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Figura 8. Hojas de plantas regeneradas no transformadas (a) y de plantas transformadas, que expresan el gen reportero
gfp en los tricomas (b). Raíces de plantas regeneradas no transformadas WT, y de plantas transformadas que expresan el gen
reportero gfp WRKY (c).
El ADN de las plantas regeneradas será extraído y analizado por PCR utilizando cebadores específicos
para cada transgen y por otro lado se realizarán “southern blot” para confirmar la integración y el número
de copias del DNA exógeno al genoma de la planta.
El objetivo del presente estudio fue determinar la función de los genes identificados en el genoma de
la soja en relación a los procesos de respuesta a estrés biótico y abiótico, con énfasis en déficit hídrico
y enfermedades causadas por patógenos fúngicos. Se escogieron para el estudio: 1) cuatro genes que
codifican factores de transcripción de la familia WRKY; 2) Genes de la familia ASR (ABA, Stress and Ripening); 3) Genes que codifican proteínas híbridas ricas en prolina (HyPRP). Los resultados obtenidos hasta
el momento se mencionan a continuación:
1) El análisis del perfil de expresión (RT-qPCR) de los cuatro genes de la familia WRKY mostró que estos
poseen expresión diferencial a lo largo de la infección con Phakopsora pachyrhizi Sydow, y también
que cuando se compararon los genotipos susceptibles y resistentes utilizados. Se observó también
una modificación de la expresión de estos genes cuando las plantas se sometieron a estrés salino.
2) Se identificó la familia Asr de soja. El análisis del perfil de expresión reveló que un gen tiene un patrón
distinto de inducción a nivel de transcriptos (mRNA), en hojas tratadas con ABA, sal y déficit hídrico; en cuanto al gen 2, presentó un patrón distinto de inducción, en raíz, tratada con ABA y déficit
hídrico. El gen 2 también presentó expresión diferencial en plantas infectadas con P. pachyrhizi, al
compararse los genotipos resistentes y susceptibles.
3) Se identificaron 35 genes HyPRP en el genoma de la soja. Se confirmó el patrón de expresión de tres
de estos genes en plantas de soja sometidas a tratamientos de alta salinidad, ácido absícico (ABA),
ácido salicílico e infección con P. pachyrhizi, siendo constatado el aumento significativo en la expresión de los genes en los tres últimos experimentos. La expresión de dos de estos genes se reprimió
después del tratamiento con sal. Los resultados obtenidos refuerzan la posibilidad de que las proteínas codificadas por los genes de las tres familias en estudio (WRKY, ASR e HyPRP) estén involucradas
en respuestas a estreses bióticos y abióticos.
4) Se construyeron vectores para la sobreexpresión y silenciamiento de los genes en estudio en soja.
Plantas transgénicas portando estas construcciones se obtuvieron a través de bombardeo o vía sistema integrado “bombardeo/Agrobacterium”, en los cuales embriones somáticos se utilizaron como
tejido blanco. Hasta el momento, se obtuvieron tres líneas que sobreexpresan los genes de interés;
además de dos líneas donde se silenciaron estos genes en conjunto. Además de estas, otras líneas
deben ser identificadas, una vez que embriones y plantas obtenidas en los experimentos de transformación se encuentran en diversas etapas. La confirmación de alteraciones en los niveles de expresión
de esas plantas posibilitará su utilización en desafíos con patógenos y experimentos de estreses abióticos, permitiendo así un estudio completo de la caracterización funcional de estos genes en soja.
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2.2.7. Perfil de la expresión génica en la interacción de transcriptomas de soja y roya asiática.
EMBRAPA SOJA.
La roya asiática, causada por Phakopsora pachyrhizi, desde su aparición viene causando serios perjuicios al agronegocio de la soja brasilera. El desarrollo de variedades resistentes es una manera económica
y confiable de combatir las enfermedades. Cinco distintos genes de resistencia a roya asiática se mapearon hasta el momento: Rpp1, Rpp2, Rpp3,e Rpp4, Rpp5 (BROMFIELD & HARTWIG, 1980; MCLEAN & BITH,
1980; HARTWIG & BROMFIELD, 1983; HARTWIG, 1986; GARCIA et al., 2008). Varias otras fuentes de resistencia también se identificaron en otros países, (MILES et al., 2006) y en Brasil (LAPERUTA et al., 2008).
Sin embargo, hasta el momento, hay disponibles apenas tres cultivares resistentes a roya (BRSGO 7560,
TMG 801 e TMG 803), estas a su vez poseen algunas limitaciones como: regiones de siembra y resistencia
apenas a algunas razas del patógeno (FUNDAÇÃO MT, 2009) debido a la gran variabilidad del patógeno, la
resistencia mediada por tales genes en la mayoría de las veces está limitada, siendo fácilmente quebrada
en una o dos campañas.
En este sentido, el entendimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la interacción entre
la soja y el hongo P. pachyrhizi es de vital importancia en la planificación de estrategias más durables para
el control de la roya asiática. El monitoreo simultáneo de la expresión génica del hospedero y del patógeno, o sea, de la interacción de los transcriptomas, viene siendo una estrategia recientemente utilizada
para la elucidación detallada y simultánea del rol del patógeno y del hospedero a nivel molecular durante
la interacción en diferentes sistemas patogénicos. La microdisección laser (LM) ofrece condiciones para
aislar células específicas que contienen al patógeno y permiten aislar tejidos de plantas normales, haciendo la comparación de la expresión génica entre diferentes tejidos. Tal estrategia viene siendo utilizada
con éxito en el enriquecimiento de secuencias expresadas en tipos celulares específicos posibilitando el
acceso a genes principalmente de función regulatoria, representados por uno o pocos transcritos en la
célula. Cuando se asocia esta técnica con metodologías de secuenciación de alta performance, la LCM
enriquece el análisis de transcriptos raros y/o tejido-específico que se expresan durante la interacción
patógeno-hospedero, causando impacto en la resolución del perfil de transcriptos expresados.
Recientemente, la técnica de LCM, asociada a la hibridación por microarreglos, se utilizó para el estudio de la interacción entre la soja y el hongo Phakopsora pachyrhizi, utilizando el genotipo Williams 82
(Tremblay et al., 2009 y Tremblay et al., 2010). Aunque los resultados alcanzados en estos trabajos sean
importantes para el conocimiento de genes expresados durante el ciclo de la roya, ambos se realizvaron
utilizando la técnica de microarreglos lo que, consecuentemente, limita el acceso a genes y transcriptos
aún desconocidos, principalmente del patógeno, y de algunos genes de función regulatoria tales como
factores de transcripción y RNAs no codificantes.
En este sentido, el principal objetivo de este trabajo fue analizar la interacción de los transcriptomas
de la soja [Glycine max (L.) Merrill] y del hongo Phakopsora pachyrhizi, utilizando las técnicas de LCM y
secuenciamiento de alto caudal, durante una interacción incompatible y tolerante.
Metodología
A. Inoculación y diseño experimental.
El experimento se instaló en Embrapa Soja, Londrina, Brasil, con un modelo de bloques totalmente al
azar, con tres repeticiones (3 plantas/maceta). Una población de P. pachyrhizi se colectó en campos experimentales en el Estado de Mato Grosso, Brasil, y multiplicada por cinco generaciones en el cultivar brasilero susceptible BRSMS-Bacuri en invernadero preparado para a inoculaciones artificiales. La población
vegetal de multiplicación del inóculo se cultivó a una temperatura diurna de 28 a 30ºC y una temperatura
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nocturna de 22 a 25ºC, 80% de humedad relativa ± 5% y 12 h de luz. La población fúngica utilizada fue
altamente similar a un aislado de Zimbáue, de acuerdo con la amplificación y secuenciación de la región
ITS del hongo (R. V. Abdelnoor, comunicación personal). Las urediniosporas se colectaron a partir de hojas infectadas sobre una bandeja plástica y se resuspendieron en agua destilada con 0,05% de Tween 20
(v/v) para una concentración final de 130.000 esporas/ml. Esta suspensión se pulverizó sobre plantas en
el estadio de desarrollo V2 (FEHR & CAVINESS, 1977). La misma solución sin esporas se usó para el tratamiento de un grupo control de la infección, compuesto por una repetición del mismo material vegetal, en
el mismo estadio fenológico sometido a falsas inoculaciones.
Se utilizaron en este estudio los genotipos de soja resistente y un cultivar brasilero tolerante. Estos genotipos mostraron lesiones características de resistencia (marronesrojizas; “reddish-brown” o RB). Después de la inoculación, las plantas permanecieron cubiertas con bolsas plásticas rociadas con agua por
12 días, para estimular el proceso infeccioso, que necesita alta humedad, y para evitar contaminaciones
cruzadas entre las muestras inoculadas y no inoculadas. Después de 13 días (312 h) de la inoculación ya
fue posible observar un gran número de lesiones en las hojas de las plantas inoculadas, lo que posibilitó
la recolección del material vegetal destinado a microdisección.
B. LCM y preparación del aRNA.
Segmentos foliares con lesiones de aproximadamente 1cm2 se recortaron e inmediatamente se fijaron en solución de Farmer (75% etanol, 25% ácido acético). Las muestras se fijaron toda la noche y al
día siguiente se deshidrataron e incluidas en parafina liquida siguiendo el procedimiento establecido por
Cai y Lashbrook (2006). Se hicieron moldes para cada una de las tres repeticiones de las plantas INOC de
ambos genotipos, varios segmentos foliares fueron incluidos en cada molde. Los moldes se mantuvieron
congelados a -20ºC hasta que la confección de las laminas y la micro disección fuesen realizadas. Los segmentos foliares parafinizados se cortaron longitudinalmente con ayuda de un micrótomo rotatorio a un
espesor de 12 µm y montados sobre láminas de vidrio tratadas con fucsina básica y “fast green”. Moldes
de las tres repeticiones fueron seccionados para la confección de las láminas inmediatamente utilizadas
en la LCM. La LCM fue realizada en un equipo PixCellTM system con CapSureTM Macro LCM caps (Arcturus Engineering). La duración de los pulsos varió de 150-170 ms con un diámetro de 7,5 µm (Figura 9).
Cada “cap” se utilizó en la captura de células de por lo menos una lámina de cada repetición. En seguida,
los “caps” se encajaron en micro tubos de 0,5ml conteniendo 30 µl de tampón de extracción del kit PicoPure RNA isolation (Arcturus Engineering) de forma que el film plástico del cap quedase en contacto con
el tampón por 30 minutos en estufa a 42ºC. Después de este período de incubación las células blanco,
células parenquimáticas de la hoja aisladas de los sitios de infección con el hongo, se desprenden del cap
por a la solución de extracción en el microtubo y fueron almacenadas a -80ºC hasta la extracción del RNA.
La extracción del RNA con el Kit PicoPure tuvo un rendimiento medio de 112ng. El mRNA fue amplificado
en dos ciclos utilizando la estrategia de transcripción in vitro según las especificaciones del Kit RiboAmp
HS Plus RNA amplification (Arcturus Engineering). Al final se obtuvieron aproximadamente 18µg de aRNA
de las muestras. La calidad del RNA se determinó utilizando el Agilent Bioanalyzer (Agilent, Wilmington,
DE, USA).
C. Secuenciamiento
Aproximadamente 18µg de aRNA de cada muestra se destinaron al secuenciamiento con la plataforma
Illumina Genome Analyzer GAAIIx utilizando la estrategia de “paired-ends”. Se generaron aproximadamente 15 millones de “reads” por genotipo.
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Resultados Parciales:
A. Microdisección
Figura 9. Imágenes de la microdisección de las células parenquimáticas de plantas de soja infectadas com a Phakopsora pachyrhizi en cortes longitudinales (aumento de 40X). (A y D) imágenes antes de la microdissección, (B y E) imágenes
después de la micro disección mostrando la región de donde las células fueron aisladas, (C y F) imagen del cap mostrando las
células capturadas por la micro dissección, (G) imagem final del cap después del aislamiento de diferentes sitios de infección.
B. Secuenciamiento
Los “reads” mostraron una calidad óptima, lo mismo que la extensión de 108 bases, teniendo 89,81%
de las bases de cada “read” Q_30 (Figura 10). Los “reads” fueron mapeados contra el genoma de referencia (Tabla 12). Los análisis de anotación de las secuencias y determinación de sus niveles de expresión
en las bibliotecas están en marcha.
Figura 10. Calidad media (Q) de los “basecalling” por base
Los “reads” de 108 pb (paired end) obtenidas a partir de los datos de RNASeq fueron analizados con
apoyo del Equipo de Bioinformática del Proyecto. El genoma de la soja disponible (Glyma01) fue utilizado
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como referencia para el anclaje de los tags en los GeneModels. La anotación fue basada en la disponible
para el genoma de la soja, bien como con base en bancos de datos Públicos de secuencias de DNA (NCBI:
www.ncbi.nlm.nih.gov) y de Proteínas [(Uniprot: http://www.uniprot.org/) y (Keeg: http://www.genome.
jp/kegg/ )]. El esquema de “pipeline” utilizado se encuentra en la Figura
Figura 11. “Pipeline” utilizado para el análisis Bioinformático en la identificación de ESTs expresados en tejidos de soja
después de la infección con roya asiática.
Se obtuvieron 80.255 y 52.496 “reads” de cada uno de los genotipos que después del mapeo contra el
genoma de la soja permitió la identificación de 31.155 contigs/singlets expresados en tolerante y 28.120
contigs/singlets en resistente. De este total, 26.761 contigs se expresaron en ambos genotipos. Cerca de
4.854.281 reads que no se mapearon contra el genoma de la soja están siendo mapeados contra ESTs
disponibles del hongo, asi como contra el genoma de la roya del trigo Puccinia graminis disponible en
Bancos de Datos públicos. Al final de los análisis, se espera identificar tanto genes de la planta como del
patógeno.
En base a la categorización funcional de los contigs/singlets, fue posible identificar genes expresados
relacionados con procesos biológicos y funciones moleculares previamente identificados en respuestas
a patógenos en diferentes patosistemas, así como en la roya, como factores de transcripción, kinasas,
peroxidasas y genes involucrados en la biosíntesis de fenilpropanoides, responsables de la formación
de compuestos secundarios y fortalecimiento de la pared celular por producción de lignina. El elevado
número de factores 2007 23/91 de transcripción y kinasas identificados sugiere intensa activación de genes e transducción de señales.
Los datos obtenidos continúan siendo procesados con ayuda del programa Blast2go para obtención de
informaciones detalladas sobre la función de los genes expresados en las dos bibliotecas y su distribución
en rutas biológicas importantes en la interacción soja-Phakopsora pachyrhizi. Además de esto, se espera
identificar genes del hongo relacionados con procesos de infección que puedan ayudar en la comprensión de los mecanismos moleculares durante la interacción planta patógeno.
Los datos están disponibles en el sitio: http://bioinfo.cnpso.embrapa.br/biotecsoja/index.php.
Bibliografía
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inheritance. Crop Science, v. 20. p. 254-255, 1980.
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FUNDAÇÃO MT. Segunda geração da soja inox já está sendo desenvolvida. Disponível em <http://
www.fundacaomt.com.br/noticias> Acesso em 23 nov. 2009. GARCIA, A.; CALVO, É. S.; KIIHL, R. A. de. S.;
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LAPERUTA, L. di C; ARIAS, C. A. A; RIBEIRO, A. S; RACHID, B. F; PIEROZZI, P. H. B; TOLEDO, J. F. F de;
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TREMBLAY A., LI S., SCHEFFLER B.E., MATTHEWS, B.F. 2009. Laser capture microdissection and expressed sequence tag analysis of uredinia formed by Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of Asian
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pachyrhizi infection. Plant Science, 179, 183–193.
2.2.8. Estudio de la interacción soja/Phakopsora por medio de la técnica de cDNA-AFLP.
EEAOC
Se realizó una inoculación, en condiciones controladas en un invernadero, sobre los genotipos resistente y susceptible, con inóculo de Brasil. Se colectaron muestras en 6 tiempos diferentes: 6 hs, 12hs, 24
hs, 72 hs, 96hs y 192 hs incluyendo cuatro tratamientos: 1) resistente inoculada, 2) resistente no inoculada (control), 3) susceptible inoculada y 4) susceptible no inoculada (control) con tres repeticiones de
cada tratamiento. Se realizó la extracción del RNA total en el laboratorio del EMBRAPA y las muestras se
trasladaron hasta Tucumán en alcohol y en hielo. En el laboratorio de la EEAOC se hizo la limpieza del
RNA y se verificó su calidad y cantidad. En estos momentos se está sintetizando el cDNA a partir del ARN
mensajero purificado con perlitas magnéticas. Este cDNA se cuantificará para posteriormente analizarlo
con la técnica de AFLP.
2.2.9. Estudio de la interacción soja/Phakopsora por medio de la técnica de microRNAs.
UBA
Se llevaron a cabo en EMBRAPA Soja (Londrina, Brasil) en colaboración con la investigadora Francismar Correa ensayos de infección con Phakopsora pachyrhizi en los cultivares resistentes y susceptibles al
patógeno. Se extrajo ARN total de tejido a las 6, 12, 24,72, 94 y 192 h post inoculación. Se evaluó la integridad del ARN extraído y se procedió al enriquecimiento en ARNs pequeños para el posterior análisis de
los niveles de expresión de microRNAs. Se ha iniciado el estudio en conjunto con INDEAR para la puesta
21
a punto de la secuenciación de microRNAs utilizando la plataforma de secuenciación Roche 454 GS-FLX y
como estrategia la obtención de bibliotecas de concatémeros.
Paralelamente se llevó a cabo un ensayo de infección realizado en el CRIAEncarnación-Paraguay en
colaboración con el Investigador Wilfrido Morel utilizando diferentes variedades de soja susceptibles y
resistentes al patógeno. Estas muestras fueron procesadas en forma semejante a las anteriores para su
el análisis de los niveles de expresión de microRNAs. A su vez se analizó en estos ensayos la expresión
de diferentes genes de Phakopsora pachyrhizi identificados por screening in silico de bibliotecas de EST
realizado en colaboración con el Dr. Patricio Yankilevich (INDEAR). Basados en información bibliográfica
de estudios realizados en otros fitopatógenos fúngicos se seleccionó un conjunto de secuencias génicas
potencialmente relevantes para la patogenicidad, con el fin de llevar a cabo experimentos de RT-PCR
semicuantitativa sobre cDNA proveniente de interacciones Phakopsora pachyrhizi/ soja. Resultados preliminares muestran que aquellos genes que codifican enzimas degradadoras de pared presentan una
máxima expresión a las 3hs post-infección, mientras que la expresión de otro gen presenta una expresión
máxima a las 24 hs post-infección.
2.2.10. Caracterización de perfiles metabólicos de plantas de soja en respuesta a inoculación con el
patógeno Phakopsora pachyrhizi.
INTA Castelar
Diseño del experimento para evaluar cambios en perfiles metabólicos de plantas de sojas resistentes
y susceptibles al patógeno Phakopsora pachyrhizi:
A partir de información previa disponible de evaluación de cultivares resistentes (R) y susceptibles (S)
al patógeno, se seleccionaron los cultivares resistentes y susceptible para conducir experimentos de análisis transcrptómico y metabolómico en forma simultanea y bajo las mismas condiciones experimentales
con el fin de poder evaluar en forma concertada los cambios ocurridos tanto en interacciones hospedante-patógeno compatibles como incompatibles.
El experimento se realizó en invernáculo en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad
en EMBRAPA Soja, Londrina, Brasil. El ensayo se condujo en macetas con dos plantas cada una. En el estadio V2-V3 las plántulas fueron inoculadas con el patógeno o solo asperjadas con agua (mock inoculadas)
y se tomaron muestras de 100 mg de tejido a las 6, 12, 24,72, 94 y 192 h post inoculación que se utilizarán para estudios a realizarse por los siguientes socios de la acción: -INTA Cautelar: Para el análisis de
perfiles metabólicos se tomaron seis replicas biológicas por muestreo (Figura 12). Las muestras han sido
liofilizadas para su procesamiento en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar. La inoculación y colecta
de muestras se realizó durante el mes de noviembre de 2009. -EMBRAPA soja: microdisección láser para
estudios de expresión genética. A partir de este tejido generar secuencias de ESTS por piroseceucniación.
-EEAOC: estudio de la expresión genética mediante cDNA-AFLP. -El Instituto Clemente Estable, INTA
Castelar, FCEyN-UBA realizarán colecciones de cDNA substractivas por la técnica SSH. -FCEN-UBA: estudio
de la expresión de micro RNAs de soja. Las muestras de ARN han sido liofilizadas para su procesamiento
en el Laboratorio de Agrobiotecnología, FCEN, UBA en colaboración con el grupo de investigación de la
UFRGS.
22
Figura 12: diseño del experimento de metabolómica para identificación de alteración de rutas metabólicas en un genotipo resistente y uno susceptible en respuesta a la infección del patógeno (I) tanto en interacciones compatibles como
incompatibles en comparación con plantas no inoculadas (NI)
Validación de protocolo para identificación de metabolitos por la técnica GC-MS: a fin de determinar
las condiciones óptimas de procesamiento de muestra, estado y cantidad optima de material vegetal,
protocolo d extracción de metabolitos, volumen de inyección y derivatización para su posterior análisis
por GC-MS, se procedió a validar el protocolo experimental a partir de hojas del cultivar susceptible
control utilizando el método descrito previamente para hojas de Arabidopsis, papa y frutos tomate (Lytovchenko et al. 2002; Roessner et al 2003) y ajustado recientemente por el grupo de trabajo de INTA Castelar para girasol (Peluffo et al 2009). Se realizaron extracciones a partir de tejido fresco y liofilizado y se
derivatizaron e inyectaron en un equipo GC-MS (LECO, EUA) dos volúmenes de extracto (2.5 y 5 % [v/v])
para evaluar abundancia relativa de metabolitos en las muestras (Figura 13).
Figura 13: Ejemplo de perfil metabólico de extractos de hoja de soja, cultivar BRS 184 para optimización del protocolo de
extracción, cantidad y estado de muestra a utilizar y volumen de inyección.
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Validación del protocolo de análisis de metabolitos en soja por GC-MS.
Se realizó un experimento para evaluar cambios en perfiles metabólicos de plantas de soja resistentes
y susceptibles al patógeno Phakopsora pachyrhizi. Como primer paso para la validación del protocolo
para identificación de metabolitos en soja por la técnica GC-MS se realizaron extracciones de material
vegetal de ambos genotipos, cultivadas en el Invernáculo del Instituto de Biotecnología en condiciones
similares a las del ensayo conducido en Londrina, pero sin inoculación con el patógeno.
El tejido de ambos genotipos se liofilizó previamente para imitar las condiciones de las muestras del
experimento de Brasil.
Se tomaron 3 variantes de masa inicial de tejido:
Tejidos liofilizado
10 mg
25 mg
35 mg
Equivalen a mg Tejido fresco
100 mg
250 mg
350 mg
Se tomaron 3 variantes de volumen a secar:
- 150 ul
- 200 ul
- 300 ul
Para cada genotipo y masa se hicieron 4 réplicas de cada volumen (2 para hacer la corrida común y la
de azúcares en el GC, y 2 más de backup) siguiendo el protocolo descrito previamente para hojas de Arabidopsis, papa y frutos tomate (Lytovchenko et al. 2002; Roessner et al 2003) y ajustado recientemente
por el grupo de trabajo de INTA Castelar para girasol (Peluffo et al, 2010).
Selección de tiempos post inoculación para evaluación por GC-MS:
La información disponible a nivel de perfiles de expresión realizadas en plantas de soja en respuesta a
Phakopsora pachyrhizi, por análisis de microarray muestran un patrón de expresión de tipo bifásico, con
un aumento temprano entre las 6 y 36 hs post inoculación, una caída a las 24-72 hs y un nuevo aumento
a las 72-168 hs post inoculación (van de Mortel et al. 2007). Atendiendo a este patrón de expresión, los
estudios de análisis metabolómicos se focalizaron en dos etapas del proceso de infección. En tiempos
tempranos: 6 y 12 hs post infección (en concordancia con la primera etapa de aumento de expresión) y
un tiempo tardío, 96 hs (en concordancia con un tiempo tardío de expresión).
Extracción y derivatización de muestras para análisis por GC-MS
A partir del tejido liofilizado, se pesaron 100 mg de cada replica biológica (1 a 6) de muestras colectadas a los 6, 12 y 96 días post inoculación con el patógeno (I) y de muestras inoculadas con agua (NI) para
el genotipo (R) y (S). En total se procesaron 72 muestras. El tejido liofilizado fue procesado y homogenizado por molido en frío y transferido a un tubo eppendorf de 2 ml. A cada muestra se le adicionaron
1400 µl de metanol 100% y 60 µl de un stock de Ribitol (0,2 mg/ml solución stock en agua) como control
interno de masa. Se agitó por 15 minutos en vortex a 70ºC, se centrifugaron 10 minutos a 14.000 rpm a
temperatura ambiente, se transfirió la fase acuosa a un vial de vidrio. Se adicionaron 750 µl de cloroformo y 1.500 µl de H2O, se agitó en vortex 15 s y se centrifugó 15 minutos a 4000 rpm. La fase polar (100
µl o 40 µl) se transfirió a un nuevo tubo. Las muestras fueron concentradas en frío, se les agregó Argón y
se congelaron a -80º C. Las muestras derivatizadas se analizaron por GC.MS en el Centro “Metabolomic
Discoveries” Potsdam, Alemania, utilizando controles de referencia. Las muestras se analizaron en un
equipo PEGASUS (LECO, USA).
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Análisis de datos
Los cromatogramas y espectros obtenidos se evaluaron con el programa MASSLAB (ThermoQuest,
Manchester, UK). Los niveles de los metabolitos detectados fueron normalizados por tiempo de retención y masa inicial de muestra. Se identificaron 123 metabolitos por comparación con bases de datos y
por comparación individual de espectros para cada uno de ellos. Estos metabolitos pudieron cuantificarse para identificar diferencias entre genotipos, tratamientos y días post inoculación. Asimismo se encontraron otros 96 metabolitos que no pudieron ser identificados por no estar representados en las base de
datos de metabolitos disponibles actualmente.
Un análisis preliminar de los niveles de un grupo de 23 metabolitos seleccionados en base al rol de los
mismos en este y otros sistema hospedante-patógeno, a través de análisis de varianza (ANOVA), de tres
factores, con efectos fijos, permitió identificar algunos cambios en los niveles de estos metabolitos entre
genotipos, días post infección y tratamientos, como también interacciones entre estos factores. Estos resultados derivan de un análisis preliminar de los perfiles metabólicos obtenidos recientemente. A partir
del análisis concertado de todos los metabolitos identificados en este sistema, se podrán identificar rutas
metabólicas claves involucradas en la respuesta a Phakopsora pachyrhizi. La identificación de patrones
de metabolitos diferenciales entre genotipos contribuirá a la selección de biomarcadores, útiles no sólo
para la selección de genes candidatos robustos, a través de la integración de perfiles metabólicos y perfiles transcripcionales, sino también para la generación de herramientas alternativas para la selección de
genotipos resistentes, a través de estrategias de ingeniería metabólica.
Bibliografía
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A., Baum T., and Whitham S. (2007). Distinct Biphasic mRNA Changes in Response to Asian Soybean Rust
Infection. MPMI 20, 8, 887–899.
2.2.11. Caracterización molecular de aislados de Phakopsora pachyrhizi provenientes del MERCOSUR.
EEAOC
En el marco del proyecto BiotecSur se optimizó un protocolo para la extracción de ADN a partir de
esporas de Phakopsora sp. Se colectaron uredinosporas a partir de hojas de soja y kudzú (K) con síntomas
típicos de la enfermedad. Se procesaron muestras provenientes de Argentina de las provincias de Tucumán (Un), Salta (Mosconi: Mo) y Misiones (MS), también se incluyeron muestras de Paraguay (1P, 2P, 3P,
4P, 5P, PL2, PL5, VP, PV, SA, CC, CRIA), de Brasil (MT, RS, PR, BA) y Uruguay (RU1, RU2, RU3, RU6). La identificación del género y la especie de las muestras se realizó por amplificación por PCR usando cebadores
desarrollados para ese fin. En todos los casos se confirmó que las muestras procesadas correspondían a
Phakopsora pachyrhizi. Posteriormente, se ajustó la técnica de AFLP para estudiar la diversidad genética
y con 34 combinaciones de cebadores, de las 64 posibles, se obtuvieron amplificaciones de buena calidad
que mostraron alta diversidad genética en las muestras analizadas (Tabla 4). Se obtuvieron 1581 bandas
amplificadas en todos los genotipos, a partir de estos datos se generó una matriz binaria tomando en
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cuenta la presencia (1) y ausencia (0) de las mismas. La matriz se cargó en el programa INFOGEN y se
calcularon las distancias genéticas entre los aislados usando el coeficiente de similitud de Jaccard. El resultado se observa en la figura 14.
Tabla 4. Combinaciones de cebadores utilizados en los estudios de P. pachyrhizi.
Combinaciones que produjeron amplificaciones. Combinaciones que no produjeron amplificaciones.
Figura 14. Dendrograma que muestra las similitudes entre aislados de Phakopsora pachiryzhi detectada con 34 combinaciones de cebadores AFLP.
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2.3. PODREDUMBRE CARBONOSA
2.3.1. Fenotipado de la resistencia a podredumbre carbonosa (Macrophomina phaseolina).
Se ajustó un procedimiento para la producción de micro esclerocios que se utilizaron para inocular los
ensayos a campo y condiciones controladas como se detalla a continuación. Colocar 4000 ml de semillas
de milleto o arroz integral, agregar 40 g de azúcar, 0,5 g de extracto de levadura y 1 g ácido tartárico. Llevar con agua destilada a volumen final de 5 litros, dejar en remojo durante 24 h y esterilizar en autoclave
durante 30 minutos a 115ºC. Dejar enfriar y colocar porciones de micelio de Macrophomina phaseolina
crecido en PDA, mezclar bien e incubar en estufa a 30°C durante 20 días para el desarrollo de los esclerocios.
(A) Evaluaciones a campo
En base a reuniones previas mantenidas por los integrantes del Consorcio, fueron cedidos al BiotecSojaSur ensayos del CRIA (Paraguay) y del INTA Balcarce (Argentina), que se iniciaron antes del otorgamiento del Proyecto. Los resultados de los mismos estarán disponibles hacia fines de agosto del corriente año.
El listado de los genotipos evaluados en Paraguay se muestra en la Tabla 5. La siembra se realizó en
surcos de 1 m de largo con 4 repeticiones por cada genotipo. Al momento de la siembra se agregaron 1,5
g de la mezcla de semillas de milleto con esclerocios por cada metro de surco. Las evaluaciones se encuentran en marcha en base a una estimación visual del nivel de severidad. La escala va del 1 al 5, como
se describe en la Figura 15. Se consideran 5 plantas por cada genotipo en estado reproductivo (R7). Se
registra la severidad en el tallo y se analiza el índice de unidades formadoras de colonias (IUFC) de acuerdo a la siguiente escala (ver Figura 15):
• Inmune (0)
• resistente (1 a <10)
• moderadamente resistente (10 a ≤30)
• moderadamente susceptible (>30 a 60)
• susceptible (>60)
RR
CONVENCIONAL
13
CD -233 COODETEC
29
CD -214 COODETEC
45 CD -216 COODETEC
1
MK- SPRING SYNGENTA
14
DALIA 500
30
BRS -245
46 A 5543 NIDERA
2
NK- 3363 SYNGENTA
15
NA 5909 NIDERA
31
CD -225 COODETEC
47 BRS 246
3
NK- 2555 SYNGENTA
16
BRS 256
32
MARIA 54
48 CD -221 COODETEC
4
BRS -282
17
CD 235 COODETEC
33
FT 10 A
49 NA 5509
5
BRS -185
18
TMG 4001
34
MUNASGA 8.4
50 BRS 243
6
FT -FENIX
19
NA 4990 NIDERA
35
BRS -255
51 CD -231 COODETEC
7
BRS -154
20
CD 226 CO0DETEC
36
NA 5009 NIDERA
52 CANDELA 5.7
8
BRS -283
21
NUEVA MARIA 55
37
IGRA 516
53 IGRA 629
9
BRS -156
22
A 4910 NIDERA
38
BRS -242
54 ANDREA 6.6
10
BRS -284
23
A 6411 NIDERA
39
A 5920 NIDERA
55 8000 NIDERA
11
BRS -268
24
IGRA 518 IGRA
40
NA 6126
56 5.7 I DON MARIO
12
V- MAX
25
DALIA 700
41
FT CASCAVEL
57 5.1 I DON MARIO
26
A 7321 RG NIDERA
42
NA 8009 NIDERA
58 7.0 I DON MARIO
27
NUEVA MERCEDES 70
43
NA 5209 NIDERA
28
A 7118 NIDERA
44
FT CAMPO MOURAO
Tabla 5. Listado de materiales evaluados en Capitán Miranda, Paraguay durante la campaña 2009.
27
Figura 15: Escala de severidad de los daños causados por Macrophomina phaseolina en soja.
Figura 16. Placas con los diferentes Índices de Unidades Formadoras de Colonias (IUFC). 1: inmune, 2: resistente, 3: moderadamente resistente, 4: moderadamente susceptible y 5: susceptible.
Aislamiento en el laboratorio.
Cuando las plantas alcanzaron la etapa reproductiva (R7) se cortaron las mismas a una altura de 10
cm, se secaron y se molieron, tanto raíz como tallo de cada muestra. Una vez terminada la molienda se
colocaron en un tubo de ensayo para el posterior análisis en el medio de cultivo en el laboratorio. Las
muestras molidas se desinfectaron con hipoclorito de sodio tres veces durante 1 minuto y se lavaron
con agua estéril para remover el desinfectante. Las muestras a ser aisladas dispersaron sobre medio de
cultivo PDA adicionado con antibiótico (Rifampimicina 0,5 g/50 ml de PDA) para eliminar contaminantes
indeseables. Se utilizaron placas de petri con 5 ml del medio de cultivo donde se sembraron 0.005 g de
raíz molida por cada muestra. La incubación se hizo a una temperatura de 30°C por un período de entre
4-5 días para el desarrollo de las colonias.
El desarrollo de colonias en el medio, determinó el nivel de resistencia de cada material genético estudiado. En la tabla 15 podemos observar los resultados obtenidos,
En Argentina se realizaron evaluaciones a campo en las localidades de Reconquista (Santa Fe), Presidente Roque Sáenz Peña (Chaco) y Anguil (La Pampa). El listado de los genotipos utilizados se muestra en
la Tabla 6.
28
Localidad: Reconquista
(Santa Fe) y P.R.S. Peña (Chaco)
*
1
Relmó
2
Don Mario
3
Relmó
4
EEAOC
5
Nidera
6
Nidera
7
Santa Rosa
8
Santa Rosa
9
Santa Rosa
10
La Tijereta
11
La Tijereta
Localidad: Anguil
(La Pampa) **
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Nidera
Nidera
ACA
Relmó
Don Mario
Don Mario
Don Mario
SPS
SPS
SPS
Tabla 6. Listado de genotipos evaluados en Argentina para resistencia/susceptibilidad a podredumbre carbonosa.
Evaluación en laboratorio de genotipos sembrados en ensayos de campo de Argentina, campaña
2009/2010. En INTA Balcarce se realizó la determinación de UFC/g de tejido radical de las muestras provenientes de tres localidades de Argentina en la campaña 2009/2010 según la metodología publicada por
Mengistu et al. (2007). Pese a los bajos valores de severidad registrados en el campo, se pudieron detectar UFC y elaborar el índice relativo de la campaña 2009/2010 en cada sitio. En la Tabla 18 se muestran
los resultados del comportamiento relativo de los genotipos usados en cada localidad en Argentina, y a
modo comparativo, se incluyen los resultados obtenidos para los genotipos usados en común con el CRIA
de Paraguay en las últimas dos campañas de campo.
(B) Bajo condiciones controladas
Se realizaron infecciones con Macrophomina sobre semillas, cotiledones y plántulas de soja en el INTA
Balcarce (ver Figura 17). Los resultados obtenidos no fueron concluyentes y se continúa trabajando en
esta línea para ajustar un protocolo definitivo.
Figura 17. Métodos de evaluación (de izquierda a derecha) en: cotiledones, semillas y plántulas de soja infectadas con
Macrophomina phaseolina.
En un futuro cercano, se conducirán ensayos de hidroponía para valorar la interacción entre la resistencia/susceptibilidad a podredumbre carbonosa y el estrés hídrico.
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2.3.2. Inoculaciones de soja con Macrophomina phaseolina en maceta y caracterización molecular
de aislados.
EEAOC
Se realizaron ensayos en condiciones semi controladas, en invernadero de la Sección Biotecnología de
la EEAOC, usando dos genotipos de soja con respuesta contrastante, en ensayos de campo, a la infección
con Macrophomina phaseolina.
Genotipos: susceptible y resistente
Tratamientos:
1-Sequía + Macrophomina phaseolina
2-Sequía
3-Macrophomina phaseolina
4-Control
Se realizaron 4 repeticiones por tratamientos y 3 bloques. Sustrato: se utilizó suelo de la localidad
Monte Redondo, Tucumán mezclado con arena (3:1), se adicionó superfosfato triple y se esterilizó en
autoclave. Macetas: de PVC de 10 cm de diámetro y 33 cm de altura. Cada maceta se llenó con aproximadamente 3000 g de sustrato. Inoculación: se realizó colocando 3 granos de arroz colonizados por el patógeno por cada semilla de soja al momento de la siembra. Se sembró una semilla por maceta. Se utilizó el
aislado Mp Nº 31, proveniente de la localidad de Monte Redondo de Tucumán.
En la figura 18 se muestran fotos del ensayo. A partir de este experimento se pudieron recuperar
unidades formadoras de colonias del genotipo tolerante inoculado con M. phaseolina. Sin embrago, las
plantas del genotipo susceptible mostraron problemas de desarrollo y los análisis fitopatológicos evidenciaron que las semillas estaban contaminadas con Fusarium sp. Para solucionar estos inconvenientes se
procedió a obtener semilla nueva de alta calidad sanitaria para repetir estos ensayos.
Figura 18. Fotografía de los ensayos bajo condiciones de invernadero de dos genotipos contrastante en su respuesta a M.
phaseolina. A) Ensayo al momento de la siembra. B) vista general del ensayo tres meses después de la siembra. C) comparación del estado de las plantas con riego óptimo (derecha) y plantas en estrés hídrico inoculadas con el hongo. D) Lavado de
las plantas antes de la desinfección y posterior siembra para contabilizar unidades formadoras de colonias.
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