Extensinas
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Seminario de Crecimiento 1. Equipo 8 Nabil Alberto Subhi‐Issa Marín Introducción Las plantas están expuestas a un gran número de organismos patógenos como insectos, hongos, bacterias y virus. A pesar de la inmovilidad y de carecer de un sistema inmune las plantas son capaces de defenderse por sí solas, utilizando una serie mecanismos naturales para ello, entre los que destacan por ejemplo la expresión diferencial de distintos genes de defensa. Estos genes están presentes de forma invariable en las plantas, independientemente de si son resistentes o susceptibles a patógenos. La resistencia inducida es una forma de defensa activa que involucra la expresión diferencial de genes y cambios metabólicos que ocurren como consecuencia de un proceso de reconocimiento específico entre la planta y el patógeno. El momento de la inducción decide por tanto las reacciones de la planta huésped. La transducción de señales hacia la activación de genes de defensa es principalmente realizada por regiones con repeticiones ricas en leucina (LRR) en los genes de resistencia. Las LRRs no tienen un efecto inhibitorio directo contra los patógenos. La LRR típica es un motivo de 24 aminoácidos enriquecidos en leucina. Los residuos de leucina se conservan en ciertas posiciones en la unidad de repetición. Estas repeticiones en los genes de resistencia les permiten reconocer productos de genes “aerovirulentos” (avr) del patógeno e inducir las respuestas correspondientes en las plantas. Las proteínas codificadas por los genes de resistencia contienen LRRs extracitoplasmáticas ( con el motivo de 24 aminoácidos) y LRR citoplasmáticas. Las LRR extracitoplásmicas juegan además un papel significativo en ciertas proteínas de defensa, como las proteínas inhibidoras de poligalaracturonidasas (PGIPs) y las extensinas, aunque estas no están involucradas directamente en el reconocimiento de patógenos y la activación de genes de resistencia. Las extensinas son glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGPs) localizadas en las paredes celulares de plantas superiores, que juegan un papel importante en defensa. Las proteínas contienen repeticiones pentapeptídicas de Ser‐Hyp, cadenas laterales (side chains) glicosiladas por galactosa y arabinosa, a menudo encontradas como dominios modulares en proteínas quiméricas, incluyendo proteínas con dominios LRR. La activación de los genes de las extensinas que provoca la insolubilización de proteínas, debido al estrés, a la presión mecánica, a la herida o a una infección patogénica, fortalece la pared celular y mejora el desarrollo de la planta, ya sea mediante la regulación de la expansión de la pared celular o por la unión de la pared celular y la membrana plasmática. Recientemente han sido descritas proteínas que contienen motivos de extensinas LRR asociados con varios dominios no relacionados con una amplia gama de funciones en la pared celular. En plantas, como en otros eucariotas, un diverso grupo de kinasas homólogas a receptores de superficie celular (RLKs) juegan un papel fundamental en procesos de transducción de la señal. Miembros de la familia RLK de la planta comparten dominios catalíticos altamente conservados conocidos por poseer sustratos específicos de serina/treonina; sin embargo, el dominio extracelular de estos receptores son bastante divergentes, lo cual permite a estas proteínas responder selectivamente a diversas señales extracelulares. La clase más grande de RLK de plantas está caracterizada por un motivo repetido rico en leucina (LRR), implicado en el reconocimiento del péptido ligando e implicado en la mediación de interacciones proteína‐proteína. En el estudio de PERK1 se definió una nueva clase de RLKs de planta con un dominio extracelular rico en prolina y compartiendo una secuencia similar a la familia extensinas de proteínas de pared celular. Irene Buendía García Ataque contra la pared celular. PGs de hongos y bacterias De todos los constituyentes de la pared celular (estructura que proporciona sostén y protección a la planta), el polisacárido pectina representa la mayor parte de la pared primaria de las dicotiledóneas y algunas monocotiledóneas. Para que los patógenos invadan las plantas es necesario que atraviesen esta barrera de pectina. Las pectinasas son las enzimas encargadas de tirar abajo esa barrera, son las primeras enzimas activadas por los hongos patógenos durante los primeros estadios de penetración en la planta huésped. Entre las pectinasas, la poligalacturonasa (PG) es una de las más importantes, especialmente las formas de escisión interna (endo‐cleaing forms). Fue estudiada principalmente en hongos, Aspergilus flavus, Botrytis cinérea y Alternaria citri, y, en bacteria, en Ralstonia solanacearum. Estas enzimas son exportadas desde el citoplasma del patógeno hasta el tejido de la planta huésped, sin embargo no siempre pueden cumplir su función ya que su camino puede verse obstaculizado al encontrar inhibidores o sustratos protegidos. Si no es el caso romperán los polímeros estructurales de la pared celular primaria y la lamela media, facilitando así la penetración y colonización de patógenos. Las plantas responden. PGIPs de la planta huésped En relación con esto en las membranas celulares de muchas plantas fueron detectados inhibidores de pectinasas, entre las cuales se prestó más atención a las Proteínas Inhibidoras de Poligalactuonasas o PIPGs. Este hecho es una evidencia de que las plantas han elaborado una respuesta adaptativa para hacer frente a las pectinasas producidas por los patógenos. Las endoPGIPs (Proteínas Inhibidoras de Poligalacturonasas, enzimas que escinden los enlaces internos del esqueleto principal de las pectinasson las más estudiadas. Tienen mayor afinidad por las endoPGs fúngicas que por las bacterianas o endógenas. Cumplen un conjunto de funciones, todas ellas con el mismo objetivo: retrasan el avance de las hifas de los hongos, reducen la desintegración del tejido huésped, y permiten la activación de respuestas de defensa en los tejidos sanos circundantes, no colonizados aún por patógenos. Se trata de moléculas solubles de naturaleza glicoproteica con una masa molecular de aproximadamente 40kDa unidas a la matriz extracelular de los tejidos del huésped mediante interacciones iónica. Están compuestas casi por completo por Regiones Repetitivas Ricas en Leucina (LRRs), coincidiendo con el dominio extracitoplasmico. La inhibición selectiva de las enzimas pectídicas por parte de PGIPs se corroboró en varios sistemas experimentales PGIPs. 1. El inhibidor proteico del guisante es capaz de inhibir tanto la endoPG como la polimetilgalacturonasa (PMG), producida por Aschota pisi, el patógeno que causa la marchitez de las hojas. 2. El inhibidor proteico aislado de las judías inhibía exclusivamente endoPG, y no exoPG. (La diferencia entre endo y exo se refiere al comienzo de la hidrólisis del poligalacturonato, exo desde el entremo no reductor, endo en cualquier punto interior de la cadena polimérica). 3. Las proteínas PV24 de las paredes del garbanzo eran más extensamente degradadas por exo PG y las formas PL (PL I y PL II) producidas por el patógeno de la marchitez, Fusarium oxysporum f.sp.cieri. 4. En peras sin madurar los inhibidores eran efectivos contra PGs producidos por Aspergillus niger y B. cinérea, pero no contra PGs producidas por Penicillum expansium. 5. Las PGs endógenas de plantas digieren la pectina de la pared celular de la fruta, mientras que las PGIPs solubilizadas (asociadas con los componentes de la pared celular durante los primeros estadios de madurez) alternan la eficacia inhibitoria de los PGIPs endógenos. Proteínas Similares a Extensinas Implicadas en Otros Procesos Se han descrito numerosos casos de proteínas con motivos similares a las extensinas LRR asociadas con dominios que no tienen relación con las funciones en la pared celular: TomL4: gen de extensinas LRR inducible por herida. Se aisló del tomate usando un plásmido de una extensina de zanahoria, pDC5. Presenta una homología del 56,6% con el dominio LRR. Análisis de Southern blot con sondas con dominios de extensina y LRR en diversas combinaciones hizo suponer que la proteína podría ser parte de una familia multigénica de extensinas en lugar de una familia multigénica LRR. Pex 1: gen no inducible por heridas. Se trata de otra extensina LRR. Consta de un péptido señal 11LRR coincidente con el dominio extracitoplásmico, y un dominio de extensina en el carboxilo terminal. >El dominio LRR es altamente homólogo al de Tom‐L4 (56,6 % de identidad). Sin embargo, tienen dominios de extensina distintos, con diferentes patrones de expresión en el tiempo y espacio, y responden ante ataques de distinto tipo. • • • Las extensinas LRR parece que tienen diferentes funciones. La intrigante similitud de los dominios LRR sugieren que están involucradas en el reconocimiento de los ligandos similares. Estudios realizados con “Southern blot” proporcionan evidencias para al menos dos genes estrechamente relacionados. Ya que las extensinas han sido implicadas en mecanismos de defensa de las plantas, la respuesta a una herida de Tom‐L 4 sugiere que la extensina debe ser una proteína relacionada. Cristina Iribarren Gomez Coadaptación Planta‐Patógeno Un ataque de un hongo patógeno a una planta provoca que PGIPs vegetales interaccionen con PGs fúngicas evitando una infección. Los dos tipos de proteínas, tanto las de ataque como las defensivas, poseen dominios ricos en leucina (LRR) descritos en animales, hongos y vegetales. A lo largo del tiempo, las diversas interacciones entre estas proteínas han provocado su coadaptación. Esto ha podido ser la causa de la especialización en la respuesta de defensa que es llevada a cabo por la planta afectada. Es decir, es algo parecido a una carrera de armamentos entre las secuencias nucleotídicas de PGIPs de plantas para mejorar su sistema de defensa. Por otro lado, los PGs de patógenos también han encontrado evolutivamente la manera de evitar esas especializadas barreras. Se sabe que los PGIPs de diferentes plantas muestran similitudes en secuencias de nucleótidos. Sin embargo, esta homología no está presente en su correspondiente secuencia de aminoácidos. Gracias a estas diferencias se pueden explicar la variabilidad funcional de estas proteínas en las plantas. Las secuencias aminoacídicas de PGIPs se caracterizan porque: ‐ ‐ ‐ Se dividen en grupos de 10.5 unidades repetidos en tándem Presentan motivos ricos en leucina (LRR) Las repeticiones provienen de modificaciones de péptidos de 24 aminoácidos similares a LRR (homólogos a proteínas kinasas) Un claro ejemplo que demuestra las diferencias de PGIPs en una misma planta y, en consecuencia, su distinto papel funcional, es caso de la judía. En la judía se conocen dos PGIPs distintas que presentan afinidades diferentes contra PGs de hongos. ‐ ‐ PGIP‐1 y PGIP‐2 son efectivas contra PGs de Aspergillus niger PGIP‐2 es capaz de actuar también contra F. moniliforme Estas diferencias se deben a un número pequeño de sustituciones aminoacídicas descritas entre los residuos 181‐ 244 de la hendidura de la endoPG de F. moniliforme. Esa región es la encargada de interaccionar con las PGIPs de la judía. Se sabe que con la simple modificación de uno de esos residuos de la hendidura, se origina una inadecuada interacción entre ambas proteínas y la acción de la PGIP falla. ‐ ‐ Al introducir un resto Prolina en la PG del hongo, se pierde el residuo Histidina en la posición 188 Æ la afinidad por la PGIP disminuye La adición de Triptófano en la secuencia de la PG fúngica después de la posición 270 Æ se inhibe la interacción PG – PGIP Con estos cambios, el hongo F. moniliforme lograría disminuir la eficacia defensiva de la planta o, incluso evadirla, disminuyendo el fitness (salud) de la planta. Se piensa que serían capaces de seleccionar sustituciones de aminoácidos para aumentar la especificidad de PGIPs o, por el contrario, para reducir la inhibición de una PG concreta. Normalmente, no se reconocen las adaptaciones de las proteínas de plantas a esas sustituciones en los hongos. Sin embargo, si la frecuencia de estos cambios es alta, se pueden identificar sitios concretos que están sometidos a sustituciones silenciadas y sustituciones no sinónimas. Este sería el caso de las PGIPs propias de pera, tomate y judía. Estas proteínas inhibitorias actúan en contra de F. moniliforme, B. cinerea y Aspergillus niger. En este caso se conocen los residuos individuales susceptibles a la acción de la selección natural que afecta a la función de las proteínas. Asimismo, se han realizado otros estudios sobre la evolución de PGIPs de plantas dicotiledóneas y PGs de hongos. En ellos se ven reflejadas sustituciones ventajosas. Se realizó un estudio de codones de 22 PGIPs de dicotiledóneas y 19 PGs fúngicos. Se llegaron a identificar hasta 9 residuos aminoacídicos de regiones β‐strand (pliegue)/β‐turn (giro) de PGIPs con residuos ricos en leucina, capaces de evolucionar adaptativamente en respuesta a la selección natural. En el caso de las judías, son dos sitios adicionales fuera de esta región β los que alteran la especificidad de PGIPs. Además, hay evidencias adicionales que destacan la importancia de la especificidad de estas proteínas inhibitorias en el control de la actividad de PG. Dicho control está basado en la existencia de diversas formas de PGIPs. Además, no hay que olvidar que las PGIPs son proteínas por lo que sus genes también pueden sufrir duplicaciones y recombinaciones en el genoma vegetal. Esto sería el origen de las múltiples PGIPs con secuencias ligeramente diferentes pero que se encuentran organizadas en agrupaciones. Se puede concluir entonces que la identificación de especificación de reconocimiento entre PGs de hongos y PGIPs de plantas permite comprender cómo contribuyen estas moléculas en la defensa de la planta. Estos enfoques que se han tratado podrían dar lugar a genes PGIPs adecuados y adaptados contra patógenos concretos a lo largo del tiempo. Otras proteínas Relacionadas con la Defensa en Plantas: PERK1 Sabemos que las plantas son capaces de reaccionar ante estímulos externos y de responder a ellos. Es decir, el estímulo es captado por un receptor que inicia una cascada de señalización interna que se traduce en una respuesta llevada a cabo por la célula vegetal. Una vez se ha captado el estímulo por un receptor, se puede iniciar una cascada de señalización en la cual las proteínas RLKs cumplen un papel importante. (Además de la síntesis de PGIPs y su importancia explicada anteriormente, existen otras moléculas implicadas en respuestas de defensa). Las proteínas RLKs: ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Son proteína kinasas homólogas a receptores de superficie celular Están implicadas en procesos de transducción de señales Presentan dominios catalíticos conservados Actúan sobre residuos de serina o treonina, sus sustratos Divergen en el dominio extracelular, lo que les permite reconocer diversidad de señales Entre los distintos tipos de RLKs, como ARK1, ARK2, ARK3 en Arabidopsis o SmPK1 en arroz; destaca una clase de RLKs de gran tamaño. Esta clase se caracteriza por presentar un motivo rico y repetitivo de leucina (LRR). Este dominio, como se ha comentado anteriormente, está implicado en el reconocimiento del péptido ligando y en la interacción entre proteínas. Además, recuerda al de las extensinas y al de las PGIPs (proteínas inhibidoras de poligalacturonidasas), lo cual permite corroborar que hay otras proteínas relacionadas con el sistema de defensa de plantas. No obstante, hay que destacar que no todas las LRR RLKs (kinasas homólogas a receptores de superficie celular con motivos ricos en leucina) presentan una función defensiva. Análisis de mutantes fenotípicos de Arabidopsis han mostrado diferentes funciones definidas genéticamente. Entre ellos, se encuentran: CLV1, un regulador del desarrollo meristemático y floral o ER, implicado en el control de la diferenciación de órganos. En el trabajo que se va a desarrollar a continuación, se caracteriza al Receptor kinasa‐1 homólogo de la extensina prolina (PERK1) a partir de cDNA aislado. Este cDNA codifica para un novedoso receptor con el mismo nombre, que se ha aislado y caracterizado en Brassica napus. En este estudio se comprobó que había similitud entre el dominio extracelular de PERK1 con las extensinas de proteínas de pared celular, relacionándolo con un posible papel defensivo de la planta. Esta implicación se investigó tratando tejido de B. napus con dos estímulos dañinos diferentes: estrés mecánico e infección con el hongo Sclerotinia sclerotium, patógeno causante de la podredumbre blanca (enfermedad que destruye los tejidos de la planta). Tratamiento de las Plantas y sus Correspondientes Estímulos Para observar la implicación de PERK1 en una función defensiva de la planta, se escogieron ejemplares jóvenes de Brassica napus de dos meses de edad y se les sometió, organizadas en dos grupos, a estímulos distintos. Seguidamente, las cultivaron durante tiempos diferentes y midieron la magnitud de la respuesta. Por un lado, la mitad de las plantas sufrieron una perforación foliar con discos de 1 cm de perímetro en la superficie de la hoja. Los científicos se aseguraron de no tocar la vena media de la lámina foliar. Tallos y raíces también fueron tratadas. En este caso, se hicieron rebanadas en segmentos tisulares de 1‐3 cm. Se aplicaron dos tratamientos de lesión con el objetivo de observar si había cambios en los niveles de PERK1 mRNA ante estos estímulos. Uno de los tratamientos consistió en frotar con manos enguantadas las hojas suavemente durante 2 min. El otro, en cambio, era un tratamiento abrasivo en el cual se frotaron los tejidos del tallo y el envés de la hoja con papel y una sustancia abrasiva. A continuación, los tejidos se colocaron en placas petri con papel de filtro humedecido con tampón fosfato y suplementado con cloranfenicol para prevenir posibles contaminaciones bacterianas; y se cultivaron durante tiempos distintos (0h, 5 minutos, 15 min, 30 min, 45 min, 1h, 2h y 4h). El tejido control y sin lesiones se correspondía con el tiempo 0h. El lote de plantas restantes se trataron con el hongo Sclerotinia sclerotiorum siguiendo el protocolo de extirpado de hoja de Kim et al. Dos horas después de la escisión de las hojas, se expandieron e inocularon con tampones de agar de hongos permitiendo que la respuesta de mRNA de PERK1 se recuperara. Este estímulo también contó con una muestra control. En ella, las hojas escindidas se inocularon con tampones de agar no colonizados por hongos. Las respuestas de estos estímulos se contabilizaron como RNA transcrito perteneciente al RNa mensajero de PERK1, supuesto receptor activado ante el estímulo. De este modo, el RNA total obtenido en los diferentes experimentos, se sometió a electroforesis en un gel de formaldehído 1.2% w/v. Después se realizó un blot de RNA de tejido múltiple con marcaje, que permitió la observación de los resultados con una autorradiografía electrónica instantánea de imágenes (Packard). Para evitar errores de hibridación, se corrigieron con clones ESt cyclophilin. Las cantidades relativas de RNA hibridado completamente con la prueba de cDNA de PERK1 se determinaron después por diferencias en las cantidades de RNA cyclophilin. Como cada RNA se cargó en un tiempo diferente, se emplearon fotografías del gel teñido con bromuro de etidio para distinguir las cantidades relativas de RNA que habían sido cargadas. Cristina Rodríguez Grande El Gen del Receptor Kinasa‐1 (PERK1), homólogo a Extensinas Ricas en Prolina es rápidamente inducido por lesión >Características La proteína receptor kinasa‐1 (PERK1), posee un dominio extracelular rico en prolina (dominio amino terminal hidrofílico), con secuencias similares a las extensinas, una región transmembrana, y un dominio catalítico poseedor de actividad kinasa en residuos serina/treonina. Los RLKs de las plantas se clasifican en varias clases en función de las características de sus dominios extracelulares, y usando este criterio, pERK1 representa una nueva clase de RLKs de las plantas. El dominio extracelular de PERK1 contiene hasta un 41% de residuos prolina. Se han estudiado las similitudes entre este dominio y glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, una familia de proteínas asociadas a la pared celular, en las que se encuentran, entre otras, las extensinas. Sin embargo, se encontraron motivos homólogos a las extensinas, como Ser(Pro)4, lo que sirvió de criterio para relacionar el dominio extracelular de este receptor a dichas proteínas. Todas las proteínas kinasas serina/treonina/tirosina muestran similitudes de secuencia aminoacídica en sus dominios catalíticos, concretamente existen 11 subdominios conservados. Todos los rasgos de esta organización están presentes en el dominio catalítico de PERK1, incluyendo los aminoácidos absolutamente conservados y los grupos de aminoácidos altamente conservados. En nuestro caso, las secuencias de PERK1 son coherentes con secuencias consenso frecuentes entre kinasas serina/treonina, lo que sugiere que PERK1 puede presentar mayor especificidad de sustrato serina/treonina que tirosina. Tras el análisis de la autofosforilación y los fosfoaminoácidos de la proteína recombinante PERK1, se demostró la actividad quinasa funcional de la misma. Además, se confirmó lo que se esperaba, la especificidad de dicha actividad para los aminoácidos serina y treonina, siendo este tipo de residuos los únicos que la quinasa puede fosforilar. Dada la similitud del dominio extracelular de PERK1 con las extensinas, se investigó un posible papel en la respuesta de la defensa de la planta. Varios estímulos hirientes provocaron una dramática y rápida acumulación de mRNA PERK1, los cuales también incrementaron en respuesta a la infección por el hongo patógeno S. sclerotiorum. Dadas las cinéticas de acumulación del mRNA PERK1 en respuesta a estos tratamientos, PERK1 puede estar involucrado de manera temprana en la percepción general y en la respuesta a un estímulo de lesión y/o patógeno (estrés mecánico). Es probable que la respuesta se dé por detección de cambios en la pared celular (a través del dominio extracelular, homólogo a las extensinas), y desencadenando una cascada de señalización en respuesta a una herida (a través de su dominio catalítico). >Localización A través de técnicas de laboratorio se detectó que la expresión del gen que codifica para PERK1 presenta sus niveles más altos en tallos y pétalos, siendo estos niveles significativamente menores en raíces, hojas y anteras. Empleando técnicas de fluorescencia, se comprobó que la fluorescencia emitida por nuestra proteína de estudio, se daba en la periferia de células epidérmicas de cebolla, lo que demostró en cuanto a su localización subcelular que, como se esperaba dada la existencia de un dominio transmembrana, pERK1 se encuentra en la membrana plasmática. >Filogenia Todos estos estudios se llevaron a cabo en la planta B. napus, perteneciente a la misma familia que Arabidopsis thaliana (crucíferas o Brassicaceae). Ambas comparten un alto grado de similitud dentro de sus genomas, de modo que se investigó en bases de datos la existencia de genes relacionados con pERK1 en el genoma de Arabidopsis. Se encontró un mayor grado de similitud de aa entre los dominios quinasa de estos genes y pERK1, y en definitiva, un alto grado de homología (tanto a nivel de nucleótidos como de aa) entre los genes. De los cuatro miembros PERK de Arabidopsis encontrados en el cromosoma III, tres (AtPERK1 ‐3) muestran un alto grado de afinidad y se agrupan con la secuencia PERK1 de B. napus. El cuarto miembro del cromosoma III, AtPERK6, tiene la misma ubicación general, pero muestra menos secuencias relacionadas y se agrupan en una posición diferente en el árbol de similitud de proteínas. Algunas de las relaciones entre los miembros de PERK podrían explicarse por un posible evento de duplicación ancestral. En el estudio de toda la posible filogenia de la familia de PERK, también se ha procurado asignar el cromosoma en el que aparece cada fragmento codificante de estas proteínas. Cambios en los niveles de mRNA de pERK1 en respuesta a esfuerzos mecánicos y la infección por un patógeno fúngico: Teniendo en cuenta la función propuesta de las extensinas en la cicatrización de heridas y la defensa de las plantas y la similitud de dominio extracelular de pERK1 con dichas extensinas, se han investigado los efectos de las heridas en la expresión génica de pERK1. Se hirieron tejidos foliares y tejidos del tallo y la raíz de B. napus, y se determinó la abundancia del mRNA de pERK1 en diferentes momentos por análisis de transferencia de ARN. En el tejido herido de la hoja, los niveles de mRNA de pERK1, que previamente se encontraban en estado estacionario, comenzaron a aumentar muy pronto (5 minutos después de la herida) y alcanzaron los niveles más altos a los 15 min (niveles 11,6 veces superiores a los basales). Los niveles de mRNA se mantuvieron bastante altos hasta 30 min después de la herida (en torno a unas 5 veces por encima de lo normal). Posteriormente, los niveles basales de mRNA de pERK1 fueron restablecidos 2 h después de la lesión. También se detectó que este rápido aumento en los niveles de mRNA de pERK1 fue una respuesta local, limitada al tejido herido. Cuando se hirió la primera hoja de cada planta, en la hoja adyacente (no herida), no se detectó ningún aumento de mRNA En el caso del tejido del tronco herido, de nuevo hubo un claro aumento en los niveles de mRNA de pERK1 5 min después de la herida. Sin embargo, los niveles máximos de mRNA se alcanzaron a los 30 min después de la lesión (aumento de 5,9). El aumento en los niveles de mRNA de pERK1 también se observó en tejido radicular, con un aumento de 2,3 veces en los niveles de mRNA a los 30 min después de la herida. Los niveles basales de mRNA de pERK1 se restablecieron en las raíces 1 h después del tratamiento. A continuación, se probaron otras dos tensiones mecánicas, frotando el envés de las hojas y tallos con papel de lija abrasivo, y suavemente las hojas. Se encontró que el tratamiento de papel de lija abrasivo causaba un rápido aumento en los niveles de mRNA de pERK1 de 4 veces en las hojas y de 3,2 veces en los tallos, 30 min después del tratamiento. Así mismo, el efecto suave sobre las hojas también tuvo consecuencias muy pronunciadas en los niveles de mRNA de pERK1. Un aumento de 4 veces se detectó en 5 minutos, con niveles máximos, correspondientes a un aumento de 14,6 veces, a los 30 minutos después de frotar. Estos resultados nos indican que la cinética de la acumulación de mRNA de pERK1es al mismo tiempo rápida y transitoria. Con el fin de abordar el papel potencial de pERK1 en la respuesta de defensa de la planta contra el ataque de patógenos, se realizó un experimento para determinar si los niveles de mRNA de pERK1 se acumulaban en respuesta a la invasión del hongo patógeno Sclerotinia sclerotiorum, responsable de la podredumbre por Sclerotinia del tallo en la enfermedad de la soja. Sin embargo, este hongo también es capaz de infectar a muchas otras plantas, incluyendo la familia Brassicaceae. Se realizaron dos bioensayos fúngicos independientes. En el primero, se observó un aumento de mRNA de pERK1 8,5 h después de la inoculación de hongos. Curiosamente, justo antes del aumento en los niveles de mRNA, se observó, aproximadamente una hora antes de los cambios en los niveles de mRNA, que las regiones de agar cubiertas por los hongos comenzaban a adherirse al tejido de la hoja, debido a las primeras etapas de la infección. Los primeros signos visibles de necrosis fueron observados en 13‐15 h después de la inoculación. Simultáneamente, se realizó un experimento control, en donde se inocularon las hojas en agar no colonizado por hongos. En este caso, no se observó ningún aumento en los niveles de mRNA de pERK1. En un experimento separado, la aplicación de dos compuestos relacionados con la defensa, jasmonato de metilo y ácido salicílico, tampoco tuvo ningún efecto significativo sobre los niveles en estado estacionario de mRNA de pERK1. Como conclusión, se entiende, en base a los resultados, que el aumento de los niveles de mRNA de pERK1en estado estacionario después de la infección por Sclerotinia, puede ser resultado directo del daño tisular de la pared celular causada por la penetración de los hongos. Bárbara Martínez Guerin Posibles funciones de PERK‐1 Teniendo en cuenta que: ‐ PERK‐1, codifica para una serina/treonina quinasa funcional intermembrana. ‐ La función propuesta de las extensinas en la cicatrización de las heridas y la defensa de las plantas y la similitud de dominio extracelular de PERK‐1 con ellas. Se han realizado algunos estudios para investigar los efectos de las heridas o las infecciones en la expresión génica de PERK‐1: >Heridas Se observa, como respuesta a las diferentes tensiones mecánicas aplicadas, aumentos dramáticos y rápidos en los niveles de mRNA de PERK1, siendo más pronunciado en las hojas que en otros lugares de la planta como la raíz o el tronco. Este rápido aumento en los niveles de mRNA de PERK‐1 en estado estacionario fue resultado de una respuesta local que se limitaba al tejido herido. Además, cuando se hirió una hoja de cada planta, y la hoja adyacente no herida se cosechó, no se detectó aumento en los niveles de ARNm de pERK1 en el tejido no herido. Todo esto nos hace pensar que puede estar implicado en la respuesta a una herida, aunque no sabemos a qué nivel. >Infección por patógenos Al igual que en el caso anterior, se vio una subida de los niveles de mRNA muy rápida y dramática, como se puede observar en el gráfico (los niveles empiezan a subir a las 4‐5h). Esto contrasta con la reacción de las proteínas extensinas convencionales en las que un aumento en los niveles de transcripción por lesión mecánica comienza hasta 12h después de haber sido producido el estímulo. Además, en un experimento por separado se aplicaron algunos de los compuestos relacionados con la defensa de la planta estudiada, B. napus, como el jasmonato de metilo y el ácido salicílico, y no tuvo ningún efecto significativo sobre los niveles del estado estacionario de ARNm de PERK‐1, con lo que el aumento de los niveles de este mRNA puede resultar directamente del daño en la pared celular causada por la penetración en ella de los hongos. Por otro lado, en un experimento con Sclerotinia sclerotiorum, se vio que algunas de las sustancias que producía éste hongo cuando se producía la infección eran poligalacturonasas, pectinasas, y el ácido oxálico. Se correlacionó la etapa de la infección con esta subida de mRNA de PERK‐1, con lo que podrían estar correlacionados ambos sucesos. Así, es posible pensar que PERK‐1 pueda tener un papel relacionado con la respuesta a la herida, y el aumento de los niveles de mRNA de PERK‐1 podría responder a un bucle de retroalimentación positivo. Sin embargo, la activación del dominio quinasa de pERK1 por el estrés mecánico aún debe ser demostrada. Si esta afirmación resulta ser falsa, y dado que se piensa que PERK1 sea un receptor de quinasa, éste será un perfecto candidato para alguna molécula de señalización que funcione en etapas previas a ciertas quinasas citosólicas. Activación de otros genes ante lesión Frente a una herida, las plantas reaccionan sintetizando un conjunto de proteínas que facilitan la cicatrización de la herida y proporcionan protección contra el exceso se herbivoría o la invasión patogénica. A parte de los genes ya explicados, como PERK1 y los genes que codifican para las PGIPs o las exensinas, hay otras vías por las que la planta puede defenderse, como son: ‐ Genes WR‐ wound responsive o genes de la herida sensible: Las plantas al ser estimuladas debidamente, comienzan a expresar estos genes, tanto en la zona de la herida en sí y en sus proximidades como en tejidos distantes a la misma no dañados en algunos casos. Las proteínas producidas por estos genes están involucradas en la síntesis de compuestos antimicrobianos, en la producción de inhibidores de proteinasa y enzimas líticas como quinasas o glucanasas, en el refuerzo de la pared celular mediante el depósito de calosa, lignina e glicoproteínas ricas en hidroxiprolina. ‐ Genes THC: Un subconjunto de estos genes activados por tensión mecánica (viento, tacto…) codifican proteínas de señalización, que dan lugar a calmodulina (proteína ligante de calcio) y algunas proteínas relacionadas. Llama la atención su cinética: muestran un aumento muy rápido en los niveles de mRNA tras darse un estímulo mediante una herida o al tacto que recuerda a lo comentado sobre PERK1. ‐ El gen de la calcineurina B: Es similar al sensor de calcio en Arabidopsis, AtCBL1, aumenta rápidamente en respuesta a heridas y otros tipos de estrés abióticos. Tiene una cinética parecida a PERK1. ‐ El gen SFR2 RLK: forma un producto miembro de la familia de receptores quinasa con dominio S de la familia de Brassica, se acumula en respuesta a heridas y de infecciones por patógenos bacterianos. ‐ Los genes WAK1 y WAK2: Forman parte de otro grupo de genes de receptor quinasa. Están asociados a la pared celular, y se ha demostrado recientemente que su expresión se regula mediante los estímulos producidos por el ambiente y que es inducido por heridas. ‐ Genes que codifican para componentes de la cascada de MAP quinasas como WIPK de tabaco y MMK4 de la alfalfa (MAP quinasas). Estos genes son regulados por una gran variedad de tensiones, acumulándose rápidamente después de producirse una herida o una estimulación biomecánica. ‐ El gen que codifica la SIPKK tabaco (MAP quinasa). Está regulado a nivel del ARNm después de la producción de la herida, y por la infección del virus del mosaico del tabaco. Se activan rápidamente después de la lesión. ‐ Los genes ATMPK3 (MAP quinasa) y ATMEKK1 (MAP quinasa quinasa quinasa) de Arabidopsis: Están regulados a nivel del ARN por las heridas, el tacto y otros tipos de estrés abióticos. ‐ WIG: Recientemente descubierto, es un nuevo gen GSK‐3 quinasa. Tiene una cinética parecida a PERK1. Los niveles de este gen aumentan rápidamente tras una herida. En general, las quinasas aumentan rápidamente y de forma transitoria pocos minutos después de la tensión mecánica. Varios genes de señalización (los que forman la cascada de MAP quinasa, WIG…) mostraron un rápido aumento en los niveles de ARNm después de un estímulo, ya fuera una herida o al tacto, de la misma forma que se ha observado para pERK1. De esta forma, al igual que se ha implicado a las quinasas comentadas en las primeras etapas de la respuesta a una herida, parece razonable sumar a PERK1 a esta lista, pero aún no hay datos suficientes para afirmarlo con seguridad.
