descargar libro
Anuncio
VIII-Capítulo 5 Obtención de plantas libres de virus Conci, Vilma C. 1 Eliminación de virus Los virus de plantas son responsables de importantes pérdidas en los rendimientos, llegando en algunos casos a ser limitantes para el cultivo. La mayoría de los virus no se transmiten por semilla, por lo tanto, las especies que se multiplican por esta vía tienen la posibilidad de liberarse de ellos en forma natural. Por otra parte, cuando las especies que se propagan exclusivamente en forma agámica son infectadas sistémicamente por virus ellos son transmitidos, con alta eficiencia, desde la planta madre a la descendencia. Esta situación. que es normal en especies que se multiplican por bulbos, tubérculos, esquejes o estacas permite que la infección continúe de generación en generación y se disemine a diferentes regiones a través del comercio de estos propágulos. Ejemplo de ello son ajo, frutilla, frutales de carozo o pepita, yuca, papa, batata y numerosas especies ornamentales. En estos casos, la obtención y multiplicación de plantas libres de virus por medios artificiales juega un papel importante para mejorar la producción y calidad de estas especies. Existen numerosos ejemplos respecto a los beneficios obtenidos como consecuencia del empleo de plantas libres de virus, no sólo por los incrementos en la producción sino que además ha permitido la recuperación de áreas de cultivo que habían sido prácticamente abandonadas. Una larga lista de especies han sido liberadas de virus a través de la regeneración de plantas in vitro. El sistema más frecuentemente utilizado y con mayores éxitos es el cultivo de meristema, suplementado en muchos casos por tratamientos de termoterapia o quimioterapia. 1.2 Cultivo de meristemas Esta técnica consiste en aislar el meristema y sembrarlo en un medio de cultivo adecuado que posibilite el desarrollo de una planta completa. El término cultivo de meristema, por lo general, no es correctamente empleado, ya que en la mayoría de los casos se siembra el domo meristemático acompañado por uno o dos primordios foliares. El domo es una estructura de menos de 0,1 mm de diámetro muy difícil de extraer con éxito en forma aislada, y de la cual resulta con frecuencia complicado obtener plantas completas. Para ello es necesario un medio de cultivo con una concentración de nutrientes muy equilibrada y condiciones ambientales muy estrictas. Por consiguiente los resultados en ese sentido han sido muy pobres. Por esta razón, en la mayoría de los casos, se utiliza el domo acompañado de uno ó más primordios foliares. Tal vez lo más aconsejable sería utilizar el término cultivo de «yema», o «brote», o «tallo». A pesar de ello, en este capítulo utilizaremos la denominación cultivo de meristema por ser esta la terminología más difundida, aunque no sea estrictamente correcta. En general se considera que las plantas provenientes del cultivo de meristema son idénticas u homólogas a la planta madre de donde se extrajo el explanto. Por el contrario, las plantas derivadas de otros tejidos como callos, nucela, primordios florales o protoplastos, usualmente presentan distintos grados de variabilidad. Esto último no es deseable para la producción de plantas libres de virus, donde el objetivo que se persigue es mejorar la sanidad de la planta pero conservar el resto de sus características agronómicas. Sin embargo, es importante aclarar que han sido señaladas ciertas mutaciones en plantas provenientes de cultivo de meristema, pero con mucha menos frecuencia y menos importantes que las detectadas con otros sistemas de obtención de plantas in vitro. El cultivo de meristema ha sido utilizado con éxito para distintos objetivos, entre ellos los más frecuentes son la rápida clonación de material deseable (micropropagación), conservación de germoplasma a baja temperatura o criopreservación y para la obtención de plantas libres de patógenos sistémicos, entre ellos los virus, que son el objetivo de este capítulo. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 303 2 Distribución de los virus en la planta Los virus en la planta no están uniformemente distribuídos. En las infecciones sistémicas algunos están limitados al floema o a pocas células parenquimáticas adyacentes; otros involucran a todas, o casi todas, las células de la planta. Existen otros virus que dejan sectores de tejidos sin infectar y sólo unos pocos invaden los nuevos tejidos meristemáticos. Los meristemas suelen tener pocos o ningún virus. Las razones para que ello ocurra no están esclarecidas completamente pero se mencionan como posibles las siguientes: 1.- Sistema vascular poco diferenciado. Los virus son rápidamente transportados a lo largo de toda la planta por el floema y así se distribuyen sistémicamente. Los meristemas no tienen tejido vascular formado, por lo tanto, el avance es solamente a través del movimiento célula a célula. Se comprobó que el Tobacco mosaic virus (TMV) y el Potato virus X (PVX) avanzan 1 a 8 cm/h por el tejido vascular y 5 a 15 µ/h de célula a célula. Por esta razón se supone que las células meristemáticas no están completamente invadidas por virus cuando están en activo crecimiento. 2.- Elevada actividad metabólica. Presumiblemente es más difícil para un virus invadir células con elevada actividad metabólica, como es el caso de las células meristemáticas, donde tiene lugar una activa mitosis. 3.- Elevadas concentraciones de auxinas. Se ha observado que elevadas concentraciones de 2,4-D en el medio de cultivo inhiben la multiplicación de los virus. Por lo tanto se puede suponer que las altas concentraciones de auxinas endógenas existentes en los ápices meristemáticos pueden producir un efecto similar. Primordios foliares Nudos Figura 1: Esquema ilustrativo de la iniciación de la hoja en el ápice del brote de dicotiledónea de hojas opuestas (Esau, 1959). 4 Factores que pueden afectar la producción de plantas libres de virus 3 Meristema apical El meristema apical incluye las células meristemáticas iniciales y sus derivadas inmediatas del ápice de la raíz o del brote. El número de células iniciales es variable y pueden presentarse en una o más filas. 304 Dentro del meristema apical se distinguen dos zonas de tejido: la túnica, que consta de una o más capas periféricas de células, y el cuerpo, masa celular rodeada por la túnica. La demarcación entre ambas zonas se deduce de las diferencias en la división de las células. Las capas de la túnica presentan predominantemente divisiones anticlinales, es decir, experimentan un crecimiento en superficie. Las células del cuerpo se dividen según varios planos y la masa crece en volumen. El concepto de túnica-cuerpo fue desarrollado refiriéndose a las angiospermas pero resulta poco apropiado para la caracterización del meristema apical de las gimnospermas. En este grupo se presentan comúnmente varias zonas de crecimiento derivadas de un grupo de células iniciales superficiales. El diámetro de los ápices oscila entre 90µ en algunas angiospermas a 3,5mm en el caso de Cyca revoluta. La forma y el tamaño del ápice cambian notoriamente durante el desarrollo de la planta. Las hojas se inician mediante divisiones periclinales de un pequeño grupo de células situadas al lado del meristema y su situación en relación al meristema apical varía en las diferentes especies (Fig. 1). Varios factores pueden afectar el buen desarrollo in vitro de una planta a partir de un meristema: el medio de cultivo empleado, el estado fisiológico del explanto, la concentración de hormonas endógenas del CONCI, Vilma C. explanto, las contaminaciones internas o externas producidas durante el desarrollo del cultivo, el tamaño y localización del explanto, etc. Mencionaremos aquí algunas consideraciones haciendo especial referencia a aquellas que afectan la obtención de plantas libres de virus. - Localización del explanto: frecuentemente se utilizan meristemas apicales y axilares con buenos resultados. Sin embargo es aconsejable el uso de yemas terminales ya que tienen un mayor crecimiento potencial que las yemas laterales. En general, los meristemas más jóvenes se desarrollan mejor que los viejos y producen mayores cantidades de plantas libres de virus que las yemas laterales, probablemente porque tienen un crecimiento más activo que las axilares. No obstante, también es posible la obtención de plantas sanas a partir de yemas axilares. - Estación o momento de la extracción: los meristemas en activo crecimiento son los más recomendados por su alto potencial de desarrollo, situación que favorece las posibilidades de obtener plantas libres de virus. Para especies vegetales con períodos de dormancia definidos los mejores resultados se obtienen cuando los meristemas están despiertos y comienzan a brotar. En el caso de ser necesario se recomienda despertar el material. Los tratamientos más usados consisten en someterlo a períodos de frío (variable según la especie) y/o el uso de ácido giberélico. - Tamaño del explanto utilizado: el meristema tiene una serie de requerimientos nutricionales para cumplir sus funciones de autoperpetuación y de generar células para formar tejidos definidos. Por lo tanto, al ser retirado de la planta debe ser sembrado en un medio de cultivo apropiado, así rápidamente desarrolla en una planta completa. Cuanto más pequeño sea el meristema (explanto) más difícil será encontrar el medio de cultivo adecuado que permita un buen desarrollo. Se ha observado que sembrar sólo el domo meristemático, en general no da buenos resultados. En la mayoría de los casos no se desarrolla una planta, sólo produce callo que luego puede, o no, regenerar plantas. Como se mencionó anteriormente, la diferenciación a partir de callo implica un incremento en la posibilidad de aparición de mutaciones y de variabilidad no deseada cuando se intenta obtener plantas genéticamente iguales a las donantes de explantos. Por esta razón generalmente se cultiva el domo, con uno o dos primordios foliares, a partir del cual se obtiene con frecuencia una planta completa. El tamaño del explanto, así como el número de primordios que deba poseer, dependerá, en cada caso, del objetivo que se persiga, la especie vegetal que se trate y el o los virus involucrados. En términos generales, cuanto más grande sea el explanto, mayor será la posibilidad de regenerar plantas, pero menor la posibilidad de obtener plantas libres de virus. Si por el contrario se parte de plantas ya saneadas, o lo que se desea es sólo la multiplicación del material in vitro, se podrán usar yemas o brotes de mayor tamaño y asegurar así el desarrollo de una planta sin mayores requerimientos nutricionales. Existe un gradiente de incremento en la concentración de virus desde el domo meristemático hacia los sucesivos primordios foliares coincidiendo con el grado de diferenciación. Esto significa que la probabilidad de obtener plantas libres de virus es inversamente proporcional al tamaño del explanto utilizado. Explantos de entre 0,2 y 0,5 mm son los que más frecuentemente producen plantas libres de virus. También se han informado, sin embargo, buenos resultados con el empleo de meristemas más grandes. El tamaño recomendado es variable y depende del hospedante, de tratamientos previos (termoterapia, quimioterapia, etc.) y del (o los) virus involucrados. En algunos casos no sólo es importante considerar la especie hospedante sino también el cultivar, ya que se han detectado notables diferencias entre ellos. Por otra parte, es probable que el tamaño del meristema por si solo no sea el factor que determina el éxito en la obtención de plantas libres de virus. Se han detectado numerosos virus en meristemas apicales de 0,10,5mm en diferentes especies (clavel, poroto, tabaco, tomate, petunia, papa, etc.). Sin embargo se ha logrado la obtención de plantas sanas con explantos de esos tamaños o Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 305 mayores, por lo que se podría suponer que la eliminación de virus ocurre también durante el proceso de cultivo in vitro o por alguna otra razón no aclarada todavía. 5 Desarrollo del cultivo El primer paso es la extracción del meristema o explanto. Para ello se corta una porción de tejido de aproximadamente 1cm que incluye el meristema y se desinfecta. Esto frecuentemente se realiza mediante la inmersión en alcohol seguida de inmersión en hipoclorito de sodio o calcio. Luego en la cámara de flujo laminar y con la ayuda de instrumental estéril y bajo microscopio estereoscópico se procede a la escisión del explanto. Una vez extraído se coloca en un medio de cultivo adecuado en el cual es mantenido, para su desarrollo, bajo condiciones apropiadas de luz, temperatura y humedad. - Fase I: Etapa de iniciación: el objetivo de esta primera etapa es iniciar el desarrollo del explanto cultivado en forma aséptica. En general ocurre primero un aumento del tamaño y luego el tejido puede ir adquiriendo lentamente pigmentación verde. Posteriormente irán desarrollándose brotes o plantas completas a partir de las cuales pueden obtenerse yemas axilares. - Fase II: Etapa de multiplicación: en esta etapa el objetivo es la multiplicación activa del explanto para la producción de numerosas plantas a partir de una, constituyendo así un clon proveniente de un solo meristema, denominado en este caso «mericlon». La multiplicación o micropropagación puede efectuarse por proliferación de brotes axilares, brotes adventicios, formación de embriones somáticos, etc., tratando siempre de evitar la formación de callo como paso previo a la diferenciación. La etapa de multiplicación puede involucrar varios repiques del material a medio de cultivo fresco. Se ha visto con frecuencia que la tasa de multiplicación varía con el tiempo de permanencia del explanto en el medio de cultivo. Es frecuente que después de 2 o más subcultivos aumente el número de yemas que se producen a partir de un explanto. Sin embargo no es aconsejable mantener el material indefinidamente en 306 esta etapa, ya que se ha observado un aumento de la variabilidad cuando las plantas son mantenidas por largos períodos en estas condiciones. En general, se considera que 10-12 subcultivos es lo máximo que debería mantenerse el material en esta etapa. - Fase III: Etapa de acondicionamiento para el transplante a tierra: frecuentemente las plantas desarrolladas in vitro no poseen raíces o, si las tienen, muchas veces no son funcionales. En general tienen malas conexiones vasculares entre la raíz y el tallo. A nivel foliar puede estar alterada la producción de clorofila. Los estomas no funcionan o lo hacen muy lentamente y la capa de cera epicuticular es muy reducida. La formación de raíces adventicias es relativamente fácil de conseguir en plantas herbáceas, y dificultosa en leñosas. Existe una etapa de inducción de raíces, de iniciación del crecimiento y de elongación de las mismas. En esta fase del crecimiento se suele incrementar la intensidad de luz para favorecer la rusticación de las plantas pero hay que tratar de que la misma no afecte a las raíces. Esto puede mejorarse cubriendo la base de los tubos con papel de aluminio o usando 0,3% de carbón activado en el medio de cultivo para proporcionar sombra a las raíces. Las plantas que se propagan por bulbos, tubérculos, rizomas, etc., pueden ser inducidas a formarlos in vitro para mejorar la eficiencia en el transplante, ya que éstos pueden ser cosechados del tubo de ensayo y sembrados directamente en tierra sin mayores dificultades. -Transplante: en el momento del transplante es importante no dañar las raíces. Es necesario lavarlas cuidadosamente para retirar los restos de agar, debido a que los medios de cultivo ofrecen un buen sustrato para el desarrollo de hongos y bacterias que pueden afectar el desarrollo de la planta en el suelo. El mayor problema en esta etapa es la deshidratación debida a algunas características anatómicas que presentan las plantas creciendo in vitro (reducida cera epicuticular, lentitud de movimiento estomático, abun- CONCI, Vilma C. dantes espacios intercelulares, dificultades en la conexiones entre el tallo y la raíz). Conviene transferir las plantas a macetas y mantenerlas con alta humedad relativa durante los primeros 15 días. Se han observado buenos resultados con el uso de rocío artificial o neblina. Otra práctica frecuente es cubrir las plantas con polietileno o recipientes de vidrio transparente, a modo de cámara húmeda, y descubrirlas progresivamente hasta destaparlas completamente al cabo de 3 ó 4 semanas. ladas de focos de contaminación. Esta etapa se extiende todo el tiempo necesario hasta la obtención del número requerido de individuos para realizar la producción a nivel comercial. Si el área protegida está lo suficientemente alejada de plantas infectadas y se evita el acceso de los vectores, es posible mantener las plantas libres de virus por muchos ciclos de cultivo. Son fundamentales los análisis periódicos que permitan llevar un registro del estado sanitario del material. 6 Multiplicación del material libre de virus ex vitro 7 Algunas alternativas para mejorar la eficiencia en la producción de plantas libres de virus Las plantas libres de virus deben ser multiplicadas bajo condiciones controladas para evitar su recontaminación. Una vez rusticadas y adaptadas nuevamente a las condiciones ex vitro ellas pueden ser multiplicadas bajo jaulas antivectores todo el tiempo que se considere necesario. En esta etapa es importante evitar que las plantas se reinfecten. Es recomendable la esterilización del suelo para evitar la contaminación con nematodes y hongos, que en algunos casos son transmisores de virus. Las jaulas deben estar revestidas de una malla muy fina para evitar la entrada de los vectores. Es recomendable, para evitar la entrada de los vectores, utilizar una doble puerta que permita abrir una de las hojas y recién cuando está cerrada, abrir la otra. Periódicamente la malla debe ser controlada para detectar inmediatamente la presencia de roturas que dejen expuestas a las plantas. A pesar de estos cuidados, es recomendable aplicar insecticidas y mantener libre de malezas dentro y fuera de la jaula, ya que las mismas pueden actuar como reservorios de vectores. Si bien la sanidad del material introducido a las jaulas debe ser previamente controlada, es conveniente, en esta etapa, repetir los análisis para detectar rápidamente la presencia de una infección a fin de eliminarla antes de que se propague. En estas condiciones es posible mantener como «plantas madres», por mucho tiempo, un stock de material libre de virus a partir del cual se pueden hacer las sucesivas multiplicaciones. La etapa de multiplicación masiva, o a gran escala, se realiza a campo en áreas ais- - Termoterapia: es la técnica más antigua utilizada para la liberación de patógenos en plantas. No obstante, es difícil la obtención de plantas libres de virus con el empleo de altas temperaturas solamente. Mantener las plantas enfermas por períodos prolongados en termoterapia disminuye la concentración de virus, pero al llevar las plantas nuevamente a condiciones normales, en poco tiempo recuperan la concentración original. Una práctica muy usada es la combinación de la termoterapia y el cultivo de meristemas. Esto implica mantener las plantas en termoterapia por un período variable de tiempo y temperatura (generalmente entre 34° y 38°C desde una a varias semanas), luego se realiza la extracción del meristema, se siembra en el medio de cultivo y se continúa con los pasos convencionales para su desarrollo. Esta práctica no es efectiva para todos los virus por igual, depende del virus y del hospedante. Se ha observado que un mismo virus en distintas especies se inactiva en forma diferente. Generalmente, esta práctica ha resultado más efectiva en virus de partículas alargadas, y menos eficiente para virus poliédricos. Podría suponerse que cuanto más largo es el tratamiento de calor, resulta más efectivo; sin embargo, no siempre es así. En crisantemo y en ajo se ha mencionado, por ejemplo, que tratamientos de 10-30 días pueden ser efectivos para la liberación de algunos virus; en cambio, tratamientos más prolongados no siempre producen mayor porcentaje de plantas sanas. Estos tratamien- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 307 tos prolongados, por otra parte, dificultan la implantación in vitro del tejido, lo cual se traduce en un número más reducido de plantas obtenidas. En algunos casos las bajas temperaturas (5°C) seguidas del cultivo de meristemas fueron utilizadas con éxito para la eliminación de virus. Esta práctica fue aplicada principalmente en el caso de viroides, los cuales se desarrollan bien con altas temperaturas. - Quimioterapia: el uso de antivirales sería la solución definitiva para estas enfermedades; sin embargo, hasta ahora no se ha encontrado un producto que por sí solo cumpla esta función. Algunas sustancias químicas ocasionan una disminución en la concentración de virus existentes en la planta y atenúan, o suprimen, los síntomas típicos de los virus, pero, una vez suspendido el tratamiento se recupera la concentración original. Han sido evaluadas diferentes sustancias pero la más utilizada es el Ribavirin o Virazole (1-β-Dribofuranosyl-1, 2, 4 – triazole –3- carboxamide). Un modo adecuado de emplear los antivirales es combinándolos con el cultivo de meristemas. También han sido aplicados directamente a los meristemas in vitro. En este caso, el antiviral es colocado en medio del cultivo en concentraciones variables, que van desde 10 a 50 mg/l, y en algunos casos hasta 100 mg/l. Las plantas son mantenidas bajo la acción del antiviral por largos períodos que incluyen varios subcultivos. Un problema importante con el Virasole es su fitotoxicidad, que a su vez depende de la dosis empleada y de la especie de planta utilizada. El éxito del proceso en muchos casos requiere de varios meses de tratamiento y la fitotoxicidad del antiviral constituye una dificultad. También se han obtenido plantas libres de virus a partir de callos a los que previamente se les aplicó Virasole, aunque esta práctica no ha sido eficiente en todos los casos. - Electroterapia: el método consiste en aplicar corriente eléctrica a yemas por un período variable de tiempo para obtener plantas libres de patógenos. Se menciona que la aplicación de electricidad produce de- 308 gradación de las partículas y pérdida de infectividad. Esta técnica ha sido citada para liberar del mosaico al almendro cv Caetanuccia. Para ello los brotes fueron sometidos a 500V por tiempos variables y luego injertados sobre pies sanos (obtenidos por semilla). Se señaló que con 5 minutos de tratamiento los resultados fueron buenos y con 20 minutos se obtuvo completa inactivación. El método también ha sido empleado para eliminar bacterias de caña de azúcar, Potato leaf roll virus de papa, Dasheen mosaic virus de araceas y Banana streak virus de banana, entre otras, aplicando 5-30V a las yemas por un período de 5 minutos. En este caso se obtuvo una eficiencia del 3 al 60%, dependiendo del cultivar y el patógeno. - Cultivo de domos proveniente del disco basal (stem-disc dome culture): el procedimiento consiste en la obtención de plantas libres de virus a partir del cultivo de estructuras con forma de domo, diferenciadas a partir del cultivo del disco basal de dientes de ajo. Se ha informado la diferenciación de 2030 brotes a partir del cultivo del disco basal de dientes de ajo en 1 mes de cultivo. Este método fue designado por los autores (Ayabe y Sumi, 1998) como cultivo del disco basal (¨stem-disc culture¨). Una modificación posterior de esta técnica consiste en la extracción de las estructuras con forma de domo y su posterior cultivo en un medio adecuado para la obtención de plantas. - Microinjerto de ápices caulinares in vitro para obtención de plantas de naranjo libres de virus: consiste en extraer el ápice caulinar de la variedad a injertar, constituído por el domo apical y primordios foliares, y luego sembrarlo sobre la superficie decapitada del epicótilo de una plántula de 2 semanas de edad (patrón) proveniente de semilla crecida in vitro. Ver VIII-7 (plantas cítricas libres de enfermedades) 8 Análisis de las plantas obtenidas o indexing De lo expuesto previamente surge que existen varias alternativas para obtener plantas libres de virus a partir del cultivo de meristemas. Si bien existen algunos CONCI, Vilma C. lineamientos, o consideraciones generales para tener más probabilidades de éxito, no hay proceso que ofrezca total seguridad. La etapa decisiva en este sistema es el análisis que permite comprobar si realmente se ha producido la total erradicación de los virus. En la bibliografía se señalan distintos porcentajes de éxito en el proceso. Esto significa que empleando el mismo protocolo, en el mismo momento, con el mismo material, se consiguen plantas sanas y plantas que aún permanecen infectadas. Por lo tanto, la única forma de separar las plantas sanas de las enfermas es un análisis que permita distinguirlas para luego multiplicar solo aquellas que fueron liberadas de los virus. El éxito de un programa de producción de plantas libres de virus no depende de la obtención de un alto porcentaje de plantas sanas en al primera etapa, sino en la obtención de al menos unas pocas plantas madres realmente libres de patógenos. Si el número es escaso pueden ser multiplicadas por diferentes sistemas, pero si alguna de ellas está contaminada, todo el trabajo será inútil, porque al final, después de las multiplicaciones a campo, lo más probable es que tengamos todas las plantas enfermas. Las plantas deben ser analizadas una por una para hacer una buena selección de «plantas madres» a partir de las cuales se iniciarán los procesos de multiplicación del material. Es recomendable hacerle más de un análisis para asegurar su sanidad, es preferible que sea en etapas diferentes a lo largo del proceso, y en lo posible por técnicas distintas. Para realizar un análisis confiable hay que tener en cuenta varios factores que son específicos para cada combinación planta-patógeno. Es importante el empleo de sistemas de alta sensibilidad que nos permitan detectar los virus aun en bajas concentraciones; sin embargo, no existe un sistema que sea infalible, siempre hay un límite de concentración por debajo del cual el virus no puede ser detectado. Para evitar errores en este sentido es recomendable tener en cuenta algunos factores. Como ya se ha mencionado, la concentración de virus no es igual en todas las partes de una planta; por lo tanto, si queremos hacer un análisis confiable hay que establecer qué tejidos y órganos son los que concentran más el patógeno y realizar la prueba a partir de ellos. Del mismo modo también se ha comprobado que existen fluctuaciones a lo largo del ciclo de cultivo; por lo tanto, es conveniente realizar el análisis cuando la concentración de virus es mayor. Esto es importante cuando se prueba el material a campo. La elección de la técnica de análisis dependerá del patógeno que se desea eliminar y de las posibilidades para realizarla. Cuanto más temprano se descarten las plantas contaminadas más seguro será el sistema. Una planta infectada siempre es un foco de contaminación. Por más cuidados que se tengan siempre se corren riesgos. Cuando las plantas están in vitro, en general, la concentración de virus es muy baja, probablemente debido a las condiciones de cultivo, la concentración de hormonas en el medio, u otros factores no bien establecidos. Sin embargo, es recomendable hacer un análisis riguroso antes de empezar con la micropropagación para hacer el primer descarte de individuos enfermos. Frecuentemente se menciona en esta etapa el empleo de la técnica inmunoenzimática de doble sándwich de anticuerpos (DAS-ELISA). Esta prueba se realiza en una placa de poliestireno con 96 celdillas en la cual se lleva a cabo una prueba por celdilla. En el primer paso cada celda es tapizada por el anticuerpo específico para el patógeno que se está analizando. Luego se coloca el extracto de la planta a probar. Si los virus están en el mismo serán atrapados por el anticuerpo previamente colocado. En el tercer paso se aplica un anticuerpo combinado con una enzima y en el último paso se coloca el sustrato específico para la enzima. Si el virus está presente en la muestra se produce el sándwich anticuerpo-virus-anticuerpo conjugado con la enzima, el sustrato es desdoblado y la reacción vira al color amarillo (respuesta positiva, planta enferma). (Fig. 2). Esta técnica tiene varias ventajas, ya que permite el análisis simultáneo de muchas muestras (96 celdillas por placa y se pueden hacer varias placas simultáneamente). Es relativamente fácil de usar y de bajo costo. Sin embargo, nuestra experiencia nos indica que esta prueba no es lo suficientemente sensible para detectar los virus en algunos casos. Muchas de las plantas in vitro que dan resul- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 309 tados negativos mediante DAS-ELISA resultan positivas cuando se prueban por otra técnica. Algunas variantes, como ELISA en membrana de nitrocelulosa o Dot Blot, han sido empleadas con resultados más satisfactorios; sin embargo, estas técnicas por sí solas permiten el escape de muchas plantas infectadas. Figura 3: Extracto vegetal conteniendo una mezcla de virus probado por ISEM-D con antisuero para Garlic virus A. Izq., partícula viral decorada con el antisuero utilizado. Der., partícula viral no decorada de una especie viral diferente. Mejores resultados se han obtenido con el empleo de técnicas que combinan la Figura 2: Placa de DAS-ELISA mostrando resultados positivos (celdillas oscuras) y negativos (celdillas claras). serología con la microscopia electrónica como son la inmunoelectromicroscopía con o sin decoración (ISEM o ISEM-D). En esta técnica se tapiza una grilla porta especimen con anticuerpo y luego se coloca sobre ella el extracto de la planta a probar. Si las partículas virales están presentes quedarán atrapadas al anticuerpo. Luego se contrasta y se observa por el microscopio electrónico (ME), donde se pueden ver las partículas de virus que han sido selectivamente atrapadas. Esto es lo que se llama ISEM. Si antes de contrastar se aplica otra vez el antisuero y éste es atrapado por las partículas virales las mismas se verán más oscuras al ME, decoradas (ISEM-D) y serán más fáciles de detectar (Fig. 3). Estas técnicas son altamente sensibles, permiten la observación directa del virus por lo cual no hay falsos positivos y no se requiere un antisuero de alta calidad para su desarrollo. El grave inconveniente con ellas es que no son de uso masivo, porque es engorroso analizar gran cantidad de muestras, y por otra parte, se requiere de un ME, que es un equipo altamente costoso. 310 Las técnicas basadas en la detección de los ácidos nucleicos han mostrado un gran desarrollo y evolución en la última década, y son utilizadas con frecuencia debido a su alta sensibilidad y especificidad. El uso de sondas moleculares ha dado buenos resultados. Consiste en dar condiciones para que el ácido nucleico del patógeno, fijado sobre un soporte sólido (membrana de nylon), se una con un fragmento de ácido nucleico complementario, marcado con moléculas radioactivas, o con un antígeno que luego será reconocido por un anticuerpo específico que será detectado por colorimetría o fluorescencia. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes son las técnicas de mayor sensibilidad con que se cuenta actualmente. Entre ellas se mencionan: PCR anidado, transcripción reversa (RT), inmuno captura (IC) PCR post. transcripción reversa (RT-PCR), entre otras. La PCR consiste en amplificar un fragmento del genoma del virus mediante la utilización de dos iniciadores que hibridan específicamente en el genoma del patógeno. La técnica permite producir, en corto tiempo, muchas copias del segmento del genoma comprendido entre los 2 iniciadores, de tal forma que luego es posible observarlo con facilidad en un gel (Fig. 4). Esto posibilita la detección de los virus, aun en bajísimas concentraciones. Esta técnica además puede ser combinada con la serología y ser realizada en placas como las de ELISA, lo que permite el análisis simultáneo de muchas plantas. Estas pruebas, si bien son altamente sensibles, no son aún de uso masivo porque tienen un costo muy elevado. Para obtener resultados en forma práctica y confiable es posible también la combi- CONCI, Vilma C. Figura 4: Fragmentos amplificados por IC-RTPCR. Líneas 1-4, segmentos de 489pb correspondientes a Onion yellow dwarf virus; líneas 4-5, segmentos de 566pb correspondientes a Leek yellow stripe virus; línea 6, marcador de peso molecular. nación de varias pruebas, pudiendo, por ejemplo, aprovechar la practicidad del ELISA y la sensibilidad de las técnicas moleculares, o de ISEM u otras. En este caso, las plantas que resultan negativas para el test de ELISA pueden ser luego analizadas por una técnica más sensible y disminuir así el número de pruebas complicadas o costosas. Esto depende de la cantidad de plantas que ELISA sea capaz de detectar, porque si no es lo suficientemente sensible tendremos que repetir la prueba con todas, o casi todas las muestras. Como se mencionó anteriormente, la concentración de virus en las plantas in vitro en general es baja, por lo tanto, se corre el grave riesgo de considerar como sanas plantas que, en realidad, están infectadas. Por esta razón se hace casi obligatorio repetir los análisis cuando las plantas son transferidas al suelo. Es necesario dejar pasar cierto tiempo antes de hacer el análisis, para que si el virus está presente, tenga la posibilidad de incrementar su concentración y ser entonces fácilmente detectado. En esta etapa se utiliza con frecuencia el test de ELISA en cualquiera de sus variantes, que generalmente conduce a resultados confiables. En algunos casos el sistema que resulta más eficiente para hacer el indexing es el empleo de plantas indicadoras. El injerto es la forma más segura de transmitir un virus y esto es lo que se emplea como sistema de diagnóstico. Se realiza un injerto desde la planta que se desea probar a plantas que son susceptibles al virus (planta indicadora) y que desarrollan síntomas claros y evidentes de la presencia del patógeno. El inconveniente, en este tipo de análisis, es que hay que esperar que la planta obtenida in vitro sea transferida al suelo, luego que se desarrolle lo suficiente como para extraer una porción de tejido (hoja, yema, brote, etc., según el tipo de injerto). Se requiere además de un operador con habilidad para realizar el injerto con éxito y luego mantener las plantas injertadas en condiciones adecuadas hasta la aparición de los síntomas. En algunos casos, este tiempo puede ser muy prolongado. A pesar de los inconvenientes que se mencionan, para algunas especies este sigue siendo el método más seguro. Por ejemplo la frutilla, que es afectada por más de 20 enfermedades diferentes y que en muchos casos ni siquiera ha sido todavía caracterizado el agente causal, la transmisión del virus a plantas indicadoras resulta la prueba más efectiva. En este caso se injerta el folíolo medio de una hoja perteneciente a la planta que se desea probar en plantas indicadoras en las cuales los patógenos van a dar síntomas claros. Algunos virus se van a manifestar después de 2 ó 3 semanas de realizado el injerto; en otros casos, la bibliografía menciona que los síntomas aparecen entre los 6 y 12 meses. Con frecuencia, no es posible identificar que virus es el que está presente, pero es posible determinar si la planta está infectada. En vid, parte de los virus son analizados mediante ELISA. Pero otros son probados por injerto a plantas indicadoras. Algunos de los virus pueden ser detectados en pocas semanas, pero para el stem pitting/grooving sindrome, por ejemplo, es necesario esperar entre 8 y 12 meses. 9 Algunas consideraciones respecto a los análisis de virus En general, cuando se habla de las plantas liberadas de virus se emplean términos como «plantas libres de virus» «planta sana» o «saneada» sin que se defina qué virus fueron eliminados ni qué pruebas se emplearon para comprobar su eliminación. El concepto de plantas libres de virus debería estar acotado al, o a los virus, analizados. En el caso de plantas que son afectadas por un conjunto de virus diferentes sería necesario realizar un análisis independiente para cada uno de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 311 ellos y señalar el o los virus de los cuales ha sido liberada o probada. Por otra parte debe definirse la técnica de análisis empleada. Como se mencionó previamente pueden emplearse diferentes métodos de diagnóstico con distintos grados de sensibilidad. Así, por ejemplo, si se cuenta con un DAS-ELISA calibrado para detectar hasta 10 ng/ml y un RT-PCR que puede detectar 10 pg/ml y se analiza una planta con 50 pg/ml; la técnica de DAS-ELISA no va a detectar el patógeno y el resultado será negativo, mientras que el RT-PCR arrojará un resultado positivo. Todas las técnicas tienen un límite de sensibilidad por debajo del cual no son capaces de detectar la presencia del patógeno. Por consiguiente, dependiendo de la sensibilidad de la técnica que se use, el porcentaje de plantas supuestamente «libres de virus» puede variar. Lo correcto sería entonces hablar de plantas negativas a un virus probado mediante una técnica determinada. Por ejemplo, «plantas negativas a Onion yellow dwarf virus mediante DAS-ELISA», lo que no significa que realmente está libre de virus sino que la técnica no lo detectó. Por esa razón se aconseja evaluar las plantas en más de una oportunidad y repetir los análisis cuando las plantas están a campo, para darle al patógeno, si está presente, la posibilidad de multiplicarse. 11 Lecturas Recomendadas 10 Agradecimientos QUACQUARELLI, A., GALLITELLI, D., SAVINO, V., and PIAZZOLLA, P. 1980. The use of electric current for obtaining mosaic-free almonds. Acta Phytopathologica Academiae Scientiarum Hungaricae, Vol, 15 (1-4):251-255. A los Ing. Agr. MSc Delia Docampo, Sergio Nome y al Dr. Luis Conci por la revisión del presente manuscrito; y a la Ing. Agr. Eva Cafrune por su colaboración en la búsqueda de información. 312 AYABE, M. and SUMI, S. 1998. Establishment of a novel tissue culture method, sem-disc culture, and is practical application to micropropagation of garlic (Allium sativum L.). Plant Cell Rep 17:773-779. AYABE, M. and SUMI, S. 2001. A novel and efficient tissue culture method-»stem-disc dome culture»-for producing virus-free garlic (Allium sativum L.). Plant Cell Rep 20:503507. ESAU, K. 1959. Anatomía Vegetal. Ed. Omega Barcelona. FRACCIOLI, G. and MARANI, F. 1998. Virus elimination by meristem tip culture and tip micrografting: 346-380 in: A. Hadidi, R.K. Khetarpal, and H. Koganezawa. Plant virus deasease control. The American Phythopathology Society. St. Paul, Minnesota, USA. HERNANDEZ, R. et al, 2001. «Electrotheraphy» Technique eliminates viral and bacterial infection from plant shoottip cultures. INIVIT Santo Domingo, Cuba. HU, C. Y. and WANG, P. J. 1983. Meristem shoot tip, and bud cultures (5):177-227 in: D. A. Evans, W.R. Sharp, P.V. Ammirato and Y. Yamada. Handbook of plant cell culture. Techniques for propagation and breeding. Vol 1 Collier Macmillan Publishers. London. KARTHA, K.K. 1981. Meristem culture and cryopreservation-methods and applications: 181-211 in: A. T. Thorpe. Plant tissue culture methods and applications in agriculture. Department of Biology, University of Calgary, Calgary, Alberta, Canada. KARTHA, K.K. 1984. Elimination of virus:577-585 in I.K. Vasil. Cell culture and somatic cell genetics of plants. Academic Press, Inc. CONCI, Vilma C.
