“Aspectos ecológicos de microalgas con potenciales biotecnológicos”

Universidad Central de Venezuela
Facultad de Ciencias
Instituto de Zoología y Ecología Tropical
Postgrado en Ecología
Tesis Doctoral
“Aspectos ecológicos de microalgas
con potenciales biotecnológicos”
Presentada por
Lic. Rubén Torres
CI V-11.405.173
Tutores
Dra. Evelyn Zoppi de Roa
Dr. Diego Rodríguez
Caracas – 2012
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Las algas son vegetales que crecen en agua, tanto dulce como salada. En el
océano constituyen el principal componente del plancton marino. Tuvieron
mucho que ver con el origen de la vida en el ámbito marino; fueron los
primeros organismos en realizar la fotosíntesis clorofílica. Van desde los
microscópicos organismos unicelulares (como las espirulinas) hasta las
gigantescas kelp (el ser vivo más largo del planeta).
Fuente: Almacén Natural
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CONTENIDO
Índice de figuras ........................................................................................................... 7
Índice de tablas........................................................................................................... 10
Resumen .................................................................................................................... 12
1. Introducción ............................................................................................................ 14
1.1 Una breve reseña histórica ............................................................................ 14
1.2 Evolución y ecología de las microalgas ......................................................... 14
1.3 Aspectos biogeográficos ............................................................................... 17
1.4 Importancia biotecnológica de las microalgas ............................................... 18
2. Antecedentes en Venezuela ................................................................................... 22
3. Justificación ............................................................................................................ 23
4. Hipótesis ................................................................................................................. 24
5. Objetivos ................................................................................................................. 25
6. Metodología ............................................................................................................ 26
6.1 Ecología de poblaciones de especies cultivadas ........................................... 26
6.2 Ecología de comunidades fitoplanctónicas .................................................... 39
7. Resultados .............................................................................................................. 57
7.1 Cultivos ......................................................................................................... 57
7.2 Ensayos con poblaciones cultivadas de Arthrospira platensis ....................... 65
7.3 Comunidades fitoplanctónicas ....................................................................... 86
8. Discusión .............................................................................................................. 116
8.1 Cultivos ....................................................................................................... 116
8.2 Ensayos con poblaciones de Arthrospira platensis ...................................... 117
8.3 Comunidades fitoplanctónicas ..................................................................... 123
9. Conclusiones ........................................................................................................ 127
10. Bibliografía .......................................................................................................... 128
11. Enlaces ............................................................................................................... 135
Apéndice 1 ................................................................................................................ 137
Apéndice 2 ................................................................................................................ 142
Apéndice 3 ................................................................................................................ 147
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Índice de figuras
Figura 1. Esquema ilustrado donde se muestra el escalamiento de microalgas de
medio líquido a medio sólido con el empleo de la técnica del asa de estaño. ............. 29
Figura 2. Esquema donde se muestra el escalamiento de poblaciones de microalgas a
fiolas de diferentes volúmenes hasta alcanzar los cultivadores a gran escala. ........... 30
Figura 3. Imágenes donde se muestran las diferentes etapas de escalamiento del
cultivo en medio líquido en el sistema integrado LOA-Ficotrón: (a) cultivos a escala
pequeña en condiciones controladas (Cámara de Crecimiento, LOA - IZET); (b), (c) y
(d) cultivos a cielo abierto en el Ficotrón, IDEA, en botellones de 5 L, tanques
circulares de 500 L y cultivadores tipo carrusel de 2000 L, respectivamente. ............. 31
Figura 4. Esquema para la preparación de cada medio (tratamiento) del diseño
factorial fraccionado 26-1.............................................................................................. 33
Figura 5. Esquema de la disposición espacial de los tanques cilíndricos en el Ficotrón
para la ejecución del diseño de bloques completos aleatorizados. ............................. 34
Figura 6. Ubicación de los sitios de muestreo (el mapa se encuentra en www.guiageoameri cas.com/mapas/venezuela.htm). ....................................................................... 39
Figura 7. (a) Mapa de Venezuela donde se destaca a la península de Paria en un
recuadro, (b) ubicación del área de estudio y (c) vista panorámica del humedal
“Palmares III” desde una carretera que lo bordea al norte, la vegetación herbácea
cubre la totalidad de su superficie y forma bandas monoespecíficas, evidenciadas por
las tonalidades distintas del color verde, que cubren toda su superficie sin formar
espejos de agua (tomado de Torres y Zoppi de Roa 2010)......................................... 41
Figura 8. Pluviodiagrama con precipitaciones medias de 47 años (1953-2000) del sur
de la península de Paria (datos tomados de la Dirección de Meteorología del MARN
2000). ......................................................................................................................... 42
Figura 9. Vista satelital del área de estudio (humedal herbáceo de El Clavo). La línea
blanca dibujada en el centro de la imagen señala el transecto levantado en la salida de
campo (fuente: http://earth.google.com/). .................................................................... 43
Figura 10. Tomas fotográficas parciales de las dos zonas de vegetación emergente
estudiadas: (a) vista de la amplia zona central de Hymenachne amplexicaulis, en
primer plano la zona de Heliconia marginata que bordea todo el litoral sur; (b) zona de
H. marginata (fotos: Carlos Lugo). .............................................................................. 44
Figura 11. Ubicación geográfica del área de estudio al sur de Monagas (Orinoco bajo),
con detalle de la localización en el mapa y fotografía panorámica de Macapaima, uno
de los cuerpos de agua visitados (foto: Rubén Torres). .............................................. 46
Figura 12. Imagen correspondiente a un sector de la orilla de la fosa El Caracol,
(Municipio Aragua, Edo. Anzoátegui, 2009), donde se pueden apreciar los desechos
petroleros que conforma parte del fondo de la misma (Foto: Olaf Ilzins). .................... 47
Figura 13. Ubicación de la laguna de Boca Chica (círculo azul) en la península de
Macanao,
isla
de
Margarita,
estado
Nueva
Esparta
(mapa:
http://www.disfrutevenezuela.com/Municipio-Peninsula-de-Macanao-Mapa.html)....... 48
Figura 14. Marcha analítica simplificada para la determinación de nitrógeno en
muestras de agua con el método Kjeldahl (1883) (continúa en la página siguiente). .. 52
Figura 15. Marcha analítica simplificada para la determinación del fósforo por el
método colorimétrico de Murphy – Riley (1962). Las dos imágenes inferiores fueron
tomadas de una presentación digital del curso de Ecología de Humedales, Postgrado
en Ecología, IZET, 2009. ............................................................................................ 53
7
Figura 16. Algunas imágenes tomadas bajo microscopio invertido de las poblaciones
de las diferentes cepas de Arthrospira spp. en la Cámara de Crecimiento (LOA-IZET).
................................................................................................................................... 59
Figura 17. Algunos cultivos de microalgas de interés biotecnológico presentes en la
Cámara de Crecimiento (LOA, IZET). ......................................................................... 62
Figura 18. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en (a) fiolas y (b)
cilindros. La densidad poblacional está expresada en términos de absorbancia a 680
nm. ............................................................................................................................. 66
Figura 19. Producción de biomasa seca en fiolas y cilindros de 2 L para cada medio
mineral. La biomasa está expresada en gramos por dos litros. ................................... 67
Figura 20. Valores comparativos de pH mostrados por los diferentes medios de cultivo.
En la figura se señala con un óvalo rojo el lapso de disminución de pH del medio – – y
la contaminación del mismo por la cianobacteria Microcystis aeruginosa. .................. 67
Figura 21. Valores comparativos de conductividad (S/cm) mostrados por los diferentes
medios de cultivo. ....................................................................................................... 68
Figura 22. Curva de calibración A 680 vs. Peso seco (mg). Las variables tienen una
relación lineal (R2 = 0,9935). ....................................................................................... 68
Figura 23. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de
cultivo. En la fase de crecimiento rápido A 680 y el tiempo presentaron correlaciones
lineales fuertes, como se evidencia en los valores del coeficiente de determinación
(R2). ............................................................................................................................ 70
Figura 24. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de
cultivo (filamentos por litro) en la Cámara de Crecimiento. ......................................... 70
Figura 25. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis obtenidas en un
ensayo factorial fraccionado 2 6-1 con combinaciones aleatorias de niveles mínimos y
centrales de cinco macronutrientes (tratamientos). La densidad poblacional fue medida
indirectamente con la absorbancia a una longitud de onda de 680 nm, correspondiente
al rojo dentro del espectro visible, pico de absorción de la clorofila a. ........................ 72
Figura 26. Diagrama de columnas mostrando en orden creciente los tiempos de
duplicación (tg) de los diferentes tratamientos del ensayo multifactorial. ..................... 79
Figura 27. Biomasa seca (g/L) cosechada en los diferentes tratamientos del ensayo
factorial 26-1. Los valores se ordenan en forma creciente. ........................................... 81
Figura 28. Diagramas circulares que muestran las variaciones porcentuales en grupos
de filamentos de diferentes tallas en una población de Arthrospira platensis, a lo largo
de un periodo de incubación que duró 30 días. La cepa se cultivó en el medio
optimizado en el ensayo factorial fraccionado 2 6-1 (tratamiento 36). ............................ 82
Figura 29. Dinámicas de crecimiento poblacional de los tres componentes de tallas de
filamentos de Arthrospira platensis: (a) filamentos con 2 células, (b) filamentos con
cuatro células y (c) filamentos con más de cuatro células. La letra “Y” en la ordenada
es la densidad (filamentos/L) y en la abscisa el tiempo está dividido en intervalos de
tres días. Salida: PAST. .............................................................................................. 83
Figura 30. Dinámicas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis a partir de
tres extracciones de volúmenes en fase de saturación. De izquierda a derecha se
muestran las curvas de crecimiento a partir de 25%, 50% y 75% de extracción. ........ 84
Figura 31. Absorbancias medias (λ = 680 nm) de los cultivos en fase de crecimiento
rápido, para tres profundidades, izquierda a derecha: 15 cm (barras azules), 25 cm
(barras rojas) y 35 cm (barras amarillas). .................................................................... 85
8
Figura 32. Biomasa seca total (g/L) en los tres bloques. ............................................. 85
Figura 33. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para las
variables (especies) y casos (parches de vegetación) escogidas para caracterizar el
ecosistema del humedal Palmares III en noviembre de 2008. Los dos primeros
componentes principales acumularon 89,965% de la inercia total del sistema. Salida:
MVSP 3.0. .................................................................................................................. 91
Figura 34. Dendrograma del Análisis de Agrupamiento o “Cluster Analysis” derivado
del conjunto de especies fitoplanctónicas y zooplanctónicas más importantes
colectadas en el ACP. Salida: MVSP 3.0. ................................................................... 92
Figura 35. Algunas especies de microalgas representantes del fitoplancton del
humedal de El Clavo, Barlovento, Edo. Miranda: (a) Lyngbya lutea (Cyanobacteria),
400x; (b) Pinnularia sp. (Bacillariophyta), 400x; (c) Asterococcus limneticus
(Chlorophyta), (d) Micrasterias sol (Chlorophyta), 250x; (e) Closterium ehrenbergii
(Chlorophyta); 250x; (f) Spirogyra ternata (Chlorophyta), 250x. Fotos: Rubén Torres,
cámara digital PAX-CAM acoplada a microscopio invertido y a computador (programa
PAX-IT!). ..................................................................................................................... 98
Figura 36. Variaciones temporales de (a) conductividad eléctrica y (b) oxígeno disuelto
a medida que la lámina de agua disminuyó en el parche de Heliconia marginata (enero
– febrero 2009). .......................................................................................................... 99
Figura 37. Concentraciones de nitrógeno (N) en las muestras de agua colectadas en la
zona de Heliconia marginata en la primera salida de campo al humedal de El Clavo
(05/01/2009). ............................................................................................................ 100
Figura 38. Curva de calibración para la obtención de fósforo total en agua de las
muestras tomadas en la zona de Heliconia marginata en la primera salida de campo al
humedal de El Clavo (05/01/2009). ........................................................................... 101
Figura 39. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para los
ambientes lagunares del Orinoco bajo, sur de Monagas. Los dos primeros
componentes principales retuvieron 95,4% de la inercia total del sistema
multidimensional original. Salida: MVSP 3.0. ............................................................ 107
Figura 40. Imágenes que muestran la composición de especies fitoplanctónicas de una
charca fangosa, específicamente proveniente del borde exterior de un área de pozos
petroleros en el norte del Edo. Bolívar, 2009. ........................................................... 109
Figura 41. Composiciones porcentuales de las divisiones de organismos procariotas y
eucariotas integrantes de la comunidad del fitoplancton en las regiones estudiadas en
el país a lo largo del estudio. .................................................................................... 115
9
Índice de tablas
Tabla 1. Especies de microalgas con potencialidades para generación de
biocombustibles. Contenido de aceites en base seca (tomada de Albarracín 2007). .. 20
Tabla 2. Composición química del medio Spirulina (Schlösser 1994). ........................ 26
Tabla 3. Diseño factorial 2 2 para ensayos de laboratorio. El experimento se simplificó
a cuatro medios de cultivo sin replicación. .................................................................. 31
Tabla 4. Resumen del diseño factorial fraccionado 26-1 (salida del programa Design
Expert)*....................................................................................................................... 32
Tabla 5. Medios de cultivos preparados en laboratorio para crecimiento de poblaciones
de microalgas y modalidades de preparación y recipientes. ....................................... 57
Tabla 6. Concentraciones milimolares (mM) de los macronutrientes totales
(representados como elementos, a excepción del carbono que se representa en las
formas de los aniones carbonato y bicarbonato) y relaciones milimolares sodio/potasio
en los cuatro medios minerales comparados en el diseño factorial 22. En rojo se
destacan las concentraciones milimolares de Na + y K+, y en azul las de Cl-, anión
directamente involucrado con el Na +. .......................................................................... 65
Tabla 7. Concentraciones milimolares totales de los macronutrientes que integran cada
uno de los medios de cultivo preparados. En rojo se destaca la relación 4:1 de K y Na
en el medio 1. ............................................................................................................. 69
Tabla 8. Tasa de crecimiento per cápita de Arthrospira platensis en la fase de
crecimiento rápido, biomasa seca producida en cada medio de cultivo y pH inicial y
final. ............................................................................................................................ 71
Tabla 9. Tasas de crecimiento per cápita y capacidades de carga en cultivos de
Arthrospira platensis para el ensayo factorial fraccionado 2 6-1. En rojo se destacan los
medios con valores mayores para uno o ambos parámetros poblacionales obtenidos
de forma experimental. ............................................................................................... 77
Tabla 10. Análisis de varianza para el diseño factorial fraccionado 2 6-1 (salida del
programa Design Expert). Los números destacados en rojo son valores de p<0,05. .. 80
Tabla 11. Resumen del Análisis de Varianza (salida de MICROSOFT EXCEL). ......... 86
Tabla 12. Composición de especies y abundancia (células/litro) de los taxa
fitoplanctónicos presentes en las zonas de vegetación en noviembre de 2008. Bm
(Brachiaria mutica), EcBmSe (ecotono B. mutica - Sesbania exasperata), Se (S.
exasperata), EcSeCa (ecotono S. exasperata - Cyperus articulatus), Ca (C.
articulatus), EcCaTd (ecotono C. articulatus-Typha dominguensis), Td (T.
dominguensis) y EcTdSe (ecotono T. dominguensis - S. exasperata)......................... 87
Tabla 13. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación
monoespecífica y ecotonos (noviembre 2008). Salida: PAST. .................................... 89
Tabla 14. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal
Palmares III, noviembre de 2008, definidas a partir a las abundancias de las especies
fitoplanctónicas. Los valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican
similitudes altas y en azul se señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud.
Salida: PAST. ............................................................................................................. 90
Tabla 15. Variables fisicoquímicas y concentraciones de cationes y aniones del agua,
determinados en las zonas de vegetaciones monoespecíficas estudiadas en el
humedal de Palmares en noviembre de 2008. ............................................................ 92
10
Tabla 16. Composición de especies y abundancias (células/litro) de los taxa
fitoplanctónicos presentes en las zonas de vegetación para agosto de 2009. EcBm1Ca
y EcCaBm2 (ecotonos B. mutica - C. articulatus); EcBm2Td (ecotono B. mutica - T.
dominguensis). ........................................................................................................... 93
Tabla 17. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación
monoespecífica y ecotonos (agosto 2009). Salida: PAST. .......................................... 94
Tabla 18. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal
Palmares III, agosto de 2009, definidas a partir a las abundancias de las especies
fitoplanctónicas. Los valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican
similitudes altas y en azul se señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud.
Salida: PAST. ............................................................................................................. 94
Tabla 19. Variables ambientales medidas en agosto de 2009..................................... 95
Tabla 20. Grupos (Taxa) fitoplanctónicos identificados en los diferentes ambientes de
vegetación en El Clavo, Barlovento, Edo. Miranda (enero de 2009). .......................... 95
Tabla 21. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica del humedal de El Clavo (enero 2009). Salida: PAST.......................... 97
Tabla 22. Índice de similitud de Jaccard para las tres zonas estudiadas en el Clavo,
Edo. Miranda (enero de 2009). El análisis se hizo en PAST. ...................................... 97
Tabla 23. Valores medios  desviaciones estándares de las variables fisicoquímicas
tomadas en la zona de Heliconia marginata del humedal herbáceo de El Clavo, Edo.
Miranda en enero - febrero de 2009. ........................................................................... 99
Tabla 24. Lista de especies y abundancia (cel./L) del fitoplancton en aguas libres de
las lagunas estudiadas en el bajo Orinoco, sur de Monagas. .................................... 102
Tabla 25. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica de lagunas de inundación del bajo Orinoco (sur de Edo. Monagas), para
enero de 2010. Salida: PAST. ................................................................................... 105
Tabla 26. Índice de similitud de Jaccard para las lagunas estudiadas en el bajo
Orinoco, sur del Edo. Monagas (enero de 2010). En rojo se resaltan los valores más
altos. Salida: PAST. .................................................................................................. 106
Tabla 27. Composición y abundancia (células por litro) de la comunidad fitoplanctónica
de tres ambientes de los módulos inundables de Mantecal (noviembre 2010). ......... 107
Tabla 28. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica entres ambientes de los módulos inundables de Mantecal (Edo. Apure),
en noviembre de 2010. Salida: PAST. ...................................................................... 108
Tabla 29. Índice de similitud de Jaccard para comparación de los tres ambientes
estudiados en Mantecal (Edo. Apure). Salida: PAST. ............................................... 109
11
Resumen
Las poblaciones naturales suelen estar bajo presión ambiental constante, y sus
tamaños poblacionales están limitados por la disponibilidad de recursos. En el caso de
la ecuación logística, el parámetro que define la magnitud de la población en equilibrio
es la capacidad de carga (K), mientras que la dinámica de retorno al mismo, luego de
una perturbación, depende de la tasa de crecimiento per cápita (r). Las comunidades
están caracterizadas por atributos estructurales como diversidad y relaciones
interespecíficas. Las cianobacterias son los organismos fotosintéticos más antiguos
del planeta; se encuentran a mitad de camino entre las bacterias y las algas
eucariotas, pues su organización es procariótica pero su aparato fotosintético es
similar al de las algas. Arthrospira y Spirulina son dos géneros de cianobacterias
filamentosas que han colonizado diversos ambientes y algunas especies son
extremófilas y de distribución muy restringida. Estas especies son propias de
ambientes alcalinos (lagos de soda) y han experimentado pocas presiones
ambientales, entre ellas competencia y depredación escasas. Poseen un gran valor
alimenticio para animales y humanos, como lo demuestran numerosas
investigaciones. Del mismo modo, existen microalgas eucariotas que poseen gran
potencial para la biotecnología alimentaria y petrolera (bioenergética), esta última con
la finalidad de generar combustibles alternativos (biocombustibles), con valores
ecológicos y económicos para generar energía eléctrica y tracción para vehículos.
Esta investigación se enfocó en el estudio de las dinámicas poblacionales de A.
platensis (especie en revisión) y muestreos de comunidades fitoplanctónicas con
interés en especies autóctonas de gran valor biotecnológico. Se diseñaron
experimentos para optimizar medios de cultivos para A. platensis a escala pequeña en
sistemas controlados (Cámara de Crecimiento) y escalas mayores en sistemas no
controlados (Ficotrón). Se obtuvieron medios de cultivo idóneos para el crecimiento de
A. platensis en condiciones controladas (medio 1 = medio Parra (2005)) y naturales
(tratamiento 36: medio central), con miras a su aprovechamiento biotecnológico a gran
escala. La dinámica de crecimiento poblacional de A. platensis evidencia
densodependencia logística, con una estructura de tallas que varía a medida que la
población crece desde etapas tempranas hasta la capacidad de carga. Se encontraron
representantes de varios géneros y especies de cianobacterias (Arthrospira spp.,
Spirulina subsalsa, Lyngbya spp., Oscillatoria spp. y Anabaena spp.) y microalgas
eucarióticas (Scenedesmus spp., Isochrysis galbana, Chlorella sp., Chaetoceros sp.,
Navicula platalea, Dunaliella salina y D. viridis) de gran interés biotecnológico en
diferentes lugares de la geografía variada del país, lo que conduce a la idea de que
Venezuela cuenta con un gran potencial en su diversidad para la biotecnología de
microalgas.
12
13
1. Introducción
1.1 Una breve reseña histórica
Las referencias más antiguas del consumo de microalgas por el hombre datan del
Antiguo Testamento, puesto que el maná que permitió la supervivencia del pueblo de
Israel es un liquen del desierto (simbiosis de hongo y alga) (García-Blairsy 2008).
Spolaore y col. (2006) mencionan que el primer uso de las microalgas por los seres
humanos se remonta a 2000 años atrás en China; para entonces, los chinos utilizaban
Nostoc sp. para sobrevivir durante la hambruna. No obstante, no se conoce con
precisión cuándo el humano empezó a emplear las microalgas (Sánchez y col. 2003).
El uso corriente de estos recursos tiene tres precedentes: tradición, desarrollo
científico y tecnológico, y la denominada “tendencia verde” (Henrikson 1994). En la
América de la conquista europea, Bernal Díaz del Castillo, miembro de las tropas de
Hernán Cortés, reportó en 1521 que una pasta azulada (la hoy conocida Arthrospira
maxima) era cosechada del lago Texcoco, secada y vendida para consumo humano
en un mercado de Tenochtitlán (hoy Ciudad de México). Los aztecas dieron a este
alimento el nombre de tecuitlalt, el cual en su lengua literalmente significa
“excrementos de las piedras” e indiscutiblemente formó parte de su cultura alimentaria,
social, económica y política (Ciferri 1983, Sánchez y col. 2003).
Se sabe entonces que el empleo alimentario de microalgas por la humanidad no es
reciente. Hoy día, algunas culturas de la zona del lago Chad en África subsahariana,
como la etnia kanembu, conservan las mismas prácticas de cosecha artesanal de A.
platensis (identificación en revisión) legadas desde tiempo inmemorial. Esta
cianobacteria filamentosa constituye la base de la dieta diaria de esa tribu, la que
extraen del lago y secan al sol para preparar una galleta denominada dihé; este hábito
alimentario peculiar le ha brindado a los kanembu mejor estado de salud que tribus
vecinas que no consumen el dihé (Ciferri 1983). Cuando los científicos descubrieron la
rapidez con la que las poblaciones de estos microorganismos crecen, con un
rendimiento 20 veces mayor que la soja o soya (Glycine max) por unidad de superficie,
los describieron como el alimento del futuro (Henrikson 1994).
1.2 Evolución y ecología de las microalgas
Dentro del vasto grupo de seres vivos considerados bajo la denominación de
microalgas, éstas incluyen en su definición más amplia a las cianobacterias
(anteriormente cianofitas o cianofíceas y conocidas comúnmente como algas verdeazules). Estos seres constituyen el grupo de organismos fotosintéticos más antiguos
14
del planeta y se puede decir que se encuentran a mitad de camino entre las bacterias
y las algas, porque su organización es procariótica pero su aparato fotosintético es
similar al de las algas (Prosperi 2000).
La Tierra tiene una edad aproximada de 4.600.000.000 de años y se ha podido
comprobar que 1.000.000.000 de años después de su formación ya había actividad
orgánica en la corteza terrestre. Los sedimentos no metamorfoseados más antiguos
de hace 3.500.000.000 de años muestran las primeras bacterias y los estromatolitos,
las más antiguas comunidades coloniales de las que se tenga conocimiento,
constituidas principalmente por algas verdes-azules filamentosas semejantes a las
Oscillatoriales (Orden al que pertenecen los géneros Oscillatoria, Lyngbya, Spirulina y
Arthrospira, entre otros), colonias que se asentaron en las costas de los mares
primitivos. Hoy sólo quedan estromatolitos vivos en la costa sur de Australia, las
Bahamas y algunas otras costas e islas remotas y prístinas (Woese 1987).
Hace unos 2.000.000.000 de años las cianobacterias produjeron suficiente oxígeno
para modificar sustancialmente la atmósfera terrestre. Muchos anaerobios obligados
(aquellos que no viven en presencia de oxígeno) fueron dañados por el oxígeno y
algunos desarrollaron modos de neutralizarlo, o se restringieron a vivir en áreas donde
este gas no penetra. Por selección natural algunos organismos aerobios se adaptaron
a vivir desarrollando una vía respiratoria que utilizaba el oxígeno para extraer más
energía de los alimentos y transformarla en ATP, prosperaron y radiaron en múltiples
formas de vida. La respiración aerobia se incorpora así al proceso anaerobio ya
existente de la glucólisis (Woese 1987, Mercado 1999).
Las cianobacterias y las microalgas eucarióticas al ser productoras que utilizan la luz
solar como fuente de energía contienen clorofila y otros pigmentos accesorios que les
otorgan una gran eficiencia fotosintética. Por el proceso de fotosíntesis que regula el
contenido de oxígeno y dióxido de carbono en la atmósfera, las microalgas contribuyen
notablemente a aliviar el efecto invernadero y se constituyen en protagonistas de la
producción inicial de materia viva en ecosistemas acuáticos (Mercado 1999).
La ecología de microalgas está determinada por un sinnúmero de factores ambientales
bióticos y abióticos que regulan sus poblaciones y determinan la amplitud de su
dispersión y la capacidad de invadir nuevos hábitats. Posiblemente el factor más
importante en la determinación de la abundancia del fitoplancton, comunidad acuática
errante constituida por microalgas, sea la disponibilidad de nutrientes. Las poblaciones
fitoplanctónicas aumentan sus números aceleradamente en la época de crecimiento
15
(surgencias, afloramientos, estación de mezcla en la zona limnética de los lagos, etc.),
por lo que ciertos nutrientes pueden hacerse limitados (Paulson 2005).
Otro factor primario a tomar en cuenta, principalmente en lo que respecta a la
distribución espacial del fitoplancton, es la luz, fenómeno físico que restringe a las
poblaciones de microalgas a parches en la zona iluminada (eufótica) de los cuerpos de
agua, único lugar donde pueden hacer la fotosíntesis. Si bien, las diferentes especies
de microalgas pueden entablar competencias intra e interespecíficas fuertes por la luz,
las comunidades fitoplanctónicas mantienen una riqueza elevada con tamaños
poblacionales moderados, fenómeno que ha sido denominado por Hutchinson (1961)
la paradoja del plancton.
De lo anterior se desprende la idea de que las poblaciones naturales suelen estar
siempre bajo presión ambiental constante, y sus tamaños poblacionales están
limitados por la disponibilidad de recursos. Aun cuando matemáticamente el
crecimiento poblacional es exponencial a densidades bajas, progresivamente se hace
densodependiente a medida que el tiempo avanza y la densidad crece. El modelo
logístico, el modelo densodependiente más conocido, explica el crecimiento de las
poblaciones durante lapsos más prolongados. Gráficamente se observa un periodo
inicial de latencia y adecuación (crecimiento lento), seguido de un incremento
exponencial (crecimiento rápido) para luego culminar en un plateau donde se alcanza
la capacidad de carga del ambiente, K (May 1976).
Las microalgas pueden ser organismos con un gran impacto negativo en la ecología
de los ambientes húmedos del planeta. Muchas especies de cianobacterias son
problemáticas en lagos y embalses usados para abastecimiento de agua para
consumo humano, donde crecen muy bien y frecuentemente producen florecimientos o
“blooms”, fenómenos en los que muchas especies se pueden acumular en las
espumas superficiales con densidades poblacionales sumamente altas. Estos
afloramientos son inducidos por enriquecimientos con macronutrientes como el fósforo
y el nitrógeno, principalmente derivados de actividades antrópicas (aguas ricas en
fertilizantes provenientes de zonas agropecuarias, vertidos industriales, aguas
domésticas, etc.); están acompañados de la producción de malos olores y sabores en
el agua, así como de neuro y hepatotoxinas mortales para animales domésticos y
seres humanos que la consumen (Carmichael 1994). En el mar ocurren las
denominadas mareas rojas, compuestas principalmente por dinoflagelados altamente
tóxicos, que producen una mortandad masiva de peces; también se dan las mareas
blancas o “blooms” en época de surgencia, congregaciones constituidas por diatomeas
16
que originan el efecto opuesto a las mareas rojas, pues desencadenan una gran
producción secundaria del zooplancton y de los siguientes peldaños de la cadena
alimentaria marina. Estas zonas de surgencia son de gran importancia en la economía
pesquera de muchas naciones del mundo.
1.3 Aspectos biogeográficos
En el contexto evolutivo y ecológico, Spirulina y Arthrospira son dos de los géneros de
cianobacterias más interesantes de este grupo antiguo, debido a la historia natural y
evolución singulares de algunas de sus especies en ambientes extremos y sumamente
restringidos, muchos de ellos agrestes e inhóspitos para casi cualquier otra forma de
vida, donde han tenido muy poca competencia y depredación. No obstante el carácter
extremófilo de ciertas especies de Spirulina y Arthrospira, estos géneros son ubicuos,
pues se encuentran representantes en ambientes marinos costeros, estuarinos,
humedales dulceacuícolas, lagos, etc., lo que también sugiere una idea del éxito
colonizador de estas cianobacterias filamentosas (Ciferri 1983).
Las microalgas extremófilas, como Arthrospira platensis, han evolucionado en sitios
que eran vastos en el precámbrico, y de los que ahora sólo quedan unos pocos sitios
aislados como relictos de esos mares antiguos por procesos continuos de evaporación
y desertificación. Estos procesos hoy día aún prosiguen y se intensifican con el
proceso de calentamiento global, como es el caso del lago Chad (África
Subsahariana), cuya superficie ha retrocedido en forma notable en el curso de menos
de un siglo. Dicho lago constituye uno de los últimos hábitats naturales de
microorganismos antiguos como A. platensis (Ciferri 1983).
De acuerdo al concepto de especie morfológica, la mayoría de las especies de algas
de agua dulce son cosmopolitas. Esto implica que las especies poseen mecanismos
muy eficientes para la dispersión o sus caracteres morfológicos han permanecido
“estáticos” en un tiempo evolutivo amplio. No obstante, hoy día muchos ficólogos
prestan atención a variaciones intraespecíficas en aspectos fisiológicos y bioquímicos.
Por otro lado, observaciones cuidadosas de poblaciones naturales pueden revelar
aislamiento reproductivo dentro de una morfoespecie o entre taxa intraespecíficos
(Ichimura 1996).
Se puede demostrar que los patrones de distribución de organismos sobre la
superficie del planeta no son aleatorios. Esta no aleatoriedad requiere explicaciones
en términos de procesos y reconstrucciones de eventos geológicos y biológicos en la
historia de la vida en la Tierra. Los procesos implican la formación de patrones
17
biogeográficos a partir de procesos abióticos muy lentos y a gran escala que incluyen
los movimientos tectónicos de placas, cambios en los niveles de los mares y océanos
y cambios climáticos, entre otros aspectos geológicos. Estos procesos han operado
casi en concierto, pues el clima puede ser afectado por los movimientos de los
continentes y los cambios en la circulación oceánica; los movimientos tectónicos
pueden alterar las corrientes oceánicas; el clima ha podido influir en la eustasia 1 de la
periodicidad interglaciar. A un nivel más local, las erupciones volcánicas,
desertificaciones, cataclismos terrestres, huracanes, etc. también han contribuido a la
creación de patrones de distribución en diferentes hábitats (Myers y Giller 1991).
La determinación de patrones de distribución parte de un análisis biogeográfico. Tales
patrones son dóciles a análisis sin supuestos específicos de procesos subyacentes o
pueden ser usados para probar hipótesis sobre procesos. La biogeografía histórica y
ecológica indirectamente ha usado patrones observados de distribución de organismos
para probar hipótesis, con miras a explicar procesos tales como la vicariancia
(separación de grupos por barreras geográficas), dispersión, interacciones de especies
y eventos de perturbación (Myers y Giller 1991).
1.4 Importancia biotecnológica de las microalgas
Pocas personas, fuera del ámbito científico, conocen qué son las llamadas
cianobacterias, a pesar de que estos organismos son responsables tanto de beneficios
como de problemas en asuntos humanos (Prosperi 2000). Tampoco se conoce a la
mayor parte de las microalgas eucariotas, aún las bien sabidas propiedades abrasivas
de las tierras de diatomeas; o las especies que producen las perjudiciales mareas
rojas; o todavía sus “primas mayores”, las macroalgas, tan apreciadas en la
gastronomía japonesa y europea, así como en las industrias de geles como el agar y
carragenina, esta última para espesar jaleas y gelatinas. Son también invaluables los
aportes de las microalgas a la industria de los colorantes por la gran diversidad de
pigmentos que producen. Clorofitas del género Dunaliella acumulan elevados
contenidos de carotenoides, varias veces más que la zanahoria en base seca, por un
proceso denominado carotenogénesis, que las hacen fuente primaria de provitamina A
para humanos (Guevara y col. 2005).
1
El término eustasia se emplea para designar los hundimientos y posteriores ascensos de la
corteza terrestre en aquellas zonas en que existieron grandes glaciares continentales durante
el Pleistoceno. Con la formación de los grandes glaciares, el relieve se fue hundiendo por el
peso del propio hielo y al finalizar el período glacial y desaparecer esos glaciares, el relieve
previamente hundido tiende a "rebotar" hacia arriba debido a que se queda liberado de dicho
peso (http://es.wikipedia.org/wiki/Eustasia).
18
A pesar del empleo milenario de las microalgas como alimento humano, la
biotecnología de estos microorganismos en realidad sólo comenzó a desarrollarse a
mediados del siglo pasado. Hoy en día, existen numerosas aplicaciones comerciales
de las microalgas. Por ejemplo, (i) las microalgas pueden ser utilizadas para mejorar el
valor nutritivo de los alimentos y la alimentación animal debido a su composición
química, (ii) desempeñan un papel crucial en la acuicultura y (iii) pueden ser
incorporadas a los cosméticos. Además, se cultivan como fuentes muy valiosas de
diversas moléculas. Respecto a esto último, por ejemplo, los ácidos grasos
poliinsaturados de los aceites se añaden a las fórmulas infantiles y complementos
nutricionales y los pigmentos son importantes como tintes naturales. Isótopos
bioquímicos estables ayudan en la determinación estructural y los estudios
metabólicos. La investigación futura deberá centrarse en la mejora de los sistemas de
producción y la modificación genética de las cepas. Las microalgas constituyen de
esta manera una alternativa económica cada vez más diversificada y competitiva
(Spolaore y col. 2006).
Entre los beneficios que la humanidad obtiene de las cianobacterias, por citar uno de
múltiples ejemplos, se encuentra su utilización como biofertilizantes en agricultura,
gracias a su capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (N 2) y producir compuestos
orgánicos ricos en nitrógeno que contribuyen a incrementar los rendimientos de las
cosechas de arroz (Prosperi 2000). El empleo de algunas especies de los géneros
Spirulina y Arthrospira para la alimentación humana está ampliamente comprobado
por un sin fin de investigaciones científicas, las que coinciden en su inocuidad (no son
tóxicas), gran palatabilidad (más de 90% comestible) y sus importantes cantidades de
proteínas (65-70% en base seca), vitaminas y otros nutrientes (Ciferri 1983, Henrikson
1994, Mani y col. 2000, Pervushkin y col. 2001, Sachdeva y col. 2004).
Está ampliamente comprobado el beneficio alimentario de Spirulina y Arthrospira en
animales de granjas pecuarias (aves de corral, porcinos, etc.) y acuícolas (peces,
camarones, etc.), y consumo humano (Martínez-Palacios y col. 1996, Soler y col.
2000, Nandeesh y col. 2001, Jaime-Ceballos y col. 2004). Las tecnologías empleadas
para cultivar masivamente microalgas y obtener productos alimenticios, farmacéuticos
y cosméticos de su biomasa son limpias en su totalidad; las granjas a cielo abierto
tienen un gran valor ecológico como trampas vivientes de gases de efecto invernadero
y purificación de biogás (Conde y col. 1993), así como recuperación de cuerpos de
agua contaminados (Ayala y Vargas 1987, Sim y Goh 1988, Cañizares y col. 1993).
19
Existen diversas especies de microalgas que metabolizan hidrocarburos, los
bioacumulan en sus vacuolas y producen aceites, a partir de los cuales se pueden
producir biocombustibles (biodiesel). La clorofita Botryococcus braunii se caracteriza
por su capacidad de producir hidrocarburos insaturados de cadena larga, llegando a
contenidos que van de 15 a 75% de su peso seco. Además, esta microalga produce
polisacáridos extracelulares que inducen la formación de colonias, el tamaño de las
mismas depende de la hidrodinámica de estrés en el biorreactor. Su gran potencial
como fuente renovable de combustibles de base o de productos químicos ha sido
demostrado por diferentes grupos de investigación (Casadevall y col. 1985, Banerjee y
col. 2003).
Otras especies de microalgas con gran potencial en biotecnología petrolera, debido a
sus gran contenido de lípidos, son Schizochytrium sp., Nannochloropsis sp., Nitzschia
sp., Isochrysis sp. y Tetraselmis suecica, entre otras (Tabla 1).
Tabla 1. Especies de microalgas con potencialidades para generación de biocombustibles.
Contenido de aceites en base seca (tomada de Albarracín 2007).
Especie
Contenido de aceite (% de peso seco)
Botryococcus braunii
25 – 75
Chlorella sp.
28 – 32
Crypthecodinium cohnii
20
Cylindrotheca sp.
16 – 37
Dunaliella primolecta
23
Isochrysis sp.
25 – 33
Monallanthus salina
20
Nannochloris sp.
20 – 35
Nannochloropsis sp.
31 – 68
Neochloris oleoabundans
35 – 54
Nitzschia sp.
45 – 47
Phaeodactylum tricornutum
20 – 30
Schizochytrium sp.
50 – 77
Tretraselmis suecica
15 – 23
20
Por su parte, la diatomea marina Chaetoceros muelleri puede tener potencial para su
explotación como un precursor renovable de los combustibles líquidos o como fuente
de lípidos, esto sobre la base de su alta tasa de crecimiento, la tolerancia a una amplia
gama de temperaturas y conductancias específicas, y una gran cantidad de lípidos
intracelulares (Mcginnis y col. 1997).
El fitoplancton ha sido ampliamente estudiado en sus dinámicas poblacionales y
comunitarias. Los estudios teóricos a partir de observaciones empíricas y de campo
han crecido notablemente debido a la importancia de muchas especies de microalgas
en la alimentación, farmacia, medicina, control de calidad de aguas, etc. Un aspecto
aún incipiente es el estudio biogeográfico de microalgas en sus ambientes nativos.
Este trabajo trata de dos temas: (1) estudio de las dinámicas poblacionales en
especies cultivadas y (2) muestreo y caracterización de hábitats y aspectos
comunitarios de especies autóctonas de gran valor en la biotecnología alimentaria y
petrolera.
21
2. Antecedentes en Venezuela
En Venezuela se han hecho numerosos trabajos taxonómicos y ecológicos de
microalgas. Diversas especies fitoplanctónicas de importancia biotecnológica son
nativas de Venezuela; las clorofitas Botryococcus braunii y Chlorella vulgaris y
cianobacterias del género Spirulina han sido reportadas para el embalse de Guri
(González de Infante y Riehl 1992). Anteriormente, B. braunii también se encontró en
la laguna de San Javier del Valle, Edo. Mérida (Yacubson 1974). En aguas salobres y
estuarinas, como el sistema del lago de Maracaibo (norte del lago) se ha reportado la
cianobacteria Spirulina subsalsa y otras cianobacterias eurihalinas (Rodríguez 2001).
En diversos sistemas marinos costeros y lagunas hipersalinas del país se han
colectado diferentes especies de clorofitas del género Dunaliella (Guevara y col.
2005), así como prasinofitas del género Tetraselmis (Romero y col. 2002), entre otras
especies.
Por otra parte, algunas investigaciones se han orientado a ensayos de cultivos de
microalgas en condiciones controladas con fines biotecnológicos. Algunos análisis han
permitido la determinación de las composiciones nutricionales y producciones de
metabolitos de diferentes especies de microalgas: Anabaena sp. (Morales y col. 2002),
Chlorella sp. (Mora y col. 2004) y Dunaliella salina (Guevara y col. 2005). Otros
ensayos han conducido a la cuantificación de efectos inmunomoduladores de Spirulina
subsalsa (Cheng-Ng y col. 2005). Parra (2005) aisló y purificó c-ficocianina y
aloficocianina de Arthrospira platensis, dos pigmentos de gran interés en la industria
de los colorantes y marcadores moleculares. Naranjo y col. (2010) hicieron una
revisión del uso de A. platensis como biofactoría de metabolitos secundarios de interés
farmacológico, con énfasis en el ácido pipecólico.
La Asociación Civil Gente de Ciencias (2007), organización científica y social
venezolana constituida por profesionales del área de las ciencias naturales, con
experiencia en el cultivo de microalgas (cultivos en laboratorio y campo; optimización
de medios de cultivo, fotobiorreactores y obtención de productos de microalgas), con
énfasis en Arthrospira platensis desde el año 2000. Las investigaciones se
concentraron en la aplicación de la biotecnología de microalgas en temas como la
nutrición animal y humana. Recientemente con Botryococcus braunii, Nannochloropsis
sp., Tetraselmis chuii e Isochrysis galbana, entre otras especies, se ha explorado la
factibilidad de producir biocombustibles a partir de aceites sintetizados o acumulados
en sus compartimentos intracelulares.
22
3. Justificación
Este trabajo está enmarcado en el estudio ecológico, taxonómico y biogeográfico de
especies de microalgas eucarióticas y cianobacterias autóctonas con potencialidades
para su cultivo masivo en Venezuela y empleo en la acuicultura, biotecnología
alimentaria, generación de biocombustibles (biodiesel), biorremediación, producción de
energías limpias y trampas de gases de efecto invernadero. También se incorporan
especies cultivadas en Venezuela desde hace varios años, como Arthrospira platensis
y A. maxima de conocido perfil nutricional, médico y biorremediador, por lo que tienen
gran demanda mundial; más de 70 países las cultivan comercialmente (Henrikson
1994).
Las especies de los géneros Spirulina y Arthrospira han sido incorporadas con éxito
notable en programas sociales y alimentarios dentro de países del cuarto mundo con
altas tasas de desnutrición, como el África Ecuatorial. Conviene entonces incorporar el
estudio ecológico de estas cianobacterias para conocer sus tasas de crecimiento
óptimas y otros parámetros poblacionales con miras a cultivarlas a gran escala en el
país y aprovechar su biomasa con la firme intención de establecer programas
nutricionales similares en Venezuela y Latinoamérica, a sabiendas de los niveles
preocupantes de desnutrición que imperan en los países de esta región.
El estudio de los organismos en su ambiente natural brinda la oportunidad de conocer
las especies con las que cuenta Venezuela y adquirir un conocimiento integral de sus
ambientes naturales. Esta propuesta lleva implícito un propósito productivo de emular
las condiciones naturales para lograr sus cultivos en sistemas controlados, y una
finalidad de conservación a partir del conocimiento de los ambientes para manejo
sustentable de ecosistemas o su protección como santuarios de vida. En síntesis, la
meta de esta investigación es brindar puntos de partida a partir de un estudio
ecológico integral a expectativas y necesidades creadas en el país por la búsqueda de
fuentes alternativas de alimentos, medicinas, pigmentos y energías limpias, así como
perspectivas para la recuperación de ecosistemas acuáticos contaminados. Esta
propuesta está enmarcada en el Plan Nacional Simón Bolívar como nuevo modelo
sociopolítico para el país.
23
4. Hipótesis
1. Las poblaciones de Arthrospira platensis cultivadas en el laboratorio presentan
densodependencia, y un crecimiento poblacional que puede ser descrito con
modelos matemáticos.
2. La geografía y ecología variadas del país permiten esperar una gran diversidad de
especies de microalgas distribuidas en forma discontinua y gradientes, algunas de
ellas con gran potencial biotecnológico.
24
5. Objetivos
1. Establecer la dinámica de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis con
optimización de medios de cultivo para fines productivos.
2. Caracterizar hábitats y comunidades fitoplanctónicas con especies de interés
biotecnológico en el país.
Del objetivo 1 se desprenden los objetivos específicos:
a. Caracterizar el crecimiento poblacional de A. platensis en condiciones
controladas y naturales.
b. Determinar los parámetros poblacionales.
c. Realizar análisis de perturbación en el modelo dinámico.
Del objetivo 2 derivan los objetivos específicos:
a. Identificar especies de microalgas de muestras colectadas en el campo.
b. Determinar riqueza, abundancia e índices de diversidad.
c. Establecer relaciones entre ambientes, variables físicas y químicas y la
composición de especies encontradas.
25
6. Metodología
El plan general de trabajo se dividió en dos niveles de organización: poblacional y
comunitario.
6.1 Ecología de poblaciones de especies cultivadas
Los estudios poblacionales se condujeron por aproximaciones experimentales y con
base en la teoría ecológica. Los mismos se centraron en cultivos de la cianobacteria
Arthrospira platensis (cepa Lefevre 1963/M-132-1, República Checa). La especie se ha
cultivado en el Laboratorio de Optimización Agrícola (LOA-IZET) por más de ocho
años. Arthrospira maxima (cepa cubana), es una especie congénere obtenida para el
cepario del laboratorio en tiempo más reciente. El cepario también cuenta con otras
especies de valor biotecnológico provenientes de otros ceparios del país y del
extranjero, así como colecciones de campo: Chaetoceros sp. (Bacillariophyta),
Botryococcus braunii (Chlorophyta), Chlamydomonas sp. (Chlorophyta), Chlorella
vulgaris (Chlorophyta), Dunaliella salina (Chlorophyta), D. viridis (Chlorophyta), D.
primolecta (Chlorophyta), Haematococcus pluvialis (Chlorophyta), Scenedesmus sp.
(Chlorophyta), Spirulina subsalsa (Cyanobacteria), Isochrysis galbana (Haptophyta),
Nannochloropsis sp. (Ochrophyta), Tetraselmis sp. (Prasinophyta), Porphyridium
cruentum (Rhodophyta) y Rhodosorus marinus (Rhodophyta).
Medios de cultivo. Se procedió a la preparación de un medio de cultivo estándar para
cianobacterias filamentosas alcalófilas de los géneros Spirulina y Arthrospira
denominado medio Spirulina o SAG (Schlösser 1994), que es una modificación del
medio Aiba y Ogawa (1977). Parra (2005), incorporó algunos cambios a este medio
nutritivo. La composición del medio Spirulina se presenta en la Tabla 2.
Tabla 2. Composición química del medio Spirulina (Schlösser 1994).
Componentes
Solución Stock
(mL)
Masa (g)
Concentración
en el medio
final
Solución I
500 (2X)
–
–
NaHCO3
Na2CO3
K2HPO4*
–
–
–
13,61
4,03
0,50
1,62×10-4M
3,80×10-5M
2,87×10-4M
Solución II
500 (2X)
–
–
NaNO3*
K2SO4
NaCl
–
–
–
5,00
2,00
2,00
2,94×10-5M
5,74×10-6M
1,71×10-5M
26
pH
Alcalino
(>9)
–
–
–
Neutro
(7)
–
–
–
Tabla 2. Continuación.
Componentes
Solución Stock
(mL)
Masa (g)
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
FeSO4.7H2O
Na2EDTA.2H2O
–
–
–
–
0,40
0,02
0,02
0,16
Concentración
en el medio
final (1X)
8,11×10-7M
2,72×10-7M
3,60×10-8M
2,15×10-7M
Traza metálica
1000 (1000X)
–
–
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
ZnSO4.7H2O
MnSO4.7H2O
H3BO3
–
–
–
–
–
–
–
–
0,80
0,70
0,001
0,002
0,01
0,001
0,001
0,00005
2,15×10-6M
2,52×10-6M
3,48×10-9M
8,97×10-9M
1,62×10-7M
3,44×10-9M
4,13×10-9M
2,00×10-11M
Co(NO3)2.6 H2O
Na2MoO4.2 H2O
CuSO4.5H2O
pH
–
–
–
–
Neutro
(7)
–
–
–
–
–
–
–
–
*Parra (2005) reemplazó el K2HPO4 por KH2PO4, debido a la mayor solubilidad de la primera
en agua. También sustituyó el NaNO3 por KNO3 para obtener una relación Na:K más próxima a
la fisiológica (4:1).
Spirulina subsalsa fue cultivada en medio Spirulina combinado con agua de mar
(50:50), debido al origen estuarino de la cepa (Morales, com. pers.). El resto de las
especies de microalgas del cepario se cultivaron en diferentes medios probados y
estandarizados como óptimos para sus crecimientos poblacionales: medio F/2
(Guillard 1975), para microalgas marinas como Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. e
I. galbana; medio Algal (Fábregas y col. 1985), el cual fue empleado tanto para
microalgas de agua dulce como Chlamydomonas sp., C. vulgaris y Scenedesmus sp.,
como para diatomeas marinas (Chaetoceros sp.), con adición de silicatos, rodofitas (P.
cruentum y R. marinus) y Tetraselmis sp., con adición de agua de mar, y clorofitas de
ambientes hipersalinos (Dunaliella spp.), con la incorporación de solución saturada de
cloruro de sodio (NaCl); medio Chu-13 (Chu 1942) modificado por Dayananda (2007)
para B. braunii; Haematococcus pluvialis fue cultivada en medio Bristol (Bold 1949).
Para especies del género Dunaliella también se probó el medio de Serpa y Calderón
(2006). Las composiciones de estos medios se presentan en el Apéndice 1.
La preparación de los medios se efectuó conforme los siguientes pasos generales:
1. Se preparó una solución madre 1000X (solución concentrada) de micronutrientes
(oligoelementos o traza metálica), según lo establecido en cada medio de cultivo.
Para ello, las sustancias requeridas como sales inorgánicas cristalizadas grado
analítico se pesaron en una balanza analítica digital AND (d = 1 mg).
27
2. Las sustancias constituyentes de la solución de macronutrientes, sales inorgánicas
cristalizadas grado analítico (salvo bicarbonato y carbonato de sodio, sales que
debido a sus altos requerimientos para el medio Spirulina se obtuvieron de sacos
de 25 ó 50 kg de agroquímicos grado técnico), también se pesaron en una balanza
analítica digital AND (d = 1 mg). Las sales de bicarbonato y carbonato de sodio se
pesaron en una balanza digital de 10 kg (d = 1 g).
3. Cada sal se disolvió en forma independiente con agitación magnética y calor, luego
se mezclaron todos los componentes de la solución madre y se enrasó al volumen
final, generalmente de un (1) litro, en un balón aforado o en un cilindro graduado
de 1 L. Algunas sales, como el sulfato ferroso heptahidratado (sal utilizada
generalmente como fuente de hierro para todos los medios), tuvieron que ser
disueltas con un quelante (EDTA disódico o citrato trisódico dihidratado). No se
añadieron vitaminas ni carbohidratos a ninguna solución de medio nutritivo.
4. La solución madre de micronutrientes se esterilizó en un autoclave analógico
vertical KALSTEIN durante 45 min hasta una temperatura tope de 119ºC
(temperatura óptima = 121ºC), y una presión de 10 PSI (presión óptima = 15 PSI).
Antes de autoclavar cualquier solución y material (pipetas Pasteur, fiolas, botellas
vacías, etc.), una cinta de papel autoadhesivo indicador (o testigo) se colocó a
cada recipiente.
5. A la solución de macronutrientes se añadió la alícuota correspondiente de solución
madre de micronutrientes estéril, para de este modo obtener el medio de cultivo
íntegro. Para trasvasar soluciones se tomó la previsión de destapar el envase
frente a la llama azul de un mechero FISHER.
6. Finalmente, la solución de medio de cultivo se autoclavó para luego enfriar y
proteger con papel envolvente.
Inóculo. Se obtuvieron cultivos monoalgales y monoclonales (poblaciones surgidas de
un filamento) de A. platensis (cepa Lefevre), por la virtud de estas cianobacterias de
reproducirse asexualmente por particiones de filamentos o tricomas en sitios críticos
que necrosan y se escinden formando hormogonios (filamentos reproductivos), sitios
denominados necridia o necridios. Esto garantizó uniformidad genética en las
poblaciones de estos microorganismos.
Para la obtención de cultivos monoclonales se cumplió la pauta siguiente:
28
1. De una cepa se aisló un filamento en una cápsula de Petri con solución buffer
alcalina (bicarbonato-carbonato de sodio, 4:1) bajo un estereoscopio (lupa).
2. Cada filamento se colocó en un tubo de ensayo con medio Spirulina esterilizado y
se colocó en cámara de crecimiento (T = 27ºC) con iluminación permanente. El
periodo de incubación fue de 15 días, tiempo en el cual el filamento inicial pudo
clonarse en varios filamentos vía escisión en necridios.
3. Los cultivos monoclonales se escalaron a fiolas de 250 mL y se mantuvieron sin
agitación en la cámara de crecimiento. En estos recipientes se mantuvieron para
ser empleados en medios sólidos y completar proceso de purificación de la cepa.
Para la siguiente etapa de purificación del cultivo monoalgal y monoclonal, con la
finalidad de controlar contaminación de bacterias y hongos, se emplearon los
siguientes pasos:
1. Se prepararon medios sólidos con disolución en caliente de agar no purificado en
medio Spirulina (1,5 g de agar por cada 100 mL de medio), de esta manera se
elaboró un medio de agar alcalino.
2. Las soluciones con agar se autoclavaron en cápsulas de Petri, para hacer placas y
en tubos de ensayo inclinados para obtener cuñas. Una vez obtenidos los medios
sólidos estériles, se procedió a encender la llama azul en un mechero FISHER y
limpiar el mesón con etanol absoluto. Este procedimiento se hizo con el fin de
tener las mayores condiciones de asepsia posibles.
3. Bajo estas condiciones de asepsia y llama azul, una vez que las soluciones
esterilizadas se enfriaron, se procedió a la siembra de las cepas vivas. Los medios
solidificados en placas y tubos fueron sembrados por medio de un asa metálica
pasada por llama azul y enfriada en algún punto del medio sólido, teniendo
cuidado de no inocular posteriormente en esa zona (figura 1).
Figura 1. Esquema ilustrado donde se muestra el escalamiento de microalgas de medio líquido
a medio sólido con el empleo de la técnica del asa de estaño.
29
4. Finalmente las cepas en las soluciones nutritivas solidificadas se ubicaron en el
cepario o cámara fría bajo luz fría (tubos fluorescentes day-light) a una
temperatura media de 23ºC.
Luego de la obtención de cepas limpias, monoclonales y monoalgales, se procedió al
escalamiento a fiolas de 250 mL, y de éstas a fiolas de mayores volúmenes en forma
sistemática hasta llegar a los cultivos en fiolas de 2 L con agitación y sin fotoperiodo
(luz por 24 h diarias). Para ello se procedió del modo siguiente:
1. Soluciones líquidas esterilizadas se trasvasaron a fiolas de 250 mL cubiertas con
tapones de algodón y gasa. Todo este material previamente se autoclavó. Los
medios líquidos nuevos se inocularon con pequeños volúmenes de cepas
provenientes de cuñas y placas del cepario en cámara fría.
2. Las cepas cultivadas en medio líquido se colocaron en la cámara de crecimiento
bajo luz fría y temperatura media de 27ºC, con agitación y luz continuas. La
agitación en la cámara de crecimiento la proveyó un blower KAWAKE (¼ HP; 220
V), y se condujo a través de un sistema de tubos y mangueras hasta culminar en
pipetas Pasteur esterilizadas sumergidas en las soluciones con inóculo.
3. Los dos pasos anteriores se repitieron para los escalamientos sucesivos hasta
culminar en cultivos a escala mayor (figuras 2 y 3).
Figura 2. Esquema donde se muestra el escalamiento de poblaciones de microalgas a fiolas de
diferentes volúmenes hasta alcanzar los cultivadores a gran escala.
Diseño de experimento. Los experimentos en laboratorio bajo condiciones
controladas se ejecutaron a escala menor (fiolas de 2 L); estas pruebas se ejecutaron
en la cámara de crecimiento del cepario del Laboratorio de Optimización Agrícola
(LOA). Los ensayos en campo se llevaron a cabo a escala mayor y con monitoreo de
las condiciones ambientales en la Planta Experimental “Ficotrón” ubicada en el
Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), Sartenejas, Edo. Miranda. Se ensayó en
30
botellones de 5 L, tanques cilíndricos de 500 L y cultivadores tipo carrusel (en inglés
“race-ways”) de 2000 L (figura 3).
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 3. Imágenes donde se muestran las diferentes etapas de escalamiento del cultivo en
medio líquido en el sistema integrado LOA-Ficotrón: (a) cultivos a escala pequeña en
condiciones controladas (Cámara de Crecimiento, LOA - IZET); (b), (c) y (d) cultivos a cielo
abierto en el Ficotrón, IDEA, en botellones de 5 L, tanques circulares de 500 L y cultivadores
tipo carrusel de 2000 L, respectivamente.
Cada diseño de experimento se definió por el número de factores o variables
independientes a fijar y su número de niveles (Montgomery 2001). En todos los
experimentos se consideraron variables dependientes: (1) la densidad poblacional
(filamentos/L), por el método directo de conteo de filamentos, y (2) la absorbancia a
longitud de onda (λ) = 680 nm, para el método indirecto.
Los ensayos de laboratorio se organizaron en diseños factoriales 22 (dos factores,
sodio (Na) y potasio (K), con dos niveles, alta y baja concentración), para comparar
cuatro medios de cultivo (modificaciones del medio Spirulina) empleados para A.
platensis. Los ensayos no se replicaron en número de fiolas, puesto que se supone la
existencia de repeticiones del experimento en cada una de las posibles combinaciones
de los niveles del factor correspondiente (Montgomery 2001). Se hicieron ajustes
matemáticos para modificar la relación Na +:K+, sin variar en forma notable las
concentraciones de los demás iones. Con estas pruebas se determinó el medio de
cultivo óptimo para el crecimiento poblacional en condiciones controladas, a partir de
los dos cationes más importantes en el equilibrio electroquímico entre los
compartimentos intra y extracelulares, y contraiones de las sales inorgánicas. Las
interacciones entre factores se evaluaron con un ANOVA de dos vías (α = 0,05). La
Tabla 3 muestra el resumen del ensayo factorial 22.
Tabla 3. Diseño factorial 22 para ensayos de laboratorio. El experimento se simplificó a cuatro
medios de cultivo sin replicación.
K+ alto
K+ bajo
Na+ alto
++
+–
Na+ bajo
–+
––
31
En campo se continuó la investigación con diseños factoriales de mayor complejidad, a
medida que se añadieron factores. El primer experimento de campo se llevó a cabo en
botellones plásticos de 5 L y el diseño correspondió a un factorial fraccionado 2 6-1 de
resolución VI, montado con el programa Design Expert versión 6, donde las variables
independientes o factores fueron seis sales grado alimenticio a dos niveles, con cinco
puntos centrales. El programa produjo 37 tratamientos, 5 centrales y el resto
combinaciones aleatorias de los factores (Tabla 4). Las sales forman parte del medio
Spirulina (Schlösser 1994), pero en lugar de la sustitución de Parra (2005) de KNO 3
por NaNO3, se empleó NH4NO3, esto debido a razones de costos. A esta escala de
experimentación se emplearon sales grado alimenticio y no reactivo, el NH4NO3 resultó
la fuente de nitrógeno disponible y muy empleada en producción de fertilizantes.
6-1
Tabla 4. Resumen del diseño factorial fraccionado 2
Study Type:
Initial
Design:
Center
Points:
Design
Model:
Factorial
2 Level Factorial
Runs:
Blocks:
37
No
Blocks
Low
Actual
6805
2015
250
500
500
1176
(salida del programa Design Expert)*.
5
Reduced
3FI
Factor
Name
Units
Type
A
B
C
D
E
F
NaHCO3
Na2CO3
K2HPO4
NaCl
K2SO4
NH4NO3
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
Numeric
Numeric
Numeric
Numeric
Numeric
Numeric
High
Actual
13610
4030
500
1000
1000
2352
Low
Coded
-1
-1
-1
-1
-1
-1
High
Coded
1
1
1
1
1
1
Mean
10207,5
3022,5
375
750
750
1764
Std.
Dev.
3164,3
937,0
116,2
232,5
232,5
546,8
*Para más detalle sobre este ensayo, ver Apéndice 2.
Las variables respuestas o dependientes aleatorias fueron: absorbancia a 680 nm,
número de filamentos por litro, y biomasa final (g/L). El medio óptimo para este
experimento se escogió por una técnica matemática multivariada denominada
superficie de respuesta (ver Apéndice 2 con salida del análisis en Design Expert, y
Apéndice 3 que muestra un marco teórico breve que explica la técnica).
Para este ensayo de campo, los medios se prepararon según esquema de la figura 4.
Los pasos se enumeran a continuación:
1. Se prepararon soluciones stocks por triplicado con agua destilada y se preservaron
en envases limpios. Los primeros ocho tratamientos se prepararon en dos
soluciones de 500 ml cada una: Solución I (Stocks A, B y C) y Solución II (stocks I,
32
D, E, F y II). Las preparaciones se hicieron en grupos de ocho debido a la
capacidad limitada del autoclave (16 botellas de vidrio de 1 L c/u).
2. Se autoclavaron las soluciones I y II de cada tratamiento.
3. Cada tratamiento se aforó a 4 L con agua filtrada.
4. Se tomó una muestra de 50 mL de cada tratamiento y se realizaron medidas de pH
y conductividad como método de comprobación de calidad del medio.
Stock A
Stock B
1/2L
Sol. I
de Trat.
X
Stock C
Stock I
Autoclavar I y II
Stock D Stock E
Stock F
Stock II
1/2L
Sol. II
de Trat.
X
4L Trat.
X
Figura 4. Esquema para la preparación de cada medio (tratamiento) del diseño factorial
fraccionado 26-1.
La siguiente escala de volumen en el estudio, la constituyeron tanques cilíndricos de
500 L. El diseño experimental empleado para evaluar el crecimiento poblacional de A.
platensis en este tipo de cultivadores fue un factorial 3 2 con bloques completos
aleatorizados. Se estableció un sistema de 9 tanques cilíndricos de 500 litros de
polietileno de alta densidad, con sistema de bombeo y aireación (blower KAWAKE ¼
HP; 220 V) bajo invernadero (Ficotrón). El sistema de bombeo está compuesto de dos
bombas de pecera (cada bomba aproximadamente suministra 2 L•min -1). Cada medio
en tanque se inoculó con 10% de los volúmenes totales, dando como resultado una
concentración promedio de 83 mg/L. Las pérdidas por evaporación se repusieron con
agua filtrada. Cada 72 h se midió la absorbancia o densidad óptica (DO) en un
espectrofotómetro SHIMADZU UV-160 a λ = 680 nm. Como medio de cultivo se
empleó el optimizado en el diseño factorial fraccionado 26-1. La variable independiente
aleatoria fue la profundidad (cm), debido a que este factor físico resulta determinante
33
en las tasas de crecimiento y mortalidad de filamentos por la generación de puntos
oscuros donde la fotosíntesis se anula. Las variables respuestas a evaluar fueron la
absorbancia a 680 nm (medida cada tres días) y biomasa total (g/L), ésta última
determinada una vez realizada la cosecha al final del periodo de incubación. La figura
5 muestra un esquema de este sistema de tanques y su disposición espacial para el
experimento.
N
60 cm
3
15 cm
25 cm
2
35 cm
25 cm
1
60 cm
35 cm
15 cm
C
S
BLOQUES
A1-25
A2 25
A3 15
B1 35
B2 15
B3 25
C1 15
C2 35
C3 35
15 cm
60 cm
25 cm
60 cm
35 cm
A
B
F IL A S
10º24`12`` N 66º53`13`` O
Figura 5. Esquema de la disposición espacial de los tanques cilíndricos en el Ficotrón para la
ejecución del diseño de bloques completos aleatorizados.
Un Análisis de Varianza (acrónimo en inglés ANOVA) de dos vías (α = 0,05) se realizó
para determinar efectos significativos de tratamientos y bloques. La corrida de la
prueba se ejecutó en EXCEL versión 2007.
Finalmente, para piletas o cultivadores tipo carrusel de 2000 L no se realizó un diseño
experimental formal, pues sólo se dispuso de un sistema con agitación por paletas de
los ocho construidos en la planta. De esta forma, no se dispuso de “réplicas” para
comparar medias poblacionales de A. platensis con diferentes tratamientos. Sólo se
pudo recurrir a un muestreo sin norma o puntual cada tres días para valorar la
absorbancia a 680 nm y biomasa final (g/L), una vez realizada la cosecha.
Biomasa. Para la obtención de biomasa seca, en laboratorio se procedió a colectar la
biomasa húmeda en una malla de poliéster con 27 μm de apertura de poro, mientras
que en el campo (Ficotrón) la cosecha se hizo con filtros metálicos con diámetro de
poro de 55 μm. El pH del medio de cultivo de A. platensis se caracteriza por su
34
alcalinidad elevada (9,5 a 10), por lo que la biomasa fue neutralizada con agua filtrada
o agua acidulada para fines de aprovechamiento alimenticio; un pH-metro digital
HANNA permitió monitorear la reducción del pH hasta 7. Finalmente, la biomasa
húmeda y neutralizada fue extendida sobre una superficie de papel parafinado y
colocada en rejas metálicas, para ser secada en un deshidratador a 60ºC por 24 h. La
biomasa total o final se estableció una vez alcanzado el plateau y sucedidos algunos
días para la estabilización de la curva (de 15 a 30 días de incubación).
Determinación de la densidad poblacional. Se determinó el crecimiento poblacional
de A. platensis por dos métodos: (1) directo, por conteo de filamentos en cámaras
cilíndricas desmontables Utermöhl (1958) bajo un microscopio invertido LEICA DMIL, y
(2) indirecto, por absorbancia o densidad óptica en un espectrofotómetro digital
SHIMADZU UV-160 a longitudes de onda (λ) de 680 y 700 nm, correspondientes al
rojo y rojo lejano, respectivamente, en las cuales la clorofila a teóricamente tiene
absorción óptima de luz visible y umbral visible-infrarrojo.
Para el conteo de filamentos, se empleó el método de conteo de bandas (Utermöhl
1958) en una cámara de 25 mL. Previamente, las muestras se dejaron sedimentar en
la cámara por 24 h. Una vez hecho el cómputo de filamentos por banda, se determinó
la densidad ( D ) o número de filamentos por litro a partir de la ecuación:
Dfilamentos /L  
S
 N  1000 (1)
L  T V
Donde:
S = superficie total de la cámara de sedimentación ( r 2 )
N = número total de filamentos contados
L = longitud de la banda recorrida (2 r )
T = ancho de la banda recorrida (según aumento del objetivo)
V = volumen total de la cámara (25 mL)
Para determinar el ancho de la banda, se calibró el microscopio con una escala
grabada en un ocular (aumento 10x) dividida en 100 líneas, la cual se superpuso a
otra escala de 2 mm de longitud grabada en un portaobjetos ubicado sobre el carro.
Para el aumento de cada objetivo se obtuvieron los siguientes factores de conversión:
35
10x: 3 líneas = 0,05 mm
20x: 10 líneas = 0,08 mm
32x: 20 líneas = 0,1 mm
Previo a cada ensayo con el método indirecto, en el espectrofotómetro se hizo un
barrido (en inglés “scan”) de absorbancias, en un intervalo de longitudes de onda de
400 a 700 nm, con factibilidad de expandir hacia el espectro UV por el límite inferior o
el infrarrojo por el límite superior; de esta manera se verificaron los máximos u óptimos
de absorción de las cepas de A. platensis.
La densidad óptica ( DOλ ) es la absorción de un elemento óptico por unidad de
distancia, para una longitud de onda dada:
DOλ 
Aλ
1
1
I 
  log10T  log10  0  (2)
l
l
l
I 
Donde:
Aλ = Absorción a longitud de onda λ
l = Distancia que la luz viaja por una muestra (i.e., el grosor de la muestra, o dicho de
otro modo, anchura o abertura de la cubeta, con exclusión de las paredes) medida en
centímetros (cm). Si l = 1 cm, entonces DOλ = Aλ
T = Transmitancia por unidad
I0 = Intensidad del rayo de luz incidente
I = intensidad del rayo de luz transmitido
(http://es.wikipedia.org/wiki/Densidad_óptica)
Mientras más alta es la densidad óptica, más corta es la transmitancia. Esta última
medida está acotada entre 0 y 1, si se transforma a porcentaje (como generalmente se
registra en espectrofotómetros), entonces la transmitancia se lee entre 0 y 100%. Para
calibrar el espectrofotómetro, se empleó una solución “blanco”, la cual teóricamente
tiene 100% T o Aλ = 0, y la misma se restó a las absorbancias de las muestras.
Modelos para crecimiento poblacional y cosecha de biomasa. Los estudios
teóricos tienen valor predictivo y se verifican en experimentos de laboratorio y campo.
Los supuestos generales de los modelos determinísticos son los siguientes (Begon y
col. 1996):
36
1. Las poblaciones son aisladas o cerradas (E = I = 0; donde E = tasa de emigración,
I = tasa de inmigración).
2. Las dinámicas son coetáneas (cohortes o individuos de la misma edad).
3. Los individuos son unitarios, excluyendo los modulares (Ej.: colonias de filamentos
o células).
4. Todos los individuos se consideran unidades reproductivas.
5. En modelos discretos, el tiempo entre generaciones Δt se iguala a la unidad.
El modelo de crecimiento densodependiente de partida es el logístico continuo de una
población simple sin estructura:
dN
 N
 rN 1   (3)
dt
 K
Siendo N(t) la densidad al tiempo t; r la tasa per cápita de crecimiento poblacional
cuando N  0, y K la capacidad de carga o densidad de equilibrio.
La solución de la ecuación (3) es:
N (t ) 
N0 K
N 0  ( K  N 0 )e rt
(4)
Siendo N0 = N(0).
El modelo de crecimiento logístico, en su forma discreta, se puede expresar como:
N t 1  N t  N t r1  bN t  (5)
O bien,
Nt 1  Nt 1  r  rbNt  (6)
Donde N t y N t 1 son densidades poblacionales a tiempos t y t+1, respectivamente, y
b es una constante definida como un término de retroalimentación densodependiente.
Este modelo es iterativo y el sistema de ecuaciones tiene un arreglo matricial que
representa la estructura de la población en el tiempo (Caswell 2001).
37
Como una aproximación experimental a la tasa de crecimiento instantánea (r), se
determinó la tasa de crecimiento per cápita o de recambio en intervalos de tiempo (t,
t+n) en la fase inicial de crecimiento exponencial, r = ΔN/[N(t)Δt], donde, las tasas
instantánea y media son comparables a densidades bajas (May 1976).
El punto de equilibrio estable (capacidad de carga, Nˆ  K ) también se determinó en
forma experimental, a partir del conteo de filamentos en el plateau de la curva de
crecimiento.
El tiempo de duplicación, tg (Begon y col. 1996), es el intervalo temporal en el que la
población inicial ( N 0 ) se duplica suponiendo crecimiento exponencial. Esto implica
que N(t) al tiempo tg es dos veces el tamaño inicial de la población (N(t) = 2 N 0 ). La
definición matemática de tg surge de un despeje e integración de la ecuación
diferencial de crecimiento exponencial:
dN
 rN
dt
2 N0

N0
ln
2N 0
 rt g
N0
ln 2  rt g
tg
dN
 r  dt
N
0
tg 
ln 2
(7)
r
Como se puede observar en la ecuación (7), el tiempo de duplicación es independiente
del tamaño poblacional inicial ( N 0 ).
Con el medio escogido como óptimo en el factorial fraccionado 2 6-1, se reprodujeron
algunos cultivos de A. platensis en botellones de 5 L, y se hicieron conteos de
filamentos clasificados en diferentes tallas (el criterio escogido fue el número de
células por filamento). Las categorías de tallas escogidas fueron: (1) filamentos con
dos células (hormogonios), (2) filamentos con cuatro células y (3) filamentos con más
de cuatro células.
Finalmente, con empleo del mismo medio optimizado, se hizo un análisis de
estabilidad posterior a perturbaciones sobre poblaciones de A. platensis. Dichas
perturbaciones consistieron en extracciones de volúmenes (25, 50 y 75%) en la fase
de saturación o capacidad de carga (K) y dilución con medio optimizado hasta el
enrase del recipiente. Se graficaron las dinámicas de crecimiento hasta el equilibrio.
38
6.2 Ecología de comunidades fitoplanctónicas
Los estudios de comunidades fitoplanctónicas se llevaron a cabo en diversas
localidades del país. Se ubicaron especies nativas de cianobacterias (entre ellas
representantes de los géneros Arthrospira y Spirulina) y eucariotas en ecosistemas
como humedales herbáceos de la península de Paria (Edo. Sucre) y El Clavo
(Barlovento, Edo. Miranda), lagunas de inundación del río Orinoco (Edo. Monagas),
sabanas inundadas todo el año (módulos de Mantecal, Edo. Apure), ambientes
marinos costeros (Bahía de Mochima, Edo. Sucre, y Puerto Cabello, Edo. Carabobo),
lagunas hipersalinas (Las Cumaraguas, Edo. Falcón), algunos sistemas contaminados
con crudos, producto de la explotación petrolera comercial, como la fosa “El Caracol”
(Edo. Anzoátegui), y manaderos naturales de hidrocarburos como la laguna de Boca
Chica en la isla de Margarita, estado Nueva Esparta (Mata García 2003). La figura 6
señala la ubicación geográfica de los sitios visitados.
Salinas de Las
Cumaraguas,
Paraguaná
Laguna de
Bocachica, Isla de
Margarita
Lagunas de
inundación, Bajo
Orinoco
Humedales de la
península de Paria
Humedales de
Barlovento
Puerto Cabello
Bahía de Mochima
Fosa El Caracol,
Edo. Anzoátegui
Módulos de Mantecal
39
Figura 6. Ubicación
de los sitios de
muestreo (el mapa
se encuentra en
www.guiageo-ameri
cas.com/mapas/ve
nezuela.htm).
Humedales de la península de Paria. La península de Paria está localizada en el
extremo noreste de la región Nororiental de Venezuela, en el estado Sucre, y abarca
un área de 1.078 km² (figura 7a). Limita al norte con el Mar Caribe y al sur con el golfo
de Paria. La Boca Dragón la separa de la Isla de Trinidad en su extremo este.
Geográficamente está localizada entre las coordenadas 10°27’00” N – 10°42’32” N y
62°32’00” W
– 63°11’00” W. La geomorfología de la península de Paria es muy
accidentada. Se trata de un sistema montañoso menos macizo que la serranía del
Interior, con relieves poco prominentes, pendientes de 30 a 45% y alturas
relativamente bajas (500 a 1000 m). El sustrato geológico está constituido por rocas
del Cretáceo metamórfico (cuarcitas, esquistos, filitas), y los rasgos más importantes
de la evolución geomorfológica cuaternaria de los depósitos continentales están
influenciados por fenómenos tectónicos. Los suelos son en general poco profundos, de
textura entre franco-arenosa y franco-arcillosa. El clima es tropical húmedo en el norte
caribeño (zona de barlovento) y semi-árido o tropical de sabana en el sur (zona de
sotavento). La precipitación anual media de la península de Paria está comprendida
entre 881,30 y 2348,6 mm, con una clara tendencia de las lluvias a incrementarse en
dirección sur-norte. La temperatura media anual para los primeros 500 m de altura,
gradualmente disminuye de 27,3 a 23,8°C (MARN 1992).
La vegetación natural de la región comprende una variedad importante de formaciones
que notablemente cambian de norte a sur. El norte está dominado por la selva húmeda
tropical y el sur tiene una vegetación de sabana con formas arbóreas características
como el chaparro y el manteco. En las desembocaduras de los ríos que vierten sus
aguas en el Golfo de Paria o el Mar Caribe, existen comunidades de manglares. Hay
diversas zonas húmedas interiores que contienen una vegetación palustrina. El
entorno del área de estudio, es de tipo bosque bajo y denso, con actividad
agropecuaria y levemente intervenido (MARN 1992).
“Palmares III” fue el sitio escogido para el muestreo en los años 2008 y 2009 (Proyecto
Fonacit 2001001850). Es un humedal palustrino, según el sistema de clasificación de
Tabilo-Valdivieso (1999). Sus aguas son someras y semipermanentes y está ubicado
en un terreno bajo o estero. Su localización geográfica precisa es la vertiente sur de la
península, cerca de la población de Los Palmares, con latitud 10°34’58” N, longitud
62°52’10” W y altitud de 30 m.s.n.m. (figura 7b). El área del humedal está cubierta de
vegetación emergente, predominantemente de hábito herbáceo, no siendo evidente la
formación de espejos de agua. Unas pocas especies de fanerógamas forman zonas o
bandas monoespecíficas, aunque también existen algunos sectores con vegetación
mixta, y al sur limita con un sembradío de cocoteros (figura 7c).
40
Figura 7. (a) Mapa de Venezuela donde se destaca a la península de Paria en un recuadro, (b)
ubicación del área de estudio y (c) vista panorámica del humedal “Palmares III” desde una
carretera que lo bordea al norte, la vegetación herbácea cubre la totalidad de su superficie y
forma bandas monoespecíficas, evidenciadas por las tonalidades distintas del color verde, que
cubren toda su superficie sin formar espejos de agua (tomado de Torres y Zoppi de Roa 2010).
41
“Palmares III” tiene un régimen hídrico estacional o semipermanente, producto de una
estacionalidad marcada. Valores medios mensuales que sintetizan 47 años (19532000) de determinaciones del régimen anual de lluvias en las cercanías del humedal,
registradas por la Estación Meteorológica de Irapa, establecen un promedio anual de
precipitaciones de 930,8 mm (MARN 2000). Se define que la estación seca va de
diciembre a marzo, abril es una transición de sequía a lluvia, la estación lluviosa
corresponde al intervalo de mayo a octubre y finalmente noviembre es la transición de
lluvia a sequía (figura 8).
Figura 8. Pluviodiagrama con precipitaciones medias de 47 años (1953-2000) del sur de la
península de Paria (datos tomados de la Dirección de Meteorología del MARN 2000).
Las comunidades de plantas que forman zonas monoespecíficas son: (1) gramínea
(Brachiaria mutica (Forssk) Stapt in Pain, Poaceae), (2) leguminosa (Sesbania
exasperata H.B.K., Fabaceae), (3) junco (Cyperus articulatus L., Cyperaceae) y (4)
enea (Typha dominguensis (Pers.) Poir. Ex Steud., Typhaceae).
Humedal de Barlovento. Al este de Caracas, donde finaliza la Cordillera de la Costa,
se inicia la llanura de Barlovento, la cual geopolíticamente es una región del centro de
Venezuela, ubicada en el estado Miranda, que abarca los municipios Acevedo, Andrés
Bello, Brión, Buroz, Páez y Pedro Gual. Esta región se encuentra inserta en la
depresión de Barlovento, siendo una de las regiones naturales que conforman la
denominada región Norte Costera. Se ubica entre los paralelos 10° y 11° latitud norte y
42
los meridianos 65° y 67° longitud oeste. Al norte limita con el mar Caribe; al sur lo hace
con la serranía del Interior y el estado Guárico; al este delimita con la serranía del
Litoral de la cordillera de la Costa, el estado Vargas y otros municipios del estado
Miranda;
al
oeste
culmina
en
el
río
Uchire
y
estado
Anzoátegui
(http://es.wikipedia.org/wiki/Barlovento_(Venezuela)).
El área donde se realizó la investigación en 2009 (Ecología de Humedales, materia
electiva del postgrado en Ecología IZET-UCV), se denomina El Clavo, ubicado a 10
msnm, 10°15’34’’ N y 66°7’28’’ O (figura 9). La precipitación total anual es 2484 mm,
con distribución bimodal, con máximos en julio-agosto y noviembre-diciembre y la
mínima entre febrero-marzo, por lo cual la estación seca es corta (MARN 1996). De
acuerdo al sistema de clasificación de Holdridge (Ewel y Madriz 1968, cit. Gordon y
Feo 2007), la zona de vida corresponde a un bosque húmedo tropical. El humedal
herbáceo es inundado por el río Colorado, afluente del río Tuy, y está dominado por
Hymenachne amplexicaulis (Poaceae). En algunos sitios del humedal se encuentran
otras especies como: Montrichardia arborescens (L.) Schott, Mimosa sp., Polygonum
acuminatum Kunth, Ludwigia octovalvis (Jacq.) Raven, Ipomoea sp., Ludwigia
helminthorrhiza (Mart.) Hara, Pistia stratiotes L., Eichhornia crassipes (Mart.) Solms.,
Lemna sp., Salvinia auriculata Aubl., Azolla filiculoides Lam. y Utricularia sp. La textura
de los suelos del humedal es arcillosa (72% arcilla, 22,4% limo y 5,6% arena); el
porcentaje medio de materia orgánica total del suelo es 2,7%, y su pH medio 6,4. La
conductividad del agua varía entre 116 y 294,7 mS/cm, y el pH del agua 6-8 (Feo
2002; cit. Gordon y Feo 2007).
Figura 9. Vista satelital del área de estudio (humedal herbáceo de El Clavo). La línea blanca
dibujada en el centro de la imagen señala el transecto levantado en la salida de campo (fuente:
http://earth.google.com/).
43
Se muestrearon dos zonas contiguas de vegetación emergente monoespecífica, en un
sentido suroeste–noreste en la parte más estrecha del humedal (ver en la figura 9 la
línea blanca que señala el transecto). Las especies dominantes en cada zona de
vegetación fueron: (1) la hierba arbórea Heliconia marginata (Heliconiaceae), y (2) la
gramínea Hymenachne amplexicaulis. Las figuras 10a y 10b muestran vistas parciales
de las dos zonas de vegetación estudiadas en el humedal herbáceo de El Clavo.
(a)
(b)
Figura 10. Tomas fotográficas parciales de las dos zonas de vegetación emergente estudiadas:
(a) vista de la amplia zona central de Hymenachne amplexicaulis, en primer plano la zona de
Heliconia marginata que bordea todo el litoral sur; (b) zona de H. marginata (fotos: Carlos
Lugo).
44
Lagunas de inundación del Orinoco bajo. El Orinoco es uno de los ríos más
importantes del mundo, no tanto por su longitud y caudal (2.140 km y algo más de
30.000 m³/s), ni por la extensión de su cuenca (989.000 km²); ni siquiera por las
peculiaridades que encierra, sino por su importancia histórica y económica y la
significación que ha tenido para Venezuela, país en el que se extiende la mayor parte
de su cuenca, con casi las dos terceras partes de la misma. Es probablemente el río
más caudaloso del mundo con relación a su cuenca, similar en extensión a la del
Danubio, pero con un caudal que triplica al de este último. En toda la extensión de la
cuenca del Orinoco los climas son isotermos, es decir, climas con escasas variaciones
de temperatura a lo largo del año (la diferencia entre la temperatura media de los
meses más y menos cálidos es de apenas 3°C), como corresponde a la zona
intertropical. Se distinguen de manera bastante nítida cinco grandes tipos de clima en
las zonas bajas (hasta los 800 msnm aproximadamente, según las consideraciones de
Antonio W. Goldbrunner, fundador de los estudios de Meteorología en Venezuela), de
los que destacan el clima de selva (Af en la clasificación de Köppen) y el de sabana
(Aw en la misma clasificación) (http://es.wikipedia.org/wiki/Cuenca_del_Orinoco). El
clima de sabana es el característico de la zona del Orinoco bajo.
La temporada de sequía se extiende de noviembre a abril y la de lluvia se ubica entre
mayo y octubre (Instituto Nacional de Canalizaciones 1999, cit. Rodríguez y
Betancourt 1999). Como sistema de inundación, el río Orinoco presenta en su orilla
bosques sometidos a inundaciones periódicas. Estos bosques crecen cercanos a las
lagunas, y en las áreas de inundación se desarrollan las macrofitas acuáticas (BlancoBelmonte 1990). Entre las especies de plantas acuáticas dominantes en estas
lagunas, se encuentran las flotantes libres Eichhornia crassipes (bora) y Paspalum
repens (tapón volador).
La figura 11 muestra el área de estudio a orillas del río Orinoco en la ribera sur del
estado Monagas, en las proximidades del puente Orinokia. Se destacan la ubicación y
una fotografía de la laguna Macapaima, uno de los ambientes estudiados en el periodo
seco del año 2010 (Proyecto PDVSA-IZET Orinokia). Algunos tramos son inundados
en forma directa y constituyen lagunas muy alargadas, paralelas y muy próximas al
curso principal; también se forman brazos y canales que comunican a unas lagunas
con otras. La laguna Macapaima es un sistema que se inunda en forma secundaria por
medio de un canal; estas lagunas suelen tener formas redondeadas y no se ubican
contiguas al río Orinoco, sino que más bien algo apartadas tierra adentro. En época de
sequía, estas lagunas redondas suelen quedar aisladas porque bajan los niveles tanto
del curso principal como de los canales.
45
Figura 11. Ubicación geográfica del área de estudio al sur de Monagas (Orinoco bajo), con
detalle de la localización en el mapa y fotografía panorámica de Macapaima, uno de los
cuerpos de agua visitados (foto: Rubén Torres).
Módulos inundables de Mantecal. Los módulos de Mantecal son un caso especial de
manejo agroecológico. En ellos, la regulación del caudal de agua se efectúa mediante
la construcción de diques-carreteras en las sabanas inundables de los Llanos bajos de
Venezuela (Cressa y col. 1993). Estos diques tienen una extensión de 3.600 ha con
una capacidad de 40 x 106 m3 (Schargel y González 1973, cit. Cressa y col. 1993).
Los módulos se encuentran en el centro-norte del estado Apure, próximos a Mantecal
y al curso del río Apure. Mantecal es una población satélite de la pequeña ciudad de
Bruzual, capital del Municipio Muñoz, jurisdicción a la cual el pueblo pertenece
(http://es.wikipedia.org/wiki/Mantecal). El estudio en el ecosistema artificial de los
módulos se llevó a cabo en las postrimerías del periodo lluvioso, transición hacia la
sequía, en noviembre de 2010 (Proyecto Mantecal, IZET).
En casi todo el territorio apureño prevalece una vegetación de sabana, con amplio
dominio del componente herbáceo, entre este último se incluyen abundantes
pastizales que alimentan a numerosas reses de ganado vacuno y bufalino de la zona.
También existen matorrales y arbustos, frecuentemente acompañados de enormes
palmas que agrupadas forman los paisajes de morichales y palmares comunes a todo
46
el llano. Posee también secciones intercaladas de selvas, llamadas "de galería", y en
menor grado, zonas de bosque tropical lluvioso y húmedo montano en las
estribaciones de los Andes. En esteros y márgenes de ríos prolifera la vegetación
acuática (http://es.wikipedia.org/wiki/Apure).
Fosas petroleras. Dentro del marco de estudios de ambientes acuáticos
continentales, se determinó la realización de muestreos de plancton en fosas
petroleras, que son ambientes residuales altamente contaminados derivado de su
empleo como sumideros de desechos de la actividad petrolera comercial. Interesan
además estos ambientes contaminados, por el hallazgo de especies fitoplanctónicas
que suponen ser un gran potencial para la biotecnología petrolera, en procura de la
derivación de biocombustibles (biodiesel).
Muestras compuestas de suelo arenoso, materia vegetal, hidrocarburo y agua, fueron
colectadas de la macro-fosa Caracol en la región de Caico Seco, ubicada en el
municipio Aragua del estado Anzoátegui, en el año 2009. Esta fosa fue escogida por
representar un área de exposición histórica a hidrocarburos que operó durante muchos
años como una de las principales y más grandes recolectoras de desechos petrolíferos
de la zona. La figura 12 muestra un acercamiento a la zona de descarga.
Figura 12. Imagen correspondiente a un sector de la orilla de la fosa El Caracol, (Municipio
Aragua, Edo. Anzoátegui, 2009), donde se pueden apreciar los desechos petroleros que
conforma parte del fondo de la misma (Foto: Olaf Ilzins, IDEA).
47
Igualmente se colectaron muestras de un pozo (P57X) ubicado al norte del estado
Bolívar, 2009. Las muestras provienen en forma específica de una pequeña charca
fangosa en la parte exterior del pozo mencionado, enmarcada en un lugar donde se
encuentra petróleo, ripios y sedimentos de perforación.
Laguna de Boca Chica. Se trata de una laguna costera hipersalina ubicada en la
proximidad de Punta Arenas, en el extremo suroccidental de la península de Macanao,
isla de Margarita, Edo. Nueva Esparta (figura 13). Se trata de un ambiente extremo
donde se han reportado emanaciones naturales de crudos. El sitio fue visitado en julio
de 2009 para obtener algunas muestras fitoplanctónicas.
Figura 13. Ubicación de la laguna de Boca Chica (círculo azul) en la península de Macanao,
isla de Margarita, estado Nueva Esparta (mapa: http://www.disfrutevenezuela.com/MunicipioPeninsula-de-Macanao-Mapa.html).
Mata García (2003) cita en forma textual: “En lo que respecta a Margarita, en un
artículo del año 1919, Charles Caracristi afirmó haber descubierto un mene en Punta
Arenas (Península de Macanao). Aguerrevere (1936), expresa en el mismo orden de
ideas: “... en la región occidental de Margarita, cerca de la Laguna de Bocachica, hay
unas pequeñas manifestaciones de petróleo (...), no quiere esto decir que se haya
comprobado definitivamente que no hay depósitos de valor comercial en ese lugar”.
Lorenz (1951, cit. Mata García 2003), ofreció una explicación de las potencialidades
petrolíferas de Margarita: “La isla de Margarita propiamente ofrece pocas condiciones
favorables para la existencia de yacimientos petrolíferos, en vista de que: 1) el
48
cretácico, por su carácter metamórfico, cabe descartarlo como roca madre; 2) los
sedimentos terciarios no poseen espesores halagadores; 3) estructuras favorables son
inestables o están parcialmente erosionadas”.
Bahía de Mochima. Esta bahía profunda y semi-cerrada, de gran belleza paisajística,
forma parte del Parque Nacional Mochima, Edo. Sucre, en los límites con el Edo.
Anzoátegui, a orillas del mar Caribe. El Parque Nacional Mochima se encuentra
altitudinalmente ubicado desde 0 hasta 600 msnm, al noreste de Venezuela, entre las
ciudades de Barcelona, Puerto la Cruz y Cumaná, y se extiende a lo largo de la costa
en un área de 94.935 ha (http://www.mochima.org/).
El clima del Parque Nacional Mochima es semiárido. En la costa las temperaturas
oscilan entre 22 y 28°C, y existen dos periodos contrastantes: (1) una época seca que
se extiende de enero a mayo, con una media de lluvias de 3,5 mm/mes y (2) una
época lluviosa entre junio y diciembre, con una media de lluvias de 60-70 mm/mes. En
el parque existe una variada vegetación en donde predominan cactus, arbustos,
helechos y orquídeas, encontrándose árboles de mayor tamaño en la zona más alta
del parque. Parte de la flora la conforman los mangles y la hierba de vidrio (Salicornia
fruticosa, Sesuvium portulacastrum y Batis marítima). Se pueden conseguir cactáceas
como el guamacho y leguminosas como el cují y el dividive (http://www.mochima.org/).
En la población de Mochima, ubicada al sur de la bahía, se encuentra la Estación
Biológica Mochima (Sucre), que es una dependencia de la Fundación Instituto de
Estudios Avanzados (IDEA). El proyecto de microalgas (Proyecto BID-Fonacit
2006000537), cuya acometida impulsó la Asociación Civil Gente de Ciencias, está
embebido
en
un
megaproyecto
(Hidrocarburos
Verdes)
de
esta
institución
gubernamental. Por tal motivo, se procedió a la toma de muestras fitoplanctónicas y
zooplanctónicas en esa localidad marina costera, en agosto de 2009, con el interés
especial de colectar especies de microalgas marinas de gran potencial para la
obtención de biocombustibles.
Salinas de Las Cumaraguas. Las Cumaraguas es un sitio natural de salinas,
ubicadas al noreste de la península de Paraguaná, específicamente en el Municipio
Falcón. Su acceso es por vía terrestre. Presentan un espectáculo digno de ver en
horas del atardecer, cuando el tanino que contienen las aguas que irrigan ese sector,
les torna el color a rojizo. El estado Falcón cuenta con grandes potencialidades para el
desarrollo de la industria salinera. Existen cinco (05) salinas naturales y unas 220.000
ha de superficie aptas para la construcción de salinas artificiales repartidas a lo largo
del territorio falconiano. De las salinas del estado, sólo Las Cumaraguas se encuentra
49
bajo explotación industrial y privada, siendo el resto de las salinas explotadas de
manera artesanal (http://www.tuplaya.com/paginasfalcon/salinas/lascumaraguas.htm).
Las coordenadas astronómicas de las salinas de Las Cumaraguas son 12°06’ N y
69°54’ W (Guevara y col. 2005).
Ambientes hipersalinos como Las Cumaraguas y Boca Chica, ambos con condiciones
semi-áridas y precipitaciones escasas, son propicios para el desarrollo de especies
extremófilas que toleran grandes concentraciones de NaCl, como especies del género
Dunaliella (Chlorophyta), las cuales constituyen las fuentes vivientes más ricas en
carotenoides, contando hasta 14% de su masa seca (Guevara y col. 2005), lo que se
traduce en grandes posibilidades para su empleo en biotecnología alimentaria,
farmacéutica y pigmentos. Es por esto que en octubre de 2010, en el marco del
proyecto de microalgas para la exploración de especies nativas de gran valor
biotecnológico, se visitaron las salinas de Las Cumaraguas para obtener muestras de
agua con grandes densidades poblacionales de Dunaliella spp., para apuntar al inicio
de su cultivo en condiciones controladas de laboratorio y optimizar el medio nutritivo.
Puerto Cabello. El muelle de Puerto Cabello está localizado en la ciudad del mismo
nombre, norte del estado Carabobo, región Central de Venezuela, a orillas del mar
Caribe. Se trata de un ambiente marino costero muy perturbado por actividades
antrópicas relacionadas con dinámicas de las faenas portuarias, refineras y el vertido
de efluentes domésticos. La ciudad de Puerto Cabello tiene una población aproximada
de 203.633 habitantes y su puerto es el segundo en importancia para el país, debido a
su gran actividad de importación de materias primas para el sector industrial
venezolano, que normalmente se trasladan hacia Valencia, la capital del estado
Carabobo, y otras regiones del país. El Palito está a la entrada de Puerto Cabello, una
de las refinerías de petróleo más importantes del país. La ciudad también posee
relevancia en el área comercial y turística, pero su actividad por tradición ha sido la
portuaria (http://www.ipapc.gov.ve/).
La temperatura oscila entre 23 y 30°C, con una media anual de 27°C. El clima es
semiárido en la franja litoral con una precipitación anual de 463 mm. En tierra
predomina la vegetación xerófila, y en ambientes estuarinos y marinos costeros se
extiende el bosque de manglar, con el mangle rojo (Rhizophora mangle) como la
especie dominante (http://es.wikipedia.org/wiki/Puerto_Cabello). Se muestrearon
diversos punto en el muelle, en enero de 2011, en procura de evaluar la composición
fitoplanctónica y zooplanctónica del lugar y caracterizar su estado ambiental.
50
El trabajo de campo se ejecutó como se describe a continuación:
Se hicieron muestreos en ambientes parcelados, como humedales herbáceos y
litorales con vegetación, por el modelo de muestreo estratificado sin afijación (número
homogéneo de muestras), que sirvió de muestreo piloto para trabajos posteriores en
los mismos sitios con muestreo por conglomerados con afijación óptima, es decir,
mayor número de muestras se tomaron en lugares con varianzas altas y menor
número en zonas con varianzas bajas (Azorín 1970, Scheaffer y col. 1987). En cada
estrato se tomaron al azar cinco muestras de fitoplancton, para ello se levantaron
parcelas de 2 × 2 m y se escogieron pares ordenados con una tabla de números
aleatorios. Las muestras se colectaron con una botella de captación LaMotte de 1 L,
en forma sistemática desde el borde hasta el centro de la parcela, de este modo sólo
se perturbaron los puntos muestreados, sin alterar el resto. Las muestras de
fitoplancton se fijaron in situ con solución de lugol.
En aguas abiertas (espejos de agua y ambientes marinos costeros), el fitoplancton se
colectó en forma diferente. Tres puntos a lo largo de un transecto, con aleatorización
del tiempo en minutos para la escogencia del primer punto, permitieron tomar dos
muestras puntuales de fitoplancton en cada sitio con una botella LaMotte de 1 L.
Posteriormente, en forma continua se tomaron muestras muy grandes por medio de
dos arrastres horizontales de 5 min con red (øporo = 105 μm) realizados desde una
pequeña embarcación con motor fuera de borda a una velocidad de 2 nudos 2. El
sistema de captura por botella permitió la retención de fitoplancton pequeño
(nanoplancton), pues constituye un tipo de trampa hermética que captura la muestra
con el agua, mientras que la red tomó en forma selectiva microalgas de mayor tamaño.
Como complemento al estudio comunitario, en los mismos ambientes se tomaron
algunas muestras de zooplancton, para conocer la microbiota animal asociada al
fitoplancton. Se tomaron dos muestras con botella LaMotte de 1 L en humedales
herbáceos y ambientes litorales, y dos barridos con red (øporo = 105 μm) en ambientes
abiertos (lagunas de inundación y ambientes marinos costeros). Las muestras se
fijaron in situ con solución de formalina al 10% V/V.
Finalmente, se midieron in situ algunas variables ambientales (pH, conductividad,
salinidad, O2 disuelto y temperatura) con un medidor digital HORIBA U-10, bajo la
2
1 nudo = 1 milla náutica por hora = 0,5144 metros por segundo (SI). Esta definición se basa
en el acuerdo internacional sobre la longitud de la milla náutica, adoptado por EE. UU. (que
utilizaba previamente una longitud de 1.852,249 m) y el Reino Unido (que utilizaba previamente
una longitud de 1.853,184 m), entre otros países (http://es.wikipedia.org/wiki/Nudo_(unidad)).
51
lámina de agua. La radiación solar se determinó como luminancia (densidad de
fotones) con un luxímetro LUTRON-LX y la profundidad con una vara graduada.
Laboratorio. Una vez trasladadas las muestras, éstas se limpiaron y procesaron para
identificar las especies y determinar sus abundancias (conteos en cámara Bogorov
bajo estereoscopio o en cámara Utermöhl bajo microscopio invertido). Las especies
fitoplanctónicas se identificaron con ayuda de claves e ilustraciones: Ortega (1984),
Varela y col. (1986) y Matto y Parra (1995). Para el zooplancton la taxonomía se hizo a
partir de los trabajos de Edmonson (1959), Elster y Ohle (1978), Infante (1980),
Dussart (1984), Reid (1984), Zoppi de Roa y Vásquez (1991), Zoppi de Roa (1993),
Velho y Lansac-Tôha (1996) y Velho y col. (1996).
Para algunas muestras de agua tomadas en un humedal de Barlovento, se hicieron
algunos análisis de nutrientes, principalmente nitrógeno (método de Kjeldahl (1883)) y
fósforo (método de Murphy-Riley (1962)). Las muestras de agua se fijaron en campo
con ácido sulfúrico. De seis puntos muestreados en la zona de H. marginata, las
muestras tomadas en los puntos 1, 2 y 3 estaban muy próximas, por lo que fueron
unidas y se obtuvo una muestra combinada, lo que permitió tener una muestra más
representativa. Los métodos químicos están representados en las figuras 14 y 15.
Para muestras de Paria, algunos nutrientes se determinaron por absorción atómica.
Muestra de
campo fijada con
ácido sulfúrico
Filtración de
la muestra
Destrucción de la
materia orgánica
con ácido sulfúrico
concentrado
Equipo de
destilación
Kjeldahl
Figura 14. Marcha analítica simplificada para la determinación de nitrógeno en muestras de
agua con el método Kjeldahl (1883) (continúa en la página siguiente).
52
Figura 14. Continuación (Fotos de equipo Kjeldahl y sucedáneas tomadas de una presentación
digital del curso de Ecología de Humedales, Postgrado en Ecología, IZET, 2009).
Muestra de
campo fijada
con ácido
sulfúrico
Filtración de
la muestra
Destrucción de la
materia orgánica
con ácido sulfúrico
concentrado
Medición y
curva de
calibración
Figura 15. Marcha analítica simplificada para la determinación del fósforo por el método
colorimétrico de Murphy – Riley (1962). Las dos imágenes inferiores fueron tomadas de una
presentación digital del curso de Ecología de Humedales, Postgrado en Ecología, IZET, 2009.
53
Índices de diversidad. Para el análisis comunitario se cumplieron las pautas
siguientes:
1. Los cómputos del fitoplancton quedaron expresados según el nivel de organización
o forma de vida en células, colonias y filamentos por litro, para el caso de muestras
obtenidas con botella de captación, o en células, colonias y filamentos por metro
cúbico para el caso de muestras tomadas con red. En forma análoga para el
zooplancton, los organismos totales quedaron expresados en individuos por litro
(Ind./L) o individuos por metro cúbico (Ind./m3), según que el método de captura
haya sido por empleo de botella de captación o red, respectivamente. Para la
extrapolación al volumen de arrastre o barrido con red, V, se calculó la distancia, d,
recorrida en bote a partir del tiempo recorrido y la velocidad de la embarcación, la
cual fue aproximadamente constante, resultando un movimiento rectilíneo
uniforme. Esta distancia se multiplicó por el área de la boca de la red, A, que es
circular (A = πr2), obteniéndose el volumen, V, de un cilindro, V = dπr2.
2. La riqueza (S) y la equidad ( J ' ) (Pielou 1975) son dos parámetros comunitarios de
relevancia para caracterizar la diversidad, por lo que fueron calculados. La riqueza
es la sumatoria de las especies presentes en la comunidad y es el índice de
diversidad más sencillo que se conoce. Por su parte, la ecuación que describe a la
equidad es la siguiente:
J ' = H ' /H max = H ' /lnS (8)
Donde H ' es el índice de diversidad de Shannon-Wiener (Shannon y Weaver 1949) y
H max = lnS es la diversidad máxima. El uso del índice de Shannon-Wiener se basa en
suponer que los individuos se muestrean al azar en una población infinita y que todas
las
especies
están
representadas
en
la
muestra.
Este
índice
se
define
matemáticamente como:
S
H ' = -∑pi lnpi (9)
i =1
Siendo pi la fracción de abundancia de la especie i.
3. Se empleó el índice de Simpson, D (Simpson 1949), el cual es un índice de
dominancia y representa la probabilidad de que dos individuos obtenidos al azar de
54
una muestra pertenezcan a la misma especie. Por lo tanto, valores mayores
indican menor diversidad. Su representación matemática es:
S
 n n  1 
D =  i i
 (10)
i =1  N N  1 
El cual normalmente es calculado como:
S
D =  pi2 (11)
i =1
Cuando se utiliza el recíproco de este índice (1/D), los valores son interpretados como
el número de especies esperado de una muestra con una determinada distribución de
individuos en especies. El valor 1/D aumenta cuando la muestra es más equitativa, por
lo cual 1/D tiene un significado biológico más claro que el índice original.
Otro índice de dominancia empleado es el de Berger-Parker (1970):
d=
N máx
(12)
N
Donde:
N máx = número total de individuos de la especie más abundante
N = número total de individuos en la comunidad
Se determinó el índice de similitud o distancia Jaccard (1901), el cual es definido como
la razón entre el tamaño de la intersección y el tamaño de la unión de dos conjuntos
de muestras, por lo que Del Pino y col. (2006) lo clasifican como un índice de
diversidad beta (β), donde se considera la tasa o grado de cambio en la composición
de especies entre diferentes comunidades en un paisaje.
El programa ejecutable libre PAST se utilizó para la determinación de los índices
anteriormente descritos.
Análisis de Datos. El manejo de la información obtenida se hizo con un Análisis de
Datos (Andrienko y Andrienko 2006), que describe el patrón de distribución espacial y
temporal de las especies asociadas a diferentes ambientes. El análisis de datos se
llevó a cabo en tres fases:
1. Descriptiva (análisis de homogeneidad, asimetría y curtosis de las variables,
evaluación de valores extremos). Se establecieron estadísticos robustos para
55
variables con notables asimetrías y valores extremos. Se eliminaron del análisis
especies zooplanctónicas con desviaciones estándares menores a 0,4 Ind./L (Peña
y Rodríguez 2003).
2. Análisis de Componentes Principales (ACP) iterativo para escoger las variables
estadísticamente importantes representadas en gráficos biplot tridimensionales
(Fluir 1988). En este análisis se utilizaron las densidades poblacionales de las
especies fitoplanctónicas (células, colonias y filamentos por litro) y zooplanctónicas
(Ind./L) como variables dependientes aleatorias. Con esta metodología se
seleccionaron las especies que se consideraron más importantes desde el punto
de vista estadístico y que posteriormente se emplearon en el Análisis de
Agrupamiento.
3. Análisis de Agrupamiento o “Cluster Analysis” (Anderberg 1973), con empleo de la
Distancia Euclídea como medida de disimilitud, el método de Ward’s como método
de agrupamiento y las variables dependientes aleatorias escogidas con el ACP:
densidades poblacionales de las especies zooplanctónicas (Ind./L). Se calcularon
los centroides para establecer las especies con mayor ponderación. Un Análisis
Multivariado de Varianza (acrónimo en inglés MANOVA) se utilizó para establecer
diferencias significativas entre grupos (α = 0,05).
Los análisis descriptivos multivariados se realizaron en el software MVSP 3.0. Los
programas JMP versión 3.2.1 (1997) y SPAD versión 3.0 (1999) sirvieron para hacer
Análisis de Datos en general, y MINITAB release 13.20 (2000) fue otra herramienta útil
para evaluar la fase descriptiva.
56
7. Resultados
7.1 Cultivos
Los medios de cultivo empleados para las especies del cepario y la cámara de
crecimiento están listados en la Tabla 5 con sus respectivas fuentes bibliográficas. Es
importante acotar que las temperaturas del cepario (cámara fría sin sistema de
agitación) y la cámara de crecimiento (cámara cálida con sistema de agitación
continua), 24 y 27°C, respectivamente, se mantuvieron constantes a lo largo del
periodo de incubación, pues se trata de un ambiente controlado. Como se puede
observar, el medio algal (Fábregas y col. 1985) fue el de más amplio uso en el
laboratorio, puesto que resultó adaptable a los requerimientos de una gran variedad de
especies de microalgas provenientes de distintos ambientes (dulceacuícola, marino y
salinas). El medio Spirulina (Schlösser 1994) con las modificaciones introducidas por
Parra (2005) funcionó muy bien para todas las cepas de Arthrospira spp. cultivadas en
la Cámara de Crecimiento, y se pudieron escalar en esa misma preparación de placas
y tubos con cuñas a medio líquido en tubos y posteriormente a fiolas.
Tabla 5. Medios de cultivos preparados en laboratorio para crecimiento de poblaciones de
microalgas y modalidades de preparación y recipientes.
Medio de cultivo
Especie
Cepa
Placas/cuñas
(medio sólido
en cápsulas y
tubos)
Spirulina (Schlösser
1994, modificación
del Aiba y Ogawa
1971) + modificación
de Parra (2005)
Arthrospira máxima
Cubana
X
X
X
Arthrospira platensis
Cubana
X
X
X
Arthrospira platensis
Lefevre
X
X
X
Spirulina + agua de
mar (50:50) (Morales,
comunicación
personal) y F/2
(Guillard 1975)
Spirulina subsalsa
C4
X
X
Chu-13 (Dayananda y
col. 2007)
Botryococcus braunii
UTEX572
X
X
X
Nannochloropsis sp.
MAD1
X
X
X
Tetraselmis sp.
TE
X
X
X
Isochrysis galbana
Nueva
Esparta
X
X
Chlamydomonas sp.
–
F/2 (Guillard 1975)
Medio Algal
(Fábregas y col. 1985)
57
X
Tubos
(medio
líquido)
Fiolas (medio
líquido)
X
Tabla 5. Continuación.
Medio de cultivo
Medio Algal
(Fábregas y col. 1985)
Medio Algal con
adición de silicatos
Medio Algal con
adición de agua de
mar
Medio Algal con
adición de solución
saturada de NaCl
(grado alimenticio)
Serpa y Calderón
(2006)
Bristol (Bold 1949)
Especie
Cepa
Placas/cuñas
(medio sólido
en cápsulas y
tubos)
Chlorella vulgaris
–
X
X
Scenedesmus sp.
–
X
X
Chaetoceros sp.
–
Porphyridium
cruentum
C1
X
X
Rhodosorus marinus
C2
X
X
Tetraselmis sp.
TE
X
X
Dunaliella salina
–
X
X
Dunaliella viridis
–
X
Dunaliella
primolecta
DPN
X
Dunaliella salina
–
Dunaliella viridis
–
X
Dunaliella
primolecta
DPN
X
Haematococcus
pluvialis
HPOC8
X
Tubos
(medio
líquido)
Fiolas (medio
líquido)
X
X
X
X
Una evaluación microscópica de las diferentes cepas, cultivadas en la cámara fría sin
agitación y la cámara cálida o de crecimiento rápido con agitación, pudo comprobar
que los cultivos estaban en buen estado (monoalgales y poco detrito), donde las cepas
cubanas de A. platensis y A. maxima mostraron filamentos helicoidales, si bien en
poblaciones de la segunda se evidenciaron algunos filamentos lineales. Por su parte,
la cepa Lefevre de A. platensis se caracterizó por mostrar una población integrada en
forma absoluta por filamentos lineales en todas las “réplicas” ubicadas en la Cámara
de Crecimiento. La figura 16 muestra un conjunto de fotografías tomadas con una
cámara digital PAX-CAM acoplada al microscopio invertido y al computador, lo que
permitió visualizar los filamentos con alta resolución y detectar el estado de pureza de
los cultivos. Durante todo el periodo de mantenimiento, las observaciones al
microscopio no detectaron invasiones de otras especies de microalgas.
58
Figura 16. Algunas imágenes tomadas bajo microscopio invertido de las poblaciones de las
diferentes cepas de Arthrospira spp. en la Cámara de Crecimiento (LOA-IZET).
59
Fig. 16. Continuación.
La cianobacteria Spirulina subsalsa se cultivó en medio Spirulina + agua de mar
(50:50), puesto que la cepa existente en la colección proviene de un ecosistema
estuarino. Los cultivos fueron viables y las poblaciones crecieron de modo rápido. Sin
embargo, una observación que se hizo recurrente en estos cultivos, es que una vez
que las poblaciones eran grandes, se iniciaba la formación de grandes colonias de
filamentos muy adosados entre sí (grandes flóculos), y que además segregaban una
sustancia mucilaginosa abundante y viscosa que envolvía a las colonias y, al cabo de
pocos días, dicha sustancia mezclada con sal precipitada del medio se endurecía y
conformaba una especie de cascarón. La consecuencia de esto es que las colonias de
filamentos se fijaban a las paredes del recipiente, y no podían ser desprendidas, aún
con la agitación constante del aire presurizado enviado del blower. Como fórmula
alternativa, S. subsalsa fue cultivada en medio F/2. Esta modificación de medio derivó
en un resultado positivo consistente en la no formación de las capas cementantes
evidenciadas en el medio Spirulina + agua de mar (50:50), pero en contraposición a
ello las poblaciones no incrementaron su tamaño en la forma que lo hacían en el
medio anterior, las mismas se mantuvieron en flóculos pequeños y dispersos con una
coloración verde menos intensa que el caso citado.
60
Otras especies de la colección. En términos generales, los medios funcionaron,
salvo el medio Algal para Dunaliella primolecta y el medio Serpa y Calderón (2006)
para todas las especies del género Dunaliella, puesto que las cepas no pudieron
adecuarse a los mismos bajo las condiciones de la Cámara de Crecimiento. Algunas
de las fiolas con cultivos de D. salina y D. viridis en medio Algal exhibieron
crecimientos poblacionales notables, dada la coloración verde que adquirieron y no
incolora como en D. primolecta. Algunas de las cepas que han crecido exitosamente
en fiolas de 250 mL se trasladaron a fiolas de 2000 mL, y han podido replicarse. No
obstante, dos cultivos en fiolas de 250 mL de D. viridis en buen estado de crecimiento
al ser unidas y llevadas a una fiola de 2000 mL con medio nuevo no pudieron
adecuarse y permanecieron en estado de latencia.
Una especie que ha crecido muy bien en fiolas pequeñas y se ha trasvasado a fiolas
grandes es la clorofita dulceacuícola Haematococcus pluvialis. Esta microalga ha
permanecido en una fase de crecimiento rápido con poblaciones sanas y libres de
contaminación por otras especies de microalgas. El color que siempre se ha
observado en los cultivos de esta especie es un verde oliva, el cual es típico de una
población con una estructura de células jóvenes, y no la coloración roja púrpura
predominante en una población de células maduras en condiciones de estrés.
Los cultivos de las especies Botryococcus braunii, Nannochloropsis sp. y Tetraselmis
sp., especies de particular interés en la producción de biocombustibles, se
mantuvieron en muy buen estado. La primera especie creció bien en medio Chu-13
(Dayananda y col. 2007) y las otras dos hicieron lo propio en el medio F/2 (Guillard
1975). Las tres especies pudieron ser escaladas a fiolas de 2000 mL en la cámara
cálida, y el crecimiento poblacional fue óptimo. Como observación curiosa, uno de los
cultivos de B. braunii en fiolas sedimentó, las células formaron grandes colonias y al
parecer produjeron una sustancia cementante que las adhirió al fondo y paredes del
recipiente de vidrio, a pesar de que el sistema de la cámara cálida contó con agitación
fuerte por medio de aireación presurizada. La figura 17 muestra una serie de
fotografías donde se evidencia la condición monoalgal de los cultivos de estas
especies, y sólo algunos animales (rotíferos) y protozoarios (ciliados) han sido
observados.
Finalmente, como se presentó en la Tabla 5, algunas especies cultivadas, como
Chlamydomonas sp., Chlorella vulgaris y Chaetoceros sp., no pudieron ser escaladas
a fiolas, bien sea porque sus tamaños poblacionales eran pequeños y permanecieron
en tubos de ensayo dentro de la cámara fría, o algunas fueron trasvasadas y no
pudieron crecer a mayores volúmenes (efecto de dilución).
61
Figura 17. Algunos cultivos de microalgas de interés biotecnológico presentes en la Cámara de
Crecimiento (LOA, IZET).
62
Figura 17. Continuación.
63
Figura 17. Continuación.
64
7.2 Ensayos con poblaciones cultivadas de Arthrospira platensis
Los ensayos con poblaciones de Arthrospira platensis tuvieron como punto de partida
un ensayo factorial 22 preliminar en dos bloques (cilindros y fiolas). Se prepararon
cuatro medios combinados: medio Spirulina (Schlösser 1994) con modificaciones de
Parra (2005), renombrado en este ensayo como medio Parra (– +), medio estándar
original de Aiba y Ogawa (1977) (+ –), medio máximo (+ +) y medio mínimo (– –). La
Tabla 6 muestra las concentraciones milimolares de los macronutrientes en las cuatro
combinaciones resultantes, con atención en los niveles de dos cationes alcalinos (Na+
y K+), cuyas concentraciones fueron modificadas de tal manera que no se afectaran
las concentraciones del resto de los iones. El ion cloruro (Cl-) por estar estrechamente
relacionado con el ion sodio (Na+), incrementó su concentración milimolar con gran
notoriedad en los medios donde el nivel de sodio fue máximo (+). En este primer
ensayo la relación milimolar Na+:K+ no es 4:1 para el medio – + ó Parra.
Tabla 6. Concentraciones milimolares (mM) de los macronutrientes totales (representados
como elementos, a excepción del carbono que se representa en las formas de los aniones
carbonato y bicarbonato) y relaciones milimolares sodio/potasio en los cuatro medios minerales
comparados en el diseño factorial 22. En rojo se destacan las concentraciones milimolares de
+
+
+
Na y K , y en azul las de Cl , anión directamente involucrado con el Na .
Macronutrientes
totales
N
P
–+
+–
++
––
4,63
0,77
4,85
0,51
4,72
0,77
4,63
0,77
K
Mg
2,31
0,08
3,86
0,08
9,19
0,08
2,31
0,08
Ca
0,04
0,07
0,07
0,04
S
0,11
1,17
0,20
0,11
Na
60,66
75,21
80,89
60,66
Cl
CO32
0,85
10,51
43,55
0,85
21,83
21,83
15,71
21,83
HCO3
110,23
117,67
103,97
110,23
Na+/K+
26,2
19,5
8,8
26,2
Las figuras 18a y 18b muestran las curvas de crecimiento poblacional de A. platensis
en los cuatro medios de cultivo y dos tipos de cultivadores, fiolas y cilindros,
respectivamente. Las curvas de crecimiento muestran que el medio Aiba y Ogawa
propició mayor incremento poblacional de A. platensis en cilindros a los 20 días de
incubación, tiempo en el cual se detuvo el experimento. En fiolas, las cinéticas en los
medios Aiba – Ogawa y Parra tuvieron gran similitud. Para ambos tipos de recipientes,
65
el medio + + sucedió a los anteriores. Puede observarse que el medio – – se
caracterizó por presentar un período de latencia y adecuación muy prolongado, hasta
que la población empezó a crecer abruptamente a partir del día 15. No obstante, entre
este tratamiento y los demás no hubo diferencias significativas (α = 0,05).
2,500
2,000
A 680
1,500
1,000
0,500
0,000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 1617181920
(a)
3
2,5
A 680
2
1,5
1
0,5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
T iempo (días )
Aiba y Ogawa
Mínimo (– –)
Máximo (+ +)
Parra
(b)
Figura 18. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en (a) fiolas y (b)
cilindros. La densidad poblacional está expresada en términos de absorbancia a 680 nm.
La figura 19 presenta una comparación gráfica de la producción de biomasa seca en
los cuatro medios propuestos para el ensayo factorial. Como se puede evidenciar el
medio Aiba y Ogawa una vez más resultó ser el más productivo en cilindros y fiolas. El
medio Parra tuvo en fiolas una producción de biomasa que casi iguala a la del Aiba y
Ogawa, pero comparativamente baja en cilindros. El medio + + tuvo una producción
similar en ambos tipos de recipientes, y la cosecha del medio – – tuvo una producción
muy baja en los dos envases, siendo ligeramente superior en cilindro. En este ensayo
se apreció que hubo diferencias significativas entre fiolas y cilindros para los
tratamientos – – y Parra, así como entre el medio – – y los medios restantes para
ambos recipientes. La dispersión de datos (desviaciones estándares) fue pequeña.
66
2
1,8
1,6
Biomasa (g/2L)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Mínimo (– –)
Máximo (+ +)
Parra
Fiola
Aiba y Ogawa
Cilindro
Figura 19. Producción de biomasa seca en fiolas y cilindros de 2 L para cada medio mineral. La
biomasa está expresada en gramos por dos litros. Intervalos de confianza: media desviación
estándar.
Los valores de pH de los cuatro medios ensayados caracterizaron el ambiente químico
donde crecieron los filamentos de A. platensis durante el periodo de incubación. Los
medios Aiba y Ogawa, Parra y + + exhibieron un gran paralelismo a lo largo de los
días del ensayo con una tendencia hacia el incremento. En contraste, el medio – –
mostró una tendencia inversa, al iniciar con un pH más alto que los otros tres medios y
después decrecer, hasta que en los últimos 5 días experimentó un nuevo aumento, el
cual coincidió con el comienzo del crecimiento rápido de A. platensis en ese medio,
luego de una latencia y adecuación prolongadas. Durante el lapso en el que el pH bajó
para el medio mínimo, aparentemente desfavorable para A. platensis, prosperó otra
especie de cianobacteria oportunista, Microcystis aeruginosa, la cual desapareció del
medio una vez el pH volvió a subir y A. platensis volvió a dominar (figura 20).
10,40
10,20
10,00
pH
9,80
9,60
9,40
9,20
9,00
Contaminación del medio
por Microcystis aeruginosa
8,80
8,60
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tiempo (días)
Mínimo (– –)
Máximo (+ +)
Parra
Aiba y Ogawa
Figura 20. Valores comparativos de pH mostrados por los diferentes medios de cultivo. En la
figura se señala con un óvalo rojo el lapso de disminución de pH del medio – – y la
contaminación del mismo por la cianobacteria Microcystis aeruginosa.
67
La conductividad eléctrica se mantuvo constante en todos los medios a lo largo del
periodo de incubación, y resultó similar para los medios Parra y Aiba - Ogawa,
mientras que para el medio máximo (+ +), los valores de conductividad resultaron
ligeramente mayores por su condición de medio enriquecido. Por su parte, el medio
mínimo (– –) tuvo valores muy inferiores y paralelos a los registrados para los medios
anteriores (figura 21).
30,00
Cond. (S/cm)
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tiempo (días)
Mínimo (– –)
Máximo (+ +)
Parra
Aiba y Ogawa
Figura 21. Valores comparativos de conductividad (S/cm) mostrados por los diferentes medios
de cultivo.
En la figura 22 se observa la relación entre la absorbancia de la masa celular y el peso
seco de la misma. La curva muestra una tendencia lineal que fue evaluada con una
regresión lineal simple, con un coeficiente de regresión R2 = 0,9935, que evidencia una
correlación fuerte. Se calculó el peso seco de la masa celular presente en 1000 ml de
cultivo, en base a la linealidad de la fase de crecimiento rápido, con la obtención del
Absorbancia (λ = 680 nm)
valor medio de 586 mg (0,586 g/L) de masa seca de A. platensis en ese volumen.
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
y = 0,0011x + 0,0578
R² = 0,9935
0
200
400
600
800
1000
1200
Peso seco (mg)
Figura 22. Curva de calibración A680 vs. Peso seco (mg). Las variables tienen una relación
lineal (R2 = 0,9935).
68
El experimento factorial 2 2 se replicó en un nuevo conjunto de fiolas, donde hubo un
reajuste de las concentraciones de los medios nutritivos del ensayo anterior (Tabla 7).
En este nuevo ensayo, la nomenclatura de los medios varió, el medio 1 corresponde al
anteriormente mencionado medio Parra, el medio 2 es el Aiba y Ogawa, el medio 3
corresponde al medio máximo (+ +) y por último el medio 4 es el mínimo (– –). Se
logró un mejor arreglo de las combinaciones milimolares de los macronutrientes, para
obtener en el medio 1, con la modificación de Parra (2005), una relación Na+:K+ bien
aproximada a la relación fisiológica normal de estos dos cationes en células vivas, lo
que no se consiguió en el primer perfil nutricional.
Tabla 7. Concentraciones milimolares totales de los macronutrientes que integran cada uno de
los medios de cultivo preparados. En rojo se destaca la relación 4:1 de K y Na en el medio 1.
Nutriente
Medio 1
Medio 2
Medio 3
Medio 4
N
29,44
29,40
29,86
29,90
P
2,87
2,87
3,33
3,30
K+
63,75
17,22
18,07
17,22
Mg2+
0,81
0,81
0,81
0,81
Ca2+
0,27
0,27
0,27
0,26
SO42-
6,60
6,60
1,34
0,86
Na+
238,07
284,60
282,62
238,06
Cl-
17,65
17,65
75,83
1,40
CO32-
38,70
38,70
27,85
38,70
HCO3-
162,02
162,02
143,16
163,02
16,5
15,6
13,8
Na+/K+
3,73
4
La figura 23 muestra las curvas de crecimiento poblacional de A. platensis en los
cuatro medios de cultivo. Como en el ensayo anterior, los medios 1 y 2 presentaron
cinéticas similares, aunque la pendiente del segundo supera un poco a la del primero.
La curva del medio 3 tiene la tercera pendiente más alta, mientras que en la curva de
crecimiento correspondiente al medio 4 se aprecia que la fase de latencia es muy
prolongada y la población rápidamente crece los últimos 5 días del ensayo. La fase de
69
crecimiento rápido de todas las curvas presentó una fuerte tendencia lineal. En
ninguno de los casos se alcanzó el plateau o capacidad de carga.
2,500
A680 = 0,1619t + 0,0473
2
R = 0,9991
2,000
A680 = 0,1612t + 0,0136
2
R = 0,9969
A680
1,500
A680 = 0,1471t + 0,0124
R2 = 0,9986
1,000
A680 = 0,1426t + 0,0404
R2 = 0,9968
0,500
0,000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Tiempo (días)
Medio 1
Medio 2
Medio 3
Medio 4
Figura 23. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de cultivo. En la
fase de crecimiento rápido A680 y el tiempo presentaron correlaciones lineales fuertes, como se
evidencia en los valores del coeficiente de determinación (R2).
La figura 24 exhibe las curvas de crecimiento para el segundo ensayo, ahora con
densidades poblacionales. Se evidencian tendencias similares a las observadas con
valores de absorbancias, la pendiente del medio 2 supera en forma ligera a las de 1 y
3, y en el medio 4 hubo un crecimiento muy lento y desfasado de los otros, por la
prolongada fase de latencia y adecuación. Las capacidades de carga no fueron
Densidad (filamentos/L)
alcanzadas y no se encontraron diferencias significativas (α = 0,05) entre los medios.
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Tiempo (días)
Medio 1
Medio 2
Medio 3
Medio 4
Figura 24. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de cultivo
(filamentos por litro) en la Cámara de Crecimiento.
70
La Tabla 8 resume los principales resultados obtenidos en el ensayo. Las tasas de
crecimiento per cápita (r) se calcularon entre los días 7 y 10. Los mayores valores de
r, capacidad de carga (K) y producción de biomasa correspondieron al medio 1. La
población que creció en el medio 3 presenta una tasa per cápita ligeramente menor a
los medios 1 y 2. Los medios 1, 2 y 3 tuvieron valores de pH inicial y final muy
próximos con una tendencia al aumento, el medio 4 mostró valores similares.
Tabla 8. Tasa de crecimiento per cápita de Arthrospira platensis en la fase de crecimiento
rápido, biomasa seca producida en cada medio de cultivo y pH inicial y final.
Medio
Parámetros poblacionales
r (días-1)
K (filamentos/L)
1
0,50
412.900
2
0,48
3
4
Biomasa seca (g/L)
pH
Inicial
Final
0,840
9,12
10,15
390.300
0,797
9,17
10,16
0,30
321.800
0,717
9,19
10,04
0,01
–
0,243
9,70
9,86
En la siguiente etapa de escalamiento, se realizó el primer diseño multifactorial a cielo
abierto en botellones de 5 L. Los ensayos produjeron, en periodos de incubación
uniformes (28 días), curvas de crecimiento logísticas con amortiguaciones monótonas
y oscilaciones amortiguadas sostenidas y crecientes (figura 25).
La inmensa mayoría de los tratamientos siguieron la dinámica de una típica curva
sigmoidea, que gráficamente representa el modelo logístico de crecimiento
poblacional. Las curvas se caracterizaron por presentar una fase inicial de crecimiento
lento (latencia y adecuación), donde incluso en algunos cultivos se evidenciaron
decrecimientos entre los días 1 y 4. A esta fase de crecimiento lento o estacionario le
siguió otra de crecimiento rápido o exponencial, la cual duró tres (3) días en la mayoría
de los tratamientos. Finalmente, después del punto de inflexión de la curva el
crecimiento empezó a amortiguarse hasta alcanzar el estado de saturación (plateau),
donde la mayoría de las poblaciones se estabilizaron una vez fue alcanzada la
capacidad de carga del ambiente (medio de cultivo).
Varios tratamientos alcanzaron un equilibrio estable con atenuación monótona
(“monotonic damping”) en el valor de la capacidad de carga ( K), mientras que algunas
poblaciones
alcanzaron
dicha
capacidad
de
carga
con
oscilaciones,
unas
amortiguadas y otras sostenidas, lo que puede atribuirse a algún retraso temporal en
el efecto de la densidad. Algunos tratamientos como el 6, 22, 26, 28 y 29 no
alcanzaron el plateau y los cultivos continuaron un crecimiento indefinido, en la
71
mayoría de los casos con marcadas oscilaciones. Por su parte, la curva del
tratamiento 19 alcanzó la capacidad de carga a una absorbancia muy inferior a los
medios más productivos, pero claramente muestra un patrón de oscilaciones
amortiguadas.
Tratamiento 2
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 1
1,000
0,500
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
16
19
22
25
28
19
22
25
28
19
22
25
28
Tratamiento 4
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 3
1,000
0,500
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
13
16
Tiempo (días)
Tratamiento 6
Tratamiento 5
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
13
Tiempo (días)
1,000
1,000
0,500
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
1
28
4
7
10
13
16
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Figura 25. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis obtenidas en un ensayo
factorial fraccionado 26-1 con combinaciones aleatorias de niveles mínimos y centrales de cinco
macronutrientes (tratamientos). La densidad poblacional fue medida indirectamente con la
absorbancia a una longitud de onda de 680 nm, correspondiente al rojo dentro del espectro
visible, pico de absorción de la clorofila a.
72
Tratamiento 8
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 7
1,000
0,500
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
1,000
0,500
19
22
25
28
19
22
25
28
19
22
25
28
19
22
25
28
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
13
16
Tiempo (días)
Tratamiento 12
Tratamiento 11
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
16
Tratamiento 10
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 9
1,000
1,000
0,500
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
1
28
4
7
10
13
16
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Tratamiento 13
Tratamiento 14
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
13
Tiempo (días)
1,000
0,500
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
Tiempo (días)
4
7
10
13
16
Tiempo (días)
Figura 25. Continuación.
73
Tratamiento 16
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 15
1,000
1,000
0,500
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
1
28
4
7
10
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
1,000
0,500
19
22
25
28
19
22
25
28
19
22
25
28
19
22
25
28
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
13
16
Tiempo (días)
Tratamiento 19
Tratamiento 20
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
16
Tratamiento 18
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 17
1,000
0,500
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
13
16
Tiempo (días)
Tratamiento 21
Tratamiento 22
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
13
Tiempo (días)
Tiempo (días)
1,000
1,000
0,500
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
1
28
4
7
10
13
16
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Figura 25. Continuación.
74
Tratamiento 24
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 23
1,000
0,500
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
1,000
0,500
19
22
25
28
19
22
25
28
19
22
25
28
19
22
25
28
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
13
16
Tiempo (días)
Tratamiento 28
Tratamiento 27
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
16
Tratamiento 26
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 25
1,000
1,000
0,500
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
1
28
4
7
10
13
16
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Tratamiento 29
Tratamiento 30
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
13
Tiempo (día)
1,000
1,000
0,500
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
1
28
4
7
10
13
16
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Figura 25. Continuación.
75
Tratamiento 32
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 31
1,000
0,500
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
16
19
22
25
28
19
22
25
28
19
22
25
28
Tratamiento 34
2,500
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
A680 nm
Tratamiento 33
1,000
0,500
1,000
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
1
4
7
10
Tiempo (días)
13
16
Tiempo (días)
Tratamiento 36
Tratamiento 35
2,500
2,000
2,000
1,500
1,500
A680 nm
2,500
1,000
1,000
0,500
0,500
0,000
0,000
1
4
7
10
13
16
19
22
25
1
28
4
7
10
13
16
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Tratamiento 37
2,500
2,000
A680 nm
A680 nm
13
Tiempo (días)
1,500
1,000
0,500
0,000
1
4
7
10
13
16
19
Tiempo (días)
Figura 25. Continuación.
76
22
25
28
La tasa per cápita de crecimiento, ΔN/[N(t)Δt], presenta un incremento notable en
algunas curvas para los primeros días. Casi todas las curvas coincidieron en el día 10
como tiempo tope del crecimiento aparentemente exponencial, donde es válido
aproximar la tasa per cápita de crecimiento al valor r. Posteriormente a este lapso de
tiempo, el crecimiento disminuye progresivamente hasta llegar al equilibrio en K. La
población decreció hasta cero (ΔN/Δt = 0), en todas los casos donde la capacidad de
carga, K, se alcanzó. Para algunos tratamientos se observaron decrecimientos en los
primeros tres días (ΔN/Δt < 0), antes del inicio del crecimiento rápido, principalmente
en las curvas correspondientes a los tratamientos 2, 3, 4, 12, 18, 25, 32 y 35, lo que
revela fases de latencia y adaptación marcadas por parte de las poblaciones de A.
platensis. La Tabla 9 resume las tasas de crecimiento per cápita (días-1) para tres
intervalos de tiempo en fase de crecimiento rápido, así como las capacidades de carga
(filamentos/L) para el método de conteo de filamentos.
Tabla 9. Tasas de crecimiento per cápita y capacidades de carga en cultivos de Arthrospira
platensis para el ensayo factorial fraccionado 26-1. En rojo se destacan los medios con valores
mayores para uno o ambos parámetros poblacionales obtenidos de forma experimental.
Tratamiento
Tasa de crecimiento per cápita (días-1)
Capacidad de carga, K
(filamentos/L)
Días 7 – 10
Días 10 – 13
Días 13 – 16
1
0,22
0,21
0,11
762.000
2
0,12
0,16
0,06
812.000
3
0,44
0,35
0,22
658.500
4
0,20
0,114
0,08
785.000
5
0,20
0,17
0,10
–
6
0,15
0,12
0,05
–
7
0,46
0,42
0,37
630.500
8
0,42
0,40
0,25
654.700
9
0,41
0,32
0,20
616.870
10
0,45
0,40
0,27
–
11
0,30
0,25
0,17
523.540
12
0,29
0,22
0,11
722.520
13
0,68
0,41
0,28
522.410
14
0,82
0,75
0,52
739.750
15
0,54
0,40
0,29
740.165
16
0,85
0,81
0,70
1.782.960
17
0,65
0,50
0,32
789.875
18
0,72
0,54
0,35
1.425.000
19
0,37
0,30
0,21
374.100
20
0,18
0,19
0,10
730.589
21
0,21
0,20
0,12
798.500
77
Tabla 9. Continuación.
Tratamiento
Tasa de crecimiento per cápita (días-1)
Capacidad de carga,
K (filamentos/L)
Días 7 – 10
Días 10 – 13
Días 13 – 16
22
0,18
0,17
0,09
–
23
0,23
0,15
0,10
851.450
24
0,37
0,30
0,16
730.215
25
0,41
0,35
0,22
831.230
26
0,16
0,12
0,08
–
27
0,45
0,39
0,30
730.257
28
0,27
0,18
0,14
–
29
0,84
0,71
0,69
–
30
0,20
0,21
0,11
–
31
0,25
0,22
0,12
–
32
0,19
0,11
0,07
–
33
0,82
0,74
0,64
1.932.680
34
0,51
0,45
0,40
1.747.890
35
0,10
0,11
0,05
301500
36
0,75
0,65
0,51
2.520.000
37
0,70
0,51
0,32
2.050.000
La figura 26 describe en orden creciente los tiempos de duplicación (tg) para
poblaciones inoculadas en 37 botellones con los tratamientos preparados. Para la
obtención de estos valores se utilizó la tasa de recambio entre los días 7 y 10, en la
fase de crecimiento rápido, como valor de la tasa de crecimiento poblacional, dado que
al día 10 las poblaciones duplicaron sus tamaños. Algunos de los tratamientos con las
mejores dinámicas de crecimiento poblacional, como los tratamientos 14, 16, 18, 29,
33, 36 y 37 estuvieron entre los medios con tiempos generacionales más cortos (de
0,8 a 1 día), y algunos con dinámicas menos eficientes tuvieron tiempos
generacionales más prolongados, como 2, 6 y 32. El tratamiento 2 tuvo un tiempo de
duplicación muy prolongado (6,5 días), a pesar de ostentar una de las capacidades de
carga más elevadas, pero el gran retraso inicial producto de una latencia y adecuación
prolongadas, desplazó con mucho el inicio de la fase crecimiento rápido, alcanzando el
plateau aproximadamente a los 18 días, cuando poblaciones en otros medios lo
habían logrado de 10 a 15 días. Algo similar se puede decir del medio 35 que tuvo el
valor de tg más alto de todos los tratamientos. El medio 16 presentó el tiempo de
duplicación más corto (0,8 días), esto debido a una tasa de crecimiento per cápita muy
alta en la fase exponencial, lo que permitió a la población salir prontamente de una
breve fase de latencia y alcanzar el plateau un poco antes de los diez (10) días.
78
Figura 26. Diagrama de
columnas mostrando en orden
creciente los tiempos de
duplicación
(tg)
de
los
diferentes tratamientos del
ensayo multifactorial.
79
El medio más productivo en biomasa fue el tratamiento 36 (aprox. 2,3 g/L), mientras
que el tratamiento 29 resultó el menos rendidor. Varios de los medios (16, 18, 33 y 36)
que mostraron los tg más bajos, también se constituyeron en los más productivos en
biomasa seca (figura 27). Un tiempo de duplicación corto implica que la producción de
biomasa será elevada en un término de tiempo breve, a la vista están los resultados
que indican que los tratamientos con tiempos generacionales menores alcanzaron la
capacidad de carga en un número de días inferior, alrededor de 10 días, y entonces
los 20 días restantes del ensayo permitieron generar un rendimiento superior de
biomasa para fines de producción masiva a escala mayor.
El análisis de varianza para las diferentes combinaciones aleatorias y niveles centrales
de cinco macronutrientes, para la variable respuesta densidad óptica o absorbancia,
determinó diferencias significativas (α = 0,05) para las sales que constituyen la
solución I del medio Spirulina. Esto repercutió en forma determinante en las dinámicas
poblacionales tan variables que se observaron en cada uno de los medios nutritivos.
De este análisis estadístico se desprende que las fuentes de carbono (NaHCO3 y
Na2CO3) y fósforo (KH2PO4), así como el efecto del modelo o diseño empleado,
resultan concluyentes para evidenciar diferencias significativas en los crecimientos de
las poblaciones de A. platensis, donde hubo combinaciones aleatorias de esos
componentes químicos esenciales para el desarrollo y replicación de los filamentos. El
nitrógeno, otro nutriente relevante en la nutrición mineral de A. platensis, no tuvo
efecto significativo en las cinéticas evidenciadas (Tabla 10).
Tabla 10. Análisis de varianza para el diseño factorial fraccionado 26-1 (salida del programa
Design Expert). Los números destacados en rojo son valores de p<0,05.
Fuente
Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
Medio
F
p
Modelo
4,18
16
0,26
4,88
0,0007
NaHCO3
Na2CO3
KH2PO4
NaCl
K2SO4
KNO3
1,19
0,43
0,25
8,32E+00
0,18
0,12
1
1
1
1
1
1
1,19
0,43
0,25
8,32E+00
0,18
0,12
22,32
8,12
4,76
0,16
3,42
2,21
0,0001
0,0102
0,0418
0,6978
0,0799
0,1532
A partir de estas determinaciones, se escogió el tratamiento 36 como el óptimo para
ser probado en ensayos a escala mayor. Esta decisión deriva del análisis de las
interacciones de la biomasa con las concentraciones milimolares de los nutrientes más
importantes en la ejecución del experimento, siendo el 36 uno de los tratamientos
centrales (ver Apéndice 2), con mejores valores de parámetros y biomasa.
80
BS (g/L)
2,500
2,000
1,500
1,000
6
11 10
1
4
15
3
22
2
27
5
14
Orden creciente de biomasa seca
17 12 31 26
8
20 24 35 13
9
16 23 33 18 34 37 21
7
36
81
0,500
0,000
29 19 30 25 28 32
Tratamiento
Figura 27. Biomasa seca
(g/L) cosechada en los
diferentes tratamientos del
ensayo factorial 26-1. Los
valores se ordenan en
forma creciente.
La figura 28 muestra el resultado de un ensayo para establecer en forma experimental
la estructura de tallas de la población de A. platensis. El resultado evidencia que las
proporciones de tallas efectivamente varían a lo largo del periodo de crecimiento de la
población. En un principio (días 0 a 6) predominan los filamentos pequeños (2 – 4
células). Una vez que las fases de latencia y adecuación ocurren y dan paso a la fase
de crecimiento rápido, los porcentajes de filamentos cortos o “jóvenes” disminuyen en
forma sistemática, y filamentos “maduros” rápidamente comienzan a aumentar sus
números hasta llegar a la fase de saturación (capacidad de carga) y porcentualmente
ser las tallas predominantes en la estructura de la población.
Día 0
3%
32%
Día 6
5%
65%
53%
2 células
2 células
4 células
4 células
> 4 células
> 4 células
42%
Día 12
17%
Día 18
53%
42%
2%
45%
2 células
2 células
4 células
4 células
> 4 células
> 4 células
41%
Día 24
Día 30
1%
67%
1%
32%
15%
2 células
2 células
4 células
4 células
> 4 células
> 4 células
84%
Figura 28. Diagramas circulares que muestran las variaciones porcentuales en grupos de
filamentos de diferentes tallas en una población de Arthrospira platensis, a lo largo de un
periodo de incubación que duró 30 días. La cepa se cultivó en el medio optimizado en el
6-1
ensayo factorial fraccionado 2 (tratamiento 36).
A continuación se presentan tres gráficos de barras y cajas combinados (en inglés “bar
chart/box plot”) que brindan información de la dinámica de crecimiento de los tres
82
componentes poblacionales de filamentos discriminados por sus tallas y la dispersión
de los datos (desviaciones estándares), respectivamente. Se verifica que la cohorte de
filamentos con dos células tiene un crecimiento poblacional vigoroso y sostenido hasta
el día 12 cuando alcanza un máximo, y desde este punto crítico empieza a declinar de
forma rápida hasta valores ínfimos al final del periodo cuando la población se
estabiliza y es madura. Los filamentos con cuatro células tienen una dinámica similar
(patrón unimodal) a la exhibida en el perfil de los filamentos más cortos de dos células,
pero con un desfase, alcanzando el máximo el día 18 y luego, como en el caso
anterior, declina la población a niveles basales hacia postrimerías del tiempo de
crecimiento asintótico. El tercer conjunto de tallas, correspondiente a filamentos con
más de cuatro células, posee una dinámica tardía respecto a los dos primeros, puesto
que la población se incrementa luego de que se han formado muchos filamentos
cortos que empiezan a crecer radialmente y sumar células al filamento, de este modo
la población de filamentos grandes empieza a ser ampliamente dominante al final del
periodo de crecimiento y se estabiliza con ligeras fluctuaciones en el estado de
saturación. Los datos medios, que son los que se grafican, presentaron poca
dispersión, lo que puede mostrarse como una aproximación experimental a una
1,8E06
6,4E05
1,6E06
5,6E05
1,4E06
4,8E05
1,2E06
(a)
30
27
24
21
18
15
12
9
30
27
24
21
18
0
15
2E05
0
9
4E05
8E04
12
6E05
1,6E05
6
2,4E05
3
8E05
6
1E06
3,2E05
3
4E05
0
Y
7,2E05
0
(b)
2,7E06
2,4E06
2,1E06
1,8E06
Y
1,5E06
1,2E06
9E05
6E05
3E05
30
27
24
21
18
15
12
9
6
(c)
3
0
0
Y
estructura de tallas de la población de A. platensis (figura 29).
Figura 29. Dinámicas de crecimiento poblacional de los tres componentes de tallas de
filamentos de Arthrospira platensis: (a) filamentos con 2 células, (b) filamentos con cuatro
células y (c) filamentos con más de cuatro células. La letra “Y” en la ordenada es la densidad
(filamentos/L) y en la abscisa el tiempo está dividido en intervalos de tres días. Salida: PAST.
83
Por último, para poner a prueba la idoneidad del modelo logístico como modelo
dinámico para A. platensis, se hizo una prueba sencilla de extracción de volúmenes a
partir de la saturación o capacidad de carga (K), y reemplazar el volumen retirado con
medio de cultivo optimizado (tratamiento 36). Esta aproximación experimental permitió
medir en cuanto tiempo la población retornó a K en las siguientes situaciones: (1)
retiro de un volumen por encima del punto de inflexión ( N = K/2), correspondiente a
25% del volumen total del cultivo; (2) retirar la mitad de la población (50%), para llevar
a la población hasta el punto de inflexión; (3) extracción del 75% del volumen total, que
implica cosechar la mayor parte de la población en una concentración muy por debajo
del punto de inflexión. Se puede observar que en el primer caso, a pesar de tratarse
de una remoción cercana al punto de saturación, su pendiente es inferior a la obtenida
para una remoción de 50%, lo que evidencia que el segundo tratamiento reduce a la
población justo a la fase de crecimiento rápido, mientras que con un 25% de remoción
las condiciones son similares o próximas a la saturación. El tratamiento con una
reducción de 75% de la población total llevó a los filamentos remanentes a un tamaño
basal, y la recuperación evidentemente se hizo muy lenta y, al momento de que en los
otros tratamientos las poblaciones alcanzaron y se estabilizaron en la capacidad de
carga, en el tercer caso la población aún no salía de la fase de latencia. El tiempo en
el que la población en el primer tratamiento (25%) retornó a K fue de cinco días, y con
una remoción de 50% la población tardó igual número de días.
3,000
2,500
A680
2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
1
3
5
7
9 11 13 15 1
3
5
7
9 11 13 15 1
3
5
7
9 11 13 15
Tiempo (días)
Figura 30. Dinámicas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis a partir de tres
extracciones de volúmenes en fase de saturación. De izquierda a derecha se muestran las
curvas de crecimiento a partir de 25%, 50% y 75% de extracción.
84
Para el cultivo de A. platensis en tanques circulares de 500 L en el Ficotrón, el
crecimiento poblacional de filamentos se intensificó, evidenciado en forma indirecta por
la medición de la absorbancia, una vez entraron en la fase de crecimiento rápido,
siendo superior en tanques con profundidades menores, seguido de los de
profundidad intermedia y finalmente por los de profundidad mayor (figura 31).
1,2
1
A680
0,8
0,6
0,4
0,2
0
A3
B2
C1
A1
A2
B3
B1
C2
C3
Tanque
Figura 31. Absorbancias medias (λ = 680 nm) de los cultivos en fase de crecimiento rápido,
para tres profundidades, izquierda a derecha: 15 cm (barras azules), 25 cm (barras rojas) y 35
cm (barras amarillas).
Cuando se observa la otra variable respuesta, biomasa total producida por tanque
(g/L), el patrón es similar, los tanques de mayor producción son los de menor
profundidad de medio líquido, mientras que los de profundidades mayores resultaron
los de menor producción (figura 32).
1,2
Biomasa seca (g/L)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
A3
B2
C1
A1
A2
B3
B1
C2
Tanque
Figura 32. Biomasa seca total (g/L) en los tres bloques.
85
C3
Es indiscutible pensar que la profundidad de la lámina de agua en los tanques
circulares afecta de manera diferencial la tasa de crecimiento y producción de
biomasa. El análisis de varianza determinó que hay diferencias significativas (α = 0,05)
entre los tratamientos (profundidades). Por otro lado, el efecto de los bloques en el
experimento parece no ser relevante (Tabla 11).
Tabla 11. Resumen del Análisis de Varianza (salida de MICROSOFT EXCEL).
Fuente de Variación
Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Media de
cuadrados
Fo
Tratamientos (profundidad)
4197,31
2
2098,66
11,82
Bloques (columnas)
Error
Total
556,03
709,95
5463,29
2
4
8
278,01
177,49
1,57
F0,05;2;4=6,94
Para cultivadores tipo carrusel (2500 L de capacidad) se tiene información limitada de
su dinámica y producción de biomasa. La tasa de crecimiento per cápita media del
cultivo en carrusel, como aproximación a la tasa instantánea, fue 0,25 días-1 y la
biomasa seca total 0,5 g/L, en la única cosecha realizada. Se puede advertir cómo
disminuyen la tasa de crecimiento per cápita media y la producción de biomasa desde
botellones hasta el carrusel en condiciones no controladas y con fotoperiodo (sólo el
intervalo de horas con luz natural).
7.3 Comunidades fitoplanctónicas
El estudio de comunidades fitoplanctónicas ofrece la oportunidad de explorar los
ambientes acuáticos variados del país, así como colectar numerosas especies de
cianobacterias y microalgas eucarióticas con gran potencial biotecnológico.
Ambientes dulceacuícolas. La Tabla 12 presenta la composición y abundancia de la
biota fitoplanctónica de un humedal herbáceo de la península de Paria (Palmares III).
El fitoplancton estuvo principalmente representado, en riqueza y abundancia, por
diatomeas (Bacillariophyta) y algas verde-azules (Cyanobacteria). La zona de
Brachiaria mutica (Poaceae) fue la comunidad vegetal con mayor número de especies
(24), mientras que el ecotono Cyperus articulatus (Cyperaceae) - Typha dominguensis
(Typhaceae) fue la vegetación con riqueza menor (8).
Las especies de diatomeas cuantitativamente importantes fueron: Gyrosigma
attenuatum, muy común en B. mutica y el ecotono T. dominguensis - Sesbania
86
exasperata (Fabaceae); tres especies del género Navicula con densidades
poblacionales grandes en zonas diversas, en especial N. platalea con una densidad
notable en el ecotono S. exasperata - C. articulatus; Nitzschia valens, abundante en B.
mutica, S. exasperata y C. articulatus. Otras diatomeas, como Pinnularia gibba y
Pleurosigma sp., fueron numerosas en B. mutica, pero se hicieron raras o ausentes en
las demás zonas de vegetación. Oscillatoria sp. fue la única cianobacteria abundante y
dominante, con densidades grandes en B. mutica, S. exasperata y los ecotonos B.
mutica - S. exasperata y T. dominguensis - S. exasperata. Otra cianobacteria,
Anabaena sp., fue muy importante en el parche de B. mutica. También se encontraron
ejemplares de Spirulina subsalsa, Arthrospira sp y Chlorella sp. Las algas verdes
(Chlorophyta) y euglenofitas (Euglenophyta) escasearon en todas las comunidades
vegetales. Se halló un género de dinoflagelado (Pyrrophyta) con algunos individuos de
la especie Protoperidinium sp. en el ecotono S. exasperata - C. articulatus.
Tabla 12. Composición de especies y abundancia (células/litro) de los taxa fitoplanctónicos
presentes en las zonas de vegetación en noviembre de 2008. Bm (Brachiaria mutica), EcBmSe
(ecotono B. mutica - Sesbania exasperata), Se (S. exasperata), EcSeCa (ecotono S.
exasperata - Cyperus articulatus), Ca (C. articulatus), EcCaTd (ecotono C. articulatus-Typha
dominguensis), Td (T. dominguensis) y EcTdSe (ecotono T. dominguensis - S. exasperata).
TAXA
Bm
EcBmSe
Se
EcSeCa
Ca
EcCaTd
Td
EcTdSe
Se
Cocconeis striata
0
0
0
0
4
0
0
0
0
Eunotia monodon
0
0
8
0
8
4
8
0
8
Fragilaria crotonensis
5
2
2
1
1
0
0
1
2
Frustulia sp.
8
4
4
2
1
4
2
0
0
264
80
24
0
40
20
4
236
24
Gomphonema brasiliense
0
0
0
0
4
0
0
0
0
Navicula fulva
72
12
32
32
52
20
0
0
32
N. oblonga
48
14
40
20
12
4
0
4
40
N. platalea
40
8
64
336
64
2
0
0
64
Nitzschia valens
80
50
64
24
96
40
24
0
64
N. obtusa
0
0
0
0
8
4
0
0
0
Pinnularia gibba
68
8
4
0
8
0
0
0
4
Pleurosigma sp.
48
20
0
0
0
0
4
0
0
Surirella sp.
0
0
0
0
8
0
4
0
0
Bacillariophyta (15 especies)
Gyrosigma attenuatum
87
Tabla 12. Continuación.
TAXA
Bm
EcBmSe
Se
EcSeCa
Ca
EcCaTd
Td
EcTdSe
Se
0
8
8
0
0
0
0
24
8
192
20
0
0
0
0
12
84
0
Arthrospira sp.
8
0
0
0
0
0
0
0
0
Chroococcus sp.
4
0
0
0
0
0
4
0
0
Lyngbya sp.
24
0
0
0
0
0
0
12
0
Merismopedia sp.
4
0
0
0
0
0
4
0
0
Microcystis aeruginosa
4
4
0
0
24
0
4
0
0
M. flos-aquae
16
8
0
0
48
0
0
0
0
Nostoc sp.
68
20
0
0
0
0
0
0
0
Oscillatoria sp.
236
488
192
12
0
0
0
180
192
Spirulina subsalsa
12
16
4
12
0
0
0
0
4
Chlorella sp.
0
8
0
0
24
0
0
0
0
Closterium sp.
12
0
0
0
0
0
4
8
0
Desmidium baylei
16
0
8
0
0
0
0
0
8
Hyalotheca sp.
12
0
0
0
0
0
0
0
0
Lambertia setosa
0
0
0
0
5
0
0
0
0
Scenedesmus sp.
0
0
0
0
0
0
0
4
0
Euglena sp.
0
0
0
0
0
0
4
12
0
Phacus undulatus
28
8
8
0
0
0
0
0
8
Trachelomonas hispida
0
0
0
0
4
0
0
0
0
T. superba
72
8
0
0
8
0
0
36
0
Protoperidinium sp.
0
0
0
8
0
0
0
0
0
Riqueza (S)
24
19
14
9
19
8
12
10
13
Synedra sp.
Cyanobacteria (10 especies)
Anabaena sp.
Chlorophyta (6 especies)
Euglenophyta (4 especies)
Pyrrophyta (1 especie)
88
Las comunidades fitoplanctónicas de Palmares III no sólo variaron en forma cualitativa
(composición de especies) en los diferentes parches de vegetación emergente, los
índices de diversidad revelan que también cambiaron en forma cuantitativa a lo largo
de los ambientes parcelados. Para 2008, la diversidad, expresada en el índice
Shannon-Wiener (H´), relativamente fue alta en los parches de B. mutica (Bm) y C.
articulatus (Ca) debido a que la riqueza y equidad, sus dos componentes, también
fueron elevadas; en el caso de T. dominguensis (Td), con el tercer valor más alto, el
ambiente mostró la equidad más prominente del humedal en esa época. Los ecotonos
de vegetación o ambientes de transición fueron menos diversos que los parches
monoespecíficos contiguos. En el ecotono S. exasperata – C. articulatus (EcSeCa) la
equidad se constituyó en la más baja, subsecuentemente los índices de dominancia de
Simpson y Berger-Parker tuvieron valores sobresalientes (Tabla 13).
Tabla 13. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación monoespecífica y
ecotonos (noviembre 2008). Salida: PAST.
Índice
Bm
EcBmSe
Se
EcSeCa
Ca
EcCaTd
Td
EcTdSe
Riqueza (S)
24
19
14
9
19
8
12
11
Equidad (J´)
0,80
0,54
0,72
0,46
0,81
0,78
0,88
0,66
Shannon-Wiener (H´)
2,55
1,60
1,89
1,00
2,38
1,62
2,20
1,59
Dominancia de Simpson (D)
0,11
0,40
0,23
0,58
0,12
0,26
0,15
0,27
Berger-Parker (d)
0,20
0,62
0,42
0,75
0,23
0,41
0,31
0,39
La Tabla 14 muestra los valores del índice de distancia o similitud Jaccard, para el
conjunto de ambientes parcelados (asociaciones de plantas emergentes) del humedal
Palmares III en noviembre de 2008. En términos generales, se evidencian similitudes
notables
entre
algunos
parches
monoespecíficos
con
ecotonos
vecinos,
principalmente en el gradiente B. mutica (Bm)  ecotono B. mutica – S. exasperata
(EcBmSe)  S. exasperata (Se). Es curioso que el ecotono S. exasperata – C.
articulatus (EcSeCa) sea tan diferente del parche monoespecífico de C. articulatus
(Ca), cuando la otra vegetación monoespecífica que converge en esa área del
humedal guarda una similitud notable con la misma zona ecotonal o mixta entre ambas
especies vegetales. Las formaciones de vegetación espacialmente más apartadas
entre sí en el humedal tuvieron similitudes moderadas a bajas. Los ambientes más
disímiles fueron el ecotono S. exasperata – C. articulatus y la zona monoespecífica de
T. dominguensis (Td).
89
Tabla 14. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal Palmares
III, noviembre de 2008, definidas a partir a las abundancias de las especies fitoplanctónicas.
Los valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican similitudes altas y en
azul se señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud. Salida: PAST.
Bm
EcBmSe
Se
EcSeCa
Ca
EcCaTd
Td
EcTdSe
Bm
EcBmSe
Se
EcSeCa
Ca
EcCaTd
Td
EcTdSe
1
0,654
0,462
0,320
0,344
0,654
1
0,571
0,400
0,462
0,462
0,571
1
0,344
0,462
0,375
0,273
1
0,231
0,286
0,467
0,417
0,421
0,333
0,240
0,182
0,533
0,375
0,320
0,400
0,533
1
0,273
0,105
0,240
0,296
0,304
0,250
0,176
0,154
0,231
0,333
0,296
0,286
0,240
0,304
0,467
0,182
0,250
0,417
0,105
0,176
0,421
0,240
0,154
1
0,250
0,118
0,250
1
0,211
0,118
0,211
1
Un Análisis de Componentes Principales (ACP) permitió comparar las especies
fitoplanctónicas y zooplanctónicas más importantes del ecosistema estudiado en la
península de Paria. La diatomea Navicula platalea, las cianobacterias Oscillatoria sp. y
Anabaena sp., Platyas quadricornis (Rotifera: Monogononta), Diaphanosoma birgei
(Crustacea: Branchiopoda: Cladocera), Moina minuta (Crustacea: Branchiopoda:
Cladocera) y Prionodiaptomus colombiensis (Crustacea: Maxillopoda: Copepoda:
Calanoida), estadísticamente se constituyeron en las especies fitoplanctónicas y
zooplanctónicas más importantes en 2008, luego de análisis descriptivos y ACP
iterativos empleados para eliminar variables en forma sistemática.
La figura 33 muestra el biplot del ACP, con la representación de los dos primeros
componentes principales (CP), los cuales reúnen una inercia acumulada de 89,965%,
que indica una gran reducción del espacio multidimensional en los dos primeros ejes.
Oscillatoria sp. fue la especie más relacionada con el primer componente principal, y
también tuvo una relación estrecha con el ecotono B. mutica – S. exasperata
(EcBmSe), mientras que N. platalea se constituyó en la segunda especie más
importante y la más estrechamente relacionada a la segunda nube de puntos más
grande, resumida en el segundo componente principal (CP2), y con una relación
cercana con el ecotono S. exasperata – C. articulatus (EcSeCa). Estas dos especies
de microalgas no tuvieron correlación alguna, por lo que fueron independientes entre
sí, a juzgar por sus autovectores que conformaron un ángulo recto entre sí. Las
especies zooplanctónicas seleccionadas para el análisis tuvieron autovectores muy
cortos, debido a las diferencias de escalas, y se concentraron en el origen de
coordenadas, sin guardar relaciones claras con las especies fitoplanctónicas
mencionadas. Moina minuta tuvo una relación positiva con Navicula platalea. Las
zonas de vegetación muestran un patrón en herradura que puede indicar algún
gradiente ambiental.
90
140
Navicula platalea
112
EcSeCa
84
CP 2
56
Oscillatoria sp.
28
Moina minuta
EcBmSe
Diaphanosoma
Se
birgei
Prionodiaptomus
colombiensis
Bm
Platyas quadricornis
-99.62
-66.41
Ca
Anabaena
33.21
sp. 66.41
EcTdSe
-33.21
EcCaTd
Td
99.62
132.82
166.03
-28
-56
-84
CP 1
Vector scaling: 146,94
Figura 33. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para las variables
(especies) y casos (parches de vegetación) escogidas para caracterizar el ecosistema del
humedal Palmares III en noviembre de 2008. Los dos primeros componentes principales
acumularon 89,965% de la inercia total del sistema. Salida: MVSP 3.0.
El dendrograma (figura 34) del análisis de agrupamiento derivado de las especies
fitoplanctónicas y zooplanctónicas que destacaron en el ACP, muestra que se
formaron tres (3) grupos: (1) ecotono B. mutica – S. exasperata discriminado por
Oscillatoria sp. con el valor de centroide más alto; (2) ecotono S. exasperata – C.
articulatus (EcSeCa) al cual está asociada N. platalea y (3) B. mutica, S. exasperata y
ecotono T. dominguensis – S. exasperata, C. articulatus, ecotono C. articulatus – T.
dominguensis y T. dominguensis, con asociación de M. minuta. La vegetación
monoespecífica de T. dominguensis ecológicamente es muy parecida al ecotono que
esta especie forma con C. articulatus. La mayor parte de los otros ambientes poseen
disimilitudes de mediana magnitud en la escala Euclidiana. Los dos ecotonos que
conforman el segundo y tercer grupo, respectivamente, son ambientes muy diferentes
entre sí y a cualquier otra comunidad de plantas acuáticas que existen en el humedal.
91
Figura 34. Dendrograma del Análisis de Agrupamiento o “Cluster Analysis” derivado del
conjunto de especies fitoplanctónicas y zooplanctónicas más importantes colectadas en el
ACP. Salida: MVSP 3.0.
En cuanto al ambiente abiótico, las variables fisicoquímicas mostraron una cierta
uniformidad, sólo algunas oscilaciones en el oxígeno disuelto. Los valores de salinidad
resultaron importantes para establecer que el humedal es un ambiente con
característica salobre. Se adicionan datos de algunos iones importantes para la
caracterización química del agua del humedal, principalmente metales alcalinos con
concentraciones importantes de sodio y muy bajas de potasio, que robustecen la idea
del carácter salobre del ambiente, y alcalino-térreos (cantidades notables de calcio y
magnesio), y aniones como sulfatos y cloruros en concentraciones altas (Tabla 15).
Tabla 15. Variables fisicoquímicas y concentraciones de cationes y aniones del agua,
determinados en las zonas de vegetaciones monoespecíficas estudiadas en el humedal de
Palmares en noviembre de 2008.
Parámetro/ ion
pH
Conductividad (mS/cm)
O2 (mg/L)
T (˚C)
Salinidad (‰)
Profundidad (cm)
Ca2+ (mg/L)
Mg2+ (mg/L)
Na+ (mg/L)
K+ (mg/L)
Cl- (mg/L)
SO42- (mg/L)
B. mutica
7,3
2,3
1,4
25,1
0,11
23,8
93,0
64,0
255,0
7,8
540,0
237,0
S. exasperata
6,9
2,3
2,3
25,4
0,11
21,8
94,0
55,0
285,0
7,1
500,0
257,0
92
C. articulatus
7,1
2,7
3,2
24,6
0,12
19,0
118,0
58,0
258,0
9,8
460,0
343,0
T. dominguensis
7,3
3,5
4,5
25,8
0,13
18,6
112,0
60,0
325,0
4,6
660,0
298,0
En agosto de 2009, un segundo muestreo en el mismo humedal de Paria, presentó
características fisonómicas cambiantes en la vegetación, debido a un incendio en
sequía que diezmó buena parte de la cobertura herbácea original, la cual cubría 100%
de su superficie, sin formar espejos de agua. El fitoplancton estuvo representado casi
en su totalidad por cianobacterias y euglenofitas, con predominio de las primeras en el
ecotono B. mutica - C. articulatus y abundancia de las segundas en B. mutica y T.
dominguensis. En términos generales, la riqueza fue muy inferior a la observada en
noviembre. Hubo un dominio alternado de una especie de euglenofita (Trachelomonas
superba) y una cianobacteria (Oscillatoria sp.). En esta época nuevamente se
encontraron representantes del género Arthrospira. Las diatomeas, en general,
escasearon en todos los ambientes, la única especie resaltante de este grupo fue N.
fulva en la zona B. mutica y el ecotono B. mutica - C. articulatus. Se observaron muy
pocas clorofitas. No se encontró fitoplancton en la zona de C. articulatus (Tabla 16).
Tabla 16. Composición de especies y abundancias (células/litro) de los taxa fitoplanctónicos
presentes en las zonas de vegetación para agosto de 2009. EcBm1Ca y EcCaBm2 (ecotonos
B. mutica - C. articulatus); EcBm2Td (ecotono B. mutica - T. dominguensis).
TAXA
Bacillariophyta (4 especies)
Gyrosigma attenuatum
Navicula fulva
Nitzschia valens
Pinnularia gibba
Cyanobacteria (5 especies)
Arthrospira sp.
Chroococcus sp.
Lyngbya sp.
Microcystis aeruginosa
Oscillatoria sp.
Chlorophyta (1 especie)
Closterium sp.
Euglenophyta (2 especies)
Trachelomonas hispida
T. superba
Riqueza (S)
Bm1
EcBm1Ca
Ca
EcCaBm2
Bm2
EcBm2Td
Td
0
100
60
20
0
100
20
20
0
0
0
0
0
100
20
20
0
100
60
20
0
23
5
0
40
20
0
0
20
0
20
0
0
0
20
0
20
7560
0
0
0
0
0
0
20
0
20
7560
20
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20
0
0
0
20
0
0
0
10.000
7
20
300
8
0
0
0
20
300
7
0
10.000
8
0
450
3
0
7680
3
La Tabla 17 muestra los índices de diversidad empleados para caracterizar la
estructura comunitaria fitoplanctónica de Palmares III en agosto de 2009. Las riquezas
fueron muy bajas en todos los ambientes, por lo que la equidad pasó a tener
preponderancia o peso mayor en el valor del índice Shannon-Wiener. Hubo zonas de
vegetación como los dos parches de B. mutica (Bm), observados en esa época, con
equidades muy altas que produjeron los índices de diversidad más altos para el
humedal. El resto de los ambientes exhibieron valores de equidad muy bajos con la
subsecuente disminución de la diversidad y aumento de los índices de dominancia de
Simpson y Berger-Parker.
93
Tabla 17. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación monoespecífica y
ecotonos (agosto 2009). Salida: PAST.
Índice
Riqueza (S)
Equidad (J´)
Shannon-Wiener (H´)
Dominancia de Simpson (D)
Berger-Parker (d)
Bm1
EcBm1Ca
Ca
Bm2
EcBm2Td
Td
7
8
0
6
3
3
0,85
1,65
0,15
0,31
0
0
0,83
1,49
0,23
0,25
0,05
0,05
0,76
0,40
0,12
0,94
0
0
0,72
0,43
0,11
0,94
0,02
0,99
El índice de similitud o distancia Jaccard señala que la mayor similitud entre bandas de
vegetación, diferentes a ellas mismas, se encontró entre los dos parches de B. mutica
(Bm1 y Bm2). La segunda pareja de ambientes parcelados con mayor similitud
ecológica es la establecida entre B. mutica (Bm2) y su ecotono con T. dominguensis
(EcBm2Td). Los demás ambientes difirieron en forma notable y en distintos grados
(Tabla 18).
Tabla 18. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal Palmares
III, agosto de 2009, definidas a partir a las abundancias de las especies fitoplanctónicas. Los
valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican similitudes altas y en azul se
señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud. Salida: PAST.
Bm1
EcBm1Ca
Bm2
EcBm2Td
Td
Bm1
1
0,364
0,429
0,250
EcBm1Ca
Bm2
1
0,400
0,375
0,500
0,222
0,286
EcBm2Td
0,364
0,857
0,429
0,857
0,400
1
0,375
0,500
1
0,500
Td
0,250
0,222
0,286
0,500
1
Las variables físicas y químicas exhibieron cierta uniformidad en agosto de 2002. Se
encontraron incrementos leves de la salinidad, conductividad, temperatura y
profundidad hacia la zona de T. dominguensis. La concentración de oxígeno en el
agua también mostró un aumento hacia esa vegetación, aunque más notable que los
otros factores abióticos. El pH se mostró más alto en el parche de C. articulatus, sin
embargo en todas las comunidades se mantuvo alrededor de la neutralidad. En cuanto
a la intensidad de luz, se obtuvieron diferencias grandes entre la cantidad de luz que
llegó al techo vegetal y la que las plantas dejaron filtrar hasta la lámina de agua. La
zona de C. articulatus generó la disminución mayor de densidad fotónica (luminancia),
al sólo permitir que se filtraran 2 lux hasta la superficie del agua, de los 70 lux que
llegaron al dosel (Tabla 19).
94
Tabla 19. Variables ambientales medidas en agosto de 2009.
Luminancia (lux)
Sobre el
Bajo el
techo
techo
56
8
ZONA
pH
Conductividad
(mS/cm)
Temperatura
(°C)
Salinidad
(‰)
Profundidad
(cm)
Oxígeno
(mg/L)
B. mutica
Ecotono B.
mutica-C.
articulatus
C. articulatus
Ecotono B.
mutica-T.
dominguensis
T.
dominguensis
6,93
2,30
26,92
0,11
18,75
0,88
6,92
2,33
26,90
0,11
15,00
0,74
53
14
7,50
2,39
25,55
0,11
17,50
0,44
70
2
7,41
3,05
31,47
0,14
16,00
2,68
65
19
7,31
3,10
30,78
0,15
29,00
3,02
60
38
En la depresión de Barlovento, Edo. Miranda, específicamente en un sector
denominado El Clavo, se muestrearon dos zonas contiguas de vegetación emergente
monoespecífica: Heliconia marginata (Heliconiaceae) e Hymenachne amplexicaulis
(Poaceae), en sentido suroeste – noreste en la parte más estrecha de un humedal
herbáceo que ocupa la parte más baja (estero) de una zona boscosa con pendientes
pronunciadas. Este estudio se realizó en enero de 2009 a comienzo de sequía, pero
aún con algunas lluvias copiosas. En una zona pequeña de espejo de agua, el
fitoplancton tuvo una abundancia importante, aunque con riqueza baja, y dominio
amplio de dos especies: la cianobacteria Lyngbya lutea (500 filamentos/L) y en
segundo término la clorofita Spirogyra ternata (100 filamentos/L). Asterococcus
limneticus fue común en la zona de H. amplexicaulis. En las dos zonas con vegetación
emergente, las densidades poblacionales de las dos primeras especies y de algunas
otras cianobacterias, clorofitas y diatomeas fueron muy inferiores al espejo (Tabla 20).
Tabla 20. Grupos (Taxa) fitoplanctónicos identificados en los diferentes ambientes de
vegetación en El Clavo, Barlovento, Edo. Miranda (enero de 2009).
Zona de
muestreo
Muestra
División
Especie
Cyanobacteria
Microcoleus
chthonoplastes
Filamentoso
1
Unicelular
1
Filamentoso
1
Unicelular
1
Unicelular
2
Colonial
1
He1
Chlorophyta
Cyanobacteria
Heliconia
marginata
He2
Chlorophyta
He3
Abundancia
(células/L;
colonias/L;
filamentos/L)
Nivel de
organización
Chlorophyta
Closterium
littorale
Microcoleus
chthonoplastes
Closterium
ehrenbergii
Closterium
lineatum
Asterococcus
limneticus
95
Tabla 20. Continuación.
Zona de
muestreo
Espejo de agua
(dominado por
Lemna sp. y
algunas otras
flotantes libres)
Muestra
Abundancia
(células/L;
colonias/L;
filamentos/L)
División
Especie
Nivel de
organización
Cyanobacteria
Lyngbya lutea
Filamentoso
500
Bacillariophyta
(diatomeas)
Pinnularia sp.
Unicelular
1
Asterococcus
limneticus
Colonial
19
Micrasterias
sol
Unicelular
2
Closterium
ehrenbergii
Unicelular
6
Closterium
lineatum
Unicelular
1
Spirogyra
ternata
Filamentoso
100
Cyanobacteria
Lyngbya lutea
Filamentoso
100
Colonial
16
Unicelular
1
Chlorophyta
Asterococcus
limneticus
Closterium
cornu
Closterium
lineatum
Closterium
parvulum
Spirogyra
ternata
Unicelular
6
Unicelular
1
Filamentoso
10
Filamentoso
100
Colonial
86
Unicelular
1
Unicelular
3
Unicelular
2
Filamentoso
11
E1
(muestra
única)
Chlorophyta
Hy1
Hymenachne
amplexicaulis
Cyanobacteria
Lyngbya lutea
Chlorophyta
Asterococcus
limneticus
Micrasterias
sol
Closterium
ehrenbergii
Closterium
lineatum
Spirogyra
ternata
Hy2
96
Tabla 20. Continuación.
Zona de
muestreo
Hymenachne
amplexicaulis
Muestra
División
Especie
Hy2
Chlorophyta
Volvox aureus
Cyanobacteria
Lyngbya lutea
Chlorophyta
Asterococcus
limneticus
Closterium
cornu
Closterium
ehrenbergii
Closterium
lineatum
Closterium
parvulum
Spirogyra
ternata
Hy3
Abundancia
(células/L;
colonias/L;
filamentos/L)
Nivel de
organización
Colonial
(cenobio)
Filamentoso
100
Colonial
47
Unicelular
1
Unicelular
5
Unicelular
3
Unicelular
1
Filamentoso
9
1
Los índices de diversidad establecen que el ambiente más diverso es el parche de H.
marginata, la cual estuvo soportada en una equidad máxima, pese a su menor riqueza.
Los índices de dominancia fueron elevados en espejo y H. amplexicaulis debido a las
grandes abundancias de unas pocas especies (Tabla 21).
Tabla 21. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica del humedal de El Clavo (enero 2009). Salida: PAST.
Índice
Riqueza (S)
Equidad (J´)
Shannon-Wiener (H´)
Dominancia de Simpson (D)
Berger-Parker (d)
Heliconia marginata
Espejo de agua
Hymenachne amplexicaulis
5
8
9
1,000
1,609
0,338
0,702
0,502
1,103
0,200
0,200
0,650
0,790
0,424
0,556
El índice de similitud de Jaccard suministró información probabilística de los ambientes
a partir de su composición en especies. Las dos zonas con vegetación emergente
fueron más parecidas entre sí que respecto al espejo de agua (Tabla 22).
Tabla 22. Índice de similitud de Jaccard para las tres zonas estudiadas en el Clavo, Edo.
Miranda (enero de 2009). El análisis se hizo en PAST.
Heliconia hirsuta
Espejo de agua
Hymenachne
amplexicaulis
Heliconia marginata
1
0,54054
0,64706
Espejo
0,54054
1
0,51429
Hymenachne amplexicaulis
0,64706
0,51429
1
97
La figura 35 muestra una serie de fotos, donde se exhiben ejemplares de especies
representantes de la comunidad fitoplanctónica del humedal de El Clavo.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Figura 35. Algunas especies de microalgas representantes del fitoplancton del humedal de El
Clavo, Barlovento, Edo. Miranda: (a) Lyngbya lutea (Cyanobacteria), 400x; (b) Pinnularia sp.
(Bacillariophyta), 400x; (c) Asterococcus limneticus (Chlorophyta), (d) Micrasterias sol
(Chlorophyta), 250x; (e) Closterium ehrenbergii (Chlorophyta); 250x; (f) Spirogyra ternata
(Chlorophyta), 250x. Fotos: Rubén Torres, cámara digital PAX-CAM acoplada a microscopio
invertido y a computador (programa PAX-IT!).
En términos generales, para cada una de las fechas en las que se visitó el humedal de
El Clavo, las mayoría de las variables fisicoquímicas tuvieron gran uniformidad en los
diferentes puntos muestreados dentro de la zona de H. marginata, único parche de
98
vegetación donde se tomaron esas mediciones dentro del ámbito del estudio. La
profundidad de la lámina de agua disminuyó rápidamente de enero a febrero conforme
la estación seca se aproximó, señal de que la época fue una transición de lluvia a
sequía y los valores de oxígeno y conductividad variaron (Tabla 23).
Tabla 23. Valores medios  desviaciones estándares de las variables fisicoquímicas tomadas
en la zona de Heliconia marginata del humedal herbáceo de El Clavo, Edo. Miranda en enero febrero de 2009.
Salida
Profundidad
(cm)
Temperatura
(°C)
05/01/2008
26/01/2008
69,2  15,4
13,7  7,0
30/01/2008
pH
%O2
[O2]mg/L
CE (μS)
–
24,7  0,6
6,28  0,1
5,92  0,2
2,2  1,3
8,7  6,4
0,3  0,2
0,7  0,5
11,3  4,6
22,5  0,3
5,58  0,3
0,9  0,8
07/02/2008
12,7  6,4
24,7  0,9
6,41  0,1
10,2 
9,3
6,5  1,9
14/02/2008
13,7  5,7
24,6  0,3
6,17  0,4
3,9  0,6
0,7  0,3
01/03/2008
11,3  4,6
23,1  0
5,73  0,2
10,8 
3,2
1,0  0,4
87,1  2,1
108,3 
6,1
99,4 
36,5
104,0 
8,4
133,8 
61,2
154,4 
61,5
0,5  0,1
CE
específica
(μS/cm)
86,8  2,1
107,2 
5,8
94,4 
34,6
102,8 
6,9
132,5 
60,4
149,4 
57,9
Salinidad
(‰)
<<1
0,1  0
0,1  0
0,1  0
0,1  0
0,1  0
Las mediciones de conductividad eléctrica (CE) y concentración de oxígeno (O 2)
fluctuaron entre los puntos a lo largo del seguimiento. Dichas fluctuaciones
principalmente fueron notables en el oxígeno, pero ambas variables mostraron
tendencias al incremento de sus valores a lo largo del tiempo, conforme la profundidad
de la lámina de agua disminuyó (figura 36).
80,0
160,0
70,0
140,0
80,0
70,0
1,0
60,0
40,0
80,0
30,0
60,0
40,0
20,0
20,0
10,0
0,0
2
3
4
5
0,6
40,0
30,0
20,0
0,2
10,0
0,0
6
0,0
1
Tiempo (días)
CE (μS)
50,0
0,4
0,0
1
[O2]mg/L
50,0
100,0
60,0
0,8
Prof. (cm)
120,0
CE (μS)
1,2
2
3
4
5
Tiempo (días)
Profundidad (cm)
[O2]mg/L
(a)
Profundidad (cm)
(b)
Figura 36. Variaciones temporales de (a) conductividad eléctrica y (b) oxígeno disuelto
a medida que la lámina de agua disminuyó en el parche de Heliconia marginata (enero
– febrero 2009).
99
6
Prof. (cm)
180,0
Los nutrientes determinados para el estudio en El Clavo fueron dos de los elementos
más importantes y limitantes para las plantas y el fitoplancton: el nitrógeno (N) y el
fósforo (P). La determinación de N total por método Kjeldahl (1883) resultó en una
concentración de 2,94 g/L de N para una muestra combinada 1-2-3, 6,44 g/L para otra
muestra combinada 4-5 y finalmente una concentración de 2,31 g/L para la muestra 6.
Llama la atención que en la muestra combinada 4-5 la concentración de N duplica a la
determinada en la muestra combinada 1-2-3 y casi triplica al contenido de la muestra
6, siendo todas muestras provenientes de la misma zona de H. marginata y tomadas
en la misma fecha. El punto de quiebre en la determinación de N lo determinó la
cantidad de ácido clorhídrico (HCl) empleado para cada titulación, ya que se necesitó
verter un volumen doble de HCl en la bureta para hacer el viraje a la coloración final de
la muestra combinada 4-5; la relación del volumen de HCl con la concentración de N
total es lineal o directa (figura 37).
7
Conc. N (mg/L)
6
5
4
3
2
1
0
1,2,3
4,5
6
Muestra
Figura 37. Concentraciones de nitrógeno (N) en las muestras de agua colectadas en la zona de
Heliconia marginata en la primera salida de campo al humedal de El Clavo (05/01/2009).
Las concentraciones de fósforo total (P) en fracciones de las mismas muestras
anteriormente mencionadas, se determinaron a partir de la curva de calibración
resultante de la medición de patrones de distintas concentraciones a las que se midió
su absorbancia a λ = 640 nm. En la muestra combinada 1-2-3 la concentración de P
fue 0,01 mg/L; en la muestra combinada 4-5 la concentración de P arrojó un resultado
físicamente ilógico, pues se trata de una concentración negativa (-4,61 mg/L), producto
de una transmitancia de 100% que al aplicar el factor de conversión a absorbancia
100
derivó en el valor negativo señalado, lo que se traduce en una interpretación dual: (1)
no había P en la muestra o (2) se produjo un error experimental en algún paso de la
marcha analítica; la muestra 6 produjo el valor más alto de contenido de P en agua
(0,19 mg/L). La figura 38 muestra la curva de calibración con la indicación de los
conjuntos de pares ordenados o interceptos de las absorbancias experimentalmente
determinadas, e introducidas en la ecuación de regresión lineal, así como sus
correspondientes valores en miligramos por litro, con la salvedad de la muestra
combinada 4-5, por lo ya reseñado.
Absorbancia (λ = 640 nm)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
y = 0,4401x + 0,0308
R2 = 0,9949
0,2
0,1
(0,11;0,19 mg/L)
(0,04;0,01 mg/L)
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Concetracion de fósforo (mg/L)
Figura 38. Curva de calibración para la obtención de fósforo total en agua de las muestras
tomadas en la zona de Heliconia marginata en la primera salida de campo al humedal de El
Clavo (05/01/2009).
En enero de 2010 se muestrearon una serie de lagunas de inundación del bajo
Orinoco, al sur de Monagas, próximas al puente Orinokia. La composición del
fitoplancton consta de cuatro grandes grupos, en orden de importancia: Cyanobacteria,
Chlorophyta, Bacillariophyta y Euglenophyta. La Tabla 24 presenta los taxa del
fitoplancton de cada localidad, en total 77 especies de los cuatro grupos antes
mencionados. Entre los componentes más importantes destacan las cianobacterias
filamentosas (Lyngbya circumcreta, Anabaena flos-aqua y A. planctonica) dominantes
en las localidades de Los Pocitos y Macapaima, y Lyngbya circumcreta dominó en las
dos lagunas anteriores y en la laguna Ramonero. Entre las coloniales destacaron
Microcystis elastica y M. parasitica en Los Pocitos y Macapaima; Gloeocapsa
101
aeruginosa fue importante en Macapaima. La cianobacteria unicelular Chroococcus sp.
destacó por su abundancia en Bañador. En Macapaima y Palital se encontraron
individuos de Spirulina subsalsa. De los grupos restantes, resaltan la diatomea
Achnanthes sp. en La Redonda, y la euglenofita Trachelomonas sp. en Guarampo. A
pesar de que ninguna especie de clorofita resultó numéricamente dominante, el grupo
fue el primero en número de especies y tercero en abundancia.
Las
Palometas
Ramonero
Guarampo
La Redonda
Bañador
Palital
Macapaima
Grupos/Estaciones
Los Pocitos
Tabla 24. Lista de especies y abundancia (cel./L) del fitoplancton en aguas libres de las
lagunas estudiadas en el bajo Orinoco, sur de Monagas.
56538
515560
Cyanobacteria
Unicelulares
Chroococcus sp.
886044
Filamentosas
Anabaena planctonica
1272000
1172640
A. flos-aqua
1600968
1549560
A. spiroides
400000
78000
Lyngbya sp.
439880
12564
128822
40846
34052
37704
4282
L. circumcreta
3000656
1900830
515288
L. limnetica
905628
161238
153958
282690
15710
18852
1203386
147674
Oscillatoria sp.
Spirulina subsalsa
52350
4188
7179252
5197308
21034
Aphanocapsa biformis
234528
288972
A. pulchra
213588
188460
Gloeocapsa aeruginosa
196836
586320
Microcystis inserta
169614
41880
Total filamentosas
2698000
15710
180084
96324
15710
332946
3247612
Coloniales
345821
18846
97402
105090
M. minima
200541
M. elastica
586320
339228
M. parasitica
335040
586320
M. robusta
196836
83760
Aphanocapsa biformis
234528
288972
A. pulchra
213588
188460
Gloeocapsa aeruginosa
196836
586320
2094
223082
14658
116254
3142
2094
4084
40787
345821
18846
102
97402
105090
586320
Microcystis inserta
169614
41880
345821
18846
97402
105090
M. minima
200541
M. elastica
586320
339228
M. parasitica
335040
586320
M. robusta
196836
83760
Merismopedia sp.
M. punctata
10470
282690
113076
2094
Total coloniales
2056308
2399724
Total Cianobacterias
9235560
7597032
Nostoc sp.
2094
223082
14658
116254
12564
12568
48162
69196
3142
2094
Actinastrum
hantzschii
35598
452448
6284
2094
39682
692239
1655834
153958
17804
372628
3939851
33504
20940
Closterium sp.
10470
C. acutum
197946
C. cetaceum
20940
C. kützingii
15710
C. ehrenbergii
C. macilentum
Coelastrum
cambricum
Cosmarium sp.
41880
3142
C. aplanatum
4188
113076
37692
9426
12564
4188
C. bioculatum
3142
C. denticulatum
6284
C. logiense
2094
C. margaritiferum
6284
Euastrum ansatum
2094
E. elegans
2094
E. pulchellum
16752
Gonatozygon sp.
12568
103
40787
3142
15710
Bambusina sp.
4084
3142
Chlorophyta
Artrodesmus sp.
Ramonero
196836
Las
Palometas
G. aeruginosa
Guarampo
188460
La Redonda
213588
Bañador
Macapaima
A. pulchra
Grupos/Estaciones
Palital
Los Pocitos
Tabla 24. Continuación.
G. pilosum
Ramonero
Las
Palometas
Guarampo
La Redonda
Bañador
Palital
Los Pocitos
Grupos/Estaciones
Macapaima
Tabla 24. Continuación.
23034
Kirchneriella lunaris
Pediastrum duplex
2094
37692
6284
25128
41880
P. tetras
Scenedesmus sp.
167520
S. armatus
2094
9426
12564
9426
2094
6284
S. bimorfus
6284
S. brasiliensis
41880
16752
S. intermedius
S. quadricauda
73290
Selenastrum gracile
50272
4188
Spirogyra sp.
12564
S. gracile
18846
Staurastrum sp.
31410
S. brasiliense
3142
6284
3142
12568
10470
S. leptocladum
3142
S. noticum
3142
S. tetracerum
2094
Staurodesmus sp.
8376
3142
Tetraedrum
arthrodesmiformis
14658
T. minimum
6284
Ulothrix zonata
4188
Xanthidium sp.
Total Chlorophyta
2094
0
544440
211494
122538
270212
249186
97402
628400
50258
77478
0
Bacillariophyta
Achnanthes sp.
A. lanceolata
3142
A. heteromorpha
12568
Actinella guianensis
3142
Gomphonema sp.
4188
G. tenellum
Pinnularia sp.
12568
12564
Hydrosera sp.
Melosira granulata
297348
4188
10470
226152
21994
8376
104
6284
50272
3142
9426
108888
138943
P. dactylus
Ramonero
Las
Palometas
Guarampo
La Redonda
Bañador
Palital
Los Pocitos
Grupos/Estaciones
Macapaima
Tabla 24. Continuación.
4188
P. hemiptera
12564
P. pectinata
9426
P. singularis
33504
Tryblionella rustica
2094
10470
Total
Bacillariophyta
8376
226152
3142
330852
122538
678672
230340
59698
644952
138943
Euglenophyta
Trachelomonas sp.
2094
593838
60726
Total Euglenophyta
2094
593838
60726
4739076
3815268
Total Fitoplancton
9246030
1449048
1553748
4141156
3010036
4257734
Los índices de diversidad señalan que las lagunas con mayor variedad fueron
Macapaima y Palital, puesto que tuvieron las mayores riquezas y equidades, junto con
Los Pocitos, el tercer ambiente más diverso y que presentó la misma equidad que
Macapaima. En las lagunas donde la equidad disminuyó, los índices de dominancia
aumentaron, además las riquezas también resultaron bajas en los mismos, lo que trajo
como consecuencia valores de diversidad relativamente bajos (Tabla 25).
Tabla 25. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica de lagunas de inundación del bajo Orinoco (sur de Edo. Monagas), para enero
de 2010. Salida: PAST.
Índice
Riqueza (S)
Equidad (J´)
Shannon y Wiener
(H´)
Dominancia de
Simpson (D)
Berger-Parker (d)
Los
Pocitos
Macapaima
Palital
Bañador
La
Redonda
Guarampo
Las
Palometas
Ramonero
24
0,82
35
0,82
43
0,75
29
0,73
25
0,48
9
0,34
14
0,80
14
0,68
2,59
2,92
2,82
2,45
1,54
0,74
2,12
1,80
0,12
0,08
0,15
0,13
0,37
0,68
0,15
0,29
0,26
0,17
0,37
0,27
0,57
0,82
0,26
0,52
Por su parte, el índice de similitud de Jaccard revela que los ambientes de mayor
similitud en el número y abundancias de especies comunes fueron Macapaima y Los
Pocitos. Los otros ambientes mostraron pocas similitudes entre sí, por lo que cada una
de esas lagunas tuvo una composición de especies diferente (Tabla 26).
105
Tabla 26. Índice de similitud de Jaccard para las lagunas estudiadas en el bajo Orinoco, sur del
Edo. Monagas (enero de 2010). En rojo se resaltan los valores más altos. Salida: PAST.
Los Pocitos
Macapaima
Palital
Bañador
La Redonda
Guarampo
Las Palometas
Ramonero
Los Pocitos
1
Macapaima
0,69
0,14
0,36
0,11
0,14
0,69
1
0,18
0,39
0,13
0,10
0,14
0,18
1
0,24
0,13
0,13
0,36
0,39
0,24
1
0,20
0,15
0,11
0,13
0,13
0,20
1
0,13
0,14
0,10
0,13
0,15
0,13
1
0,19
0,17
0,14
0,26
0,26
0,44
0,46
0,32
0,12
0,26
0,11
0,15
0,19
0,46
0,17
0,32
0,14
0,12
0,26
0,26
0,26
0,11
0,44
0,15
1
0,17
0,17
1
Palital
Bañador
La Redonda
Guarampo
Las Palometas
Ramonero
Un análisis de componentes principales (ACP) permitió establecer relaciones entre las
especies fitoplanctónicas y zooplanctónicas más importantes en el análisis descriptivo
e iterativo, para la eliminación sistemática de especies con pocas varianzas y raras
que redundaron en información. Los dos primeros ejes retuvieron 95,4% de la varianza
del sistema multidimensional. Las cianobacterias Anabaena planctonica, Lyngbya
circumcreta y L. limnética, y los rotíferos Brachionus havanaensis, Keratella americana
y Lecane proiecta fueron las especies escogidas para este análisis puesto que
tuvieron las mayores varianzas y correlaciones con los primeros componentes
principales. La figura muestra el biplot, donde las tres especies de cianobacterias
estuvieron fuertemente relacionadas a los dos primeros componentes principales, y
los organismos L. circumcreta y L. limnética al primer componente principal, y A.
planctonica al segundo componente principal. Los rotíferos no aparecen en este biplot,
puesto que estuvieron relacionados con otros componentes, sus abundancias y
varianzas resultaron muy inferiores a las de las especies fitoplanctónicas, de las que
se contaron hasta millones de células por litro. Lyngbya circumcreta estuvo asociada a
la laguna Ramonero y totalmente superpuesta a L. limnetica (máxima correlación). Las
lagunas Guarampo, Palital, La Redonda y Las Palometas estuvieron muy asociadas
entre sí (figura 39).
En Mantecal se muestrearon algunos bajíos, esteros (pastizal) y espejos de agua, en
etapas finales de lluvias o inicio de la transición de lluvia a sequía (noviembre de
2010). Se hicieron muestreos puntuales en cada estrato a lo largo del gradiente
ambiental desde el bajío hasta el espejo.
106
968947.3
Anabaena planctonica
775157.9
581368.4
CP 2
387578.9
Los Pocitos
Macapaima
193789.5
Bañador
-387578.9
-193789.5
La Redonda
Las Palometas
Guarampo
Palital
Ramonero
Lecane proiecta
Brachionus
Keratella
Lyngbya
limnetica
americana
havanaensis
193789.5
Lyngbya circumcreta
387578.9
581368.4
775157.9
968947.3
-193789.5
-387578.9
CP 1
Vector scaling: 807456,00
Figura 39. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para los ambientes
lagunares del Orinoco bajo, sur de Monagas. Los dos primeros componentes principales
retuvieron 95,4% de la inercia total del sistema multidimensional original. Salida: MVSP 3.0.
La Tabla 27 muestra la composición de especies fitoplanctónicas en tres ambientes de
los módulos inundables de Mantecal. Dominaron las clorofitas, seguidas de las
cianobacterias y en menores proporciones las euglenofitas y diatomeas. Las especies
más abundantes fueron las clorofitas Desmidium baylei y Scenedesmus brasiliensis en
bajío, Euastrum pectinatum en bajío y pastizal y Cosmarium subtumidum en pastizal.
La cianobacteria Microcystis aeruginosa fue el principal representante de este grupo
en las muestras, y también se hallaron filamentos de Arthrospira sp. El espejo de agua
fue el ambiente menos rico en especies y también exhibió las menores densidades
poblacionales.
Tabla 27. Composición y abundancia (células por litro) de la comunidad fitoplanctónica de tres
ambientes de los módulos inundables de Mantecal (noviembre 2010).
Taxa
Cyanobacteria
Anabaena planctonica
Arthrospira sp.
Chroococcus sp.
Bajío
Pastizal
Espejo
5416
1285
2569
745
4545
458
45
107
89
Tabla 27. Continuación.
Cylindrospermum muscicola
Lyngbya circumcreta
Merismopedia glauca
1045
1526
Microcystis aeruginosa
M. flos-aqua
14025
4188
748
225
Nostoc sp.
Oscillatoria tenuis
4326
458
4589
Chlorophyta
Cosmarium sp.
Cosmarium subtumidum
Closterium ehrenbergii
Desmidium baylei
Euastrum crassum
457
4458
784
45126
1546
2546
14565
6821
4895
74
12546
3012
1458
15689
4589
15878
485
5963
856
589
2589
451
5846
745
1265
512
Euastrum pectinatum
Hyalotheca sp.
Micrasterias sol
Scenedesmus brasiliensis
Scenedesmus quadricauda
Staurastrum paradoxum
Staurastrum triangularis
Euglenophyta
Trachelomonas superba
Phacus orbicularis
Bacillariophyta
Achnanthes lanceolata
1256
236
152
58
2548
452
Gomphonema sp.
74
859
412
Una observación de los índices de diversidad permite fácilmente advertir que en el
pastizal se conjugan una riqueza y equidad elevadas que se combinan para la
obtención de un valor de diversidad Shannon-Wiener relativamente alto, si se compara
con los otros ambientes contiguos. El bajío fue el segundo lugar más diverso, donde
riqueza y equidad disminuyeron un poco. El espejo fue menos rico y equitativo que los
otros dos ambientes, y los índices de dominancia, especialmente el de Berger-Parker,
subieron en forma notable (Tabla 28).
Tabla 28. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad
fitoplanctónica entres ambientes de los módulos inundables de Mantecal (Edo. Apure), en
noviembre de 2010. Salida: PAST.
Índice
Bajío
Pastizal
Espejo
Riqueza (S)
Equidad (J´)
19
0,744
22
0,803
8
0,611
Shannon y Wiener (H´)
Dominancia de Simpson (D)
2,189
0,181
0,365
2,483
0,114
0,208
1,271
0,387
0,553
Berger-Parker (d)
108
El índice de Jaccard muestra que el bajío y el pastizal tuvieron una gran similitud, y
que el espejo fue un ambiente totalmente diferente a ambos (Tabla 29).
Tabla 29. Índice de similitud de Jaccard para comparación de los tres ambientes estudiados en
Mantecal (Edo. Apure). Salida: PAST.
Bajío
Pastizal
Espejo
Bajío
Pastizal
Espejo
1
0,640
0,286
0,640
1
0,304
0,285
0,304
1
Fosas petroleras y lagunas con emanaciones naturales de crudos. La figura 40
muestra un conjunto de fotos con observaciones de especies de microalgas de una
muestra de pozo (P57X) del Edo. Bolívar, 2009. La muestra proviene en forma
específica de una pequeña charca fangosa en la parte exterior del pozo mencionado,
enmarcada en un lugar donde se encuentra petróleo, ripios y sedimentos de
perforación. Se evidenciaron muchas cianobacterias filamentosas (principalmente
Oscillatoria tenuis); también hubo una cantidad de euglenofitas y diatomeas pennadas,
y algunas clorofitas (principalmente Scenedesmus spp.).
Figura 40. Imágenes que muestran la composición de especies fitoplanctónicas de una charca
fangosa, específicamente proveniente del borde exterior de un área de pozos petroleros en el
norte del Edo. Bolívar, 2009.
109
Figura 40. Continuación.
110
Figura 40. Continuación.
111
Figura 40. Continuación.
112
Figura 40. Continuación.
La Fosa El Caracol en la región de Caico Seco, ubicada en el municipio Aragua del
estado Anzoátegui, fue escogida para la búsqueda de especies de microalgas nativas
con gran potencialidad para la producción de biodiesel, por representar un área de
exposición histórica a hidrocarburos que operó durante muchos años como una de las
principales y más grandes recolectoras de desechos petrolíferos de la zona. Se
tomaron muestras de agua libre en tres puntos denominados: Zona I, Zona II y Zona
III.
En la Zona I se identificaron dos géneros de cianobacterias (Chroococcus y
Anabaena), un género de clorofita (Chlamydomonas) y una especie de diatomea
(Tabellaria flocculosa). Para la Zona II se reportaron dos géneros de clorofitas
(Chlamydomonas y Chlorella), un género de cianobacteria (Anabaena, aunque una
especie diferente a la encontrada en la Zona I) y uno de diatomea (Navicula).
Finalmente en la Zona III, a diferencia del resto de las zonas, en esta localidad de
estudio se identificaron cinco géneros de cianobacterias (Lyngbya, Merismopedia,
Aphanocapsa, Synechocystis y Chroococcus) además de una clorofita (Chlorella sp.).
Salinas y lagunas hipersalinas. La laguna de Boca Chica en la isla de Margarita,
Edo. Nueva Esparta, es un ambiente natural extremófilo, con una salinidad elevada (>
40 ppm), que se presenta como una laguna costera en la costa suroeste de la
113
península de Macanao, donde ocurren emanaciones naturales de crudo. Un análisis
de muestras tomadas en este lugar, mayo de 2009, refiere que en las mismas se
encontraron ejemplares de Dunaliella primolecta (Chlorophyta) y Chaetoceros sp.
(Bacillariophyta)
en
densidades
muy
bajas,
125
y
145
células
por
litro,
respectivamente.
La salina de Las Cumaraguas, norte de la península de Paraguaná, Edo. Falcón, es
otro ambiente extremófilo donde se ubica una de las poblaciones naturales de
Dunaliella salina más importantes del Caribe sur. Las muestras colectadas exhibieron
abundancias de 14.000 a 75.000 células por litro, en fase de crecimiento, y se inició el
cultivo de la especie en la Cámara de Crecimiento con la metodología expuesta y
resultados explicados en la sección de cultivos.
Ambientes marinos costeros. En Mochima y Puerto Cabello, entre los años 2009 y
2010, se colectaron muestras de fitoplancton marino donde las diatomeas centrales
(Bacillariophyta) y dinoflagelados dominaron en riqueza y abundancia los ambientes.
En la bahía de Mochima, se encontraron individuos de las diatomea Chaetoceros sp. y
Nitzschia valens, así como la haptofita Isochrysis galbana, en densidades bajas (100 a
250 células por litro). En el muelle de Puerto Cabello se hallaron blooms (o
afloramientos) de la diatomea Coscinodiscus sp. (>17.000.000 de células por litro), el
dinoflagelado colonial Alexandrium catenella (>15.000.000 de células por litro) y la
cianobacteria Anabaena sp. (>5.000.000 de células por litro).
Síntesis de los ambientes. La figura 41 muestra una síntesis gráfica de todas las
regiones muestreadas y las composiciones porcentuales del fitoplancton en cada
lugar. Se muestra que en los ambientes de aguas continentales las cianobacterias,
diatomeas y clorofitas fueron los grupos más representativos. Las euglenofitas
constituyeron otros representantes de agua dulce encontrados en porcentajes muy
inferiores, pero en la fosa petrolera de Bolívar se evidencia una gran importancia
numérica de este taxón, junto a cianobacterias, clorofitas y diatomeas en porcentajes
menores. Las clorofitas del género Dunaliella resultaron muy importantes en
ambientes hipersalinos, con una dominancia absoluta en las salinas de Las
Cumaraguas. En medios marítimos, las diatomeas, pirrofitas (o dinoflagelados) y las
haptofitas, éstas en Mochima representadas por Isochrysis galbana, resultaron los
taxones predominantes. Con esta representación gráfica de las divisiones de
cianobacterias y microalgas eucariotas, se comprueban las grandes variaciones
porcentuales de los taxones mayores del fitoplancton, como consecuencia de la
variedad de ambientes acuáticos representados en el país.
114
Composición porcentual
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Haptofitas
Pirrofitas
Euglenofitas
Diatomeas
Clorofitas
Cianobacterias
Figura 41. Composiciones porcentuales de las divisiones de organismos procariotas y
eucariotas integrantes de la comunidad del fitoplancton en las regiones estudiadas en el país a
lo largo del estudio.
115
8. Discusión
8.1 Cultivos
Los medios preparados para mantenimiento y experimentos se caracterizaron por sus
componentes exclusivamente minerales (medios minerales), es decir, sólo se
emplearon sales inorgánicas sin la incorporación de fuentes orgánicas para los
macronutrientes (Ej.: urea como fuente de nitrógeno) y micronutrientes. La única
incorporación orgánica a los medios minerales fue el EDTA disódico, el cual no
funcionó como nutriente, sino como agente quelante que “secuestró” iones Hierro II
(Fe2+) y calcio (Ca2+). Por este mecanismo ambos cationes permanecieron como
formas solubles en agua. En el caso específico del Fe2+, la acción del quelante evitó
que se oxidara a Hierro III (Fe 3+) y reaccionar con el fósforo del medio, para formar un
precipitado de fosfato férrico, lo que trae como consecuencia la no disponibilidad de
este nutriente para las microalgas. De forma homóloga, la mediación del quelante
impidió que el ion calcio hiciese precipitar a los aniones fosfato y sulfato.
Por otro lado, no hubo necesidad de suplementar con vitaminas y carbohidratos
(cultivos mixotróficos) a ningún medio nutritivo, a pesar de formar parte de sus
formulaciones. Ciferri (1983) y Duerr y col. (1997) mencionan que cultivos mixotróficos
producen una cantidad de biomasa elevada en comparación con la autotrofía (medios
minerales para microalgas, incluidas fuentes inorgánicas de carbono, como los
empleados en esta investigación) y heterotrofía. Dicha aseveración se puede deber al
efecto energético de la incorporación de carbohidratos a los medios, así como la
actuación eficiente de las vitaminas como coenzimas en muchos procesos catabólicos.
Además, estos aditivos orgánicos aumentan el valor nutricional de la biomasa de
microalgas. No obstante, adiciones de carbohidratos simples como glucosa, sacarosa
o fructosa, también producen crecimientos rápidos y descontrolados de bacterias, las
cuales pueden ser patógenas y mortales para los cultivos. Otros microorganismos
favorecidos por la adición de carbohidratos y vitaminas son las microalgas invasoras,
las cuales suelen poseer tasas de crecimiento per cápita (r) superiores a las de
especies de valor biotecnológico, como Arthrospira spp. y Spirulina spp., las que
pueden ser desplazadas por competencia. El medio altamente básico (pH>9,5) donde
crece A. platensis es un escudo o primera línea de defensa para estas especies
primitivas, las cuales evolucionaron en esos ambientes agrestes e inhóspitos para casi
cualquier otra forma de vida (Ciferri 1983).
Para el medio Schlösser (1994, modificación del medio Aiba y Ogawa (1977)), un
aporte importante realizado por Parra (2005) fue la sustitución en algunas sales, del
116
catión sodio (Na+) por el catión potasio (K+), para generar una relación Na+ : K+ 4 a 1
(la proporción en el medio original es de 10 a 1). Este ajuste tuvo por finalidad una
mayor aproximación a las condiciones imperantes en los medios naturales de A.
platensis en los lagos carbonatados de África (L’évêque 1987).
La razón de la adaptabilidad de la cepa Lefevre de A. platensis a las condiciones
naturales del país puede derivar de las características del lugar de origen de esa
variedad, África tropical (específicamente borde sur del desierto del Sahara). Las
similitudes climáticas en temperatura y radiación solar altas durante la mayor parte del
año son adecuadas para esa cepa silvestre, más que para otras que sólo se han
cultivado en invernaderos y condiciones controladas de manera persistente. Los
ambientes naturales de A. platensis son lagos y lagunas carbonatados, cerrados,
altamente alcalinos con valores de temperatura y radiación solar elevados. Estos
cuerpos de agua están confinados a regiones desérticas tropicales y subtropicales en
el interior de los continentes y, en general, son ambientes naturales muy hostiles, por
lo que a menudo los centros urbanos están apartados de ellos (Jones y Grant 1999).
La composición de los medios de cultivo afecta la tasa de crecimiento y producción de
biomasa de los microorganismos, y define el costo de producción del mismo (Raoof y
col. 2006). Por esa razón, para esta investigación fue de gran importancia obtener
medios de cultivo óptimos que permitiesen maximizar la producción y minimizar los
costos. Por ejemplo, el empleo de sales grado técnico y alimenticio, en lugar de sales
grado reactivo o analítico de precios muy elevados debido a sus altos grados de
pureza, ha permitido la viabilidad económica de los experimentos. Por otro lado, en
numerosas oportunidades sales de alta pureza han demostrado ser menos nutritivas
que las de grado técnico o alimenticio. Estas impurezas constituyen valores nutritivos
agregados que aumentan la calidad nutricional de los medios preparados.
8.2 Ensayos con poblaciones de Arthrospira platensis
Los ensayos factoriales 22 permitieron llegar a una primera aproximación del proceso
de optimización de los medios de cultivos, con el propósito firme de conocer y procurar
tasas de crecimientos poblacionales y rendimientos de biomasa óptimos para la meta
de aprovechamiento biotecnológico de A. platensis. Los medios 1 y 2 presentaron una
dinámica similar, lo cual indica que el intervalo de variación de las concentraciones de
Na+ y K+ no afectaron la tasa de crecimiento poblacional, por lo que puede explorarse
la posibilidad de disminuir las concentraciones de estos iones hasta un mínimo que
permita mantener esta tasa de crecimiento. La tasa de crecimiento ligeramente menor
del medio 3 indica que un incremento del Cl - pudo afectar en forma desfavorable el
117
crecimiento de A. platensis. En el caso de la curva de crecimiento del medio 4, con
una fase de latencia y adecuación muy prolongada, la misma señala que una
disminución pronunciada del Cl- en conjunto con el SO42- incrementan de modo
apreciable dicha adaptación al medio. Sin embargo, la baja concentración de estos
iones no afecta la tasa de crecimiento una vez alcanzada la fase exponencial.
En los ensayos se lograron ajustes del pH del medio de cultivo a un valor de 10,5, una
unidad por encima de lo establecido por Melack (1979), lo que significó una mejor
aproximación al pH del medio natural de A. platensis. Los cambios incorporados por
Parra (2005), y reajustes posteriores en el segundo ensayo factorial 2 2, determinaron
que el pH del medio se mantuviera estable por un tiempo prolongado y con pocas
variaciones en la conductividad, de este modo siendo alcanzadas las condiciones
óptimas para el crecimiento de A. platensis. Estas condiciones de laboratorio se
corresponden con los trabajos de Wood y Talling (1988), Njuguna (1988), Melack
(1988) y Jones y Grant (1999), donde se reportan alcalinidades extremas y
osmolaridades elevadas de los ambientes originarios de esta cepa.
A un pH de 8,5, el medio de cultivo de A. platensis frecuentemente se contaminó con
otras especies de microalgas (principalmente de los géneros de cianobacterias
Anabaena, Microcystis y Oscillatoria), las cuales se encuentran comúnmente en el
agua potable, lo que visualmente originó matices de color verde diferentes al verdeazul, característico de los medios observados cuando A. platensis es la única especie
existente. Sena y col. (2011) mencionan un tratamiento de alta alcalinidad (pH 12, con
empleo de KOH) de 72 h, como procedimiento inicial determinante para eliminar a
Microcystis spp. y otras cianobacterias, partiendo del hecho de que A. platensis
sobrevive a condiciones de dureza y alcalinidad extremas en lagos de soda (en inglés
“soda lake”). La toxicidad de un medio muy alcalino con contenido de sales potásicas
como KOH o K2CO3 para cianobacterias invasoras u oportunistas como Microcystis
aeruginosa, aparentemente viene del hecho de que esta especie y congéneres tienen
densidades bajas de canales de potasio, por lo que una entrada masiva de iones
potasio (K+) al compartimento intracelular no permite su salida rápida por los canales,
debido a su insuficiencia numérica, y ocurre un gran desequilibrio electroquímico con
inversión de la polaridad de la membrana plasmática. La consecuencia final es la
muerte de la célula por intoxicación con potasio.
Para la cuantificación del peso neto de la biomasa de A. platensis, resultó necesario
determinar una relación lineal entre la absorbancia y el peso seco de la biomasa, de tal
manera de conocer su peso neto en cualquier instante de tiempo de manera rápida,
precisa y no destructiva. Boussiba y Richmond (1979) fueron los únicos en cuantificar
118
biomasa seca de microalgas en cultivos controlados, pero no lo hicieron en sentido
estricto, ni mucho menos en una relación lineal para su determinación. Otros autores
como Chen y col. (1996), Chen y Zhang (1997) y Zhang y Chen (1999), no
desarrollaron una metodología cuantitativa para estimar la biomasa, ya que ésta fue
tomada húmeda, lo que puede conducir a errores importantes en la cuantificación de
su peso.
La tasa de crecimiento para un cultivo autotrófico de A. platensis en medio Zarrouk,
obtenida por Chen y Zhang (1997), fue de 0,0083 h-1, mientras que para un cultivo
mixotrófico (suplementado con glucosa) en medio Zarrouk, reportado por los mismos
autores, el valor fue de 0,026 h-1, ambos en condiciones de laboratorio. La tasa de
crecimiento per cápita o de recambio obtenida en este trabajo para el cultivo
autotrófico en medio 1, el más productivo de las cuatro combinaciones obtenidas para
condiciones controladas, fue de 0,50 días-1 = 0,021 h-1, similar a la obtenida por Chen
y Zhang (1997) para el cultivo mixotrófico, y más de dos veces superior a la
conseguida para su cultivo autotrófico. Entonces, para los fines de este trabajo resulta
significativo el rendimiento notablemente superior obtenido en cultivos con medios
minerales, y similar al mixotrófico sin suplir glucosa u otra fuente orgánica.
El ensayo factorial fraccionado 2 6-1 permitió evaluar el crecimiento diferencial de
poblaciones de A. platensis en un gran número de medios de cultivos simultáneos con
combinaciones aleatorias de macronutrientes. El crecimiento diferenciado para cada
tratamiento puede deberse a que estas cianobacterias crecen en condiciones
altamente selectivas, principalmente en concentraciones altas de sales (Borowitzka
1999). Es evidente que cultivos con tratamientos centrales y algunos con
concentraciones importantes de ciertas sales inorgánicas propiciaron crecimientos
vigorosos y relativamente saludables de las poblaciones de A. platensis, con poca o
nula contaminación de otras especies de microalgas. En contraste, otros tratamientos
fueron poco viables por carencias considerables de una buena parte de los
requerimientos nutricionales de la microalga, disminuyendo notablemente la capacidad
de carga del medio. No es descartable que debido al empleo de sales amónicas en los
tratamientos, sus concentraciones hayan sido suficientemente altas en algunos
recipientes, como para intoxicar o limitar el crecimiento de las poblaciones residentes
de A. platensis, conocido el efecto deletéreo que el amonio en concentraciones altas
tiene sobre esta especie (Boussiba 1989).
Como consecuencia de la selectividad de medios de cultivo de A. platensis, la especie
contó con dinámicas de crecimiento poblacional variables. Vonshak y Richmond
(1985) reportaron que tasas de crecimiento per cápita elevadas se observaron a
119
densidades poblacionales bajas, mientras que tasas de crecimiento bajas estuvieron
relacionadas con limitación por luz en cultivos densos bajo condiciones óptimas a cielo
abierto, lo que coincide con la mayoría de las curvas obtenidas para el ensayo
multifactorial a partir del punto de inflexión, cuyas dinámicas se maximizaron en
medios centrales, como el tratamiento 36, que contaron con las concentraciones
óptimas de los principales nutrientes, en especial las fuentes de carbono.
El tiempo de duplicación (tg) es un parámetro poblacional importante en la
caracterización de la dinámica de crecimiento poblacional de microorganismos, y tiene
gran aplicabilidad en biotecnología como medida de eficiencia de cultivos masivos de
microalgas para maximizar la velocidad y rendimiento de los mismos. Melack (1979)
obtuvo para A. platensis un tiempo de recambio (“turnover time”), comparable con el tg
obtenido en varios de medios del ensayo factorial fraccionado, de 8,9 a 18,9 h en
condiciones naturales en un lago de Kenia. Para especies congéneres de A. platensis
o
próximas
a
ella,
se
tiene
que
Tomaselli
y
col.
(1995)
determinaron
experimentalmente valores de tg de 27 horas para Spirulina subsalsa en condiciones
de laboratorio; Garnier y col. (1994) obtuvieron un tg de 70 h para A. maxima en
condiciones de laboratorio.
Los cultivos a mayor escala (tanques circulares de 500 L y cultivadores tipo carrusel
de 2000 L) brindaron la oportunidad de probar el medio optimizado en botellones, para
iniciar el cultivo masivo de A. platensis. Es importante resaltar la disposición espacial
de los tanques para el experimento. Debido a que para el momento del ensayo en
tanques se aproximaba el solsticio de invierno, la proyección de la eclíptica solar sobre
el Ficotrón ocurrió a más de 30° al sur, más allá de los 10° respecto al Ecuador, lo cual
constituye una fuente de variación adicional “no deseada”. Para contrarrestar este
efecto, se escogió un “Diseño en Bloques Aleatorios” que permitió extraer la variación
“posible”, producto del fenómeno descrito. El análisis de varianza no produjo
diferencias significativas entre los bloques, lo que hace presumir que la inclinación u
oblicuidad de los rayos solares no tuvo una implicación directa en la dinámica de los
cultivos. En otros términos, la diferencia de minutos transcurridos entre los tanques
que se iluminaron primero en el eje cardinal Este, con los rayos iniciales del alba, y los
últimos tanques en el punto cardinal opuesto iluminados de último, no repercutió de
manera decisiva en el crecimiento de las poblaciones, a pesar de que los
microorganismos responden de manera rápida a cambios igualmente rápidos. La
profundidad de la lámina sí tuvo un efecto significativo, esto debido a que a mayor
profundidad los rayos solares penetran cada vez con menor intensidad y se forman
120
puntos oscuros donde las microalgas no pueden fotosintetizar y mueren, cayendo en
forma notable la productividad primaria.
También es destacable la disminución del rendimiento de la cosecha de biomasa en
cultivos a escalas mayores a las de botellones. En estos recipientes la producción de
biomasa fue alta en buena medida por el volumen de los mismos, pero también a su
disposición inclinada que aumentó en forma notable la superficie de exposición a los
rayos solares. La temperatura es otro factor decisivo en la producción primaria, la
misma en botellones fue 2 o 3ºC superior a los tanques, los cuales tuvieron en contra
su diseño, pues son recipientes muy altos que generan sombra abundante aún en
horas del mediodía y el material (polietileno) no es conductor de calor. En estanques
tipo carrusel el volumen empleado es de 2000 L, la capacidad calórica aumenta aún
más, no obstante sus temperaturas fueron ligeramente más altas que las de los
tanques, ya que este tipo de cultivadores tiene un diseño de superficie amplia con
poca profundidad (lámina delgada), lo que genera mayor exposición a los rayos
solares y generación de pocos puntos muertos o zonas no iluminadas. No obstante, la
producción de biomasa no fue elevada, quizá debido a algún factor físico como la
temperatura, para la cual hubo un seguimiento y se registraron valores moderados a
bajos (18 - 20°C en horas diurnas; 17 - 19°C durante las noches). La causa alternativa
puede obedecer a la preparación y suministro de medio nutritivo en cantidades
suficientes, así como sus solubilidades, tomando en cuenta los altos grados de
impurezas de las sales grado técnico o alimenticio aplicadas, en ocasiones
conformadas por conglomerados muy compactos.
La estructura de tallas en la población de filamentos de A. platensis permite explicar
mecanismos
de
autorregulación
poblacional
típicos
de
poblaciones
con
densodependencia. A densidades poblacionales muy bajas, los recursos (luz y
nutrientes) son disponibles y predominan tricomas muy cortos y hormogonios
(filamentos reproductivos de las cianobacterias del Orden Oscillatoriales constituidos
por sólo dos células), lo que permite una adaptación rápida al medio y crecer en forma
exponencial, una vez se inicia la fase de crecimiento rápido. En el proceso de
maduración del cultivo, empiezan a dominar filamentos o tricomas de gran tamaño
(con muchas células) y en la fase de saturación la tasa de crecimiento instantánea se
reduce notablemente hasta llegar a cero en la capacidad de carga. En esta etapa no
hay producción de hormogonios y los filamentos maduros no reproductivos son el
componente de talla ampliamente predominante en el cultivo en fase de equilibrio.
Entonces, cuando la capacidad de carga es alcanzada, no hay incremento poblacional
121
y la población se atenúa u ocurren retrasos (oscilaciones amortiguadas y ciclos)
asociados a efectos de la densidad alrededor del punto de equilibrio estable (K).
La tasa de crecimiento per cápita explica la recuperación de una población luego de
una perturbación (May 1976). Una perturbación por extracción de una parte de la
población en estado de equilibrio puede ser respondida en función del tamaño de las
poblaciones remanentes en el medio y de su tasa intrínseca de crecimiento per cápita.
La tasa de crecimiento elevada de A. platensis, principalmente en condiciones
naturales, es debida a su forma de reproducción vegetativa por escisión de filamentos
y generación de hormogonios que se multiplican radialmente por fisión binaria en
pocos días. La perturbación no puede ser total o llegar a niveles basales, porque las
poblaciones remanentes en el cultivo son pequeñas y biológicamente inviables, lo que
puede conducir a la extinción. Una remoción de 75% y reemplazo con medio nutritivo
nuevo generó un efecto de dilución que no permitió que la población se adecuara en
forma rápida. Esto no es conveniente en términos biotecnológicos, puesto que se
busca maximizar el rendimiento de cosecha con una tasa de recuperación o resiliencia
elevada.
Como nota complementaria para el tema de poblaciones, llama la atención la
morfología rectilínea de los filamentos de A. platensis en condiciones de laboratorio
(Cámara de Crecimiento), cuyos filamentos originalmente tenían una estructura
helicoidal, típica del género. Una sucesión de varias generaciones desde el primer
inóculo en la Cámara de Crecimiento con exposición a luz artificial (400 lux) originó el
cambio a la forma rectilínea. Al respecto, se debe comentar que cuando la cepa fue
llevada al Ficotrón, y los cultivos se aclimataron a condiciones a cielo abierto, la misma
nuevamente empezó a adquirir la morfología helicoidal, luego de su exposición a la
radiación solar por tres generaciones sucesivas. La explicación a esta recuperación
está contenida en la calidad o composición de longitudes de onda de la luz solar,
específicamente a su componente de rayos ultravioletas, los que inducen a un
arrollamiento o arreglo de los tricomas en forma espiral, que generan en los filamentos
regiones alternas de mayor y menor exposición a las radiaciones más fuertes (Ciferri
1983).
En condiciones de laboratorio, la cianobacteria se adecuó a una fuente luz artificial
menos intensa (luz fría) y de menor calidad (a pesar del empleo de las denominadas
lámparas fluorescentes “day-light” que contienen la mayor parte de las longitudes de
onda del visible), y su disposición rectilínea permitió aumentar la superficie de
exposición de los filamentos para captar la luz con mayor eficiencia. En condiciones
naturales, las zonas oscuras o menos expuestas de los filamentos espirales o
122
helicoidales, como adaptación pertinente para hallar protección o menor exposición de
los filamentos a las radiaciones ultravioletas, suelen incrementar en forma notable las
concentraciones de ficocianinas, pigmentos antena exclusivos de las cianobacterias
que contribuyen a la captación de longitudes de onda adicionales a las captadas por la
clorofila a, y que contribuye al incremento de su eficiencia fotosintética. Resulta de
particular interés biotecnológico la producción de A. platensis (y A. máxima) en
condiciones naturales o semi-controladas a cielo abierto (estanques cerrados) para
obtener poblaciones con morfología helicoidal, por el gran atractivo que brindan las
ficocianinas a la industria de los colorantes y su empleo en salud y farmacéutica como
marcadores moleculares (Henrikson 1994).
8.3 Comunidades fitoplanctónicas
En aguas continentales, los humedales de Paria, Barlovento y Mantecal tienen como
característica común las presencias de grandes formaciones vegetales que ocupan la
mayor parte de su superficie, con predominio de plantas emergentes de hábito
herbáceo, de allí la denominación de humedales herbáceos (Mitsch y Gosselink 2007),
si bien las composiciones de especies, fisionomías y dominancias varían.
Asociaciones del fitoplancton y zooplancton a determinadas clases de vegetación
dentro de un mismo humedal se evidenciaron en análisis de componentes principales.
En el caso del humedal Palmares III, península de Paria, se encontró un patrón en
herradura de los parches de vegetación, lo que conlleva la presunción del
establecimiento de un gradiente espacial, con la composición de especies planctónicas
variando a lo largo de las zonas de vegetación monoespecífica y ecotonos. En este
mismo análisis multivariado se observaron relaciones bióticas entre especies
fitoplanctónicas, y de éstas con algunos organismos zooplanctónicos, como los
cladóceros, los cuales se alimentan del fitoplancton. La disposición parcelada de la
vegetación acuática genera asociaciones diferenciales de las comunidades del
fitoplancton y zooplancton en sus predios. Las intensidades variables de la radiación
solar bajo los techos de las asociaciones de plantas tienen causalidad inmediata en las
disposiciones espaciales o formas de crecimiento de las diferentes especies de
plantas emergentes. La consecuencia de esto es que la calidad de luz que se filtra
hasta la lámina de agua es escasa, por lo que la sombra generada va en detrimento
de la actividad fotosintética del fitoplancton, mientras que para el zooplancton
significan refugios eficaces de depredadores visuales.
La homogeneidad de buena parte de las variables abióticas en el agua robustece el
pensamiento de que la estructura aérea de la vegetación y ciertas condiciones
123
microclimáticas locales son las causas reales del establecimiento de patrones de
distribución espacial de las especies fitoplanctónicas y zooplanctónicas. En los
humedales ubicados en Paria, Barlovento y Mantecal contrastan en modo notable las
composiciones y abundancias de las especies entre los distintos parches de
vegetación. Por otra parte, las distintas zonas de vegetación generaron efectos locales
sobre algunas variables fisicoquímicas,
como
la
concentración de oxígeno
(concomitante a cambios en la concentración de dióxido de carbono) y conductividad,
por tasas de descomposición diferenciales asociadas al tipo de material vegetal y
variaciones en las concentraciones de iones disueltos, respectivamente. En el caso del
humedal de Barlovento, tales cambios en la concentración de oxígeno y conductividad
se relacionaron con la disminución progresiva de la profundidad de la lámina de agua
por advenimiento de sequía, lo que produjo un efecto de concentración de iones. Las
asociaciones
de
plantas
emergentes
también
establecen
microclimas.
Las
concentraciones de nutrientes, principalmente el fósforo y el nitrógeno, resultaron
bajas en ese humedal, lo que determina que el flujo de energía y materia para el
funcionamiento del ecosistema está determinado, en modo preponderante, por los
aportes de las plantas acuáticas en forma de hojarasca y materiales en distintos
estados de descomposición que constituye una fuente importante de nutrientes para la
comunidad del plancton (Mitsch y Gosselink 2007). Las cianobacterias pueden
contribuir al incremento de las fuentes de nitrógeno en el humedal mediante la fijación
de nitrógeno atmosférico.
El carácter salobre del humedal Palmares III, según sistema de clasificación de TabiloValdivieso (1999), se pone de manifiesto en la composición de especies
fitoplanctónicas descritas para este ambiente, en el cual se encontraron microalgas
típicas de agua dulce como clorofitas, euglenofitas y cianobacterias del género
Arthrospira, diatomeas con un espectro amplio de tolerancia a la salinidad (eurihalinas)
de los géneros Navicula y Nitzschia, así como pirrofitas (o dinoflagelados) del género
Protoperidinium y la cianobacteria Spirulina subsalsa, especies principalmente
relacionadas a ambientes estuarinos.
Para lagunas de inundación del bajo Orinoco, las grandes abundancias de
cianobacterias fijadoras de nitrógeno (en especial especies de los géneros Lyngbya y
Anabaena,
éstas
caracterizadas
por
sus
grandes
heterocistos),
indican
concentraciones altas de este elemento en Los Pocitos, Macapaima y Ramonero. El
fitoplancton menos abundante en ambientes como Palital, Bañador y La Redonda, con
un número de especies muy alto en el Orden Desmidiales, sugiere que se trata de
ambientes limpios, oligotróficos y con aguas ligeramente ácidas (Comas 2008). Las
124
diatomeas resultaron muy abundantes en Las Palometas y La Redonda, este grupo es
muy importante para la alimentación del zooplancton encontrado en la zona,
principalmente rotíferos y cladóceros. La abundancia de diatomeas en esas lagunas
indica valores de pH ligeramente alcalinos, con presencia de silicatos (Wetzel 1975).
Por su parte, la laguna de Guarampo fue un ambiente diferente en cuanto a la
estructura de la comunidad fitoplanctónica, en este caso hubo abundancias menores
de la mayoría de sus componentes, con predominio notable de euglenofitas del género
Trachelomonas; este tipo de composición fitoplanctónica a menudo caracteriza a
ambientes ricos en materia orgánica y ligeramente eutrofizados (Comas 2008). La
relación estrecha de Guarampo con Palital, Las Palometas y La Redonda en el análisis
de componentes principales se debe a las densidades poblacionales menores
registradas en estos ambientes, mas no a las composiciones de especies, las cuales
son muy diferentes.
En general, para la mayoría de los ambientes de agua dulce estudiados la diversidad
fue alta donde las equidades, y en segundo término las riquezas, contribuyeron en
modo determinante a los valores del índice Shannon-Wiener. La reducción de los
valores de diversidad por equidades bajas incrementaron los índices de dominancia en
algunos sitios, donde se encontraron dominios amplios de algunas especies
fitoplanctónicas. Los estudios con índices de diversidad permiten caracterizar las
comunidades a un nivel simple, como sistemas independientes o aislados. Los índices
de distancia y similitud de Jaccard brindan comparaciones entre comunidades
distintas, donde se establece un segundo nivel de análisis de complejidad comunitaria
(diversidad beta) respecto al estudio de comunidades simples (diversidad alfa) (Del
Pino y col. 2006). En el humedal de Paria, las similitudes entre ambientes contiguos y
disimilitudes entre parches lejanos encontraron asidero en la propuesta de este índice
de complejidad al constatar, que efectivamente al haber pocas especies comunes a
ciertos ambientes, los clasifica como comunidades diferentes dentro de una gran
comunidad heterogénea dividida en ambientes parcelados.
Spirulina subsalsa, especie de gran valor biotecnológico, fue encontrada en Paria y
lagunas de inundación del Orinoco. Rodríguez (2001) la reporta en aguas salobres y
estuarinas, como el sistema del lago de Maracaibo (norte del lago). Esto evidencia que
S. subsalsa puede ser hallada en una gran variedad de ambientes, con una
distribución geográfica amplia en el país. En Barlovento y Mantecal se hallaron
algunas especies de cianobacterias de los géneros Lyngbya y Arthrospira, así como
clorofitas del género Scenedesmus, especies también referidas con potencialidades
importantes para la biotecnología. Las presencias de microalgas en ambientes
125
extremófilos, como salinas y lagunas hipersalinas, y altamente contaminados o
intervenidos, como las fosas petroleras y el muelle de Puerto Cabello, indican la
adaptabilidad de estos microorganismos a ambientes modificados por actividades
antrópicas. Sus potencialidades biotecnológicas se reflejan en sus capacidades para
vivir en tales ambientes, con capacidades para la absorción y resíntesis de
hidrocarburos a compuestos más simples, como Chlorella spp. y Scenedesmus spp.
(Albarracín 2007). Se conoce también la gran producción de pigmentos fotosintéticos
(carotenoides) de Dunaliella salina y D. viridis, especies de gran valor en la industria
de colorantes y en la producción de vitamina “A”, con poblaciones ubicadas en salinas
de Paraguaná y Laguna Boca Chica, isla de Margarita, respectivamente. Ambientes
marinos costeros no perturbados, como la bahía de Mochima, también ofrecen en su
diversidad algunas especies de gran valor biotecnológico para producción de
biocombustibles, Isochrysis galbana, Nitzschia valens y Chaetoceros spp.
Existe una gran variedad de ecosistemas terrestres y acuáticos en el país, producto de
su ubicación tropical y variedad de relieves, desde sistemas montañosos con alturas
importantes que modifican el clima, hasta llanuras continentales y costeras, vastos
territorios selváticos, depresiones, sistemas deltaicos y un gran frente marino. La
cuenca del río Orinoco sintetiza las tres grandes formas de relieve que existen en la
naturaleza: por un lado macizos antiguos y escudos, cordilleras de levantamiento
reciente (es decir, del Terciario) por el otro, y depresiones tectónicas y cuencas o
llanuras de acumulación, en tercer lugar. Para un país con estas características
geomorfológicas, y más si se encuentra en la zona intertropical, tal variedad ambiental
representa una gran ventaja ecológica y económica. Sólo Canadá y los Estados
Unidos, además de Venezuela y Colombia, que en su territorio tiene una parte
reducida del escudo guayanés, presentan una disposición geológica similar
(http://es.wikipedia.org/wiki/Río_Orinoco). Tal multiplicidad de ambientes produce una
gran complejidad de hábitats dulceacuícolas, salobres, marítimos y extremos, que
unida a la condición de país megadiverso, permite la exploración de comunidades
biológicas con un banco genético muy importante de especies promisorias para el
desarrollo de la biotecnología en campos como la alimentación, producción de
biocombustibles, biorremediación, farmacología, cosmética, colorantes, etc.
126
9. Conclusiones
1. Se obtuvieron dos medios de cultivo óptimos para el crecimiento de Arthrospira
platensis, uno en condiciones controladas (medio 1 = medio Parra (2005)) y otro en
condición natural (tratamiento 36, medio central), lo que inicia el aprovechamiento
biotecnológico de la especie a diferentes escalas.
2. La dinámica de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis muestra
densodependencia logística, con evidencia de una estructura de tallas que varía
conforme la población crece y alcanza un equilibrio.
3. El crecimiento diferencial de poblaciones de Arthrospira platensis mostrado en
tratamientos con combinaciones aleatorias y centrales de nutrientes en un
experimento factorial fraccionado, señala que esta especie crece en condiciones
altamente selectivas.
4. La mayoría de los tratamientos con tiempos de duplicación, tg, más cortos (y por
ende tasas de crecimiento per cápita, r, más elevadas) se constituyeron en los
más productivos en biomasa.
5. La profundidad de la lámina de agua en sistemas de tanques circulares a cielo
abierto influye en la dinámica de crecimiento poblacional y producción de biomasa
de Arthrospira sp.
6. Se encontraron especies de cianobacterias (Arthrospira spp., Spirulina subsalsa,
Lyngbya spp., Oscillatoria spp. y Anabaena spp.) y microalgas eucarióticas
(Scenedesmus spp., Isochrysis galbana, Chlorella sp., Chaetoceros sp., Navicula
platalea, Dunaliella salina y D. viridis) de gran interés biotecnológico en diferentes
lugares de la geografía variada del país, lo que conduce a la idea de que
Venezuela cuenta con un potencial genético importante en su biodiversidad para la
biotecnología.
127
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http://es.wikipedia.org/wiki/Barlovento_(Venezuela)
http://earth.google.com/
http://es.wikipedia.org/wiki/Cuenca_del_Orinoco
http://es.wikipedia.org/wiki/Río_Orinoco
http://es.wikipedia.org/wiki/Mantecal
http://es.wikipedia.org/wiki/Apure
http://www.disfrutevenezuela.com/Municipio-Peninsula-de-Macanao-Mapa.html
http://www.mochima.org/
http://www.tuplaya.com/paginasfalcon/salinas/lascumaraguas.htm
http://www.ipapc.gov.ve/
http://es.wikipedia.org/wiki/Puerto_Cabello
http://es.wikipedia.org/wiki/Nudo_(unidad)
135
136
Apéndice 1
Medios de cultivo para microalgas
f/2 Medium (Guillard 1975)
Fuente: http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/media/table/f2.html
NaNO3 (75.0 g/L dH2O)
1.0 ml
NaH2PO4·H2O (5.0 g/L dH2O) 1.0 ml
Na2SiO3·9H2O (30.0 g/L dH2O) 1.0 ml
f/2 Trace Metal Solution
1.0 ml
f/2 Vitamin Solution
0.5 ml
Filtered seawater to
1.0 L
Autoclave after all additions.
Note: f/2 Medium contains extensive silica precipitate and should be used only when
growing diatoms. For other algal groups use f/2-Si Medium.
f/2 Trace Metal Solution:
FeCl3·6H2O
3.15 g
Na2EDTA·2H2O
4.36 g
CuSO4·5H2O (9.8 g/L dH2O)
1.0 ml
Na2MoO4·2H2O (6.3 g/L dH2O) 1.0 ml
ZnSO4·7H2O (22.0 g/L dH2O)
1.0 ml
CoCl2·6H2O (10.0 g/L dH2O)
1.0 ml
MnCl2·4H2O (180.0 g/L dH2O) 1.0 ml
Distilled water to
1.0 L
Autoclave.
f/2 Vitamin Solution:
Vitamin B12 (1.0 g/L dH2O) 1.0 ml
Biotin (0.1 g/L dH2O)
10.0 ml
Thiamine HCl
200.0 mg
Distilled water to
1.0 L
Filter sterilize into plastic vials and store in refrigerator.
Note: Vitamin B12 and Biotin are obtained in a crystalline form. When preparing the Vitamin B12 Stock
Solution allow for approximately 11% water of crystallization (For each 1.0 mg of Vitamin B 12 add 0.89
ml dH2O). When preparing the Biotin Stock Solution allow for approximately 4% water of crystallization
(For each 1.0 mg of Biotin add 9.6 ml dH2O).
137
Fuente:
Vera, A., M. Martínez, K. Morillo y S. Montes. 2011. Cultivo discontinuo de Chlorella
sp. en medios enriquecidos con el exudado gomoso de Acacia macracantha. En:
http://revistas.luz.edu.ve/index.php/bcib/article/viewFile/90/3326.
138
Medio Chu-13 modificado por Dayananda (2007)
Modified CHU13 Medium, one liter [3]
Compound
mg/L
KNO3
400
K2HPO4
80
CaCl2 dihydrate
107
MgSO4 heptahydrate
200
Ferric Citrate
20
Citric acid
100
CoCl2
0.02
H3BO3
5.72
MnCl2 tetrahydrate
3.62
ZnSO4 heptahydrate
0.44
CuSO4 pentahydrate
0.16
Na2MoO4
0.084
0.072 N H2SO4
1 drop
The remaining volume is pure, de-ionized water.
Fuente: http://en.wikipedia.org/wiki/Chu_13
139
Medio Bristol UTEX
Bristol Medium
Directions
H.C. Bold's modification of Bristol's recipe (Bold 1949). General purpose freshwater
medium and as bristol's solution, an essential component of other media--see Bold 1NV,
Bold 3N, Bristol-NaCl, LDM, Proteose, Soil extract, and Trebouxia.
For 1 L Total
1. To approximately 900 mL of dH2O add each of the components in the order specified
while stirring continuously.
2. Bring total volume to 1 L with dH2O.
*For 1.5% agar medium add 15 g of agar into the flask; do not mix.
3. Cover and autoclave medium.
4. Store at refrigerator temperature.
# Component
1
2
3
4
5
6
NaNO3 (Fisher
BP360-500)
CaCl2·2H2O (Sigma
C-3881)
MgSO4·7H2O
(Sigma 230391)
K2HPO4 (Sigma P
3786)
KH2PO4 (Sigma P
0662)
NaCl (Fisher S271500)
Amount
Stock Solution
Concentration
Final
Concentration
10 mL/L
10 g/400mL dH2O
2.94 mM
10 mL/L
1 g/400mL dH2O
0.17 mM
10 mL/L
3 g/400mL dH2O
0.3 mM
10 mL/L
3 g/400mL dH2O
0.43 mM
10 mL/L
7 g/400mL dH2O
1.29 mM
10 mL/L
1 g/400mL dH2O
0.43 mM
Fuente: http://web.biosci.utexas.edu/utex/mediaDetail.aspx?mediaID=29
140
Medio Serpa y Calderón (2005)
Fuente:
Serpa, R.F. y A. Calderón. 2006. Efecto de diferentes fuentes de nitrógeno en el
contenido de carotenoides y clorofila de cuatro cepas de Dunaliella salina TEOD.
Ecología Aplicada 5(2): 93 – 99.
141
Apéndice 2
ENSAYO Nro. 2: Optimización en botellones
Factorial 26-1 con 5 ptos. centrales Desing Expert
St.
Id
Run
Block
Type
NaHCO3 Na2CO3 K2HPO4 NaCl K2SO4 NH4NO3
mg/L
mg/L
10207,5
3022,5
Fact
13610
33
0
1 Block 1
Center
28
28
2 Block 1
mg/L
375
mg/L
mg/L
mg/L
750
750
1764
4030
250 1000
1000
1176
2
2
3 Block 1
Fact
13610
2015
250
500
500
2352
11
11
4 Block 1
Fact
6805
4030
250 1000
500
1176
14
14
5 Block 1
Fact
13610
2015
500 1000
500
2352
25
25
6 Block 1
Fact
6805
2015
250 1000
1000
1176
30
30
7 Block 1
Fact
13610
2015
500 1000
1000
1176
22
22
8 Block 1
Fact
13610
2015
500
500
1000
2352
6
6
9 Block 1
Fact
13610
2015
500
500
500
1176
7
7
10 Block 1
Fact
6805
4030
500
500
500
1176
27
27
11 Block 1
Fact
6805
4030
250 1000
1000
2352
3
3
12 Block 1
Fact
6805
4030
250
500
500
2352
34
0
13 Block 1
Center
10207,5
3022,5
375
750
750
1764
4
4
14 Block 1
Fact
13610
4030
250
500
500
1176
31
31
15 Block 1
Fact
6805
4030
500 1000
1000
1176
10
10
16 Block 1
Fact
13610
2015
250 1000
500
1176
12
12
17 Block 1
Fact
13610
4030
250 1000
500
2352
24
24
18 Block 1
Fact
13610
4030
500
500
1000
1176
5
5
19 Block 1
Fact
6805
2015
500
500
500
2352
18
18
20 Block 1
Fact
13610
2015
250
500
1000
1176
23
23
21 Block 1
Fact
6805
4030
500
500
1000
2352
29
29
22 Block 1
Fact
6805
2015
500 1000
1000
2352
35
0
23 Block 1
Center
10207,5
3022,5
375
750
750
1764
8
8
24 Block 1
Fact
13610
4030
500
500
500
2352
26
26
25 Block 1
Fact
13610
2015
250 1000
1000
2352
13
13
26 Block 1
Fact
6805
2015
500 1000
500
1176
20
20
27 Block 1
Fact
13610
4030
250
500
1000
2352
21
21
28 Block 1
Fact
6805
2015
500
500
1000
1176
1
1
29 Block 1
Fact
6805
2015
250
500
500
1176
9
9
30 Block 1
Fact
6805
2015
250 1000
500
2352
17
17
31 Block 1
Fact
6805
2015
250
500
1000
2352
15
15
32 Block 1
Fact
6805
4030
500 1000
500
2352
32
32
33 Block 1
Fact
13610
4030
500 1000
1000
2352
16
16
34 Block 1
Fact
13610
4030
500 1000
500
1176
19
19
35 Block 1
Fact
6805
4030
250
500
1000
1176
36
0
36 Block 1
Center
10207,5
3022,5
375
750
750
1764
37
0
37 Block 1
Center
10207,5
3022,5
375
750
750
1764
142
Design-Expert® Software
Interaction
E: K2SO4
Biomasa
2.4
Design Points
E- 500.000
E+ 1000.000
Actual Factors
B: Na2CO3 = 3022.50
C: K2HPO4 = 375.00
D: NaCl = 750.00
F: NH4NO3 = 1764.00
Biomasa
X1 = A: NaHCO3
X2 = E: K2SO4
2
1.6
1.2
0.8
6805.00
8506.25
10207.50
11908.75
13610.00
875.00
1000.00
A: NaHCO3
Design-Expert® Software
Interaction
F: NH4NO3
Biomasa
2.4
Design Points
F- 1176.000
F+ 2352.000
Actual Factors
A: NaHCO3 = 10207.50
B: Na2CO3 = 3022.50
C: K2HPO4 = 375.00
E: K2SO4 = 750.00
Biomasa
X1 = D: NaCl
X2 = F: NH4NO3
2
1.6
1.2
0.8
500.00
625.00
750.00
D: NaCl
143
Design-Expert® Software
Interaction
B: Na2CO3
Biomasa
2.4
Design Points
B- 2015.000
B+ 4030.000
Actual Factors
C: K2HPO4 = 375.00
D: NaCl = 750.00
E: K2SO4 = 750.00
F: NH4NO3 = 1764.00
Biomasa
X1 = A: NaHCO3
X2 = B: Na2CO3
2
1.6
1.2
0.8
6805.00
8506.25
10207.50
11908.75
13610.00
11908.75
13610.00
A: NaHCO3
Design-Expert® Software
Interaction
E: K2SO4
Biomasa
2.4
Design Points
E- 500.000
E+ 1000.000
Actual Factors
B: Na2CO3 = 3022.50
C: K2HPO4 = 375.00
D: NaCl = 750.00
F: NH4NO3 = 1764.00
Biomasa
X1 = A: NaHCO3
X2 = E: K2SO4
2
1.6
1.2
0.8
6805.00
8506.25
10207.50
A: NaHCO3
144
Design-Expert® Software
Biomasa
Design points above predicted value
Design points below predicted value
2.3555
2.5
0.838
X1 = A: NaHCO3
X2 = E: K2SO4
Biomasa
Actual Factors
B: Na2CO3 = 3022.50
C: K2HPO4 = 375.00
D: NaCl = 750.00
F: NH4NO3 = 1764.00
2.175
1.85
1.525
1.2
1000.00
6805.00
875.00
8506.25
750.00
10207.50
11908.75
A: NaHCO3
E: K2SO4
625.00
13610.00
500.00
Design-Expert® Software
Biomasa
Design points above predicted value
Design points below predicted value
2.3555
2.36
0.838
X1 = D: NaCl
X2 = F: NH4NO3
Biomasa
Actual Factors
A: NaHCO3 = 10207.50
B: Na2CO3 = 3022.50
C: K2HPO4 = 375.00
E: K2SO4 = 750.00
2.12
1.88
1.64
1.4
2352.00
500.00
2058.00
625.00
1764.00
750.00
1470.00
875.00
D: NaCl
1000.00
145
1176.00
F: NH4NO3
Design-Expert® Software
Biomasa
Design points above predicted value
Design points below predicted value
2.3555
2.5
0.838
X1 = A: NaHCO3
X2 = B: Na2CO3
Biomasa
Actual Factors
C: K2HPO4 = 375.00
D: NaCl = 750.00
E: K2SO4 = 750.00
F: NH4NO3 = 1764.00
2.175
1.85
1.525
1.2
4030.00
6805.00
3526.25
8506.25
3022.50
10207.50
2518.75
11908.75
A: NaHCO3
146
13610.00
2015.00
B: Na2CO3
Apéndice 3
Fuente: http://bellman.ciencias.uniovi.es/d_experimentos/d_experimentos_archivos/sr.pdf
147
148
149
150