corporación autónoma regional del centro de antioquia corantioquia
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CORPORACIÓN AUTÓNOMA REGIONAL DEL CENTRO DE ANTIOQUIA CORANTIOQUIA AVANCES EN LA MICROPROPAGACION DE CINCO ESPECIES FORESTALES EN LA ESTACIÓN BIODIVERSIDAD DE PIEDRAS BLANCAS INFORME FINAL Medellín, Junio de 2006 AVANCES EN LA MICROPROPAGACION DE CINCO ESPECIES FORESTALES EN LA ESTACIÓN BIODIVERSIDAD DE PIEDRAS BLANCAS PROGRAMA PARA LA BIODIVERSIDAD Y EL DESAROLLO PROYECTO “MANEJO Y CONSERVACIÓN DE LA FLORA” Contrato 6571/2005 Presentado por OSCAR DARIO QUINTERO GARCÍA. Ingeniero Agrónomo Interventor Juan Lázaro Toro Murillo Ingeniero Forestal Corporación Autónoma Regional del Centro de Antioquia Medellín, Junio de 2006 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ TABLA DE CONTENIDO Pág. RESUMEN INTRODUCCION 1. PROPAGACION in vitro del Caunce (Godoya antioquensis Planch). 6 7 9 1.1 Antecedentes. 1.2 Material vegetal 9 10 1.3 Establecimiento in vitro 10 1.4 Multiplicación 10 1.5 Enraizamiento 12 2. Propagación in vitro de yarumo blanco (C. telenitida) y yarumo común (C. angustifolia). 13 2.1 Antecedentes 13 3. Propagación in vitro de palma de chontaduro (Bactris gasipaes H.B.K.). 15 3.1 Antecedentes 15 4. Inducción de brotes sobre cotiledones inmaduros de Cedro Negro (Juglans neotropica). 5. Seguimiento a las palmas de chontaduro en el suroeste Antioqueño. 5.1 Antecedentes 6. Propagación asexual de Caunce (Godoya antioquensis Planch) CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA ANEXO 17 20 20 23 25 28 31 3 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ LISTA DE FIFURAS Figura 1. Cápsulas inmaduras (a) y maduras (b) del Caunce Pág. 11 Figura 2. Secuencia de la dehiscencia en cápsulas de Caunce y Semillas 11 Figura 3. Respuesta de acodos al ácido indol butírico (AIB). Figura 4. Siembra de acodos en bolsas con tierra-arena (2:1) 24 24 4 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1. Micropropagación in vitro de G. antioquensis Diels. 12 Tabla 2. Micropropagación de C. telenitida y C. angustifolia. 14 Tabla 3. Micropropagación de palma chontaduro (B. gasipaes H.B.K.). 16 Tabla 4. Micropropagación de Cedro Negro (J. neotropica Diels) 18 Tabla 5. Evaluación de diferentes hormonas en brotes de J. neotropica 19 Tabla 6. Insectos plaga en palma de chontaduro. 21 Tabla 7. Recomendaciones realizadas para palma de chontaduro. 22 5 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ Resumen Con base en el trabajo realizado se demostró la utilidad de la técnica de cultivo de tejidos vegetales, para obtener material de forma clonal masiva vía organogénesis directa e indirecta, para las especies Bactris gasipaes, Cecropia telenitida, Cecropia angustifolia y Godoya antioquensis. Para la especie forestal cedro negro (Juglans neotropica Diels), se logró la estandarización preliminar del protocolo de micropropagación in vitro, a partir de frutos inmaduros, como una alternativa de propagación para esta especie vulnerable a la extinción. De otro lado, mostrar la importancia de transferir de condiciones in vitro a ex vitro (campo o medio ambiente), y hacer seguimiento al material vegetal de B. gasipaes, producido por vía embriogénesis somática, para observar el crecimiento, desarrollo, producción de flores, frutos, resistencia o susceptibilidad a plagas y enfermedades etc. Parámetros que determinan que no se afectaron las características de la especie, al ser producidas por técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro. Palabras claves: Propagación in vitro, micropropagación, especies forestales, Bactris gasipaes, Cecropia telenitida, Cecropia angustifolia, Godoya antioquensis, Juglans neotropica. 6 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ INTRODUCCIÓN Entre los avances y desarrollos de la ciencia, la biotecnología es posiblemente el de mayor importancia para el sector agrícola. De las técnicas mas utilizados en la biotecnología, específicamente en el área vegetal, es el cultivo de tejidos, el cual es un método de micropropagación in vitro, que ofrece un gran potencial como alternativa y complemento a los métodos tradicionales de propagación y mejoramiento genético de las plantas. La técnica de micropropagación in vitro, es un proceso que se realiza en laboratorio y consiste esencialmente, en aislar una porción de tejido (explante) de una planta (hoja, yema apical, raíz, embrión, cotiledón, meristemo, apropiadas etc.) de y luz, proporcionarle humedad, artificialmente temperatura las (condiciones condiciones físicas), y vitaminas, minerales, carbohidratos, hormonas (condiciones químicas), en ambiente completamente aséptico, para producir una gran cantidad de material vegetal idéntico al individuo de donde se extrajo tejido. En especies forestales la micropropagación in vitro, se muestra como una alternativa a los métodos de propagación convencional, para obtener material vegetal, sobre todo en especies, que están en peligro de extinción, que tienen problemas de germinación o que producen poca semilla. El objetivo general del presente trabajo de investigación, fue la utilización de la técnica de cultivo de tejidos in vitro para micropropagar material vegetal de las especies, yarumo blanco (Cecropia telenitida), yarumo común (Cecropia angustifolia), Caunce (Godoya antioquensis) y palma de chontaduro (Bactris gasipaes), especies con importancia ecológica y/o económica, presentes en la jurisdicción de CORANTIOQUIA, y cuyos 7 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ lineamientos se enmarcan dentro del proyecto Manejo y conservación de la flora. Los resultados promisorios de este trabajo se muestran especie por especie, cuyo manejo en laboratorio puede servir de modelo para extrapolar a otras especies de características similares. Además será de gran utilidad para proyectos dirigidos a la propagación y conservación de árboles nativos cuyas poblaciones naturales se encuentran amenazadas. 8 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ 1. PROPAGACION in vitro de CAUNCE (Godoya antioquensis Planch) 1.1 Antecedentes Especie endémica del departamento de Antioquia, se encuentra en las cordilleras Central y Occidental, entre 1600 – 2600 m.s.n.m , en el parque ARVI es una especie muy rara, crece en bosques secundarios, rastrojos altos y áreas abiertas. Su madera fue utilizada para leña y la fabricación de cabos de herramientas. En el área del parque ARVI se utilizó ampliamente como leña, por sus facilidades para arder, aun en estado verde, lo cual causó la casi desaparición de la especie en este territorio (Toro, 2000). A.G.S., (2004), al realizar una investigación en especies endémicas en la jurisdicción de CORANTIOQUIA, encontró información sobre la existencia en Ecuador y Perú de ejemplares de herbarios de G. antioquensis, colectados en los años 1979 y 1997 respectivamente, y a pesar de ello, en Colombia solo está reportada para el departamento de Antioquia; hasta el momento. Los municipios dentro de la jurisdicción de CORANTIOQUIA donde se encuentra la especie son: Medellín, Andes, Anorí, Caicedo, Caldas, Copacabana, Envigado, Pueblo Rico, Santa Rosa de Osos e Ituango. La micropropagación in vitro del caunce, se plantea como un complemento y alternativa potencialmente útil para la obtención de material vegetal, la cual puede enmarcarse dentro de la estrategia Nacional para la conservación de plantas, cuya misión se dirige a orientar las acciones de conocimiento, conservación y uso sostenible, adelantada por el instituto Alexander von Humboldt, la red Nacional de Jardines Botánicos, Ministerio de medio ambiente y la Asociación Colombiana de Herbarios desde el año 2001. 9 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ 1.2 Material vegetal Cápsulas indehiscentes o dehiscentes fueron recolectadas de árboles localizados en Cerro Asturias (Parque regional ARVI), la madurez de las cápsulas se caracteriza por el cambio de color de amarillo a café (fig. 1), las cápsulas se lavaron con agua corriente para retirar el polvo, antes de iniciar el proceso de desinfección. 1.3 Establecimiento in vitro En la cabina de flujo laminar, las cápsulas indehiscentes se desinfectaron sumergiendo en etanol al 70% durante 30 segundos y luego flameando, operación que se repitió dos veces. Luego con ayuda de un bisturí y pinzas se realizó un corte longitudinal en la cápsula para extraer las semillas y sembrarlas en medio de germinación WG (tabla 1). Para el caso de las cápsulas que ya estaban dehiscentes (fig. 2a y b), se sacaron las semillas con ayuda de un pinza, y se desinfectaron mediante dos lavados, el primero, con una solución de etanol al 70% durante 30 segundos, seguido del segundo lavado con solución de hipoclorito de sodio al 0.25% por 30 min. Luego se retiraron los residuos de ambas soluciones, realizando tres lavados consecutivos con agua destilada estéril, para sembrar también en el medio WG. 1.4 Multiplicación La germinación se inicio alrededor de los 30 días extendiéndose hasta los 70 días, pasado este tiempo las parte aérea (epicótilo), se cortó y se subcultivó en medio WC (tabla 1), que estimula la brotación de yemas preexistentes y su posterior elongación, luego cada tallo fue separado y llevado a condiciones de enraizamiento. 10 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ a b Figura 1. Cápsulas inmaduras (a) y maduras (b) del Caunce. a b c d e Figura 2. Secuencia de la dehiscencia en cápsulas de Caunce (a, b, c, d), y Semillas (e). 11 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ Tabla 1. Micropropagación de G. antioquensis Diels. PROCEDIMIENTO DETALLE Material Vegetal: semillas maduras Procedentes de Los frutos se recolectan al inicio de la madurez cuando se cápsulas dehiscentes e indehiscentes. tornan cafés, se secan al sol sobre papel periódico hasta FIGURA que liberen las semillas. Desinfección 1. Cápsulas indehiscentes: sumergir en etanol al 70% durante 30 seg y flamear (fig. a y b). 2. Cápsulas dehiscentes: lavar las semillas con NaOCl al 0.25%(v/v) durante 30 min, luego con etanol al 70% por 30 seg. Enjuagar tres veces. Establecimiento Colocar las semillas sobre medio WG, compuesto de sales WPM ( Lloyd y Mccown, 1981) o MS (Murashige & Skoog, 1962) a la mitad de la concentración original, sin reguladores de crecimiento. 1. Abrir la cápsula, haciendo un corte longitudinal para extraer las semillas y sembrar directamente en medio WG. 2. Pesar 0,2 gr de semillas y envolver con papel filtro, preparar 100 ml de solución de NaOCl al 0,25%(v/v), suplementado con 2 gotas de tween-20, agitar a 150 r.p.m durante 30 min. Composición WG Sales MS/2 o WPM/2, Sacarosa 3% (p/v), Tiamina 1 mg/L, Piridoxina 0,5 mg/L, Ac. Nicotínico 0,5 mg/L, Glicina 1 mg/L, Mio inositol 100 mg/L, Phytagel 0.2% (p/v). pH ajustado a 5.7 antes de ser esterilizado a 121ºC durante 20 minutos. Composición WC Multiplicación Sales MS, Sacarosa 3%(v/v), Adenina 2 mg/L, Tiamina 1 Separar el epicótilo (parte aérea), de las plántulas y mg/L, Piridoxina 0,5 mg/L, Ac. Nicotínico 0,5 mg/L, sembrarlo sobre el medio WC, colocar en condiciones Glicina 1 mg/L, Mio inositol 100 mg/L, Biotina 1 mg/L, de luz (8h) a temperatura 23±1°C Phytagel 0.2% (p/v). pH ajustado a 5.7 antes de ser esterilizado a 121ºC durante 20 minutos. ENRAIZAMIENTO Composición CR Sembrar los esquejes en medio CR, compuesto de sales Sales MS/2, AIB 0.5 mg/L, Sacarosa 15g/L, Tiamina 0.5 MS (Murashige & Skoog, 1962), a la mitad de la mg/L, Piridoxina 0.25 mg/L, Ac. Nicotínico 0.25 mg/L, concentración original (MS/2), suplementado con AIB, Glicina 0.5 mg/L, Mio inositol 50 mg/L, Phytagel 1.8 sacarosa y vitaminas. g/L, pH 5.7; Esterilizar a 121ºC por 22 min. 1.5 Enraizamiento Los tallos de aproximadamente de 1-2 cm de longitud, fueron sembrados en medio RC (tabla 1), durante ocho días en condiciones de oscuridad, posteriormente se pasaron a condiciones de luz (8h) y transcurridos otros 14 días se indujo los brotes radicales in vitro. Al cabo de 45 días las plántulas enraizadas, se pasaron a condiciones ex vitro, primero se retiro el agar y residuos de medio de cultivo con agua 12 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ corriente y sembradas en una mezcla de sustrato compuesto de tierra negra, tierra amarilla y arena (1:1:1), las plántulas se colocaron bajo condiciones de polisombra en el vivero. 2. PROPAGACION in vitro DE YARUMO BLANCO (Cecropia telenitida) y YARUMO COMÚN (Cecropia angustifolia). 2.1 Antecedentes Ambas especies forestales son de importancia ecológica, son muy utilizadas en la protección de microcuencas, en la recuperación de suelos y coberturas vegetales, los frutos son consumidos por las aves silvestres y murciélagos (Toro, 2000), aunque son propagadas normalmente por semilla sexual, presentan la dificultad de conseguir semilla viable por ser muy apetecidas por las aves, además su recolección es muy dispendiosa por tener que recolectar directamente los frutos de los árboles. La propagación clonal masiva por medio de cultivos in vitro, ha mostrado rápidas tasas de multiplicación y crecimiento en poco tiempo, frente a la propagación sexual (Quintero, 2004). El protocolo de multiplicación que se utilizo para la obtención del material vegetal de yarumo blanco y común se resume en la tabla 2. 13 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ Tabla 2. Micropropagación de C. telenitida y C. angustifolia. PROCEDIMIENTO DETALLE FIGURA Material Vegetal Los frutos maduros se dejan en remojo y luego se maceran Semillas sexuales para extraer las semillas y secar a la sombra. Desinfección Pesar 0,2 gr de semillas y envolver con papel filtro, preparar Sumergir las semillas en etanol al 70% durante 1 min. 100 ml de solución de NaOCl al 3%(v/v), suplementado Luego lavar con de hipoclorito de sodio al 3% con 2 gotas de tween-20, agitar a 150 r.p.m durante 30 min. durante 30 minutos, se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y sembrar. Establecimiento Composición del medio GY Sembrar las semillas en medio GY, en fase liquida y Sales Murashige & Skoog, 1962 (1/4) de concentración, en condiciones de luz (16h) y temperatura 23±1°C La 14,4 µM de ácido giberélico (GA3), 2,5% (p/v) de sacarosa. germinación en este medio inicia aproximadamente a El pH del medio fue ajustado a 5,8 antes de ser esterilizado los 30 días. a 121 ºC por 20 minutos. Multiplicación Composición medio MY Las semillas que van germinando se subcultivan en Sales medio MY, donde se forman masas organogénicas suplementado con 4,4 µM de BAP, 3% (p/v) sacarosa, que se subcultivan cada 30 días en el mismo medio. 0.24% (p/v) gelrite. El pH del medio fue ajustado a 5,8 Cada tres meses se obtienen tallos diferenciados los antes de ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos; las cuales son separados con ayuda de un bisturí y condiciones subcultivados en medio para enraizamiento. fotoperíodo de 16 horas de luz. Enraizamiento Composición medio R Subcultivar los esquejes en medio R, e incubar en Sales WPM a la mitad de la concentración, suplementado condiciones de oscuridad durante 72 horas, después con 4,9 µM de AIB, 1,5% (p/v) sacarosa, 0,24% (p/v) sacar a condiciones de luz (16h) y al cabo de 24 días gelrite. El pH del medio fue ajustado a 5,8 antes de ser están listas para ser transferidas a condiciones ex vitro esterilizado a 121ºC por 20 minutos WPM (Lloyd de & Mccown, crecimiento 1981) temperatura completo, 21 ±1°C, en bandejas de polipropileno. Aclimatación 1. Las plántulas con raíces bien formadas, se sacan de los 1. Siembra en bandejas de polipropileno con sustrato frascos y se lavan las raíces con agua corriente para retirar estéril, compuesto de compost mas arena (1:1), y los residuos de gel, para evitar contaminación. Permanecen cubiertas con tapas transparentes. dos meses bajo este sistema, el primer mes cubiertas y 2. siembra en bolsas negras de 1kg, para dejar en realizando riegos semanales con medio WPM diluido; el condiciones de vivero. segundo mes sin tapa y riegos con agua corriente. 2. Transplantar a bolsas con sustrato compuesto de tierra negra y arena (2:1). Mantener en condiciones de luz indirecta y riego nebulizado durante la primera semana. 14 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ 3. PROPAGACIÓN in vitro DE PALMA DE CHONTADURO (Bactris gasipaes H.B.K.). 3.1 Antecedentes La especie esta distribuida ampliamente en el Neotrópico, en Colombia se cuenta con pequeños bancos de germoplasma, pero no cuentan con suficiente caracterización que permita a los cultivadores disponer de material de calidad (Reyes et al., 2002). Actualmente el cultivo se ha visto limitado por los problemas de propagación por semilla sexual y por los sistemas de propagación vegetativa vía hijuelos (Mora y Solis, 1980). Las variedades más productivas son partenocárpicas (fruto sin semilla) y la propagación por hijuelos es bastante limitada, por su bajo porcentaje de prendimiento y problemas de anclaje (Blaak, 1980). Además los procesos de autoincompatibilidad genera una alta variabilidad (heterocigocidad) lo cual dificulta el establecimiento de plantaciones homogéneas, altamente productivas y de gran rendimiento (Mora, 1981). La mayor parte de las investigaciones realizadas sobre el cultivo in vitro en esta especie se han realizado en Costa Rica y Ecuador (Arias y Huete, 1983; Arias, 1985; Valverde y Arias, 1985; Valverde et al., 1987; Valverde et al., 1989; Stein y Stephens, 1991; Valverde et al., 1992), indicando que es factible la producción masiva optimizando los métodos desarrollados. La labor de micropropagación del material de chontaduro procedente del suroeste antioqueño (Colombia), se hizo de acuerdo a los protocolos establecidos por Garcés y Roldan, (1996) y Botero y Atehortúa, (1999), (Tabla 3). 15 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ Tabla 3. Micropropagación de palma chontaduro (B. gasipaes H.B.K.). PROCEDIMIENTO DETALLE Material vegetal: meristemas apicales, sometidos a Ápices caulinares, aislados de plantas de menos de un FIGURA doble esterilización con NaOCl al 2.3% (v/v) con año de edad. adición de 2 gotas de Tween-20 por cada 100 ml, durante 40 y 10 min en agitación constante. Siembra in vitro: reducir los ápices hasta un tamaño de Composición M50 0.2-0.5 cm de altura, sembrar los ápices en posición Sales vertical en medio M50 y mantener durante un mes en suplementado con 1.0 mg/L de biotina, 5.7µM de AIA, condiciones de oscuridad a 24 ±1°C. 9µM de 2-4 D, 8.3µM de piclorám, 5.4µM de ANA, Murashige & Skoog, (1962) completo, 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) de sacarosa y agua de coco 15% (v/v), El pH del medio fue ajustado a 5,7 antes de ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos Inducción de Embriones y multiplicación. Composición M7 Posteriormente subcultivar en medio M7, retirar el Murashige & Skoog, 1962) completo, suplementado con exceso de tejido foliar y cortar verticalmente, procurando 1.0 mg/L de biotina, 22.8µM de AIA, 9µM de 2-4 D, pasar por la mitad de la zona meristemática. Mantener en 5.4µM de ANA, 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) de condiciones de oscuridad a 24±1°C hasta que se formen sacarosa, y agua de coco 15% (v/v). El pH del medio los embriones. En este medio se mantienen entre 8-10 fue ajustado a 5,7 antes de ser esterilizado a 121ºC por 20 meses, con subcultivos mensuales. minutos. Bioconversión de los embriones en plántulas. Composición medio CH Los embriones formados son retirados del explante y MS (Murashige & Skoog, 1962) completo, suplementado subcultivados al medio CH los explantes se mantuvieron con Biotina 1.0 mg/L, 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) bajo condiciones de luz (16h) a 23 ±1°C durante un mes. de sacarosa. El pH del medio fue ajustado a 5,7 antes de Luego son transferidos a medio B otro mes y subcultivar ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos, al medio inicial CH hasta el desarrollo de las plántulas. Composición medio B MS (Murashige & Skoog, 1962) completo a mitad de concentración, suplementado con Biotina 1.0 mg/L, agua de coco 15% (v/v), 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) de sacarosa. El pH del medio fue ajustado a 5,7 antes de ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos Enraizamiento: esta fase se realiza con palmas que no Composición medio R desarrollan raíz durante la fase de bioconversión, las MS (Murashige & Skoog, 1962) diluido al 50% de su palmas se siembran en medio R en medio haciendo concentración, cambios de medio cada 30 días. La formación de raíces suplementado con 2,5µM de AIB, 1.5% (p/v) de en las palmas dura como mínimo 4 meses, al cabo de los sacarosa, 0.2 % (p/v) de fitagel a un pH de 5,7 y cuales se obtienen entre 2-5 raíces nuevas, que se mantenidos con un fotoperíodo de 12 horas a 23 ±1ºC. con sus respectivas vitaminas y caracterizan por su grosor y de color crema. 16 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ 4. Inducción de brotes sobre cotiledones inmaduros de cedro negro (Juglans neotropica Diels). 4.1 Antecedentes El Cedro Negro o Nogal (Juglans neotropica Diels), es una especie forestal, que presenta problemas de latencia en la semilla (López y Piedrahita, 1999; Gómez, 2001); además el Nogal es vulnerable de extinción (Calderón, 2001), por la extracción intensiva de su madera, utilizada en la fabricación de guitarras, muebles, puertas, ventanas, armarios entre otros (Ospina et al, 2003). Dando como resultado la desaparición progresiva de la especie dentro del ecosistema (Humboldt, 1998). Una solución alternativa y complementaria para la propagación y producción de las micropropagación especies in vitro, maderables, técnica, que es la permite aplicación rápidas de la tasas de multiplicación Castro et al. (1994); Carrizosa et al, (1994), hecho que se ha demostrado con éxito en otras especies del mismo genero como J. regia L., J. nigra L., J. cinerea L., valoradas por su importancia ecológica, maderable y nueces comestibles. (Driver y Kuniyuki, 1984; Tulecke y McGranahan, 1985; Leslie y McGranahan, 1992; Pijut, 1992; Chenevard et al. 1997; Saadat y Hennerty, 2002). En Colombia solo ha sido reportado el protocolo parcial, para la inducción de brotes in vitro, vía organogénesis directa para J. neotropica Diels; utilizando yemas apicales obtenidas a partir de plantas de invernadero de 1-4 meses de edad (Cruz y Cruz, 2003). El procedimiento que se resume a continuación describe los pasos preliminares de desinfección, establecimiento, multiplicación y enraizamiento para J. neotropica, utilizando cotiledones en estado inmaduro (tabla 4). 17 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ Tabla 4. Micropropagación de cedro negro (J. neotropica Diels). PROCEDIMIENTO DETALLE MATERIAL VEGETAL: Frutos inmaduros, los cuales Edad entre 20 y 28 semanas después de la polinización. FIGURA presentan formación de la testa (cubierta). DESINFECCION -Lavar las semillas con Hipoclorito de sodio (NaOCl) al Retirar la cáscara de los frutos, con ayuda de un cuchillo y lavar los restos de corteza con cepillo y agua corriente. 2.5%, durante 20 min. -Flamear con Etanol al 90%, tres veces, en cabina de flujo laminar. Explante Colocar las semillas desinfectadas sobre papel craft Extraer los cotiledones con la ayuda de pinzas y bisturí. estéril y envolverlas, para fracturar la semilla, con ayuda de un martillo y poder extraer los fragmentos de cotiledón. Medio de establecimiento Colocar los fragmentos de cotiledón sobre el medio de inducción de brotes (MI), en la oscuridad a 22ºC, durante 30 días, para obtener la inducción de los brotes. Composición del medio MI: Sales Murashige y Skoog (1962), suplementado con 2 mg/L de kinetina, 1 mg/L de BAP, 0.5 mg/L de TDZ, 250 mg/L de L-glutamina, sacarosa 30 g/L, phytagel 0.22%, pH 5.7 Desarrollo y crecimiento de brotes Los brotes que se obtienen son transferidos a medio de desarrollo (MD), libre de reguladores de crecimiento y condiciones de luz (12h) para inducir la elongación. Composición del medio MD: Sales Murashige y Skoog (1962), suplementado con 200 mg/L de caseína hidrolizada, sacarosa 30 g/L, phytagel 0.22%, pH 5.7 Hasta el momento los porcentajes de desarrollo son bajos (1%). Enraizamiento Se cortan los esquejes (1cm) y se siembran en medio de enraizamiento (MR1). Los explantes fueron sembrados en el medio y colocados en condiciones de oscuridad por 7 días a temperatura 21 ±1ºC para la inducción de raíces. Composición medio (MR1) Sales MS al 50% de su concentración, suplementado IBA 2,5 µM, sacarosa al 1,5% (p/v), caseína hidrolizada 100 mg/L, gelrite 0,22% (p/v). Transcurridos siete días, los esquejes se transfieren a otro Composición medio MR2 medio de cultivo (MR2), a una temperatura 21 ± 1ºC y sales MS al 50%, suplementado con 1.5% (p/v) de un fotoperíodo de 12h. Al cabo de seis días se observa la sacarosa, gelrite 0.22% (p/v) formación de un primordio radicular. 18 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ Cabe mencionar que durante el desarrollo del procedimiento para la multiplicación in vitro de cedro negro, se han obtenido otros resultados satisfactorios, y que solo se mencionan de forma cualitativa, por que los datos no se han analizado por métodos estadísticos; los resultados son los siguientes: Inducción de los brotes adventicios en tres diferentes medios de Cultivo MS (Murashige & Skoog, 1962), WPM (Lloyd y McCown, 1981), DKW (Driver y Kuniyuki, 1984) (Anexo 1); inducción de brotes con tres diferentes concentraciones (2.27, 1.4 y 0.5 µM de la hormona Thidiazuron (TDZ), no hay diferencias al sembrar los fragmentos de cotiledón para inducir los brotes, en el medio de cultivo por su cara interior (envés) o exterior (haz), los embriones que se obtienen al abrir los frutos inmaduros, tienen un 70% de germinación al sembrarse en medios de cultivo (MS, WPM y DKW) libres de hormonas y en condiciones de oscuridad durante 30 días. También se evaluaron diferentes combinaciones de hormonas (Tabla 5), para ayudar a la elongación de los brotes, pero sin ningún éxito. Los ensayos que se realizaron fueron los siguientes: Tabla 5. Evaluación de diferentes hormonas en brotes de J. neotropica. COMPONENTE DB1 DB2 DB3 DB4 DB5 MS(Murashige & Skoog) 100 100 100 100 100 BAP(mg/L) ANA (mg/L) AIA (mg/L) AIB (mg/L) GA3 (mg/L) L-Glutamina (mg/L) Caseina hidrolizada (mg/L) Tiamina (mg/L) Piridoxina (mg/L) Ac. Nicotínico (mg/L) Glicina (mg/L) Mio inositol (mg/L) Sacarosa (g/L) Phytagel (g/L) Gelrite (g/L) pH 0.1 0.15 ----1.0 0.5 0.5 1.0 100 30 2.2 -5.7 0.1 0.15 ---125 -1.0 0.5 0.5 1.0 100 30 2.2 -5.7 0.5 0.01 ----200 1.0 0.5 0.5 1.0 100 30 1.8 -5.7 0.5 0.01 ----200 1.0 0.5 0.5 1.0 100 30 1.8 -5.7 0.1 ---1.0 --1.0 0.5 0.5 1.0 100 30 -2.4 5.7 *DB: Medio para desarrollo de brotes. 19 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ 5. Seguimiento a las palmas de chontaduro en el suroeste Antioqueño. 5.1 Antecedentes Desde el año de 1999 se realizó un experimento para obtener palmas de chontaduro (Bactris gasipaes H.B.K.) en convenio con la Universidad de Antioquia, por cultivo in vitro mediante embriogénesis somática, el material vegetal obtenido, de la multiplicación in vitro se adapto en los viveros de Niquía, en convenio de CORANTIOQUIA-Secretaria de Agricultura. Se escogieron las palmas mas adaptas a las condiciones ambientales y se llevaron a la región del suroeste antioqueño (Hispania), donde fueron sembradas 43 palmas. A la fecha de las 43 palmas sembradas en el predio del Ingeniero Forestal Benicio Uribe Escobar, solo crecieron 33 palmas de chontaduro, aproximadamente de cinco años de edad, y una altura promedio de 7 m; todas se encuentran en fase reproductiva (formación de flores y frutos). Pero la perdida permanente de frutos inmaduros y las inflorescencias se observo, inicialmente desconociendo el agente (s) causal (es). Se recolectaron frutos del suelo para determinar la perdida, tanto de frutos y palmas. Al realizar la disección de los frutos se encontró perforaciones y ataques en forma de galerías, causadas por larvas de tipo curculionidae, características del orden coleóptera, así como el ataque de hongos saprofitos e insectos en fase adulta, que permitieron su posterior identificación (tabla 6). Las recomendaciones como la captura de insectos, control de insectos con biopreparados, plateo y fertilización recomendados durante el periodo 10 de Noviembre de 2005 hasta 20 de Mayo de 2006, se resumen en la tabla 7. 20 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ Tabla 6. Insectos plaga en palma de chontaduro. ESPECIE Picudo de la caña de azúcar (Metamasius hemipterus). CARACTERISTICA DAÑO Como su nombre lo dice también ataca caña de azúcar, plátano y banano por eso no es aconsejable tener cerca dichos cultivos. Su daño consiste en la elaboración de galerías en la base de los racimos de las flores, los cuales se debilitan y se secan. Su control se realiza con trampas construidas con tarros que contengan rodajas de piña o partes tiernas picadas de tallo de caña, banano y/o chontaduro como cebo, para su posterior captura, utilizando 10 tarros/hectárea. tomado de Peña et al, 2002 Barrenador del tallo Los daños son causados por las larvas que emergen de los huevos (Rhynchophorus palmarum) ovipositados por la hembra en los tejidos frescos resultante del deshije. Las larvas penetran en el tallo y como consecuencia el daño favorece el desarrollo de pudriciones que pueden destruir La planta. Su control es ante todo preventivo, es un insecto que es atraído por las heridas frescas o que comienzan a fermentarse por lo cual se deben proteger los cortes después del deshije con soluciones insecticidas o caldo bórdeles, tomado de Peña et al, 2002 actualmente el insecto se captura mediante la localización de trampas con feromona de agregación y trozos de material vegetal (rodajas de piña, caña, banano o chontaduro) como cebo. El Picudo negro Actualmente es la plaga de mayor importancia económica que afecta los (Palmelampius heinrichi) cultivos de chontaduro. El insecto en estado adulto perfora el botón floral femenino o el fruto para alimentarse u ovipositar. Los huevos colocados por la hembra, eclosionan y la larva barrena (perfora) los botones ó frutos provocando la caída. En inflorescencias recién abiertas el insecto puede atacar acentuándose el daño. Cuando el ataque del insecto ocurre en frutos desarrollados, estos pueden llegar a su maduración, pero afectando su calidad tanto externa como interna. Su control y manejo esta relacionado con el proceso de apertura de la espata floral y polinización de las flores recomendando el método del embolsado del racimo con bolsa plástica. Cucharón marceño Antes que la espata abra (estructura que protege la inflorescencia), se (Cyclocephala sp.) debe regar con extracto de ají-ajo (10 cc/L), para repeler a los adultos, los cuales son atraídos por el olor que expelen las flores durante la polinización,. Tumbando las flores y frutos pequeños. 21 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ Tabla 7. Recomendaciones realizadas para palma de chontaduro. LABOR DETALLE Embolsar las Practica que se debe realizar preferiblemente entre 0 y 24 horas después de la apertura, para inflorescencias y protegerlo del pequeño insecto, el picudo negro Palmelampius heinrichi: Curculionidae FIGURA racimos Deshoje Enterrar y aplicar cal agrícola a los tallos y hojas de las palmas que se cortan durante la limpia del cultivo, muy importante para evitar que los insectos plagas se sigan multiplicando y afectando el cultivo. Plateo Fertilización y Realizar como mínimo cuatro fertilizaciones al año, de la siguiente manera: la primera aplicación, agregar materia orgánica 3 Kg/planta, cal dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr), completar la fertilización con 5 gr de elementos menores (AGRIMINS), revolver bien con tierra y agregar alrededor de cada planta. La segunda aplicación, materia orgánica 3 Kg/planta, cal dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr). En la tercera aplicación, materia orgánica 3 Kg/plant), cal dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr). La cuarta aplicación, materia orgánica 3 Kg/planta, cal dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr), 5 gr de elementos menores (AGRIMINS). Trampeo Colocar trampas para la captura de M. hemipterus, R. palmarum, P. heinrichi ). Las trampas se pueden fabricar con tarros plásticos y residuos vegetales en proceso de fermentación (trozos de tallo de plátano, caña de azúcar, palma de chontaduro), posteriormente al capturar los insectos, se echan en un recipiente con solución jabonosa para matarlos. Las mismas trampas se pueden utilizar como cebos tóxicos, sumergir los trozos de material vegetal en melaza (150 cc + 850 cc de agua + 1cc de insecticida), y dejar remojando de un día para otro, luego colocar los trozos en el tarro. Las trampas con cebos atrayentes se deben cambiar cada 8 o15 días. Fumigar con Aplicar a la base de los racimos ANISAFER (Metarhizium anisoplae) y BASSAR (Beauveria bassiana) controladores como controladores biológicos en dosis de 4 g/L, dejando en remojo 12 horas antes. biológicos Aplicación de La materia orgánica se obtiene de desechos orgánicos como hojarasca, cáscaras, residuos de Materia orgánica cosechas, desechos de desyerbas, pulpa de café, estiércol de animales (bovinos, equinos, aves y cerdos) no se deben aplicar frescos, es mejor prepararlos por medio de técnicas de compostaje. Renovación Es importante que siempre se deje crecer un tallo productor de racimos y un hijuelo para que lo sustituyan (el hijuelo no debe sobre pasar los 1.5 mt de altura, de lo contrario se deben cortar y de dejar crecer otro de nuevo) cuando el principal esté muy alto o un ataque de plaga o enfermedad lo dañe como se viene presentando. 22 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ 6. Propagación asexual de Caunce (Godoya antioquensis Planch). Este ensayo se plantea como una alternativa para obtener material de mayor altura en menor tiempo, debido a que hasta el momento las tasas de multiplicación in vitro no superan a las tasas de crecimiento de plantas obtenidas por semillas. En el sitio conocido como Cerro Asturias (parque ARVI), se realizó un ensayo preliminar con la especie conocida como Caunce, el ensayo consistió en seleccionar 60 brotes básales (chupones), y proceder con ayuda de una navaja a efectuar un corte en forma de anillado, para realizar acodos aéreos y comparar el efecto de 5000ppm de ácido indolbutírico (AIB) con 0 ppm (control), para inducir raíces adventicias. De 60 acodos realizados 35 fueron con AIB y los 25 restantes sin hormona. Después de tres meses de seguimiento, se procedió a separarlos de las ramas y observar el efecto de la hormona AIB, en la producción de raíces adventicias. Encontrando un efecto positivo en los 35 acodos que se realizaron con AIB (5.000 ppm), al presentar abundante formación de raíces, en comparación con los acodos a los que no se les aplico la hormona, los cuales presentaban al momento de la evaluación formación de callo en la base del corte (fig. 3). Los acodos se sembraron en bolsas plásticas negras conteniendo tierra y arena en proporción (2:1), para continuar con el proceso de prendimiento de cada brote (chupón) y adaptación como plantas independientes (fig. 4). 23 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ a b c Figura 3. Respuesta de acodos al Ácido indol butírico (AIB). a. Formación de tejido calloso en acodos sin AIB. b. Inducción de raíces adventicias en presencia de AIB. c. Acodos con AIB, listo para transplantar. Figura 4. Siembra de acodos en bolsas con tierra-arena (2:1). 24 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ CONCLUSIONES -Aunque se logró el establecimiento y micropropagación clonal para G. antioquensis Planch, las tasas de multiplicación no son lo suficientemente rápidas para obtener gran cantidad de material, indicando que se deben evaluar nuevas combinaciones de hormonas, que aceleren las tasas de división celular. -La ventaja que mostró la propagación in vitro de G. antioquensis Planch, fue la de obtener material de mayor altura que el propagado por semillas. De otro lado la propagación por medio de acodos aéreos que se realizó en árboles de la misma especie, se observa como otro método alternativo con muy buenas perspectivas, al producirse material vegetal de muy buen tamaño y características deseadas. -Importante evaluar concentraciones mas bajas de ácido indol butírico (AIB), e inclusive comparar con otras hormonas enraizadoras, como el ácido indolacético (AIA) y ácido naftalenacético (ANA). -Hacer seguimiento a los acodos de G. antioquensis Planch, en condiciones de vivero y campo (parcelas demostrativas), es importante para observar si hay crecimientos plagiotrópicos, como se ha observado en otras especies forestales que son propagadas por este método. -Para las especies yarumo blanco y yarumo común, la ventaja de propagar por la técnica de cultivo in vitro, se justifica por las altas tasas de multiplicación y de producción masiva, ya que se obtienen grandes cantidades de plántulas listas para sembrar en condiciones de campo en un periodo de 8 meses, situación que no se observa al producir el material por semillas. 25 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ -Aunque hay reportes de la inducción de brotes in vitro en cedro (J. neotropica Diels, utilizando yemas apicales, no se ha logrado producir material a condiciones ex vitro (medio ambiente); de ahí la importancia de implementar un protocolo utilizando otro tipo de explante (cotiledones inmaduros), permitiendo en un futuro cercano la obtención de plántulas de cedro negro en épocas donde no hay producción de semilla sexual. -Hasta el momento se obtienen grandes cantidades de brotes sobre la superficie de los cotiledones de J. neotropica, pero se obtienen muy bajos porcentajes de desarrollo de los brotes en plántulas (1%), faltando dilucidar los factores químicos y físicos que permitan obtener grandes cantidades de plántulas, por medio de este protocolo. -La siembra y germinación de los embriones inmaduros de J. neotropica, de 16-24 semanas de edad, sobre los medios MS, DKW y WPM, ha mostrado resultados muy positivos, si se observa como una labor de rescate de embriones, y podría ser una práctica a utilizar, si en la especie se presenta perdidas de frutos durante la etapa de formación y maduración. -Los embriones se pueden evaluar bajo condiciones in vitro, para tratar de obtener material vegetal vía embriogénesis somática como se ha demostrado en otras especie como J. regia L., J. nigra L., J. cinerea L. -La producción de palmas de chontaduro, por el protocolo establecido por Botero y Atehortúa (1999), no ha permitido obtener material nuevo, iniciando desde el establecimiento de nuevos ápices, por las bajas tasas de bioconversión de embriones a plántulas, el número de ensayos ha sido grande pero sin éxito. -El proceso de adaptación al medio ambiente, de las palmas que se sacan del laboratorio, se ha visto afectado por las condiciones climáticas de la 26 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ zona donde se realiza dicha labor, haciendo muy dispendioso y lento el desarrollo y crecimiento de las palmas de B. gasipaes. -El material que se encuentra establecido en campo de B. gasipaes, ha presentado un crecimiento vegetativo y desarrollo normal; el inicio de la producción de flores y frutos tampoco se vio afectada. Las limitantes han sido la aparición de plagas relacionadas con el cultivo afectando la producción. -Las recomendaciones realizadas se han encaminado al no uso de agroquímicos hasta donde la situación lo permita, la fertilización con abono orgánico, suplementado con cal agrícola y elementos menores ha sido suficiente para mantener una emisión constante de inflorescencias y frutos, sin la manifestación de deficiencias minerales. -El uso de trampas dentro del cultivo ha permitido la capturar una gran cantidad de adultos de Palmelampius heinrich, para su posterior destrucción. Pero no se obtenido éxito para el control de Metamasius hemipterus y Rhynchophorus palmarum. -El corte y tumba de algunas palmas se debió, a que fueron perforadas en el tallo por Rhynchophorus palmarum, causando pudrición del mismo, de ahí la importancia de mantener un hijuelo como mínimo por planta (para la sustitución). -El uso de controladores biológicos (Beauveria bassiana y Metarhizium anisoplae), no ha tenido una aceptación total por parte del propietario, ya que estos microorganismos actúan lentamente en el control de insectos blanco (Metamasius hemipterus y Rhynchophorus palmarum, Palmelampius heinrich). 27 Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________ BIBLIOGRAFIA ANDEA GEOLOGICAL SERVICES Ltda (A G. S.). 2004. Estrategia para la conservación y propagación para las poblaciones de tres especies endémicas y en peligro extinción en la jurisdicción de CORANTIOQUIA. Medellín. 115 p. BLAAK, G. 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COMPUESTO MS (mg/L) WPM (mg/L) DKW (mg/L) Na2 EDTA 37,3 37,3 45.4 FeSO4.7H2O 27,8 27,8 33.8 NH4NO3 1650 400 1416 KNO3 1900 ---- Zn(NO3)2. 6H2O --- --- 17 H3BO3 6,2 6,2 4.8 KH2PO4 170 170 265 Ca(NO3).4H2O ---- 556 1968 CaCl2.2H2O 440 96 149 KI 0,83 ---- NaMoO4.2H2O 0,25 ---- 0.39 CoCl2.6H2O 0,025 ---- --- K2SO4 --- --- 1559 NiSO4. 6H2O --- --- 0.005 MgSO4.7H2O 370 370 740 MnSO4.4H2O 22,3 22,3 33.5 ZnSO4.7H2O 8,6 8,6 --- CuSO4.5H2O 0,025 0,025 0.25 Mio inositol 100 100 100 Tiamina 0,1-1 0,1-1 2 Ácido nicotínico 0,5 0,5 1 Piridoxina 0,5 0,5 --- Glicina 2,0 2,0 2 31
