Prieto ManriqueE_2015
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EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ACEITES VEGETALES A VACAS PASTOREANDO CON/SIN SISTEMA SILVOPASTORIL INTENSIVO CON LEUCAENA SOBRE LOS ÁCIDOS GRASOS EN LA LECHE Y LA PRODUCCIÓN DE METANO IN VITRO EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ACEITES VEGETALES A VACAS PASTOREANDO CON/SIN SISTEMA SILVOPASTORIL INTENSIVO CON LEUCAENA SOBRE LOS ÁCIDOS GRASOS EN LA LECHE Y LA PRODUCCIÓN DE METANO IN VITRO ESPERANZA DEL PILAR PRIETO MANRIQUE Estudiante Tutora LILIANA MAHECHA LEDESMA Co-tutor JOAQUIN ANGULO ARIZALA Comité tutorial LILIANA MAHECHA LEDESMA JOAQUIN ANGULO ARIZALA JULIO ERNESTO VARGAS SANCHEZ JAIME RICARDO ROSERO NOGUERA DOCTORADO EN CIENCIAS ANIMALES UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA 2015 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias | Agradecimientos Mis más sinceros agradecimientos a la Universidad de Sucre que financió mis estudios, a Colciencias, a la Universdad de Caldas y a la Universidad de Antioquia quienes financiaron el proyecto de investigación. A todos los docentes que acompañaron mi proceso de formación de doctorado, especialmente a la D. Agri. Liliana Mahecha Ledesma y a los profesores Joaquín Angulo Arizala, Julio E Vargas Sánchez y Ricardo Rosero Noguera, miembros de mi comité tutorial por su orientación. Al M.Sc. Julio Vargas Sánchez - profesor Universidad de Caldas y líder del proyecto de investigación. Al DR. Gerardo Gagliostro – investigador INTA, por sus enseñanzas sobre el tema. A Luis Edwin Avila, Juan Carlos Gómez, Juan Pablo Vélez, David Mayorga, Carlos Mario Bohada, Alejandro Montoya, Elsa Tequín y demás estudiantes de la Universidad de Caldas que participaron en la ejecución de la fase de campo y de proyecto. A mis compañeros de UDEA Fredy Ramírez, laboratorio del Elizabeth Correa y Omar Ceballos por su acompañamiento y apoyo en la fase in vitro. A José Alfredo Jiménez Fonseca, Asistente técnico de Fedegan, por su valioso apoyo en las fincas de Guajira. A Juan Carlos Pérez y Henry Cuello, estudiante y egresado de la Universidad de Sucre, quienes apoyaron la fase de campo en Guajira. A los ganaderos Carlos Alberto Gómez Buendía (Finca Asturias), Milciades Salas (Finca Pradera ), Andrés Jaramillo Bernal (Finca Maracaibo), Roberto Gutiérrez (Fincas Vargas y Japón), Claudia Patricia Arcila (Finca Esperanza), Juan José Molina y Flia (Finca Hatico), Salvador Raad (Finca Salsipuedes), Abraham Ovalle (finca Campo Alegre) , a los administradores Juan Fernando Suárez (Finca Lucerna), José Fernando Cardona (Finca San Felipe), Alirio Nieto (Finca La Pradera) y a sus trabajadores quienes muy gentilmente, apoyaron el desarrollo de este trabajo. A mi compañero de trabajo DR. René Patiño, por su constante tutoría, al DR. Mario Cerón Muñoz - profesor de la Universidad de Antioquía y a dos grandes sucreños: DR. Oscar Vergara Garay – profesor Universidad de Córdoba - i Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias y M.Sc. Wilson Barragán – Investigador de Corpoica -, quienes me acompañaron en el procesamiento estadístico. A todos MIL GRACIAS. ii Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias | Dedicatoria Dedico este trabajo a mi familia y especialmente a mi amado esposo y a nuestro hijo Juan Andrés, para quienes la ganadería forma parte de su cotidianidad. A mis estudiantes de la universidad de Sucre que en poco tiempo serán los profesionales encargados de contribuir con el desarrollo de la ganadería y al sector ganadero, especialmente al sector lechero. iii Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla de Contenido | Agradecimientos .................................................................................................................................... i | Dedicatoria............................................................................................................................................ iii | Resumen General ................................................................................................................................. 1 | Abstract .................................................................................................................................................. 4 | Introducción General ........................................................................................................................... 7 | Objetivos............................................................................................................................................... 12 Objetivo General ................................................................................................................................ 12 Objetivos Específicos ......................................................................................................................... 12 Hipótesis .............................................................................................................................................. 13 | Capítulo 1 ............................................................................................................................................. 14 Efecto de la suplementación lipídica sobre la concentración de ácido linoleico conjugado (CLA-c9t11) en leche de vaca y la producción de metano: Revisión ............................................ 14 RESUMEN ............................................................................................................................................... 15 INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 16 ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO ............................................................................................................. 18 ORIGEN DEL CLA-c9t11 EN RUMIANTES ................................................................................................. 19 Formación de CLA como consecuencia de la bio-hidrogenación ruminal (BHR) de ácidos grasos. .... 19 Síntesis endógena en la glándula mamaria ........................................................................................ 27 ESTRATEGIAS PARA AUMENTAR CLA-c9t11 Y ATV EN LECHE ................................................................. 28 EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE CLA-c9t11 Y ATV ................................................................. 29 EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE PRODUCCIÓN Y COMPOSICIÓN DE LA LECHE ..................... 38 EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE LA PRODUCCIÓN DE METANO ............................................ 39 CONSIDERACIONES FINALES ................................................................................................................... 44 REFERENCIAS .......................................................................................................................................... 45 | Capítulo 2 ............................................................................................................................................. 62 iv Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Caracterización de la grasa y ácidos grasos en la leche de vacas de los sistemas doble propósito y lechería tropical, pastoreando con /sin sistema silvopastoril intensivo con leucaena ................................................................................................................................................... 62 RESUMEN ............................................................................................................................................... 63 INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 65 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................................... 68 Localización ........................................................................................................................................ 68 Análisis estadístico ............................................................................................................................. 77 RESULTADOS .......................................................................................................................................... 78 Lechería Tropical ................................................................................................................................ 78 Sistema Lechería Tropical SSPi ........................................................................................................... 83 Sistema Doble Propósito .................................................................................................................... 87 Sistema Doble Propósito SSPi ............................................................................................................. 90 DISCUSIÓN ............................................................................................................................................. 93 Contenido de grasa en leche .............................................................................................................. 93 Consumo de alimento ........................................................................................................................ 93 Concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche y de sus precursores en la dieta............ 95 Concentración de CLA, TVA y otros AGCL en la leche y número de partos...................................... 102 Concentración de CLA, TVA y otros AGCL en la leche y tercio de lactancia ..................................... 102 CONCLUSIONES .................................................................................................................................... 103 REFERENCIAS ........................................................................................................................................ 104 | Capítulo 3 ........................................................................................................................................... 114 Ácidos grasos, fermentación ruminal y producción de metano in vitro, de forrajes de silvopasturas intensivas con leucaena ............................................................................................. 114 RESUMEN ............................................................................................................................................. 115 ABSTRACT ............................................................................................................................................. 116 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................... 117 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................................... 119 Localización ...................................................................................................................................... 119 Determinación de la cinética de fermentación y degradación in vitro ............................................ 124 v Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Determinación de metano, pH, ácidos grasos volátiles y perfil de ácidos grasos (ALC, ATV y AGCL) ......................................................................................................................................................... 126 Estimación de la biohidrogenación .................................................................................................. 128 Análisis estadístico ........................................................................................................................... 128 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................................... 129 Ácido linoleico conjugado, trasvaccénico y otros ácidos grasos de cadena larga después de la fermentación ruminal ...................................................................................................................... 129 Parámetros de fermentación y producción de metano ................................................................... 137 CONCLUSIONES .................................................................................................................................... 142 AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................. 143 REFERENCIAS ........................................................................................................................................ 144 | Capítulo 4 ........................................................................................................................................... 155 Efecto de la inclusión in vitro de aceites vegetales a dietas de base forrajera con/sin sistema silvopastil intensivo con leucaena, sobre ácidos grasos, fermentación ruminal y producción de metano ......................................................................................................................... 155 RESUMEN ............................................................................................................................................. 156 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................... 157 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................................... 160 Localización ...................................................................................................................................... 160 Determinación de la cinética de fermentación y degradación in vitro ............................................ 165 Determinación de metano, pH, ácidos grasos volátiles (AGV) y perfil de ácidos grasos (CLA-c9t11, ATV y AGCL)...................................................................................................................................... 166 Análisis estadístico ........................................................................................................................... 168 RESULTADOS ........................................................................................................................................ 169 Concentraciones de CLA-c9t11 , ATV y otros AGCL producto de la fermentación ruminal .............. 169 Parámetros de fermentación y producción de metano ................................................................... 173 DISCUSIÓN ........................................................................................................................................... 175 Perfil de ácidos grasos producto de la fermentación ruminal .......................................................... 175 Parámetros de fermentación ........................................................................................................... 178 Producción de metano ..................................................................................................................... 180 Inclusión de leucaena, biohidrogenación y producción de metano ................................................. 182 vi Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias CONCLUSIONES .................................................................................................................................... 183 REFERENCIAS ........................................................................................................................................ 184 | Capítulo 5 ........................................................................................................................................... 193 Efecto de la suplementación con aceite de girasol sobre el perfil de ácidos grasos de la leche de vacas en sistemas de lechería tropical y doble propósito manejadas con y sin sistema silvopastoril intensivo con leucaena ................................................................................................. 193 RESUMEN ............................................................................................................................................. 194 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................... 196 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................................... 199 Localización ...................................................................................................................................... 199 Análisis estadístico ........................................................................................................................... 208 Análisis económico ........................................................................................................................... 209 RESULTADOS ........................................................................................................................................ 210 Ensayo 1. Sistema Lechería Tropical ................................................................................................. 210 Ensayo 2. Sistema Lechería Tropical SSPi ......................................................................................... 213 Tabla 5.12. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día) a partir del consumo total utilizando cromo como marcador, en los diferentes tratamientos en el sistema lechería tropical SSPi ......................................................................................................................................................... 213 Ensayo 3. Sistema Doble Propósito SSPi ........................................................................................... 216 DISCUSIÓN ........................................................................................................................................... 225 Consumo de forraje .......................................................................................................................... 225 Producción y composición de la leche.............................................................................................. 227 Perfil de ácidos grasos ...................................................................................................................... 230 Análisis económico ........................................................................................................................... 232 CONCLUSIÓN ........................................................................................................................................ 233 REFERENCIAS ........................................................................................................................................ 234 | Capítulo 6 ........................................................................................................................................... 242 Conclusiones Generales ...................................................................................................................... 242 vii Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Lista de tablas Pag Tabla 1.1. Porcentaje de ácidos grasos presentes en aceite de diferentes semillas............ 30 Tabla 1.2. Variación en el porcentaje de CLA , ATV , AG insaturados, saturados del total de grasa de la leche, % grasa, producción de leche y rendimiento en grasa , en la leche de vaca suplemetadas con diferentes fuentes de AG ................................................. 36 Tabla 2.1. Localización y características generales de las fincas en estudio....................... 69 Tabla 2.2. Suplementacón ofrecida en las fincas en estudio……………………………….. 70 Tabla 2.3. Composición química y ácidos grasos de los forrajes de los sistemas de producción en estudio.............................................................................................................. 72 Tabla 2.4. Composición química y ácidos grasos de los suplementos................................. 73 Tabla 2.5. Consumo estimado de forraje y de ácidos grasos oleico, linoleico y linolénico... 74 Tabla 2.6. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema lechería tropical.................................................................................................................................. 79 Tabla 2.7. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema lechería tropical SSPi............................................................................................................................ 85 Tabla 2.8. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema doble propósito................................................................................................................................ 88 Tabla 2.9. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema doble propósito SSPi....................................................................................................................... 91 viii Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 3.1. Composición nutricional y perfil de ácidos grasos de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, propios de lecherías sin y con sistema silvopastoril, utilizados en la evaluación in vitro, antes de la incubación por veinticuatro horas.................................................................................................................. 121 Tabla 3.2. Ácidos grasos (g de AG/100 g de AG Totales) obtenidos en la fermentación ruminal in vitro de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, propios de lecherías sin y con sistema silvopastoril, después de la incubación por veinticuatro horas...................................................................................................................................... 132 Tabla 3.3. Biohidrogenación obtenida en la fermentación ruminal in vitro de los ácidos grasos insaturados C18 de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, propios de lecherías sin y con sistema silvopastoril, después de la incubación por veinticuatro horas................................................................................................................... 134 Tabla 3.4. Cinética de fermentación, producción de metano, concentración y proporción de ácidos grasos volátiles (AGV) producto de la fermentación ruminal in vitro de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, propios de lecherías sin y con sistema silvopastoril............................................................................................................... 138 Tabla 4.1. Ácidos grasos de los aceites.................................................................................. 161 Tabla 4.2. Composición nutricional y perfil de ácidos grasos de los tratamientos utilizados, en la evaluación in vitro, antes de la incubación de las dietas........................... 162 Tabla 4.3. Ácidos grasos (g de AG/100 g de AG Totales) obtenidos en la fermentación ruminal in vitro de las dietas con adición de diferentes aceites a nivel del 2% y 4% de la MS, después de la incubación por 24 horas.......................................................................... 170 Tabla 4.4. Cinética de fermentación, producción de metano, concentración y proporción de ácidos grasos volátiles (AGV) producto de la fermentación in vitro de las dietas con adición de diferentes aceites a nivel del 2% y 4% de la MS.................................................. 174 Tabla 5.1. Localización de los ensayos realizados................................................................. 200 ix Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.2. Características de los sistemas de producción de leche....................................... 200 Tabla 5.3. Manejo alimenticio dado en los diferentes sistemas........................................... 201 Tabla 5.4. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos, en el sistema lechería tropical (LT) ……………………........................................................ 202 Tabla 5.5. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos, en el sistema lechería tropical SSPi (LTSSPi) ………………….......................................... 202 Tabla 5.6. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos, en el sistema doble propósito (DP) …………………….......................................................... 203 Tabla 5.7. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos, en el sistema doble propósito SSPi (DPSSPi) …………………............................................ 203 Tabla 5.8. Perfil de ácidos grasos del aceite de girasol utilizado.......................................... 204 Tabla 5.9. Consumo estimado de MS y cantidad de aceite suministrado en cada uno de los sistemas.............................................................................................................................. 204 Tabla 5.10. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día), en los diferentes tratamientos en el sistema lechería tropical….................................................. 210 Tabla 5.11. Consumo de forraje, producción, composición y perfil de ácidos grasos de la leche en el sistema lechería tropical……………………...................................................... 211 Tabla 5.12. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día), en los diferentes tratamientos en el sistema lechería tropical SSPi............................................ 213 Tabla 5.13. Consumo de forraje, producción, composición y perfil de ácidos grasos de la leche en el sistema lechería tropical SSPi.......................................................................... 214 Tabla 5.14. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día), en los diferentes tratamientos en el sistema doble propósito SSPi….......................................... 217 x Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.15. Consumo de forraje, producción, composición y perfil de ácidos grasos de la leche en el sistema doble propósito SSPi.......................................................................... 218 Tabla 5.16. Análisis económico sin precio de venta del litro de leche diferencial por contenido de CLA.................................................................................................................... 222 Tabla 5.17. Análisis económico con precio de venta del litro de leche diferencial por contenido de CLA.................................................................................................................... 224 Lista de Figuras Pag. Figura 1.1. Tipos comunes de lípidos de almacenamiento y de membrana................. 19 Figura 1.2. Vías de biohidrogenación de los ácidos (A) linolénico, (B) linoleico y (C) oleico. ............................................................................................................................... 21 Figura 1.3. Papel de Butyrivibrio spp. , Propionibacterium acnes y Butyrivibrio proteoclasticum sobre el metabolismo de los ácidos grasos insaturados linoleico y oleico................................................................................................................................. 23 Figura 1.4. Vías metabólicas para la biosíntesis de CLA y compuestos relacionados de ácido linoleico por bacterias del rumen (B) y protozoos (P)....................................... 24 Figura 1.5. Vías para la síntesis ruminal y endógena de CLA cis9, trans-11 en vacas lecheras y estrategias para aumentar el contenido CLA en la grasa de la leche.................................................................................................................................. 29 Figura 2.1. Concentración de CLA-c9t11 en la grasa láctea de los sistemas LT, DP, DPSSPi (3 tercios de lactancia) y LTSSPI (2 tercios de lactancia)................ 81 Figura 2.2. Concentración de ATV en la grasa láctea de los sistemas LT, DP, DPSSPi (3 tercios de lactancia) y LTSSPI (2 tercios de lactancia)....................... 82 xi Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Lista de Abreviaturas AG Ácidos grasos AGCL Ácidos grasos de cadena larga ATV Ácido trans-vaccénico BHR Biohidrogenación ruminal CLA Ácido linoleico conjugado (Conjugated linoleic acid) FA Fatty Acids LDL Lipoproteínas de baja densidad (Low density lipoproteins) LCFA Long chain fatty acids MS Materia seca xii Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias | Resumen General El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de la suplementación con aceites vegetales (comerciales) sobre la concentración de ácido linoleico conjugado C18:2 c9t11 (CLA-c9t11), el ácido transvaccénico C18:1 t11 (ATV), otros ácidos grasos de cadena larga (AGCL), la fermentación ruminal y la producción de metano in vitro y sobre la concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche producida en ganaderías de lechería tropical especializada (LT) y doble propósito (DP), cuyos animales pastorean en solo gramíneas de pasto Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (Leucaena leucocephala). Inicialmente se evaluó el efecto del plano alimenticio, número de partos y tercio de lactancia sobre CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche producida en estas ganaderías. Seguidamente, mediante un estudio in vitro, se determinó el efecto de los forrajes propios de estas ganaderías, sobre la concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL, fermentación ruminal y producción de metano. El perfil de ácidos grasos de los alimentos y de la leche, así como el de la digesta de los estudios in vitro, se obtuvo por cromatografía de gases. Los estudios in vitro se realizaron mediante la técnica de producción de gas y el consumo de leucaena se determinó mediante la técnica de desaparición de forraje. En la fase inicial, la concentración de CLA-c9t11 en la leche osciló entre 1.02 y 2.22 g/100g de AG. En los sistemas LT, LTSSPi y DP, la alta participación de la grasa de los suplementos (51 a 84%) en el total de grasa consumida (entre 1.63 a 4.44% de la MS) y la composición de la grasa de los suplementos, llevó a variaciones en el perfil de AG. 1 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias En el sistema DPSSPi a base de solo forraje, solo varió la concentración de ATV, siendo menor cuando el forraje se cosechó a mayor edad. Sin embargo, en los sistemas LT, DP y DPSSPi, el índice de aterogenicidad no fue afectado por el plano alimenticio manteniendo un valor entre 2.16 y 2.89, mientras que en el sistema LTSSPi, si hubo efecto y el mayor consumo de ácido oleico, en una de las tres fincas evaluadas, redujo el índice de aterogenicidad a 1.69 vs 2.12, 2.70. El número de partos y el tercio de lactancia demostraron poca influencia sobre el contenido de CLA-c9t11 y el perfil de ácidos grasos en la leche, cuando se compara frente a los factores dietarios. En el ensayo in vitro inicial, no se encontró efecto de los forrajes, sobre el contenido de CLA-c9t11 en la digesta. La inclusión de 14% de leucaena aumentó el contenido de ácido linoleico y linolénico en el alimento, y de ATV, esteárico, linoleico y linolénico en la digesta, no afectó la cinética de fermentación, digestibilidad de la materia seca (MS), pH, total y proporción de ácidos grasos volátiles (AGV), ni redujo la producción de metano. La suplementación con aceite de girasol al 2 y 4% de la MS en las dietas de los diferentes sistemas, en el estudio in vitro, resultó en un mayor aumento en el contenido de ácido linoleico, CLA-c9t11 y de ATV en la digesta, con respecto a aceite de palma y lino. Ninguna suplementación afectó la cinética de fermentación, pH, concentración total de AGV, proporción de AGV, ni redujo la producción de metano. En base a estos resultados, se seleccionó el aceite de girasol para evaluar bajo condiciones de campo. A nivel de campo, no se pudo desarrollar el estudio en la finca del sistema DP porque se presentó rechazo del aceite por parte de las vacas. En los otros sistemas (LT, LTSSPi y DPSSPi), la proporción de CLA-c9t11 y ATV aumentaron linealmente con los dos niveles de suplementación y los AG aterogénicos disminuyeron, obteniéndose una leche con mayor cantidad de AG insaturados y menor índice de aterogenicidad. El 2 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias ingreso neto adicional fue mayor a nivel de suplementación de 4%, si la leche se mercadea con un valor diferencial por contenido de CLA- c9t11. Los resultados del presente estudio, muestran que la suplementación con aceite de girasol a vacas en pastoreo, permite aumentar en la leche los AG benéficos para la salud humana. No obstante, el nivel de inclusión de leucaena (14 a 16%) observado en los animales en condiciones de campo y la cantidad de aceite adicionado, no fueron suficientes para reducir la producción de metano in vitro. Esta investigación mejoró el conocimiento de la leche producida en Colombia, como “producto funcional”, constituyéndose en una herramienta para mercadear nuestros productos lácteos con un valor diferencial. 3 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias | Abstract Aim of this investigation was to evaluate the effect of dietary supplementation with vegetable oils (commercial) on concentration of c9t11 C18:2 conjugated linoleic acid (c9t11 CLA), t11 C18:1 transvaccenic acid (TVA) and other long-chain fatty acids (LCFA), ruminal fermentation and methane production in vitro, and on concentration of c9t11 CLA, TVA and other LCFA in the produced milk of specialized tropical dairy (LT) and double-purpose cattle (DP) which herds graze in cord grass Estrella (Cynodon plectostachyus) and/oder Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania), and in intensive livestock farming systems (SSPi) with Leucaena (Leucaena leucocephala). Initially, the effect of dietary level, parity and third of lactation on the production of c9t11 CLA, TVA and other LCFA was evaluated in the produced milk of these herds. Thereafter, the effect of own forage on the concentration of c9t11 CLA, TVA and others LCFA, ruminal fermentation and methane production was assessed by an in vitro study. Fatty acid profiles of food and milk, as well as the digesta of in vitro studies were assessed by gas chromatography. In vitro studies were performed by gas production technique. Leucaena consumption was estimated by herbage disappearance. In the initial phase, concentration of c9t11 CLA in the produced milk ranged from 1.02 2.22 g/100g FA. In LT, LTSSPi and DP systems, the amount of fat supplements (51 84%) on total fat consumed (1.63 - 4.44% of DM), and the fat composition of these supplements led to changes in the fatty acid profile. In the DPSSPi system based on single fodder, only TVA concentration varied being lower when the fodder was harvested later in life. Atherogenic index was not affected in LT, DP, or DPSSPi systems by dietary levels conserving values between 2.16 - 2.89. But in LTSSPi system, the increased consumption of oleic acid reduced the rate of atherogenicity in one of the 4 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias three tested farms to 1.69 vs 2.12, 2.70 in the remaining two farms. Parturition and lactation have little influence on content of c9t11 CLA and profile of fatty acids in milk, when compared against dietary factors. In the initial in vitro assay, no effect of forage was found on the content of c9t11 CLA in the digesta. Inclusion of 14% leucaena increased content of linoleic and linolenic acids in the food, and of TVA, stearic, linoleic and linolenic acids in the digesta, did not affect fermentation kinetics, digestibility of dry matter (DM), pH, total and ratio of volatile fatty acids or methane production. Supplementation with sunflower oil (2 - 4% DM) in the different dietary systems, in vitro, increase more the content of linoleic acid, c9t11 CLA and ATV in the digesta compared to palm or flax oil supplementation. Any of the tested supplementations affect fermentation kinetic, pH, total VFA concentration, VFA ratio or reduced methane production. Based on these results, sunflower oil was selected to be evaluated under field conditions. At the field level, the study could not be performed on the DP system farm due to a high incidence of oil rejection by cows. In the other systems (LT, LTSSPi and DPSSPi), the proportion of c9t11 CLA and ATV increased linearly with the two levels of supplementation whilst the content of atherogenic FA decreased. This resulted in milk containing greater amount of unsaturated FA and lower atherogenic index. Additional net income was higher at supplementation level of 4%, when milk is marketed with a differential value based on the c9t11 CLA content. The results of this study show that supplementation with sunflower oil to grazing cows can increase content of fatty acids in milk, which are beneficial to human health. However, inclusion levels of leucaena (14 -16%) in animals under field conditions, and the amount of oil added, were not sufficient to reduce methane production in vitro. 5 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Altogether, this research improved the knowledge of milk produced in Colombia as "functional product", becoming a tool to market our dairy products with added value. 6 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias | Introducción General Ante la inminente apertura de mercados se ha generado el reto de transformar la producción ganadera colombiana, mejorando su productividad y su competitividad. La producción de leche en Colombia es de gran importancia para la economía del país con una participación del 10% en el PIB Agropecuario y del 24% en el PIB Pecuario. La política para el sector lácteo colombiano busca mejorar la competitividad de este sector mediante el desarrollo de conglomerados productivos en zonas, con ventajas competitivas para la producción de leche, estableciendo las bases para incentivar una mayor inversión y las condiciones óptimas para su desarrollo (CONPES, 2010). Se estima que el país cuenta con 3.2 millones de vacas en ordeño, responsables por una producción diaria de 15.7 millones de litros de leche, distribuidas en 395.215 unidades productoras (CNL, 2010). Se presumen grandes oportunidades para el sector lácteo en el contexto internacional por el incremento de la demanda en algunos países de oriente y la posibilidad de una desactivación gradual de subsidios existiendo la voluntad del gobierno para buscar mercados para los productos lácteos y de establecer futuras negociaciones con países deficitarios en leche (CNL, 2010). Por otra parte, existe una tendencia internacional de mejorar la calidad de la alimentación, lo que implica el incremento de consumo de proteína animal dentro de lo cual están los productos lácteos. Así mismo, en Colombia hay una cultura de consumo y hay diversificación de la oferta, desde el consumo de leche cruda hasta productos lácteos funcionales. Con el objetivo de incrementar la productividad, profundizar y diversificar los mercados interno y externo y aprovechar las oportunidades y ventajas comparativas que tiene el sector lácteo, este busca entre otras características, el aumento de la oferta de productos lácteos funcionales y la producción amigable con el medio ambiente y socialmente responsable (CNL, 2010). 7 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Los ácidos grasos (AG) insaturados como el ácido linoleico conjugado c9t11 (CLAc9t11) o ácido ruménico, el ácido transvaccénico (ATV) , algunos AGCL n-3 de la leche bovina, se relacionan con beneficios para la salud humana (Harris, 2008; Shingfield et al., 2013). En la leche bovina CLA y ATV resultan del consumo de AG poliinsaturados y de la extensión de la biohidrogenación ruminal (BHR), mientras que los AG n-3, provienen de la dieta y su presencia en la leche depende de su capacidad para escapar a la BHR (Chilliard et al., 2003; Palmquist, 2007). La magnitud de las cantidades presentes en la leche está determinada principalmente por factores dietarios (Palmquist, 2005). A diferencia de otros AG, el CLA-c9t11 no es sólo una molécula energética que interviene en procesos metabólicos de obtención y almacenamiento de energía, sino que, además, posee una actividad biológica e interviene en otros procesos funcionales de la célula (Weiss et al., 2004a).En efecto, el CLA ha demostrado potenciales beneficios para la salud, observados experimentalmente sobre todo en modelos animales, como agente anti arteriosclerótico, antiinflamatorio, antidiabético y sobre todo, anti carcinogénico (inhibe la mutagénesis), así como potenciador del sistema inmune (Belury, 2002; Pariza, 2004; Khanal, 2004; Weiss et al., 2004a). Aunque estos efectos no han sido comprobados de forma concluyente en la especie humana, los alimentos ricos en CLA-c9t11, podrían ser considerados dentro del grupo de los llamados "alimentos funcionales", siendo el CLA-c9t11 el "ingrediente funcional". El estudio de los factores que afectan el contenido de este AG en la leche, es uno de los temas de investigación dentro del ámbito de la nutrición de los rumiantes (Angulo et al., 2013; Renna et al., 2010; Castro et al., 2009; Lee et al., 2009; Prandini et al., 2009; Chilliard et al., 2003; Chilliard y Ferlay, 2004), ya que permite obtener información sobre la posibilidad y mecanismo que aumenten dicho contenido. 8 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias El ATV, es el mayor AG trans en la grasa de rumiantes, siendo además el precursor de CLA-c9t11 en los tejidos (Field et al., 2009). En algunos estudios ha mostrado además efectos anticancerígenos (Miller et al., 2003; Sauer et al., 2004). Los AGCL n-3 reducen en el suero las lipoproteínas de baja densidad, contribuyendo a una disminución en el riesgo a incidencia de enfermedad cardiovascular humana (Shingfield et al., 2008). El ácido oleico C18:1 cis-9, en los seres humanos, puede prevenir aumento de la lipoproteína de baja densidad en la sangre y puede disminuir la presión arterial (Dhakal et al., 2014). En contraste, existen evidencias que los AG saturados presentes en la leche tales como láurico C12:0, mirístico C14:0 y palmítico C16:0, aumentan las lipoproteína de baja densidad (Givens, 2010), con efecto aterogénico (Ulbritch y Southgate, 1991) e hipercolesterolémico (Givens, 2010) cuando los mismos son consumidos en exceso. En este contexto, toda disminución en la presencia de estos AG y el aumento de ATV, AGCL n3 y otros insaturados, permitirá ofrecer una leche mas saludable. De otra parte, el metano es un potente gas de efecto invernadero que tiene un potencial de calentamiento 21 veces mayor que el dióxido de carbono (IPCC 2007). A la producción agrícola se le atribuye 40% de la producción de metano originado en actividades humanas. La producción de metano entérica, principalmente de la ganadería, constituye la mayor fuente individual y alcanza de 15% a 20% de la producción global de gases efecto invernadero de origen antrópico (Sheehle and Kruger 2006, Moss 2000, Lassey et al. 1997). La producción ruminal de metano constituye una pérdida de eficiencia nutricional que alcanza del 6% al 8% de la energía bruta consumida, pero puede incluso llegar hasta 12% de la misma (Johnson and Johnson 1995). Estas razones sugieren, que la búsqueda de tecnologías que permitan reducir la producción de metano en condiciones comerciales, deba ser un importante tema de estudio. 9 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias En Colombia, el 45% de la leche se produce en lechería especializada con un mayor nivel tecnológico y uso de insumos y el 55% bajo el sistema doble propósito (CONPES, 2010). Los dos sistemas en su expresión tradicional tienen una base forrajera de solo gramíneas. No obstante, otros productores utilizan sistemas más adecuados a las condiciones medio ambientales con una base forrajera silvopastoril (SP), que permite aumentar la oferta de forraje, en particular durante el periodo seco, mejorar la calidad de la dieta a lo largo del año y mejorar la conservación y el reciclaje de nutrientes (Murgueitio, 1999; Pagiola et al., 2005; Pagiola et al., 2007). Hay evidencia de que ciertos metabolitos secundarios presentes en plantas forrajeras no gramíneas, pueden limitar la biohidrogenación ruminal y disminuir el metano (Khiaosa-Ard et al., 2009; Soliva et al., 2005; Soliva et al., 2008). De igual forma, la suplementación con lípidos reduce la emisión de metano (Beauchemin et al., 2007), disminuyendo la cantidad de materia orgánica fermentada en el rumen, la actividad de las bacterias metanogénicas y el número de protozoos y a través del mayor uso de hidrógeno durante el proceso de biohidrogenación (Johnson et al., 1995). A nivel del país existen pocos estudios de caracterización de niveles de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche y sobre la utilización de aceites poliinsaturados como estrategia para aumentar la presencia de los nutrientes funcionales y disminuir la producción ruminal de metano. El desarrollo de capacidad para elevar recomendación sobre suplementación de las dietas propias de la ganadería colombiana con AG poliinsaturados, como estrategia para aumentar los ácidos grasos benéficos en la leche y disminuir la producción ruminal de metano, exige contar con una previa evaluación de los resultados de la utilización de dicha estrategia bajo las condiciones de alimentación específicas del país. Dichas condiciones varían de acuerdo al sistema de producción lechería tropical y doble propósito. Asimismo, para poder entender y luego provocar los cambios deseados, es necesario abordar el estudio de los procesos de fermentación ruminal bajo las condiciones de alimentación propias de estos sistemas de producción. 10 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la suplementación con aceites vegetales (comerciales) sobre los ácidos grasos (CLA-c9t11, ATV y otros AGCL), la fermentación ruminal y la producción de metano, mediante técnicas in vitro y sobre la concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche producida en ganaderías de lechería tropical especializada (LT) y doble propósito (DP), cuyos animales pastorean en solo gramíneas de pasto Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (Leucaena leucocephala). Esta tesis consta de 6 capítulos. El primero incluye la revisión de literatura y los siguientes 4 capítulos presentan el análisis de los datos y su respectiva discusión. El último capítulo presenta las conclusiones generales. 11 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias | Objetivos Objetivo General Conocer el efecto de la suplementación alimenticia con aceites vegetales (comerciales) sobre los ácidos grasos CLA-c9t11, ATV y otros AGCL, la fermentación ruminal y la producción de metano, mediante técnicas in vitro y sobre la producción de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche, de ganaderías de lechería tropical especializada (LT) y doble propósito (DP), que pastorean en solo gramíneas en pasto Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (Leucaena leucocephala). Objetivos Específicos 1. Evaluar el efecto de las condiciones alimenticias propias de cada finca, número de partos y el tercio de lactancia sobre el porcentaje de grasa, la concentración de CLAc9t11, ATV y otros AGCL en la leche. 2. Determinar mediante un estudio in vitro, el efecto de los forrajes sobre CLA-c9t11, ATV, otros AGCL, fermentación ruminal y producción de metano, de ganaderías que pastorean en solo gramíneas (Cynodon plectostachyus y/o Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos con Leucaena (Leucaena leucocephala). 12 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias 3. Evaluar mediante estudio in vitro, el efecto de la adición de aceites vegetales saturados (Palma) e insaturados (Girasol y Lino) y su nivel de inclusión, a la base forrajera propia de ganaderías que pastorean en solo gramíneas de Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsusmaximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos con Leucaena (Leucaena leucocephala), sobre la concentración de CLA-c9t11, ATV, otros AGCL, la fermentación ruminal y la producción de metano y seleccionar el aceite y nivel de inclusión, que presente mejor concentración de CLA-c9t11, ATV, AGCL y menor producción de metano. 4. Establecer el efecto de la suplementación alimenticia con el mejor nivel de inclusión del aceite más destacado en la prueba in vitro sobre la concentración de: CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche y sobre la relación beneficio-costo en las ganaderías en estudio. Hipótesis En ganaderías de producción lechera tropical especializada y de doble propósito, que pastorean en solo gramíneas y en sistemas silvopastoriles, la suplementación con aceites vegetales, afecta el patrón de ácidos grasos de cadena larga (CLA-c9t11 y ATV) en la leche y también en la digesta ruminal en sistemas experimentales de fermentación in vitro, al tiempo que disminuye la producción de metano sin disminuir la eficiencia de dicha fermentación. 13 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias | Capítulo 1 Efecto de la suplementación lipídica sobre la concentración de ácido linoleico conjugado (CLAc9t11) en leche de vaca y la producción de metano: Revisión 14 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN LIPIDICA SOBRE LA CONCENTRACION DE ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO (CLA-c9t11) EN LECHE DE VACA Y LA PRODUCCION DE METANO: REVISIÓN RESUMEN Existe una tendencia internacional en mejorar la calidad de la alimentación humana, lo que implica el incremento de consumo de proteína animal, dentro de lo cual están los productos lácteos saludables y ricos en CLA-c9t11 ("ingrediente funcional", por sus potenciales beneficios para la salud humana). Igualmente, se desea una producción amigable con el medio ambiente y socialmente responsable, razón por la cual, se búscan tecnologías que permitan reducir la producción de metano. La suplementación con AG insaturados ha mostrado ser eficiente en la búsqueda de estos objetivos. Este documento presenta una revisión sobre el efecto de la suplementación con lípidos sobre la concentración de CLA-c9t11, AG insaturados en la leche bovina y la reducción en la emisión de metano, abordando inicialmente el concepto y origen del CLA-c9t11 en rumiantes, junto con los factores que lo afectan, información de gran utilidad cuando se va a aplicar este tipo de tecnologías a nivel de finca de productor. Palabras Clave: ácidos grasos, biohidrogenación, glándula mamaria. 15 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias INTRODUCCIÓN En los últimos años, existe una tendencia internacional en los consumidores orientada a la mejora en la calidad de la alimentación con el uso de alimentos benéficos para la salud humana, entre los cuales se incluyen los llamados alimentos funcionales. Así mismo, es evidente la mayor conciencia y compromiso del consumidor con las producciones amigables con el medio ambiente y socialmente responsables (CNL, 2010). Como alimentos funcionales se consideran aquéllos alimentos y/o componentes de los mismos que poseen propiedades adicionales sobre la salud, que superan el beneficio clásico de un aporte de nutrientes (Milner, 1999). También son considerados como funcionales aquéllos alimentos en los que se encuentra reducida alguna fracción que resulta no saludable para el ser humano. En el caso de la leche y en el contexto del presente trabajo, toda reducción en el contenido de los ácidos láurico, mirístico y palmítico resulta de interés funcional por sus potenciales efectos aterogénicos (Ulbritch y Southgate, 1991) cuando los mismos son consumidos en exceso. Durante esta última década, estudios con ácido linoleico conjugado (CLA), han revelado funciones benéficas sobre la salud. El CLA C18:2 cis9, trans11 también conocido como CLA-c9t11 ó ácido ruménico (AR), ha mostrado potenciales beneficios para la salud, observados experimentalmente sobre todo en modelos animales, como agente anti arteriosclerótico, antiinflamatorio, antidiabético y, sobre todo, anti carcinogénico (inhibe la mutagénesis), así como potenciador del sistema inmune ( Belury, 2002; Pariza, 2004; Khanal, 2004; Weiss et al., 2004a, Shingfield et al., 2008, Salter, 2013). Además, se ha reportado que el CLA trans10,cis12 inhibe la síntesis de ácidos grasos, reduciendo la acumulación de grasa corporal en individuos con sobrepeso (Weiss et al., 16 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias 2004b) aunque estos efectos adegazantes no han sido comprobados de forma concluyente en la especie humana. En general, las concentraciones totales de CLA en la leche de los rumiantes oscilan entre un 0.3 y un 2.0% del total de ácidos grasos de la grasa de leche dependiendo del sistema de alimentación (pastoril o estabulado) y de la suplementación practicada. Entre las distintas especies productoras, es la leche de vaca la que presenta los contenidos más altos de CLA (0.2 – 3.7 g CLA/100 g de grasa) seguida de la de cabra (0.59 – 3.24 g/100 g de grasa) y la oveja (1.17 – 2.97 g/100 g de grasa) (Parodi, 2003). En la leche bovina, el CLA resulta del consumo que los animales hacen de AG poliinsaturados y de la extensión de la biohidrogenación ruminal (BHR) (Chilliard et al., 2003). Por otra parte, la magnitud de las cantidades presentes en la leche está determinada principalmente por factores dietarios (Palmquist, 2005). El estudio de los factores que afectan el contenido en CLA de la leche es uno de los temas de investigación de interés actual, dentro del ámbito de la nutrición de los rumiantes (Renna et al., 2010; Castro et al., 2009; Lee et al., 2009; Prandini et al., 2009; Chilliard et al., 2003; Chilliard y Ferlay, 2004), ya que permite obtener información sobre la posibilidad y mecanismo de modulación natural de la presencia de este AG benéfico en los lácteos. De otra parte, uno de los mayores contaminantes del medio ambiente es el metano, potente gas de efecto invernadero que tiene un potencial de calentamiento 21 veces mayor que el dióxido de carbono (IPCC 2007). A la producción agrícola se le atribuye 40% de la producción de metano originado en actividades humanas. La producción de metano entérica proveniente de la actividad ganadera, constituye la mayor fuente individual y alcanza de 12% a 18% de la producción global de gases efecto invernadero de origen antrópico, dependiendo del método de estimación (FAO 2006; Westhoek et al., 2011). La producción ruminal de metano constituye una pérdida de eficiencia 17 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias nutricional (energética) que alcanza de 6% a 8% de la energía bruta consumida, pero puede incluso llegar hasta 12% de la misma (Johnson and Johnson 1995). Estas razones justifican la búsqueda de tecnologías que permitan reducir la producción de metano en condiciones comerciales de producción. Algunos estudios encontraron, que la suplementación con lípidos de origen animal (Chouinard et al. 2001; Shingfield et al., 2003, 2006; Abu-Ghazaleh et al., 2003, 2004a) y de origen vegetal (Stanton et al., 2003; Khanal and Olson, 2004), permite aumentar la concentración de CLA-c9t11 en la leche y reducir la emisión de metano (Johnson et al., 1995; Beauchemin et al., 2007). Este documento presenta una revisión sobre el efecto de la suplementación con lípidos sobre la concentración de CLA-c9t11 en la leche bovina y la reducción en la emisión de metano, abordando inicialmente el concepto y origen del CLA-c9t11, en rumiantes. ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO El acrónimo CLA (“Conjugated linoleic acid” en inglés) es un término que engloba una mezcla compleja de isómeros posicionales y geométricos del ácido linoleico (C18:2 cis9,cis12) con dos dobles enlaces, que se encuentra de forma natural en la grasa de alimentos derivados de rumiantes como la carne y fundamentalmente en los productos lácteos. Aunque se han detectado distintos isómeros posicionales (7-9, 8-10, 9-11, 1012, 11-13, 12-14) y geométricos (cis-trans, trans-cis, trans-trans y cis-cis) del CLA en la grasa de la leche, más del 70% del contenido en CLA corresponde al isómero C18:2 cis9, trans11 o ácido ruménico (AR) (Bauman et al., 2003a), al que se atribuyen la mayoría de sus propiedades biológicas saludables (McCrorie et al., 2011). Otro isómero del CLA que está siendo también objeto de investigación por su implicación en la inhibición de la síntesis de grasa en mamíferos, es el C18:2 trans10, cis12; pero su 18 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias contenido en la grasa láctea es muy bajo (menos del 0.1% sobre el total de ácidos grasos y menos del 1% sobre el total de CLA), aunque se han encontrado valores de 2.9% del total de CLA cuando las vacas lecheras fueron suplementadas con aceite de girasol más alga marina (Angulo et al, 2012a). No obstante, sus efectos sobre la salud humana son cuestionados por la comunidad científica (McCrorie et al., 2011). ORIGEN DEL CLA-c9t11 EN RUMIANTES Formación de CLA como consecuencia de la bio-hidrogenación ruminal (BHR) de ácidos grasos. Los lípidos consumidos por los animales están formados por triglicéridos en el caso de las semillas oleaginosas y por fosfolípidos y galactolípidos, en el caso de los forrajes y otros alimentos de origen vegetal (Figura 1.1) Figura.1.1. Tipos comunes de lípidos de almacenamiento y de membrana. Todos los tipos de lípidos mostrados tienen ya sea glicerol o esfingosina como la columna vertebral, a la que están unidos uno o más grupos alquilo de cadena larga y un grupo de cabeza polar. En triglicéridos, glicerofosfolípidos, galactolípidos, y sulfolípidos, los grupos alquilo son ácidos grasos en enlace éster. Tomada de Nelson y Cox (2004). 19 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias En el rumen, estos lípidos sufren dos procesos metabólicos: lipólisis y biohidrogenación. Durante la lipólisis, los enlaces éster entre los AG y el glicerol o la galactosa se rompen por medio de diversas enzimas microbianas (por ejemplo, lipasas, galactosidasas, fosfolipasas). El glicerol y la galactosa son fermentados formándose ácidos grasos volátiles propiónico y acético, respectivamente. La lipólisis ruminal de los tri y di-glicéridos es consecuencia de la actividad de la bacteria Anaerovibrio lipolitica, la cual es muy sensible a variaciones en el pH del rumen y en condiciones de acidosis la lipólisis se ve significativamente reducida. Así mismo, Butyrivibrio fibrisolvens lipasa hidroliza fosfolípidos (Dehority, 2003) y diferentes galactosidasas y fosfolipasas (e.g., fosfolipasa A y fosfolipasa C), producidas por los microbios del rumen, catalizan la hidrólisis de fosfolípidos y galactolípidos de las plantas (Jenkins,1993). Los protozoos ciliados poseen actividad lipasa, pero no los hongos (Dehority, 2003), aunque su contribución es más baja que la de las bacterias. Después de la lipólisis, los AG insaturados son biohidrogenados por los microorganismos del rumen (isomerasas y reductasas). Este proceso (Figura 1.2) convierte los AG insaturados en AG saturados, vía isomerización a AG intermediarios trans, seguido por hidrogenación de los dobles enlaces (Harfoot y Hazlewood, 1997). 20 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Figura 1.2. Vías de biohidrogenación de los ácidos (A) linolénico, (B) linoleico y (C) oleico. Adaptado de Harfoot y Hazlewood (1988). Así, la BHR consiste en una primera isomerización: la forma geométrica cis de los dobles enlaces pasa a la forma trans (más estable en el rumen). De esta forma, el doble enlace en posición 12 del ácido linoléico, es transferido con configuración trans al carbono 11, para dar lugar a CLA cis9, trans11, con un porcentaje en torno a 30% en vacas (Piperova et al., 2002) y a proporciones variables de diferentes isómeros conjugados y no conjugados (trans9, cis11; trans10, cis12; etc) (Jenkins, 2008). A continuación, tiene lugar una hidrogenación progresiva de los dobles enlaces y se produce entonces, una rápida hidrogenación del enlace cis9 para formar ácido transvaccénico (C18:1 trans11) (TVA) y una segunda sobre el enlace trans11 para dar lugar finalmente a ácido esteárico (C18:0). Sin embargo, en función de diversos 21 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias factores, la hidrogenación ruminal podría quedar incompleta, dando lugar a un flujo al duodeno de ácidos grasos insaturados y determinados metabolitos intermedios (Stanton et al., 2003), que podrían llegar a absorberse en el intestino y aparecer en los productos finales (leche y carne). La BHR del ácido linolénico (C18:3 cis9, cis12, cis15) comienza igualmente con la isomerización del enlace cis12 a trans11, posteriormente se produce ATV pero a partir de C18:2 trans11,cis15 (Loor et al., 2002, 2004). Existe discrepancia si durante este proceso se forma CLA-c9t11; Lee y Jenkins (2011), demostraron en cultivos continuos de fermentación, que los microorganismos ruminales en mezcla, obtenidos de rumen de ganado, son capaces de formar isómeros C18:3 y diferentes CLA, incluido el CLAc9t11; aunque en proporción menor al 15%, indicando que las vías de biohidrogenación del ácido linolénico son más complejas que las reportadas previamente. En el caso del ácido oleico, no ocurre solamente la biohidrogenación a ácido esteárico sino que, además, se forman numerosos isómeros trans (Mosley et al., 2002) y parte del ácido oleico, es transformado en los ácidos 10-hidroxiesteárico y 10-cetoesteárico, como demostraron Jenkins et al., (2006). Cuando se suplementan las dietas de ganado vacuno con grasas ricas en ácido oleico (AG mono-insaturado), también se han observado incrementos en los niveles de CLA-c9t11 (Secchiari et al. 2003; Collomb et al., 2004a), aunque estos aumentos son menos importantes que cuando se utilizan aceites vegetales ricos en ácidos grasos poli-insaturados. Según Bauman et al. (1999), la velocidad a la que el ATV es reducido a ácido esteárico es más lenta que los pasos previos; en consecuencia, la acumulación de ATV, facilita que una parte del mismo, escape del rumen y sea disponible para la absorción intestinal. El CLA-c9t11 junto a diferentes ácidos grasos trans mono-insaturados, 22 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias fundamentalmente el ATV, serían los intermediarios más destacados, de este proceso de hidrogenación. La biohidrogenación se realiza por acción de diversas enzimas (isomerasas y reductasas) microbianas. Entre las bacterias ruminales responsables de la biohidrogenación de los ácidos grasos, Butyrivibrio fibrisolvens (Kepler y Tove, 1967; Fukuda et al., 2006; Wallace et al., 2006a) en los pasos iniciales y Butyrivibrio proteoclasticus (Moon et al., 2008) en el paso final (reducción a ácido esteárico), jugarían el papel más relevante (Figura 1.3), aunque se sabe que otras bacterias como Ruminococcus, Eubacterium , Fusocillus (Palmquist et al., 2005; Wallace et al., 2006a) y Propionibacterium acnés (McKain et al., 2010), pueden estar también implicadas. Figura 1.3. Papel de Butyrivibrio spp., Propionibacterium acnes y Butyrivibrio proteoclasticum sobre el metabolismo de los ácidos grasos insaturados linoleico y oleico.Tomado de McKain et al. (2010) y Wallace et al. (2006b). 23 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Los hongos del rumen, pueden biohidrogenar ácido linoléico obteniendo como producto final ATV, pero su biohidrogenación es más baja que la realizada por las bacterias del rumen, siendo Orpinomyces el hongo más activo (Nam y Garnswotrhy, 2007). Con respecto a los protozoos existe contradicción, Jenkins et al. (2008), en su revisión concluye que los protozoos no producen por si mismo CLA-c9t11, ni ATV; sin embargo, mediante ellos se pueden obtener estos ácidos, disponibles para el animal. No obstante, Or-Rashid et al. (2011) y Buccioni et al. (2012), plantean que los protozoos influyen en el contenido de intermediarios de la BHR por las isomerasas y que la mezcla de bacterias y protozoos, tiene una mayor capacidad para biohidrogenar ácido linoléico, que las bacterias solas (Figura 1.4). Figura 1.4. Vías metabólicas para la biosíntesis de CLA y compuestos relacionados de ácido linoleico por bacterias del rumen (B) y protozoos (P). Flechas sólidas más gruesas son actividades bacterianas y protozoarias que conducen a la formación de isómeros de CLA y C18: 1, incluyendo C18:0, las flechas punteadas son la actividad bacteriana que conduce a la formación de los compuestos posibles y las flechas continuas delgadas representan las actividades bacterianas. Tomado de Or-Rashid et al. (2011). 24 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Las tasas de lipólisis y BHR dependen del tipo y la cantidad de grasa, entregada al rumen (Beam et al., 2000) y el pH ruminal (Van Nevel y Demeyer, 1996). El proceso de BHR no deja de ser un mecanismo de defensa de los microorganismos ruminales para reducir la toxicidad de los ácidos grasos insaturados. Los ácidos grasos de cadena larga inhiben el metabolismo microbiano, y esta actividad inhibitoria, es mayor cuanto mayor es su grado de insaturación, por lo tanto la BHR es modificada a través de toxicidad diferencial sobre las bacterias ruminales de los diferentes AG poliinsaturados, incluyendo los ácidos grasos omega tres del aceite de pescado eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA). Si se puede entender como la toxicidad selectiva de un AG, o incluso otros factores, afectan la fisiología de las bacterias biohidrogenantes del rumen, es posible que se puedan sugerir nuevas modificaciones en la dieta de los animales que finalmente conducirían a productos de rumiantes más saludables para el consumo humano (Maia et al., 2010). La isomerización previa a la BHR requiere que el grupo carboxilo de la molécula esté libre, lo cual determina que la lipólisis pueda considerarse como la etapa limitante del proceso global y que todos los factores que repercuten sobre la lipólisis afecten también a la BHR (Bauman et al., 2003b). La eficacia de la BHR se relaciona negativamente con la proporción de concentrados en la dieta (Sauvant y Bas, 2001). De hecho, la BHR es más intensa en dietas con abundantes forrajes (Kucuk et al., 2001; Lee et al., 2006). Cuando disminuye la proporción de forraje, el flujo de isómeros C18:1trans totales hacia el duodeno puede duplicarse (Loor et al., 2004). Ello es debido, principalmente, a un incremento lineal del flujo del isómero C18:1trans-10, cuya proporción en dichas circunstancias puede pasar del 4 al 25% del total de isómeros del grupo (Piperova et al., 2002;Loor et al., 2004). En general, todas aquellas características de la dieta, como el pequeño tamaño de partícula, abundancia de concentrados, exceso de almidón degradable en rumen, ausencia de tampones, que reducen el valor medio diario de pH ruminal a menos de 6.25 (Sauvant et al., 1999) afectan negativamente a la eficacia de 25 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias la BHR. Troegeler-Meynadier et al., (2006) comprobaron in vitro que un pH <6 inhibe la isomerización y la segunda reducción, lo cual puede relacionarse con el hecho que las bacterias celulolíticas, principales responsables de la BHR, son muy sensibles a valores de pH <6 (Slyter, 1986; Owens et al., 1998). Otros factores que afectan negativamente a la eficacia de la BHR, son la elevada concentración de los ácidos linoleico (Atkinson et al., 2006; Harvatine y Allen, 2006) y linolénico (Troegeler-Meynadier et al., 2006). También, la presencia en el medio ruminal de ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA) inhiben la reducción del ATV (Chow et al.,2004; Lee et al., 2005), la de los ácidos oleico y linoleico (AbuGhazaleh y Jenkins,2004) y la suya propia (Dohme et al.,2003; Chow et al., 2004). La BHR está fuertemente influenciado por metabolitos secundarios presentes en las plantas (PSM), que incluye Polifenol Oxidasa (PPO) y taninos (Lee et al.,2007a; Cabiddu et al., 2009, 2010). La Polifenol oxidasa aumentó la protección de los lípidos de la actividad lipolítica y disminuyó la BHR por 11-22% (Lee et al.,2007b, 2008). Sin embargo, no se puedo concluir definitivamente a partir de estos resultados si la protección fue debida a la inhibición de la lipasa, o si la protección de lípidos fue debida al complejo proteína-fenol y / o lípidos –fenol (Lee et al., 2010). Varios informes sobre la relación entre taninos y metabolismo ruminal mencionan los efectos negativos de la degradación de la proteína y la fibra sobre el desarrollo de la microflora ruminal. Sin embargo, hay poca información disponible sobre los efectos de los compuestos polifenólicos, sobre la actividad de la linoleico isomerasa (LA-I) en el rumen (Cabiddu et al., 2009, 2010). No obstante, Vasta et al. (2009a,b) informaron que los taninos no interfieren con LA-I, pero interfieren con la proliferación microbiana. Así, los taninos no inhiben la actividad de las enzimas microbianas, pero cambian la composición de la población microbiana ruminal. 26 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Buccioni et al. (2012), en su revisión sugieren que la lipólisis y BHR están directamente influenciadas por la asociación de PPO, tasa de pasaje, encapsulado en lípidos y otros metabolitos secundarios de las plantas (MSP), y esto a veces puede conducir a resultados que son aparentemente contradictorios. Por lo tanto, se necesita investigar sobre como las interacciones entre PPO, tasa de pasaje ruminal, encapsulado en lípidos y MSP influencian la lipólisis y la biohidrogenación y su respectiva jerarquía. Síntesis endógena en la glándula mamaria El CLA-c9t11 contenido en la leche, se origina de la absorción intestinal con posterior transferencia a la glándula mamaria de este AG producido en el rumen y de su síntesis endógena a partir de ATV por acción de la enzima Delta-9 desaturasa en la glándula mamaria (Bauman y Lock 2006). Esta última es la principal vía de acumulación de CLAc9t11 en la leche bovina y se estima que más del 74% de CLA-c9t11 en la grasa de la leche es sintetizado a través de esta vía (Bichi et al., 2012). Los estudios detallados sobre el posible origen endógeno de otros isómeros de CLA son muy escasos, quizá porque la mayoría de ellos contribuye con porcentajes muy pequeños a la grasa de leche de vaca y su significado biológico aún no ha sido clarificado. El trans7 cis9 es cuantitativamente el segundo isómero más importante de CLA, constituyendo entre el 3 y el 15% del total de los isómeros en grasa de origen lácteo. Corl et al. (2002) sugirieron que su síntesis era casi exclusivamente en la glándula mamaria por medio de la Delta-9 desaturasa a partir del C18:1 trans7 producido en el rumen por isomerización del ácido oleico. Es importante tener en cuenta que, la producción de grasa de la leche depende del equilibrio entre el aumento en la transferencia de los AG de la dieta a la glándula 27 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias mamaria y la disminución de la síntesis de novo que pueda tener lugar. Una disminución en la síntesis de AG dentro de la glándula mamaria se observa frecuentemente cuando se añaden fuentes suplementarias de AG a la dieta de vacas lecheras en lactación (Lock y Bauman, 2004). ESTRATEGIAS PARA AUMENTAR CLA-c9t11 Y ATV EN LECHE Se han propuesto estrategias para aumentar el CLA-c9t11 en la grasa de la leche, las cuales se centran en aumentar la cantidad de ATV producido en el rumen e incrementar la actividad de la Delta-9 desaturasa (Figura 1.5). El aumento de ATV que sale del rumen, se puede conseguir manipulando la dieta y el proceso de biohidrogenación mediante el incremento en el ingreso de ácidos poliinsaturados linoleico y linolénico (precursores de ATV) al rumen y al mantener la vía de formación de trans11 e inhibir el paso de ATV a ácido esteárico. Por lo tanto, el contenido de CLA-c9t11en la grasa de la leche puede ser notablemente afectado por vía natural, seleccionando racionalmente la combinación de alimentos, que afectan el suministro dietético de AG poliinsaturados y/o afectan el ambiente ruminal, con el fin de alterar la velocidad y la integridad de la biohidrogenación (Bauman y Lock 2006). De otra parte, el aumento de la Delta-9 desaturasa se puede conseguir, mediante selección genética dada la alta variabilidad entre vacas para producir leche con alto CLA-c9t11, lo que exige avanzar en la obtención de marcadores moleculares indicativos de una alta capacidad individual de generación de CLA y el desarrollo de estudios destinados a cuantificar la expresión del gen responsable de la expresión de la enzima estearil CoA desaturaturasa o Delta-9 desaturasa (Gagliostro, 2004b).Se esperan futuros avances mediante el uso de selección asistida por marcadores para aumentar la frecuencia de genotipos favorables y la formulación de dietas, para aprovechar este potencial genético y mejorar la composición de los ácidos grasos de los alimentos producidos por los rumiantes (Shinfgield et al., 2013). 28 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Figura 1.5. Vías para la síntesis ruminal y endógena de CLA cis9, trans-11 en vacas lecheras y estrategias para aumentar el contenido CLA en la grasa de la leche. Adaptado de Bauman y Lock (2006). EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE CLA-c9t11 Y ATV Una comparación entre diferentes tipos de aceites de origen vegetal sugiere que aquéllos con contenidos más altos en los ácidos linoleico y linolénico (como los procedentes de semillas de soja, algodón, girasol, lino, cártamo y colza –Tabla 1.1) son los más idóneos para aumentar el CLA-c9t11 en leche (Stanton et al., 2003; Khanal y Olson, 2004). Además se ha comprobado que aquellos más ricos en ácido linoleico (girasol, soja) son los más efectivos (Kelly et al., 1998; Dhiman et al., 2000; Lock y Garnsworthy, 2002; Collomb et al., 2004b, Shingfield et al., 2006; Hervás et al., 2006). Este efecto es lineal ante la adición de cantidades crecientes de aceite a la ración 29 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias (hasta 3-4% de la MS, al menos), con una respuesta de alrededor de 0,4% de los AG totales por punto de aumento de la concentración de lípidos de la ración para la soja, el girasol o el lino (Chilliard et al., 2007a). Este efecto se explica por un fuerte aumento en la producción de ATV en el rumen, el cual resulta luego capturado por la glándula mamaria y desaturado a CLA-c9t11 por la Delta-9 desaturasa. En cambio, un aceite rico en AG oleico (C18:1 c9) (oliva, colza) aumenta sólo débilmente la secreción de CLA-c9t11 (Chilliard et al., 2007b). Tabla.1.1. Porcentaje de ácidos grasos presentes en aceite de diferentes semillas Aceite Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico Autor C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 Colza 4.5 1.4 61.2 23.0 9.9 Rego et al. 2009 Girasol 5.4 2.8 26.8 64.9 0.1 Rego et al. 2009 Lino 4.4 2.6 20.0 16.3 56.7 Rego et al. 2009 Girasol -- -- 15.31 65.23 0.21 Jacob et al. 2011 Soja -- -- 21.53 51.65 8.83 Jacob et al. 2011 Soja 9.6 5.3 26.0 50.5 5.5 Boerman y Lock, 2014 Soja -- -- 25.0 51.0 -- Vargas-Bello-Pérez et al. 2015 19.9 2.4 17.1 58.4 0 Aprianita et al. 2014 Semilla de algodón La forma de incorporación de estos ácidos grasos insaturados en la dieta del ganado puede jugar un papel importante. La presentación en forma protegida como sales cálcicas o el empleo de semillas intactas sin procesar produce leves incrementos en los niveles de CLA en leche, ya que hay mínima interacción de estos ácidos grasos a nivel ruminal para la producción del principal precursor de CLA-c9t11. La adición de semillas sometidas a molienda, extrusión, micronización o calentamiento mejora los contenidos de CLA-c9t11 en leche (Chouinard et al., 2001; Dhiman et al., 2000; Secchiari et al., 2003). Las formas de suplementación más efectivas, para aumentar CLA-c9t11 en la leche, han sido la adición directa de aceite extraído de las semillas o las semillas sometidas a tratamiento térmico previo (Chilliard et al., 2007b). Un rápido y eficaz 30 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias contacto del aceite con las bacterias ruminales, conduce a la acumulación ruminal del precursor ATV (Gagliostro, 2011). Este efecto es particularmente importante cuando las vacas se encuentran en alimentación bajo pastoreo, debido a que la tasa de pasaje resulta más rápida y la población microbiana involucrada en el proceso de biohidrogenación puede verse afectada (Kolver, 1997). Además de los efectos del tipo de lípidos alimentarios, de su forma de presentación y de la cantidad, existen importantes interacciones con la naturaleza de los forrajes y con la relación forraje:concentrado de la ración (Chilliard et al., 2007b). El efecto de la suplementación con semillas oleaginosas sobre la proporción de grasa en leche depende de la naturaleza de la semilla (lino, colza), de su forma (extruída, harina en frio, entera sin procesar) y de la interacción con el tipo de dieta basal (ensilaje de hierba, heno o pastura) (Lerch et al. 2012). Asímismo, el efecto de la suplementación con semilla de lino molida, sobre la proporción de AG de la leche, depende de la relación forraje:concentrado y del tipo de forraje de la dieta basal, siendo mayores los niveles de C18:1 trans10, C18:1 trans15, C18:1 cis15, C18:2 trans11,cis15 y C18:3 n-3 en la grasa de la leche, con dietas que contenían 5% de semilla de lino molida y relación forraje:concentrado de 35:65, comparada con niveles de 1 y 3% y relación F:C de 50:50 o 65:35 (Sterk et al. 2011). En la mayoría de los estudios realizados se ha observado un aumento del contenido en CLA-c9t11 y ATV al emplear dietas en las que se aportan lípidos ricos en AG insaturados. La suplementación con isómeros sintéticos de CLA en forma protegida (Giesy et al., 2002; Perfield et al., 2002; Bernal-Santos et al., 2003) es biológicamente efectiva pero no es viable comercialmente debido al elevado precio de adquisición. Los aceites vegetales y el aceite de pescado son suplementos más asequibles. Se ha demostrado que la incorporación en la ingesta de suplementos con aceites de pescado 31 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias (Cruz-Hernandez et al., 2007; Shingfield et al., 2006) aumenta el contenido de CLA, sin producir cambios en las características organolépticas de la leche, ni en productos derivados (Caroprese et al., 2013; Ramaswamy et al., 2001; Baer et al., 2001; Campbell et al., 2003). Los AG poliinsaturados que contienen los aceites de pescado como C20 – C22 incluyendo a los ácidos omega3 eicosapentanoico (EPA, C20:5 n-3) y docosahexaenoico (DHA, C22:6 n-3) inhiben las reductasas implicadas en la etapa final de biohidrogenación (conversión de ATV a esteárico) favoreciendo de esta forma la acumulación de ATV en líquido ruminal (AbuGhazaleh, 2008; Murphy et al., 2008; Chow et al. 2004). De acuerdo con lo anteriormente expuesto, una manera de optimizar la producción ruminal de ATV precursor del CLA-c9t1, ha sido la combinación de aceites de origen vegetal (como sustrato, para formación de ATV) con aceite de pescado o suplementos de origen marino (como inhibidores del paso final de la biohidrogenación). Gagliostro (2006), evaluó el efecto de la suplementación con 0.8 Kg/día de aceite de girasol, combinado con 0.24 Kg/día de aceite de pescado (AP), este último aumentó en 37% el contenido de CLA-c9t11 en leche, al pasar de 2.86 a 3.92 por 100 g de AG. Angulo (2012a), encontró diferencias para niveles de CLA-c9t11 en leche, siendo menor este valor con la grasa de palma al compararla con aceite de girasol (2.7% de la MS) más alga (DHA 0.4% de la MS) y aceite de lino (2.7% de la MS) mas alga (0.4% de la MS), presentando valores de 1.0; 1.8 y 1.6% respectivamente. El efecto de la suplementación con AG insaturados sobre la composición de los AG de la leche, ha sido ampliamente revisado (Chilliard et al. 2001 y 2007a). Estos generalmente aumentan el porcentaje de AG C18 en la leche y disminuyen los AG de cadena corta y media, lo que puede ser debido a una inhibición en la síntesis de novo por los AG de cadena larga (Barber et al. 1997) o por sustitución de AG de cadena 32 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias corta y media por AG de cadena larga sobre los triglicéridos de la leche (Stoffel et al. 2015; Hansen and Knudsen, 1987). De otra parte, la suplementación con AG insaturados procedentes de aceite vegetal o de pescado, disminuyen la grasa de la leche, sin ningún cambio en la producción o en otros componentes de la leche (Bauman y Grinari, 2001), diferentes publicaciones (Harvatine y Bauman, 2006; Gervais et al. 2009) han mostrado que CLA trans10, cis12 disminuye la grasa de la leche, a través de una baja regulación en la transcripción de las enzimas y proteínas que participan en la síntesis de lípidos en la glándula mamaria (Shingfield et al. 2010, Maxin et al. 2011).Recientemente, Angulo et al. (2012b) encontraron que CLA trans10, cis12 y AGCL de la familia n-3 (DHA), podrían ser considerados como posibles supresores de la grasa de la leche, mediado en parte por una disminución en la proteína 1 unida al elemento de respuesta de los esteroles (SREBP1), que juega un papel crítico en la regulación de la dieta sobre los genes lipogénicos, especialmente aquellos asociados con la síntesis de novo. Cruz- Hernández et al. (2007), demostraron que la adición de 0.5% de aceite de pescado (AP), combinado con aceite de girasol al 3.0% del consumo de M.S, en raciones de vacas lecheras que consumían una dieta de 50% de forraje (heno y ensilaje de cebada y alfalfa) y 50% de concentrado (grano de cebada y maíz), permitió obtener una composición de grasa de leche estable que contiene aproximadamente 4% de ATV y 2% de CLA-c9t11, con tan solo una reducción en la grasa de la leche del 11%, al compararla con el respectivo período en pretratamiento. Los inconvenientes asociados al uso de aceite de pescado, son su extremadamente baja palatabilidad, su elevado costo, la variabilidad estacional en sus AG constitutivos por la diversidad biológica en las especies marinas capturadas para su obtención, la falta de un suministro constante de este insumo por parte de los laboratorios o 33 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias empresas proveedoras, la existencia de una restricción a su uso en algunos países para alimentación de rumiantes, más un cierto riesgo de desvíos en la fermentación ruminal hacia la producción de ciertos AG no deseados como el C18:1 trans10, fundamentalmente en los ovinos (Gómez-Cortés, 2010). La generación de una mayor cantidad de AG relacionados con alteraciones del metabolismo lipídico (C18:1 trans10 y CLA-c9t11), sugirió que la adición de pequeñas cantidades de aceite de pescado a la ración de ovinos afectaría en mayor medida al ecosistema ruminal que la incorporación a la dieta de mayores cantidades de aceites de oleaginosas como el girasol o la soja (Gómez-Cortés, 2010). El ácido linolénico (18:3 n-3), contenido en el aceite de lino, también presenta potencialidad para incrementar los niveles de CLA-c9t11 en la grasa láctea (GómezCortes et al., 2008) y en el fluido ruminal con la formación de ATV y un menor riesgo de incrementar el 18:1 trans10. La suplementación con aceite de lino puede también reducir la relación Omega-6/omega-3 en leche de vacas, (Gagliostro, 2004b), cabras (Gagliostro, 2004c) y ovejas (Gómez-Cortés, 2010). Estudios in vitro (Castillo Vargas, 2012) demostraron que la sustitución parcial de C18:2 por C18:3 incrementó las tasas de conversión del C18:2 a CLA-c9t11 y de CLA-c9t11 a ATV. La mayor tasa de isomerización del C18:2 se obtuvo al combinarlo con el C18:3 lo que implicaría que la desaparición del C18:2 del fluido ruminal resultaría mayor cuando se encuentra en mezcla con C18:3 que sólo. Razón por la cual se desarrollan trabajos de investigación que mezclan aceite de soja, rico en ácido linoleico (C18:2 cis9, cis12), con aceite de lino fuente de ácido linolénico (C18:3 cis9, cis12, cis15), buscando generar una leche funcional, pero manteniendo niveles bajos de C18:1 trans10, lo que podría atenuar la inhibición de la síntesis de novo mamaria y mantener niveles cercanos al 3% de grasa en la leche o mayores. De acuerdo con lo anterior, Gagliostro y Antonacci (2013), suplementaron vacas lecheras, con una mezcla de aceites de soja 34 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias lino en proporción 70:30, suministrando 0,7 Kg/vaca/día, durante 27 días y aumentaron en la leche, el CLA-c9t11 de 1.24% que se tenía inicialmente a 3.13% a los 27 días. De otra parte, se ha demostrado, que la suplementación con aceites vegetales ricos en AG poliinsaturados, no solo permite aumentar los niveles de CLA-c9t11, sino que también aumenta ATV, AG insaturados (moni y poliinsaturados) y disminuye los AG saturados (Tabla 1.2), tanto en leche como en queso, sin afectar las características sensoriales del queso (Vargas-Bello-Pérez et al., 2015), con un impacto alto en la composición de la grasa y su efecto sobre la salud humana. Así mismo, la suplementación con aceites ricos en AG poliinsaturados, disminuye el % de grasa en leche, aunque en trabajos recientes de Saliba et al, (2014) y de Boerman y Lock (2014), un aumento en la producción de leche con la suplementación, conllevó a que el rendimiento en producción de grasa (kg/día) no se viera afectado (Tabla 1.2). Un aspecto importante a tener en cuenta en la alimentación de los animales rumiantes es que, debido al efecto inhibidor de los lípidos sobre el metabolismo microbiano, un aporte de alimentos con elevados contenidos en grasa puede provocar una inhibición de la fermentación ruminal, disminuyendo significativamente la digestibilidad y el consumo de alimento (Harfoot y Hazlewood, 1997). Generalmente, se recomienda que la grasa total no exceda del 6-7% de la MS de la dieta, de otra forma puede ocurrir una depresión en el consumo de alimento (NRC 2001). 35 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 1.2. Variación en el porcentaje de CLA-c9t11, ATV, AG insaturados, saturados del total de grasa de la leche, % grasa, producción de leche y rendimiento en grasa, en la leche de vaca suplemetadas con diferentes fuentes de AG. Autor Vargas-Bello-Pérez et al. 2015 Boerman y Lock 2014 Saliba et al. 2014 Aprianita et al. 2014 Ferlay et al. 2013 Caroprese et al. 2013 Angulo et al. 2012 Tratamiento Control (sin aceite) Aceite de Soya 500 g/a/d* Aceite Palma 500 g/a/d Control (vainas de Soja) AG de soja destilada (AG libres) Aceite de soja (AG como TG**) Sin aceite de semilla Lino Forraje:Concentrado 70:30 Forraje:Concentrado 30:70 Con aceite de semilla Lino Forraje:Concentrado 70:30 Forraje:Concentrado 30:70 Control (sin aceite) Aceite semilla algodón (800 g/a/d) Heno :Concentrado 50:50 0% semilla de lino extruida 5% semilla de lino extruida 10% semilla de lino extruida 15% semilla de lino extruida Ensilaje maíz :Concent 60:40 0% semilla de lino extruida 5% semilla de lino extruida 10% semilla de lino extruida 15% semilla de lino extruida Control (no suplementa grasa) Semilla de Lino entera (1,2 kg/día) Aceite de pescado (200 g/día) Grasa de Palma (3,1 % de la MS) Aceite % MS dieta CLAc9t11 ATV Insaturados Saturados 1.53 4.44 1.33 0.62 1.54 1.70 31.79 41.56 32.65 68.21 58.44 67.35 2.0% 2.0% 0.31 0.27 0.12 0.35 0.79 0.83 0% 0% 0.51 0.36 1.13 0.64 36.11 37.55 3.0% 3.0% 0.88 0.51 0.4 1.8 2.17 1.02 1.7 4.5 0% 5% 10% 15% 0.578 0.915 1.640 1.122 0% 5% 10% 15% 0.61 0.71 0.77 0.92 0.24 0.29 0.57 Queso 1.0 2.6% 2.6% 3.1% Grasa Leche % Prod Leche Kg/d Grasa Kg/d 3.30 3.18 3.11 39.5 42.0 41.4 0.870 0.780 0.650 1.300 1.340 1.290 63.89 62.54 4.22 3.76 25.4 32.2 1.046 1.165 48.96 46.67 25.2 36.6 51.04 53.33 74.8 63.4 4.07 3.37 4.1 3.4 26.9 34.1 32.3 35.4 1.106 1.160 1.346 1.224 1.65 2.95 5.61 3.20 24.32 34.40 42.43 48.17 69.9 59.8 52.0 45.8 3.59 3.50 350 2.91 26.1 25.8 28.3 28.0 0.936 0.905 0.981 0.804 1.54 1.95 2.31 3.12 1.78 2.00 2.04 Queso 1.5 25.9 34.1 45.1 46.2 32.96 32.51 36.50 Queso 32.1 69.0 60.8 48.9 48.1 67.04 67.49 63.50 Queso 67.9 3.38 3.07 2.71 3.12 3.51 3.62 4.30 Leche 25.3 25.2 23.6 25.1 0.858 0.745 0.646 0.799 36 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Ferlay et al. 2010 Rego et al. 2009 Cruz –Henández et al. 2007 Aceite Girasol (2,7 %)+ DHA Alga (0,4%) Aceite de Lino (2,7 %)+DHA Alga (0,4%) Control (sin semilla lino) Semilla de lino extruida Control (sin aceite) Aceite de Colza 0,5 Kg/a/d Aceite de Girasol 0,5 Kg/a/d Aceite de Lino 0,5 Kg/a/d Control (sin aceite) 1,5% aceite girasol+0,5% Aceite Pescado 3,0% aceite girasol+0,5% Aceite Pescado 4,0% aceite girasol+0,5% Aceite Pescado 3.1% 3.1% 0% 5.0% 0% 2.0% 3.5% 4.5% 1.6 1.8 0.38 1.51 1.18 1.14 1.60 1.54 0.42 2.15 2.09 2.78 4.7 6.9 0.86 4.51 2.70 2.53 3.31 3.69 0.80 3.08 3.95 6.62 47.5 50.0 25.06 42.64 52.5 50.0 74.94 57.36 63.0 52.5 51.3 52.4 68.90 62.80 56.56 49.29 4.22 3.73 3.75 3.33 3.27 3.59 3.81 3.50 3.63 3.39 27.3 29.2 22.2 21.9 22.0 22.2 27.26 31.31 26.55 29.51 1.139 1.079 0.820 0.720 0.700 0.780 1.038 1.095 0.963 1.000 *g/a/d = gramos/animal/día, **TG=triglicéridos 37 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE PRODUCCIÓN Y COMPOSICIÓN DE LA LECHE Al evaluar la frecuencia de aparición de efectos positivos, nulos o negativos del aporte de lípidos no protegidos en la ración de vacas lecheras, sobre el consumo, la producción y la composición de la leche de vaca y se encontró una gran variabilidad de respuesta. Dicha variabilidad podría explicarse por modificaciones en el consumo voluntario y del comportamiento ingestivo de las vacas, la naturaleza de la dieta base, el modo y la frecuencia de distribución de los alimentos, la cantidad y la naturaleza de los lípidos no protegidos utilizados, el nivel de producción y el estado de lactancia de las vacas (Morand-Fehr et al., 1986). La suplementación con grasa incrementa la densidad energética en la ración y este incremento se sugiere como la principal razón para aumentar la producción de leche (Grainger y Beauchemin, 2011). Sin embargo, el efecto de la suplementación con grasa sobre la producción de leche de acuerdo al grado de saturación de la grasa suplementada ha sido diferente. La suplementación con AG saturados aumenta la producción de leche, mientras que la suplementación con AG insaturados frecuentemente no causa aumentos significativos en vacas bajo pastoreo (Schoeder, 2004). Igual resultado se encontró en experimentos en estabulación (Gagliostro y Chilliard, 1992). Cuando el consumo de alimento ha disminuido o ha sido similar con la suplementación con grasa a vacas bajo pastoreo, el aumento en la producción de leche puede ser explicado por un mejoramiento en la eficiencia de utilización de la energía, que ha sido atribuido a bajas pérdidas de energía como calor y metano y al uso directo de AGCL en la formación de la grasa de la leche (Garnsworthy, 1997). 38 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias La reducción en la concentración de proteína de la leche ha sido variable con la suplementación con AG insaturados, puede ser el resultado de un bajo consumo de MS. La reducción del consumo de MS sugeriría menos proteína microbial disponible para la síntesis de proteínas de la leche (Weiss et al., 2011) o porque la producción de leche aumenta y por tanto se presenta dilución de proteína de la leche, cambiando así la concentración pero no el rendimiento (Schoeder et al., 2004, Boerman y Lock, 2014). Sin embargo, los resultados de estudios con vacas bajo pastoreo sugieren que la concentración de proteína generalmente no es afectada por la suplementación con grasa (Schoeder et al., 2004). La concentración de lactosa en la leche es notablemente constante debido a sus propiedades osmóticamente activas (Sutton, 1988). Aumento de lactosa con disminución en consumo, cuando se suplementa con AG insaturados, es debido posiblemente a la mayor eficiencia de utilización de la energía del alimento y al aumento en los AGCL preformados en leche que lleva a un ahorro de glucosa debido a una reducción en la síntesis de novo y así, esta glucosa puede entonces ser utilizada por otros tejidos o para más síntesis de lactosa (Boerman y Lock, 2014). EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE LA PRODUCCIÓN DE METANO El metano (CH4), se forma en el rumen por acción de los organismos metanogénicos, un subgrupo de las Archea. En el proceso de digestión ruminal, la fibra de los vegetales es degradada por microorganismos y fermentada principalmente a ácidos grasos volátiles (AGV), amonio, hidrógeno (H2) y CO2. Los organismos metanogénicos usan H2 para reducir CO2 a CH4 en una serie de reacciones que están acopladas a la síntesis de ATP (Leahy, 2010). 39 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Para mitigar la producción de metano en el rumen se han usado múltiples alternativas que comprenden: adición de ionóforos, uso de forrajes de alta calidad, aumento en el uso de granos y uso de grasas (Hook et al. 2010). Estas alternativas nutricionales reducen la emisión de metano por manipulación de la fermentación ruminal, inhibición directa de los metanogénicos y protozoos, o retirando los iones de hidrógeno del proceso metanogénico (Boadi et al., 2004). La defaunación frecuentemente reduce la metanogénesis ruminal (Holtshausen, 2009, Hess et al., 2003, Cheeke 2000) por que cerca del 25% de los metanogénicos ruminales viven asociados a los protozoos (Newbold et at., 1997). Sin embargo, la mayoría de alternativas han fallado, o solo han alcanzado un éxito muy limitado, debido a baja eficacia, efecto poco selectivo sobre los microorganismos, toxicidad de los compuestos contra el hospedador o la generación de resistencia contra el compuesto anti metanogénico (McAllister and Newbold 2008; Martin et al., 2010). En términos generales, se conoce que los lípidos pueden reducir la emisión de metano disminuyendo: la cantidad de materia orgánica fermentada en el rumen, la actividad de las bacterias metanogénicas y el número de protozoos, y a través del uso de hidrógeno durante el proceso de biohidrogenación (Johnson and Johnson 1995). Sin embargo, la cantidad de hidrógeno utilizado en el proceso de biohidrogenación es pequeña (1%) en comparación con la cantidad de hidrógeno utiliza para reducir el dióxido de carbono para producir metano (48%; Czerkawski, 1986). Los aceites ricos en AG de cadena media reducen la producción de metano (Machmüller, 2006,), los ácidos láurico (C12: 0) y mirístico (C14: 0) han sido los más eficaces (Dohme et al, 2001; Soliva et al, 2003). Panyakaew et al, (2013), en un estudio in vitro, adicionando 120 mg de aceite de coco (C12:0 (44%) y C14:0 (18%)) /100 ml de fluido de incubación, redujo la producción de metano en 14,5%. 40 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Se considera que los AG de la dieta, principalmente los poliinsaturados, constituyen una de las alternativas dietarias más prometedoras para deprimir la metanogénesis (Martin et al., 2006; 2010; Wu et al, 2013; Cieslak et al, 2013). Se ha comprobado que en vacas lecheras la suplementación con AG del lino (rico en linolénico), deprimen la metanogénesis ruminal, sin embargo también muestran un efecto negativo sobre la producción de grasa en la leche, y aún demanda mayor investigación (Martin et al., 2008). En otro estudio la inclusión de semillas oleaginosas trituradas en la dieta de vacas lactantes, en 9 a 10% de MS de la dieta (6,7 y 7,3 % de grasa en bruto) redujo la producción de CH4 por unidad de leche corregida al 4% de grasa, en aproximadamente el 15% (Beauchemin et al., 2009). Se ha encontrado un efecto similar en la disminución de la producción de metano ruminal con los ácidos grasos C18: oleico, linoleico y linolénico (Beauchemin et al., 2009 , JCLA et al., 2007). Beauchemin et al. (2007), compararon grasa animal (sebo 47% AG saturados) y aceite de girasol (78 % de AG insaturados en la dieta), suplementando 3,4 % de la MS de la dieta y encontraron que la producción de metano se redujo en 17 % para ambas fuentes de lípidos, pero el aceite de girasol presentó mejor potencial para adoptar en ganaderías porque presentó mínimo efecto sobre la digestibilidad de la fibra y aumentó consumo de energía digestible y ganancia de peso en el ganado. La reducción de metano in vitro, inducida por la adición de grasa a la dieta puede alcanzar hasta un 50% (Machmüller et al., 1998) y se ha observado que está asociada a la disminución de protozoarios (Cieslak et al., 2006). Los metanógenos dependen de la actividad metabólica de los protozoos (Janssen et al., 2010). Así, el efecto supresor sobre producción de metano de C18: 2 y C18: 3 observado, puede ser debido a un efecto tóxico indirecto sobre los metanógenos del rumen. 41 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Los ácidos grasos de cadena impar y ramificada (OBCFA) son principalmente de origen bacteriano y forman parte de los lípidos de membrana de las bacterias, con un perfil constante y específico para cada especie. Los cambios en el perfil de OBCFA pueden reflejar variaciones en la abundancia relativa de las poblaciones de bacterias específicas o su actividad metabólica, razón por la cual se utilizan como indicadores, del efecto de la suplementación con grasa sobre la población de bacterias, en estudios in vitro (Amaro, 2012). La respuesta inhibitoria de grasas en la producción de metano depende de la concentración, tipo, composición de AG de las grasas, y la composición nutricional de las dietas (Beauchemin et al., 2008; Machmüller, 2006). Mayores concentraciones de grasa, aunque sustancialmente reducen la producción de metano, a menudo ejercen efectos perjudiciales sobre la digestibilidad y la fermentación de los alimentos afectando el rendimiento de los animales. Un reciente meta-análisis de 29 trabajos de investigación que contenía 105 tratamientos dietarios, informó que los AG C12: 0 y C18: 3 tienen un marcado efecto inhibidor sobre la metanogénesis en comparación con otros AG en la dieta. Las emisiones de metano no se vieron afectadas considerablemente por la concentración total de AG saturados, pero fueron deprimidas por las concentraciones totales de AG mono y poliinsaturados en las dietas. Las grasas mostraron una respuesta cuadrática sobre el consumo de MS (aumento de 14.3 kg / día a 14.9 kg / día con concentraciones de grasa de 4.2% de la MS, por encima de este disminuyó). Las digestibilidad de la MS y de la fibra detergente neutro se redujo linealmente con incremento en la concentración de grasa. La producción de leche alcanzó niveles de meseta dentro de un rango de 3.9 a 6.0% de concentración de grasa, y luego disminuyó con el aumento de las concentraciones de grasa. Los ácidos grasos volátiles totales y porcentaje de acetato en el fluido ruminal no fueron alteradas por las grasas, pero el porcentaje de propionato aumentó 42 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias linealmente con el aumento de las concentraciones de grasas en la dieta. Las grasas tendieron a disminuir el porcentaje de butirato y la relación acetato:propionato linealmente. De este análisis, se puede concluir que las grasas con altas concentraciones de C12:0, C18: 3 y AG poliinsaturados hasta 6% de MS de la dieta, deberían ser consideradas a la hora de desarrollar estrategias efectivas de alimentación para disminuir metano sin comprometer la productividad del ganado lechero (Patra, 2013). Estudios in vitro que evaluaron aceite de coco (44% de C12:0) en dosis de 80 y 120 mg/100 ml de fluido de incubación, con y sin adición de 20 mg de una mezcla de aceite de girasol y lino (PUFA), redujeron la producción de metano en 12.7 y 14.5% para la dosis de 80 y 120 mg sin adición de PUFA y en 31 y 28% para la dosis de 80 y 120 mg con adición de PUFA (Panyakaew et al., 2013). Wu et al. (2013), adicionando 50 mg/500 mg de sustrato de ácido oleico o linoleico disminuyó la producción de metano con ambos aceites. Cieslak et al. (2013), evaluó la adición de 50 g/kg de MS de aceite de uva (69.6% de ácido linoleico) o aceite de grosella negra (58.6% de ácido linoleico) en 2 dietas, alfalfa más harina de trigo en proporción 60:40 y heno de pradadera más harina de trigo en proporción 60:40, encontraron que aunque la adición de los aceites no afectó la fermentación, solo se presentó una disminución en la producción de metano en la dieta con alfalfa, siendo de 4.7 , 3.71 y 3.62 mmol a las 24 horas de fermentación para los tratamientos control, aceite de uva y grosella respectivamente, y de 3.37 , 3.92 y 3.75 mmol para los tratamientos control, aceite de uva y grosella respectivamente, en la dieta con heno de pradera, sugiriendo que pudo haber un efecto detrimental del tipo de dieta y aceite sobre los protozoos. Igualmente, Amaro et al (2012), evaluando ácido estearidónico (C18:4 n-3), a niveles de 1, 5, 20 y 50 mg/L de medio de incubación, no encontró efecto de la adición de aceite sobre la producción de metano, concluyendo que se necesitan altos niveles de ácido estearidónico no esterificado para mitigar metano. 43 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias FAO (2013), en su revisión concluye que los lípidos son eficaces en la reducción de emisión de metano entérico, pero la viabilidad de esta práctica de mitigación depende de su costo-efectividad y de los efectos potenciales sobre la alimentación, productividad y el contenido en la grasa de la leche, en animales en periodo de lactancia (positivo o negativo). Subproductos de alimentos con alto aceite, como los granos de destilería y alimentos de la industria del biodiesel, pueden servir como fuentes rentables de lípidos con potencial efecto suprimiendo metano. Su posible reducción, no ha sido bien establecida y en algunos casos la producción de metano, puede aumentar, debido al aumento de la ingesta de fibra. Hay un gran número de oleaginosas no tradicionales siendo investigadas como materia prima para biocombustibles, que si están disponibles, se pueden utilizar para la alimentación del ganado y tienen un efecto beneficioso sobre la productividad de los animales (a través de mejoras en la energía y el suministro de proteínas), incluyendo un efecto de mitigación de metano, aunque se carece de datos para apoyar este concepto. CONSIDERACIONES FINALES De acuerdo a la revisión realizada, la suplementación con lípidos de origen vegetal fuente de AG insaturados, permite aumentar la concentración de CLA-c9t11, disminuir la proporción de AG saturados en la leche y reducir la emisión de metano, pero la respuesta varía de acuerdo con la fuente de grasa empleada, su nivel y la interacción con la dieta basal. En Colombia la producción de leche se realiza, con animales bajo pastoreo de gramínea sola o en mezcla con leguminosas, dentro de los que se encuentran los sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi), con o sin suplementación con alimentos concentrados. La aplicación de estrategias nutricionales, como la suplementación 44 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias lipídica, para producir leche más saludable y disminuir metano, conlleva a que se desarrollen estudios sobre las características de la leche en relación con la composición de la grasa (proporción de nutrientes funcionales y AG insaturados) y la variación que se desprende de los sistemas de producción con su alimentación característica; evaluar diferentes fuentes de AG insaturados, para incrementar la presencia de nutrientes funcionales y conocer los efectos que se ocasionan, sobre la producción de metano y la fermentación ruminal, ayudados de la técnica in vitro de producción de gas y así poder seleccionar, la mejor opción a probar en finca de productor, buscando un producto diferencial, con un impacto alto en la composición de la grasa y su efecto sobre la salud humana. REFERENCIAS AbuGhazaleh AA, Schingoethe DJ, Hippen AR and Kalscheur KF. 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El trabajo se llevó a cabo en 10 ganaderías (fincas), representativas de los sistemas de producción denominados lechería tropical (LT) 3 fincas, lechería tropical sistema silvopastoril intensivo (LTSSPi) 3 fincas, doble propósito (DP) 2 fincas, doble propósito sistema silvopastoril intensivo (DPSSPi) 2 fincas. Estos productores realizan pastoreo rotacional con período de ocupación entre 12 a 48 horas, en solo gramíneas de Cynodon plectostachyus y/o Megathyrsus maximus cv. Tanzania y en los sistemas silvopastoriles en Cynodon plectostachyus y/o Megathyrsus maximus cv. Tanzania con Leucaena leucocephala. En los sistemas de producción LT, LTSSPi y DP se suplementa la dieta base con concentrado y/o subproductos de la agroindustria o una mezcla de ambos. En cada finca, se seleccionaron 5 vacas de más de un parto, en las que se tomaron muestras individuales de leche, durante 3 veces (día 62 ± 22, día 147 ± 22 y día 227 ± 22 de lactancia). Conjuntamente con cada uno de los muestreos de leche, se estimó el consumo de suplemento y de forraje y se tomaron muestras de cada componente de la dieta para determinar el contenido de grasa y el perfil de AG de la misma a fines de estimar el consumo de grasa y de ácidos grasos. El análisis de grasa total de la leche, se realizó en la leche fresca, mediante Milkoscan 133 B mientras que los AG de la leche se analizaron mediante cromatografía de gases con detector de ionización de llama (FID) y 63 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias los AG de los alimentos mediante cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas.Cada sistema de producción se analizó independientemente. El contenido de grasa en leche no fue afectado por el manejo alimenticio dado en cada finca (p>0.05), ni por el número de parto (p>0.05), pero fue afectado por el tercio de lactancia (p<0.05), en el sistema LTSSPi y DPSSPi y con una tendencia (p=0.09) en el sistema LT, presentando el primer tercio el menor valor, en los tres sistemas (LT, LTSSPi y DPSSPi). Las concentraciones de CLA-c9t11, ATV y AGCL de la leche fueron afectadas por las condiciones alimenticias inherentes a cada finca. En los sistemas LT, LTSSPi y DP, la alta participación de la grasa de los suplementos en el total de grasa consumida y la composición de la grasa de los suplementos, provocó variaciones en el perfil de AG de la leche. En el sistema LT el ácido linoleico representó la mayor contribución a los AG insaturados consumidos aunque en una de las fincas la proporción de CLA-c9t11 y de ATV en la leche fueron menores, con respecto a las otras dos fincas (p<0.05), debido al poco aprovechamiento del ácido linoleico presente en la semilla de algodón utilizada como suplemento. En el sistema DP la situación fue similar, sin afectar la proporción de CLA-c9t11 y de ATV en la leche (p>0.05), pero aumentando la proporción de ácido linoleico en la leche (p<0.05). En el sistema LTSSPi, el mayor consumo de ácido oleico en una de las fincas evaluadas no afectó la proporción de CLA-c9t11 y de ATV en la leche (p>0.05), pero aumentó la proporción de ácido oleico en la leche (p<0.05), conllevando a un aumento en los AG monoinsaturados (p<0.05) y a un menor índice de aterogenicidad (p<0.05). En el sistema DPSSPi a base de solo forraje, no se detectaron diferencias significativas en el contenido de CLA-c9t11 en la leche (p>0.05), pero si para el ATV (p<0.05), siendo menor cuando el forraje se cosechó a mayor edad. 64 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias El efecto del número de parto sobre los AG insaturados de la leche, resultó significativo con muy poca frecuencia, solo se presentó para AG oleico en el sistema LTSSPi y para AG linolénico en el sistema DP. Hubo diferencia asociadas al tercio de lactancia para la proporción de CLA-c9t11, en los sistemas LT y DP, presentando un valor mayor en el segundo y tercer tercio con respecto al primero. Para los demás ácidos grasos insaturados evaluados, no se presentó una variación consistente asociada al tercio de lactancia, que afectara el índice de aterogenicidad. INTRODUCCIÓN El ácido linoleico conjugado C18:2 c9t11(CLA-c9t11) o ácido ruménico, el ácido transvaccénico C18:1 t11 (ATV), algunos ácidos grasos de cadena larga (AGCL) de la familia omega tres (n-3) y la proporción de ácidos grasos (AG) insaturados, de la leche bovina, se relacionan con beneficios para la salud humana (Harris, 2008; Shingfield et al., 2013). Se ha reportado que el CLA-c9t11 inhibe el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer humano, reduce la tasa de desarrollo del tumor inducido químicamente, altera el metabolismo de las lipoproteínas, y modifica la función inmune en modelos animales (Shingfield et al., 2008). Por lo tanto, el CLA- c9t11 puede tener varios beneficios potenciales sobre la salud en los seres humanos. El ATV es el principal ácido graso trans en la grasa de rumiantes siendo a su vez el precursor del CLA-c9t11 en los tejidos (Field et al., 2009). Dicho AG ha demostrado a su vez efectos anticancerígenos (Miller et al., 2003; Sauer et al., 2004). Los AG 18:3 n-3 reducen la presencia en sangre de lipoproteínas de baja densidad, contribuyendo así a una disminución en el riesgo a incidencia de enfermedad cardiovascular en el ser humano (Shingfield et al., 2008). Asimismo, el ácido oleico C18:1 cis-9 puede prevenir el aumento de la lipoproteína de baja densidad en la sangre y disminuir la presión arterial (Dhakal et al., 2014). En contraste, existen evidencias que los AG saturados tales como el láurico (C12:0), el mirístico (C14:0) y el palmítico (C16:0), aumentan la presencia de 65 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias lipoproteína de baja densidad (Givens, 2010), con efecto aterogénico (Ulbritch y Southgate, 1991) e hipercolesterolémico (Givens, 2010). En la leche bovina, tanto el CLA-c9t11, como el ATV, los AGCL n-3 e insaturados, resultan del consumo de AG insaturados, de la extensión de la biohidrogenación ruminal (BHR) o de su capacidad para escapar a la misma. La magnitud de las cantidades presentes de cada AG en la leche está fuertemente determinada por factores dietarios (Palmquist, 2007). El contenido en CLA-c9t11 en la leche es mayor en animales que reciben raciones con una mayor proporción de forraje, y puede a su vez estar afectado por el tipo de forraje consumido siendo mayor en animales en pastoreo que cuando los mismos reciben forrajes conservados (ensilados) (Weiss et al., 2004 a y b; Mele et al., 2006; Mohammed et al., 2006). El efecto enriquecedor de las pasturas sobre los niveles de CLA-c9t11 en leche se explica por el consumo de ácido linolénico proveniente del pasto, su posterior conversión en ATV (C18:1 t11) a nivel de rumen y la subsiguiente conversión a CLA-c9t11 por actividad de la enzima mamaria Delta-9 desaturasa (Griinari y Bauman (1999). Se estima, que más del 74% de CLA-c9t11 en grasa de la leche es sintetizado a través de la actividad de la enzima Delta-9 desaturasa (Bichi et al.,2012). Aunque las dietas a base en pasturas resultan en una leche con mayores niveles basales de CLA-c9t11, se pueden alcanzar aumentos adicionales con la suplementación a base de lípidos que contengan AG polinsaturados (Chilliard y Ferlay, 2004; Schroeder et al., 2004). Esta práctica permite aumentar el CLA-c9t11, ATV, AG insaturados y disminuir la concentración de AG saturados (Ferlay et al 2013) que presentan efectos aterogénicos (Ulbritch y Southgate, 1991) e hipercolesterolémicos (Givens, 2010), aunque su efecto varía de acuerdo con la cantidad y fuente de grasa 66 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias empleada y con la composición de la dieta basal (Chillard y Ferlay 2004; Dewhurst et al. 2006). En Colombia, el 45% de la leche se produce en Lechería especializada de trópico alto orientada solo a la producción de leche y el otro 55% bajo el sistema doble propósito orientado a la producción de leche y carne (CONPES, 2010), en donde se incluyen los sistemas de lechería tropical como una modificación del doble propósito pero con mayor nivel tecnológico y orientado solo a la producción de leche. Los sistemas doble propósito y de lechería tropical en su expresión tradicional se manejan bajo pastoreo con una base forrajera de solo gramíneas, sin o con suplementación de alimentos concentrados, con el fin de cubrir los requerimientos nutricionales de las vacas. Sin embargo, otros productores utilizan pastoreo en sistemas con una base forrajera silvopastoril (SP), que permite aumentar la oferta de forraje, en particular durante el periodo seco, mejorar la calidad de la dieta a lo largo del año y mejorar la conservación y el reciclaje de nutrientes (Murgueitio, 1999; Pagiola et al., 2005; Pagiola et al., 2007). Hay evidencia de que ciertos metabolitos secundarios presentes en plantas forrajeras no gramíneas, pueden afectar la biohidrogenación ruminal (Khiaosa-Ard et al., 2009) y de esta forma podrían modificar la composición de la leche. El rango en las concentraciones de CLA-c9t11 en la leche de las vacas bajo pastoreo es amplio (0.5 a 1.7%), debido a cambios estacionales en la disponibilidad de pasto, asignación de pastura, composición botánica de los recursos naturales y pastos cultivados, concentración de lípidos y ácido linolénico (Chilliard y Ferlay, 2004; Schroeder et al., 2004) y al tipo de suplemento ofrecido (Rico et al., 2007) siendo los factores dietarios los principales determinantes de las concentraciones de CLA-c9t11 en leche. Otros factores como el número de partos y el estado de lactación también pueden presentan cierta influencia (Lawless et al., 1999; White et al., 2001; Kelsey et al., 2003). Existe en Colombia muy poca información al respecto y por lo tanto, el 67 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias desarrollo de estrategias de suplementación en la ganadería colombiana con ácidos grasos poliinsaturados que permitan aumentar los ácidos grasos benéficos en la leche, exige un previo conocimiento de como las diferentes condiciones de producción y alimentación específicas del país influyen sobre el valor saludable de la leche de acuerdo al sistema de producción. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de las condiciones alimenticias propias de cada finca, el número de partos y el tercio de lactancia sobre el porcentaje de grasa, la concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche, en ganaderías de los sistemas lechería tropical y doble propósito, bajo pastoreo de solo gramíneas (Cynodon plectostachyus y/o Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y bajo pastoreo en sistemas silvopastoriles (Cynodon plectostachyus y/o Megathyrsus maximus cv. Tanzania con Leucaena leucocephala). MATERIALES Y MÉTODOS Localización Este trabajo se llevó a cabo en 12 ganaderías (fincas), seleccionadas representativas de los siguientes sistemas de producción: a. Doble propósito (DP) definido en su forma más universal de ordeño con becerro y cruces mixtos de Bos taurus x Bos indicus, sin sistemas silvopastoriles. b. DP (idem) en pastoreo en sistemas silvopastoril intensivos (SSPi). c. Lechería tropical (LT) definida por cruces mixtos de Bos taurus x Bos indicus con predominio de Bos taurus, el ordeño sin ternero, pastoreo sin SSPi. d. LT (idem) en pastoreo con SSPi 68 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias El Sistema Silvopastoril Intensivo se definió como el uso de la tierra destinado a la producción tropical eficiente y natural de ganado bovino, donde se combina en el mismo espacio una mezcla de gramíneas mejoradas (estoloníferas y cespitosas), con un segundo estrato de plantas de Leucaena leucocephala u otras, no menor a 8.000 arbustos por hectárea (Murgueitio et al., 2009). La localización y características generales de las fincas se presentan en la Tabla 2.1. Tabla 2.1. Localización y características generales de las fincas en estudio Finca Municipio y Departamento m.s.n.m T.P.1 °C Forraje D.D.2 pastura Leche L/día3 LT LT LT LTSSPi Esperanza Pradera San Felipe Asturias Risaralda - Caldas Risaralda - Caldas Pereira-Risaralda Tebaida - Quindío 1.743 1.743 1.411 1.190 21 21 22 23 30 32 27 43 15.4 12.2 11.8 15.6 5 LTSSPi Hatico 987 24 51 13.4 6 LTSSPi Lucerna 941 23 41 15.6 7 8 9 10 DP DP DP DPSSPi Maracaibo Vargas Japón Pradera 1.969 1.630 1.630 223 18 23 23 28 27 21 31 10.8 9.3 ---6.2 11 DPSSPi Salsipuedes CerritoValle del Cauca Buga la GrandeValle del Cauca Neira - Caldas Palestina - Caldas Palestina - Caldas La Jagua del Pilar - Guajira Fonseca - Guajira 12 28 47 5.5 12 DPSSPi Campo Alegre Fonseca - Guajira 12 28 Estrella Guinea Estrella Estrella Guinea Leucaena Estrella Guinea Leucaena Estrella Leucaena Estrella Estrella Guinea Estrella Guinea Leucaena Guinea Leucaena Guinea Leucaena 31 ---- N° Sistema 1 2 3 4 1 T.P= Temperatura Promedio D.D.= Días de descanso 3 Promedio de los 3 muestreos, del grupo de vacas en estudio DP= Terneros menores de 3 meses permanecen con la vaca 3 horas/día y mayores de 3 meses solo en ordeño DPSSPi= Terneros menores de 4 meses permanecen con la vaca 8 horas/día y mayores de 4 meses solo en ordeño 2 69 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Estos productores realizan pastoreo rotacional con periodo de ocupación entre 12 a 48 horas, con disponibilidad de agua fresca y limpia para los animales. En los sistemas LT, LTSSPi y DP se suplementa la dieta base de acuerdo con la producción de leche/animal/día, con concentrado y/o subproductos de la agroindustria o una mezcla de los dos (Tabla 2.2) y en todos los sistemas de producción se ofrece sal mineralizada. Tabla 2.2. Suplementacón ofrecida en las fincas en estudio. Sistema Finca LT La Esperanza Relación Leche: Suplemento 4.0:1.0 LT La Pradera 3.2:1.0 LT San Felipe 3.0:1.0 LTSSPi Asturias 4.0:1.0 LTSSPi Hatico 4.0:1.0 LTSSPi Lucerna 4.0:1.0 DP Maracaibo 5.5:1.0 DP Vargas 5.9:1 DP Japón 5.1:1 DPSSPi DPSSPi DPSSPi Pradera Salsipuedes Campo Alegre -------------- Suplementación Concentrado: Estandar 70 (harina) Promedio= 3,8 Kg Conc /animal/día Mezcla preparada en Finca (18% proteína) Promedio: 4.3 Kg Mezcla + 1.5 Kg galleta =5.8 Kg/a/d Concentrado: Soya leche 18 Promedio:4.1 kg/a/d Mezcla Maní Forrajero 80% + Matarratón 20% (4,7 Kg/a/día) + Cachaza (2 L/a/día) Mezcla: Maxileche 70 + Supl Energético, en relación 3:1 Promedio: 4.2 Kg de mezcla /a/d Mezcla: Salvado arroz (38%) + Soya leche 18 (38%)+ barredura Milo (24 %) Promedio: 3.3 Kg de mezcla /a/d Concentrado: Soya leche 18 Barredura Milo: 0.8 Kg/a/d Promedio:4.0 kg Concen + 0.8 kg barred: 4.8 kg/a/d Mezcla Torta de Soya (25%)+harina de maíz (75%) 1 kg de semilla de algodón/a/d Promedio= 1,8 Kg Mezc. + 1 Kg Semilla Algo= 2.8 Kg/a/d 20 gr de Rumencin + 20 gr de Carbonato de Ca Concentrados: Alimento 14-16 : 1 kg animal/día y Estandar 70:Según producción(8 l=0.5 a >20 l=4 Kg/a/d) Promedio: 1 Kg(14-16) + 1.7 Kg estándar 70 =2.7 Kg/a/d Silo de cítrico: 1 kg/a/d Concentrado: Alimento 14-16 : 1 kg animal/día y Estandar 70:Según producción(8 l=0.5 a >20 l=4 Kg/a/d) Promedio: 1 Kg(14-16) + 2.8 Kg estándar 70 =3.8 Kg/a/d Silo de cítrico: 1 kg/a/d No se suplementa No se suplementa No se suplementa 70 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Se trabajaron 3 fincas por sistema. En cada finca, se seleccionaron 5 vacas de más de un parto, en las que se tomó muestra individual de leche, durante 3 veces (día 62 ± 22, día 147 ± 22 y día 227 ± 22 de lactancia), en el periodo de lluvias (Mayo - inicio de Diciembre). Así cada sistema contó con 15 vacas y dado que estas no tenían igual número de partos, se evaluó el efecto del número de partos sobre las variables en estudio. La muestra de leche, se tomó por triplicado: una para determinación de grasa y demás componentes, una para perfil de ácidos grasos y una contramuestra. Los muestreos se hicieron de acuerdo a las recomendaciones de I.O.S.. and I.D.F (2008). Conjuntamente con cada uno de los muestreos de leche, se determinó el consumo de materia seca del suplemento mediante la diferencia entre la oferta y rechazo y también del forraje, mediante la técnica de desaparición de forraje descrito por (Macoon et al., 2003). Seguidamente, se tomaron muestras de cada componente de la ración para determinar la composición química incluyendo el contenido de grasa y el perfil de ácidos grasos de los alimentos (Tabla 2.3 y 2.4). Con base en lo anterior, se estimó el consumo de forraje, de grasa y de ácidos grasos oleico, linoleico y linolénico que se presentan en la Tabla 2.5. 71 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 2.3. Composición química y ácidos grasos de los forrajes de los sistemas de producción en estudio LECHERÍA TROPICAL Variable Esperanza Pradera LECHERÍA TROPICAL SSPi DOBLE PROPÓSITO DOBLE PROPÓSITO SSPi San Felipe Asturias Hatico Lucerna Asturias Hatico Lucerna Maracaibo Vargas Pradera Salsipue Pradera Leucaena Leucaena Salsipue Estrella Guinea Estrella Estr-Gui Estr-Gui Estrella Leucaena Leucaena Leucaena Estrella Estr-Gui Guinea Guinea Grasa % 1.5 0.8 1.2 1.1 0.9 1.0 2.0 2.6 2.3 1.2 1.0 1.2 1.2 2.7 3.5 Proteína % 16.2 11.5 12.2 11.9 8.9 8.7 26.0 27.6 27.3 13.8 15.7 9.6 7.8 28.6 24.5 FDN % 64.3 65.7 69.2 69.0 69.1 72.9 31.4 31.5 28.8 69.7 68.2 71.1 72.0 33.0 29.9 FDA % 28.7 37.2 31.5 32.0 34.0 35.1 14.4 17.2 16.0 32.6 31.7 37.8 38.6 17.0 15.3 Cenizas % 9.6 14.4 8.4 10.2 9.7 9.4 6.9 8.3 7.7 10.6 11.1 12.2 11.5 8.2 7.4 g AG/100g AG Totales C14:0 0.44 0.61 0.60 0.59 0.76 0.59 0.30 0.55 0.52 0.58 0.53 0.86 0.67 0.33 0.35 C16:0 24.78 29.51 26.00 27.20 27.85 25.91 24.46 24.10 24.97 25.32 26.30 27.42 27.34 22.77 21.63 C18:0 1.75 2.45 2.05 2.15 2.53 2.08 5.20 6.21 7.20 1.72 1.93 3.13 2.45 6.43 6.33 C18:1c9 1.79 2.05 2.06 2.07 2.38 1.94 2.15 3.04 3.36 2.17 1.95 3.61 1.83 2.99 3.15 C18:2c9,12 15.20 17.33 15.94 16.03 16.87 15.80 16.29 16.04 14.01 15.99 15.99 14.31 15.39 14.17 11.41 C18:3c9,12,15 47.26 39.04 41.61 41.70 35.84 41.70 42.54 39.62 38.08 43.95 44.09 43.69 43.21 43.20 47.39 Saturados 30.95 36.98 34.52 34.89 38.48 34.62 33.14 35.39 37.19 32.63 32.97 34.49 34.65 32.80 31.38 Insaturados 69.04 63.01 65.47 65.10 61.51 65.37 66.85 64.60 62.80 67.36 67.02 65.50 65.34 67.19 68.61 Monoinsaturados 4.76 4.96 5.75 5.38 6.13 5.84 6.89 7.63 9.44 5.51 5.17 6.12 4.87 8.52 8.63 Poliinsaturados 64.28 58.05 59.72 59.71 55.13 59.53 59.95 56.97 53.36 61.85 61.85 59.38 60.47 58.67 59.98 Sumatorias 72 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 2.4. Composición química y ácidos grasos de los suplementos Variable LECHERÍA TROPICAL LECHERÍA TROPICAL SSPi DOBLE PROPÓSITO Esperanza Pradera San Felipe Asturias Hatico Lucerna Maracaibo Vargas Grasa % 5.7 4.2 4.0 7.3 10.0 5.9 7.9 3.8 Proteína % 17.1 18.0 20.5 15.8 12.2 12.8 19.7 17.3 FDN % 32.0 36.7 26.0 32.7 19.6 24.1 36.5 36.3 FDA % 10.0 16.2 7.3 11.4 5.8 6.5 18.5 14.5 Cenizas % 6.4 9.0 8.2 9.5 7.0 5.8 3.7 7.5 g AG/100g AG Totales C16:0 22.62 26.70 19.70 27.88 25.88 24.24 28.33 21.47 C18:0 2.56 2.69 3.06 8.76 5.33 11.01 3.00 3.43 C18:1c9 23.73 21.43 23.94 22.60 33.56 26.45 19.00 21.80 C18:2c9,12 44.83 40.41 44.35 28.65 27.67 25.93 44.90 36.20 C18:3c9,12,15 2.24 1.59 4.26 1.60 1.50 1.33 0.99 1.97 Saturados 27.60 35.43 25.26 43.13 34.77 41.14 33.63 37.90 Insaturados 72.39 64.56 74.73 56.86 65.22 58.85 66.36 62.09 Monoinsaturados 24.88 22.27 25.62 25.89 35.56 30.57 20.23 23.47 Poliinsaturados 47.51 42.28 49.11 30.97 29.65 28.27 46.13 38.62 Sumatorias 73 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 2.5. Consumo estimado de forraje y de ácidos grasos oleico, linoleico y linolénico Item Lechería tropical ESPERANZA PRADERA SAN FELIPE Lechería tropical SSPi ASTURIAS Consumo Kg MS/a/d Pasto 8.60 8.20 8.09 9.27 Leucaena 0.00 0.00 0.00 2.62 Concentrado 3.42 5.22 3.69 5.04 Total 12.02 13.42 11.78 16.93 % Forraje 72 61 69 70 % Concentrado 28 39 31 30 % Gramínea 100 100 100 78 % Leucaena 0 0 0 22 Consumo Grasa Kg/a/d Pasto 0.129 0.069 0.094 0.103 Leucaena 0.000 0.000 0.000 0.052 Concentrado 0.196 0.220 0.148 0.370 Total 0.325 0.288 0.242 0.525 % de la MS 2.70 2.15 2.05 3.10 Aporte Grasa % Forraje 39.6 23.8 38.8 29.5 Concentrado 60.4 76.2 61.2 70.5 Consumo del AG (% del total de Grasa Consumida) Oleico Pasto 0.71 0.49 0.80 0.41 Leucaena 0.21 Concentrado 14.32 16.32 14.65 15.93 Linoleico Pasto 6.03 4.13 6.19 3.14 Leucaena 1.61 Concentrado 27.06 30.78 27.14 20.20 Linolénico Pasto 18.74 9.31 16.15 8.18 Leucaena 4.21 Concentrado 1.35 1.21 2.61 1.13 Total 68.20 62.24 67.53 55.02 Participación de cada AG (% del total de Grasa Consumida) Oleico 15.03 16.81 15.45 16.55 Linoleico 33.08 34.91 33.32 24.95 Linolénico 20.09 10.52 18.75 13.51 Doble Propósito Doble Propósito SSPi HATICO LUCERNA MARACAIBO VARGAS PRADERA SALSIPUEDES 4.82 0.78 3.33 8.93 63 37 84 16 6.09 2.14 4.59 12.83 64 36 74 26 9.92 0.00 2.52 12.44 80 20 100 0 8.80 0.00 2.43 11.23 78 22 100 0 8.72 1.66 0.0 10.38 100 0 84 16 7.99 0.25 0.0 8.23 100 0 97 3 0.043 0.021 0.334 0.397 4.44 0.058 0.050 0.269 0.377 2.94 0.119 0.000 0.200 0.319 2.56 0.090 0.000 0.093 0.183 1.63 0.109 0.045 0.000 0.154 1.48 0.098 0.009 0.000 0.107 1.30 16.0 84.0 28.6 71.4 37.3 62.7 49.1 50.9 100 0.0 100 0.0 0.26 0.16 28.20 0.30 0.44 18.89 0.81 0.96 2.55 0.88 1.68 0.26 11.91 11.10 1.82 0.83 23.25 2.43 1.85 18.52 5.97 7.85 10.12 4.15 14.13 0.94 28.15 18.43 3.87 2.05 1.26 61.70 6.42 5.03 0.95 54.82 16.40 21.65 30.90 12.65 39.67 3.89 0.62 63.85 1.00 60.98 61.24 60.55 28.61 25.90 7.18 19.63 22.80 12.40 12.72 34.11 17.02 12.05 26.28 22.65 3.43 14.27 43.55 1.94 15.06 43.55 74 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias El análisis de grasa total y demás componentes de la leche, se realizó en la leche fresca, mediante Milkoscan 133 B. Las muestras de leche y alimentos para perfil de ácidos grasos, se mantuvieron congeladas a -20ºC hasta la realización del análisis. Los AG de la leche se analizaron mediante cromatografía de gases con detector de ionización de llama (FID). Para esto, la muestra se descongeló, se homogenizó vigorosamente con la mano y luego por 3 min en vortex, se transfirieron 300 ul a viales de 4 ml ámbar con tapa de sílica y se liofilizaron. La derivatización de los ácidos grasos y extracción de los metil éster de ácidos grasos, se llevó a cabo a partir de esta muestra, siguiendo el protocolo de transesterificación mediante el siguiente procedimiento: tomar 300 uL de leche liofilizada en viales de reacción ámbar de 4 ml con tapas de sílica, adicionar 300 ppm de estándar interno C19, adicionar 1 ml de metóxido de sodio 0.5 N en metanol y mezclar en vortex durante 3 minutos, calentar durante 10 minutos a 50 ºC, sacar y mezclar, calentar a 50ºC por 20 minutos, sacar y mezclar, enfriar a temperatura ambiente, adicionar 1ml de hexano y tapar, mezclar en vortex por 2 minutos y transferir con pipeta Pasteur la capa superior a viales de 1.5 ml para posterior análisis en cromatografía. Se utilizó un cromatógrafo de gases HEWLET PACKARD 6890, con automuestreador. Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes; fase móvil: gas transportador Nitrógeno, flujo de columna 1ml/min, velocidad lineal 26 cm/seg ; inyector :temperatura 220 °C, volumen 0.2 ul, modo splitt, radio splitt 1:50; columna: Modelo CP – Sil – 88 marca restek, longitud 100m, diámetro interno 0.25 mm , espesor de la película 0.2 uL; rampa de temperatura: temperatura 150 °C, tiempo de calentamiento 3 minutos, rata 15 °C/min; detector : FID, temperatura 250 °C, flujo de H2 40 ml/min, flujo de aire 400 ml/min, flujo de N 10 ml/min . Los ácidos grasos fueron separados e identificados por comparación de los tiempos de retención con sus respectivos estándares (MatreyaLLC, Pennsylvania, U.S.A.), se cuantificaron utilizando la curva de calibración de los estándares de CLA (CLA-c9t11; CLA-c10t12; CLAt10c12 y CLA Mezcla para los isómeros restantes), de ATV y los demás ácidos grasos, con el 75 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias estándar FAME Mix de Supelco 37, además se utilizó el ISTD (ácido nonadecanoico, C19:0). El porcentaje de cada AG fue calculado a partir de su concentración (ppm) determinada por cromatografía (Tequin-Ocampo, 2014). Con base en el porcentaje de cada AG, se calculó mediante sumatorias, el porcentaje de AG saturados, insaturados, monoinsaturados , poliinsaturados, omega 3 (C18:3 c9,12,15; C20:3 c11,14,17; C20:5 c5,8,11,14,17), omega 6 (C18:2 t9,12; C18:2 c9,12; C18:3 c6,9,12; C18:2 c10,t12; C18:2 t10,c12; C20:3 c8,11,14; C20:4 c5,8,11,14; C22:2 c13,16) , relación n6/n3, C10 a C16, trans C18:1 (ATV y C18:1 t9), aterogénicos (C12:0,C14:0,C16:0) e índice de aterogenicidad. El índice aterogénico (IA) fue calculado de acuerdo con Ulbricht y Southgate (1991), mediante la ecuación IA = C12:0+ 4C14:0 + C16:0/AG insaturados. Para la determinación de la composición química de los alimentos (Tablas 2.3 y 2.4), se utilizaron las técnicas analíticas convencionales de la AOAC (1999) (materia seca método ID 934.01, cenizas método ID 942.05, proteína bruta método ID 984.13, grasa y fibra detergente ácido método ID 973.18) y los descritos por Van Soest et al. (1991) para los análisis de fibra detergente neutro y fibra detergente ácido. El perfil de ácidos grasos, de los alimentos, se realizó mediante el método de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas. Para esto, 15 g de muestra de alimento fue liofilizada, seguidamente se realizó la derivatización de los ácidos grasos siguiendo el protocolo de esterificación, que consiste en pesar 50 mg alimento y depositarlos en viales de reacción ámbar de 4 ml con tapas de silica, adicionar 300 ppm de estándar interno C19, adicionar 1 ml de metóxido de sodio 0.5 N en metanol y mezclar en vortex durante 3 minutos, calentar durante 10 minutos a 50 ºC, sacar y mezclar, adicionar 1 ml de HCl0.5 N en metanol y mezclar en vortex durante 3 minutos, calentar durante 10 minutos a 50 ºC, sacar y mezclar, enfriar a temperatura ambiente, adicionar 1ml de hexano y tapar, mezclar en vortex por 2 minutos y finalmente, transferir con pipeta Pasteur la capa superior a viales de 1.5 ml para posterior análisis cromatográfico. Se utilizó un cromatógrafo de gases acoplado a 76 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias espectrómetro de masas ShimadzuQP2010 plus, con automuestreador. Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes; fase móvil: gas transportador Helio, flujo de columna 1ml/min, velocidad lineal 26 cm/seg; inyector:temperatura 220 °C, volumen 0.2 ul, modo splitles; columna: Modelo CP – Sil – 88 marca restek, longitud 100m, diámetro interno 0.25 mm , espesor de la película 0.2 uL; rampa de temperatura: temperatura 150 °C, tiempo de calentamiento 3 minutos, rata 15 °C/min; detector: temperatura 250 °C, flujo de N2 10 ml/min. Los ácidos grasos fueron separados e identificados por comparación de los tiempos de retención con sus respectivos estándares (MatreyaLLC, Pennsylvania, U.S.A.) y por comparación de la librería del equipo; se cuantificaron utilizando la curva de calibración de los estándares de CLA y sus isómeros, de ATV y los demás, con el estándar FAME mix de supelco 37, además se utiliza el ISTD (ácido nonadecanoico, C19:0).El porcentaje de cada AG fue calculado a partir de su concentración (ppm) determinada por cromatografía (TequinOcampo, 2014). Análisis estadístico El análisis para las variables contenido de grasa, perfil de ácidos grasos de la leche y las respectivas sumatorias, se realizó mediante un modelo mixto de medidas repetidas para cada sistema de forma independiente, que incluyó efecto del manejo alimenticio propio de cada finca (finca), tercio de lactancia, vaca dentro de finca, número de partos y sus interacciones, utilizando PROC MIXED de SAS (SAS, 2001). La diferencia entre promedios dentro de sistema, se analizó mediante prueba de TuckeyKramer, con nivel de significancia del 5%. Se consideraron tendencias estadísticas cuando el valor de p fue < 0.05 ≤ 0.1. Las fincas de cada sistema de producción están ubicadas en la misma zona agroecológica que influye las condiciones de producción y por tanto existe homogenidad dentro de cada 77 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias sistema. Sin embargo, cada sistema de producción está ubicado en una zona agroecológica diferente, razón por la cual cada sistema se evaluó independientemente, utilizando el modelo estadístico descrito anteriormente, el cual permitió cumplir el objetivo propuesto en la fase de caracterización, que buscó conocer el % de grasa y el perfil de AG de la leche de cada sistema de acuerdo al manejo alimenticio dado en cada finca, al número de partos y al tercio de lactancia. Se inició con 12 fincas, pero para el segundo muestreo, una de las fincas cambió su sistema de Doble propósito a Lechería Tropical y en otra finca del sistema DPSSPi, se presentó una alta mortalidad de terneros, que ocasionó la suspensión del ordeño de sus madres, razón por la cual solo se analizaron 10 fincas. Así mismo, para el sistema LTSSPi, por problemas técnicos en el laboratorio, hubo necesidad de eliminar el perfil de AG de la leche del último tercio de lactancia y por esto el análisis se realizó con base en el tercio 1 y 2. RESULTADOS Lechería Tropical Las condiciones alimenticias propias de cada finca (finca) y el número de parto, no afectaron el porcentaje de grasa de la leche (p>0.05) (Tabla 2.6). Hubo una tendencia (p= 0.09) al aumento en el contenido de grasa de la leche, con el tercio de lactancia, siendo el último tercio el que presentó la mayor cantidad de grasa (Tabla 2.6). 78 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 2.6. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema Lechería Tropical Finca Parto Ácido Graso Grasa % Proteina % Sólidos no grasos % Sólidos totales % Lactosa % MUN (mg/dl) g AG/100g AG Totales C6:0 C8:0 C10:0 C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 + C14:1 cis C15:0 + C15:1 cis C16:0 C16:1 cis C17:0 C17:1 cis10 C18:0 C18:1 cis9 C18:1 trans9 C18:1 trans11 C18:2 cis9,12 C18:2 cis9,trans11 C18:3 cis6,9,12 C18:3 cis9,12,15 C20:0 C22:0 Sumatorias Esperanza 4.01 3.15 8.69 12.67 a 4.76 19.32 1.52 1.18 2.24 0.43 2.91 0.23 15.56 2.48 21.60 1.33 0.90 0.48 14.62 21.79 0.51 6.32 2.10 2.09 0.25 0.37 0.32 0.13 a a a a a a a a a Tercio lactancia Pradera 3.48 2.97 8.25 11.76 b 4.52 15.45 San Felipe 3.53 2.97 8.28 11.71 b 4.53 15.34 3 3.63 3.07 8.55 12.10 4.70 17.08 6 3.71 2.99 8.27 11.99 4.51 16.32 1 3.49 2.77 8.26 11.76 4.57 14.53 1.31 0.99 1.78 0.39 2.53 0.23 13.56 2.22 23.73 1.58 0.78 0.48 16.61 23.76 0.59 5.09 2.52 1.28 0.21 0.36 0.26 0.09 1.68 1.15 2.06 0.44 2.61 0.25 14.71 2.73 21.98 1.44 1.10 0.53 14.33 22.17 0.57 6.34 1.97 2.08 0.23 0.48 0.32 0.15 1.50 1.12 1.95 0.43 2.59 0.23 14.01 2.39 21.67 1.40 0.93 0.53 15.90 24.35 0.55 5.61 2.10 1.93 0.26 0.39 0.30 0.14 1.50 1.10 2.10 0.41 2.78 0.24 15.21 2.56 23.20 1.50 0.92 0.48 15.29 20.80 0.56 6.21 2.30 1.70 0.20 0.42 0.30 0.10 1.55 1.20 2.14 0.42 2.65 0.25 14.39 2.30 21.33 1.33 1.00 0.55 16.59 22.88 0.59 6.12 2.28 1.53 0.16 0.45 0.28 0.11 ab b b ab a a b b a ac a ab ac b ab a a b a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2 3.70 3.05 8.37 12.01 4.63 18.34 1.56 1.14 2.05 0.44 2.76 0.23 14.93 2.58 22.63 1.48 0.90 0.49 14.69 22.23 0.52 5.79 2.19 1.91 0.24 0.40 0.32 0.13 a b a a b a a ab ab b b b b b b b b b 3 3.84 3.26 8.60 12.37 4.61 17.24 1.39 1.99 1.89 0.39 2.63 0.23 14.51 2.54 23.35 1.54 0.88 0.47 14.29 22.61 0.56 5.83 2.13 2.01 0.29 0.40 0.30 0.13 Valor de p b c b b b c c bc ac b b b b b b ab b b Finca ns ns ns 0.0701 ns ns Parto ns ns ns ns ns ns Tercio 0.0904 <0.0001 <0.0001 0.0048 ns <0.0152 Finca*Tercio ns ns ns ns ns ns 0.0006 0.0029 ns ns ns ns 0.0311 0.0154 ns ns < 0,0001 0.0294 ns ns ns 0.0173 ns 0.0165 ns 0.0281 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 0.0168 < 0,0001 0.0064 0.0327 ns ns ns 0.0003 < 0,0001 0.0064 0.0002 0.0091 < 0,0001 ns 0.0085 ns ns 0.0001 0.0006 ns ns ns 0.0005 ns ns ns 0.0163 ns 0.0637 ns < 0,0001 0.0708 0.0519 0.0019 ns 0.0375 0.0179 0.0059 0.0274 ns 0.0307 ns ns 79 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Saturados 64.10 64.35 64.31 62.69 65.81 63.96 Insaturados 35.90 35.65 35.69 37.31 34.19 36.04 Monoinsaturados 30.89 31.04 30.15 32.53 28.86 31.65 Poliinsaturados 5.01 4.61 5.54 4.78 5.33 4.39 a Omega 3 (n3) 0.53 a 0.36 b 0.57 a 0.51 0.41 0.42 a Omega 6 (n6) 2.77 2.77 2.62 2.65 2.79 2.59 n6/n3 5.70 a 7.97 b 4.99 a 5.93 7.28 6.28 C10 a C16 45.34 44.34 44.33 43.33 46.01 43.50 Trans C18:1 6.84 a 5.68 b 6.89 a 6.18 6.76 6.72 Aterogénicos C12, 14,16 40.12 37.43 39.14 37.48 40.32 38.40 Índice de aterogenicidad 2.42 2.16 2.36 2.11 2.51 2.27 Valores con letras diferentes en la misma fila difieren significativamente entre tratamientos (p<0,05). 64.45 35.55 30.16 5.39 b 0.47 b 2.81 7.02 45.25 6.29 40.31 2.41 64.35 35.65 30.26 5.39 b 0.50 b 2.77 6.51 45.26 6.40 37.96 2.25 ns ns ns ns <0,0001 ns 0.0180 ns 0.0194 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 0.0122 0.0244 ns ns ns ns ns ns ns ns ns 0.1707 <0,0001 ns 0.0002 0.0081 0.0079 ns 0.0049 80 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias El CLA-c9t11, fue diferente entre fincas (p<0.05), siendo la finca Pradera la que presentó la menor proporción (Figura 2.1). No se presentó efecto del número de partos (p>0.05). Se presentaron diferencias entre tercios de lactancia (p<0.05), con un mayor valor en el último tercio; la interacción finca x tercio de lactancia fue significativa (p<0,05), siendo la finca Pradera en el primer tercio la que presentó el menor valor (Tabla 2.6). Figura 2.1. Concentración de CLA-c9t11 (ruménico) en la grasa láctea de los sistemas LT, DP, DPSSPi (3 tercios de lactancia) y LTSSPI (2 tercios de lactancia). El ATV fue diferente entre fincas (p<0.05), presentando la finca Pradera la menor proporción de ATV con respecto a las fincas Esperanza y San Felipe (Figura 2.2). No se presentó efecto del número de partos, ni del tercio de lactancia (p>0.05). Se presentó interacción entre finca x tercio de lactancia (p<0.05), nuevamente la finca pradera en el primer tercio presentó el menor valor. 81 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias ATV C18:1 t11 % 7,00 6,00 a a 6,32 b 5,74 a 5,89 4,88 5,09 5,00 6,50 6,26 6,49 6,34 b 4,40 4,00 3,00 2,00 % TVA 1,00 LT LT SSPi DP Salsipuedes PraderaGua Vargas Maracaibo Lucerna Hatico Asturias Sanfelipe PraderaRi Esperanza 0,00 DP SSPi Figura 2.2. Concentración de ATV C18:1 t11 en la grasa láctea de los sistemas LT, DP, DPSSPi (3 tercios de lactancia) y LTSSPI (2 tercios de lactancia). El ácido linolénico presentó una mayor proporción en la leche de la finca San Felipe (p<0.05). No se presentó efecto del número de partos, ni del tercio de lactancia (p>0.05). Se presentó interacción entre finca x tercio de lactancia (p<0.05), la finca San Felipe en el primer tercio presentó el mayor valor. Los ácidos oleico y linoleico, no presentaron diferencias entre fincas, numero de parto o tercio de lactancia (p>0.05) (Tabla 2.6). Las condiciones alimenticias propias de cada finca (finca), el número de partos y el tercio de lactancia no afectaron la proporción de AG saturados, insaturados, omega 6, aterogénicos, ni índice de aterogenicidad (p>0.005) (Tabla 2.6). 82 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias En la leche de la finca Pradera, la proporción los ácidos grasos n-3 fue menor (p<0.005) y la relación n6/n3, fue mayor a las otras dos fincas (p<0.005). Igualmente, la finca Pradera presentó la menor proporción de ATV y de Trans C18:1 (ATV + C18:1 t9) (p<0.005), Los AG poliinsaturados fueron menores en el primer tercio de lactancia y aumentaron en los dos últimos tercios de lactancia (p<0.05). Los AG omega 3, presentaron un comportamiento similar (p<0.05), con una marcada interacción de finca x tercio (p<0.05), la finca Pradera en el primer tercio presentó el menor valor. Sistema Lechería Tropical SSPi El contenido de grasa en leche no presentó diferencias entre fincas (p>0.05), ni número de parto (p>0.05), pero presentó diferencia significativa por tercio de lactancia (p<0.05), siendo el tercer tercio el que presentó la mayor cantidad de grasa (Tabla 2.7). En este sistema los AG fueron cuantificados solo para el 1 y 2 tercio. El CLA-c9t11, no fue diferente entre fincas (Figura 2.1), partos, ni tercios de lactancia (p<0.05) (Tabla 2. 7). El ATV no fue diferente entre fincas (Figura 2.2), ni número de partos (p>0.05) (Tabla 2.7), pero fue diferente entre tercios de lactancia (p<0.05), con un mayor valor en el tercio 2 con respecto al primer tercio y hubo interacción entre finca x tercio de lactancia (p<0.05), la finca Hatico en el segundo tercio presentó el mayor valor. El ácido oleico presentó una mayor proporción en la leche de la finca Hatico (p<0.05). En el cuarto parto (p<0.05) y en el segundo tercio (p<0.05) y se presentó interacción entre finca x tercio de lactancia (p<0.05), la finca Hatico en el segundo tercio presentó el mayor valor. . 83 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Los ácidos linoleico y linolénico, no presentaron diferencias entre fincas, numero de parto o tercio de lactancia (p>0.05) (Tabla 2.7). Los AG insaturados fueron diferentes entre fincas (p<0.05), entre tercios de lactancia (p<0.05) y en la interacción finca x tercio (p<0.05), presentando la finca Hatico y el segundo tercio de lactancia, la mayor proporción. No se presentó diferencia por número de parto (p<0.05). La proporción de AG monoinsaturados fue mayor en la finca Hatico (p<0.05), mientras que los AG poliinsaturados no presentaron diferencias entre fincas (p>0.05). Los AG monoinsaturados y poliinsaturados no fueron diferentes entre número de partos, ni entre tercios de lactancia (p>0.05). En este sistema, la proporción de AG omega 3, no fue diferente entre fincas, número de partos, ni tercios de lactancia (p>0.05). Los AG omega 6, no fueron diferentes entre fincas, ni número de partos (p>0.05), pero fueron diferentes entre tercios de lactancia siendo mayores en el segundo tercio (p<0.05), con interacción de finca x tercio (p<0.05), no obstante, lo anterior no afectó la relación n6/n3 en ninguno de los efectos evaluados (p>0.05). La proporción de AG aterogénicos, fue diferente entre fincas (p<0.05), partos (p<0.05), tercio de lactancia (p<0.05) e interacción finca x tercio (p<0.05), presentando el mayor valor la finca Lucerna, los partos 5 y 7 y el primer tercio de lactancia. Sin embargo, el índice de aterogenicidad no presentó diferencias entre Lucerna y Asturias, siendo mayor en estas y en el primer tercio de lactancia (p<0.05). 84 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 2.7. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema Lechería Tropical SSPi Finca Asturias Hatico Lucerna Grasa % 3.16 3.43 3.45 Proteína % 3.35 3.11 3.24 Sólidos no grasos% 8.79 a 7.96 b 8.28 ab Sólidos totales % 11.96 11.38 11.87 Lactosa % 4.67 a 4.01 b 4.18 b MUN (mg/dl) 9.38 7.78 8.46 g AG/100g AG Totales C6:0 1.44 1.32 1.40 C8:0 1.15 0.91 1.15 C10:0 1.95 ab 1.48 b 2.30 a C12:0 2.38 ab 1.96 b 2.98 a C14:0 + C14:1 cis 12.24 b 11.11 b 16.03 a C15:0 + C15:1 cis 2.16 1.80 1.90 C16:0 22.3 22.19 22.63 C16:1 cis 1.17 1.48 1.25 C17:0 1.14 a 0.80 b 0.88 b C17:1 cis10 0.57 0.44 0.46 C18:0 18.53 17.01 15.68 C18:1 cis9 23.91 b 27.28 a 22.43 b C18:1 trans9 0.78 b 1.08 a 0.62 b C18:1 trans11 5.74 6.49 4.88 C18:2 cis9,12 2.55 2.65 3.14 C18:2 cis9,trans11 1.02 1.46 1.07 C18:3 cis6,9,12 0.31 0.26 0.26 C18:3 cis9,12,15 0.30 0.30 0.34 C20:0 0.37 0.38 0.31 Sumatorias Saturados 63.67 a 58.46 b 65.45 a Insaturados 36.32 b 41.53 a 34.54 b Monoinsaturados 32.05 b 36.85 a 29.79 b Ácido Graso Parto 3 4 5 6 7 3.39 3.07 3.53 3.31 3.43 3.28 3.21 3.39 3.12 3.17 8.67 8.50 8.42 8.27 8.31 12.01 11.23 12.00 11.61 11.83 4.58 a 3.99 b 4.22 ab 4.38 ab 4.32 ab 7.05 7.12 11.72 8.47 8.34 1 2.84 2.95 8.16 11.21 4.29 5.23 Tercio lactancia 2 3 a 3.54 b 3.66 a 3.25 b 3.51 8.37 8.50 a 11.86 ab 12.14 4.38 4.23 a 9.23 b 11.16 1.35 0.85 1.08 1.06 1.82 1.63 2.29 1.95 12.18 b 9.76 b 1.97 1.97 22.11 21.98 1.05 1.39 0.99 1.03 0.48 0.57 18.95 17.76 25.03 b 29.95 a 0.80 0.72 4.92 4.87 2.63 2.8 0.86 1.00 0.34 0.39 0.26 0.23 0.43 0.34 1.30 1.06 2.16 2.90 15.97 b 2.21 22.57 1.63 0.81 0.44 14.07 23.54 b 0.79 5.61 2.41 1.44 0.22 0.32 0.29 1.24 0.94 1.57 1.95 11.31 b 1.93 22.31 1.18 1.01 0.51 19.33 24.28 b 0.89 6.23 2.57 1.22 0.26 0.31 0.39 2.20 1.21 2.37 3.11 16.42 a 1.69 22.91 1.26 0.85 0.45 15.25 19.9 b 0.93 6.55 3.5 1.41 0.16 0.45 0.32 1.71 1.22 2.15 2.72 14.04 1.95 21.80 1.22 0.93 0.48 16.56 23.53 0.90 5.07 2.70 1.23 0.22 0.31 0.32 a 1.06 a 0.92 a 1.67 a 2.16 b 12.21 1.96 a 22.95 1.38 0.95 0.50 17.59 a 25.55 a 0.75 a 5.20 2.87 1.14 a 0.33 0.32 a 0.39 63.44 36.55 32.37 63.44 36.55 32.11 62.39 37.60 33.12 65.48 34.51 29.23 63.25 a 61.81 b 36.74 a 38.18 b 32.32 33.47 57.88 42.11 37.64 b b b b a b b b b b b b c b c Valor de p Finca Parto Tercio F*T ns ns 0.0352 ns ns ns 0.0001 0.0308 0.0505 ns ns ns ns ns 0.032 ns 0.0176 0.0788 ns ns ns ns 0.0001 0.0020 ns ns 0.0001 0.0103 ns ns 0.0087 ns 0.0177 ns 0.0001 0.0113 0.0271 ns 0.0001 0.0063 0.0148 0.0298 0.0001 0.0001 ns ns ns 0.0403 ns ns 0.0016 0.0037 ns ns ns Ns 0.0314 ns ns Ns ns ns ns Ns ns ns ns Ns 0.0339 0.0372 0.0052 0.0425 0.0025 ns 0.0335 Ns ns ns 0.0013 0.0262 ns ns ns 0.0029 ns ns ns Ns ns ns 0.0037 0.0084 ns ns ns Ns ns ns 0.0119 Ns 0.0189 0.0189 0.0051 ns ns ns 0.0414 0.0244 0.0414 0.0244 ns 0.0101 85 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Poliinsaturados 4.21 4.78 4.77 4.13 4.38 4.54 4.47 Omega 3 (n-3) 0.38 0.29 0.30 0.30 0.25 0.31 0.37 Omega 6 (n-6) 2.82 3.03 3.44 2.98 3.14 2.81 2.86 n6/n3 8.14 11.39 11.16 11.55 12.86 8.75 8.97 C10 a C16 41.14 b 38.55 b 46.51 a 40.76 a 36.44 b 46.12 a 39.37 b Trans C18:1 6.36 ab 7.51 a 5.51 b 5.77 5.64 6.38 7.10 Aterogénicos C12, 14,16 36.99 b 35.07 b 41.55 a 36.68 b 33.80 b 41.26 a 35.57 b Índice de aterogenicidad 2.12 a 1.69 b 2.70 a 2.15 1.65 2.46 1.87 F*T =Finca * Tercio Valores con letras diferentes en la misma fila difieren significativamente entre tratamientos (p<0,05). 5.43 0.37 3.69 10.01 47.63 a 7.40 4.46 4.72 0.3 0.34 2.95 a 3.24 b 10.10 10.76 43.38 a 40.75 b 6.97 a 5.95 b ns ns ns ns ns ns ns ns 0.0301 ns ns ns 0.0187 0.0502 0.0529 0.0351 ns 0.0013 42.05 a 38.42 a 37.32 b 0.0083 0.0289 0.0580 0.0003 2.71 2.32 a 2.02 b 0.0094 ns 0.0016 Ns 0.0009 Ns 0.0015 0.0295 0.0003 0.0001 86 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Sistema Doble Propósito En este sistema se evaluaron 2 fincas.El contenido de grasa en leche no fue afectado por el manejo alimenticio dado en cada finca (p>0.05), el número de parto (p>0.05), ni el tercio de lactancia (p>0.05) (Tabla 2.8). El CLA-c9t11, no fue afectado por el manejo alimenticio dado en cada finca (p>0.05) (Figura 2.1), ni el número de parto (p>0.05), fue afectado por el tercio de lactancia (p<0.05), con un mayor valor en el segundo y tercer tercio y la interacción finca x tercio de lactancia fue significativa (p<0.05) siendo menor en la finca Maracaibo en el primer tercio (Tabla 2.8). El ATV no fue diferente entre fincas (p>0.05) (Figura 2.2), partos (p>0.05), ni tercios de lactancia (p>0.05). El ácido linoleico presentó una mayor proporción en la leche de la finca Maracaibo (p<0.05), en el tercer parto (p<0.05), no presentó diferencias por tercio de lactancia (p>0.05) y se presentó interacción entre finca x tercio de lactancia (p<0.05), siendo menor en la finca Vargas en el segundo tercio. Los ácidos oleico y linolénico, no presentaron diferencias entre fincas, numero de parto o tercio de lactancia (p>0.05) (Tabla 2.8). La proporción de AG saturados, insaturados, omega 6, n6/n3, C10 a C16, trans C18:1, aterogénicos e índice de aterogenicidad, no fueron afectados por la finca (p>0.05), el parto (p>0.05), ni tercio de lactancia (p>0,05). Solo los omega 3, presentaron diferencias entre fincas (p<0.05), siendo la finca Maracaibo la que presentó la mayor proporción con respecto a la finca Vargas que solo registró linolénico en la leche y los demás n3 no los registró, aunque la relación n6/n3 no se vio afectada (p>0.05). 87 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 2.8. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema Doble Propósito Ácido Graso Grasa % Proteína % Sólidos no grasos % Sólidos totales % Lactosa % MUN (mg/dl) g AG/100g AG Totales C6:0 C8:0 C10:0 C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 + C14:1 cis C15:0 + C15:1 cis C16:0 C16:1 cis C17:0 C17:1 cis10 C18:0 C18:1 cis9 C18:1 trans9 C18:1 trans11 C18:2 cis9,12 C18:2 cis9,trans11 C18:2 trans9,12 C18:3 cis6,9,12 C18:3 cis9,12,15 C20:0 Sumatorias Saturados Finca Maracaibo Vargas 2.70 2.96 3.20 3.28 8.79 8.84 11.44 11.71 4.77 4.78 14.24 a 19.95 b Parto 2 3 4 2.88 2.65 3.16 3.20 3.33 3.13 8.85 8.95 8.54 11.66 11.55 11.67 4.87 a 4.84 a 4.59 b 16.56 16.51 20.23 5 2.63 3.32 8.93 11.43 4.82 a 15.08 Tercio lactancia 1 2 3 2.40 2.94 3.15 2.86 a 3.37 b 3.50 b 8.10 a 8.87 b 9.07 c 10.95 a 11.68 b 12.10 b 4.72 4.79 4.82 16.28 16.45 18.55 Valor de p Finca Parto Tercio ns ns ns ns ns 0.0001 ns ns 0.0001 ns ns 0.0121 ns 0.0377 ns 0.0200 ns ns F*T ns 0.0021 0.0019 ns ns 0.0093 ns ns ns ns ns 0.0005 ns 0.064 0.0013 ns ns ns ns 0.0127 0.0009 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 0.0003 ns ns 0.008 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 0.0249 0.0258 ns ns ns 0.0034 ns ns ns ns ns 0.0002 ns ns ns ns ns ns ns 0.0422 ns 0.0106 0.0787 ns ns 0.0005 ns 0.0315 0.0358 0.0055 0.0312 ns 0.0037 0.0055 0.0333 0.0207 ns ns ns ns 1.93 1.14 2.14 0.43 2.68 0.21 15.08 2.59 21.36 1.47 1.05 0.56 14.30 22.78 0.66 6.50 1.92 A 1.98 0.35 0.17 0.44 0.27 1.08 1.14 2.10 0.45 2.80 0.27 15.41 2.77 23.31 1.74 0.98 0.60 13.50 22.49 0.62 6.26 1.40 b 2.22 0.42 0.20 0.34 0.23 2.06 0.77 1.15 1.33 2.27 a 2.33 a 0.43 0.43 2.95 a 2.94 a 0.27 0.28 15.84 14.50 2.65 2.59 22.98 21.45 1.52 1.60 0.99 1.09 0.51 0.65 13.99 14.69 20.56 23.16 0.62 0.67 6.49 6.38 1.48 a 2.11 b 2.00 2.19 0.35 0.35 0.20 0.19 0.40 0.45 0.25 0.29 1.45 1.74 1.07 1.01 2.02 ab 1.87 b 0.46 0.43 2.68 ab 2.41 b 0.20 0.21 15.28 15.39 2.74 2.74 22.43 22.50 1.39 1.76 2.00 0.98 0.55 0.60 13.47 13.45 23.20 23.61 0.61 0.67 6.42 6.23 1.53 a 1.52 a 2.15 2.71 0.45 0.40 0.19 0.16 0.38 0.35 0.19 0.25 1.6 1.38 2.41 0.46 2.99 0.27 15.71 2.55 21.82 1.47 1.11 0.66 14.61 21.91 0.70 6.23 1.79 1.65 0.33 0.14 0.40 0.26 63.03 63.63 65.77 62.89 64.80 62.09 62.56 a a a a a a a 1.89 0.96 1.83 0.39 2.42 0.20 14.79 2.63 22.52 1.64 0.88 0.41 13.43 23.54 0.59 6.48 1.48 2.37 0.40 0.28 0.36 0.23 62.08 b b b b b b b 1.02 1.08 2.12 0.46 2.82 0.26 15.25 2.86 22.67 1.71 1.05 0.59 13.66 23.45 0.64 6.43 1.71 2.26 0.44 0.13 0.42 0.25 63.11 b b a a ab b a ns ns ns ns 88 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Insaturados 36.97 36.37 34.23 37.91 37.11 37.44 35.20 Monoinsaturados 31.96 31.76 29.73 32.55 32.30 32.87 30.99 Poliinsaturados 5.01 4.61 4.51 5.36 4.81 4.57 4.21 Omega 3 (n-3) 0.55 A 0.34 b 0.45 0.53 0.45 0.36 0.40 Omega 6 (n-6) 2.40 1.99 1.96 2.63 2.12 2.07 2.13 n6/n3 4.65 5.81 4.51 5.58 5.21 5.62 5.68 C10 a C16 44.68 45.96 47.60 46.28 45.38 45.02 46.15 Trans C18:1 7.16 6.90 7.10 7.09 7.03 6.89 6.95 Aterogénicos C12, 14,16 39.11 41.51 41.73 38.88 40.36 40.27 40.50 Índice de aterogenicidad 2.32 2.46 2.65 2.20 2.31 2.39 2.53 F*T =Finca * Tercio Valores con letras diferentes en la misma fila difieren significativamente entre tratamientos (p<0,05). 37.92 32.78 5.14 0.42 2.21 5.41 44.61 7.06 39.70 2.25 36.89 31.81 5.08 0.52 2.25 5.60 45.20 7.08 40.72 2.39 Ns Ns Ns 0.0099 Ns Ns Ns Ns Ns Ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 0.0421 ns ns ns ns n ns ns 89 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Sistema Doble Propósito SSPi En las 2 fincas evaluadas, el contenido de grasa en leche no fue afectado por el manejo alimenticio dado en cada finca (p>0.05), ni por el número de parto (p>0.05), fue afectado por el tercio de lactancia (p<0.05), presentando el primer tercio el menor valor (Tabla 2.9). El CLA-c9t11, no fue diferente entre fincas (p>0.05) (Figura 2.1), partos (p>0.05), ni tercios de lactancia (p>0.05) (Tabla 2.9). El ATV fue diferente entre fincas (p<0.05) (Figura 2.2), siendo la finca Pradera la que presentó la mayor proporción, pero no presentó diferencias por parto (p>0.05), ni tercio de lactancia (p>0.05). Los ácidos oleico, linoleico y linolénico de la leche, no presentaron diferencias entre fincas, numero de parto o tercio de lactancia (p>0.05) (Tabla 2.9). La proporción de AG saturados, insaturados, omega 6, aterogénicos, índice de aterogenicidad, no fueron afectados por la finca (p>0.05), el parto (p>0.05), ni tercio de lactancia (p>0.05). Los omega 3, solo presentaron diferencias entre tercios de lactancia (p<0.05), siendo mayores en el tercer tercio y por tanto la relación n6/n3 fue menor en este tercio de lactancia (p<0,05). La proporción de trans C18:1 fue diferente entre fincas (p<0.05), siendo mayor en la finca Pradera. El número de partos (p>0.05) y el tercio de lactancia (p>0.05) no afectaron esta variable. 90 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 2.9. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema Doble Propósito SSPi Ácido Graso Grasa % Proteína % Sólidos no grasos % Sólidos totales % Lactosa % MUN (mg/dl) g AG/100g AG Totales C6:0 C8:0 C10:0 C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 + C14:1 cis C15:0 + C15:1 cis C16:0 C16:1 cis C17:0 C17:1 cis10 C18:0 C18:1 cis9 C18:1 trans9 C18:1 trans11 C18:2 cis9,12 C18:2 cis9,trans11 C18:2 trans9,12 C18:3 cis6,9,12 C18:3 cis9,12,15 C20:0 C22:0 C24:0 Finca Pradera Salsipuedes 4.40 4.99 3.43 3.65 8.96 8.77 13.33 13.76 4.75 a 4.30 b 12.50 17.75 1.46 1.08 1.87 0.33 2.42 0.21 14.87 2.58 24.21 1.42 1.13 0.52 14.58 21.56 0.55 5.89 a 1.01 2.05 0.28 0.26 0.43 0.36 0.19 0.10 1.36 0.96 1.87 0.39 2.55 0.23 16.42 3.07 24.13 1.43 1.18 0.58 14.18 22.37 0.41 4.40 b 1.25 1.43 0.15 0.25 0.41 0.31 0.16 0.13 1 4.41 3.61 9.14 13.50 4.73 17.43 3 4.80 3.31 8.58 13.38 4.49 16.18 Parto 4 4.55 3.57 8.76 13.33 4.36 13.82 5 4.97 3.74 9.16 14.07 4.63 15.34 6 4.74 3.46 8.68 13.43 4.41 12.85 1 3.83 3.25 8.70 12.63 4.53 12.92 1.41 1.02 1.83 0.38 2.46 0.23 15.54 2.81 21.84 1.12 1.21 0.47 16.15 22.46 0.50 5.68 1.27 1.67 0.15 0.23 0.46 0.37 0.17 0.11 1.46 1.12 2.04 0.37 2.63 0.22 15.64 2.80 24.97 1.52 1.15 0.55 14.38 21.03 0.55 5.20 1.03 1.64 0.30 0.26 0.40 0.31 0.18 0.11 1.38 1.97 1.77 0.33 2.40 0.21 15.97 2.78 23.39 1.51 1.55 0.56 14.07 22.94 0.43 4.76 1.26 1.75 0.17 0.30 0.49 0.34 0.19 0.11 1.37 1.01 1.87 0.36 2.51 0.23 14.84 2.71 25.04 1.41 1.19 0.57 14.38 22.12 0.47 4.95 1.14 1.73 0.23 0.23 0.40 0.34 0.19 0.12 1.43 1.99 1.84 0.38 2.43 0.19 16.23 3.03 25.62 1.56 1.07 0.53 12.91 21.27 0.46 5.14 0.96 1.91 0.23 0.25 0.35 0.31 0.15 0.11 1.41 1.06 2.04 0.40 2.65 0.23 15.86 2.73 23.61 1.45 1.10 0.56 14.23 22.06 0.51 5.39 1.15 1.80 0.19 0.22 0.41 0.27 0.17 0.10 Tercio lactancia 2 3 a 5.1 b 5.15 a 3.61 b 3.75 a 8.92 b 8.98 a 13.85 b 14.14 4.59 4.46 a 16.80 b 15.66 1.42 1.14 2.08 0.40 2.81 0.23 ab 16.70 2.83 25.65 1.51 a 1.09 0.54 ab 13.06 20.67 0.50 4.90 1.05 1.73 0.25 0.26 0.40 a 0.32 ab 0.15 0.11 a a a a a a a a a a a a a 1.40 0.88 1.48 0.29 2.00 0.19 14.37 2.93 23.29 1.31 1.28 0.56 15.85 23.17 0.44 5.15 1.18 1.70 0.22 0.27 0.46 0.41 0.21 0.13 b b b b b b b b b b b b b b Finca ns ns ns ns 0.0299 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 0.0227 ns ns ns ns ns ns ns ns Valor de p Parto Tercio ns <0.0001 ns <0.0001 ns 0.0102 ns <0.0001 ns ns ns 0.0007 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns F*T ns ns ns ns 0.0603 <0.0001 ns ns 0.0006 0.0478 0.0014 0.068 0.0031 ns 0.0025 ns ns ns 0.0483 ns ns 0.0943 ns ns ns 0.000028 <0,0001 ns ns ns 0.0122 0.0066 ns ns ns 0.0003 ns ns ns ns ns 0.0943 ns ns ns 0.0101 ns ns 0.0088 0.0129 0.0362 ns ns ns 91 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Sumatorias Saturados 65.36 66.95 65.55 67.09 65.25 66.14 66.73 65.85 67.83 64.78 Insaturados 34.64 33.05 34.45 32.91 34.75 33.86 33.27 34.15 32.17 35.22 Monoinsaturados 30.03 29.29 30.38 28.90 30.26 29.63 29.13 30.01 28.20 30.78 Poliinsaturados 4.61 3.76 4.07 4.01 4.49 4.23 4.14 4.14 3.97 4.44 Omega 3 (n-3) 0.66 0.63 0.63 0.60 0.57 0.64 0.60 0.56 a 0.58 a 0.80 b Omega 6 (n-6) 1.79 1.69 1.67 1.71 1.85 1.79 1.66 1.64 1.64 1.92 n6/n3 2.68 2.88 2.80 2.78 2.47 3.00 2.84 3.09 a 2.91 a 2.34 b C10 a C16 46.22 47.65 44.50 47.91 46.28 47.06 48.92 47.07 ab 50.10 a 43.64 b Trans C18:1 6.45 a 4.84 b 6.18 5.75 5.19 5.49 5.61 5.87 5.42 5.64 Aterogénicos C12, 14,16 41.52 43.08 39.82 43.22 41.79 42.41 44.26 42.16 45.17 39.56 Índice de aterogenicidad 2.53 2.89 2.59 2.77 2.64 2.77 2.79 2.70 3.09 2.35 F*T =Finca * Tercio; Valores con letras diferentes en la misma fila difieren significativamente entre tratamientos (p<0,05). ns ns ns ns ns ns ns ns 0.0234 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 0.0209 ns 0.0055 0.0456 ns ns ns 92 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias DISCUSIÓN Contenido de grasa en leche El contenido de grasa en leche, en las fincas de los sistemas LT y LTSSPi, estuvo dentro de los valores normales, al compararlo con los porcentajes de grasa en leche reportados por Calderon et al., (2006) para varias regiones de Colombia (3.19 a 3.48%); sin embargo, sorpresivamente las fincas del sistema DP presentaron valores promedio bajos (2.70 y 2.96 –Tabla 2.8), mientras que las fincas del sistema DPSSPi presentaron valores promedio altos (4.40 y 4.99% -Tabla 2.9). Los valores altos de grasa encontrados en el sistema DPSSPi están asociados con la menor producción de leche respecto a los valores promedios nacionales, esto hace que ocurra un efecto de concentración de los componentes de la leche. Existe una relación inversa entre la producción de leche y el porcentaje de constituyentes de la misma; cuando se produce más cantidad, los componentes disminuyen por tener un mayor factor de dilución (Prendiville et al., 2011; Campabadall C., 1999). Esta explicación también aplicaría para la mayor concentración de grasa encontrada en el último tercio de lactancia. En cuanto a los valores bajos de grasa en leche encontrados en el sistema DP, estos podrán ser explicados por el efecto del amamantamiento de la cría. Se ha demostrado, que vacas que amamantan sus crías, presentan menor % de grasa en leche para la venta, que aquellas que no lo hacen y que el porcentaje de grasa es mayor en la leche que consumen las crías, que en la leche para venta (Ojeda et al., 2001; Froberg et al., 2007; Cozma et al., 2011). Las vacas del sistema Doble propósito (DP) amamantaron sus crías, por tanto su porcentaje de grasa en la leche para la venta, fue menor que el de las vacas de los sistemas LT y LTSSPi que no amamantaron cría. Consumo de alimento El consumo diario de MS por animal estuvo entre 8.23 y 14.64 Kg MS, valores que están de acuerdo con la proporción de suplemento consumido. Así, las fincas del 93 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias sistema DPSSPi, que no recibían suplementación presentaron un menor consumo que las suplementadas. De otra parte, las fincas Hatico del sistema LTSSPi y la finca Salsipuedes del sistema DPSSPi, presentaron un consumo bajo ocasionado por el bajo consumo de leucaena, en Hatico se registró poca disponibilidad de forraje debido posiblemente a la edad del cultivo en donde correspondió el muestreo (más de 10 años) y en Salsipuedes, se presentó rechazo de la leucaena por parte de los animales; los valores de FDN (29.9%) y FDA (15.3 %) para la leucaena de Salsipuedes, fueron similares a las demás fincas, lo que lleva a proponer que el bajo consumo fue debido posiblemente a baja palatabilidad, ocasionada por un mayor nivel de taninos como consecuencia de una mayor edad del forraje (47 días), con respecto a la finca PraderaGuajira (31 días). Es conocido que la presencia de taninos en la leucaena, por sus propiedades astringentes pueden constituir factores disuasivos del consumo (García et al., 2008). La cantidad de alimento consumido está dentro de los rangos reportados para este tipo de animales, Mahecha et al. (2000), en un sistema silvopastoril, reporta un consumo de forraje promedio de 9.5 Kg/animal/día – 7.7 Kg de C. plectostachyus y 1.8 Kg de leucaena- correspondiente a una proporción gramínea: leucaena de 81:19 y un consumo total de 13 Kg MS/animal incluyendo pastoreo más concentrado; Bacab-Pérez y Solorio-Sánchez (2011), reportan un consumo de forraje entre 8.25 y 11.8 Kg de MS/animal y consumo total entre 9.75 – 13.3 Kg de MS/animal en sistemas silvopastoriles de L. leucocephala cv. Cunningham asociada con P. máximum cv Tanzania y para el sistema tradicional con C. plectostachyus un consumo diario de forraje de 3.63 Kg de MS/animal y consumo total de 11.63 Kg de MS/animal. Igualmente, Restrepo et al. (2013), reportan para sistema silvopastoril de L. leucocephala asociada con Megathyrsus máximus y C. plectostachyus un consumo de forraje de 8.47 Kg de MS/animal y consumo total de 12.7 Kg de MS /animal. 94 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche y de sus precursores en la dieta Para las diferentes fincas analizadas, la concentración de CLA-c9t11 en la grasa de la leche, presentó valores entre 1.28% y 2.22% y la proporción de ATV, estuvo entre 4.40 y 6.50%. Algunos de los valores de CLA-c9t11 fueron superiores al valor promedio reportado por Rico et al. (2007) de 1.35% o Vargas et al (2013) de 1.0 a 1.2%, en animales bajo pastoreo en Sabana de Bogotá y mucho más altos, a los valores reportados con animales estabulados, alimentados con forrajes conservados en TMR y con suplementación lipídica, los cuales están entre 0.27 y 0.92% (Vargas-Bello- Pérez et al 2015; Boerman and Lock 2014; Saliba et al. 2014; Ferlay et al. 2013). Igual situación se presentó con los valores de ATV, los cuales están entre 0.62 y 1.65 % para los grupos control (sin adición de aceite), en los trabajos de estos autores y entre 2.6 a 3.3 % en el trabajo de Vargas et al (2013). No obstante, Angulo et al., (2012a), reportan valores de 1.6 a 1.8 % para CLA-c9t11 y de 4.7 a 6.9% para ATV, alimentando con TMR e incluyendo diferentes tipos de fuentes de AG poliinsaturados más alga marina. Es conocido que la grasa de la leche producida a partir de pastos es rica en ácidos grasos insaturados, incluyendo ácidos C18 - trans y CLA-c9t11. El pasto es una fuente rica de AG poliinsaturada, principalmente linolénico (18: 3n-3), que contribuye como precursor de CLA-c9t11 y de C18:1 trans-11 (Chilliard et al., 2007). Además, se ha comprobado que la suplementación con ácido linoleico es efectiva para aumentar CLAc9t11 (Rego et al., 2009; Shingfield et al., 2006; Hervás et al., 2006; Angulo et al 2012), esto podría ser debido a que, la suplementación con ácido linoleico, favorece la formación de ATV y CLA-c9t11, que llega de rumen a glándula mamaria e incrementa los niveles de este último ácido graso en glándula mamaria a partir del ATV. 95 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias En todos los forrajes de los sistemas evaluados, el AG que estuvo en mayor proporción fue el ácido linolénico con valores entre 34.8 y 47.3 %, valor similar al reportado por Vargas et al (2013) de 41%, para pasto kikuyo a edad de rebrote de 45 días, pero menor al reportado por Elgersma et al (2006) de 50-70%. El ácido linoleico se presentó en mayor proporción en los suplementos, a excepción del suplemento utilizado en Hatico que presenta mayor proporción de ácido oleico. El valor de ácido linoleico estuvo entre 36.2 y 44.8% para los sistemas LT y DP, mientras que para las fincas del sistema LTSSPi estuvo entre 26 y 28.6 %, diferencia que puede ser debida a las materias primas utilizadas en la preparación de los suplementos. Los forrajes utilizados, fuente de linolénico y linoleico, constituyen la base alimenticia, no obstante en los sistemas LT, LTSSPi y DP, se utiliza suplementación con alimentos concentrados, consumiendo una proporción forraje:concentrado de 70:30 en LT y LTSSPi y de 80:20 en DP. Estos concentrados, altos en MS y con mayor porcentaje de grasa que los forrajes, hacen el mayor aporte de la grasa consumida. Se estimó que del consumo total diario de grasa, el concentrado está aportando entre el 60 y 84% de la grasa, en estos sistemas (Tabla 2.5). Por lo tanto, las diferencias presentadas en la proporción de ATV, CLA-c9t11, omega 3, relación n6/n3 y Trans C18:1 en el sistema LT y en la proporción de insaturados, monoinsaturados, Trans C18:1, aterogénicos e índice de aterogenicidad en el sistema LTSSPi y de ácido linoleico en la leche del DP, fueron determinadas por las diferencias en la cantidad del AG precursor, existente en el suplemento consumido en cada finca. En el sistema LT, el porcentaje estimado de ácido linoleico del concentrado, estuvo entre el 27.06 y 30.78% del total de grasa consumida, proporción mayor a la de los ácidos oleico y linolénico de forraje y concentrado. Así mismo, el ácido linoléico consumido, tuvo la mayor participación, seguido del ácido linolénico (Tabla 2.5), lo que corresponde con altos valores de CLA-c9t11 para las fincas Esperanza y San 96 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Felipe (2.09 y 2.08 respectivamente). No obstante la finca Pradera, que muestra el mayor porcentaje estimado de ácido linoleico consumido en el concentrado (30.78%) y mayor consumo de linoleico respecto a las otras 2 fincas, presenta el menor valor de CLA-c9t11 (1.28%) y de ATV (5.09%) de estas tres fincas, debido posiblemente a que en esta finca se suministra semilla de algodón entera (rica en ácido linoleico), como parte del concentrado. Igual situación ocurre, en la finca Maracaibo del sistema DP, donde también se ofrece semilla de algodón entera. En esta finca se estimó que el ácido linoleico participó en 28.15% del total de grasa consumida, mayor al 18.43% estimado para la finca Vargas (Tabla 2.5); sin embargo, el valor de CLA-c9t11 en la leche de Maracaibo fue menor que en Vargas (1.98% vs 2.22). Esta observación está de acuerdo con lo encontrado por Rico et al., (2007), quienes reportan una asociación negativa (r=-0.7, p<0.05) entre la semilla de algodón y el contenido de CLA-c9t11, indicando una tendencia a la disminución del CLA-c9t11 al suplementar con semilla de algodón. Sin embargo, Aprianita et al (2014), resaltan la bondad del aceite de semilla de algodón para aumentar CLA-c9t11 y ATV en leche. En las fincas de este estudio se utilizó semilla de algodón sin ningún tipo de procesamiento y la forma de incorporación de los AG insaturados en la dieta del ganado puede jugar un papel importante. La presentación en forma protegida como sales cálcicas o el empleo de semillas intactas sin procesar produce leves incrementos en los niveles de CLA en leche, ya que hay mínima interacción de estos ácidos grasos a nivel ruminal para la producción del principal precursor de CLA-c9t11. La adición de semillas sometidas a molienda, extrusión, micronización o calentamiento mejora los contenidos de CLA-c9t11 en leche (Chouinard et al., 2001; Dhiman et al., 2000; Secchiari et al., 2003). Las formas de suplementación más efectivas, para aumentar CLA-c9t11 en la leche, han sido la adición directa de aceite extraído de las semillas o las semillas sometidas a tratamiento térmico previo (Chilliard et al., 2007b). 97 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias De otra parte en las fincas Pradera (LT) y Maracaibo (DP), en que se suministró semilla de algodón entera, la proporción de ácido linoleico en leche fue mayor, con diferencias significativas en la finca Maracaibo del sistema DP. Lo que demuestra que el ácido linoleico presente en la semilla de algodón, puede aumentar linoleico en leche, pero presenta dificultad para aumentar CLA-c9t11. Venturelli et al. (2015) reportan que semillas enteras de oleaginosas sin procesamiento pueden producir una menor concentración de CLA-c9t11 y ATV en leche que las semillas procesadas o el aceite, debido a una menor disponibilidad de los ácidos grasos insaturados que hay en la semilla para que sean biohidrogenados en el rumen, dando como resultado un mayor contenido de ácidos grasos polinsaturados en leche. En el sistema LTSSPi, el porcentaje estimado de ácido linoleico del concentrado fue baja, entre 18.28 % y 23.25% del total de grasa consumida y el porcentaje total de oleico, linoleico y linolenico consumido, fue más bajo que en los otros sistemas (Tabla 2.5), por tanto los valores de CLA-c9t11 en leche en este sistema fueron menores. Asimismo, en la finca Hatico, el ácido oleico presentó la mayor participación de los ácidos grasos precursores consumidos y esta finca marcó la diferencia en este sistema, con una mayor proporción de ácido oleico, monoinsaturados y menor índice de aterogenicidad en la leche. Aunque en este sistema existe un consumo de leucaena entre 16 y 26 % de la MS del forraje consumido diariamente, su aporte sobre aumento de CLA-c9t11 y ATV no marca la diferencia en estos AG, dada la alta participación del concentrado. Asimismo el alto consumo de oleico en la finca Hatico, no aumentó los valores de CLA-c9t11, ni de ATV en leche de manera significativa, lo que está de acuerdo con lo reportado por Rego et al. (2009), quienes indican que ATV no es el principal producto de la isomerización de oleico en rumen y con lo encontrado por Stoffel et al. (2015), que al suplementar con aceite de girasol rico en ácido oleico, aumentó la proporción total de C18:1 en leche. 98 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias En el sistema DP, aunque la proporción de ácido linoleico consumido fue mayor en la finca Maracaibo (Tabla 2.5), no se presenta diferencias entre CLA-c9t11 y ATV en la leche, debido posiblemente a la dificultad del ácido linoleico presente en la semilla de algodón para aumentar CLA-c9t11, expuesta anteriormente. En el sistema DPSSPi que no usa suplementación y los AG presentes en la leche solo provienen del forraje, la edad del forraje y su efecto sobre la disponibilidad de la grasa a nivel de rumen, así como el consumo de leucaena, cobran importancia. La finca Salsipuedes cosechó el forraje a mayor edad que la finca Pradera (47 vs 31 días). Así mismo, la finca Salsipuedes presentó un bajo consumo de leucaena con respecto a Pradera (3% vs 16%), que representa 0.24 vs 1.6 Kg de MS/animal/día respectivamente, pero su contenido de grasa y de ácido linolénico fue mayor que el de Pradera, razón por la cual el consumo total estimado de ácido linolénico y linoleico fue similar (Tabla 2.5), no obstante la finca Salsipuedes presentó una menor proporción CLA-c9t11 en leche, disponibilidad aunque no significativa, la cual puede deberse a una pobre a nivel ruminal de los AG poliinsaturados ingeridos, ocasionada por la edad de los forrajes, lo que también se refleja en menor ATV y menor proporción de trans C18:1 producto de la biohidrogenación, no obstante, el total de AG saturados, insaturados, omega 3, omega 6, aterogénicos e índice de aterogenicidad no se vieron afectados. Ferlay et al. (2006) reportan una disminución (p<0.01) en CLA-c9t11 de 17.2 a 8 mg/g de grasa, cuando se cambió de 21 a 42 días de rebrote en una pastura nativa conformada por 50% de Festuca rubra y en la Sabana de Bogotá se encontró que el contenido de CLA-c9t11 en la leche de vacas en pastoreo de kikuyo disminuyó (p<0.01) de 22.4 a 14.4 mg/g de grasa al aumentar la edad de rebrote de 50 a 70 días (Aguilar et al., 2009). Cuando se alimenta con altas dosis de AG insaturados se ha observado una disminución en la grasa de la leche, relacionada con un cambio en los procesos 99 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias microbianos que implica una alteración en las vías y en la integridad de la biohidrogenación que resulta en un aumento en la formación de C18:1 trans10 y de intermediarios relacionados (Griinari et al. 1998), que están altamente correlacionados con aumentos en el contenido en la grasa de la leche de muchos C18:1 trans y de isómeros de CLA (Kadegowda et al. 2008, Loor et al. 2005, Shingfield et al. 2008). Asimismo, con este tipo de suplemen tación pueden haber cambios en la expresión de genes lipogénicos en glándula mamaria que provocan una disminución en la expresión de genes envuelto en la síntesis de la grasa (Angulo et al., 2012b). En este estudio, otros CLA como el C18:2 c10t12, C18:2 t10c12 y mezcla de CLA, no fueron detectados o su contenido fue más bajo que el nivel de detección y solo se registraron en pocas muestras, no ofreciendo información consistente para ser analizada. Existe evidencia de que los AG saturados de la dieta aumentan las concentraciones de colesterol asociado a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Givens, 2010). Los AG saturados laúrico, mirístico y palmítico puede provocar aterosclerosis en seres humanos; teniendo el ácido mirístico, un efecto 4 veces más fuerte que el palmítico, sobre los niveles plasmáticos del colesterol (Ulbricht y Southgate 1991), razón por la que se busca disminuir estos AG en la leche y aumentar los AG insaturados, buscando un índice de aterogenicidad bajo. La proporción de AG insaturados en la leche de las fincas en estudio fue similar a la registrada en otros estudios realizados con dietas en base a forrajes frescos (Rico et al 2007; Vargas et al 2013), pero superior a la registrada en estudios con forrajes conservados (Ferlay et al 2010; Ferlay et al 2013), debido al mayor suministro de ácido linolénico y linoleico por parte de los forrajes frescos y de los suplementos utilizados. Es de destacar la finca Hatico con 41.53% de AG insaturados y solo 58.46 % de AG saturado, esta finca presentó un mayor suministro de grasa, con una mayor proporción de oleico en el suplemento (Tabla 2.5), que se refleja en una mayor proporción de monoinsaturados en la leche, conllevando 100 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias a una mayor proporción de insaturados en la leche y menor proporción de aterogénicos e índice de aterogenicidad. Los AG n-3 y n-6 son esenciales en la dieta, ya que son necesarios para las funciones fisiológicas normales ligadas a la integridad de membrana y a señales reguladoras de las células; el equilibrio de AG n-6 y n-3 en la dieta es un factor crítico que influye en la salud humana (Wijendran y Hayes, 2004). Los efectos beneficiosos de los AG poliinsaturadas n-3 están bien documentados y el aumento en su consumo reduce el riesgo de enfermedad cardiovascular, mejora el desarrollo fetal y puede proteger contra la demencia (Givens y Gibbs, 2008). Se ha recomendado aumentar la ingesta de AG n3 y disminuir la ingesta de AG n-6, basado en la preocupación de que el alto consumo de AG n-6 pueden interferir con el metabolismo de los AG n-3, y se puede aumentar el riesgo de enfermedades inflamatorias, trastornos del sistema inmune y aumentan la susceptibilidad de los lípidos del tejido a una modificación oxidativa (Kris-Etherton y Innis, 2007; Calder, 2006), se recomienda mantener una relación n-6/n-3, menor de 5:1 (World Health Organization, 2003). En salud humana resulta más conveniente utilizar la relación omega 6/3, que la concentración individual absoluta de ellos en la ración (Gagliostro, 2011). En este estudio la leche de las fincas del sistema DPSSPi, donde su alimentación es solo a base de forraje y no reciben suplemento, presentaron una baja relación n6/n3 (2.68 y 2.88), ocasionada por el alto consumo de linolénico (n3), proveniente del forraje; en las fincas de los sistemas LT y DP que reciben suplementación rica en ácido linoleico (n6), esta relación estuvo en torno a 5 y solo en la leche del sistema LTSSPi esta relación fue superior a 5, situación suceptible de mejorar con una suplementación de ácidos grasos que busque este objetivo. Los ácidos láurico, mirístico y palmítico cuando son consumidos en exceso elevan el colesterol plasmático total y el colesterol asociado a las LDL (Schrezenmeir y Jagla 2000 ), a pesar de que el riesgo de aterosclerosis por el consumo de grasas lácteas, no 101 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias está definido (Chowdhury et al., 2014), los productos lácteos con índice aterogénicos inferiores tienen menos probabilidad que sean negativos para la salud humana (Ulbricht y Southgate 1991; Allred et al., 2006). El índice aterogénico de las leches en estudio estuvo entre 2.12 a 2.89 y en la finca Hatico en 1.69. Vargas-Bello-Pérez et al., (2015) reportan un valor de 2.50 para leche de vacas alimentadas con dietas TMR a base de forrajes conservados y de 1.55 para leche de vacas alimentadas con TMR, pero suplementadas con 500 g/animal/día de aceite de soja. Concentración de CLA, TVA y otros AGCL en la leche y número de partos El efecto del número de parto sobre los AG insaturados de la leche, se presentó con muy poca frecuencia, solo se presentó para AG oleico en el sistema LTSSPi y para AG linolénico en el sistema DP. De La Fuente et al. (2009), sugieren que la influencia del número de partos sobre el contenido de ácidos grasos en la leche es mínimo. Asimismo, Kelsey et al. (2003), concluyen que los factores fisiológicos como número de partos tienen poca influencia sobre el contenido de CLA en la leche cuando se compara frente a los factores dietarios. Concentración de CLA, TVA y otros AGCL en la leche y tercio de lactancia Algunos investigadores han sugerido que al aumentar los días de lactancia se presenta variación en la composición de la grasa láctea, evidenciándose en los primeros días una mayor concentración de ácidos grasos de cadena larga provenientes de la movilización de las reservas corporales, y posteriormente el incremento en los ácidos que se obtienen por síntesis de novo (Bargo et al 2006; Kelsey et al 2003). Sin embargo, Mapekula et al., (2011) observaron concentraciones más altas de ácidos 102 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias grasos saturados en la etapa temprana de la lactancia en comparación con mediados y finales de la lactancia. Kay et al., (2005) y Stoop et al., (2009) encontraron un aumento en la concentración de CLA en la medida que se incrementaban los días en lactancia. En el estudio de Vargas et al (2013), el perfil de AG, con excepción al CLA-c9t11, no fue modificado por el tercio de lactancia y este AG presentó mayores concentraciones en animales de segundo tercio al compararlos con los de primer tercio. Los resultados de este estudio, están de acuerdo con estos autores en el sentido que se presentó diferencia por tercio de lactancia para la proporción de CLA-c9t11, en los sistemas LT y DP, presentando un valor mayor en el segundo y tercer tercio con respecto al primero. Para los demás ácidos grasos insaturados evaluados, no se presentó una variación consistente por tercio de lactancia, que afectara el índice de aterogenicidad, contrario a lo observado por Nantapo et al. (2014), quienes reportan menor proporción de AG insaturados en lactancia tardía, lo que llevó a un alto índice de aterogenicidad. CONCLUSIONES En los sistemas LT, LTSSPi y DP, la alta participación de la materia grasa contenida en los suplementos en el total de grasa consumida y su composición en ácidos grasos produjo variaciones en el perfil de AG de la leche. En los sistemas LT y DP, los suplementos ofrecidos presentaron un buen contenido de ácido linoleico compuesto que representó la mayor participación de los AG insaturados consumidos por las vacas, que condujo a obtener leches con niveles altos de CLA-c9t11 y de ATV. En las fincas que utilizan semilla de algodón como suplemento, la proporción de ácido linoleico presente en el alimento no se vio reflejada en las proporciones de CLA-c9t11 en la leche, pero si en la proporción de ácido linoleico en la leche indicando un efecto pobre de este suplemento sobre la síntesis del CLA. 103 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias En el sistema LTSSPi, los suplementos ofrecidos presentaron una menor proporción de ácido linoleico lo que se tradujo en un menor consumo del mismo ocasionando un menor nivel de CLA-c9t11 en la leche. No obstante el mayor consumo del ácido oleico en una de las fincas de este sistema, ocasiona una leche más rica en este ácido graso, con una mayor proporción de AG insaturados y un bajo índice de aterogenicidad. Las fincas del sistema DPSSPi a base de solo forraje, en las que el ácido linolénico presenta la mayor participación, seguido del ácido linoleico, presentaron niveles de CLA-c9t11 entre 1.43 y 2.05% observándose que la edad del forraje y por lo tanto su grado de madurez puede estar disminuyendo la disponibilidad de precursores a nivel de rumen resultando aconsejable implementar períodos de descanso más cortos a fines de mejorar el valor saludable de la leche y derivados. El índice de aterogenicidad varió de 1.69 a 2.89, ofreciendo una ventaja para la salud humana, sin embargo puede ser menor con la manipulación de la alimentación de las vacas, mediante la suplementación con aceites ricos en AG poliinsaturados. El número de partos y el tercio de lactancia tienen poca influencia sobre el contenido de CLA y el perfil de ácidos grasos en la leche, cuando se compara frente a los factores dietarios. REFERENCIAS Aguilar OX, Moreno BM, Pabón ML y Carulla JE. 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WHO Technical Report Series 916, Geneva, Switzerland, backcover. 2003; 916: i-viii, 1-149. 113 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias | Capítulo 3 Ácidos grasos, fermentación ruminal y producción de metano in vitro, de forrajes de silvopasturas intensivas con leucaena Este capítulo corresponde al segundo objetivo de esta tesis Determinar mediante estudio in vitro, el efecto de los forrajes sobre CLA-c9t11, ATV, otros AGCL, fermentación ruminal y producción de metano, de ganaderías que pastorean en solo gramíneas (Cynodon plectostachyus y/o Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos con Leucaena (Leucaena leucocephala). Este capítulo ha sido sometido a la revista Agronomía Mesoamericana (2015), bajo el título “Ácidos grasos, fermentación ruminal y producción de metano, de forrajes de silvopasturas intensivas con leucaena”, por lo tanto el artículo conserva la estructura requerida por la revista. 114 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias ÁCIDOS GRASOS, FERMENTACIÓN RUMINAL Y PRODUCCIÓN DE METANO, DE FORRAJES DE SILVOPASTURAS INTENSIVAS CON LEUCAENA Evaluación in vitro de forrajes del sistema silvopastoril Esperanza Prieto-Manrique, Julio Ernesto Vargas-Sánchez, Joaquín Angulo-Arizala, Liliana Mahecha-Ledesma RESUMEN El objetivo del presente trabajo fue conocer el perfil de los ácidos grasos de cadena larga, la fermentación ruminal y producción de metano generados en un sistema in vitro cuando se utilizan diferentes forrajes caraterísticos de un sistema de producción de tipo sistema silvopastoril intensivo.La investigación se desarrolló en el laboratorio NUTRILAB–GRICA, perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrarias, de la Universidad de Antioquia, Medellín–Colombia, en Julio del 2013. Se utilizó la técnica de producción de gas in vitro, utilizando como substrato de fermentación las gramíneas (C. plectostachyus y/o M.maximus cv. Tanzania) y Leucaena (L. leucocephala), solas o en sus combinaciones, con una relación forraje:concentrado 70:30 y gramínea: leucaena 56:14, para un total de siete tratamientos. No se encontró efecto de los forrajes (p>0,05), sobre el contenido de ácido linoleico conjugado ( ALC, C18:2 c9t11) o ruménico, en la digesta. La inclusión de 14 % de leucaena aumentó el contenido de ácido linoleico (C18:2 c9, 12) y linolénico (C18:3 c9, 12, 15) en el alimento y de transvaccénico ( ATV, C18:1 t11), esteárico (C18:0), linoleico y linolénico en la digesta (p<0,05), y no afectó la cinética de fermentación, digestibilidad de la materia seca (MS), pH, total y proporción de ácidos grasos volátiles, ni redujo la producción de metano. C. plectostachyus y M. maximus se comportaron similar en las variables evaluadas (p>0,05). Los resultados in vitro sugieren que las especies forrajeras utilizadas en los sistemas silvopastoriles generan productos finales de biohidrogenación predisponentes a aumentar los ácidos grasos benéficos en la leche. Palabras Clave: ácido linoleico conjugado, ácido transvaccénico, Cynodon plectostachyus, Megathyrsus maximus cv. Tanzania, Sistema silvopastoril 115 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias FATTY ACIDS, RUMINAL FERMENTATION AND METHANE PRODUCTION, OF FORAGE IN INTENSIVE SILVOPASTURES WITH LEUCAENA ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of forages on the long chain fatty acids, ruminal fermentation and methane production in an intensive silvopastoral system of Leucaena leucocephala. The study was carried out by the in vitro gas production technique using grasses (C. plectostachyus y/o M. maximus cv. Tanzania) and Leucaena (L. leucocephala), alone or with their combinations, with 70:30 forage:concentrate ratio and 56:14 grass:leucaena ratio, as fermentation substrate. This work was developed in the laboratory NUTRILAB-GRICA, belonging to the Faculty of Agricultural Sciences, University of Antioquia, Medellin- Colombia, in July 2013. No forage effect (p>0,05) on the conjugated linoleic fatty acid content (CLA, C18:2 c9t11 or rumenic acid),in the digesta was found. The inclusion of 14 % of the leucaena increased linoleic (C18: 2 c9, 12) and linolenic (C18: 3 c9, 12, 15) acids in food and transvaccenic (TVA, C18: 1 t11), stearic (C18: 0), linoleic and linolenic acids in the digesta (p <0.05), and did not affect the kinetics of fermentation, digestibility of dry matter, pH, total and ratio volatile fatty acids, or reduce methane production. C. plectostachyus and M. maximus had a similar behavior in the evaluated variables (p> 0.05). Silvopastoral systems could be an option to increase the beneficial fatty acids in milk. Keywords: conjugated linoleic acid, transvaccenic acid, Cynodon plectostachyus, Megathyrsus maximus cv. Tanzania, silvopastoral system 116 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias INTRODUCCIÓN El ácido linoleico conjugado C18:2 cis9-trans11 (ALC c9t11) o ácido ruménico, el ácido transvaccénico (ATV) y algunos ácidos grasos de cadena larga (AGCL) n-3 de la leche bovina se relacionan con beneficios para la salud humana (Harris, 2008). Así, ALC y ATV, resultan del consumo de ácidos grasos (AG) insaturados y de la extensión de la biohidrogenación ruminal, mientras que (AGCL) n-3 provienen de la dieta y de su capacidad para escapar a la biohidrogenación. La magnitud de las cantidades presentes en la leche está determinada principalmente por factores dietarios (Palmquist, 2007). El contenido de ALC c9t11en la leche, es más elevado en animales que reciben raciones con una mayor proporción de forraje lo que a su vez puede estar afectado por el tipo de forraje consumido, siendo más alto en animales en pastoreo (forraje fresco) que cuando reciben forrajes conservados (ensilados) (Weisset al., 2004 a y b; Mele et al., 2006; Mohammed et al., 2006). El efecto enriquecedor de las pasturas sobre los niveles de ALC c9t11 en leche, se explica por el consumo de ácido linolénico proveniente del pasto, su posterior conversión en ATV (C18:1 trans11) como resultado de la biohidrogenación a nivel de rumen y la subsiguiente conversión a ALC c9t11, por actividad de la enzima mamaria delta-9 desaturasa (Griinari y Bauman, 1999). Se estima, que más del 74 % de ALC c9t11 en la grasa de la leche es sintetizado a través de la actividad de la enzima delta-9 desaturasa (Bichi et al., 2012). Por lo tanto, resulta de interés aumentar el flujo de ATV desde el rumen para aumentar el contenido de ALC c9t11en la leche debido a sus potenciales efectos benéficos sobre la salud. Uno de los mayores contaminantes del medio ambiente es el metano, gas de efecto invernadero que tiene un potencial de calentamiento veintiún veces mayor que el dióxido de carbono (IPCC, 2007). A la producción agrícola se le atribuye 40 % de la 117 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias producción de metano originado en actividades humanas. La producción de metano entérica, principalmente de la ganadería, constituye la mayor fuente individual y alcanza de 15 % a 20 % de la producción global de gases efecto invernadero de origen antrópico (Lassey et al., 1997; Moss et al., 2000; Sheehle y Kruger, 2006). La producción ruminal de metano constituye además una pérdida de energía cuya magnitud representa del 6 % al 8 % de la energía bruta consumida pudiendo inclusive llegar hasta el 12 % de la misma (Johnson y Johnson, 1995). Por las razones expuestas, la búsqueda de alternativas naturales que permitan reducir la producción de metano en condiciones de sistemas comerciales de producción, es un relevante tema de estudio. En Colombia, el 45 % de la leche se produce en lechería especializada y el 55 % bajo el sistema doble propósito (CONPES, 2010), que en su expresión tradicional se manejan bajo pastoreo con una base forrajera de solo gramíneas. Sin embargo, otros productores utilizan pastoreo en sistemas con una base forrajera silvopastoril, que permite aumentar la oferta de forraje, en particular durante el periodo seco, mejorar la calidad de la dieta a lo largo del año y mejorar la conservación y el reciclaje de nutrientes (Murgueitio, 1999; Pagiola et al., 2005, 2007). Hay evidencia de que ciertos metabolitos secundarios presentes en plantas forrajeras no gramíneas, pueden limitar la biohidrogenación ruminal (Khiaosa-Ard et al., 2009) y la producción de metano (Jayanegara et al., 2011; Tan et al., 2011). Adicionalmente, existe variación en la composición lipídica de los forrajes frescos (Krebsky et al., 1996; Addis et al., 2005; Cabiddu et al., 2009), que puede afectar la cantidad de ATV producido en el rumen. El desarrollo de estrategias alimenticias que permitan aumentar los ácidos grasos benéficos en la leche y disminuir la emisión de metano en los sistemas de producción de Colombia, exige un conocimiento previo a escala experimental para conocer el 118 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias potencial impacto de las diferentes condiciones de alimentación sobre los procesos de fermentación ruminal Por todo lo expuesto este trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto de los diferentes forrajes utilizados en un sistema silvopastoril intensivo de Leucaena leucocephala sobre los ácidos grasos de cadena larga, fermentación ruminal y producción de metano MATERIALES Y MÉTODOS Localización Este trabajo fue desarrollado en el laboratorio NUTRILAB –GRICA, perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrarias, de la Universidad de Antioquia, Medellín –Colombia, durante el mes de Julio del 2013. El estudio se realizó mediante la técnica de producción de gas in vitro (Menke y Steingass, 1988; Theodorou et al., 1994); utilizando como substrato de fermentación forrajes y sus combinaciones más la adición de concentrado, propios de la base alimenticia, de ganaderías que pastorean en solo gramíneas de estrella (C. plectostachyus) y/o Guinea (M. maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (L. leucocephala), con una proporción de gramínealeucaena 80:20 y de forraje-concentrado 70:30. Se aplicaron los siguientes tratamientos: 1. Pasto Estrella 70 % + Concentrado 30 % (EC) 2. Pasto Guinea 70 % + Concentrado 30 % (GC) 3. Pasto Estrella 35 %+ Guinea 35 % + Concentrado 30 % (EGC) 4. Pasto Estrella 56 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 % (ELC) 119 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias 5. Pasto Guinea 56 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 % (GLC) 6. Pasto Estrella 28 %+ Guinea 28 % + Leucaena14 % + Concentrado 30 % (EGLC) 7. Leucaena70 % + Concentrado 30 % (LC) La composición nutricional y el perfil de ácidos grasos de los tratamientos utilizados, se presenta en el Cuadro 1. 120 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Cuadro 1. Composición nutricional y perfil de ácidos grasos de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, utilizados en la evaluación in vitro, antes de la incubación de las dietas por veinticuatro horas. Medellín, Colombia. Julio del 2013. Table 1. Nutritional composition and fatty acid profile of forages and their combinations plus concentrate, used in the in vitro evaluation, before incubation of diets for twenty four hours. Medellin, Colombia. July 2013. TRATAMIENTOS VARIABLE EC GC EGC ELC GLC EGLC LC n=3 n=3 n=3 n=3 n=3 n=3 n=3 Composición Química (%) % Grasa % Proteína % FDN % FDA % Cenizas 3,3 13,0 62,7 27,4 9,2 3,0 15,1 55,1 25,5 12,2 3,2 13,8 57,9 26,6 10,6 3,2 15,1 56,8 24,5 9,4 3,2 16,7 50,5 23,3 12,7 3,2 15,6 53,7 23,7 10,0 3,4 22,8 34,8 12,2 7,5 ÁCIDOS GRASOS (AG) g de AG/100 g de AG totales C12 C14 C16 C18 C18:1t11 1,13 1,21 31,33 6,71 1,02 1,25 1,31 33,06 6,82 0,98 1,10 1,17 31,15 6,81 1,07 0,88 1,02 30,50 7,05 1,09 0,98 1,12 31,99 6,87 0,93 1,06 1,15 31,54 7,04 0,96 0,86 0,96 30,05 7,71 0,88 C18:1c9 C18:2c9,12 17,64 21,89 16,76 21,93 17,41 22,03 17,64 22,78 16,95 22,93 17,38 22,55 15,20 21,00 9,47 10,76 9,79 11,17 11,67 10,99 16,91 44,68 23,24 32,52 46,33 20,11 33,69 44,30 22,99 32,84 43,66 21,34 35,00 44,33 20,37 35,53 44,72 21,16 34,59 42,93 18,28 39,03 C18:3c9,12,15 Sumatorias AG saturados AGMI AGPI EC: Estrella 70 % + Concentrado 30 %; GC: Guinea 70 % + Concentrado 30 %; EGC: Estrella 35 % + Guinea 35 % + Concentrado 30 %; ELC: Estrella 56 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; GLC: Guinea 56% + Leucaena 14% + Concentrado 30 %; EGLC: Estrella 28 % + Guinea 28 %+ Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; LC: Leucaena70 % + Concentrado 30 %; FDN: Fibra insoluble en detergente neutro, FDA: Fibra insoluble en detergente ácido, AGMI: ácidos grasos monoinsaturados, AGPI: ácidos grasos poli insaturados. EC: Estrella 70 % + Concentrate 30 %; GC: Guinea 70 % + Concentrate 30 %; EGC: Estrella 35 % + Guinea 35 % + Concentrate 30 %; ELC: Estrella 56 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30 %; GLC: Guinea 56 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30 %; EGLC: Estrella 28 % + Guinea 28 % + Leucaena14 % + Concentrate 30 %; LC: Leucaena70 % + Concentrate 30 %; FDN (NDF): neutral detergent fiber, FDA (ADF): acid detergent fiber, AGMI (MUFA): monounsaturated fatty acids, AGPI (PUFA):polyunsaturated fatty acids. 121 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Las muestras de forraje y de concentrado empleadas, provenían de una sola finca manejada bajo sistema silvopastoril intensivo, representativa de los sistemas evaluados. Los forrajes tenían una edad de rebrote de 40 días y su cosecha se realizó durante la época de lluvias. Los forrajes se colocaron en estufa a 60 °C durante 48 horas y luego fueron molidos, al igual que el concentrado, utilizando una criba de 1mm. Los ácidos grasos cis-monoenoicos con 18 carbonos o menos se funden por debajo de la temperatura ambiente (los isómeros trans tienen puntos de fusión un poco más altos) y debido a la presencia del doble enlace, son más susceptible a la oxidación que los ácidos grasos saturados. En general, los ácidos grasos poliinsaturados tienen bajos los puntos de fusión, y son susceptibles a deterioro oxidativo o auto-oxidación, por lo que si no están protegidos, se autooxidan muy rápidamente en el aire, y puede que no sea posible obtener un análisis preciso por medios cromatográficos. El mecanismo de autooxidación implica el ataque de los radicales libres y es exacerbado por la luz fuerte y por iones metálicos. Cuando es necesario concentrar extractos de lípidos, volúmenes grandes de disolventes se eliminan mejor por medio de un evaporador de película rotatorio a una temperatura, que en general no debe exceder de aproximadamente 40 °C (Christie W.W. 1990). En términos generales puede decirse que la exposición a la temperatura de 60 grados centígrados e incluso al aire y a la luz, puede generar alguna tipo de oxidación de los ácidos grasos polinsaturados, y que la liofilización sería un método de preparación preferido (como se hizo con las muestras de forraje de la fase 1), sin embargo, para los propósitos del estudios el método de secado si ofrece alguna alteración constituiría un error sistemático al que se expusieron todos y cada uno de los tratamientos por lo que la observación de los efectos evaluados (forrajes o aceites) no queda comprometida. 122 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Se tomó una muestra de alimento de cada tratamiento para determinar la composición química y el perfil de ácidos grasos. La composición química se realizó mediante las técnicas analíticas convencionales de la AOAC (1999) (materia seca método ID 934.01, cenizas método ID 942.05, proteína bruta método ID 984.13, grasa y fibra detergente ácido método ID 973.18) y los descritos por Van Soest et al. (1991) para los análisis de fibra detergente neutro y fibra detergente ácido. El perfil de ácidos grasos, se realizó mediante el método de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas, siguiendo la metodologia propuesta por TequinOcampo (2014), tanto para la extraccion-derivatización como para el análisis cromatográfico en sí mismo. Para esto, las muestra de alimento fueron liofilizadas, seguidamente se realizó la derivatización de los ácidos grasos siguiendo el protocolo de esterificación, que consiste en pesar 50 mg de alimento y depositarlos en viales de reacción ámbar de 4 ml con tapas de sílica, adicionar 300 ppm de estándar interno C19 y 1 ml de metóxido de sodio 0.5 N en metanol, mezclar en vortex durante tres minutos, calentar durante diez minutos a 50 ºC, sacar y mezclar, adicionar 1 ml de HCl 0.5N en metanol y mezclar en vortex durante tres minutos, calentar durante diez minutos a 50 ºC, sacar y mezclar, enfriar a temperatura ambiente, adicionar 1ml de hexano y tapar, mezclar en vortex por dosminutos y finalmente, transferir con pipeta Pasteur la capa superior a viales de 1.5 ml para posterior análisis cromatográfico. Se utilizó un cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de masas, con automuestreador. Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes; fase móvil: gas transportador helio, flujo de columna 1 ml/min, velocidad lineal 26 cm/seg; inyector: temperatura 220 °C, volumen 0.2 ul, modo Splitless; columna: Modelo CP – Sil – 88 , longitud 100 m, diámetro interno 0.25 mm , espesor de la película 0.2 uL; rampa de temperatura: temperatura 150 °C, tiempo de calentamiento tres minutos, rata 15 °C/min; detector: temperatura 250 °C, flujo de N2 10 ml/min. Los ácidos grasos fueron separados e 123 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias identificados por comparación de los tiempos de retención con sus respectivos estándares y por comparación de la librería del equipo; se cuantificaron utilizando la curva de calibración de los estándares de ALC y sus isómeros, de ATV y los demás ácidos grasos. Se utilizó como estándar interno ácido nonadecanoico (C19:0). El porcentaje de cada AG fue calculado a partir de su concentración (ppm), determinada por cromatografía (Tequin-Ocampo, 2014). La solución tampón se preparó un día antes del inicio del ensayo, de acuerdo con las recomendaciones de McDougall (1948): 9.8 g/l de NaHCO3, 4,65 g/l de Na2HPO4.7H2O, 0.57 g/l de KCl, 0.47 g/l NaCl, 0.12 g/l de MgSO4.7H2O, 0.05 g/l de CaCl2. Estos reactivos fueron disueltos totalmente en agua destilada y la solución fue saturada con CO2 y almacenada a 39 °C. En cada tratamiento se usaron tres inóculos, procedentes de tres novillos que consumían pastos Cynodon plectostachyus; Panicum máximum; Brachiaria mutica; Dichantium aristatum Benth. La colecta del líquido ruminal se hizo inmediatamente después del sacrificio, se filtró en paños de algodón y se almacenó en termos precalentados con agua a 40 °C. En el laboratorio, el líquido ruminal de cada animal se filtró nuevamente y fue transferido a tres erlenmeyer (uno por cada animal), los cuales fueron saturados con CO2 y mantenidos en estufa a 39 °C, durante el tiempo que demoró la inoculación. Determinación de la cinética de fermentación y degradación in vitro La cinética de fermentación se determinó mediante la técnica de producción de gas in vitro (Menke y Steingass, 1988; Theodorouet al., 1994), modificada por Posada et al. (2006). Se utilizaron botellas de 100 ml de capacidad, en las que se colocó 0.5 g de sustrato de fermentación, 5 ml de líquido ruminal y 45 ml de medio de cultivo, bajo un 124 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias flujo de C02. Las botellas se cerraron con tapones de caucho y se pre-cintarón con cápsulas de aluminio. Luego se agitaron y se colocaron dentro de una estufa de cultivo que se mantuvo a 39 ºC. Adicionalmente, se utilizaron dos frascos/inóculo, que contenían medio de cultivo e inóculo, pero no sustrato, los cuales fueron usados como blancos, para corregir la presión generada por la utilización de CO2 y la presión producida por la fermentación de los microorganismos presentes en el líquido ruminal. Al cabo de 2, 4, 6, 8,10,12,15, 24, 30, 36, 48, 72 y 96 horas de incubación, se midió la producción de gas a partir del aumento de presión en el espacio de la cabeza de los viales, utilizando un transductor digital, acoplado a una aguja que se introducía a través de la tapa de caucho de los frascos. La presión se midió en libras por pulgada cuadrada (PSI). Para transformar los datos de presión (PSI) (X) en volumen de gas (ml) (Y), se utilizó la ecuación Y= -0.1375 + (5.1385*X) + (0.0777*X2) propuesta por Posada et al. (2006). Al finalizar la incubación, el contenido de las botellas se filtró usando crisoles (poro número 1), de peso conocido, se utilizó una bomba de vacío. El residuo recuperado se secó en horno (65°C por 48 h), luego se pesó y se usó para calcular por gravimetría la digestibilidad de la MS (García-González et al., 2008). Para establecer la relación entre la cantidad de sustrato degradado (mg) y el volumen de gas producido (ml) se calculó el factor de partición (FP), que es considerado como un factor de eficiencia microbiana (Duque et al., 2009). 125 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Determinación de metano, pH, ácidos grasos volátiles y perfil de ácidos grasos (ALC, ATV y AGCL) Para estas determinaciones se utilizaron botellas de fermentación similares a las descritas, preparadas de manera simultánea y de la misma forma; pero en este caso la fermentación solo se adelantó por un periodo total de veinticuatro horas. Al cabo de este tiempo, se midió el volumen de gas acumulado en el espacio de cabeza de la botella, utilizando un transductor digital y mediante una jeringa se tomó una muestra de gas presente en la botella y se colocó dentro de un tubo de ensayo (10 ml) con vacío. Posteriormente, en esta muestra de gas, se determinó la concentración de metano mediante cromatografía de gases, para ello,se tomaron 200µl de muestra, los cuales se inyectaron manualmente, con una jeringa de 1 ml, en un cromatógrafo equipado con detector de ionización de llama (FID) y una columna empacada, modelo GS-AL/KCl , de 50m de largo, 0,53 mm de diámetro, con fase móvil de nitrógeno al 99.995 % de pureza, flujo constante de 1 mL/min y programación del horno con isoterma a 80 ºC, durante 5 min, seguido de una temperatura post corrida de 100 ºC durante un minuto. El contenido de metano se determinó mediante la generación de un curva de calibración obtenida diluyendo un estándar de metano de alta pureza (99.99 %) con CO2, procedimiento que se realizó siguiendo los lineamientos de López y Newbold (2007). La producción de metano (ml) fue calculada a partir del volumen total de gas (ml) y la concentración de metano. Esta se expresó por gramo de materia seca incubada (MSi). Del mismo modo, se hizo determinación de la concentración de metano a 48 horas, la muestra provenía de las botellas que se incubaron por 96 horas; para esto, el gas que produjo cada botella a las 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 24, 30, 36 y 48 horas de incubación, se colectó en la respectiva medición de producción de gas, con una jeringa, conectada 126 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias junto con el transductor digital a una válvula de 3 salidas. La primera salida fue conectada a una aguja que se insertaba en el interior de la botella incubada, la segunda al trasductor de presión y la tercera a la jeringa plástica que colectaba el gas. El gas colectado fue acumulado en una bolsa herméticamente cerrada, utilizando una bolsa para cada botella, posteriormente se tomó una muestra del gas presente en esta bolsa y se colocó dentro de un tubo de ensayo (10 ml) con vacío. Luego de abrir las botellas incubadas por veinticuatro horas, se midió el pH con pHmetro digital y se tomó una muestra de líquido sobrenadante de cada botella (0.8 ml), para hacer la determinación de ácidos grasos volátiles (AGV); esta muestra fue congelada inmediatamente y posteriormente, se preparó para análisis de cromatografía de gases; para esto la muestra fue descongelada y agitada, se tomaron 800 µl de muestra y se colocaron en un tubo eppendorf, se adicionaron 500 µl de una solución con 20 g/l de ácido metafosfórico y 4 g/l de ácido crotónico (usado como estándar interno) en ácido clorhídrico 0.5 N, se tapó y dejó por dos horas, al cabo de las cuales se centrifugó a 13.000 rpm durante quince minutos, seguidamente se tomó 1 ml de sobrenadante y se colocó en viales de 1.5 ml, los cuales fueron colocados en el automuestreador del cromatógrafo. Se usó un cromatógrafo equipado con detector de ionización de llama, con una columna capilar TR-FFAP de 30 m × 0.53 mm × 1 m. Las condiciones de temperatura fueron 50 ºC iniciales en la columna por cinco minutos, 225 ºC por diez minutos con un gradiente de 5 ºC por minuto. El gas portador fue nitrógeno con un flujo de 1 ml/minuto, el volumen de inyección de 0,4 µl a una temperatura de 225 ºC en modo split 1:50. La concentración de AGV (mmol/litro) fue calculada a partir de la concentración (ppm) determinada por cromatografía y asumiendo una masa molar de 60.05 g/mol para el ácido acético, 74.08 g/mol para propiónico, 88.11 g/mol para ácido butírico e isobutírico 127 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias y 102.13 g/mol para los ácidos pentanóico e isopentanóico, seguidamente se calculó la proporción molar de cada AGV. El líquido que quedó en las botellas, se usó para el análisis de AG, para esto, se almacenó a -20 ºC hasta el momento de la extracción de los lípidos y su análisis por cromatografía de gases, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para AG de los alimentos. Estimación de la biohidrogenación La biohidrogenación (BH) se estimó como la desaparición de ácido oleico (C18: 1c9), linoleico (C18: 2c9,12) y linolénico (C18: 3c9,12,15) contenidos en las dietas incubadas y después de 24 h de incubación, asumiendo que la desaparición de estos ácidos grasos se debió a la biohidrogenación. Cada ácido graso se expresó como una proporción del total de estos ácidos grasos C18 (Amaro et al., 2012). El porcentaje de cada AG después de la fermentación fue corregido por su blanco, para esto se le restó el respectivo porcentaje de AG presente en el blanco y luego sí, se estableció la relación, aplicando la siguiente fórmula descrita por Amaro et al. (2012): Biohidrogenación=1-(AG C18 individual contenido en la fermentación después de 24 h de incubación/Total de AG C18 en la fermentación después de 24 h de incubación)/(AG C18 individual contenido en la dieta/Total de AG C18 en la dieta). Análisis estadístico La cinética de producción de gas fue ajustada al modelo de France et al., (2000); correspondiente a G = A[1 −exp−c(t−L)], donde G (ml/g) es el volumen de gas 128 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias acumulado en el tiempo (t); A (ml/g) es el volumen de gas correspondiente a la digestión completa del sustrato (asíntota); C (%/hora) es la tasa constante de producción de gas y L (horas) es el tiempo de colonización. El ajuste de los datos al modelo y las estimativas de los parámetros se realizaron a través de PROC NLIN de SAS (2004). El perfil de ácidos grasos (ALC, ATV, AGCL), biohidrogenación, parámetros de producción de gas, FP, digestibilidad de la MS, producción de metano, pH y los AGV, se analizaron mediante ANOVA en un diseño completamente al azar (CAA). El efecto fijo en el modelo correspondió al tratamiento experimental y el efecto aleatorio al inóculo ruminal. La diferencia entre promedios, se analizó mediante prueba de Tukey con nivel de significancia del 5 %; utilizando PROC GLM de SAS (2004). Adicionalmente, para dilucidar el efecto de la leucaena sobre la composición de AG en la fermentación, se realizaron contrastes ortogonales utilizando PROC GLM de SAS (2004). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Ácido linoleico conjugado, trasvaccénico y otros ácidos grasos de cadena larga después de la fermentación ruminal La proporción de ácidos grasos después de la fermentación ruminal, se presenta en el Cuadro 2. No se presentó efecto significativo del tratamiento (p>0,05), sobre el contenido de ALC c9t11 (ácido ruménico). Igualmente, la comparación de los tratamientos con leucaena vs sin leucaena (ELC, GLC, EGLC vs EC,GC,EGC), no fue 129 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias significativa (p>0,05), indicando que la inclusión de leucaena no tuvo efecto sobre este AG . No obstante, si hubo un efecto significativo del tratamiento (p<0,05) sobre el contenido de ATV (C18:1 t11), linoleico (C18:2 c9,12), linolénico (C18:3 c9,12,15) y esteárico (C18:0). El tratamiento que incluía solo leucaena como forraje (LC) marcó la diferencia, ya que presentó la mayor proporción de ATV (C18:1 t11) respecto a los tratamientos GC y EGC, de linoleico (C18:2 c9,12) respecto a GC, de linolénico (C18:3 c9,12,15) respecto a EC, GC y de esteárico (C18:0) con respecto a EGC. Asimismo, las comparaciones entre los tratamientos que incluían leucaena respecto a los que no la incluían (ELC,GLC,EGLC) vs. (EC,GC,EGC), mostraron que la inclusión de leucaena aumentó el porcentaje de estos ácidos grasos y hubo una tendencia (p=0.08) a incrementar ácido linolénico. Al comparar el comportamiento de las gramíneas EC contra GC, no se presentaron diferencias significativas entre ellas (p>0,05), en el contenido de ATV, linoleico, linolénico y esteárico, cuando se encontraban solas o en mezcla con leucaena. De otra parte, la inclusión de 14 % de leucaena en la mezcla con gramínea no afectó la biohidrogenación de los ácidos oleico, linoleico y linolénico (p>0,05). La biohidrogenación del ácido oleico C18:1 c9 fue de 76 a 92 %, la del ácido linoleico C18:2 c9,12 de 47 a 55 % y la del ácido linolénico C18:3 c9,12,15 de 18 a 39 % (Cuadro 3). El tratamiento LC que incluyó 70 % de leucaena como único forraje, tampoco afectó la biohidrogenación de estos tres ácidos grasos (p>0,05). La mayor proporción de ATV, linolénico y linoleico en la digesta de tratamientos que incorporaban leucaena (Cuadro 2) y el no efecto de la leucaena, sobre la biohidrogenación del ácido oleico, linoleico y linolénico (Cuadro 3), sugieren que el aumento en ATV cuando se incluyó leucaena comparado a cuando no se incluyó, se debió a un aumento en sus precursores (linoleico y linolénico). Así, en los alimentos, el AG linoleico: aumentó 0,52% en EGLC vs EGC, 0,89% en ELC vs EC y 1,0% en GLC 130 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias vs GC; el AG linolénico: aumentó 0,91% en GLC vs GC, 1,19% en EGLC vs EGC y 1,7% en ELC vs EC. Por lo tanto, los microrganismos al presentar mayor sustrato, incrementaron la producción de ATV producto de la biohidrogenación incompleta de los AG insaturados, con gran potencial para ir a tejidos. Lo que está de acuerdo con lo encontrado por otros autores, quienes reportan que el mayor consumo de ácido linolénico y linoleico, su posterior conversión en ATV a nivel de rumen, aumenta los niveles de ALC c9t11 en leche (Griinari y Bauman, 1999; Chilliard et al., 2007). 131 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Cuadro 2. Ácidos grasos (g de AG/100 g de AG Totales) obtenidos en la fermentación ruminal in vitro de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, después de la incubación por veinticuatro horas. Medellín, Colombia. Julio del 2013. Table 2. Fatty acids (g of FA/100 g of total FA) obtained in the in vitro ruminal fermentation of forages and their combinations plus concentrate, after incubation for twenty four hours.Medellin, Colombia. July 2013. Acidos Grasos (AG) C6:0 C8:0 C10:0 C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 C15+C14:1c9 C16:0 C16:1c9 C17:0 C17:1c10 C18:0 C18:1c9 C18:1t9 C18:1t11 C18:2c9,12 C18:2c9t11 C18:2t9,12 C18:2c10t12 C18:2t10c12 C18:2MX C18:3c6,9,12 C18:3c9,12,15 EC 1,22 0,22 0,11 0,10 0,63 0,15 2,36 2,92 24,51 0,36 1,01 5,72 26,29 4,53 4,53 14,18 2,14 0,79 0,26 0,30 0,53 0,25 0,32 1,55 ab ab bc b GC 1,06 0,21 0,11 0,11 0,64 0,14 2,35 2,88 23,86 0,34 1,04 9,51 25,62 4,08 4,25 13,53 1,89 0,71 0,26 0,28 0,48 0,17 0,33 1,74 ab b c b EGC 1,07 0,21 0,11 0,11 0,64 0,15 2,35 2,85 23,58 0,52 1,00 7,34 24,36 4,60 6,23 13,71 2,18 0,77 0,28 0,30 0,52 0,24 0,29 1,90 b b bc ab TRATAMIENTOS ELC GLC 1,28 1,13 0,23 0,23 0,11 0,12 0,12 0,13 0,64 0,70 0,17 0,16 2,41 2,60 3,00 3,16 25,31 26,50 0,39 0,39 1,04 1,15 4,07 0,29 26,64 ab 27,70 4,96 5,01 2,62 2,87 15,07 ab 15,37 2,28 abc 2,43 0,95 0,96 0,33 0,29 0,35 0,33 0,53 0,61 0,23 0,26 0,35 0,38 1,78 ab 2,16 a ab ab ab EGLC 1,32 0,25 0,12 0,13 0,68 0,19 2,51 3,12 25,63 0,40 1,11 2,21 27,76 4,70 2,89 15,12 2,23 0,92 0,34 0,38 0,62 0,23 0,32 1,82 a ab bc ab LC 1,41 0,26 0,12 0,12 0,64 0,17 2,27 2,68 25,62 0,42 1,03 2,22 27,82 4,82 1,15 16,65 2,73 0,89 0,33 0,34 0,71 0,22 0,35 2,38 a a a a Valor p 0,1300 0,7114 0,3476 0,4222 0,3805 0,5678 0,4455 0,1030 0,1734 0,3447 0,1113 0,0611 0,0136 0,2285 0,7687 0,0155 0,0013 0,8193 0,4098 0,4239 0,1210 0,2706 0,8588 0,0076 EC, GC, EGC 1,11 0,21 0,10 0,10 0,63 0,14 2,35 2,88 23,98 0,40 1,01 7,52 25,42 4,40 5,00 13,80 2,07 0,75 0,26 0,29 0,50 0,22 0,30 1,72 b b b b b b a b b b b b b CONTRASTES ELC, GLC, EGLC 1,24 0,23 0,11 0,12 0,67 0,17 2,50 3,09 25,81 0,39 1,10 2,18 27,33 4,89 2,81 15,18 2,31 0,94 0,32 0,35 0,58 0,23 0,35 1,91 a a a a a a b a a a a a a Valor P 0,0504 0,2534 0,0539 0,0287 0,1063 0,1178 0,1124 0,0360 0,0130 0,7311 0,0168 0,0053 0,0024 0,0326 0,2479 0,0078 0,0088 0,1356 0,0564 0,0497 0,0994 0,3998 0,3489 0,0858 132 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias C20:0 C20:1c11 C21:0 C22:0 C23+C20:3c11,14,17 C24:0 C24:1c15 0,96 0,30 0,26 0,74 0,80 1,23 0,6 0,92 0,27 0,21 0,68 0,74 1,08 0,54 0,93 0,30 0,71 0,76 1,13 0,57 1,01 0,31 0,25 0,76 0,81 1,22 0,67 1,05 0,30 0,77 0,83 1,22 0,6 1,03 0,31 0,26 0,79 0,85 1,27 0,68 1,07 0,31 0,75 0,75 1,20 0,58 0,1989 0,9688 0,6874 0,1649 0,2181 0,0188 0,4955 0,93 0,28 0,24 0,70 0,76 1,14 0,57 b b b a 1,02 0,30 0,25 0,77 0,82 0,23 0,64 a a a b 0,0252 0,5602 0,3762 0,0110 0,0378 0,0420 0,0921 EC: Estrella 70 % + Concentrado 30 %; GC: Guinea 70 % + Concentrado 30 %; EGC: Estrella 35 %+ Guinea 35 % + Concentrado 30 %; ELC: Estrella 56 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; GLC: Guinea 56 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; EGLC: Estrella 28 % + Guinea 28 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; LC: Leucaena70 % + Concentrado 30 %. Valores con letras diferentes en lamisma fila difieren significativamente entre tratamientos (p<0,05). EC: Estrella 70 % + Concentrate 30 %; GC: Guinea 70 % + Concentrate 30 %; EGC: Estrella 35 % + Guinea 35% + Concentrate 30 %; ELC: Estrella 56 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30%; GLC: Guinea 56 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30%; EGLC: Estrella 28 % + Guinea 28 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30%; LC: Leucaena70 % + Concentrate 30 %. Values with different letters in the same row differ significantly between treatments (p <0.05). 133 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Cuadro 3. Biohidrogenación obtenida en la fermentación ruminal in vitro de los ácidos grasos insaturados C18 de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, después de la incubación por veinticuatro horas. Medellín, Colombia. Julio del 2013. Table 3. In vitro ruminal biohydrogenation of unsaturated C18 fatty acids from forages and their combinations plus concentrate, after incubation for twenty four hours. Medellin, Colombia. July 2013. Acidos Grasos (AG) C18:1c9 C18:2c9,12 C18:3c9,12,15 TRATAMIENTO Valor P EC GC EGC ELC GLC EGLC LC 0,84 0,50 0,38 0,88 0,55 0,24 0,76 0,52 0,18 0,91 0,51 0,39 0,81 0,50 0,19 0,85 0,51 0,30 0,92 0,47 0,38 0,5427 0,4435 0,1644 Biohidrogenación=1-(AG C18 individual contenido en la fermentación después de 24 h de incubación/Total de AG C18 en la fermentación después de 24 h de incubación)/ (AG C18 individual contenido en la dieta/Total de AG C18 en la dieta) EC: Estrella 70 % + Concentrado 30 %; GC: Guinea 70 % + Concentrado 30 %; EGC: Estrella 35 %+ Guinea 35 % + Concentrado 30 %; ELC: Estrella 56 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; GLC: Guinea 56 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; EGLC: Estrella 28 % + Guinea 28 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; LC: Leucaena70 % + Concentrado 30 %. Biohydrogenation= 1-(individual content of C18 FA during fermentation after 24 h of incubation/total content of C18 FA during fermentation after 24 h of incubation) / ( individual content of C18 FA in the diet/ total content of C18 FA in the diet) EC: Estrella 70 % + Concentrate 30 %; GC: Guinea 70 % + Concentrate 30 %; EGC: Estrella 35 % + Guinea 35% + Concentrate 30 %; ELC: Estrella 56 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30%; GLC: Guinea 56 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30%; EGLC: Estrella 28 % + Guinea 28 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30%; LC: Leucaena70 % + Concentrate 30 %. A pesar de que se han reportado varios efectos adversos de ácidos grasos trans en la salud humana, también se ha mencionado que el efecto de los bio-trans (trans producidos en el rumen por microorganismos, principalmente C18:1 t11) no es el mismo que el de los trans-industriales (C18:1 t9 y t10) y por el contrario algunos de ellos, como el ALC c9t11, ha sido reportado con gran potencial para la salud humana. Asimismo, su precursor el ATV (ácido graso trans importante en la grasa de rumiantes) ha tomado gran importancia, debido a que se ha encontrado que puede servir como un precursor 134 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias para la síntesis de ALC c9t11 endógeno, en los tejidos humanos (Ryhänen et al., 2005 ; Mosley et al., 2006). Igualmente, el AG esteárico, paso final de la BH completa, también se aumentó en los tratamientos con leucaena, indicando que la inclusión de leucaena también aumentó el producto de la BH completa, esto debido a la mayor cantidad de precursores para la formación de ácido esteárico. Varios estudios han relacionado una disminución en la BH con la inclusión de leucaena, que podría deberse a su contenido de taninos (3.0 a 4.9 %) (García et al., 2008), los cuales son compuestos fenólicos que interfieren con los procesos digestivos por la unión de proteínas de la dieta y por la disminución de la actividad de algunos microoganismos ruminales (Makkar, 2003). Minieri et al., (2014), encontraron que dietas ricas en taninos redujeron la biohidrogenación en estudios in vitro. No obstante, otros reportes han sugerido que suplementando con alimentos ricos en taninos se puede alterar favorablemente la biohidrogenación ruminal de ácidos grasos insaturados mejorando la acumulación de ATV y por lo tanto, el contenido de ALC c9t11 en leche o carne (Khiaosa-ard et al., 2009, Vasta et al., 2009). Carreño et al. (2014), también encontraron mayor proporción de ATV en estudios in vitro, evaluando diferentes dosis de taninos. Sin embargo, estos resultados han sido logrados utilizando dosis que han sido consideradas como excesivas en taninos e imprácticas en condiciones de campo. La leucaena utilizada en el presente estudio presentó 4,24 % de taninos totales (porcentaje de ácido tánico). De acuerdo con la determinación de taninos realizada por Sallam et al. (2010) y Soltan et al. (2013), se estimó que de los taninos totales el 66 % son TC, así que se estimó, que la leucaena utilizada en el presente estudio contuvo 2,8 % de TC, cantidad inferior a la reportada por García et al. (2008) de 3,66 % y por Sallam et al. (2010) de 3,25 %. Por lo tanto, la inclusión de 14% de leucaena en las 135 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias mezclas en estudio, contenían 5,93 g de ácido tánico/Kg de MS, que representó el 0,59% de la dieta. En estudios in vitro, Minieri et al., (2014) reporta una disminución en la BH de los ácidos linoleico y linolénico utilizando 22.3 g de ácido tánico/kg de MS de taninos de Quebracho. Así mismo, Khiaosa-Ard et al., (2009), reporta una inhibición del paso final de la BH del ácido linolénico utilizando 7,9% de la MS de taninos condensados y Carreño et al (2014), utilizando 6 y 8 % de la MS, cantidades superiores a la utilizada en el presente estudio. La BH está fuertemente influenciada por metabolitos secundarios presentes en las plantas, que incluye Polifenol Oxidasa (PPO) y taninos (Lee et al.,2007; Cabiddu et al., 2010). Aunque hay poca información disponible sobre los efectos de los compuestos polifenólicos, sobre la actividad de la linoleico isomerasa (LA-I) en el rumen (Cabiddu et al., 2009, 2010), Vasta et al. (2009) informó que los taninos no interfieren con LA-I, pero interfieren con la proliferación microbiana, así, los taninos no inhiben la actividad de las enzimas microbianas, pero si cambian la composición de la población microbiana ruminal. Situación que pudo no haberse presentado en nuestro estudio, debido al bajo nivel de taninos empleado y por tanto no se afectó la BH. La utilización de leucaena en el presente trabajo, se realizó incorporando la cantidad de forraje representativo de dietas observadas en los animales en condiciones de campo; por lo tanto, los resultados encontrados in vitro, tienen gran potencial que deberían ser profundizados con más investigaciones, que permitan evaluar su efecto directamente en el animal. Estudios previos realizados por Mahecha et al. (2008) resaltaron la bondad del sistema silvopastoril leucaena-estrella-guinea para la producción de ALC c9t11 en leche . Sin embargo, los efectos no pudieron ser atribuidos totalmente al sistema, porque el objetivo de la evaluación fue comparar diferentes dosis de grasa sobrepasante en animales pastoreando en el sistema silvopastoril y no se utilizó un testigo con solo pastura. Se han reportado porcentajes importantes de ácidos grasos 136 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias poliinsaturados en el músculo de novillos pastoreando en sistemas silvopastoriles compuestos por L. leucocephala, P. maximum y C. plectostachyus (RodríguezEchevarría et al., 2013). De igual manera, se debería tener en cuenta la disponibilidad de forraje aportado por la leucaena en el sistema, que podría ser dependiente de la época climática, así como del manejo del pastoreo en el sistema, ya que esto podría afectar su porcentaje de inclusión por los animales en la dieta y por lo tanto, cambiar el efecto. Mahecha et al. (2000) reportan una relación de hasta 71:29 (gramínea:leucaena) para algunos meses, en un sistema con aproximadamente cuatro años de establecido. Parámetros de fermentación y producción de metano La cinética de la fermentación, al igual que el FP, no se vieron afectados por el tratamiento (p>0.05). El porcentaje de digestibilidad de la materia seca presentó diferencias significativas (p<0,05), siendo el tratamiento LC el que se comportó de manera diferente, presentando la menor digestibilidad; no obstante, la inclusión de la leucaena en la mezcla, no afectó la digestibilidad de la materia seca lo cual se considera benéfico (Cuadro 4). 137 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Cuadro 4. Cinética de fermentación, producción de metano, concentración y proporción de ácidos grasos volátiles (AGV) producto de la fermentación ruminal in vitro de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado. Medellín, Colombia. Julio del 2013. Table 4. Kinetics of fermentation, methane production, concentration and ratio of volatile fatty acids (VFA) produced by in vitro fermentation of forages and their combinations plus concentrate. Medellín, Colombia. Julio del 2013. VARIABLES A (ml/g de MS inc) c (/h) L (h) Digestibilidad % FP (mg MS Deg/ml de gas) Metano 48 h ml/g Ms Inc Metano 24 h ml/g Ms Inc pH Total AGV (mmol/L) Proporción molar ( % molar) Acético Propiónico Isobutírico Butírico Isopentanóico Pentanóico acetato:propionato EC 289,08 0,046 4,07 73,84 a 1,92 100,21 24,44 6,91 38,320 65,19 23,92 1,00 7,54 1,28 1,03 2,72 b a ab b TRATAMIENTOS GC EGC ELC GLC 245,01 261,64 274,22 260,92 0,050 0,053 0,050 0,046 4,86 4,97 4,37 5,17 71,32 ab 73,66 a 72,48 ab 70,31 b 2,30 2,22 2,03 2,07 74,53 86,56 86,97 80,79 22,82 24,86 23,56 23,47 6,84 6,82 6,88 6,89 37,100 36,020 37,410 38,820 65,66 23,47 1,09 7,37 1,37 1,03 2,79 b a a b 65,65 23,4 1,06 7,49 1,34 1,03 2,8 b a a b 65,99 23,29 0,99 7,41 1,29 1,01 2,83 b ab ab b 66,35 23,01 1,04 7,25 1,35 0,99 2,88 b ab ab b EGLC LC Valor P 270,86 266,45 0,4233 0,050 0,040 0,4948 4,64 4,66 0,9266 71,12 ab 64,77 c <0,0001 1,99 2,12 0,3984 93,52 68,01 0,8334 24,09 22,02 0,9971 6,83 6,85 0,5677 38,580 32,600 0,7568 66,34 22,98 1,01 7,33 1,30 0,98 2,88 b ab ab b 67,93 21,53 0,93 7,38 1,27 0,93 3,15 a <0,0001 b 0,0145 b 0,0142 0,9928 0,4934 0,0708 a 0,0015 EC: Estrella 70 % + Concentrado 30 %; GC: Guinea 70 % + Concentrado 30 %; EGC: Estrella 35 %+ Guinea 35 % + Concentrado 30 %; ELC: Estrella 56 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; GLC: Guinea 56 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; EGLC: Estrella 28 % + Guinea 28 % + Leucaena 14 % + Concentrado 30 %; LC: Leucaena70 % + Concentrado 30 %; A (ml/g): volumen de gas correspondiente a la digestión completa del sustrato (asíntota); C (%/hora):tasa constante de producción de gas; L (horas): tiempo de colonización. Valores con letras diferentes en lamisma fila difieren significativamente entre tratamientos (p<0,05). EC: Estrella 70 % + Concentrate 30 %; GC: Guinea 70 % + Concentrate 30 %; EGC: Estrella 35 % + Guinea 35% + Concentrate 30 %; ELC: Estrella 56 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30%; GLC: Guinea 56 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30%; EGLC: Estrella 28 % + Guinea 28 % + Leucaena 14 % + Concentrate 30%; LC: Leucaena70 % + Concentrate 30 %; A (ml/g): gas volumen from a complete digestión of the substrate (asymptote); C (%/hour): constant gas production rate; L (hours): time of colonization. Values with different letters in the same row differ significantly between treatments (p <0.05). La investigación con leguminosas forrajeras, ha sugerido que los taninos condensados pueden ayudar a reducir la producción de gas ruminal (Monforte-Briceño et al., 2005). 138 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Hess et al. (2003) informaron que la inclusión de leguminosas arbóreas con altos niveles de taninos como un suplemento de gramíneas con bajos niveles de proteína, disminuyó la digestibilidad de la materia seca. Sin embargo, en el presente estudio, un nivel de inclusión de 14 % de leucaena en la dieta, no afectó la producción de gas, ni la digestibilidad de la MS. Solo se vio un efecto sobre la digestibilidad de la MS, cuando la leucaena se incluyó como único forraje en un 70 % de la dieta, y aunque la digestibilidad de este tratamiento fue menor que en los otros (64.77 % vs 70.31 a 73.84 %), su valor estuvo dentro del reportado (60-70 %) por Barros-Rodríguez et al. (2012). No obstante, en este tratamiento, no se presentaron diferencias para la producción de gas y cinética de fermentación, debido posiblemente a que se incluyó un 30% de concentrado en la dieta y a que la variedad de leucaena utilizada, L. leucocephala cv. Cunningham, se caracteriza por un bajo contenido de taninos condensados, mimosina y una elevada degradabilidad ruminal de las fracciones nutritivas (García et al., 2008), que no afectaron la fermentación microbiana. Igualmente, el FP utilizado como factor de eficiencia microbiana no se vio afectado. De otra parte, se ha demostrado que los rumiantes pueden tolerar hasta 30 % de leucaena en la dieta sin tener un impacto negativo en la producción (Yami et al., 2000; Ghosh et al., 2007). Este efecto se ha atribuido, en parte, a la capacidad de ciertas bacterias del rumen en degradar mimosina y sus metabolitos (Klieve et al., 2002). No se presentaron diferencias significativas (p>0,05) en la producción de metano entre tratamientos (Cuadro 4). En los últimos años, a la utilización como alimento para rumiantes de algunas leguminosas como la leucaena, se le atribuye un efecto en la reducción de las emisiones de gases de efecto invernadero, esto debido a su contenido de compuestos secundarios como los taninos (Jayanegara et al., 2011). En general se acepta que los taninos pueden afectar la metanogénesis debido a un efecto directo sobre las bacterias metanogénicas ruminales y arqueas, y a un efecto indirecto, sobre la digestión de la fibra para disminuir la producción de hidrógeno, que es un sustrato 139 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias para estos microorganismos (Tavendale et al., 2005). Además, se ha sugerido que un efecto inhibidor de los taninos en la metanogénesis del rumen, se debe a protozoos asociados a la producción de metano (Hesset al., 2003). Sin embargo, Tiemann et al. (2008) no encontraron cambios en el patrón de fermentación o el número de protozoos cuando el metano se redujo en animales alimentados con leguminosas ricas en taninos condensados. El efecto de los taninos sobre los protozoos, bacterias, hongos y metanógenos del rumen, es variable y en su mayoría dependen del tipo de taninos, su origen y los niveles de suplementación (Patra y Saxena, 2011). Tan et al. (2011), mostraron una reducción en la producción de metano por inclusión de 10 mg de TC/500 mg de MS. Sin embargo, la producción de metano no disminuyó cuando se incorporaron 0.2 % y 1.8 % de taninos condensados en la dieta (Sliwinski et al., 2002; Beauchemin et al., 2007). En el presente estudio la inclusión de 14% de leucaena en la dieta, representó 1,96 mg de TC/500 mg de MS, correspondiente a 0.39 % de TC de la MS de la dieta. Es posible que el bajo nivel de taninos empleado en las dietas en evaluación (ELC, GLC, EGLC), no haya afectado protozoos, bacterias, hongos y metanógenos del rumen, así como tampoco se vio afectada la degradación de la MS. Makkar (2003), informó que un nivel de taninos entre 2 y 4% de la MS (límite establecido en rumiantes), no afectó el buen funcionamiento ruminal. El efecto de los taninos en la reducción de gases de efecto invernadero, se atribuye principalmente a una reducción en la digestión de los alimentos (efecto indirecto) (Barros-Rodríguez et al., 2014), reducción que no se presentó con los niveles de inclusión de 14 % de leucaena utilizados en este estudio. Resultados similares fueron reportados por Molina et al. (2013), evaluando in vitro, forraje de Guinea y leucaena solos y sus mezclas (90:10, 80:20 y 70:30, teniendo mayor participación las gramíneas), mediante la técnica de producción de gas, donde la degradación de la materia seca y la producción de metano g/Kg de MS incubada o g/Kg de MS degradada a las 48 h de incubación, no fueron disminuidas por el tratamiento. 140 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias No se observaron diferencias significativas (p>0,05) para pH, ni para el total de AGV y aunque el tratamiento LC presentó una mayor proporción de acético y mayor relación acético:propiónico con respecto a todos los tratamientos, los tratamientos que incluían leucaena en la mezcla (ELC, GLC, EGLC), presentaron un comportamiento similar con respecto a los que no la incluían (EC, GC y EGC). Por lo tanto, la inclusión de leucaena en la mezcla no afectó la proporción de AGV. La presencia de compuestos secundarios en la leucaena, tales como taninos condensados forman un complejo proteína-tanino, que inhiben la actividad de los microorganismos del rumen y resulta en cambios en la ecología del rumen, estos efectos limitan la degradación de los nutrientes y pueden causar una reducción en la producción de ácidos grasos volátiles (AGV) (Ramana et al., 2000; Salem et al., 2006; Galindo et al., 2009). Sin embargo, en el presente estudio un nivel de inclusión de 14 % de leucaena en la dieta, no afectó pH, ni total de AGV, debido posiblemente, al bajo nivel de taninos, expuesto anteriormente. El tratamiento que incluía solo leucaena como forraje, marcó la diferencia, presentando la mayor proporción significativa de acético y mayor relación acético:propiónico. Galindo et al. (2009), evaluando un sistema silvopastoril intensivo con leucaena, también encontró un patrón de fermentación ruminal acético (72.17 % molar). La proporción molar de isobutírico, fue menor para el tratamiento LC vs EGC y GC, debido posiblemente a una menor degradación de la proteína, con respecto a estas gramíneas. La utilización de fuentes proteicas propician mayor disponibilidad de compuestos como amoniaco, aminoácidos y péptidos, así como ácidos grasos de cadena corta ramificados, los cuales se producen como resultado de la degradación de las proteínas (Bach et al., 2005). Por lo tanto, al presentarse menor degradación de la 141 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias proteína (complejo tanino-proteína), se disminuyó la proporción de ácido isobutírico en el tratamiento LC. Sin embargo este efecto no se presentó en los tratamientos que incluían 14% de leucaena en la mezcla. Al comparar el comportamiento de las gramíneas EC contra GC, no se presentaron diferencias significativas entre ellas (p>0,05), en los parámetros de fermentación y producción de metano, cuando se encontraban solas o en mezcla con leucaena. La mezcla de leucaena en un 14% con gramínea y concentrado, como ocurre en la dieta de animales que pasatorean el sistema silvopastoril intensivo evaluado, tiene un gran potencial en la ganadería porque no tiene efectos negativos sobre la fermentación ruminal sino que por el contrario aumentan los AG reportados como benéficos para la salud humana tales como ATV, linoleico y linolénico, de suma importancia, dado que el aumento de estos AG a nivel ruminal se relaciona con el aumento de ALC c9t11 y de AG insaturados, que podría ocurrir en la leche. No obstante, los resultados obtenidos en este estudio in vitro, se deben confirmar en estudios reales con ensayos de respuesta productiva. CONCLUSIONES La inclusión de 14 % de leucaena en la dieta de vacas, propia de los sistemas silvopastoriles evaluados, aumentó la proporción de ácidos linolénico y linoleico en la dieta, no afectó su BH y conllevó a una mayor producción de ATV (producto de la BH), esteárico, linoleico y linolénico después de la incubación. El aumento en ATV (C18:1 t11) como precursor del ALC (C18:2 c9t11) que se forma en glándula mamaria y la acumulación de AG insaturados, se constituye en un buen punto de partida para incorporar este tipo de sistemas silvopastoriles dentro de estrategias que permiten 142 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias aumentar los ácidos grasos benéficos en la leche en sistemas de producción de ganado doble propósito y de lechería tropical. La inclusión de 14 % de leucaena en la dieta de vacas, no afectó la cinética de fermentación, digestibilidad de la MS, FP, fermentación ruminal (pH, AGV), ni disminuyó la producción de metano. Es posible que el bajo nivel de taninos empleado en las dietas en evaluación, no haya afectado protozoos, bacterias, hongos y metanógenos del rumen, así como tampoco se afectó el buen funcionamiento ruminal. El comportamiento de las gramíneas Estrella y Guinea fue similar, en el contenido de ATV, linoleico, linolénico, esteárico, parámetros de fermentación y producción de metano, por lo tanto, se esperaría que la respuesta en sistemas de producción que involucren una u otra gramínea podría ser similar. Es de esperar que dentro del desarrollo de estrategias, que permitan aumentar los ácidos grasos benéficos en la leche de ganaderías colombianas, los sistemas silvopastoriles de leucaena con estrella y/o guinea, y en los que se incluya una suplementación con AG poliinsaturados, ofrezcan una ventaja comparativa en la producción de leche con alto ALC c9t11 y mayor proporción de AG insaturados; no obstante, se necesitan estudios in vitro que evalúen previamente la fuente y el nivel de inclusión de los AG poliinsaturados, para posteriormente probar en finca la mejor opción y así poder ofrecer al mercado un producto diferencial. AGRADECIMIENTOS Los autores de este trabajo agradecen la financiación de Colciencias (Proyecto Colciencias No. PRE00503029606), Universidad de Caldas, Universidad de Antioquia 143 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias (UdeA), y la Universidad de Sucre. Así mismo, resaltan y agradecen el apoyo logístico y técnico del profesor Ricardo Rosero y la colaboración y el acompañamiento de la Fundación CIPAV en el desarrollo del proyecto. REFERENCIAS Addis, M., A. Cabiddu, G. Pinna, M. Decandia, G. Piredda, A. Pirisi and G. Molle. 2005. Milk and cheese fatty acid composition of sheep fed different Mediterranean forages with particular reference to CLA cis-9, trans-11. J. Dairy Sci. 88:3443–3454. Amaro, P., M.R.G. Maia, R.J. Dewhurst, A.J.M. Fonseca and A.R.J.Cabrita. 2012. Effects of increasing levels of stearidonic acid on methane production in a rumen in vitro system. Anim. Feed Sci. Technol. 173:252–260. AOAC (Association of Official Analytical Chemist). 1999. Official Methods of Analysis.16th ed. AOAC International, Gaithersburg, MD, USA. Bach, A., S. Calsamiglia, and D. Stern. 2005. Nitrogen Metabolism in the Rumen. J. Dairy Sci. 88:(E. Suppl.): E9-E21. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(05)73133-7. Barros-Rodríguez, M., J. 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Conjugated linoleic acid: Implicated mechanisms related to cancer, atherosclerosis and obesity. Prof. Anim. Sci. 20:127-135. 154 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias | Capítulo 4 Efecto de la inclusión in vitro de aceites vegetales a dietas de base forrajera con/sin sistema silvopastil intensivo con leucaena, sobre ácidos grasos, fermentación ruminal y producción de metano Este capítulo corresponde al tercer objetivo de esta tésis. Evaluar mediante estudio in vitro, el efecto de la adición de aceites vegetales saturados (Palma) e insaturados (Girasol y Lino) y su nivel de inclusión, a la base forrajera propia de ganaderías que pastorean en solo gramíneas de Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos con Leucaena (Leucaena leucocephala), sobre la producción de CLA-c9t11, ATV, otros AGCL, la fermentación ruminal y la producción de metano y seleccionar el aceite y nivel de inclusión, que presente mejor CLA-c9t11, ATV, AGCL y menor producción de metano. 155 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias EFECTO DE LA INCLUSION in vitro DE ACEITES VEGETALES A DIETAS DE BASE FORRAJERA CON/SIN SISTEMA SILVOPASTIL INTENSIVO CON LEUCAENA, SOBRE ÁCIDOS GRASOS, FERMENTACIÓN RUMINAL Y PRODUCCIÓN DE METANO RESUMEN Se evaluó in vitro el efecto de la inclusión de 3 aceites vegetales (girasol, lino y palma) a dos niveles 2 y 4 % de la MS en 4 dietas representativas de vacas lecheras en alimentación pastoril (2 de monocultivo y 2 de sistema silvopastoril intensivo con L. leucocephalal), sobre la producción de ácidos grasos (AG), parámetros de fermentación ruminal y producción de metano mediante la técnica de producción de gas in vitro. Mediante incubacion de 24 horas se evaluó la producción de AG, pH, AGV, producción de metano y mediante incubacion de 96 horas se evaluó la cinética de fermentación, producción de metano a 48 h y digestibilidad de la MS. En todos los tratamientos evaluados, la suplementación con aceite de girasol aumento el contenido de linoleico (C18:2 c9,12) , CLA (C18:2 c9t11) y de ATV (C18:1 t11) en la digesta (p>0.0001) pero redujo en 2 y 1% la digestibilidad de la MS con respecto al aceite de palma y de lino y al igual que aceite de lino y palma no afectó la cinética de fermentación, pH, total de AGV, proporción de AGV, ni redujo la producción de metano. El aumento en ATV precursor del CLA-c9t11 a nivel de glándula mamaria, sugiere que la suplementación con aceite de girasol al 2 y 4% de la MS, sea la mejor opción a evaluar en ensayos in vivo bajo condiciones de campo, para aumentar los ácidos grasos benéficos en la leche de ganaderías colombianas manejas con y sin sistemas silvopastoriles. Palabras Clave: suplementación con aceites vegetales, ácido linoleico conjugado, ácido transvaccénico. 156 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias INTRODUCCIÓN La producción de leche en Colombia es de gran importancia para la economía del país. La política para el sector lácteo colombiano busca mejorar la productividad de este sector mediante el desarrollo de ventajas competitivas para la producción de leche (CONPES, 2010). Por este motivo, el sector lácteo busca incrementar la oferta de productos lácteos funcionales mediante tecnologías amigables con el medio ambiente y socialmente responsables (CNL, 2010). Los ácidos grasos (AG) insaturados como el ácido linoleico conjugado C18:2 c9t11 (CLA-c9t11) ó ruménico, el ácido transvaccénico C18:1 t11 (ATV) y algunos AG de cadena larga n-3 presentes en la leche bovina, se relacionan con beneficios para la salud humana (Harris, 2008). El interés que ha suscitado el CLA-c9t11 proviene de sus potenciales beneficios para la salud, observados en modelos experimentales con animales de laboratorio. Se ha informado que el CLA-c9t11 presenta actividad como agente anti arteriosclerótico, antiinflamatorio, antidiabético y sobre todo, anti carcinogénico (inhibe la mutagénesis), así como potenciador del sistema inmune (Belury, 2002; Pariza, 2004; Khanal, 2004; Weiss et al., 2004a, 2004b; Shingfield et al., 2008). De acuerdo con lo anterior, el CLA-c9t11 puede tener varios beneficios potenciales en los seres humanos. En la leche bovina la presencia del CLA-c9t11 y del ATV resulta del consumo de AG insaturados y de la extensión de la biohidrogenación ruminal (BHR), mientras que los AG n-3, provienen de la dieta y su presencia en la leche depende de su capacidad para escapar a la BHR (Chilliard et al., 2003; Palmquist, 2007).La magnitud de las cantidades presentes en la leche de ambos AG está determinada principalmente por factores dietarios (Palmquist, 2005). Se estima que más del 74% de CLA-c9t11 en la grasa de la leche, es sintetizado en la glándula mamaria mediante la actividad de la 157 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias enzima Delta-9 desaturasa a partir de ATV (Bichi et al., 2012). Por lo tanto, resulta de interés aumentar el flujo de ATV desde el rumen para aumentar el contenido de CLAc9t11 en la leche. De otra parte, el metano es un potente gas de efecto invernadero que tiene un potencial de calentamiento 21 veces mayor que el dióxido de carbono (IPCC 2007). A la producción agrícola se le atribuye 40% de la producción de metano originado en actividades humanas. La producción de metano entérica, principalmente de la ganadería, constituye la mayor fuente individual y alcanza de 15% a 20% de la producción global de gases efecto invernadero de origen antrópico (Sheehle and Kruger 2006, Moss 2000, Lassey et al., 1997). La producción ruminal de metano constituye además una pérdida de eficiencia nutricional que alcanza de 6% a 8% de la energía bruta consumida, pero puede incluso llegar hasta 12% de la misma (Johnson and Johnson 1995). Por las razones expuestas, la búsqueda de tecnologías que permitan reducir la producción de metano en condiciones comerciales de producción pecuaria es un tema de estudio de actual relevancia. En Colombia, el 45% de la leche se produce en lechería especializada y el 55% bajo el sistema doble propósito (CONPES, 2010) que en su expresión tradicional tienen una base forrajera de solo gramíneas.En otros sistemas de producción adaptados a las condiciones medio ambientales se utiliza una base forrajera silvopastoril (SP), que permite aumentar la oferta de forraje, en particular durante el periodo seco, mejorar la calidad de la dieta a lo largo del año y mejorar la conservación y el reciclaje de nutrientes (Murgueitio, 1999; Pagiola et al., 2005; Pagiola et al., 2007). Hay evidencias experimentales que demuestran que ciertos metabolitos secundarios presentes en plantas forrajeras no gramíneas, pueden limitar la biohidrogenación ruminal y disminuir la emisión de metano entérico (Khiaosa-Ardet al., 2009; Soliva et al., 2005; Soliva et al., 2008). 158 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias La suplementación con lípidos poliinsaturados permite aumentar CLA-c9t11 y reducir la producción de metano. La suplementación con aceites de origen vegetal sugiere que aquellos con contenidos más altos en los ácidos linoleico y linolénico (como los procedentes de semillas de soja, algodón, girasol, lino, cártamo y colza) son los más efectivos para aumentar el CLA-c9t11 en leche (Stanton et al., 2003; Khanal y Olson, 2004), y se ha sugerido que el efecto es lineal ante el agregado de cantidades crecientes de aceite a la ración hasta el 3-4% de la MS (Chilliard et al., 2007). Además se ha comprobado que aquéllos aceites más ricos en ácido linoleico (girasol, soja) son los más efectivos (Kelly et al., 1998; Dhimanet al., 2000; Lock y Garnsworthy, 2002; Collomb et al., 2004; Shingfield et al., 2006; Hervás et al., 2006), aunque la respuesta puede variar de acuerdo a la relación forraje:concentrado (Bauman y Griinari, 2001) y la presencia de taninos (Vasta et al., 2009; Mineri et al., 2014). Así mismo, la suplementación con lípidos reduce la emisión de metano, a través de diferentes mecanismos que incluyen la disminución de la cantidad de materia orgánica fermentada en el rumen, disminución de la actividad de las bacterias metanogénicas y del número de protozoos y por el mayor uso de hidrógeno durante el proceso de biohidrogenación (Johnson et al., 1995; Beauchemin et al., 2009). La respuesta inhibitoria de las grasas en la producción de metano depende de la concentración, el tipo, la composición de ácidos grasos de las grasas, y la composición nutricional de las dietas (Beauchemin et al., 2008; Machmüller, 2006). El desarrollo de estrategias de suplementación en la ganadería colombiana con ácidos grasos poliinsaturados, que permitan aumentar los AG benéficos en la leche y disminuir la emisión de metano, exige un previo conocimiento del efecto de diferentes fuentes de AG poliinsaturados bajo condiciones de alimentación específicas del país. Dichas condiciones varían de acuerdo al sistema de producción y a los procesos de fermentación ruminal que se generan en cada uno de ellos, aspectos que merecen 159 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias evaluarse experimentalmente a fines de porponer la mejor opción y posteriormente evaluarla en campo. En este contexto, el presente trabajo exploratorio conducido in vitro, busca evaluar el efecto de la adición de aceites vegetales saturados (Palma) y poliinsaturados (Girasol y Lino) y su nivel de inclusión, a la base forrajera propia de ganaderías que pastorean en solo gramíneas de Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsusmaximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos con Leucaena (Leucaena leucocephala), sobre la concentración de CLA-c9t11, ATV, otros AGCL, la fermentación ruminal y la producción de metano y seleccionar el aceite y nivel de inclusión, que presente mejor concentración de CLA-c9t11, ATV, AGCL y menor producción de metano. MATERIALES Y MÉTODOS Localización Este trabajo fue desarrollado en el laboratorio NUTRILAB –GRICA, perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrarias, de la Universidad de Antioquia, Medellín –Colombia. El estudio se realizó mediante la técnica de producción de gas (Menke and Steingass, 1988; Theodorou et al., 1994); utilizando un diseño factorial (4 dietas x 3 tipos de aceites x 2 niveles de inclusión). Las dietas fueron representativas de ganaderías de los sistemas lechería tropical (LT) y doble propósito (DP), que pastoreaban en solo gramíneas de Estrella (Cynodon plectostachyus) o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (Leucaena leucocephala), las cuales fueron identificadas en una etapa previa, de caracterización de 10 fincas productoras de leche en Colombia, como se muestra a continuación: 160 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias 1. Lechería tropical sin SSPi (Pasto Estrella 65% + concentrado 35%) 2. Lechería tropical con SSPi (Pasto Estrella59% + Leucaena15% + concen. 26%) 3. Doble propósito sin SSPi (Pasto Estrella 80% + concentrado 20% ) 4. Doble propósito con SSPi (Pasto Guinea 84% + Leucaena 16%) Estas dietas se suplementaron con tres aceites comerciales: palma, girasol y lino, adicionados a niveles del 2 (10 mg de aceite/500 mg de sustrato) y 4% (20 mg de aceite/500 mg de sustrato) de la dieta en base seca. El perfil de AG de los aceites utilizados, se presenta en la Tabla 4.1. Tabla 4.1. Ácidos grasos de los aceites Ácido Graso Aceite de Girasol Aceite de Lino Aceite de Palma g AG/100g AG Totales C16:0 7.66 6.50 46.57 C17:1 c10 1.80 0.04 2.78 C18:0 4.22 3.56 4.33 C18:1 c9 28.23 21.48 34.69 C18:2 c9,12 55.95 18.66 9.58 C18:3 c9,12,15 0.22 48.78 0.24 La composición nutricional y el perfil de AG de los tratamientos (mezcla de alimento con aceite) utilizados, se presenta en la Tabla 4.2. 161 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 4.2. Composición nutricional y perfil de ácidos grasos de los tratamientos utilizados, en la evaluación in vitro, antes de la incubación de las dietas. Lechería Tropical SSPi Estrella59% -Leucaena 15% + Concent 26% Girasol Lino Palma 2% 4% 2% 4% 2% 4% 4.7 6.6 4.8 6.9 4.9 6.4 13.8 12.8 14.8 14.1 14.7 13.8 57.1 56.0 55.9 55.5 56.6 55.5 24.9 24.3 24.8 24.2 25.1 24.2 9.6 9.7 9.4 9.5 9.4 9.4 Doble Propósito Estrella 80% + Concent 20% Girasol Lino Palma 2% 4% 2% 4% 2% 4% 4.0 5.8 4.1 6.3 4.2 5.9 10.8 11.2 11.9 10.9 11.6 11.3 65.5 65.0 65.5 64.1 64.5 63.5 30.1 29.0 29.8 29.4 29.6 29.2 9.6 9.6 10.0 9.7 9.7 9.8 Doble Propósito SSPi Guinea 84% - Leucaena 16% Girasol Lino Palma 2% 4% 2% 4% 2% 4% 3.1 4.9 3.0 4.8 3.0 4.9 15.0 15.2 15.4 15.3 15.2 15.1 59.2 52.3 59.5 58.5 59.1 59.0 29.3 26.1 29.7 29.5 29.1 29.4 12.6 12.8 11.7 11.9 11.8 11.9 0.7 0.9 0.8 0.7 1.1 1.0 19.5 37.1 39.4 5.9 6.8 6.0 20.4 24.2 27.1 0.6 0.8 0.4 20.7 18.3 17.8 26.8 6.0 4.0 0.9 0.7 0.8 0.6 0.8 0.7 0.8 0.6 0.7 0.6 1.0 1.0 23.1 19.4 21.3 18.1 37.2 40.2 6.3 6.0 5.5 5.3 6.1 5.9 21.1 23.0 18.2 19.4 23.6 26.7 0.6 0.5 0.6 0.5 0.6 0.4 33.5 37.7 21.8 20.6 18.2 15.8 7.9 6.5 26.0 30.4 7.5 5.6 0.7 0.4 0.7 0.6 0.7 0.6 0.7 0.5 0.7 0.5 0.9 0.9 21.5 19.2 21.4 17.1 36.8 41.3 5.4 5.7 5.3 4.9 5.2 5.4 21.2 23.7 18.1 19.4 23.9 27.2 0.7 0.5 0.6 0.4 0.5 0.4 35.8 35.5 20.5 20.6 17.5 15.0 8.2 5.6 25.4 32.3 6.8 5.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 19.4 17.4 18.5 4.2 5.0 3.7 16.5 21.7 13.4 0.4 34.9 36.7 16.9 15.7 10.1 39.8 31.7 34.9 29.3 48.6 49.4 25.5 22.4 22.3 26.5 28.5 42.9 42.9 48.4 25.0 22.1 34.5 29.9 31.2 27.1 48.1 50.1 23.1 24.8 20.0 21.0 25.6 28.1 42.6 45.3 48.8 51.8 26.6 21.9 31.8 29.4 31.4 25.4 46.3 50.6 23.2 28.8 21.6 21.0 28.8 28.7 45.1 42.1 47.1 53.7 25.0 20.9 28.5 26.6 26.0 21.0 48.4 50.2 19.8 25.9 16.3 19.7 25.9 29.6 51.7 47.7 57.7 59.5 26.3 20.3 Lechería Tropical Estrella 65% + Concent 35% Girasol Lino Palma 2% 4% 2% 4% 2% 4% 5.7 7.6 5.6 6.4 5.1 7.1 12.2 12.4 12.8 12.1 11.8 12.0 57.6 55.6 58.8 60.7 61.7 57.7 25.5 25.1 25.8 26.7 26.8 25.5 10.2 10.0 10.0 10.0 9.8 9.9 Sistema/Dieta Aceite Nivel % Grasa % Proteína % FDN % FDA % Cenizas Ácidos Grasos (AG) g de AG/100 g de AG totales C12:0 0.9 C14:0 0.9 C16:0 23.9 C18:0 6.5 C18:1 c9 22.2 C18:1 t11 0.8 C18:2 c9,12 33.6 C18:3 c9,12,15 5.4 Sumatorias AG Saturados 35.7 AG Monoinsaturados 24.5 AG Poliinsaturados 39.9 0.9 0.8 20.6 6.2 23.5 0.6 37.4 4.5 1.0 0.9 23.5 6.2 20.0 0.8 22.7 19.2 0.2 0.4 0.3 0.3 0.7 0.7 14.5 40.4 42.7 3.9 4.2 4.4 16.6 21.8 26.5 0.5 17.2 11.4 10.6 41.2 14.0 9.1 162 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Las muestras de forraje y de concentrado empleadas, provenían de una sola finca manejada bajo SSPi. Los forrajes tenían una edad de rebrote de 40 días y su cosecha se realizó durante la época de lluvias. Luego de cosechados, los forrajes se colocaron en estufa a 60 °C durante 48 horas y luego fueron molidos, al igual que el concentrado, en un molino Thomas – Willey® , utilizando una criba de 1mm. Se tomó muestra de alimento de cada tratamiento para determinar la composición química y el perfil de AG. La composición química se realizó mediante las técnicas analíticas convencionales de la AOAC (1999) (materia seca método ID 934.01, cenizas método ID 942.05, proteína bruta método ID 984.13, grasa y fibra detergente ácido método ID 973.18) y los descritos por Van Soest et al. (1991) para los análisis de fibra detergente neutro y fibra detergente ácido. El perfil de AG, se realizó mediante el método de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas. Para esto, las muestras de alimento fueron liofilizadas, seguidamente se realizó la derivatización de los ácidos grasos siguiendo el protocolo de esterificación , que consiste en pesar 50 mg alimento y depositarlos en viales de reacción ámbar de 4 ml con tapas de silica, adicionar 300 ppm de estándar interno C19, adicionar 1 ml de metóxido de sodio 0.5 N en metanol y mezclar en vortex durante 3 minutos, calentar durante 10 minutos a 50 ºC, sacar y mezclar, adicionar 1 ml de HCl 0.5 N en metanol y mezclar en vortex durante 3 minutos, calentar durante 10 minutos a 50 ºC, sacar y mezclar, enfriar a temperatura ambiente, adicionar 1ml de hexano y tapar, mezclar en vortex por 2 minutos y finalmente,transferir con pipeta Pasteur la capa superior a viales de 1.5ml para posterior análisis cromatográfico. Se utilizó un cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de masas Shimadzu QP2010 plus, con automuestreador. Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes; fase móvil: gas transportador Helio, flujo de columna 1ml/min, velocidad lineal 26 cm/seg; inyector: temperatura 220 °C, volumen 0.2 µl , modo splitles; columna: Modelo CP – Sil 163 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias – 88 marca restek, longitud 100m, diámetro interno 0.25 mm , espesor de la película 0.2 µl ; rampa de temperatura: temperatura 150 °C, tiempo de calentamiento 3 minutos, rata 15 °C/min; detector: temperatura 250 °C, flujo de N2 10 ml/min. Los ácidos grasos fueron separados e identificados por comparación de los tiempos de retención con sus respectivos estándares (Matreya LLC, Pennsylvania, U.S.A.) y por comparación de la librería del equipo; se cuantificaron utilizando la curva de calibración de los estándares de CLA y sus isómeros (CLA c9t11; CLA c10t12; CLA t10c12 y CLA Mezcla para los isómeros restantes), de ATV y los demás ácidos grasos, con el estándar FAME mix de supelco 37, además se utilizó el ISTD (ácido nonadecanoico, C19:0). El porcentaje de cada AG fue calculado a partir de su concentración (ppm) determinada por cromatografía (Tequin-Ocampo, 2014).Los valores encontrados de AG de los alimentos se muestran en la tabla 4.2. La solución tampón se preparó un día antes del inicio del ensayo, de acuerdo con las recomendaciones de McDougall (1948): 9.8 g/l de NaHCO3, 4.65 g/l de Na2HPO4.7H2O, 0.57 g/l de KCl, 0.47 g/l NaCl, 0.12 g/l de MgSO4.7H2O, 0.05 g/l de CaCl2. Estos reactivos fueron disueltos totalmente en agua destilada y la solución fue saturada con CO2y almacenada a 39 °C. En cada tratamiento se usaron 3 inóculos, procedentes de 3 novillos que consumían pastos del trópico bajo colombiano. La colecta del líquido ruminal se hizo inmediatamente después del sacrificio, se filtró en paños de algodón y se almacenó en termos pre-calentados con agua a 40 °C. En el laboratorio, el líquido ruminal de cada animal se filtró nuevamente y fue transferido a tres erlenmeyer (uno por cada animal), los cuales fueron saturados con CO2 y mantenidos en estufa a 39 °C, durante el tiempo que demoró la inoculación. 164 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Determinación de la cinética de fermentación y degradación in vitro La cinética de fermentación se determinó mediante la técnica de producción de gas (Menke and Steingass, 1988; Theodorou et al., 1994), modificada por Posada et al. (2006). Se usaron botellas de 100-ml de capacidad en las que se colocó, 0.5 g de sustrato de fermentación, 5 ml de líquido ruminal y 45 ml de medio de cultivo, bajo un flujo de C02. Las botellas se cerraron con tapones de caucho y se pre-cintarón con cápsulas de aluminio. Luego, las botellas se agitaron y se colocaron dentro de una estufa de cultivo que se mantuvo a 39ºC. Adicionalmente, se utilizaron 2 frascos/inóculo, que contenían medio de cultivo e inóculo, pero no sustrato, los cuales fueron usados como blancos, para corregir la presión generada por la utilización de CO2 y la presión producida por la fermentación de los microorganismos presentes en el líquido ruminal. Al cabo de 2, 4, 6, 8,10,12,15, 24, 30, 36, 48, 72 y 96 horas de incubación, se midió la producción de gas a partir del aumento de presión en el espacio de la cabeza de los viales, utilizando un transductor digital (Ashcroft 2089QG - Precision Digital Test Gauges, USA), acoplado a una aguja que se introducía a través de la tapa de caucho de los frascos. La presión se midió en libras por pulgada cuadrada (PSI).Para transformar los datos de presión (PSI) (X), en volumen de gas (ml) (Y) se utilizó la ecuación Y= -0.1375+(5.1385*X)+(0.0777*X2) propuesta por Posada et al. (2006). Al finalizar la incubación, el contenido de las botellas se filtró usando crisoles Pyrex® (poro número 1), de peso conocido y utilizando una bomba de vacío. El residuo recuperado se secó en horno (65°C por 48 h), luego se pesó y se usó para calcular por gravimetría la digestibilidad de la MS (García-González et al., 2008b). 165 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Para establecer la relación entre la cantidad de sustrato degradado (mg) y el volumen de gas producido (ml) se calculó el factor de partición (FP), que es considerado como un factor de eficiencia microbiana (Duque y Noguera, 2009). Determinación de metano, pH, ácidos grasos volátiles (AGV) y perfil de ácidos grasos (CLA-c9t11, ATV y AGCL) Para estas determinaciones se utilizaron botellas de fermentación similares a las arriba descritas, preparadas de manera simultánea y de la misma forma; pero en este caso la fermentación solo se adelantó por un periodo total de 24 horas. Al cabo de este tiempo, se midió el volumen de gas acumulado en el espacio de cabeza de la botella, utilizando un transductor digital (Ashcroft 2089QG - Precision Digital Test Gauges, USA) y mediante una jeringa se tomó una muestra de gas presente en la botella y se colocó dentro de un tubo de ensayo (10 ml) con vacio. Posteriormente en esta muestra de gas, se determinó la concentración de metano mediante cromatografía de gases, para ello,se tomaron 200µl de muestra, los cuales se inyectaron manualmente, con una jeringa Pressure-Lok® serie A2 de 1 ml, en un cromatógrafo Hewlett Packard 6890 Serie II equipado con detector de ionización de llama (FID) y una columna empacada, modelo GS-AL/KCl marca Agilet, de 50m de largo 0.53 mm de diámetro, con fase móvil de nitrógeno al 99.995% de pureza, flujo constante de 1mL/min y programación del horno con isoterma a 80 ºC, durante 5 min, seguido de una temperatura post corrida de 100ºC durante un minuto. El contenido de metano se determinó mediante la generación de un curva calibración obtenida diluyendo un estándar de metano de alta pureza (99.99%) con CO2, procedimiento que se realizó siguiendo los lineamientos de López y Newbold (2007). La producción de CH4 (ml) fue calculada a partir del volumen total de gas (ml) y la concentración de CH4. La producción de CH4 (ml) se expresó por gramo de materia seca incubada (MSi). 166 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Del mismo modo, se hizo determinación de la concentración de metano a 48 horas, la muestra provenía de las botellas que se incubaron por 96 horas; para esto, el gas que produjo cada botella a las 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 24, 30, 36 y 48 horas de incubación, se colectó en la respectiva medición de producción de gas, con una jeringa, conectada junto con el transductor digital a una válvula de 3 salidas. La primera salida fue conectada a una aguja que se insertaba en el interior de la botella incubada, la segunda al trasductor de presión y la tercera a la jeringa plástica que colectaba el gas. El gas colectado fue acumulado en una bolsa herméticamente cerrada, utilizando una bolsa para cada botella, posteriormente se tomó una muestra del gas presente en esta bolsa y se colocó dentro de un tubo de ensayo (10 ml) con vacío. Luego de abrir las botellas incubadas por 24 horas, se midió el pH con pH-metro digital (Schott Handylab pH1) y se tomó una muestra de líquido sobrenadante de cada botella (0.8 ml) para hacer la determinación de AGV; esta muestra fue congelada inmediatamente y posteriormente, se preparó para análisis de cromatografía de gases; para esto la muestra fue descongelada y agitada , se tomaron 800 µl de muestra y se colocaron en un tubo ependorf , se adicionó 500 µl de una solución con 20 g/l de ácido metafosfórico y 4 g/l de ácido crotónico (usado como estándar interno) en ácido clorhídrico 0.5N, se tapó y dejo por 2 horas, al cabo de las cuales se centrifugó a 13.000 rpm durante 15 minutos, seguidamente se tomó 1 ml de sobrenadante y se colocó en viales de 1.5 ml, los cuales fueron colocados en el automuestreador del cromatógrafo. Se usó un cromatógrafo HP6890 serie II equipado con detector de ionización de llama, con una columna capilar TR-FFAP de 30 m × 0.53 mm × 1 m (Restik, USA).Las condiciones de temperatura fueron 50 ºC iniciales en la columna y por 5 minutos, 225 ºC por 10 minutos con un gradiente de 5º por minuto. El gas portador es nitrógeno con un flujo de 1 ml/minuto, el volumen de inyección de 0.4 µl a una tempera de 225 ºC en modo split 1:50. 167 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias La concentración de AGV (mmol/litro) fue calculada a partir de la concentración (ppm) determinada por cromatografía y asumiendo una masa molar de 60.05g/mol para el ácido acético, 74.08 g/mol para propiónico, 88.11 g/mol para butírico e isobutírico y 102.13 g/mol para pentanóico e isopentanóico, seguidamente se calculó la proporción molar de cada AGV. El líquido que quedó en las botellas, se usó para el análisis de AG, para esto se almacenó a -20ºC hasta el momento de la extracción de los lípidos y su análisis por cromatografía de gases, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para AG de los alimentos. Análisis estadístico La cinética de producción de gas fue ajustada al modelo de France et al., (2000); correspondiente a G = A[1-exp-c(t-L)] , donde G (ml/g) es el volumen de gas acumulado en el tiempo (t); A (ml/g) es el volumen de gas correspondiente a la digestión completa del sustrato (asíntota) ; C (%/hora) es la tasa constante de producción de gas y L (horas) es el tiempo de colonización. El ajuste de los datos al modelo y las estimativas de los parámetros se realizaron a través de PROC NLIN de SAS (2004). El perfil de ácidos grasos (CLA-c9t11,ATV, AGCL), los parámetros de producción de gas, FP, digestibilidad de la MS, producción de metano, pH y los AGV, se analizaron mediante ANAVA en un diseño completamente al azar (CAA) con arreglo factorial 4x3x2 (4 dietas x 3 aceites x 2 niveles). El efecto fijo en el modelo correspondió al tratamiento experimental y el efecto aleatorio al inóculo ruminal. La diferencia entre promedios se analizó mediante prueba de Tuckey con nivel de significancia del 5%; utilizando PROC GLM de SAS (2004). 168 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias RESULTADOS La tabla 4.2, muestra la composición química y ácidos grasos de la mezcla de los alimentos más el aceite antes de la incubación. Como se esperaba, en los tratamientos con adición de aceite de girasol, lino o palma, los AG más representativos fueron el linoleico, linolénico y palmítico, respectivamente, en todas las dietas en evaluación. No obstante, en los tratamientos con adición de aceite de lino, la participación del ácido linoleico y palmítico fue alta en dietas que incluían suplementación con concentrado, especialmente a nivel bajo (2%) de adición de aceite. Concentraciones de CLA-c9t11 , ATV y otros AGCL producto de la fermentación ruminal La proporción de AG en cada tratamiento producto de la fermentación ruminal después de 24 horas de incubación se presenta en la tabla 4.3. No se detectó efecto de interacción entre las fuentes de variación estudiadas. Hubo efecto significativo del tipo de aceite (p<0.0001), sobre el contenido de CLA-c9t11 (C18:2 c9t11) y ATV (C18:1 t11) siendo el aceite de girasol el que presentó los mayores porcentajes. No se detectó efecto significativo de la dieta, ni del nivel de inclusión de aceite (p>0.05), sobre el contenido de CLA-c9t11 y ATV. 169 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 4.3. Ácidos grasos (g de AG/100 g de AG Totales) obtenidos en la fermentación ruminal in vitro de las dietas con adición de diferentes aceites a nivel del 2% y 4% de la MS, después de la incubación por 24 horas Dieta Ácidos Grasos (AG) C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C13:0 C14:0 C15:0 + C14:1 c9 C16:0 C16:1c9 C17:0 C17:1c10 C18:0 C18:1 t9 C18:1 t11 TVA C18:1 c9 C18:2 t9,12 C18:2 c9,12 CLA C18:2 c9t11 CLA C18:2 c10t12 CLA C18:2 t10c12 CLA C18:2 Mezcla C18:3 c9,12,15 C20:0 C20:1 c11 C22:0 C23:0+c20:3 c11,14,17 C24:0 C24:1 c15 LT 0.17 0.15 0.11 0.42a 0.13b 1.16 1.60b 20.39 0.35b 0.60 13.35 26.80 2.88 12.16 8.55 0.26c 3.65 1.66 0.25 0.46 0.34 1.86 0.74 0.32 0.64 0.53 0.70 0.62 LTSSPi 0.18 0.15 0.11 0.39a 0.14b 1.08 1.67b 20.02 0.37b 0.59 13.79 26.23 2.73 12.09 8.43 0.31b 3.84 1.73 0.29 0.46 0.33 1.82 0.73 0.32 0.68 0.55 0.74 0.35 DP 0.20 0.15 0.11 0.36b 0.14b 1.04 1.80b 18.90 0.38b 0.60 14.14 26.55 2.88 11.91 8.35 0.33ab 3.99 1.63 0.28 0.48 0.32 1.91 0.75 0.33 0.72 0.60 0.79 0.38 Aceite DPSSPi 0.19 0.15 0.12 0.30c 0.18a 0.96 2.47a 18.32 0.47a 0.97 14.30 25.51 1.57 12.78 9.44 0.46a 2.95 2.21 0.32 0.54 0.40 2.14 0.76 0.33 0.79 0.63 0.83 0.42 Girasol 0.18 0.15 0.10 032c 0,14b 0,89b 0.71 15.31b 0.36 0.57 12.93 25.03 3.42 15.19a 9.06a 0.24b 6.12a 2.77a 0.28ab 0.43b 0.53a 1.19b 0.73 0.30 0,86a 0.55 0.77 0.35 Lino Palma 0.18 0.19 0.15 0.15 0.11 0.12 0.36b 0.42a 0,16a 0,14b 1,04b 1,25a 2.12 1.83 16.39b 26.53a 0.42 0.41 0.87 0.62 14.70 14.05 27.95 25.83 2.17 1.96 12.22b 9.29c 7.59b 9.42a 0.52a 0.27b 2.89b 1.81b 1.69b 0.96c 0.33a 0.25bc 0.65a 0.37c 0.32b 0.20c 3.38a 1.21b 0.73 0.77 0.37 0.30 0,64b 0,61b 0.61 0.57 0.78 0.75 0.58 0.41 Nivel 2% 0.18 0.15 0.12 0.38 0.15 1.10 1.95 19.60 0.41 0.64 12.27 27.10 2.65 12.31 7.94b 0.32 3.18b 1.72 0.29 50.00 0.34 1.73 0.76 0.33 0.72 0.60 0.80 0.54 4% Dieta Aceite Nivel 0.19 ns ns ns 0.14 ns ns ns 0.11 ns ns ns 0.36 <0.0001 <0.0001 ns 0.14 0.0002 0.0353 ns 1.01 ns 0.0018 ns 1.82 0.0001 ns ns 19.21 ns <0.0001 ns 0.38 0.0177 ns ns 0.73 ns ns ns 13.52 ns ns ns 25.45 ns ns ns 2.38 ns ns ns 12.17 ns <0.0001 ns 9.44a ns 0.0488 0.0218 0.36 0.0093 <0.0001 ns 4.04a ns <0.0001 0.0271 1.89 ns <0.0001 ns 0.28 ns 0.0431 ns 0.47 ns <0.0001 ns 0.35 ns <0.0001 ns 2.13 ns <0.0001 ns 0.72 ns ns ns 0.32 ns ns ns 0.69 ns <0.0001 ns 0.55 ns ns ns 0.74 ns ns ns 0.35 ns ns ns p<0.05 Dieta x Aceite ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns Dieta x Nivel ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns Aceite x Nivel ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns Dieta x Aceite x Nivel ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 170 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias LTSSPi: Estrella 59%-Leucaena 15% + Concentrado 26%; LT: Estrella 65% + Concent rado 35%; DP: Estrella 80% + Concentrado20%; DPSSPi: Guinea 84% Leucaena 16% ; CLA C18:2 Mezcla : demás isómeros presentes. Valores con letras diferentes en la misma fila difieren significativamente entre tratamientos (p<0.05). 171 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias La inclusión de aceite de girasol aumentó el contenido de ácido linoleico C18:2 c9,12 (p<0.0001), con un mayor valor cuando el nivel de inclusión de aceite fue del 4% (p<0.02). También aumentaron los valores del CLA en mezcla (p<0.0001) y el AG C22:0 (p<0.0001), sin efecto de la dieta, ni del nivel de inclusión de aceite sobre estos AG. Por su parte, la inclusión de aceite de lino aumentó el contenido de ácido linolénico C18:3 c9,12,15 (p<0.0001), AG C18:2 t9,12 (p<0.0001), CLA c10t12 (p<0.04) y CLA t10c12 (p<0.0001). No se presentó efecto de la dieta, ni del nivel de inclusión de aceite sobre los AG linolénico, CLA c10t12 y CLA t10c12. La inclusión de aceite de palma aumentó el contenido de ácido palmítico C16:0 (p<0.0001), de mirístico C14:0 (p<0,0018), Láurico C12:0 (p<0.0001) y presentó el menor valor en los CLA evaluados. El ácido oleico (C18:1 c9) fue afectado por el tipo de aceite (p<0.0488) y el nivel de inclusión (p<0.0218), siendo menor cuando se suplementó con aceite de lino y mayor con un nivel del 4%. El ácido esteárico (C18:0), fue similar entre dietas, fuente de aceite y nivel de inclusión (p>0.05). Este resultado sugiere que la suplementación con aceites vegetales, la dieta y el nivel de inclusión de aceite, no afectaron la biohidrogenación completa lo que se ve reflejado en similares valores de C18:0 en todos los tratamientos Se detectó un efecto significativo de dieta (p<0.0001) sobre el contenido de ácido láurico (C12:0) siendo la dieta que incluía la mayor cantidad de concentrado (65% de Estrella y 35% de Concentrado) la que presentó la mayor proporción de este AG y la que no incluía concentrado (84% Guinea y 16% de leucaena), la menor proporción del mismo. Así mismo esta última dieta, presentó una mayor proporción de AG C13:0, 172 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias C15:0, C16:1 c9 y C18:2 t9,12 con diferencias significativas respecto a las otras dietas (p <0,05). Parámetros de fermentación y producción de metano Los parámetros de fermentación se presentan en la tabla 4.4. La cinética de la fermentación, al igual que el pH, total de AGV y proporción molar de AGV no se vieron afectados por la fuente de aceite, ni el nivel de aceite (p>0.05), pero si por la dieta (p<0.0001). La dieta que incluía Estrella 80% + Concentrado 20%, presentó la mayor producción de gas (A) (p<0.0017). La dieta que incluía la mayor proporción de concentrado (Estrella 65% + concentrado 35%) presentó una tasa mayor de producción de gas (c) (p<0.0001) y la dieta de solo forraje que no incluía concentrado (Guinea 84% + Leucaena 16%), presentó el mayor tiempo de colonización (L) (p<0.0001). El total de AGV, fue mayor para la dieta con mayor concentrado (Estrella 65% + concentrado 35%) y menor para la dieta de solo forraje que no incluía concentrado (Guinea 84% + Leucaena 16%) (p<0.0001). Igualmente, esta última presentó menor proporción de propiónico, butírico y mayor proporción de acético, mayor relación acético:propiónico que la primera (p<0.0001). 173 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 4.4. Cinética de fermentación, producción de metano, concentración y proporción de ácidos grasos volátiles (AGV) producto de la fermentación in vitro de las dietas con adición de diferentes aceites a nivel del 2% y 4% de la MS Dieta Parámetro Aceite Nivel p<0.05 LT LTSSPi DP DPSSPi Girasol Lino Palma 2% 4% Dieta Aceite Nivel DxA DxN AxN DxAxN A (ml/g de MS incubada) 174,51b 180,54b 203,25a 175,72b 178.20 180.43 191.88 181.94 185.06 0.0017 ns ns ns ns ns ns c (%/h) 0,061a 0,054b 0,05b 0,051b 0.056 0.054 0.051 0.054 0.053 ˂0.0001 ns ns ns ns ns ns L (h) 5,49bc 5,13c 6,31b 7,63a 6.10 6.14 6.18 6.26 6.02 ˂0.0001 ns ns ns ns ns ns Digestibilidad % 69,05a 69,34a 69,66a 64,76b 67,13b 67,98b 69,49a 69,91a 66,49b ˂0.0001 0.0036 ˂0.0001 ns ns ns ns FP Metano 48 Horas (ml /g MS Incubada) Metano 24 Horas (ml /g MS Incubada) 3,23a 3,08a 2,80b 3,10a 3.09 3.10 2.97 3,16a 2,94b 0.0467 ns 0.0415 ns ns ns ns 41.80 45.51 46.33 41.12 41.91 43.74 45.42 43.81 43.57 ns ns ns ns ns ns ns 17.09 15.58 16.09 14.48 15.91 15.94 15.57 16.13 15.49 ns ns ns ns ns ns ns pH 6,78b 6,78b 6,80b 6,85a 6.81 6.79 6.81 6.80 6.81 ˂0.0001 ns ns ns ns ns ns Total AGV (mmol/L) 29,66a 28,75ab 28,55b 26,77c 28.14 28.36 28.71 28.77 28.14 <0,0001 ns ns ns ns ns ns Acético % 61,84c 62,89b 62,7b 66,04a 63.26 63.35 63.49 63.45 63.28 <0,0001 ns ns ns ns ns ns Propiónico % 29,18a 28,79ab 28,58b 26,58c 28.35 28.43 28.07 28.22 28.34 <0,0001 ns ns ns ns ns ns Butírico % 8,97a 8,30b 8,70ab 7,36c 8.38 8.20 8.42 8.31 8.36 <0,0001 ns ns ns ns ns ns Acético: Propiónico 2,12c 2,18b 2,19b 2,48a 2.23 2.23 2.26 2.25 2.24 <0,0001 ns ns ns ns ns ns Proporción molar (% molar) LT: Estrella 65% + Concent rado 35%; LTSSPi: Estrella 59%-Leucaena 15% + Concentrado 26%; DP: Estrella 80% + Concentrado20%; DPSSPi: Guinea 84% Leucaena 16%. D= Dieta, A= Aceite, N= Nivel Valores con letras diferentes en la misma fila difieren significativamente entre tratamientos (p<0,05). 174 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias El porcentaje de digestibilidad de la MS, fue afectado por la dieta, la fuente de aceite y su nivel de inclusión. La dieta de solo forraje de Guinea 84% y Leucaena 16%, que no incluía concentrado, presentó la menor digestibilidad (64.8% vs 69.3; 69.7; 69.1) (p<0.0001). La suplementación con aceite de palma presentó la mayor digestibilidad (69%) (p<0.0036) mientras que la presencia de aceites de girasol y de lino disminuyeron la digestibilidad en 2% y 1% respectivamente, con respecto al aceite de palma resultando similares entre sí. La inclusión de aceite al 4% de la MS presentó menor digestibilidad que al 2% (66.5% vs 69.9%) (p<0.0001). El FP fue afectado por la dieta y el nivel de inclusión de aceite resultando bajo en la dieta que incluía Estrella 80% + Concentrado 20% (p<0.0467) y con un nivel de inclusión de aceite del 4% (p<0.0415). No hubo efecto (p>0.05) de la dieta, fuente de aceite, ni nivel de inclusión de aceite, sobre la producción de metano. No hubo efecto de las interacciones entre dieta, fuente de aceite y nivel de aceite (p>0.05), sobre las variables evaluadas. DISCUSIÓN Perfil de ácidos grasos producto de la fermentación ruminal La inclusión de aceite de girasol aumentó la proporción de CLA-c9t11 y ATV a 24 horas de fermentación en todas las dietas evaluadas. Este resultado está de acuerdo con lo reportado en estudios in vitro por Jacob et al., (2012), quienes compararon la suplementación con aceite de girasol (65.23% de ácido linoleico) vs aceite de soya 175 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias (51.65% de ácido linoleico) en dietas para ganado altas en fibra (relación forraje:concentrado de 65:35), con lo reportado por Wu et al., (2013), quienes compararon ácido oleico vs linoleico y con lo reportado por Castilla Vargas, (2012) quien comparó la mezcla de ácido linoleico y linolénico en diferentes proporciones en dieta a base de pasto. La magnitud y los patrones de biohidrogenación (BHR) difieren con los diferentes aceites vegetales suplementados. El primer paso de la BHR a nivel ruminal del ácido linoleico es la isomerización a CLA-c9t11 y la posterior reducción a ATV, pero los primeros pasos de la BHR del linolénico no presentan este comportamiento (Jenkins et al., 2008; Lee et al., 2011). Por lo tanto, el mayor consumo de precursor y las diferencias en el proceso de BHR, permiten explicar la mayor producción de CLA-c9t11 y ATV en los tratamientos con adición de aceite de girasol. No se encontró efecto del nivel de inclusión de aceite en la dieta sobre la proporción de CLA-c9t11 y ATV. No obstante, el nivel del 4% de inclusión, redujo significativamente la digestibilidad al compararlo con el 2% (66.5% vs 69.9%) y el FP (2.94 vs 3.16), indicando una pérdida en la eficiencia microbiana. Jacob et al., (2012) encontró mayor producción de CLA-c9t11 en dietas suplementadas con 6% de aceite de girasol o soya vs 4.5%; sin embargo, la digestibilidad de la MS fue significativamente reducida a nivel del 6%. En nuestro estudio, la adición de aceite a nivel de 4% de la MS, llevó a que el porcentaje de grasa final de los 9 sustratos a evaluar que incluían concentrado, estuviera entre 5.8 y 7.62 %, donde siete de los nueve tratamientos presentaron valores de grasa superiores a 6.28 % (Tabla 4.2). Un aspecto importante a tener en cuenta en la alimentación de los animales rumiantes es que, debido al efecto inhibidor de los lípidos sobre el metabolismo microbiano, un aporte de alimentos con elevados contenidos en grasa puede provocar una disminución significativa de la digestibilidad y el consumo de alimento (Harfoot y Hazlewood, 1997). Generalmente, se recomienda que la grasa total no exceda del 6-7% de la MS total de la dieta, de otra forma puede ocurrir una depresión en el consumo de alimento (NRC 2001). 176 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Diferentes publicaciones (Harvatine y Bauman, 2006; Gervais et al., 2009) han demostrado que el isómero CLA t10c12 disminuye la concentración de grasa de la leche a través de una baja regulación en la transcripción de las enzimas y proteínas que participan en la síntesis de lípidos en la glándula mamaria (Shingfield et al., 2010, Maxin et al., 2011). La presencia de los isómeros trans-10 y trans-11 son afectados por el tipo de AG adicionado siendo la producción de trans-10 mayor con adición de ácido linoleico mientras que el ácido linolénico fue principalmente hidrogenado vía trans-11 (Zened et al., 2011). Stoffel et al. (2015), reportan una correlación positiva entre el contenido de ácido linoleico en la dieta y los AG C18:1 t10 y CLA t10c12 en la leche. No obstante, en el presente estudio la proporción de CLA t10c12 fue mayor para las dietas con adición de aceite de lino. Debido posiblemente, a que en estos tratamientos, la participación del ácido linoleico fue alta, especialmente en dietas que incluían suplementación con concentrado, lo que pudo inducir cambios en los procesos de la BHR ocasionados por el aumento en la cantidad total de ácidos linoleico, presente en estas dietas y por tanto una mayor proporción de CLA t10c12. Así mismo, la menor proporción de ácido oleico en los tratamientos con adición de aceite de lino después de la incubación, podría estar asociado a que estos tratamientos presentaron la menor proporción de este ácido graso con respecto a los tratamientos con adición de aceite de girasol o palma, antes de la incubación, dada la alta proporción del ácido linoleico y palmítico presente en ellos. La suplementación con aceite de palma aumentó el contenido de ácido palmítico (C16:0) (p<0.0001), mirístico (C14:0) (p<0.0018), láurico (C12:0) (p<0.0001) y presentó el menor valor en los CLA evaluados. Dietas bajas en grasa (1.2 % de la MS) con adición de aceite de palma (1.7% de la MS), aumentaron los AG menores a C16:0 en la leche y decrecieron el total de AG C18 comparado con adición de la misma cantidad 177 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias de aceite rico en ácido linoleico (Stoffel et al., 2015). La inclusión de grasas saturadas de origen animal en dietas para humanos, puede incrementar el riesgo de enfermedades cardiovasculares (Joyce et al., 2009). De otra parte, se ha demostrado, que la suplementación con aceites vegetales ricos en AG poliinsaturados no solo permite aumentar los niveles de CLA-c9t11, sino que también aumenta ATV, AG insaturados (mono y poliinsaturados) y disminuye los AG saturados (Boerman and Lock 2014, Saliba et al., 2014; Vargas-Bello-Pérez et al., 2015), con un impacto alto en la composición de la grasa y su efecto sobre la salud humana. Estas observaciones están de acuerdo con los resultados del presente trabajo donde la adición de aceite de girasol y lino disminuyó la concentración de C12:0, C14:0, C16:0 con respecto a la inclusión de aceite de palma y aumentó el total de AG C18 mono y poliinsaturados. Dietas altas en forraje suplementadas con una pequeña cantidad de aceite de semillas ricas en AG poliinsaturados produce principalmente el isómero CLA-c9t11 y ATV en la leche de vacas (Kraft et al., 2003; Cruz-Hernández et al., 2004, 2006). Las dietas evaluadas en el presente experimento presentaron una proporción de pasto que osciló entre 65 y 100% pero no se detectó un efecto significativo de la dieta (p>0.05) sobre el contenido de CLA-c9t11 y ATV después de la fermentación. Los resultados obtenidos in vitro sugieren que cuando el objetivo es aumentar el contenido de CLA-c9t11 y ATV en la leche de vacas que consumen dietas altas en forraje (como las evaluadas en el presente estudio), se puede evaluar a nivel de campo, la suplementación con el mismo aceite en todos los sistemas de producción objeto de este estudio. Parámetros de fermentación El objetivo principal del presente estudio fue seleccionar el aceite y nivel de inclusión, que presentara mejor CLA-c9 t11, ATV, AGCL y menor producción de metano, mediante niveles prácticamente factibles de suplementación con aceite y sin perjudicar 178 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias la fermentación, digestibilidad de la fibra y por lo tanto la eficiencia de utilización del alimento. Así, los parámetros de la cinética de fermentación (A,c,L), no se vieron afectados por la fuente o nivel de inclusión de aceite. Igualmente, aunque el porcentaje de digestibilidad fue menor con nivel de inclusión del 4% (66.5 % vs 69.9%) (por razones expuestas anteriormente), el pH, total de AGV, proporción de acético, propiónico, butírico y relación acético:propiónico, no se vieron afectadas por la fuente o nivel de aceite. Estos resultados están de acuerdo con los hallados por Jacob et al., (2012), quienes no encontraron efecto sobre pH, total de AGV, proporción de acético, propiónico, butírico y relación acético:propiónico, al suplementar con aceite de girasol o de soya a nivel del 4.5% de la MS en dietas para ganado altas en fibra (relación forraje:concentrado 65:35), pero si se presentó un efecto significativo sobre estos parámetros cuando el nivel de inclusón representó e 6% de la MS. La inclusión de aceite de lino al 2,3 y al 4% de la MS en raciones completamente mezcladas (TMR) con una relación 50% concentrado y 50% forraje no afectó ni el pH ruminal, ni la concentración total de AGV o el número de protozoarios (Benchar et al., 2012). En un ensayo con ovinos, Brodiscou et al., (1994), reportaron un decrecimiento en la concentración total de AGV cuando el aceite de lino representó el 6% de la ración con una relación forraje:concentrado 55:45. En general, se asume que la suplementación con grasas no protegidas y altamente insaturadas a dietas de rumiantes disminuye la proporción de acetato y la relación acetato: propionato en el rumen, con un efecto antimicrobiano de los aceites ricos en AG poliinsaturados como una probable explicación de este fenómeno (Jenkins y Jenny, 1992). No obstante, el tipo y fuente de aceite y la relación forraje:concentrado de la dieta basal, son los factores que determinan mayormente el efecto de la suplementación con lípidos sobre la fermentación ruminal (Toral et al., 2009). Las dietas utilizadas en el presente estudio 179 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias presentaron una alta participación de forraje, que puede estar favoreciendo la fermentación ruminal. Producción de metano Los aceites ricos en AG de cadena media reducen la producción de metano (Machmüller, 2006) siendo los ácidos láurico (C12:0) y mirístico (C14:0) los más eficaces (Dohme et al, 2001; Soliva et al, 2003; Panyakaew et al, 2013). Igualmente, la inclusión de AG poliinsaturados en la dieta, constituye una de las alternativas de alimentación más promisoria para deprimir la metanogénesis (Martin et al., 2006; 2010; Wu et al, 2013; Cieslak et al, 2013; Patra, 2013). Aunque la cantidad de hidrógeno utilizado en el proceso de biohidrogenación es pequeña (1%) en comparación con la cantidad de hidrógeno utilizada para reducir el dióxido de carbono para producir metano (48%; Czerkawski, 1986), la reducción de la producción de metano in vitro, inducida por la adición de grasa a la dieta puede alcanzar hasta un 50% (Machmüller et al., 1998) y se ha observado que el efecto está asociado en gran parte a la disminución de protozoarios (Cieslak et al., 2006). Los metanógenos dependen de la actividad metabólica de los protozoos (Janssen et al., 2010). Así, el efecto supresor sobre producción de metano del C18:2 y C18:3 observado, puede ser debido a un efecto tóxico indirecto sobre los metanógenos del rumen. En el presente estudio, la suplementación con diferentes aceites vegetales y el nivel de inclusión de aceite, no afectaron la producción de metano. La ausencia de diferencias entre los aceites utilizados fue también reportado por Beauchemin et al., (2009) y JCLA et al., (2007), quienes encontraron un efecto similar sobre la producción de metano ruminal entre los AG linoleico y linolénico. Sin embargo, diversos estudios in vitro, han encontrado diferencias entre aceites. 180 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias El uso de aceite de coco (C12:0+C14:0 ) in vitro, en dosis de 80 o 120 mg /100 ml de fluido de incubación, con y sin adición de 20 mg de una mezcla de aceite de girasol y lino (PUFA), redujo la producción de metano en ambos casos (con y sin PUFA), pero esta reducción fue dos veces mayor con la adición de PUFA (Panyakaew et al., 2013). La adición de 50 mg de los ácidos oleico o linoleico a 500 mg de sustrato disminuyó la producción de metano en el trabajo informado por Wu et al. (2013). Cieslak et al., (2013), evaluaron la adición de 50 g/kg de MS de aceite de uva (69.6% de ácido linoleico) o aceite de grosella negra (58.6% de ácido linoleico) y encontraron que la adición de los aceites no afectó la fermentación pero provocó una disminución en la producción de metano en 21 y 23 % a las 24 horas de fermentación para los tratamientos con aceite de uva y grosella, respectivamente. Amaro et al., (2012), evaluando ácido estearidónico (C18:4n3), a niveles de 1, 5, 20 y 50 mg/L de medio de incubación, no encontró efecto de la adición de aceite sobre la producción de metano, concluyendo que se necesitan altos niveles de ácido estearidónico no esterificado para mitigar metano. En el presente estudio, la cantidad de aceite adicionada fue de 10 mg/500 mg de sustrato ó 20 mg/500 mg de sustrato para el nivel de 2% o 4% de inclusión de aceite respectivamente, que corresponde con 20 ó 40 g de aceite/Kg de MS y con 5,59 ó 11,19 mg de ácido linoleico/500 mg de sustrato para el nivel de 2% ó 4% respectivamente. Las cantidades de aceite de girasol (55.95% de ácido linoleico) adicionadas en el presente trabajo resultaron inferiores a las utilizadas en los trabajos de Cieslak et al (2013) ( 50 g de aceite/Kg de MS) ó por Wu et al., (2013) (50 mg de ácido linoleico/500 mg de sustrato) y por lo tanto resulta posible que la cantidad de aceite no fue suficiente para disminuir metano. 181 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Inclusión de leucaena, biohidrogenación y producción de metano En el presente ensayo, el grado de inclusión de leucaena fue representativo de las condiciones reales de alimentación de vacas en los sistemas de producción silvopastoriles. La presencia de esta especie forrajera no indujo diferencias en cuanto a la concentración del CLA-c9t11, del ATV, esteárico o en la producción de metano indicando que los taninos presentes en la leucaena no redujeron la BHR o la producción de metano. Este resultado podría estar en parte explicado por la baja concentración de taninos en las dietas evaluadas. En la dieta de la finca del sistema lechería tropical SSPi (LTSSPi), la inclusión de leucaena fue de 15% y en la finca del sistema doble propósito SSPi (DPSSPi), la inclusión de leucaena fue del 16%. La leucaena utilizada en el presente estudio, contenía 4.24% de taninos totales (% de ácido tánico), lo que corresponde a 6.36 y 6.78 g de ácido tánico/kg de MS (0.63% y 0.67% de la MS), para las fincas LTSSPi y DPSSPi, respectivamente. En estudios in vitro, Minieri et al., (2014) reportan una disminución en la BHR de los ácidos linoleico y linolénico cuando los taninos de Quebracho son incluídos a razón de 22.3 g de ácido tánico/kg de MS cantidad superior a la utilizada en el presente estudio. Así mismo, Khiaosa-Ard et al., (2009), reportan una inhibición del paso final de la BHR del ácido linolénico cuando los taninos condensados representaron el 7.9% de la MS proporción que vuelve a resultar superior a la utilizada en el presente estudio. En nuestro trabajo, las dietas de los sistemas LTSSPi y DPSSPi, contenían 2.10 y 2.24 mg de TC/500 mg de MS, respectivamente, lo que equivale al 0.42% y 0.45% de la dieta, respectivamente. Tan et al., (2011), mostraron una reducción en la producción de CH4 ante la inclusión de 10 mg de TC / 500 mg de MS, pero la producción de metano no disminuyó cuando la incorporación de dichos taninos fue del orden de 0.2% y 1.8% 182 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias en la dieta (Sliwinski et al., 2002; Beauchemin et al., 2007). Resultapor lo tanto posible que el nivel de taninos utilizado en este estudio, no haya sido suficiente como para afectar la producción de metano. CONCLUSIONES La inclusión de aceite de girasol y lino redujo la digestibilidad de la MS entre 1y 2% con respecto al aceite de palma, efecto que resultó aún mayor (-3,4%) cuando el nivel de inclusión de aceite fue del 4%, manteniéndose dicha digestibilidad dentro de valores aceptables. En todos los sistemas base pastoril evaluados, la adición de aceite de girasol a al 2 y 4% de la MS aumentó la proporción de ácido linoleico en la dieta, conllevando a una mayor producción de CLA-c9t11 (C18:2 c9t11), ATV (producto de la BHR) y linoleico después de la incubación. El aumento del ATV resulta importante dado su rol como precursor a nivel mamario del CLA-c9t11. Esta estrategia de alimentación constituye una herramienta nutricional viable a fines de aumentar la concentración de los ácidos grasos benéficos en la leche para los sistemas de producción evaluados. Adicionalmente, la suplementación con aceite no afectó la cinética de fermentación, el pH, la producción de AGV, ni disminuyó la producción de metano. Es posible que el bajo nivel de aceite y de taninos empleado en las dietas en evaluación, no haya afectado protozoos, bacterias, hongos y metanógenos del rumen, así como tampoco se afectó el buen funcionamiento ruminal. Los resultados permiten sugerir que la utilización del aceite de girasol al 2 y 4% de la materia seca consumida sería una estrategia promisoria a evaluar bajo condiciones de campo a fines de aumentar los ácidos grasos benéficos y el valor saludable de la leche 183 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias de ganaderías colombianas manejadas con y sin sistemas silvopastoriles de leucaena con estrella y/o guinea. REFERENCIAS Amaro P, Maia MRG, Dewhurst RJ, Fonseca AJM and Cabrita ARJ. Effects of increasinglevels of stearidonicacidonmethaneproduction in a rumen in vitro system. Anim. Feed Sci. 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Establecer el efecto de la suplementación alimenticia con el mejor nivel de inclusión del aceite más destacado en la prueba in vitro sobre la concentración de: CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche y sobre la relación beneficio-costo en las ganaderías en estudio. 193 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ACEITE DE GIRASOL SOBRE EL PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS DE LA LECHE DE VACAS EN SISTEMAS DE LECHERÍA TROPICAL Y DOBLE PROPÓSITO MANEJADAS CON Y SIN SISTEMA SILVOPASTORIL INTENSIVO CON LEUCAENA RESUMEN Los ácidos grasos insaturados como el ácido linoleico conjugado C18:2 c9t11 (CLAc9t11) o ruménico, el ácido transvaccénico C18:1 t11 (ATV) y algunos ácidos grasos (AG) de cadena larga n-3 más la abundancia relativa de los AG saturados/insaturados de la leche bovina presentan potenciales beneficios para la salud humana. La presencia de estos AG en la leche resulta fuertemente dependiente de factores dietarioscomo la suplementación con aceites vegetales ricos en AG poliinsaturados aunque la respuesta final puede variar en función de la cantidad y fuente lipídica empleada y con la composición de la dieta basal. En el presente trabajo se evaluó el efecto de la suplementación con aceite de girasol a dos niveles de inclusión (2% y 4% de la MS total), sobre el consumo de forraje , la producción y composición de la leche con especial énfasis en la concentración del CLA-c9t11, ATV y otros AGCL potencialmente favorables para la salud humana y sobre la relación beneficio-costo de ganaderías de los sistemas de producción lechería tropical especializada (LT) y doble propósito (DP) que pastorean en solo gramíneas de pasto Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con la presencia de Leucaena (Leucaena leucocephala). El trabajo se desarrolló en 4 fincas de Colombia productoras de leche donde cada una fue juzgada como representativa de un sistema de producción. Así quedaron definidas la lechería tropical especializada sin (LT) y con sistema silvopastoril intensivo (LTSSPi) y doble propósito sin (DP) y con sistema silvopastoril intensivo (DPSSPi), en donde además del pastoreo, las vacas recibían en promedio 3.4, 5.8, 4.0 y 2.0 Kg concentrado/animal/día, 194 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias respectivamente. En cada finca se seleccionaron 9 vacas con más de 2 partos y que se encontraban entre los 70-110 días de lactancia y se utilizó un diseño de cuadrado latino modificado (sobrecambio), 3 X 3 (periodos de 21 días), cada tratamiento se repitió 3 de veces. En el tratamiento 1, no se ofreció suplementación de aceite (0%) y en los tratamientos 2 y 3, se suplementó con aceite de girasol (63.32% de ácido linoleico y 28.32% de ácido oleico) al 2% (250, 324, 250, 200 g aceite/animal/día, para LT, LTSSPi, DP, DPSSPi, respectivamente) y 4% (500, 650, 500, 400 g aceite/animal/día, para LT , LTSSPi, DP, DPSSPi, respectivamente) de la MS. En el sistema DP, repetidamente se presentó rechazo del aceite por parte de las vacas, razón por la cual solo se presentan resultados de 3 fincas. La suplementación con aceite de girasol no afectó el consumo de forraje en el sistema LT (p>0.05), aunque tendió a disminuirlo en los sistemas LTSSPi (p=0.07) y DPSSPi (p=0.06), no afectó la producción de leche (p>0.05), % de proteína (p>0.05), ni % de lactosa (p>0.05) en ninguno de los 3 sistemas. La proporción de grasa (p<0,05), sólidos totales (p<0.05) y MUN (p<0.05) en la leche del sistema DPSSPi, disminuyeron con la suplementación de aceite a nivel del 2 y 4%, mientras que en el sistema DPSSPi, estas tres variables aumentaron a un nivel del 2% con respecto al 4% (p<0.05) y en el sistema LT no fueron afectadas (p>0.05). La proporción de CLA-c9t11, ATV y oleico aumentaron (p<0.05) linealmente con los dos niveles de suplementación en los 3 sistemas y los ácidos grasos aterogénicos C12:0, C14:0 y C16:0 disminuyeron (p<0.05), obteniéndose una leche con mayor cantidad de AG insaturados y menor índice de aterogenicidad (p<0.05). La relación beneficio costo fue mayor a nivel de suplementación de 4% en dos de los tres sistemas, si la leche se mercadeara con un valor diferencial por contenido de CLA-c9t11. Los resultados del presente estudio, muestran que la suplementación con aceite de girasol a vacas en pastoreo, permite aumentar los ácidos grasos benéficos para la salud humana. 195 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias INTRODUCCIÓN Los ácidos grasos insaturados como el ácido linoleico conjugado C18:2 c9t11 (CLAc9t11) o ruménico, el ácido transvaccénico C18:1 t11 (ATV) y algunos ácidos grasos (AG) de cadena larga de la serie omega tres (n-3) presentes en la leche bovina, se relacionan con potenciales beneficios para la salud humana (Harris, 2008; Shingfield et al., 2013). El CLA-c9t11 es el principal isómero CLA presente en la leche y proviene principalmente de la desaturación del ATV por la actividad de la enzima mamaria Delta9 desaturasa (Griinari y Bauman,1999; Bichi et al.,2012). Se ha reportado que CLAc9t11 inhibe el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer humano, reduce la tasa de desarrollo del tumor inducido químicamente, altera el metabolismo de las lipoproteínas, y modifica la función inmune en modelos animales (Shingfield et al., 2008). Por lo tanto, puede concluirse que el CLA c9t11 presenta promisorios beneficios potenciales en salud humana. El ATV producido en el rumen durante la biohidrogenación de los AG insaturados, es el principal AG trans en la grasa de rumiantes y el precursor de CLA-c9t11 en los tejidos (Field et al., 2009). El principal n-3 en la grasa de la leche es el ácido linolénico (C18:3 c9,12,15) con pequeñas cantidades de ácido docosahexaenoico (22:6 n-3) y ácido eicosapentanoico (20:5 n-3) (Ferlay et al., 2013). Los AG n-3 reducen en el suero las lipoproteínas de baja densidad, contribuyendo a una disminución en el riesgo a incidencia de enfermedad cardiovascular humana (Shingfield et al., 2008). Asimismo, el ácido oleico C18:1 cis9, en los seres humanos, puede prevenir aumento de la lipoproteína de baja densidad en la sangre y puede disminuir la presión arterial (Dhakal et al., 2014). Como contraposición a la presencia de AG saludables, existen evidencias que ciertos AG saturados tales como láurico (C12:0), mirístico (C14:0) y palmítico (C16:0), aumentan las lipoproteínas de baja densidad (Givens, 2010), con un potencial 196 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias efecto aterogénico (Ulbritch y Southgate, 1991) e hipercolesterolémico (Givens, 2010) cuando los mismos son consumidos en exceso. Aunque la alimentación base pastoril resulta predisponente a obtener leches con mayores niveles basales de CLA-c9t11, se pueden alcanzar aumentos adicionales mediante la suplementación con lípidos polinsaturados (Chilliard y Ferlay, 2004; Schroeder et al., 2004). La suplementación con aceites de origen vegetal sugiere que aquéllos con contenidos más altos en los ácidos linoleico y linolénico (como los procedentes de semillas de soja, algodón, girasol, lino, cártamo y colza) son los más idóneos para aumentar el CLA-c9t11 en la leche (Stanton et al., 2003; Khanal y Olson, 2004). El efecto sería lineal ante el agregado de cantidades crecientes de aceite a la raciónhasta un máximo de 3-4% de la MS. (Chilliard et al., 2007). Además se ha comprobado que aquéllos alimentos más ricos en ácido linoleico (girasol, soja) son los más efectivos (Kelly et al., 1998; Dhiman et al., 2000; Lock y Garnsworthy, 2002; Collomb et al., 2004; Shingfield et al., 2006; Hervás et al., 2006). La suplementación con aceites vegetales ricos en AG poliinsaturados no solo permite aumentar los niveles de CLA-c9t11, sino que también permite aumentar el ATV, los AG insaturados (moni y poliinsaturados) y disminuir los AG saturados (Vargas-Bello-Pérez et al 2015; Boerman y Lock, 2014; Saliba et al., 2014; Angulo et al., 2012; Rego et al., 2009; Cruz-Hernández et al., 2007), con un impacto alto en la composición de la grasa láctea y su valor saludable. Sin embargo, esta suplementación, puede disminuir el porcentaje de grasa en leche (Vargas-Bello-Pérez et al 2015; Boerman y Lock, 2014; Saliba et al., 2014; Angulo et al., 2012; Rego et al., 2009; Cruz-Hernández et al., 2007), aunque en trabajos recientes, un aumento en la producción de leche con la suplementación, conllevó a que el rendimiento en producción de grasa (kg/día) no se viera afectado (Saliba et al., 2014; Boerman y Lock, 2014). Es importante destacar que el efecto de la suplementación con aceites ricos en AG poliinsaturados puede variar de 197 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias acuerdo con la cantidad y fuente de grasa empleada y con la composición de la dieta basal (Chillard y Ferlay 2004; Dewhurst et al. 2006, Grainger y Bauchemin 2011). En Colombia, el 45% de la leche se produce en Lechería especializada y el 55% bajo el sistema doble propósito (CONPES, 2010) que en su expresión tradicional tienen una base forrajera de solo gramíneas. Otros productores utilizan sistemas más adecuados a las condiciones medio ambientales con una base forrajera silvopastoril (SP), que incluye mezcla de pasto y plantas arbustivas para consumo directo por parte de los animales lo cual permite aumentar la oferta de forraje, en particular durante el periodo seco, mejorar la calidad de la dieta a lo largo del año y mejorar la conservación y el reciclaje de nutrientes (Mahecha y Angulo, 2012; Pagiola et al., 2007; Pagiola et al., 2005; Murgueitio, 1999). Hay evidencia de que los taninos condensados presentes en las plantas, pueden incidir en la biohidrogenación ruminal (Khiaosa-Ard et al., 2009). El desarrollo de estrategias de suplementación en la ganadería colombiana con ácidos grasos poliinsaturados, que permitan aumentar los ácidos grasos benéficos de la leche, exige un previo conocimiento del efecto de diferentes fuentes de ácidos grasos poliinsaturados bajo condiciones de alimentación específicas del país. Dichas condiciones varían de acuerdo al sistema de producción y a los procesos de fermentación ruminal que se generan en cada uno de ellos aspectos que deben ser evaluados experimentalmente para seleccionar la mejor opción y posteriormente evaluarla en campo. De acuerdo con lo anterior, en un estudio previo, se evaluó in vitro, el efecto de la adición de aceites vegetales saturados (Palma) e insaturados (Girasol y Lino) con un nivel de inclusión del 2 y 4% de la MS, simulando a las dietas propias de las ganaderías de los sistemas LT y DP, con y sin sistema silvopastoril. Los resultados obtenidos indicaron que en todas las dietas, la suplementación con aceite de girasol aumentó el contenido de linoleico (C18:2 c9,12) , CLA-c9t11 (C18:2 c9t11) y de ATV (C18:1 t11) en la digesta y no afectó la cinética de fermentación, pH, total de AGV, ni 198 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias proporción de AGV. Estos resultados más el aumento en la concentración de ATV como precursor a nivel mamario del CLA-c9t11 resultan en un criterio importante para decidir y justificar que la suplementación con aceite de girasol represente la mejor opción a evaluar bajo condiciones de campo, para aumentar los AG benéficos en la leche de ganaderías colombianas manejadas con y sin sistemas silvopastoriles. El objetivo de este trabajo fue conocer el efecto de la suplementación alimenticia con aceite de girasol a nivel de inclusión del 2% y 4% de la MS, sobre el consumo de forraje, la producción, composición, concentración de: CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche y sobre la relación beneficio-costo de ganaderías de lechería tropical especializada (LT) y doble propósito (DP), que pastorean en solo gramíneas en pasto Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (Leucaena leucocephala). MATERIALES Y MÉTODOS Localización Se realizaron cuatro ensayos independientes, cada uno en una finca de Colombia, productora de leche, representativa de un sistema de producción. El primer y segundo ensayo se llevaron a cabo en el sistema de lechería tropical especializado sin (LT) y con sistemas silvopastoril intensivo (LTSSPi); el tercero y el cuarto ensayo se realizarón en el sistema doble propósito sin (DP) y con sistema silvopastoril intensivo (DPSSPi). En adelante hare referencia al sistema. Los ensayos se desarrollaron durante los meses de finales de mayo a julio del 2014. Su ubicación se presenta en la Tabla 5.1. 199 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.1. Localización de los ensayos realizados Ensayo Sistema Municipio Departamento 1 LT Pereira-Risaralda 2 LTSSPi 3 4 Coordenadas m.s.n.m Temperatura Promedio °C 4° 48’ 51” N 75° 41’ 40” O 1.411 22 Tebaida - Quindío 4° 27’ 08” N 75° 47’ 12” O 1.190 23 DP Neira - Caldas 5° 09’ 59’’ N 75° 31’ 08’’ O 1.969 18 DPSSPi La Jagua Guajira 10° 30’ 36” N 73° 04’ 17” O 223 28 del Pilar- El sistema de producción Doble propósito (DP) estuvo definido por la utilización de animales con cruces mixtos de Bos taurus x Bos indicus y ordeño con ternero al pie mientras que el sistema denominado Lechería tropical (LT) fue definido por cruces mixtos de Bos taurus x Bos indicus, con predominio de Bos taurus y ordeño sin ternero. Los grupos raciales utilizados para los cruzamientos en cada finca, el tipo y número de ordeños/día se presentan en la Tabla 5.2. Tabla 5.2. Características de los sistemas de producción de leche Ensayo Sistema Grupo Racial N° ordeños Tipo de ordeño 1 LT Holstein, Blanco Orejinegro, Gyr, Brahman 2 Mecánico 2 LTSSPi Rojo Sueco, Montbeliarde, Holstein, Brahman 2 Mecánico 3 DP Holstein , Brahman 1 Mecánico 4 DPSSPi Holstein , Brahman 2 Manual En cada ensayo se utilizarón los mismos tratamientos y se seleccionaron animales similares. Se trabajó con 9 vacas representativas del hato , que tenían más de 2 partos y que se encontraban entre 70-110 días de lactancia utilizando un diseño de cuadrado latino modificado (sobrecambio), donde se aplicaron 3 tratamientos, en 3 periodos de 21 días cada uno (columnas) y cada tratamiento se repitió 3 veces. 200 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Los 3 tratamientos aplicados fueron los siguientes: T1: Manejo alimenticio dado por el ganadero (sin suplementación con aceite) T2: Manejo alimenticio dado por el ganadero + aceite de girasol al 2% de la MS T2: Manejo alimenticio dado por el ganadero + aceite de girasol al 4% de la MS El manejo alimenticio dado por el ganadero consistió en pastoreo rotacional con un período de ocupación de un día con descansos entre 19 a 39 días, dependiendo del sistema (Tabla 3) con disponibilidad de sales mineralizadas y de agua fresca y limpia para los animales. La base forrajera de los 4 sistemas en estudio, estuvo constituida principalmente por pasto Estrella (Cynodon plectostachyus) o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania). En los sistemas silvopastoriles intensivos, la Leucaena (Leucaena leucocephala), está a una distancia de 1 m entre plantas en LTSSPi y a 1.5 m entre surcos en DPSSPi. La dieta base se suplementa con alimentos balanceados y/o subproductos de la agroindustria o una mezcla de los dos. La cantidad de suplemento en el sistema LT y LTSSPi, se ofrece de acuerdo con la producción de leche/animal/día y en el sistema DP y DPSSPi en cantidades fijas e iguales para todos los animales (Tabla 5.3). Tabla 5.3. Manejo alimenticio dado en los diferentes sistemas 1 LT Estrella Edad forraje 19 días 2 LTSSPi Estrella + Leucaena 39 días 3 DP Estrella 26 días 4 DPSSPi Guinea Tanzania + Leucaena 36 días Ensayo Sistema Forrajes Suplementación Concentrado ( harina de maíz y torta de Soya) Promedio:3,4 kg/a/d ItalLeche 6000 Promedio: 5,8 Kg de mezcla /a/d Mezcla Torta de Soya (25%)+harina de maíz (75%) 2,3 Kg Mezcla + 1,7 Kg Semilla Algodón= 4,0 Kg/a/d 1,4 Kg/a/d Concentrado Verano de Italcol + 0,6 Kg/a/d fruto de algarrobo (Samanea saman ) La composición química y el perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos en cada sistema se presentan en las tablas 5.4, 5.5, 5.6 y 5.7. 201 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.4. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos, en el sistema Lechería Tropical (LT) Variable Pasto Concentrado Composición Química Grasa (%) 2.84 4.02 Proteína (%) 18.90 23.75 FDN (%) 62.89 25.73 FDA (%) 26.48 4.25 Ácidos grasos (AG) g de AG/100 g de AG totales C12:0 0.56 4.14 C16:0 22.25 18.08 C18:1 c9 3.07 26.24 C18:2 c9,12 15.40 43.55 C18:3 c 9,12,15 46.37 1.64 Tabla 5.5. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos, en el sistema Lechería Tropical SSPi (LTSSPi) Variable Pasto Leucaena Concentrado Composición Química Grasa (%) 1.69 2.18 5.31 Proteína (%) 11.80 26.40 17.46 FDN (%) 66.10 42.80 35.59 FDA (%) 31.87 11.38 12.40 Ácidos grasos (AG) g de AG/100 g de AG totales C12:0 0.81 0.62 6.78 C16:0 25.04 21.59 21.91 C18:1 c9 3.15 2.47 18.79 C18:2 c 9,12 15.98 12.23 41.99 C18:3 c 9,12,15 42.29 46.46 1.60 202 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.6. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos, en el sistema Doble Propósito (DP) Variable Pasto Semilla de Algodón Concentrado Composición Química Grasa (%) 2.29 8.70 2.29 Proteína (%) 12.02 22.84 20.83 FDN (%) 66.04 50.89 33.08 FDA (%) 30.77 32.41 2.27 Ácidos grasos (AG) g de AG/100 g de AG totales C12:0 0.43 0.05 0.03 C16:0 23.51 21.94 17.58 C18:1 c9 3.72 12.45 24.02 C18:2 c9,12 15.51 59.60 50.54 C18:3 c 9,12,15 44.73 0.10 1.99 Tabla 5.7. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos, en el sistema Doble Propósito SSPi (DPSSPi) Variable Pasto Leucaena Concentrado Composición Química Grasa (%) 1.88 3.78 2.00 Proteína (%) 16.34 29.40 13.99 FDN (%) 60.44 29.73 49.31 FDA (%) 29.92 13.34 32.10 Ácidos grasos (AG) g de AG/100 g de AG totales C12:0 0.49 0.09 33.71 C16:0 26.55 21.30 12.49 C18:1 c9 3.96 6.01 16.88 C18:2 c 9,12 17.47 13.32 12.33 C18:3 c 9,12,15 34.24 42.00 0.63 203 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Se utilizó aceite comercial de girasol. El perfil de ácidos grasos del aceite, se presenta en la tabla 5.8. Tabla 5.8. Perfil de ácidos grasos del aceite de girasol utilizado ÁCIDO GRASO g /100 g AG Totales C16:0 4.88 C18:0 3.46 C18:1c9 28.32 C18:1t9 0.01 C18:2c9,12 63.32 La cantidad de aceite que se suministró (Tabla 5.9), se definió con base en el consumo de MS, estimado para cada sistema, utilizando la ecuación propuesta por NRC (2001), para vacas lactantes. Tabla 5.9. Consumo estimado de MS y cantidad de aceite suministrado en cada sistema Sistema LT Consumo estimado de MS Kg/animal/día 12.5 LTSSPi 16.2 DP 12.5 DPSSPi 10.0 Cantidad de aceite g/animal/día 2% = 250 4% = 500 2% = 324 4% = 650 2% = 250 4% = 500 2% = 200 4% = 400 El aceite fue mezclado manualmente con el suplemento y suministrado en comedero individual, al momento del ordeño, en los sistemas LT, LTSSPi,DP y después del ordeño, en el sistema DPSSPi. En los sistemas con 2 ordeños se suministró la mitad de la ración diaria en cada ordeño. El suministro de aceite se hizo en forma gradual 204 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias iniciando con 100 g/animal/día y de acuerdo al comportamiento del animal, se aumentó la cantidad, hasta llegar a la cantidad total, proceso que requirió de 3 días en el sistema DPSSPi, de 5 días en los sistemas LT y DP y de 7 días en el sistema LTSSPi. Inicialmente se asignaron los tratamientos al azar y luego de manera consecutiva, recibiendo cada uno de los tratamientos por un periodo de 3 semanas (21 días), alcanzando así, un periodo experimental total de 63 días. Las primeras dos semanas se usaron como período de acostumbramiento al tratamiento y la última para realizar medición diaria de la producción de leche y toma de muestras de leche, alimentos y heces. Diariamente se registró el consumo de suplemento mediante oferta y rechazo. En los sistemas LTSSPi y DPSSPi, con el fin de conocer la proporción de leucaena consumida del total de forraje consumido, se estimó el consumo de forraje, mediante la técnica de desaparición de forraje descrita por Macoon et al., (2003). Para la Leucaena, se adaptó esta metodología y se estimó la disponibilidad de forraje por metro lineal (Mahecha et al. 2000). La diferencia en la cantidad de forraje antes y después del pastoreo, se tomó como forraje consumido por las vacas, de igual forma se estimó la proporción consumida de cada forraje (gramínea y leucaena). Medición que se realizó, una vez por semana durante todo el periodo experimental. Los días 4, 5 y 6 de la última semana de evaluación, de cada periodo experimental, se tomaron tres muestras de leche de cada uno de los animales: una para determinación de CLA, ATV y AGCL, otra para determinación de grasa, proteína y sólidos totales, y una tercera que se usó como contramuestra. Los muestreos se hicieron de acuerdo a las recomendaciones de I.O.S.. and I.D.F (2008). Las muestras se colocaron en refrigeración inmediatamente después de su recolección y las muestras tomadas para determinación de CLA, ATV y AGCL, se almacenaron a -20°C hasta su análisis. El 205 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias análisis de CLA, ATV y AGCL de las muestras de leche se hizo mediante cromatografía de gases con detector FID y la determinación de grasa, proteína y sólidos totales, se realizó en la leche fresca mediante Milkoscan 133B. Conjuntamente con la última toma de muestra de leche de cada período, se tomaron muestras de cada componente de la dieta, para determinar la composición química, lignina y el perfil de ácidos grasos (Tablas 4, 5, 6 y 7). La muestra de forraje, se tomó antes de la entrada de los animales al potrero, el que fue dividido en 3 partes y de cada una, se tomó una muestra representativa de lo consumido por la vaca. Para la determinación de la composición química de los alimentos (Tablas 5.4 , 5.5, 5.6 y 5.7), se utilizaron las técnicas analíticas convencionales de la AOAC (1999) (materia seca método ID 934.01, cenizas método ID 942.05, proteína bruta método ID 984.13, grasa y fibra detergente ácido método ID 973.18) y los descritos por Van Soest et al. (1991) para los análisis de fibra detergente neutro y fibra detergente ácido. La determinación de lignina se realizó siguiendo el protocolo para lignina detergente ácido en beakers tecnología Ankom (Leterme y Estrada 2010). El análisis de ácidos grasos de las muestras de alimentos, se hizo mediante cromatografía de gases con detector FID. El consumo de forraje se cuantificó, usando cromo como marcador externo, para lo cual se suministró 16 gr de óxido de cromo/animal/día (con 57,32 % de cromo) durante los últimos 15 días de cada período y en los últimos 5 días se tomó muestra de materia fecal del recto de cada animal, en horas de la mañana y de la tarde, las cuales fueron congeladas y luego en el laboratorio se descongelaron y se mezclaron para obtener una muestra por vaca y por período, de aproximadamente 500 g. La misma fue secada a 60 °C x 72 horas y molida para determinar la concentración de cromo mediante espectrómetro de absorción atómica (Williams et al. 1962; Penning PD y Johnson RH. 1983) y de lignina detergente ácido en beakers tecnología Ankom (Leterme y Estrada 2010). En los sistemas LTSSPi y DPSSPi (que presentaron limitado espacio para 206 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias congelación), cada muestra de heces, se colocó en bandeja de aluminio (100 g /muestra) y se pre-secó al sol y posteriormente en el laboratorio estas muestras, se secaron en estufa a 60 °C x 48 horas.Seguidamente, las 10 muestras/período de cada vaca se molieron y se mezclaron, para así obtener una muestra/vaca/período de aproximadamente 60 g, en la que se determinó concentración de cromo y lignina, por los métodos mencionados anteriormente. El consumo de materia seca proveniente del forraje (CMSf), se calculó mediante la ecuación propuesta por Correa et al (2009), utilizando los datos de producción de heces (H) estimados utilizando el marcador externo Cr, corregido por el porcentaje de recuperación en las heces y la concentración de lignina como marcador interno, mediante las siguientes formulas. Producción de heces (H) (Lippke 2002). H, g = (g de Cr en el alimento) x (tasa de recuperación del Cr en las heces)/(g/kg de Cr en las heces). Se asumió una tasa de recuperación de Cr en heces de 79 % (Correa et al., 2009). Consumo de materia seca proveniente del forraje (CMSf) CMSf kg/vaca/d= ([Ligh]*H - [Ligs]*CMSs)/ [Ligf] Donde: Ligh es el porcentaje de lignina en las heces, H es la producción de heces, Ligs es el porcentaje de lignina en el suplemento, CMSs Consumo MS del suplemento y Ligf es el porcentaje de lignina en el forraje. CMS total = CMS forraje + CMS suplemento En los sistemas LTSSPi y DPSSPi, una vez obtenido el consumo de forraje, se estimó el consumo correspondiente a gramínea y leucaena utilizando las proporciones de consumo obtenidas por el método de aforo, descrito anteriormente. 207 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Adicionalmente, en todos los sistemas se estimó el consumo de grasa y de los ácidos oleico, linoleico y linolénico por tratamiento, con base en el consumo de forraje y de concentrado registrado y con la concentración de grasa y de AG de los alimentos. Análisis estadístico El consumo de forraje, la producción de leche, composición de la leche, perfil de AG (CLA, ATV, AGCL) de cada sistema, se analizaron mediante ANAVA en un diseño de cuadrado latino modificado (sobrecambio), usando el procedimiento MIXED de SAS (2008). El efecto fijo en el modelo correspondió al tratamiento experimental efectos aleatorios a la vaca y y los al periodo. El modelo también incluyo los efectos residuales (carry-over). La diferencia entre promedios, se analizó mediante prueba de Tuckey-Kramer, con nivel de significancia del 5%; utilizando PROC MIXED de SAS (2008), versión 9.2. Se consideraron tendencias estadísticas cuando el valor de p fue < 0.05 ≤ 0.1. El efecto carry estuvo dado por: Σ cϒl = cϒl1=k1 + cϒl2=k2 + cϒL= (k-1) Donde c puede asumir los valores de -1, 0 y 1, cuando se cumplen las siguientes condiciones: c = 1, Si ese tratamiento fue aplicado al animal en el periodo anterior c = 0, Si ese tratamiento no fue aplicado al animal en el periodo anterior c = −1, Si el tratamiento anterior es el último nivel del tratamiento (K) c = 0, Si es el primer periodo 208 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Cuando el tratamiento previo es el último nivel del tratamiento todos los coeficientes del efecto carry son -1, porque se tiene una restricción al último nivel para tener en cuenta en los (k-1) efectos carry. El valor del último nivel del tratamiento se estima por diferencia entre entre los valores de los otros tratamientos (Cerón et al., 2013). Análisis económico Para realizar este análisis solo se tuvo en cuenta el costo del aceite en los sistemas LT y LTSSPi y el costo del aceite más el concentrado en el sistema DPSSPi. Adicionalmente para calcular el precio de venta sugerido, se incluyó la tasa de interés bancario anual (TIBA), que representa la utilidad que el dinero invertido habría tenido en el banco, de no haberse utilizado en la compra de aceite. Para conocer el grado en que los ingresos, superan a los costos de la nueva inversión realizada, se calculó la relación beneficio – costo, mediante la siguiente fórmula. RB:C = Ingreso adicional/Egreso adicional. Este análisis también se realizó, colocando un precio de venta diferencial al litro de leche, de acuerdo al % de CLA-c9t11 presentes en esta, el cual se calculó de una manera proporcional, teniendo como base el % de CLA-c9t11 presentes en la leche sin adición de aceite y su respectivo precio de litro de leche. De tal forma que si una leche producida sin adición de aceite a la dieta de la vaca presenta 1.39% de CLA-c9t11 y el precio a productor es de 1.130 $/L, una leche con 2.24% de CLA-c9t11 (como resultado de la adición de aceite de girasol al concentrdo suministrado a esta vaca) tendrá un precio al productor de 1.821 $/L (2.24% x $1.130/1.39%= 1.821 $/L), marcando así una diferencia de $691 en el precio del litro pagado al productor de acuerdo al contenido de CLA-c9t11. 209 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias En el sistema DP, se presentó rechazo del aceite por parte de las vacas, hacia la segunda semana de iniciado el ensayo, situación que se repitió aun retirando la semilla de algodón del suplemento, razón por la cual solo se presentan resultados de 3 sistemas. RESULTADOS Ensayo 1. Sistema Lechería Tropical Consumo El concentrado adicionado con aceite, fue consumido en su totalidad por las vacas, la proporción forraje:concentrado fue de 81:19 y el consumo estimado de grasa y AG oleico, linoleico y linolénico se presenta en la Tabla 5.10. Tabla 5.10. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día) a partir del consumo total utilizando cromo como marcador, en los diferentes tratamientos en el sistema lechería tropical Consumo Grasa Sistema LT 1 Tratamiento Consumo AG Kg/a/d Kg/a/d Grasa % MS1 Aceite Kg/a/d Aceite % MS1 Oleico Linoleico Linolénico 0% 0.488 3.04 0.000 0.00 0.0402 0.1057 0.1776 2% 0.754 4.63 0.250 1.54 0.1185 0.2750 0.1715 4% 0.948 6.51 0.500 3.43 0.1819 0.4179 0.1564 % de la MS total consumida. El consumo de forraje (Tabla 5.11), no fue afectado por el tratamiento (p>0.05). Se presentó una tendencia (p=0.06) en el efectos residual del tratamiento con adición de aceite al 2% para esta variable. Este tratamiento junto con el tratamiento al 4% tendieron a reducir lo el consumo de forraje en el período siguiente a su aplicación, contrario al tratamiento sin adición de aceite (0%). 210 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.11. Consumo de forraje, producción, composición y perfil de ácidos grasos de la leche en el sistema lechería tropical. Variable 0% Adición de aceite 2% 4% Tratamiento p< Carry 0% Carry 2% Consumo de Forraje Kg MS /animal /día 13.35 12.85 11.72 0.6270 0.2553 0.0674 Leche L/día 11.60 12.95 11.96 0.4798 0.4205 0.8820 Grasa % 4.32 3.65 3.89 0.1576 0.1189 0.1810 Proteína % 2.94 3.06 3.02 0.3603 0.4992 0.7204 Sólidos Totales % 12.41 11.90 11.94 0.2164 0.3310 0.0613 Lactosa (%) 4.42 4.49 4.42 0.6859 0.1295 0.2546 MUN (mg/dl) 19.82 18.80 17.67 0.2598 0.3990 0.4877 Grasa (Kg/día) 0.39 0.42 0.37 0.5934 0.5452 0.8565 Proteína(Kg/día) 0.29 0.37 0.31 0.0795 0.1047 0.9742 Sólidos Totales (Kg/día) 1.20 1.44 1.21 0.1720 0.1758 0.9689 g de AG /100 g de AG Total medido en leche C6:0 1.37a 1.22ª 0.79b <0.0001 0.0020 0.0028 C8:0 0.89a 0.75ª 0.49b <0.0001 0.0049 0.0099 C10:0 1.95a 1.42b 1.08c 0.0005 0.1650 0.2451 C11:0 0.29 0.23 0.16 0.1526 0.1766 0.2151 C12:0 2.41a 1.89b 1.45c 0.0042 0.1579 0.1224 C13:0 0.02 0.01 0.02 0.2010 0.0951 0.0902 C14:0 9.96a 8.16b 6.79b 0.0020 0.4349 0.4122 C14:1 c9 1.01a 0.95ª 0.68b 0.0014 0.0107 0.0042 C16:0 21.84a 18.47b 15.29c <0.0001 <0.0001 0.0001 C16:1 c9 1.33a 1.14ab 0.95b 0.0140 0.0982 0.0922 C17:0 0.97a 0.78b 0.62c 0.0002 0.2724 0.0065 C17:1 c10 0.40a 0.32b 0.26b 0.0056 0.3916 0.0673 C18:0 14.49b 15.76ab 17.86a 0.0231 0.0070 0.0134 C18:1 c9 32.23b 35.30ª 37.36a 0.0006 0.1140 0.2189 C18:1 t11(TVA) 6.06b 8.56ab 9.70ª 0.0123 0.7116 0.8298 C18:2 c9,12 1.39 1.30 1.35 0.7115 0.1686 0.1969 C18:2 c9t11(CLA) 1.39 1.92 2.24 0.0799 0.5044 0.6270 C18:2 t9,12 0.29b 0.46ª 0.48ª 0.0033 0.6970 0.3302 C18:3 c9,12,15 0.61a 0.44b 0.32c <0.0001 0.0402 0.0019 C20:0 0.38 0.36 0.35 0.1409 0.2110 0.1017 Sumatorias Saturados 54.06a 47.39b 43.35c <0.0001 0.3216 0.1379 Insaturados 45.94c 52.61b 56.65a <0.0001 0.3216 0.1379 Monoinsaturados 40.30c 46.33b 50.47a <0.0001 0.2171 0.0824 Poliinsaturados 4.82 4.95 5.39 0.2755 0.4114 0.6241 Omega 3 (n3) 0.82a 0.68ab 0.59b 0.0554 0.7118 0.4684 Omega 6 (n6) 2.79 2.71 2.71 0.8488 0.2560 0.4359 Relación n6/n3 3.29b 3.90ab 4.63ª 0.0418 0.2103 0.1670 C10 a C16 39.14a 32.59b 26.17c <0.0010 0.0414 0.0259 Trans C18:1 6.90b 10.49ª 11.65a 0.0030 0.7161 0.9946 Aterogénicos 34.50a 28.69b 23.60c <0.0001 0.0709 0.0413 Índice de Aterogenicidad 1.43a 1.04b 0.78c <0.0001 0.2148 0.1645 Valores con letras diferentes en la misma fila difieren significativamente entre tratamientos (p< 0.05). Omega 3 = C18:3 c9,12,15; C20:3 c11,14,17; C20:5 c5,8,11,14,17 . Omega 6 = C18:2 t9,12; C18:2 c9,12; C18:3 c6,9,12; C18:2 c10,t12; C18:2 t10,c12; C20:3 c8,11,14; C20:4 c5,8,11,14; C22:2 c13,16. Aterogénicos = C12:0, C14:0, C16:0. Índice de Aterogenicidad = C12+4C14+C16/AG Insaturados 211 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Producción y composición de la leche La producción y la composición de la leche (Tabla 5.11), no fueron afectadas por el tratamiento (p>0.05), ni se presentaron efectos residuales para estas variables (p>0.05). Perfil de ácidos grasos de la leche Hubo una tendencia estadística (p= 0.07) al aumento en la proporción de CLA-c9t11 con la adición de aceite (Tabla 5.11 ). La suplementación con aceite de girasol, aumentó la concentración en grasa láctea de los ácidos ATV, oleico y esteárico (p<0.05), aunque disminuyó la del ácido linolénico (p<0.0001). Igualmente disminuyó la proporción de láurico, mirístico (p<0.05) y palmítico (p<0.0001). Se observó tambien una disminución en la proporción de los AG saturados (p<0.0001) de 10 a 16 átomos de carbono (p<0.05), de los AG potencialmente aterogénicos (p<0.0001) y un aumento en la proporción de los AG insaturados (p<0,0001) principalmente los monoinsaturados (p<0.0001) lo que se vio reflejado en un menor índice de aterogenicidad (p<0.0001). La disminución de linolénico, conllevó a una reducción en los omega 3 (p<0.05) y un aumento en la relación n6/n3 (p<0.05) (Tabla 5.11). El aumento en ATV con la suplementación con aceite de girasol, ocasionó un aumento en el total de trans C18:1 (p<0.05), donde la mayor participación fue de ATV y la proporción restante de C18:1 t9. Se presentaron efectos residuales de los tratamientos 0 y 2% de adición de aceite, para los AG palmítico, esteárico y linolénico (p<0.05).La adición de aceite al 2% de la MS 212 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias disminuyó la proporción de ácido palmítico y linolénico y aumento la de esteárico en la leche, en el periodo siguiente a su aplicación, contrario al tratamiento sin adición de aceite (0%). Ensayo 2. Sistema Lechería Tropical SSPi Consumo El concentrado adicionado con aceite, fue consumido en su totalidad por las vacas, la proporción forraje:concentrado fue de 71:29 y con base en los aforos, la proporción gramínea:leucaena fue de 84:16, lo que corresponde a un 11.36% de la dieta en leucaena. El consumo estimado de grasa y AG oleico, linoleico y linolénico se presenta en la Tabla 5.12 Tabla 5.12. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día) a partir del consumo total utilizando cromo como marcador, en los diferentes tratamientos en el sistema lechería tropical SSPi Consumo Grasa Sistema/Finca LTSSPi 1 Tratamiento Consumo AG Kg/a/d Kg/a/d Grasa % MS1 Aceite Kg/a/d Aceite % MS1 Oleico Linoleico Linolénico 0% 0.569 2.78 0.000 0.000 0.0661 0.1697 0.1167 2% 0.821 4.77 0.324 1.882 0.1523 0.3582 0.0944 4% 1.107 6.57 0.650 3.858 0.2356 0.5452 0.0980 % de la MS total consumida. El consumo de forraje tendió a disminuir con la adición de aceite (p=0.07) (Tabla 5.13). Se presentó efecto residual del tratamiento con 0% y 2% de adición de aceite sobre el consumo de forraje (p<0.05). El tratamiento al 2% redujo lo el consumo de forraje en el período siguiente a su aplicación, contrario al tratamiento sin adición de aceite (0%). 213 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.13. Consumo de forraje, producción, composición y perfil de ácidos grasos de la leche en el sistema lechería tropical SSPi. Variable 0% Adición de aceite 2% 4% Tratamiento p< Carry 0% Carry 2% Consumo de Forraje Kg MS /animal /día 14.65 11.80 12.35 0.0732 0.0272 0.0294 Leche L/día 18.71 18.70 19.49 0.3994 0.3232 0.0712 Grasa % 4.47a 3.79b 3.94b 0.0025 0.0405 0.8819 Proteína % 3.09 3.18 3.23 0.2288 0.2378 0.0495 Sólidos Totales % 12.85a 12.30b 12.48b 0.0219 0.2071 0.1732 Lactosa (%) 4.57 4.56 4.58 0.8068 0.7987 0.7565 MUN (mg/dl) 20.34a 13.83b 13.76b 0.0036 0.0205 0.8191 Grasa (Kg/día) 0.88a 0.75b 0.83ab 0.0152 0.0054 0.0388 Proteína(Kg/día) 0.58ab 0.56b 0.65a 0.0448 0.0396 0.0049 Sólidos Totales (Kg/día) 2.49 2.36 2.57 0.1828 0.0410 0.0175 g de AG /100 g de AG Total medido en leche C6:0 1.69a 1.47b 1.20c <0.0001 0.2413 0.2251 C8:0 1.01a 0.85b 0.69c <0.0001 0.3098 0.1908 C10:0 2.17a 1.62b 1.50b 0.0025 0.5326 0.1450 C11:0 0.26a 0.20b 0.17b 0.0008 0.9921 0.5404 C12:0 3.06a 2.35b 2.17b 0.0012 0.2836 0.2936 C13:0 0.00 0.00 0.01 0.0643 0.9483 0.0423 C14:0 12.06a 9.72b 8.61b 0.0002 0.6222 0.2620 C14:1 c9 0.99a 0.86ab 0.77b 0.0181 0.8067 0.7188 C16:0 27.25a 20.83b 17.92b <0.0001 0.4041 0.7049 C16:1 c9 1.32a 1.17ab 0.80b 0.0177 0.3884 0.1878 C17:0 0.68a 0.63a 0.55b 0.0005 0.0635 0.2739 C17:1 c10 0.26a 0.25a 0.19b 0.0005 0.0041 0.2460 C18:0 12.37 13.64 14.23 0.2429 0.6747 0.5590 C18:1 c9 23.85b 26.80a 25.57ab 0.0039 0.0255 0.0028 C18:1 t11(TVA) 6.52c 9.98b 14.54a <0.0001 0.7308 0.6601 C18:2 c9,12 1.46b 2.12a 1.97a <0.0001 0.0005 0.0819 C18:2 c9t11(CLA) 1.26c 2.05b 2.92a <0.0001 0.5063 0.5210 C18:2 t9,12 0.19b 0.25a 0.27a 0.0026 0.9678 0.0153 C18:3 c9,12,15 0.51a 0.49a 0.35b 0.0059 0.0409 0.7959 C20:0 0.29 0.32 0.31 0.2801 0.5230 0.0589 C20:1 c11 0.11b 0.12a 0.11ab 0.0466 0.0026 0.0882 Sumatorias Saturados 61.28a 51.92b 47.86b <0.0001 0.2063 0.3266 Insaturados 38.72b 48.08a 52.14a <0.0001 0.2063 0.3266 Monoinsaturados 34.38b 42.55a 45.97a <0.0001 0.2305 0.3411 Poliinsaturados 4.19b 5.60a 6.26a <0.0001 0.0873 0.7719 Omega 3 (n3) 0.72a 0.53b 0.46b 0.0010 0.5663 0.6782 Omega 6 (n6) 2.13b 2.92a 2.72a <0.0001 0.0002 0.5376 Relación n6/n3 3.70b 5.07ab 6.07a 0.0028 0.7613 0.3640 C10 a C16 48.03a 37.06b 31.81b <0.0001 0.4037 0.9675 Trans C18:1 8.47c 13.27b 16.73a <0.0001 0.5641 0.2017 Aterogénicos 42.55a 33.00b 28.42b <0.0001 0.4433 0.9563 Índice de Aterogenicidad 2.10a 1.29b 1.01b <0.0001 0.3499 0.9787 Valores con letras diferentes en la misma fila difieren significativamente entre tratamientos (p< 0.05). Omega 3 = C18:3 c9,12,15; C20:3 c11,14,17; C20:5 c5,8,11,14,17 . Omega 6 = C18:2 t9,12; C18:2 c9,12; C18:3 c6,9,12; C18:2 c10,t12; C18:2 t10,c12; C20:3 c8,11,14; C20:4 c5,8,11,14; C22:2 c13,16. Aterogénicos = C12:0, C14:0, C16:0. Índice de Aterogenicidad = C12+4C14+C16/AG Insaturados 214 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Producción y composición de la leche La producción de leche, el % de Proteína y lactosa de la leche, no fueron afectadas por el consumo de aceite (p>0.05) (Tabla 5.13). Se presentó efecto residual del tratamiento con 2% de adición de aceite para proteína (p<0.05), aumentándola en el periodo siguiente a su aplicación. La adición de aceite de girasol disminuyó el % de grasa (p<0.05), sólidos totales de la leche (p<0.05) y MUN (p<0.05), con efecto residual del tratamiento sin adición de aceite, sobre el % de grasa y MUN (p<0.05), que aumenta estas dos variables en el periodo siguiente a su aplicación. Sin embargo, la producción de grasa (Kg/animal/d) y de proteína solo disminuyó (p<0.05) con el nivel de suplementación del 2% y la producción de sólidos totales (Kg/animal/d) no se vió afectada (p> 0.05) con ningún nivel de suplementación. Perfil de ácidos grasos La proporción de CLA-c9t11 (p<0.0001), ATV (p<0,0001), ácido linoleico (p<0.0001), ácido oleico (p<0,05), aumentaron en la grasa láctea con la adición de aceite de girasol (Tabla 5.13) y la del ácido linolénico disminuyó (p<0.05). La proporción de ácidos láurico (p<0.0012), mirístico (p<0.0002) y palmítico (p<0.0001) disminuyó, con la suplementación con aceite de girasol. Se observó tambien una disminución en la proporción de los AG saturados (p<0.0001), AG C10 a C16 (p<0.0001), de los AG potencialmente aterogénico (p<0.0001) y un aumento en la proporción de los AG insaturados (p<0,0001), tanto los monoinsaturados (p<0.0001), como los poliinsaturados (p<0.0001), lo que se vio reflejado en un menor índice de aterogenicidad (p<0.0001). 215 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias La disminución de linolénico, conllevó a una reducción en los omega 3 (p<0.0010) y un aumento en la relación n6/n3 (p<0.0028). El aumento en ATV con la suplementación con aceite de girasol, ocasionó un aumento en el total de trans C18:1 (p<0.0001), donde la mayor participación fue de ATV y la proporción restante de C18:1 t9. Se presentó efecto residual del tratamiento sin adición de aceite que disminuyó la proporción de ácidos oleico, linoleico y aumentó la proporción de ácido linolénico (p<0.05) en el periodo siguiente a su aplicación, contrario al tratamiento con 2% de adición que aumento la proporción de ácidos oleico (p<0.05) tendio a aumentar linoleico (p=0.08) y no presentó ningún efecto sobre la proporción de ácido linolénico (p>0.05) en el periodo siguiente a su aplicación. Ensayo 3. Sistema Doble Propósito SSPi Consumo El concentrado adicionado con aceite, fue consumido en su totalidad por las vacas, la proporción forraje:concentrado fue de 83:17 y con base en los aforos, la proporción gramínea:leucaena fue de 80:20, lo que corresponde a un 16,6% de la dieta en leucaena. El consumo estimado de grasa y AG oleico, linoleico y linolénico se presenta en la Tabla 5.14. 216 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.14. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día) a partir del consumo total utilizando cromo como marcador, en los diferentes tratamientos en el sistema doble propósito sistema silvopastoril intensivo SSPi. Consumo Grasa Sistema/Finca DPSSPi 1 Tratamiento Consumo AG Kg/a/d Kg/a/d Grasa % MS1 Aceite Kg/a/d Aceite % MS1 Oleico Linoleico Linolénico 0% 0.269 2.22 0.000 0.000 0.0169 0.0418 0.0859 2% 0.414 4.28 0.200 2.070 0.0710 0.1596 0.0657 4% 0.605 6.53 0.400 4.320 0.1272 0.2848 0.0623 % de la MS total consumida. El consumo de forraje, tendió a disminuir con la adición de aceite (p=0.06) (Tabla 5.15). 217 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.15. Consumo de forraje, producción, composición y perfil de ácidos grasos de la leche en el sistema doble propósito sistema silvopastoril intensivo SSPi. Variable 0% Adición de aceite 2% 4% Tratamiento p< Carry 0% Carry 2% Consumo de Forraje Kg MS /animal /día 10.29 7.86 7.47 0.0669 0.4787 0.0542 Leche lts/día 10.50 10.93 11.33 0.3120 0.7117 0.8482 Grasa % 3.69ab 4.27a 3.51b 0.0087 0.0082 0.1743 Proteína % 3.28 3.23 3.16 0.3588 0.8520 0.3944 Sólidos Totales % 12.50ab 12.99a 12.14b 0.0044 0.0100 0.1522 Lactosa (%) 4.81 4.89 4.86 0.3692 0.1497 0.4667 MUN (mg/dl) 20.40ab 21.14a 18.28b 0.0550 0.2107 0.8149 Grasa (Kg/día) 0.31ab 0.39a 0.30b 0.0412 0.0263 0.0894 Proteína(Kg/día) 0.33 0.33 0.34 0.8600 0.8336 0.4334 Sólidos Totales (Kg/día) 1.38 1.51 1.43 0.3701 0.3075 0.2424 g de AG /100 g de AG Total medido C6:0 1.74a 1.57a 1.09b 0.0022 0.5752 0.2855 C8:0 1.26a 1.02a 0.69b 0.0005 0.9912 0.2367 C10:0 2.75a 1.95b 1.13c <0.0001 0.9201 0.0458 C11:0 0.41 0.20 0.32 0.0678 0.0533 0.2318 C12:0 0.54a 0.43b 0.34 <0.0001 0.9153 0.0677 C13:0 0.05 0.04 0.10 0.3837 0.5352 0.4460 C14:0 14.82a 11.96b 7.91c <0.0001 0.2421 0.0555 C14:1 c9 1.65a 1.12b 0.76c <0.0001 0.9659 0.0020 C16:0 31.91a 25.72b 15.67c <0.0001 0.0026 0.0007 C16:1 c9 1.85a 1.25b 0.87b 0.0002 0.3781 0.0543 C17:0 1.07a 1.00a 0.75b 0.0001 0.2021 0.0695 C17:1 c10 0.46a 0.37b 0.27c <0.0001 0.3268 0.0436 C18:0 8.59b 13.73a 14.50a 0.0002 0.9151 0.1290 C18:1 c9 22.50b 29.34a 33.90a 0.0015 0.9841 0.5085 C18:1 t11(TVA) 4.49b 4.32b 12.08a <0.0001 <0.0001 <0.0001 C18:2 c9,12 0.99b 1.15b 1.51a 0.0002 0.4560 0.3765 C18:2 c9t11(CLA) 1.16b 1.05b 2.60a <0.0001 <0.0001 <0.0001 C18:2 t9,12 0.26b 0.36a 0.40a 0.0046 0.4868 0.6580 a ab C18:3 c9,12,15 0.63 0.53 0.50 0.0251 0.5959 0.4918 C20:0 0.41 0.41 0.36 0.2455 0.5476 0.3539 Sumatorias Saturados 64.00a 58.14a 43.59b <0.0001 0.0457 0.0244 Insaturados 36.00b 41.86b 56.41a <0.0001 0.0457 0.0244 Monoinsaturados 31.67b 37.56b 50.17a <0.0001 0.0754 0.0359 Poliinsaturados 4.27b 4.35b 6.24a <0.0001 0.0011 0.0014 Omega 3 (n3) 1.11a 0.92ab 0.81b 0.0317 0.7192 0.3317 Omega 6 (n6) 1.97b 2.16b 2.57a 0.0017 0.4615 0.3034 Relación n6/n3 1.86b 2.16b 3.25a 0.0002 0.1288 0.0472 C10 a C16 53.28a 42.93b 27.12c <0.0001 0.0137 0.0020 Trans C18:1 5.23b 5.19b 14.38a <0.0001 <0.0001 <0.0001 Aterogénicos 47.21a 38.18b 23.88c <0.0001 0.0062 0.0012 a b Índice de Aterogenicidad 2.85 1.78 0.60c <0.0001 0.1643 0.0013 Valores con letras diferentes en la misma fila difieren significativamente entre tratamientos (p< 0.05). Omega 3 = C18:3 c9,12,15; C20:3 c11,14,17; C20:5 c5,8,11,14,17 . Omega 6 = C18:2 t9,12; C18:2 c9,12; C18:3 c6,9,12; C18:2 c10,t12; C18:2 t10,c12; C20:3 c8,11,14; C20:4 c5,8,11,14; C22:2 c13,16. Aterogénicos = C12:0, C14:0, C16:0. Índice de Aterogenicidad = C12+4C14+C16/AG Insaturados 218 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Producción y composición de la leche La producción de leche, el % de Proteína y lactosa de la leche, no fueron afectadas por el tratamiento (p>0.05) (Tabla 5.15). El % de grasa, la producción de grasa (Kg/animal/día) y el % de sólidos totales de la leche con respecto al tratamiento testigo (0%) no fueron afectados por la adición de aceite. Las diferencias se presentan entre los tratamientos con adición de aceite, el tratamiento con adición de aceite al 4% del consumo de MS, disminuyó el % de grasa (p<0.0087), la producción de grasa (Kg/animal/día) (p<0,0412), sólidos totales de la leche (p<0.0044), con respecto al tratamiento con adición al 2%. No obstante, la producción de sólidos totales (Kg/animal/d) no se vió afectada (p> 0.05) con ningún nivel de suplementación. Igual situación presentó el MUN, el cual tendió (p=0.05) a disminur con la adición de aceite al 4%, respecto a la adición de aceite al 2%. Perfil de ácidos grasos La proporción de CLA-c9t11 (p<0.0001), ATV (p<0.0001), ácido linoleico (p<0.0002), ácido oleico (p<0.0015), aumentaron en la grasa láctea con la adición de aceite de girasol (Tabla 5.15), mientras que la de ácido linolénico disminuyó (p<0.05). Con la suplementación con aceite de girasol, la proporción de ácidos láurico (p<0.0001), mirístico (p<0.0001) y palmítico (p<0,0001) disminuyó en la grasa láctea. Se observó tambien a una disminución en la proporción de los AG saturados (p<0.0001), de ácidos C10 a C16 (p<0.0001), de los AG potencialmente aterogénicos (p<0.0001) y un aumento en la proporción de de los AG insaturados (p<0.0001), tanto 219 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias los monoinsaturados (p<0.0001), como los poliinsaturados (p<0.0001), lo que se ve reflejado en un menor índice de aterogenicidad (p<0.0001). La disminución de ácido linolénico, conllevo a una reducción en los omega 3 (p<.05) y un aumento en la relación n6/n3 (p<0.0002). El aumento en ATV con la suplementación con aceite de girasol, ocasionó un aumento en el total de trans C18:1 (p<0.0001), donde la mayor participación fue de ATV y la proporción restante de C18:1 t9. Se presentó efecto residual del tratamiento sin adición de aceite y del tratamiento con 2% de adición sobre la proporción del ácido palmítico (p<0.0026), ATV, CLA-c9t11 (p<0.0001), la proporción de AG saturados, de AG insaturados, de ácidos C10 a C16, de ácidos Trans C18:1 y de ácidos potencialmente aterogénicos y del tratamiento con 2% de adición, sobre la relación n6/n3 e índice de aterogenicidad que aumentó la relación n6/n3 y redujo el índice de aterogenicidad en el periodo siguiente a su aplicación. Análisis económico El aceite de girasol utilizado tuvo un costo de 3921.42 $/litro. En el sistema DPSSPi, donde las vacas no reciben ningún tipo de suplementación, para adicionar el aceite se hizo necesario el uso de concentrado y por tanto también se incurrió en este costo. El análisis económico nos muestra, que cuando no se da un precio de venta al litro de leche diferencial, acorde con su contenido de CLA-C9t11, sino que solo se tiene en 220 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias cuenta como utilidad, la tasa de referencia ofrecida por el sistema financiero (TIBA) y los litros de leche producidos, la relación beneficio costo es baja, ingresando entre $ 0.21 a $1.56 por cada peso invertido. Adicionalmente, en el sistema LTSSPi, con un nivel de suplementación de aceite al 2% de la MS, esta relación es negativa, dado que el ingreso neto diario con este tratamiento es menor que el obtenido sin adición de aceite por una menor producción de leche y un costo adicional del aceite, con respecto al tratamiento sin adición (Tabla 5.16). 221 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.16. Análisis económico sin precio de venta del litro de leche diferencial por contenido de CLA Sistema Modelo LT LTSSPi DPSSPi Aceite g/día (1) Costo Variable Precio aceite $/día (2) Costo /L $/L (4= 2/3) Precio actual de vta sin aceite $/L (5) Precio de venta + Costo aceite (6= 4+5) Produccion Leche L/d (3) *TIBA $ (7) Precio Venta sugerido $/L (8= 6 + 7) Ingreso Bruto diario $ (9=8* 3) Ingreso Neto diario $ (10 = 9- 2) Ingreso Adicional $ (11) Egreso Adicional $ ( 12= 2) Relación Beneficio Costo (13 =11/12) 0 0.00 11.60 0 1,130 1,130.00 0.000 1,130.00 13,108.00 13,108.00 0.00 0.00 0.00 250 980.36 12.95 75.70 1,130 1,205.70 0.023 1,205.73 15,614.15 14,633.80 1,525.80 980.36 1.56 500 1,960.71 11.96 163.94 1,130 1,293.94 0.050 1,293.99 15,476.11 13,515.40 407.40 1,960.71 0.21 0 0.00 18.71 0.00 1,100 1,100.00 0.000 1,100.00 20,581.00 20,581.00 0.00 0.00 0.00 324 1,270.54 18.66 68.09 1,100 1,168.09 0.021 1,168.11 21,796.93 20,526.39 -54.61 1,270.54 -0.04 650 2,548.92 19.49 130.78 1,100 1,230.78 0.040 1,230.78 23,987.92 21,439.00 858.00 2,548.92 0.34 0 0.00 10.50 0.00 1,115 1,115.00 0.000 1,115.00 11,707.50 11,707.50 0.00 0.00 0.00 200 2,054.08 10.93 187.93 1,115 1,302.93 0.057 1,302.99 14,241.66 12,187.58 480.08 2,054.08 0.23 400 2,838.37 11.33 250.52 1,115 1,365.52 0.077 1,365.59 15,472.19 12,633.82 926.32 2,838.37 0.33 Costo litro de aceite = $3921.42 Tasa de interés bancario anual TIBA = 11% *TIBA $ = columna4 x (0.11/360 días) 222 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Con un precio de venta del litro de leche diferencial, proporcional con su contenido de CLA-C9t11 (Tabla 5.17), razón por la cual se hace la inversión en el aceite, la relación beneficio costo sube, ingresando entre $3.46 a $10.43 por cada peso invertido, con una mayor relación para el tratamiento con suplementación de aceite al 2% de la MS en el sistema LT y al 4% de la MS, en los sistema LTSSPi y DPSSPi. En este último, la suplementación con aceite al 2% no mejoró el contenido de CLA y la relación beneficio costo fue negativa a este nivel. Con excepción a este caso, los datos están indicando que para recuperar la inversión realizada y obtener mayores ingresos por la suplementación con aceite de girasol, es necesario mercadear la leche con un precio diferencial acorde a su contenido de CLA-c9t11. 223 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Tabla 5.17. Análisis económico con precio de venta del litro de leche diferencial por contenido de CLA Cálculo del estudio CLA c9t11 Sistema Modelo LT LTSSPi DPSSPi Finca San Felipe Asturias Pradera con aceite y concentrado Aceite g/día (1) Costo Variable Precio aceite/día (2) Producción Leche L/d (3) CLA % (16) Precio de venta litro diferencial por CLA (17) Total Ingreso Total Ingreso Bruto Neto diferencial diferencial por CLA por CLA (18= 3*17) (19=18-2) 0 0.00 11.60 1.39 1,130.00 13,108.00 250 980.36 12.95 1.92 1,563.99 500 1,960.71 11.96 2.24 0 0.00 18.71 324 1,270.54 650 Ingreso adicional (20) Egreso Adicional (2) Relación Beneficio Costo (21 =20/2) 13,108.00 0.00 0.00 0.00 20,253.64 19,273.29 6,165.29 980.36 6.29 1,826.42 21,843.98 19,883.27 6,775.27 1,960.71 3.46 1.26 1,100.00 20,581.00 20,581.00 0.00 0.00 0.00 18.66 2.05 1,792.47 33,447.42 32,176.88 11,595.88 1,270.54 9.13 2,548.92 19.49 2.92 2,551.35 49,725.86 47,176.94 26,595.94 2,548.92 10.43 0 0.00 10.50 1.16 1,115.00 11,707.50 11,707.50 0.00 0.00 0.00 200 2,054.08 10.93 1.05 1,012.38 11,065.30 9,011.21 -2,696.29 2,054.08 -1.31 400 2,838.37 11.33 2.60 2,497.60 28,297.85 25,459.48 13,751.98 2,838.37 4.85 Precio venta diferencial por CLA (17) = CLA % con suplementación con aceite X precio actual (sin suplementación con aceite) / CLA % sin suplementación con aceite.(ej: Un litro de leche con 1.39% de CLA.c9t11 vale $1,130; proporcionalmente con 1.92 % de CLA-c9t11 tendrá un valor de $1,563 (1.92% x $1,130/1.39% =1,563 $/L)) 224 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias DISCUSIÓN Consumo de forraje Muchos autores han sugerido que el consumo es la variable más importante que determina el desempeño del animal como el factor determinante de la cantidad de nutrientes que pueden ser absorbidos (Illius, 1998). En el presente estudio, el consumo de forraje en los tratamientos sin adición de aceite de girasol estuvo entre 10,29 y 14,65 Kg MS/animal/día cuando se determinó con cromo como marcador externo. La capacidad de predicción de la producción de heces con marcadores externos, depende del porcentaje de recuperación de estos en las heces (Mir et al., 1989). En este trabajo utilizamos el porcentaje de recuperación de cromo, obtenido en Colombia, por Correa et al., (2009), sin embargo es posible que nuestro porcentaje de recuperación haya sido diferente, lo que estaría ocasionando alguna imprecisión en el valor de consumo presentado. No obstante, para estimar el consumo utilizando cromo, como marcador externo, se manejó la misma metodología en todos los animales en cada sistema, por lo que la técnica permitió conocer el consumo de forraje bajo pastoreo y evaluar el efecto del tratamiento sobre este. A pesar que se han ideado diferentes técnicas que permiten estimar el consumo de MS en animales bajo pastoreo, que se han publicado en diferentes revisiones y trabajos (Chávez et al., 1981, Cordova et al., 1978, Lippke 2002, Mejía 2002, Souza et al., 2014), todos los autores coinciden en que ningún método desarrollado hasta el presente, cuantifica con exactitud el consumo de forraje por rumiantes bajo condiciones de pastoreo. El consumo de forraje no fue afectado por la adición de aceite en el sistema LT, aunque tendió a disminuir con la adición de aceite, en los sistemas LTSSPi y DPSSPi. La respuesta sobre el consumo con la adición de aceites ha sido variable. El consumo no fue afectado, en los estudios con suplementación con aceite de soya al 3.6 o 4% 225 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias (Dhiman et al., 2000) o aceite maíz, palma o cártamo alto en oleico, a nivel del 5% (He y Armentano, 2011), mientras que el consumo fue afectado, suplementando con aceite de soya al 2% (Boerman y Lock, 2014). La reducción en el consumo de MS atribuido a un se ha efecto hipofágico de los AG insaturados, que causan señales de saciedad tales como una reducción en el tamaño de la comida, frecuencia de las comidas, o una combinación de los dos (Allen, 2000). No obstante, el efecto de la suplementación con grasa sobre el consumo, esta influenciado por el grado de saturación de los ácidos grasos presentes en la dieta y a la cantidad consumida (Drackley y Elliott, 1993; Bu et al. 2007). Estos efectos fueron propios de cada sistema, lo que pudo haber ocasionado las diferencias en la respuesta al consumo en los sistemas de este trabajo. La tendencia en la disminución del consumo, observada en los tratamientos con adición de aceite en los sistemas LTSSPi y DPSSPi, no se vió reflejada en una disminución en la producción de leche, debido posiblemente a una mayor densidad energética en la ración por la adición del aceite (Weiss et al., 2011) y por lo tanto un consumo similar de energía y/o a una mayor eficiencia de la alimentación (Boerman y Lock, 2014). Los AG del suplemento podrían haber sido utilizados como fuente de energía para tejidos, así como precursores para la formación de AG preformados en la grasa de la leche. Adicionalmente, en estos tratamientos se presentó una disminución de los AG C10 a C16, con respecto al tratamiento sin adición de aceite. Entonces, la reducción en la síntesis de novo llevaría a reducir el requisito de NADPH a partir de la vía de las pentosa fosfato, que se produce por oxidación de la glucosa (Bauman y Davis, 1975), por lo tanto, la reducción de la síntesis de novo en la glándula mamaria llevaría a una reducción en la demanda de acetato y de glucosa para la síntesis de grasa, y así, esta glucosa podría entonces ser utilizada por otros tejidos o para más síntesis de lactosa, regulador osmótico de leche, resultando en producción de leche. 226 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias Producción y composición de la leche La producción de leche no fue afectada por la suplementación con aceite de girasol, en ninguno de los sistemas evaluados. Estos resultados son consistentes con los hallados por Schoeder et al. (2004) quienes informan que en la mayoría de estudios analizados, la suplementación con AG insaturados no aumenta significativamente la producción de leche en vacas bajo pastoreo. Igual resultado se encontró en experimentos en estabulación (Gagliostro y Chilliard, 1992). Sin embargo Aprianita et al. (2014) y (Boerman y Lock, 2014), reportaron un aumento en la producción de leche cuando suplementaron con aceite como fuente de AG insaturados, por un mejoramiento en la eficiencia de utilización de la energía y por el efecto de ahorro de glucosa de los AG, ocasionada por una disminución en la síntesis de novo en glándula mamaria. La concentración de proteína no fue afectada por la suplementación con aceite de girasol, en ninguno de los sistemas evaluados. Los resultados de estudios con vacas bajo pastoreo sugieren que la concentración de proteína generalmente no es afectada por la suplementación con grasa (Schoeder et al. 2004). La falta de efecto de la dieta con aceite de girasol, sobre las concentraciones de proteína de leche observado en nuestro experimento es consistente con los hallazgos de Rego et al. (2009) con animales bajo pastoreo y con los de Aprianita et al. (2014) para el caso de los SSPi. Asimismo, como la producción de leche no se aumentó, el efecto de dilución en la concentración de proteína reportado por otros autores (Schoeder et al. 2004; Boerman y Lock, 2014) no se presentó. La concentración de lactosa no fue afectada por la suplementación con aceite de girasol, en ninguno de los sistemas evaluados. Resultados que están de acuerdo con los obtenidos por Cruz- Hernández et al. (2007), Benchaar et al. (2012), Aprianita et al. (2014). La concentración de lactosa en la leche es notablemente constante debido a 227 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias sus propiedades osmóticamente activas (Sutton, 1988). En nuestro trabajo, el efecto mínimo de la suplementación con aceite de girasol sobre el rendimiento y la concentración de lactosa también podría estar relacionado con que el consumo de alimento no fue afectado en el sistema LT y en los SSPi donde se presentó una tendencia a disminuir el consumo de forraje, esta respuesta puede estar relacionada con la mayor eficiencia de utilización de la energía (ahorro de glucosa por los AG) descrita previamente para producción de leche En el sistema LTSSPi, en los tratamientos con 2% (324 g de aceite) y 4% (650 g de aceite) de aceite suplementado, se presentó una disminución en la concentración de grasa en la leche lo que provocó una disminución en la concentración de los sólidos totales sin efecto sobre la concentración de proteína y lactosa o la producción de leche. El aceite suplementario disminuyó la concentración en la leche de los AG procedentes de síntesis de novo (C8:0 a C14:0 y la mitad del C16:0) con un aumento concomitante en la concentración de los AG preformados de 18 átomos de C a excepción del ácido linolénico en comparación con el tratamiento sin adición de aceite. Estas, características resultan propias del llamado síndrome de bajo contenido de grasa en leche comúnmente conocido como “Depresión de Grasa en Leche (MFD)”. Este fenómeno es en general observado en vacas alimentadas con suplementos que contienen aceite vegetal o de pescado (Bauman y Griinari, 2001). Clásicamente, MFD representa una depresión en el contenido graso de la leche sin producir ningún cambio en el rendimiento de leche ni en sus otros componentes (Bauman et al., 2011). Por lo general causa una reducción en la producción de los AG sintetizados de novo y preformados presentes en la leche, debido a la regulación coordinada de enzimas asociadas con la síntesis de lípidos en la glándula mamaria (Peterson et al., 2003; Harvatine y Bauman, 2011). El efecto de la sustitución de AG preformados por AG de novo en la leche fue reportado por He y Armentano (2011) y He et al., (2012), quienes informaron que la reducción en la producción de AG de novo en la leche resulta a veces 228 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias compensada por un aumento en la captura de los AG preformados cuando se alimentó con suplementos altos en grasa a vacas lecheras. En El sistema LTSSPi, a diferencia de los sistemas LT y DPSSPi, la cantidad de concentrado consumida fue mayor (5.18 vs 3.0 y 1.8 kg MS/animal/día, respectivamente) y la relación forraje: concentrado estimada fue de 71:29 vs 80:20 y 83:17. Cruz-Hernández et al. (2007), reportan que a mayor cantidad de concentrado y aceite, la producción de C18:1 t10 es mayor. El síndrome MFD, está asociado con un aumento en la concentración en la leche de intermediarios de la biohidrogenación como C18:1 t10 y el CLA t10c12 estando este último isómero estrechamente asociado a una inhibición de la síntesis de novo en la glándula mamaria (Bauman et al., 2011). En el presente estudio, no se determinó la concentración de C18:1 t10 y el CLA t10c12 no fue detectado en las muestras de leche analizadas lo que no permite sacar conclusiones firmes. El nitrógeno uréico en leche (MUN), fue menor para la suplementación con aceite (al 2 y 4%) en el sistema LTSSPi y tendió a disminuir con la suplementación al 4% con respecto al 2% en el sistema DPSSPi. Nuestros resultados, están de acuerdo con los de Stoffel et al. (2015), quienes encontraron una disminución en el MUN en la leche de vacas suplementadas con diferentes aceites al compararlas con dietas sin suplementación con aceite, siendo el tratamiento con ácido linoleico el que presentó el menor MUN con respecto a la suplementación con ácido oleico o palma. Los AG insaturados (Jenkins, 1993; Pantoja et al., 1994) y los taninos condensados (Carulla et al., 2005) tienen un efecto similar inhibiendo los microorganismos del rumen y decreciendo la digestibildad de la materia organica. Los taninos condensados son capaces de formar complejos estables con las proteínas (Barry y McNabb, 1999). Los resultados obtenidos sugieren, que el efecto conjunto de AG insaturados y taninos condensados presentes en la leucaena de los sistemas SSPi, haya limitado la 229 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias degradación de las proteínas en el rumen, disminuyendo la producción de amoniaco. No obstante esta proteína pudo ser absorbida en el intestino, razón por la cual la concentración y producción de proteína en la leche no se vio afectada. La menor producción de amoniaco por el empleo de AG insaturados y taninos, sugiere menores requerimientos de energía para detoxificar excesos de amoniaco. Perfil de ácidos grasos El aumento lineal observado en CLA-c9t11 y ATV, puede explicarse por un mayor consumo de ácido linoleico contenido en el aceite de girasol. Como ya fue comentado, el ácido linoleico sufre una biohidrogenación ruminal con producción del ATV. Posteriormente, parte de este ATV resulta desaturado por la enzima Delta 9-desaturasa en glándula mamaria dando lugar a la producción del CLA-c9t11 y ATV en la leche. En nuestro estudio in vitro realizado previamente, la adición de aceite de girasol a sustratos representativos de estas fincas aumentó la proporción de ATV, lo que resulta compatible con los resultados obtenidos en la fase de campo. No obstante, el aumento de CLA-c9t11 y ATV en la leche, entre tratamientos fue diferente en cada sistema, debido posiblemente a la diferencia en cantidades de aceite suministradas y a su interacción con la dieta basal consumida. El aceite de girasol utilizado presentó una buena proporción de ácido linoleico (63.32%) y de ácido oleico (28.32%) (Tabla 5.8). En todos los sistemas y de acuerdo a lo esperado, el ácido linolénico se presentó en mayor proporción en los forrajes, seguido del ácido linoleico (Tabla 5.4, 5.5, 5.7). Los concentrados presentaron diferencias en su contenido de ácido linoleico. En los sistema LT y LTSSPi, el contenido de ácido linoleico en el concentrado resultó superior con valores de 43.5 y 42% respectivamente (Tablas 5.4 y 5.5), mientras que en el sistema DPSSPi, este ácido graso fue bajo en el 230 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias concentrado (12.3%), presentando una mayor proporción el ácido láurico (33.7%) (Tabla 5.7), que influyó en un menor consumo de ácido linoleico en este sistema con respecto a los sistemas LT y LTSSPi (Tablas 5.10, 5.12 y 5.14) y que esta relacionado con los menores valores de CLA-c9t11 en la grasa láctea para el sistema DPSSPi. La suplementación con aceite de girasol, aumentó en todos los sistemas analizados la proporción de ácido oleico en la grasa láctea. En este estudio se utilizó aceite comercial de girasol, que presentó una alta proporción AG linoleico C18:2 c9,12 (63.32 %), pero también una proporción considerable de AG oleico C18:1 c9 (28.32%), que pudo escapar a la biohidrogenación y ocasionar esta respuesta. Una situación similar pudo haberse presentado para el ácido linoleico en la grasa láctea en el sistema LTSSPi para los niveles de suplementación del 2 y 4% y en esistema DPSSPi a nivel de suplementación del 4%. El principal n-3 en la grasa de la leche es el ácido linolénico (Ferlay et al., 2013), ácido graso presente mayoritariamente en los forrajes y en el aceite de lino. La suplementación con aceite disminuyó la proporción de este ácido en la leche, en el sistema LT para ambos niveles de aporte de aceite (2 y 4%) y en los sistemas LTSSPi y DPSSPi (ambos del SSPi), solo cuando el nivel de suplementación fue del 4%. Estos resultados explican el aumento en la relación n6/n3, que en el caso de los sistemas LT y DPSSPi se mantuvo por debajo de 5:1 y para el sistema LTSSPi llegó a 5:1 y 6:1 cuando los niveles de aporte fueron del 2 y 4% respectivamente. Se ha postulado una relación n6/n3 menor de 5:1 como favorable para la salud humana (World Health Organization, 2003). La suplementación con aceite de girasol disminuyó la presencia en leche de los ácidos pro-aterogénicos (C12:0, C14:0 y C16:0) en todos los sistemas. La disminución de 231 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias estos ácidos grasos y el aumento de los AG insaturados, permiten obtener un menor índice de aterogenicidad lo que resulta favorable a la salud humana. Efecto residual Cuando se realizan cuadrados latinos donde las filas son individuos y las columnas períodos, se presume que el individuo puede estar afectado por el tratamiento aplicado anteriormente. Este efecto residual (secuelas del tratamiento previo o efecto carry) puede ser detectado utilizando una modificación al cuadrado latino denominado “cross over” o de reversión, propuesto por Cochran et al., (1941), como una necesidad de experimentación en ganado lechero y es muy útil cuando no es posible garantizar un adecuado período de descanso entre la aplicación de tratamientos. Boerman y Lock (2014), evaluaron aceite de soya al 2% de la MS en períodos de 21 días con muestreo a partir de los 18 días sin efectos residuales detectables entre tratamientos. Benchar et al., (2012), evaluaron aceite de lino a nivel de 2,3 o 4% de la MS por periodos de 28 días, sin efectos residuales. En nuestro estudio utilizando periodos de 21 días con muestreos de leche a partir de los 15 días, se presentó efecto residual para algunas variables, constituyéndose en un acierto el modelo estadístico utilizado, ya que este realizó un ajuste por efectos residuales, evitando cometer un error en el análisis de los datos (Cerón et al., 2013). Análisis económico Con el análisis económico que incluyó un precio diferencial para el pago de la leche con mejor contenido de CLA-c9t11, se obtuvieron mejores resultados. Esto indica que el uso de esta tecnología se vería retribuido si la leche se vende con un precio diferencial, así leche con un mayor contenido de CLA-c9t11 permitirá cubrir el requerimiento necesario para obtener los beneficios sobre la salud humana. Estudios en animales indican que 232 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias 800 mg/día de CLA-c9t11, podrían ejercer un efecto antitumoral en una persona de unos 70 kg de peso vivo (Watkins y Li, 2003), el efecto preventivo, sería unas diez veces menor al enunciado y los efectos reductores sobre la ateroesclerosis se alcanzarían a partir de consumos diarios cercanos a los 250 mg (Kritchevsky, 2003). El estudio económico presentado se limitó al cálculo de la relación marginal que produce la introducción del aceite en la dieta de los animales y el valor de venta mínimo esperado, de tal forma que no cambió el resto de la estructura de costos del productor ni las condiciones actuales de la comercialización. El cálculo realizado no pretendió medir el precio en la comercialización de la nueva leche rica en CLA-c9t11, ya que esta medición escapa de los alcances de la presente investigación. No obstante, en otro país como Argentina, que ha sacado al mercado leche con alto CLA, mediante la articulación entre INTA con la empresa láctea, aumentan un 25% el precio del litro de esta leche en góndola, con respecto al valor del litro de leche estándar, de acuerdo con el estudio realizado por INTA y la empresa que realiza la transformación y comercialización de la leche (Gagliostro 2015, comunicación personal). En Colombia se necesita este tipo de estudios lo que implica la unión entre conocedores de la tecnología, productores, procesadores y comercializadores. Sin embargo, para conseguir este objetivo, desde el punto de vista de la investigación se deben evaluar otras fuentes de aceites que permitan aumentar CLA-c9t11, como los aceites en crudo que son más económicos que los refinados y los aceites producidos a nivel nacional. CONCLUSIÓN La suplementación alimenticia con aceite de girasol a nivel de inclusión del 2% y 4% de la MS, no afectó la producción de leche, aumentó la proporción de CLA-c9t11, ATV, oleico y linoleico, y disminuyó los ácidos grasos aterogénicos C12:0, C14:0 y C16:0 obteniéndose una leche con mayor cantidad de AG insaturados y menor índice de aterogenicidad, que ofrece potenciales beneficios para la salud humana. En el sistema 233 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias LTSSPi, la suplementación con aceite, disminuyó la proporción de grasa en la leche, este resultado podría aplicarse para la producción de leche con menor contenido de grasa y con mayor calidad de ácidos grasos, la cual podría mercadearse a nichos especiales de mercado. De mercadearse la leche obtenida con un valor diferencial por contenido de CLA-c9t11, un nivel de suplementación de 4% sería el más beneficioso. REFERENCIAS Allen MS. 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Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (Leucaena leucocephala). Para cumplir con estos objetivos resultó necesario conocer previamente como las condiciones alimenticias de estos sistemas impactan sobre la producción de CLA-c9t11, TVA y otros AGCL en la leche, así como la influencia del tipo de forraje utilizado sobre la presencia de los ácidos grasos (CLAc9t11, ATV y otros AGCL), la fermentación ruminal y la producción de metano, mediante técnicas in vitro. De acuerdo a los objetivos propuestos y a los resultados obtenidos es posible llegar a las siguientes conclusiones: 1. De acuerdo a lo esperado, los factores dietarios fueron los principales determinantes de las concentraciones de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en leche mientras que otros factores como el número de partos y el estado de lactación presentaron menor influencia. En los sistemas de producción que ofrecen suplementación con alimentos concentrados y/o subproductos de la agroindustria, la cantidad de suplemento, el contenido y la composición de la grasa determinan la variación en el perfil de AG de la leche, mientras que en fincas que no suplementan y la alimentación es sólamente a base de forraje, la edad del forraje constituye un factor de relevancia. 242 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias 2. Fincas en las que se utiliza como suplemento la semilla de algodón, la proporción de ácido linoleico presente en el alimento no se vio reflejada en las proporciones de CLAc9t11 en la leche, pero si en la proporción de ácido linoleico en la leche y por tanto el uso de semilla no resulta ser la mejor elección cuando se busca aumentar los niveles de CLA-c9t11 en la leche. 3. Puesto que dentro de cada sistema de producción estudiado, las condiciones de alimentación, especialmente en lo que se refiere a la cantidad de suplemento y a la composición de la grasa de los suplementos ofrecidos, fueron similares pero estas varíaron entre sistemas de producción con efectos diferentes sobre los parámetros de interés, se recomienda que cada sistema sea analizado en forma independiente a fines de optimizar los resultados deseados. 4. En todos los forrajes de los sistemas evaluados, el AG que estuvo en mayor proporción fue el ácido linolénico con valores entre 34.8 y 47.3 %. En los suplementos, el ácido linoleico se presentó en mayor proporción, con valores entre 36.2 y 44.8% para los sistemas LT y DP, entre 26 y 28.6 % para las fincas del sistema LTSSPi. Esto llevó a un alto consumo de AG insaturados (entre 55 a 68% del total de grasa consumida), que se vio reflejado en un buen contenido de CLA-c9t11 (para los sistemas LT, DP y DPSSPi), ATV y en un adecuado índice de aterogenicidad, en la leche de las fincas en estudio. Estos resultados sugieren ventajas potenciales para mercadear la leche y sus productos en nichos especiales de mercado con un valor diferencial y potencian la noción de valor agegado en origen (finca) 5. Los estudios in vitro mostraron que el comportamiento de las gramíneas Estrella y Guinea es similar en cuanto a su potencial para generar ATV, linoleico, linolénico, esteárico, parámetros de fermentación y producción de metano. La inclusión de 14 - 16 243 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias % de leucaena en la dieta de vacas, propia de los sistemas silvopastoriles evaluados, aumentó la proporción de ácidos linolénico y linoleico en la dieta, no afectó su BH y conllevó a una mayor producción de ATV (producto de la BH), esteárico, linoleico y linolénico después de la incubación. El aumento en ATV (C18:1 t11) como precursor del CLA (C18:2 c9t11) que se forma en glándula mamaria y la acumulación de ácidos grasos insaturados, se constituye en un buen punto de partida para incorporar este tipo de sistemas silvopastoriles dentro de estrategias que permiten aumentar los ácidos grasos benéficos en la leche en sistemas de producción de ganado doble propósito y de lechería tropical. No obstante, la cantidad de suplemento, el % de grasa y el perfil de AG de los suplementos utilizados pueden afectar los ácidos grasos benéficos en la leche. 6. La adición de aceite de girasol in vitro, a nivel de inclusión del 2 y 4% de la MS, a la dieta de vacas que pastoreaban en solo gramínea de Estrella (Cynodonplectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsusmaximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos con Leucaena (Leucaena leucocephala)), es una herramienta idónea a fines de aumentar la proporción ácido linoleico en la dieta lo que resulta predisponente a obtener una mayor producción de CLA (C18:2 c9t11), ATV (producto de la BH) y ácido linoleico después de la incubación, con respecto a aceite de lino y palma. 7. La inclusión de 14 -16 % de leucaena en la dieta de vacas y la suplementación con aceite (2 y 4% de la MS), no afectaron la cinética de fermentación, el factor de partición (FP), fermentación ruminal (pH, AGV), ni disminuyeron la producción de metano in vitro. Es posible que el bajo nivel de taninos y de aceite empleado en las dietas en evaluación, no haya afectado protozoos, bacterias, hongos y metanógenos del rumen, así como tampoco se afectó el buen funcionamiento ruminal. 244 Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias 8. La suplementación alimenticia con aceite de girasol a nivel de inclusión del 2% y 4% de la MS, en los diferentes sistemas de producción, no afectó el consumo de forraje en el sistema LT y tendió a disminuirlo en los sistemas LTSSPi y DPSSPi, aunque esta tendencia no afectó la la producción de leche. La suplementación alimenticia con aceite de girasol a nivel de inclusión del 2% y 4% de la MS, en los diferentes sistemas de producción, aumentó la proporción de CLA-c9t11, ATV , ácidos oleico y linoleico, y disminuyó los ácidos grasos aterogénicos C12:0, C14:0 y C16:0 obteniéndose una leche con mayor cantidad de AG insaturados y menor índice de aterogenicidad, que ofrece beneficios para la salud humana. En el sistema DPSSPi, la suplementación con aceitede girasol, disminuyó la proporción de grasa en la leche, este resultado podría aplicarse para la producción de leche con menor contenido de grasa y con mayor calidad de ácidos grasos, la cual podría mercadearse a nichos especiales de mercado. 245
