorbancia, la capacidad de generar fuentes de fotones (luz) que son absorbidas sólo por algunos componentes en una muestra. Típicamente, los rayos X se usan para revelar la composición química, mientras que las longitudes de onda cercanas al ultravioleta y el infrarrojo se usa para distinguir las configuraciones de diversos isómeros detalladamente. En la espectroscopia de absorción, los fotones absorbidos no son emitidos de nuevo (como en la fluorescencia) sino que la energía que se transfiere al compuesto químico en la absorbancia de un fotón se pierde por medios no radiantes, como la transferencia de energía por calor a otras moléculas. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 1 de 26 Aunque la intensidad relativa de las líneas de absorción no varía con la concentración, a cualquier longitud de onda dada la absorbancia medida (− log (I / I0)) es proporcional a la concentración molar de las especies que absorben y el grosor de la muestra por la que la luz pasa. Esto se conoce como ley de BeerLambert. El gráfico de la cantidad de radiación absorbida respecto a la longitud de onda para un compuesto particular se conoce como espectro de absorción. El espectro de absorción normalizado es característico para cada compuesto particular, no cambia con la concentración y es como la "huella digital" química del compuesto. En las longitudes de onda correspondientes a los niveles de energía resonantes de la muestra, se absorben algunos de los fotones incidentes, lo que provoca una caída en la intensidad de transmisión medida y una pendiente en el espectro. El espectro de absorción puede medirse usando un espectrómetro. Conociendo la forma del espectro, la longitud de ruta óptica y la cantidad de radiación absorbida, se puede determinar la estructura y la concentración del compuesto. Los espectros de absorción de luz visible pueden tomarse en cualquier material que sea visiblemente claro. El poliestireno, el cuarzo, y las células de borosilicato (Pyrex), son los materiales más usados. La luz ultravioleta es absorbida por la mayor parte de cristales y plásticos, por lo que se usan células de cuarzo. El Si-O presente en el cristal y el cuarzo, y el C-C en el plástico absorben la luz infrarroja. Los espectros de absorción infrarrojos se realizan generalmente con una delgada película de la muestra sostenida entre platos de cloruro de sodio. Otros métodos implican suspender el compuesto en una sustancia que no absorba en la región de estudio. Las emulsiones de aceite mineral (Nujol) y los cristales de bromuro de potasio suelen ser los más comunes. El NaCl y KBr, al ser iónicos, no absorben el infrarrojo de forma significativa, y el Nujol tiene un espectro infrarrojo relativamente sencillo. Espectrometría como instrumento analítico A menudo es de interés conocer no sólo la composición química de una muestra dada, sino también las concentraciones relativas de varios compuestos de una mezcla. Para hacer esto debe construirse una escala, o curva de calibración, usando varias concentraciones conocidas para cada compuesto de interés. El gráfico que resulta de la concentración respecto a la absorbancia se hace a mano o usando un software de ajuste de curvas apropiado, que usa una fórmula matemática para determinar la concentración en la muestra. La repetición de este proceso para cada compuesto en una muestra da un modelo de varios espectros de absorción que en conjunto reproducen la absorción observada. De esta manera es posible, por ejemplo, medir la composición química de los cometas sin tener muestras de ellos en la Tierra. Un ejemplo simple: un cianuro estándar a 200 partes por millón da una absorbancia con un valor arbitrario de 1540. Una muestra desconocida da un valor de 834. Ya que esta es una relación lineal y pasa por el origen, el valor desconocido se calcula fácilmente como 108 partes por millón. Con este método de proporción no es necesario conocer los valores de los coeficientes gobernantes, o cromóforos, o la longitud de célula experimental. En la práctica, el uso de una curva de calibración, más que un solo punto de comparación, reduce la incertidumbre en la medida final por exclusión de la interferencia aleatoria (ruido) en la preparación de los estándares. ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una técnica complementaria es la espectrometría de absorción. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 2 de 26 Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros. TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía. La espectrometría de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrónicos. En general, las especies objeto de examen tendrán un estado electrónico basal (un estado de baja energía) de interés, y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados vibracionales. En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado. La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues, mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de vibración. En un experimento típico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida por una muestra, manteniendo la luz de excitación a una longitud de onda constante. A esto se le llama espectro de emisión. Un espectro de excitación se mide mediante el registro de una serie de espectros de emisión utilizando luz de diferentes longitudes de onda. INSTRUMENTOS En la espectrometría de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos: Fluorómetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. Espectrofluorómetros. Usan monocromadores de retículo de difracción para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las moléculas de la muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90° con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o transmitida llegue al detector. Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitación, incluyendo el láser, fotodiodos y lámparas; arcos de xenón y lámparas de vapor de mercurio. Un láser sólo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitación o el filtro. La desventaja de este método es que la longitud de onda de un láser no se puede cambiar mucho. Una lámpara de vapor de mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un arco de xenón tiene un espectro de emisión continuo con intensidad casi constante en el rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo por encima de 200 nm. En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo más común de monocromador utiliza un retículo de difracción; es decir, la luz colimada entra en una rejilla y sale con un ángulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El monocromador puede entonces seleccionar qué longitudes de onda transmite. Para permitir mediciones de AINS-02 Tipos de espectrometria Página 3 de 26 anisotropía se añaden dos filtros de polarización: uno después del monocromador de excitación o filtro, y otro antes del monocromador de emisión o filtro. Como se mencionó antes, la fluorescencia se mide más a menudo en un ángulo de 90° en relación a la luz de excitación. Esta geometría se utiliza en lugar de colocar el sensor en la línea de la luz de excitación en un ángulo de 180° a fin de evitar la interferencia de la luz de excitación transmitida. El monocromador no es perfecto y transmitirá la luz con otras longitudes de onda diferentes a las establecidas. Un monocromador ideal sólo transmite luz en el rango especificado y tiene una transmisión independiente de la longitud de onda. Al medir en un ángulo de 90º, sólo la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce en una mejor relación señal-ruido, y reduce el límite de detección a un factor de aproximadamente 10000, si se compara con la geometría de 180°. Por otra parte, la fluorescencia también puede ser medida desde la parte delantera, procedimiento que se utiliza a menudo para las muestras turbias. El detector puede ser de un solo canal o de múltiples canales. El detector de un único canal sólo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento, mientras que el de múltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes de onda simultáneamente, con lo que el monocromador de emisión o filtro es innecesario. Los diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y desventajas. El fluorímetro más versátil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de excitación continua, puede registrar tanto un espectro de excitación como un espectro de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitación se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta absorción, y el monocromador de emisión escanea el espectro. Para medir los espectros de excitación, la longitud de onda que pasa a través del filtro o monocromador de emisión se mantiene constante y el monocromador de excitación va escaneando. El espectro de excitación generalmente es idéntico al espectro de absorción, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorción. ANÁLISIS DE LOS DATOS A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general, proporcional a la concentración del fluoróforo. A diferencia de la espectrometría visible o ultravioleta 'estándar', los espectros independientes del dispositivo no son fáciles de alcanzar. Son varios los factores que influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para lograr el espectro 'verdadero', es decir, independiente de la máquina. Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relación al instrumento o a la muestra. En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento. Como punto de partida, la intensidad de las fuentes de luz y las características de la longitud de onda varían con el tiempo durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lámpara tiene una intensidad constante en todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un haz separador después del filtro o monocromador de excitación, para dirigir una porción de luz a un detector de referencia. Además, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisión de los monocromadores y los filtros, ya que también puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisión del monocromador varía dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razón por la que debe colocarse un detector de referencia después del filtro o monocromador de excitación. El porcentaje de fluorescencia recogido por el detector también depende del sistema. Por otra parte, la eficiencia cuántica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, varía entre los diferentes detectores, según la longitud de onda y el tiempo. La corrección de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estándar" del espectro es un proceso tedioso, que sólo se aplica en la práctica cuando es estrictamente necesario. Es el caso de las mediciones AINS-02 Tipos de espectrometria Página 4 de 26 de rendimiento cuántico o cuando se encuentra la longitud de onda con la mayor intensidad de emisión, por ejemplo. Como se mencionó anteriormente, también surgen distorsiones de la muestra. Por lo tanto, algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta también. En primer lugar, la fotodescomposición puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el tiempo. La dispersión de la luz también debe tenerse en cuenta. Los tipos más importantes de dispersión en este contexto son la dispersión de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por dispersión de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersión Raman la luz cambia a longitudes de onda más largas. La dispersión de Raman es el resultado de un estado electrónico virtual inducido por la luz de excitación. A partir de este estado virtual, las moléculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de número de onda constante en relación con la excitación; por ejemplo, en el agua el pico aparece a un número de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitación. Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la reabsorción, que ocurre porque otra molécula o parte de una macromolécula absorbe las longitudes de onda en la que el fluoróforo emite radiación. Si este es el caso, una parte o la totalidad de los fotones emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro efecto del filtro interno se produce a causa de las altas concentraciones de absorción de las moléculas, incluyendo el fluoróforo. El resultado es que la intensidad de excitación de la luz no es constante a lo largo de la solución. Como resultado, sólo un pequeño porcentaje de la luz de excitación llega a los fluoróforos que son visibles para el sistema de detección. Los efectos del filtro interior cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por tanto, deben ser considerados al analizar el espectro de emisión de luz fluorescente. APLICACIONES La espectrometría de fluorescencia se utiliza en análisis bioquímicos, médicos, químicos y de investigación de compuestos orgánicos. También se ha utilizado para diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos. La fluorescencia también puede utilizarse para reorientar los fotones. Fluorescencia del triptófano Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede ser usada para estimar la naturaleza del microambiente del triptófano (un aminoácido). Cuando se realizan experimentos con desnaturalizantes, surfactantes u otras moléculas anfifílicas, el microambiente del triptófano puede cambiar. Por ejemplo, si una proteína que contiene un único triptófano en su núcleo "hidrofóbico" se desnaturaliza con el aumento de temperatura, aparece un cambio de color en el espectro de emisión del rojo. Esto se debe a la exposición del triptófano a un medio ambiente acuoso en contraposición a una proteína hidrofóbica interior. En contraste, la adición de un tensioactivo a una proteína que contiene triptófano, que se encuentra expuesto al solvente acuoso, causará un cambio al espectro azul de emisión si el triptófano está incrustado en la vesícula o micela de surfactante. Las proteínas que carecen de triptófano pueden ser enlazadas a un fluoróforo. A 295 nm, el espectro de emisión del triptófano es dominante sobre la fluorescencia más débil de la tirosina y fenilalanina. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 5 de 26 ESPECTROMETRÍA DE RAYOS X La espectrometría de rayos X es un conjunto de técnicas espectroscópicas para la determinación de la estructura electrónica de materiales mediante el uso de excitación por rayos X. ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN POR RAYOS X Karl Manne Georg Siegbahn de Uppsala, Suecia (Premio Nobel 1924), fue uno de los pioneros en el desarrollo de rayos X espectrometría de emisión (también llamado X-espectroscopía de fluorescencia de rayos). Midió las longitudes de onda de los rayos X en muchos elementos de alta precisión, utilizando electrones de alta energía como fuente de excitación. Los rayos X intensos y de longitud de onda sintonizable son típicamente generados con sincrotrones. En un material, los rayos X pueden sufrir una pérdida de energía en comparación con el haz de luz que entra. Esta pérdida de energía del haz re-emergente refleja una excitación interna del sistema atómico, de forma análoga a la conocida espectrometría Raman que se utiliza ampliamente en la región óptica. En la región de los rayos X hay suficiente energía para producir cambios en el estado electrónico (transiciones entre orbitales, lo que contrasta con la región óptica, donde la pérdida de energía es a menudo debida a los cambios en el estado de rotación o los grados de libertad vibracionales). Por ejemplo, en la región ultraligera de los rayos X (por debajo de aproximadamente 1 k eV), las excitaciones de los campos cristalinos dan lugar a la pérdida de energía. Podemos pensar en el proceso fotón-dentro-fotón-fuera como un evento de dispersión. Cuando la energía del rayo X corresponde a la energía de enlace de un nivel electrónico básico, este proceso de dispersión potencia su resonancia en muchos órdenes de magnitud. Este tipo de espectrometría de emisión de rayos X se conoce a menudo como dispersión inelástica resonante de rayos X (RIXS). Debido a la amplia separación de energías orbitales de los niveles básicos, es posible seleccionar un determinado átomo de interés. Así, se puede obtener información valiosa sobre la estructura electrónica local de sistemas complejos, y los cálculos teóricos son relativamente sencillos de realizar. Instrumentos Existen varios diseños eficientes para analizar un espectro de emisión de rayos X en la región de los rayos X ultra ligeros. La cifra de valor para estos instrumentos es el rendimiento espectral, es decir, el producto de la intensidad detectada y el poder de resolución espectral. Por lo general, es posible cambiar los parámetros dentro de un cierto rango, mientras se mantiene su producto constante. Espectrómetros de rejilla Normalmente, los rayos X que emergen de una muestra deben pasar una hendidura que define la fuente, y luego los elementos ópticos (espejos y/o rejillas) los dispersan por difracción según su longitud de onda y, por último, se coloca un detector en sus puntos focales. Monturas de rejilla esférica Henry Augustus Rowland (1848-1901) desarrolló un instrumento que permitía el uso de un solo elemento óptico que combina la difracción y la concentración: una rejilla esférica. Reflectivity of X-rays is low AINS-02 Tipos de espectrometria Página 6 de 26 regardless of the used material and therefore grazing incidence upon the grating is necessary. La reflectividad de los rayos X es baja, independientemente del material utilizado y, por tanto, la incidencia sobre la rejilla es necesaria. Imaginemos un círculo con la mitad del radio R tangente al centro de la superficie de la rejilla. Este pequeño círculo se llama círculo de Rowland. Si la hendidura de entrada están en cualquier parte de este círculo, un haz de luz que pase por la hendidura y golpee la rejilla se dividirá en un haz reflejado especularmente, y en haces de todos los órdenes de difracción, que van a concentrarse en determinados puntos en el mismo círculo. Monturas de hendidura plana Los espectrómetros de hendidura plana son similares a los espectrómetros ópticos. En primer lugar necesita una óptica que convierta los rayos divergentes emitidos por la fuente de rayos X en un haz paralelo. Esto puede lograrse mediante la utilización de un espejo parabólico. Los rayos paralelos que salen de este espejo golpean una rejilla plana (con una distancia de ranura constante) en el mismo ángulo, y son difractados en función de su longitud de onda. Un segundo espejo parabólico, a continuación, recoge los rayos difractados en un cierto ángulo y crea una imagen en un detector. Un espectro dentro de un determinado rango de longitud de onda puede ser registrado simultáneamente usando un detector sensible de posición bidimensional tal como una placa fotomultiplicadora de microcanal o un chip CCD sensible a los rayos X (también se pueden utilizar placas de película fotográfica). Interferómetros En lugar de utilizar el concepto de interferencia de haz múltiple que producen las rejillas, se puede dejar simplemente que dos rayos interfieran. Registrando la intensidad de dos de esos rayos co-lineales en algún punto fijo y cambiando su fase relativa, se obtiene una intensidad del espectro en función de la diferencia de longitud de ruta. Se puede demostrar que esto es equivalente a una transformada de Fourier del espectro en función de la frecuencia. La mayor frecuencia registrable de dicho espectro depende del tamaño mínimo de paso elegido en la exploración y de la resolución de frecuencia (es decir, cómo de bien una cierta onda puede definirse en términos de su frecuencia). Esta última característica permite un diseño mucho más compacto para lograr alta resolución que para un espectrómetro de rejilla, porque las longitudes de onda de los rayos X son pequeñas en comparación con las diferencias de longitud de ruta alcanzables. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 7 de 26 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA En química analítica, la espectrometría de absorción atómica es una técnica para determinar la concentración de un elemento metálico determinado en una muestra. Puede utilizarse para analizar la concentración de más de 62 metales diferentes en una solución. Aunque la espectrometría de absorción atómica data del siglo XIX, la forma moderna fue desarrollada en gran medida durante la década de los 50 por un equipo de químicos de Australia, dirigidos por Alan Walsh. PRINCIPIOS EN LOS QUE SE BASA La técnica hace uso de la espectrometría de absorción para evaluar la concentración de un analito en una muestra. Se basa en gran medida en la ley de Beer-Lambert. En resumen, los electrones de los átomos en el atomizador pueden ser promovidos a orbitales más altos por un instante mediante la absorción de una cantidad de energía (es decir, luz de una determinada longitud de onda). Esta cantidad de energía (o longitud de onda) se refiere específicamente a una transición de electrones en un elemento particular, y en general, cada longitud de onda corresponde a un solo elemento. Como la cantidad de energía que se pone en la llama es conocida, y la cantidad restante en el otro lado (el detector) se puede medir, es posible, a partir de la ley de Beer-Lambert, calcular cuántas de estas transiciones tiene lugar, y así obtener una señal que es proporcional a la concentración del elemento que se mide. INSTRUMENTOS Para analizar los constituyentes atómicos de una muestra es necesario atomizarla. La muestra debe ser iluminada por la luz. Finalmente, la luz es transmitida y medida por un detector. Con el fin de reducir el efecto de emisión del atomizador (por ejemplo, la radiación de cuerpo negro) o del ambiente, normalmente se usa un espectrómetro entre el atomizador y el detector. Tipos de atomizadores Para atomizar la muestra normalmente se usa una llama, pero también pueden usarse otros atomizadores como el horno de grafito o los plasmas, principalmente los plasmas de acoplamiento inductivo. Cuando se usa una llama, se dispone de tal modo que pase a lo largo lateralmente (10 cm) y no en profundidad. La altura de la llama sobre la cabeza del quemador se puede controlar mediante un ajuste del flujo de mezcla de combustible. Un haz de luz pasa a través de esta llama en el lado más largo del eje (el eje lateral) e impacta en un detector. Análisis de los líquidos Una muestra de líquido normalmente se convierte en gas atómico en tres pasos: 1. Desolvación. El líquido disolvente se evapora, y la muestra permanece seca. 2. Vaporización. La muestra sólida se evapora a gas. 3. Atomización. Los compuestos que componen la muestra se dividen en átomos libres. Fuentes de luz AINS-02 Tipos de espectrometria Página 8 de 26 La fuente de luz elegida tiene una anchura espectral más estrecha que la de las transiciones atómicas. Lámparas de cátodo hueco. En su modo de funcionamiento convencional, la luz es producida por una lámpara de cátodo hueco. En el interior de la lámpara hay un cátodo cilíndrico de metal que contiene el metal de excitación, y un ánodo. Cuando un alto voltaje se aplica a través del ánodo y el cátodo, los átomos de metal en el cátodo se excitan y producen luz con una determinada longitud de onda. El tipo de tubo catódico hueco depende del metal que se analiza. Para analizar la concentración de cobre en un mineral, se utiliza un tubo catódico de cobre, y así para cualquier otro metal que se analice. Lásers de diodo. La espectrometría de absorción atómica también puede ser llevada a cabo mediante láser, principalmente un láser de diodo, ya que sus propiedades son apropiadas para la espectrometría de absorción láser. La técnica se denomina espectrometría de absorción atómica por láser de diodo (DLAAS o DLAS), o bien, espectrometría de absorción por modulación de longitud de onda. MÉTODOS DE CORRECCIÓN DE FONDO El estrecho ancho de banda de las lámparas catódicas huecas hace que sea raro el solapamiento espectral. Es decir, es poco probable que una línea de absorción de un elemento se solape con otra. La emisión molecular es mucho más amplia, por lo que es más probable que algunas bandas de absorción molecular se superpongan con una línea atómica. Esto puede resultar en una absorción artificialmente alta y un cálculo exagerado de la concentración en la solución. Se utilizan tres métodos para corregir esto: AINS-02 Corrección de Zeeman. Se usa un campo magnético para dividir la línea atómica en dos bandas laterales. Estas bandas laterales están lo suficientemente cerca de la longitud de onda original como para solaparse con las bandas moleculares, pero están lo suficientemente lejos como para no coincidir con las bandas atómicas. Se puede comparar la absorción en presencia y ausencia de un campo magnético, siendo la diferencia la absorción atómica de interés. Corrección de Smith-Hieftje (inventada por Stanley B. Smith y Gary M. Hieftje) - La lámpara catódica hueca genera pulsos de alta corriente, provocando una mayor población de átomos y auto-absorción durante los pulsos. Esta auto-absorción provoca una ampliación de la línea y una reducción de la intensidad de la línea a la longitud de onda original. Lámpara de corrección de deuterio. En este caso, se usa una fuente de amplia emisión (una lámpara de deuterio), para medir la emisión de fondo. El uso de una lámpara separada hace de este método el menos exacto, pero su relativa simplicidad (y el hecho de que es el más antiguo de los tres) lo convierte en el más utilizado. Tipos de espectrometria Página 9 de 26 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN La espectrometría de emisión es una técnica espectroscópica que analiza las longitudes de onda de los fotones emitidos por los átomos o moléculas durante su transición desde un estado excitado a un estado de inferior energía. Cada elemento emite un conjunto característico de longitudes de onda discretas en función de su estructura electrónica. Mediante la observación de estas longitudes de onda puede determinarse la composición elemental de la muestra. La espectrometría de emisión se desarrolló a finales del siglo 19, y los esfuerzos teóricos para explicar los espectros de emisión atómica condujeron a la mecánica cuántica. Hay muchas maneras en que los átomos pueden ser llevados a un estado excitado. El método más simple es calentar la muestra a una temperatura alta, produciéndose las excitaciones debido a las colisiones entre átomos de la muestra. Este método se utiliza en la espectrometría de emisión de llama, y fue también el método utilizado por Anders Jonas Ångström cuando descubrió el fenómeno de las líneas de emisión discretas en 1850. A pesar de que las líneas de emisión están causadas por una transición entre estados energéticos cuantizados, y pueden ser muy agudas a primera vista, tienen una anchura finita; es decir, se componen de más de una longitud de onda de luz. Esta ampliación de la línea espectral tiene muchas causas diferentes. Las líneas de emisión en los gases calientes fueron descubiertas por Ångström, y la técnica fue desarrollada por David Alter, Gustav Kirchhoff y Robert Bunsen. La espectrometría de emisión suele llamarse a menudo espectrometría de emisión óptica, debido a la naturaleza de la luz que se emite. TÉCNICA EXPERIMENTAL EN LA ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN POR LLAMA La solución que contiene la sustancia que va a ser analizada se conduce al quemador y se dispersa en la llama como un spray fino. El solvente se evapora en primer lugar, dejando partículas sólidas finamente divididas que se desplazan a la región más caliente de la llama, donde se producen átomos e iones gaseosos. Los electrones son entonces excitados, tal como se describió más arriba. Es común usar un monocromador para permitir una detección fácil. En un nivel simple, la espectrometría de emisión por llama se puede observar utilizando sólo un mechero Bunsen y muestras de metales. Por ejemplo, el metal sodio colocado en la llama se iluminará de amarillo, el metal calcio de rojo y el cobre creará una llama verde. Hay cuatro etapas principales durante la espectrometría de emisión por llama: 1. Evaporación: La muestra que contiene partículas metálicas se deshidrata por el calor de la llama, y el disolvente se evapora. 2. Atomización: En esta etapa, los iones metálicos que se encontraban en el disolvente se reducen a átomos de metal. Por ejemplo, Mg2 + (aq) + 2e → Mg (g). Los electrones en los átomos de metal absorben la energía del calor de la llama y pasan a niveles más altos de energía. 3. Excitación: Los electrones en estado basal de los átomos de metal son ahora capaces de absorber la energía del calor de la llama. El cuanto (cantidad) de energía absorbido depende de las fuerzas electrostáticas de atracción entre los electrones con carga negativa y el núcleo de carga positiva. Esto, a su vez, depende del número de protones en el núcleo. Como los electrones absorben energía, se desplazan a niveles más altos de la energía y pasan a estado excitado. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 10 de 26 4. Emisión de radiación: Los electrones en estado excitado son muy inestables y se mueven hacia un estado basal con bastante rapidez. Cuando lo hacen, emiten la energía que absorbieron. Para algunos metales, esta radiación corresponde a longitudes de onda de luz en la región visible del espectro electromagnético, y se observan como un color característico del metal. Como los electrones de diferentes niveles de energía son capaces de absorber luz, el color de la llama será una mezcla de todas las diferentes longitudes de onda emitidas por los distintos electrones en el átomo de metal que se investiga. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 11 de 26 ESPECTROMETRÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE La espectrometría ultravioleta-visible o espectrofotometría UV-Vis implica la espectroscopia de fotones en la región de radiación ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano. En esta región del espectro electromagnético, las moléculas se someten a transiciones electrónicas. Esta técnica es complementaria de la espectrometría de fluorescencia, que trata con transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la espectrometría de absorción mide transiciones desde el estado basal al estado excitado. APLICACIONES La espectrometría UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinación cuantitativa de soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos muy conjugados. Soluciones de iones metálicos de transición Las soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz visible) debido a que los electrones en los átomos de metal se pueden excitar desde un estado electrónico a otro. El color de las soluciones de iones metálicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de una solución diluida de sulfato de cobre es muy azul; agregando amoníaco se intensifica el color y cambia la longitud de onda de absorción máxima. Compuestos orgánicos Los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugación, también absorben luz en las regiones del espectro electromagnético visible o ultravioleta. Los disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en agua, o el etanol para compuestos orgánicos solubles. Los disolventes orgánicos pueden tener una significativa absorción de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en espectrometría UV. El etanol absorbe muy débilmente en la mayoría de longitudes de onda. La polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la absorción del espectro de un compuesto orgánico. La tirosina, por ejemplo, aumenta su máximo de absorción y su coeficiente de extinción molar cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando disminuye la polaridad de los disolventes. Aunque los complejos de transferencia de carga también dan lugar a colores, éstos son a menudo demasiado intensos para ser usados en mediciones cuantitativas. La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración de la solución. Por tanto, la espectrometría UV/VIS puede usarse para determinar la concentración de una solución. Es necesario saber con qué rapidez cambia la absorbancia con la concentración. Esto puede ser obtenido a partir de referencias (las tablas de coeficientes de extinción molar) o, con más exactitud, determinándolo a partir de una curva de calibración. El espectrofotómetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR). La presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la concentración. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un estándar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibración. La respuesta (por ejemplo, el pico de altura) para una concentración particular se conoce como factor de respuesta. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 12 de 26 LEY DE BEER-LAMBERT La espectrometría UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para determinar las concentraciones de especies absorbentes en solución, usando la Ley de Beer-Lambert: donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz incidente a una determinada longitud de onda, I es la intensidad de transmisión, L la longitud de ruta a través de la muestra, y c la concentración de las especies absorbentes. Para cada especie y longitud de onda, ε es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extinción. Esta constante es una propiedad fundamental molecular en un solvente dado, a una temperatura y presión particular, y tiene como unidades 1/M * cm o, a menudo, U/M * cm. La absorbancia y extinción ε a veces son definidas en términos de logaritmo natural en lugar de logaritmo de base 10. La ley de Beer-Lambert es útil para la caracterización de muchos compuestos, pero no sirve como relación universal para la concentración y absorción de todas las sustancias. En moléculas complejas de gran tamaño, como los tintes orgánicos (Xylenol Naranja o Rojo Neutro, por ejemplo), a veces se encuentra una relación polinómica de segundo orden entre la absorción y la concentración. ESPECTROFOTÓMETRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE El instrumento utilizado en la espectrometría ultravioleta-visible se llama espectrofotómetro UV-Vis. Mide la intensidad de luz que pasa a través de una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a través de la muestra (Io). La relación I / Io se llama transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T). La absorbancia (A) se basa en la transmisión: A = - log (%T) Las partes básicas de un espectrofotómetro son una fuente de luz (a menudo una bombilla incandescente para las longitudes de onda visibles, o una lámpara de arco de deuterio en el ultravioleta), un soporte para la muestra, una rejilla de difracción o monocromador para separar las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. El detector suele ser un fotodiodo o un CCD. Los fotodiodos se usan con monochomadores, que filtran la luz de modo que una sola longitud de onda alcanza el detector. Las rejillas de difracción se utilizan con CCDs, que recogen la luz de diferentes longitudes de onda en píxeles. Un espectrofotómetro puede ser único o de doble haz. En un instrumento de un solo haz (como el Spectronic 20), toda la luz pasa a través de la célula muestra. La Io debe medirse retirando la muestra. Este fue el primer diseño, y todavía está en uso en la enseñanza y laboratorios industriales. En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un haz se utiliza como referencia, y el otro haz de luz pasa a través de la muestra. Algunos instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de referencia y el de la muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la del haz de referencia. Las muestras para espectrofotometría UV-Vis suelen ser líquidas, aunque la absorbancia de los gases e incluso de los sólidos también puede medirse. Las muestras suelen ser colocadas en una célula transparente, conocida como cubeta. Las cubetas suelen ser rectangulares, con una anchura interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud de ruta, L, en la Ley de Beer-Lambert. También se pueden usar tubos de ensayo como cubetas en algunos instrumentos. Las mejores cubetas están hechas con cuarzo de alta calidad, aunque son AINS-02 Tipos de espectrometria Página 13 de 26 comunes las de vidrio o plástico. El cristal y la mayoría de los plásticos absorben en el UV, lo que limita su utilidad para longitudes de onda visibles. ESPECTRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE Un espectro ultravioleta-visible es esencialmente un gráfico de absorbancia de luz frente a una longitud de onda en el rango del ultravioleta o la luz visible. Este espectro puede ser producido directamente con los espectrofotómetros más sofisticados, o bien pueden registrarse los datos de una sola longitud de onda con los instrumentos más simples. La longitud de onda se representa con el símbolo λ. Del mismo modo, para una determinada sustancia, puede hacerse un gráfico estándar del coeficiente de extinción (ε) frente a la longitud de onda (λ). Este gráfico estándar sería efectivamente "la concentración corregida" y, por tanto, independiente de la concentración. Para una sustancia determinada, la longitud de onda en la cual se produce el máximo de absorbancia en el espectro se llama λ max, y se pronuncia "lambda-max". Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones empíricas que pueden utilizarse para predecir λ max, la longitud de onda de la absorción UV-Vis, para compuestos orgánicos conjugados como dienos y cetonas. Las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlace en una determinada molécula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la molécula. La absorción UV-Vis no es, sin embargo, una prueba específica para ningún compuesto determinado. La naturaleza del disolvente, el pH de la solución, la temperatura, la concentración de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden influir en los espectros de absorción de los compuestos, así como las variaciones en la anchura de la hendidura (ancho de banda efectivo) en el espectrofotómetro. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 14 de 26 ESPECTROMETRÍA INFRARROJA La espectrometría de infrarrojos (espectroscopia IV) es un tipo de espectrometría de absorción que utiliza la región infrarroja del espectro electromagnético. Como las demás técnicas espectroscópicas, puede ser utilizada para identificar un compuesto o investigar la composición de una muestra. La espectrometría infrarroja se basa en el hecho de que los enlaces químicos de las sustancias tienen frecuencias de vibración específicas, que corresponden a los niveles de energía de la molécula. Estas frecuencias dependen de la forma de la superficie de energía potencial de la molécula, la geometría molecular, las masas atómicas y, posiblemente, el acoplamiento vibracional. Si la molécula recibe luz con la misma energía de esa vibración, entonces la luz será absorbida si se dan ciertas condiciones. Para que una vibración aparezca en el espectro infrarrojo, la molécula debe someterse a un cambio en su momento dipolar durante la vibración. En particular, una aproximación de Born-Oppenheimer y aproximaciones armónicas; es decir, cuando el hamiltoniano molecular correspondiente al estado electrónico estándar puede ser aproximado por un oscilador armónico cuántico en las cercanías de la geometría molecular de equilibrio, las frecuencias vibracionales de resonancia son determinadas por los modos normales correspondientes a la superficie de energía potencial del estado electrónico estándar. No obstante, las frecuencias de resonancia pueden estar, en una primera aproximación, en relación con la longitud del enlace y las masas de los átomos en cada extremo del mismo. Los enlaces pueden vibrar de seis maneras: estiramiento simétrico, estiramiento asimétrico, tijeras, rotación, giro y wag. Con el fin de hacer medidas en una muestra, se transmite un rayo monocromo de luz infrarroja a través de la muestra, y se registra la cantidad de energía absorbida. Repetiendo esta operación en un rango de longitudes de onda de interés (por lo general, 4000-400 cm -1) se puede construir un gráfico. Al examinar el gráfico de una sustancia, un usuario experimentado puede obtener información sobre la misma. Esta técnica funciona casi exclusivamente en enlaces covalentes, y se usa mucho en química, en especial en química orgánica. Se pueden generar gráficos bien resueltos con muestras de una sola sustancia de gran pureza. Sin embargo, la técnica se utiliza habitualmente para la identificación de mezclas complejas. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Las muestras líquidas pueden ser prensadas entre dos planchas de una sal de alta pureza (como el cloruro de sodio). Estas placas deben ser transparentes a la luz infrarroja para no introducir ninguna línea en el espectro de la muestra. Las placas obviamente son solubles en agua, por lo que la muestra, los reactivos de lavado y el medio deben ser anhidros (es decir, sin agua) Las muestras sólidas se preparan mezclando una cierta cantidad de muestra con una sal altamente purificada (por lo general bromuro de potasio). Esta mezcla se tritura y se prensa con el fin de formar una pastilla por la que pueda pasar la luz. La pastilla necesita ser prensada a altas presiones para asegurar que sea translúcida, pero esto no puede lograrse sin un equipo adecuado (por ejemplo, una prensa hidráulica). Al igual que el cloruro de sodio, el bromuro de potasio no absorbe la radiación infrarroja, por lo que las únicas líneas espectrales provendrán del analito. MÉTODO TÍPICO Un haz de luz infrarroja es generado y dividido en dos rayos. Uno pasa por la muestra, y el otro por una referencia que suele ser la sustancia en la que está disuelta o mezclada la muestra. Ambos haces se reflejan de vuelta al detector, pero primero pasan a través del separador, que alterna rápidamente cuál de los dos rayos entra en el detector. Las dos señales se comparan y, a continuación, se registran los datos. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 15 de 26 Hay dos razones por las que se utiliza una referencia: Evita que las fluctuaciones de energía eléctrica de la fuente afecten a los resultados finales, ya que tanto la muestra como la referencia se ven afectadas del mismo modo. Por esa misma razón, también impide la influencia de variaciones sobre el resultado final, debido al hecho de que la fuente no necesariamente emite la misma intensidad de luz para todas las longitudes de onda Permite que los efectos del disolvente se anulen, porque la referencia es normalmente la forma pura del disolvente en el que se encuentra. USOS Y APLICACIONES La espectrometría infrarroja se utiliza ampliamente tanto en la industria como en la investigación científica, porque es una técnica rápida y fiable para medidas, control de calidad y análisis dinámicos. Los instrumentos actuales son pequeños y pueden ser transportados, incluso para tomar medidas de campo. Con los avances en tecnología de filtrado computacional y la manipulación de los resultados, se pueden medir con precisión las muestras en una solución (el agua produce una banda larga de absorbancia en el rango de interés, lo que daría un espectro ilegible sin dicho tratamiento computacional). Algunas máquinas incluso dicen automáticamente qué sustancia está siendo analizada a través de miles de espectros de referencia almacenados en la memoria. Haciendo medidas a una frecuencia específica a través del tiempo, se pueden seguir los cambios en la naturaleza o la cantidad de un enlace en particular, lo que es especialmente útil para medir el grado de polimerización en la fabricación de polímeros. Las máquinas modernas pueden medir en el rango de interés con gran frecuencia, como 32 veces por segundo. Esto se puede hacer mientras se toman medidas simultáneas con otras técnicas. Así las observaciones de reacciones químicas son procesadas con mayor rapidez, y de forma más precisa y exacta. ESPECTROMETRÍA DE INFRARROJOS POR TRANSFORMADA DE FOURIER La espectrometría infrarroja por transformada de Fourier (FTIV) es una técnica de análisis para obtener el espectro infrarrojo con mayor rapidez. En lugar de registrar los datos variando la frecuencia de luz infrarroja monocromática, se guía la luz IV (con todas las longitudes de onda de pista utilizada) a través de un interferómetro. Después de pasar por la muestra, la señal medida da el interferograma. La realización de una transformada de Fourier de la señal produce un espectro idéntico al de la espectrometría infrarroja convencional (dispersiva). Los espectrofotómetros FTIV son más baratos que los convencionales, porque es más simple construir un interferómetro que un monocromador. Además, la medida de un solo espectro es mucho más rápida en esta técnica, debido a que la información de todas las frecuencias se toman al mismo tiempo. Esto permite hacer múltiples lecturas de una sola muestra y obtener un promedio, lo que aumenta la sensibilidad del análisis. Debido a sus múltiples ventajas, casi todos los modernos espectrofotómetros de infrarrojos son FTIV. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 16 de 26 ESPECTROMETRÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR La espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN), más comúnmente conocida como espectrometría RMN, es una técnica que explota las propiedades magnéticas de ciertos núcleos. Las aplicaciones más importantes para su uso en química orgánica son la espectrometría RMN de protones y la de carbono-13. En principio, la RMN es aplicable a cualquier núcleo que posea espín. Pueden obtenerse muchos tipos de información mediante un espectro RMN. Al igual que se utiliza la espectrometría de infrarrojos para identificar grupos funcionales, el análisis de un espectro RMN unidimensional proporciona información sobre el número y tipo de entidades químicas en una molécula. El impacto de la espectrometría RMN en las ciencias naturales ha sido sustancial. Puede utilizarse, entre otras cosas, para estudiar mezclas de analitos, para comprender efectos dinámicos como el cambio en la temperatura y los mecanismos de reacción, y es una herramienta de valor incalculable para la comprensión de la estructura y función de las proteínas y los ácidos nucleicos. Este tipo de espectrometría se puede aplicar a una amplia variedad de muestras, tanto en solución como en estado sólido. TÉCNICAS BÁSICAS DE ESPECTROMETRÍA RMN Cuando se sitúan dentro de un campo magnético, los núcleos activos de RMN (como el 1 H, o el 13 C) absorben a una frecuencia característica del isótopo. La frecuencia de resonancia, la energía de la absorción y la intensidad de la señal son proporcionales a la fuerza del campo magnético. Por ejemplo, en un campo magnético de 21 Tesla, los protones resuenan a 900 MHz. Es común referirse a un imán de 21 T como imán de 900 MHz, aunque distintos núcleos resuenan a una frecuencia diferente en este campo. En el campo magnético terrestre, los mismos núcleos resuenan en frecuencias de audio. Este efecto se utiliza en los espectrómetros RMN y otros instrumentos. Debido a que estos instrumentos son fáciles de transportar y baratos, a menudo se utilizan para la enseñanza y el trabajo de campo. Desplazamiento químico Dependiendo del entorno químico local, los diferentes protones en una molécula resuenan a frecuencias ligeramente diferentes. Dado que tanto este desplazamiento como la frecuencia de resonancia fundamental son directamente proporcionales a la fuerza del campo magnético, el desplazamiento de frecuencia se convierte en un campo independiente de valor adimensional conocido como desplazamiento químico. El desplazamiento químico se reporta como una medida relativa de algunas frecuencias de resonancia de referencia. (Para los núcleos 1 H, 13 C, y 29 Si, se usa como referencia el tetrametilsilano o TMS.) Esta diferencia entre la frecuencia de la señal y la frecuencia de la referencia se divide por la frecuencia de la señal de referencia para obtener el desplazamiento químico. Los desplazamientos de frecuencia son muy pequeños en comparación con la frecuencia RMN fundamental. Un desplazamiento de frecuencia típico podría ser de 100 Hz, en comparación con una frecuencia RMN fundamental de 100 MHz, por lo que el desplazamiento químico se expresa generalmente en partes por millón (ppm). Mediante la comprensión de los diferentes entornos químicos, el desplazamiento químico puede ser utilizado para obtener información estructural sobre la molécula en una muestra. La conversión de los datos en bruto a esta información se llama asignación del espectro. Por ejemplo, para el espectro 1H-RMN del etanol (CH3CH2OH), cabría esperar tres señales específicas en tres desplazamientos químicos específicos: uno para los grupos CH3, uno para el grupo CH2 y otro para el grupo OH. Un grupo CH3 típico tiene un desplazamiento de alrededor de 1 ppm, un CH2 adjunto a un OH tiene un desplazamiento de alrededor de 4 ppm y un OH tiene un desplazamiento en torno a 2-3 ppm, dependiendo del disolvente utilizado. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 17 de 26 A causa del movimiento molecular a temperatura ambiente, los tres protones metilo alcanzan un promedio durante el curso del experimento RMN (que normalmente requiere unos pocos milisegundos). Estos protones se degeneran y forman un pico al mismo desplazamiento químico. La forma y el tamaño de los picos son indicadores de la estructura química. En el ejemplo anterior -el espectro de protones de etanol-, el pico de CH3 sería tres veces más grande que el OH. Del mismo modo, el pico de CH2 sería el doble en tamaño al pico de OH, pero sólo 2/3 del tamaño del pico de CH3. El software de análisis moderno permite analizar el tamaño de los picos para comprender cómo muchos protones dan lugar al pico. Esto se conoce como integración, un proceso matemático que calcula el área bajo un gráfico (lo que, en esencia, es un espectro). El analista debe integrar el pico y no medir su altura, porque los picos también tienen anchura y, por ende, su tamaño depende de su área y no de su altura. Sin embargo, cabe mencionar que el número de protones, o cualquier otro núcleo observado, es sólo proporcional a la intensidad, o integral, de la señal RMN, en los experimentos RMN unidimensionales más simples. En experimentos más elaborados, como los que suelen utilizarse para obtener el espectro RMN del carbono-13, la integral de las señales depende de la tasa de relajación del núcleo, y de sus constantes de acoplamiento escalar y dipolar. Muy a menudo, estos factores son poco conocidos, por lo que la integral de la señal RMN es muy difícil de interpretar en los experimentos más complicados. Acoplamiento-J Parte de la información más útil para determinar la estructura en un espectro RMN unidimensional proviene del acomplamiento-J o acoplamiento escalar (un caso especial de acoplamiento espín-espín) entre los núcleos activos de RMN. Este acoplamiento surge de la interacción de los diferentes estados espín a través de los enlaces químicos de una molécula, y resulta en la división de señales RMN. Estos patrones de división pueden ser complejos o simples y, del mismo modo, pueden ser interpretables o engañosos. Este acoplamiento proporciona información detallada sobre la conectividad de los átomos en una molécula. El acoplamiento a núcleos equivalentes n (espín ½) divide la señal en un multiplete n + 1 con ratios de intensidad que siguen el triángulo de Pascal. El acoplamiento a espines adicionales conducirá a nuevas divisiones de cada uno de los componentes del multiplete; por ejemplo, el acoplamiento a dos núcleos diferentes de espín ½ , con constantes de acoplamiento muy distintas, conducirá a un doblete de dobletes (abreviatura: dd). Hay que tener en cuenta que el acoplamiento entre núcleos que son químicamente equivalentes (es decir, que tienen el mismo desplazamiento químico) no tiene efecto de los espectros RMN, y los acoplamientos entre núcleos que son distantes (por lo general más de 3 enlaces en moléculas flexibles) suelen ser demasiado pequeños para observar divisiones. Los acoplamientos de largo alcance, de más de tres enlaces, se observan a menudo en compuestos aromáticos y cíclicos, conduciendo a patrones de división más complejos. Por ejemplo, en el espectro de protones para el etanol que se ha descrito anteriormente, el grupo CH3 se divide en un triplete con una relación de intensidad de 1:2:1 mediante los dos protones CH2 vecinos. Del mismo modo, el CH2 se divide en un cuarteto con una relación de intensidad de 1:3:3:1 mediante los tres protones CH3 vecinos. En principio, los dos protones CH2 también se dividen de nuevo en un doblete para formar un doblete de cuartetos mediante el protón hidroxilo, pero el intercambio intermolecular del protón hidroxilo acídico a menudo resulta en una pérdida de información del acoplamiento. El acoplamiento a cualquier núcleo de espín ½, tal como el fósforo-31 o el flúor-19, funciona de esta manera (aunque las magnitudes de las constantes de acoplamiento pueden ser muy diferentes). Pero los patrones de división difieren de los descritos anteriormente para los núcleos con espín superior a ½ debido a que el número cuántico de espín tiene más de dos valores posibles. Por ejemplo, para el acoplamiento al deuterio (un núcleo de espín 1) divide la señal en un triplete 1:1:1, porque el espín 1 tiene tres estados de espín. Del mismo modo, un núcleo de espín 3/2 divide una señal 1:1:1:1 en un cuarteto y así sucesivamente. El acoplamiento combinado con el desplazamiento químico (y la integración de protones) nos dice no sólo el entorno químico de los núcleos, sino también el número de núcleos activos RMN vecinos en la molécula. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 18 de 26 En los espectros más complejos, con múltiples picos en desplazamientos químicos similares, o en el espectro de núcleos distintos del hidrógeno, el acoplamiento es a menudo la única manera de distinguir núcleos diferentes. Acoplamiento de segundo orden (o fuerte) La descripción anterior asume que la constante de acoplamiento es pequeña en comparación con la diferencia en frecuencias RMN entre los espines inequivalentes. Si la separación del desplazamiento disminuye (o la fuerza del acoplamiento aumenta), los patrones de intensidad del multiplete se distorsionan, y luego se vuelven más complejos y difíciles de analizar (especialmente si más de dos espines están involucrados). La intensificación de algunos picos en un multiplete se logra a expensas del resto, que a veces casi desaparece en el ruido de fondo, aunque el área integrada bajo los picos se mantenga constante. En la mayoría de RMN de alto campo, sin embargo, las distorsiones suelen ser modestas y las distorsiones características (techo) pueden ayudar a identificar los picos. Los efectos de segundo orden disminuyen cuando la diferencia de frecuencia entre multipletes aumenta, por lo que el espectro RMN de alto campo (es decir, de alta frecuencia) muestra menos distorsión que los espectros de frecuencia menor. Los primeros espectros a 60 MHz eran más propensos a la distorsión que los espectros de máquinas posteriores que operan en frecuencias de 200 MHz o superiores. Inequivalencia magnética Pueden ocurrir efectos más sutiles si los espines químicamente equivalentes (es decir, núcleos relacionados por simetría y con la misma frecuencia RMN) tienen diferentes relaciones de acoplamiento respecto a los espines externos. Los espines que son químicamente equivalentes pero no son indistinguibles (sobre la base de sus relaciones de acoplamiento) se denominan espines con inequivalencia magnética. Por ejemplo, los sitios 4 H del 1,2-diclorobenceno se dividen en dos pares químicamente equivalentes por simetría, pero un individuo miembro de uno de los pares tiene diferentes acoplamientos a los espines que componen el otro par. La inequivalencia magnética puede dar lugar a espectros muy complejos que sólo pueden ser analizados mediante modelado computacional. Estos efectos son más comunes en los espectros RMN de sistemas aromáticos y otros no flexibles, mientras que el promedio conformacional de los enlaces CC en moléculas flexibles tiende a igualar los acoplamientos entre protones en carbonos adyacentes, reduciendo los problemas con la inequivalencia magnética. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 19 de 26 ESPECTROMETRÍA DE CORRELACIÓN La espectrometría de correlación es uno de los diversos tipos de espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) bidimensional. Este tipo de experimento RMN es mejor conocido por su acrónimo, COSY. Otros tipos de espectrometría RMN bidimensional son la espectrometría-J, la de intercambio (EXSY), la de efecto Overhauser nuclear (NOESY), la de correlación total (TOCSY), y experimentos de correlación heteronuclear como el HSQC, HMQC y HMBC. Los espectros bidimensionales RMN proporcionan más información acerca de una molécula que los espectros RMN unidimensionales, y son especialmente útiles para determinar la estructura de la molécula, en particular para moléculas que son demasiado complicadas para la RMN unidimensional. El primer experimento bidimensional, COSY, fue propuesto por Jean Jeener, un profesor de la Université Libre de Bruxelles, en 1971. Este experimento fue posteriormente implementado por Walter P. Aue, Enrico Bartholdi y Richard R. Ernst, que publicaron sus trabajos en 1976. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE ESTADO SÓLIDO Una variedad de circunstancias físicas impide que las moléculas sean estudiadas en solución, ni tampoco mediante otras técnicas espectroscópicas a un nivel atómico. En los medios de fase sólida, tales como cristales, polvos microcristalinos, geles, soluciones anisotrópicas, etc, se da en particular el acoplamiento dipolar y la anisotropía de desplazamiento químico, que se convierten en dominantes para el comportamiento de los sistemas de espín nuclear. En la espectrometría RMN convencional en estado de solución, estas interacciones adicionales darían lugar a una ampliación considerable de las líneas espectrales. Diversas técnicas permiten establecer condiciones de alta resolución, que pueden, al menos para los espectros de 13 C, ser comparables a los espectros RMN en estado de solución. Dos conceptos importantes para la alta resolución en la espectrometría RMN de estado sólido son la limitación de la posible orientación molecular mediante orientación de la muestra, y la reducción de las interacciones magnéticas nucleares anisotrópicas mediante giro de la muestra. De este último enfoque, destaca el método del giro rápido en torno al ángulo mágico, cuando el sistema está compuesto por núcleos de espines 1/2. Una serie de técnicas intermedias, con muestras de alineamiento parcial o movilidad reducida, se están utilizando también en espectrometría RMN. Las aplicaciones de la RMN de estado sólido suelen utilizarse en investigaciones sobre proteínas de la membrana, fibrillas de proteínas, todo tipo de polímeros, análisis en química inorgánica, y también otras más "exóticas" como las hojas de plantas y las pilas de combustible. ESPECTROMETRÍA RMN APLICADA A PROTEÍNAS Gran parte de la reciente innovación dentro de la espectrometría RMN se ha dado en el campo de estudio de las proteínas, y se ha convertido en una técnica muy importante en la biología estructural. Un objetivo común de estas investigaciones es obtener una alta resolución de las estructuras tridimensionales de las proteínas, similar a lo que puede lograrse por cristalografía de rayos X. En contraste con la cristalografía de rayos X, la RMN se limita sobre todo a las proteínas relativamente pequeñas, de menos de 35 kDa, aunque los avances técnicos permiten la resolución de estructuras más grandes. La espectrometría RMN es a menudo la única manera de obtener información de alta resolución, en todo o en parte, de proteínas no estructuradas. Las proteínas son varios órdenes de magnitud más grandes que las pequeñas moléculas orgánicas que se mencionaron anteriormente en este artículo, pero la misma teoría se aplica a la RMN. Debido al mayor número de elementos presentes en la molécula, los espectros unidimensionales básicos se ven solapados con la superposición de señales, hasta el punto de que el análisis resulta imposible. Por lo tanto, se realizan experimentos multidimensionales (2, 3 o 4D) para hacer frente a este problema. Para facilitar estos experimentos, es conveniente marcar isotópicamente la proteína con 13 C y 15 N, debido a que los isótopos 12 C AINS-02 Tipos de espectrometria Página 20 de 26 predominantes de forma natural no son activos a la RMN, mientras que el momento cuadrápolo nuclear del isótopo 14 N predominante de forma natural impide que se pueda obtener información de alta resolución a partir de este isótopo de nitrógeno. El método más importante utilizado para la determinación de la estructura de las proteínas utiliza experimentos NOE para medir las distancias entre pares de átomos dentro de la molécula. Posteriormente, las distancias obtenidas se utilizan para generar una estructura 3D de la molécula usando un programa de ordenador. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 21 de 26 ESPECTROMETRÍA RAMAN La espectrometría Raman es una técnica espectroscópica utilizada en física de la materia condensada y también en química para el estudio de los modos vibracionales, rotacionales y otros de baja frecuencia en un sistema. Se basa en la dispersión inelástica, o dispersión Raman, de la luz monocromática, que por lo general procede de un láser en el rango visible, infrarrojo cercano, o ultravioleta cercano. La luz láser interactúa con fonones u otras excitaciones en el sistema, por lo que la energía de los fotones láser se desplaza hacia arriba o hacia abajo. Normalmente, la muestra se ilumina con un rayo láser. La luz del punto iluminado se recoge con una lente y se envía a través de un monocromador. Las longitudes de onda cercanas a la línea láser, debidas a la dispersión elástica de Rayleigh, son filtradas, mientras que el resto de la luz recogida se dispersa en un detector. La dispersión Raman espontánea es generalmente muy débil, y como resultado la principal dificultad de la espectrometría Raman es separar la luz débil dispersada inelásticamente de la luz intensa láser por dispersión de Rayleigh. Históricamente, los espectrómetros Raman utilizaban rejillas de difracción holográfica y múltiples etapas de dispersión para lograr un alto grado de rechazo láser. En el pasado, los detectores de elección para las configuraciones de dispersión Raman eran los fotomultiplicadores, lo que daba lugar a largos tiempos de adquisición. Sin embargo, la instrumentación moderna en casi todo el mundo emplea filtros de muesca o borde para rechazar el láser, así como espectrógrafos y detectores CCD. Hay diferentes tipos avanzados de espectrometría Raman, como la de superficie potenciada, la polarizada, la estimulada, la de transmisión, la compensada espacialmente y la híper-Raman. TEORÍA BÁSICA El efecto Raman se produce cuando la luz incide sobre una molécula e interactúa con la nube de electrones de los átomos de esa molécula. El fotón incidente excita uno de los electrones a un estado virtual. La molécula se excita desde el estado basal a un estado de energía virtual, y se relaja a un estado vibracional excitado, lo que genera la dispersión de Raman Stokes. Si la molécula ya se encontraba en un estado elevado de energía vibracional, la dispersión Raman se llama entonces dispersión Raman anti-Stokes. Para que la molécula exhiba el efecto Raman es necesario un desplazamiento en la polarizabilidad molecular, o cantidad de deformación de la nube de electrones con respecto a la coordenada vibracional. La cantidad del desplazamiento de polarizabilidad determinará la intensidad de la dispersión Raman, siempre que el desplazamiento Raman sea igual al nivel vibracional que está involucrado. HISTORIA Aunque la dispersión inelástica de la luz la predijo Smekal en 1923, no fue hasta 1928 cuando se observó en la práctica. El efecto Raman fue nombrado después de que uno de sus descubridores, el científico indio Sir CV Raman, observara el efecto por medio de la luz del sol (en 1928, junto con KS Krishnan e independientemente de Grigory Landsberg y Leonid Mandelstam). Raman ganó el Premio Nobel de Física en 1930 por este descubrimiento, realizado utilizando la luz del sol, un filtro fotográfico de banda estrecha para crear luz monocromática y un filtro "cruzado" para bloquear esta luz monocromática. Posteriormente, el arco de mercurio se convirtió en la principal fuente de luz, primero con detección fotográfica y, a continuación, con detección espectrofotométrica. En la actualidad, se utilizan láseres como fuentes de luz. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 22 de 26 APLICACIONES La espectrometría Raman se utiliza comúnmente en química, ya que la información vibracional es muy específica para los enlaces químicos de las moléculas. Por lo tanto, proporciona una huella dactilar de la molécula que puede ser identificada. La región de huella digital de las moléculas orgánicas está en el rango de 500-2000 cm -1. Otra forma de uso de la técnica es el estudio de cambios en las uniones químicas, por ejemplo cuando un sustrato se añade a una enzima. Los analizadores de gases Raman tienen muchas aplicaciones prácticas. Por ejemplo, se usan en medicina para el seguimiento en tiempo real de las mezclas de gases respiratorios y la anestesia durante la cirugía. En física del estado sólido, la espectrometría Raman espontánea se utiliza para, entre otras cosas, caracterizar los materiales, medir la temperatura, y encontrar la orientación cristalográfica de una muestra. Al igual que ocurre con moléculas individuales, un material sólido tiene modos de fonón característicos que pueden ayudar a identificarlo. Además, la espectrometría Raman se puede utilizar para observar otras excitaciones de baja frecuencia en los sólidos, como plasmones, magnones, y excitaciones de brecha en superconductores. La señal Raman espontánea proporciona información sobre la población de un modo fonón determinado en el rango entre la intensidad Stokes (desplazada hacia abajo) y anti-Stokes (desplazada hacia arriba). La dispersión Raman mediante un cristal anisotrópico da información sobre la orientación del cristal. La polarización de la luz de dispersión Raman en relación con el cristal, y la polarización de la luz láser, pueden utilizarse para conocer la orientación del cristal, siempre que la estructura cristalina sea conocida. Las fibras activas Raman, como la aramida y el carbono, tienen modos vibracionales que muestran un cambio en la frecuencia Raman con estrés aplicado. Las fibras de polipropileno también exhiben cambios similares. El modo de respiración radial es una técnica de uso habitual para evaluar el diámetro de los nanotubos de carbono. La espectrometría Raman compensada espacialmente (SORS), que es menos sensible a las capas superficiales que la espectrometría Raman convencional, se puede utilizar para descubrir la falsificación de medicamentos sin necesidad de abrir su embalaje interior, y para monitorización no invasiva de tejido biológico. La espectrometría Raman se puede utilizar también para investigar la composición química de documentos históricos, como el Libro de Kells, y contribuir al conocimiento de las condiciones sociales y económicas en el momento en que los documentos fueron producidos. Esto es especialmente útil porque la espectrometría Raman es una forma no invasiva que permite preservar este tipo de materiales. MICROESPECTROMETRÍA RAMAN La espectrometría Raman ofrece varias ventajas para el análisis microscópico. Dado que se trata de una técnica de dispersión, las muestras no necesitan ser fijadas o seccionadas. Los espectros Raman pueden ser obtenidos a partir de un volumen muy bajo (<1 μm de diámetro); estos espectros permiten la identificación de especies presentes en ese volumen. El agua no interfiere de manera apreciable. Por lo tanto, la espectroscopia Raman es adecuada para el examen microscópico de minerales, materiales como cerámica y polímeros, y células y proteínas. Un microscopio Raman consiste de un microscopio óptico estándar con un láser de excitación, un monocromador y un detector sensible (como un dispositivo de carga acoplada (CCD), o un tubo fotomultiplicador (PMT)). AINS-02 Tipos de espectrometria Página 23 de 26 En visualización directa, todo el campo de visión se examina por dispersión sobre una pequeña gama de números de onda (turnos Raman). Por ejemplo, un número de onda característico para el colesterol podría ser utilizado para registrar la distribución de colesterol en un cultivo celular. El otro enfoque es la visualización hiperespectral o las imágenes químicas, en las que miles de espectros Raman son adquiridos por todo el campo de visión. Los datos pueden ser utilizados para generar imágenes que muestran la ubicación y la cantidad de distintos componentes. Tomando el ejemplo del cultivo celular, una imagen hiperespectral podría mostrar la distribución de colesterol, así como de proteínas, ácidos nucleicos y ácidos grasos. Las técnicas sofisticadas de procesamiento de imágenes y señales pueden utilizarse para ignorar la presencia de agua, los medios de cultivo y otros interferentes. La microscopía Raman y, en particular, la microscopía confocal, disponen de una resolución espacial muy alta. Por ejemplo, las resoluciones laterales y de profundidad son de 250 nm y 1,7 μm, respectivamente, utilizando un microespectrómetro confocal Raman con la línea de 632,8 nm de un láser de He-Ne con una abertura de 100 μm de diámetro. Dado que las lentes objetivo de los microscopios enfocan el rayo láser a varios micrómetros de diámetro, el resultado del flujo de fotones es mucho mayor que los que se logran en las configuraciones Raman convencionales. Esto tiene el beneficio añadido de una mayor desactivación de la fluorescencia. Sin embargo, el alto flujo de fotones también puede causar la degradación de la muestra, y por esta razón algunas configuraciones requieren un sustrato que conduzca térmicamente (lo que actúa como un disipador de calor) a fin de mitigar este proceso. Mediante el uso de la microespectrometría Raman, se pueden medir los espectros Raman, resueltos en vivo en el tiempo y el espacio, de regiones microscópicas de la muestra. Como resultado de esto, puede eliminarse la fluorescencia del agua, el medio y los intermediarios. En consecuencia, este tipo de espectrometría es apropiada para examinar proteínas, células y órganos. Para muestras biológicas y médicas, la microscopía Raman generalmente utiliza láseres de infrarrojo cercano (diodos de 785 nm y 1064 nm). Esto reduce el riesgo de dañar la muestra mediante la aplicación de alta potencia. Sin embargo, la intensidad del Raman en infrarrojo cercano es baja (debido a la dependencia ω -4 de la intensidad de dispersión Raman), y la mayoría de detectores requieren mucho tiempo de registro. En la actualidad se dispone de detectores más sensibles, por lo que esta técnica es apropiada para uso general. La microscopía Raman de muestras inorgánicas, tales como rocas, cerámicas y polímeros, puede utilizar una gama más amplia de longitudes de onda de excitación. ANÁLISIS RAMAN POLARIZADO La polarización de la luz dispersada Raman también contiene información útil. Esta propiedad puede medirse utilizando un láser de excitación polarizado y un analizador de polarización. Los espectros adquiridos con el analizador, tanto en perpendicular como en paralelo al plano de excitación, pueden ser utilizados para calcular el coeficiente de despolarización. El estudio de la técnica es pedagógicamente útil en la enseñanza de las conexiones entre la teoría de grupos, la simetría, la actividad Raman y los picos en el espectro Raman correspondiente. La información espectral que se deriva de este análisis da una idea sobre la orientación molecular y la simetría vibracional. En esencia, permite al usuario obtener valiosa información relativa a la forma molecular, por ejemplo, en química sintética o análisis polimórfico. A menudo se utiliza para entender la orientación macromolecular en entratamados cristalinos, cristales líquidos o muestras de polímeros. AINS-02 Tipos de espectrometria Página 24 de 26 VARIACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA RAMAN Se han desarrollado diversas variaciones de la espectrometría Raman. El propósito habitual es aumentar la sensibilidad (por ejemplo, una mayor superficie Raman), para mejorar la resolución espacial (microscopía Raman), o para adquirir información muy específica (resonancia Raman). AINS-02 Espectrometría Raman de superficie mejorada (SERS). Normalmente se hace en un coloide de plata o de oro, o en un sustrato que contiene plata u oro. Los plasmones de superficie de plata y oro son excitados por el láser, lo que resulta en un aumento en los campos eléctricos que rodean el metal. Teniendo en cuenta que las intensidades Raman son proporcionales a la intensidad del campo eléctrico, hay un gran aumento de la señal medida (de hasta 10 y 11). Este efecto fue observado por Fleishman, pero prevaleció la explicación propuesta por Van Duyne en 1977. Hiper-Raman. Un efecto no lineal en el que los modos vibracionales interactúan con el segundo armónico del haz de excitación. Para ello se requiere una potencia muy alta, pero permite la observación de los modos vibracionales que son normalmente "silenciosos". A menudo se basa en una potenciación de tipo SERS para incrementar la sensibilidad. Espectrometría Raman de resonancia. La longitud de onda de excitación es equivalente a una transición electrónica de la molécula o cristal, a fin de que los modos vibracionales asociados con el estado electrónico excitado se vean muy potenciados. Esto es útil para el estudio de moléculas grandes, como los polipéptidos, que pueden mostrar cientos de bandas en los espectros Raman "convencionales". También es útil para asociar los modos normales con sus cambios de frecuencia observados. Espectrometría Raman espontánea. Utilizada para estudiar la dependencia a la temperatura de los espectros Raman de las moléculas. Espectrometría Raman de pinzas ópticas (OTRS). Se utiliza para estudiar partículas individuales, e incluso procesos bioquímicos en células individuales atrapadas por pinzas ópticas. Espectrometría Raman estimulada. Un pulso de dos colores transfiere la población desde el estado basal a un estado excitado rovibracional, si la diferencia de energía se corresponde a una transición Raman permitida. Dos fotones de ionización ultravioleta, aplicados después de la transferencia de población (pero antes de la relajación), permite registrar el espectro Raman intra-molecular o inter-molecular de un gas o grupo molecular. Esta es una técnica útil para observar la dinámica molecular. Espectrometría Raman compensada espacialmente (SORS). La dispersión Raman se obtiene de regiones compensadas lateralmente fuera del punto láser de excitación, lo que disminuye significativamente las aportaciones de la capa superficial en comparación con la espectrometría Raman tradicional. Espectrometría Raman anti-Stokes coherente (CARS). Se utilizan dos rayos láser para generar un haz de frecuencia anti-Stokes coherente, que puede ser mejorada mediante resonancia. Tipos de espectrometria Página 25 de 26 Referencias bibliográficas Bibliografía Apuntes de espectrofotometria http://www.bioquimica.ucv.cl/paginas/central/bioquimica%20clinica/apuntes%20de%20espectrofotometria.pdf http://unrn.edu.ar/blogs/taid/files/2012/08/03-M%C3%A9todos-espectrosc%C3%B3picos-imprimir.pdf AINS-02 Tipos de espectrometria Página 26 de 26