CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD DE

CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD DE SACAROSA
( Objetivo: obtención de cloroplastos)
TEORÍA
1. INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis es el proceso por el cual las plantas convierten la energía luminosa en
energía química. La siguiente ecuación:
6 CO2 + 12 H2O
C6 H12 O6 + 6 O2 + 6 H2O
resume el proceso, pero da pocos detalles sobre su complejidad. Hay realmente 2 grupos
de reacciones, las denominadas de la “fase luminosa” y las de la denominada “fase
oscura”. Los productos de las reacciones de la "fase luminosa" son el oxígeno
molecular, los transportadores de electrones reducidos (NADPH) y el ATP. El ATP y
los transportadores reducidos se usan en las reacciones de la “fase oscura” para
convertir el dióxido de carbono en carbohidratos. La reacción de Hill es una fase
importante de las reacciones de la "fase luminosa" en la que los electrones son
transportados del agua a un aceptor de electrones en presencia de luz y cloroplastos. El
objetivo de esta práctica es seguir la velocidad de la reacción de Hill usando
cloroplastos aislados. Estudiaremos además el efecto de un inhibidor.
1.1. REACCIONES LUMINOSAS DE LA FOTOSINTESIS
Todos los componentes que participan en las reacciones de la “fase luminosa” se
localizan en las membranas de los tilacoides de los cloroplastos, mientras que los
enzimas de la “fase oscura” se localizan en el estroma.
Figura 1. Esquema de los cloroplastos.
Figura 2. Esquema de la fase luminosa de la fotosíntesis. Fotofosforilación no cíclica.
La figura 2 representa el flujo de electrones en las reacciones luminosas, mientras la
altura de los distintos compuestos indica los niveles energéticos relativos de los
electrones en cada punto de la ruta. En el centro de las distintas series de reacciones hay
dos fotosistemas denominados Fotosistema II (PS II) y Fotosistema I (PS I). Cada
fotosistema es un conjunto formado por clorofilas a y b, carotenoides, citocromos y
otros transportadores de electrones. Cada fotosistema también contiene una molécula de
clorofila a especial que absorbe a un máximo de 680 nm en el PS II y a 700 nm en el PS
I nm. Estas moléculas especiales de clorofila se denominan P680 y P700
respectivamente. Los electrones excitados en P680 del PS II son transferidos a la
plastoquinona y los de la P700 se transfieren a la ferredoxina.
Los dos fotosistemas están unidos por una cadena transportadora de electrones. A
medida que los citocromos y otros transportadores de electrones de esta cadena se
reducen y oxidan sucesivamente, parte de la energía se acopla a la síntesis de ATP. Los
electrones liberados por P700 (en PS I) pasan a través de otra cadena transportadora de
electrones hasta el NADP+. Existe además una tercera transferencia de electrones,
concretamente del agua a la forma oxidada del P680 en el PS II. En un proceso
denominado fotolisis, el agua se hidroliza: se descompone en protones, oxígeno y
electrones. Estos electrones pasan mediante una corta cadena de transporte de electrones
a la P680.
El flujo de electrones del agua al NADP+ se denomina ruta no cíclica (o esquema Z)
puesto que los electrones empiezan en un compuesto (agua) y terminan en otro
(NADP+). La síntesis de ATP a través de esta ruta se denomina fotofosforilación nocíclica. Los productos de la ruta no cíclica de las reacciones luminosas son el oxígeno
molecular, transportadores de electrones reducidos (NADPH + H+) y ATP. El ATP
también se produce cuando los electrones siguen una ruta cíclica, como se indica en la
figura 3. Esta ruta implica el PS I y transportadores de electrones de la ruta principal de
transporte de electrones. La síntesis de ATP a través de esta vía se denomina
fotofosforilación cíclica.
Esquema de la fotofosforilación
cíclica
Para estudiar estas reacciones se purifican los cloroplastos en un gradiente de densidad:
Al girar los tubos se produce una fuerza que se conoce como fuerza centrífuga relativa
RCF que se mide en x g (veces la fuerza de la gravedad). Los rotores de las centrífugas
giran y esa velocidad se mide en RPM (revoluciones por minuto). Influye también en la
fuerza el radio de giro: r. Para medir los g que se producen se utiliza la siguiente
fórmula:
De esta forma podemos conocer la fuerza que se produce durante el proceso,
lógicamente la centrifugación depende también del tiempo.
1.- Homogeneización
Materiales y reactivos
-
Vaso de precipitados de 250 ml
-
Balanza
-
Gradilla
-
Tampón Tris-NaCl pH= 7,5: Tris (hydroximetil)aminometano 0,02
M, NaCl 0,35 M ajustar el pH a 7,5 con HCl 6 N. Almacenar a 4ºC.
-
Batidora
-
Embudo
-
Gasa
Procedimiento práctico:
Se pesan 25 gramos de hojas de espinacas en el vaso de precipitados, se añaden 100ml
del Tampón Tris-HCl y se introduce la mezcla en la batidora. Se homogeneiza durante 3
min. Se filtra en una doble capa de gasa. Se aprieta bien para obtener la máxima
cantidad.
2.- Centrifugación
Materiales y reactivos:
-
Centrífuga refrigerada
-
Gradilla
-
Tubos de centrífuga
Procedimiento práctico:
1. -Formación del gradiente:
A un tubo de centrífuga de 50 ml se le añaden las siguientes cantidades de sacarosa:
-
5ml de sacarosa en agua al 60% (peso/volumen)
-
5ml de sacarosa en agua al 50% (peso/volumen)
-
5ml de sacarosa en agua al 40% (peso/volumen)
-
5ml de sacarosa en agua al 30% (peso/volumen)
-
5ml de sacarosa en agua al 20% (peso/volumen)
Para que el gradiente salga bien hay que tomar las siguientes precauciones:
-
Las disoluciones deben de estar frías (nevera).
-
Cada capa debe depositarse muy lentamente sobre la anterior, para evitar que se
mezclen las disoluciones.
-
Con cada disolución se utiliza una pipeta Pasteur diferente.
-
Sobre la última capa se deposita la muestra biológica que consiste en un ml de
un homogenado de células de espinaca, preparado previamente.
CENTRIFUGACIÓN
•
Los tubos se equilibran de dos en dos.
•
Se colocan los tubos equilibrados uno en frente del otro en el rotor.
•
El rotor debe de estar previamente enfriado y se coloca en la centrífuga.
CONDICIONES DE CENTRIFUGACIÓN
•
El rotor que se va a utilizares el A8.24 que estará enfriado a 4Cº.
•
La temperatura se ajusta a 4Cº.
•
La velocidad se ajusta a 18.300 rpm.
•
El tiempo se ajusta a 20 minutos.
•
Cuando se para el rotor se sacan los tubos y se extraen la fracciones con pipetas
Pasteur.
•
En este caso nos interesa la fracción verde que son los cloroplastos.
Densidad de los cloroplastos:
Calculo de la densidad de los cloroplastos:
Se pesan 10 veces 100μl de agua destilada, este peso será la densidad 1,000.
Se pesan 10 veces fracciones de 100 μl de los cloroplastos y el peso obtenido deberá ser
dividido por el peso del agua destilada, para obtener la densidad a la que sedimentan
los cloroplastos.
Cálculos numéricos:
Calcula la fuerza en g que se producen en la parte superior del tubo de centrífuga (r=
5´72cm).
Calcula la fuerza en g que se producen en la parte media del tubo de centrífuga (r=
8´26cm).
Calcula la fuerza en g que se producen en la parte inferior del tubo (r= 10,80cm).
Ejercicio: Haz un esquema de la práctica.
Para saber más:
Fraccionamiento subcelular
Introducción al fraccionamiento subcelular
Técnicas de rotura de células y tejidos
Centrifugación
Centrífugas
Centrifugación diferencial
Velocidad de sedimentación
Equilibro de sedimentación : centrifugación en gradiente de densidad
Algunos recursos de utilidad en centrifugación
Protocolos de aislamiento de organelas de Protocol-Online