Biología Celular
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Biología Celular La biología celular estudia la composición, estructura y funciones de las células. diferenciación contactos célula-célula proliferación contactos célula-matriz contactos célula-matriz apoptosis crecimiento migración contactos célula-matriz contactos célula-matriz diferenciación video células ... ... .... .... Las células en cultivo pueden examinarse vivas mediante microscopía microscopio invertido lámpara halógena cámara calefaccionada lámpara de mercurio cámara CCD mesa a datos a la computadora ntivib ratori a El empleo de proteínas fluorescentes permite analizar poblaciones celulares, células individuales y subestructuras celulares Ser/Thr65 Tyr66 Gly67 Fluorescencia Empleo de proteínas fluorescentes para visualizar la diferenciación y dinámica morfológica in situ Transfección de retinas enteras Visualización panorámica (b) y detallada (c) de neuronas ganglionares que expresan la GFP. pistola de helio “gen gun” para introducir cDNA codificante de la GFP. dendritas CMV GFP Expresión de GFP en neuronas in situ axón Secuencia temporal ilustrando la remodelación dendrítica de una neurona ganglionar de retina in situ video dinámica dendritas Marrs et al., MCN2006 La manipulación de proteínas fluorescentes permite visualizar la localización, movilidad e interacciones de proteínas foto-activación foto-conversión (cambio de intensidad) (cambio de color) 488 nm 510 nm (quimera) FRET, transferencia de energía por resonancia BiFC, Complementación bimolecular de la fluorescencia interacción emisión donor interacción absorción aceptor superposición video de GTPasas Rho & Cdc42 (Machacek et al, Nature 2009) Wang et al, ARB, 2008 Kerppola, MethCellBiol, 2008 El empleo de proteínas quimeras fluorescentes permite determinar la dinámica de complejos moleculares: dinámica de adhesiones al substrato GFP-paxilina cinética de ensamble y desensamble Fluorescence intensity (A.U. x104) 30 20 10 0 video dinámica de adhesiones (Burdisso & Arregui) 0 5 10 15 Time (min) 20 El empleo de láseres y el desarrollo de quimeras fluorescentes permite estudiar la dinámica de proteínas dentro y entre compartimientos pulso láser UV (400nm) máxima potencia láser (488nm) Fotoactivación de fluorescencia en una variante de GFP Lippincott-Schwartz & Patterson TICB 2009 La microscopía multi-dimensional permite el análisis simultáneo de múltiples componentes celulares Giepmans et al., Science 2006 Adquisición y procesamiento de imágenes en 4 dimensiones serie temporal + varios planos de foco en el eje z. En el ejemplo se muestra el esquema de adquisición de los datos y su posterior procesamiento. Organización de la cromatina durante mitosis visualizada mediante transfeccion de la histona 2B-CFP. Gerlich, Nature 2003 Super-resolución: permite describir procesos biológicos a nivel molecular 1-detección de fluorescentes individuales 2- activación y muestreo controlado de subpoblaciones distintas de fluorescentes en el tiempo Toomre & Bewersdorf, ARCDB 2010 Kanchanawong et al, Nature 2010 Paterson et al, ARCP 2010 La célula contiene una alta densidad de macromoléculas y organelas La concentración de proteínas en el citoplasma es de ~ 300 mg/ml (Zimmerman & Trach, J. Molec. Biol 1991, 222:599) La densidad macromolecular del citosol modula la síntesis, estabildad y dinámica de las proteínas. FRAP revela que Moléculas < 500 daltons difunden libremente en el citosol, la difusión de grandes macromoléculas, como las proteínas es significativamente retardada (Seksek et al J Cell. Biol 1997, 138: 131). Densidad de microtúbulos de interfase en un fibroblasto inmunofluorescencia núcleo C. O. Arregui Densidad de filamentos de actina en la lamela de un keratinocito malla de actina Svitkina et al, JCB 1997 Densidad de túbulos pertenecientes a la red del retículo endoplásmico C. O. Arregui Reconstrucción de una porción del citoplasma de una célula de Dictiostelium discoideum actina en rojo ribosomas en gris membranas en azul Ellis & Minton, Nature 2004 1 1 8 Eucaryotic cell David Goodsell, Scripps Res. Inst. http://mgl.scripps.edu/people/goodsell/ proteínas en azul, DNA/RNA en rosado lípidos en amarillo carbohidratos en verde ribosomas en magenta 8 La estructura y función de las células depende fundamentalmente de las proteínas Alberts et al, MBC 2002 Revisión de algunos conceptos relacionados a las proteínas • El plegado de las proteínas es asistido por chaperonas y ocurre en el citosol o en compartimientos específicos (RE, mitocondrias). • La función de las proteínas depende de su estructura tridimensional. • La estructura tridimensional es determinada por la secuencia de aminoácidos. • Cada proteína adopta una estructura tridimensional única o conformación nativa. • La conformación nativa es la más estable termodinámicamente y se mantiene por múltiples interacciones no covalentes. • Los dominios son partes de una proteína con autonomía estructural y funcional. • La desnaturalización implica la pérdida de la conformación nativa y de la función de la proteína. La función de las proteínas depende de su estructura tridimensional Fosfatasa de tirosina PTP1B Quinasa de tirosina Src Integrina Proteína con un único dominio globular. Proteína con varios dominios globulares. Proteína de transmembrana con un dominio intracelular, transmembrana y extracelular. En la célula el plegado de las proteínas es asistido por chaperonas Las chaperonas son proteínas que interaccionan, estabilizan o ayudan a proteínas no nativas a adquirir su conformación nativa sin estar presentes en la estructura final. Algunas chaperonas (TF, NAC, RAC) interaccionan con el ribosoma y bloquean segmentos hidrofóbicos de los polipéptidos que emergen del ribosoma, impidiendo su agregación y degradación. Esta función es regulada por el ATP en otras chaperonas (ej. Hsp70, Hsp90, BiP). Las chaperoninas son complejos cilíndricos multiproteicos que encapsulan y activamente contribuyen a completar el proceso de plegado en ~10% de las proteínas. Su función es dependiente de ATP (ej. Hsp60, GroEL, CCT/TRIC). La elongación de los polipéptidos en eucariotas ocurre a ~ 4 aminoácidos por segundo y en bacterias a ~ 20 aa/seg. En células humanas existen ~ 200 chaperonas y co-chaperonas. Las chaperoninas representan entre el 0.1-1% del total de proteínas solubles. NAC: Nascent chain associated complex RAC; Ribosome associated complex PFD, prefoldin TF: Trigger factor Hartl et al Nature 2011 La mayoría de las proteínas en el citosol se degradan en los proteosomas por procesos específicos dependientes de ATP Los lisosomas son organelas que degradan material transferido de endosomas y autofagosomas. Los proteosomas son complejos cilíndricos compuestos por proteasas que forman una cámara central (CP) y varias subunidades reguladoras (RP) en los extremos que unen substratos poli-ubiquitinilados, los despliegan y transfieren a la cámara central donde son degradados a péptidos cortos. Deubiquitination Lys (ATPasas) Reconstrucción de imágenes de microscopía electrónica 19S tapa cámara 20S Varias proteínas reguladoras son substratos del proteosoma, ej. IκB, p53, inhibidores de CDK, securina, β-catenina, HIF, etc) tapa ~ 2,5 MDa Lodish et al, MCB 2004 Smalle & Vierstra, ARPB 2004 Varias enfermedades humanas resultan de la agregación intra o extracelular de polipéptidos mal plegados Soto, Nature Rev Neuro 2003 La presencia de agregados proteicos puede visualizarse por histoquímica. Al microscopio electrónico se observa que los agregados forman fibras (centro) Soto, Nature Rev Neuro 2003 Las células exhiben una organización modular (0.5-1 μm) Gavin et al, COCB 2003 En las células las proteínas usualmente forman complejos (ensambles) funcionales Alberts et al, MBC 2002 Los complejos de señalización dependen de módulos o dominios proteicos que median interacciones reversibles Pawson & Nash, TICB 2001 Los complejos de señalización son dinámicos señal1 GEF PP GEF PP SH3 Crk SH2 SH3 Crk SH2 pY pY pY pY pY pY Cas PP SH3 Src kinasa SH2 FERM pY861 pY925 pY576/577 pY397 FAT FAK kinasa LD LD PP autofosforilación de FAK unión de Src fosforilación y max activación de FAK fosforilación de Cas unión de Crk y GEFs (C3G, DOCK180) SH3 PP pax señal1 GEF PP GEF PP SH3 Crk SH2 SH3 Crk SH2 señal2 Sos SH3 SH3 pY pY pY pY pY pY Grb2 Cas PP SH3 SH2 Src kinasa pY861 pY925 pY576/577 pY397 FERM SH2 FAT FAK kinasa LD LD PP SH3 unión de Grb2 interacción con Sos PP pax Otros ejemplos de ensambles funcionales multiproteicos transcripción eliminación de intrones degradación de proteínas Ejemplos de ensambles funcionales multiproteicos contracción distribución de cromosomas adhesión celular Ejemplos de ensambles funcionales multiproteicos transporte núcleo-citoplásmático Los interactomas describen las interacciones entre proteínas a nivel global Interactoma de S. cerevisiae connectivity 1.870 proteínas 2.240 interacciones ROBUSTEZ ~73% genes de levadura no son esenciales; mutaciones al azar no afectan la topología de la red (Giaever et al, Nature 2002) (n=1.572 mutants) nodo Jeong et al, Nature 2001 DIP: Database of Interacting Proteins http://dip.doe-mbi.ucla.edu P53 es un ejemplo de proteína nodal (hiperconectada) Vogelstein et al, Nature 2000 Modelos hipotéticos de la evolución de los compartimientos subcelulares Cuatro compartimientos principales: - Núcleo y citosol - organelas de secreción y endocitosis - mitocondrias - plastidios Alberts et al, MBC 2002 Las proteínas contienen secuencias que codifican su localización subcelular Lodish et al, MCB 2004 El reconocimiento de las señales de localización puede depender de características de la secuencia primaria, secundaria o terciaria NLS, SKL son ejemplos de señales dependientes de la secuencia primaria. La secuencia señal de proteínas de mitocondrias y del RE depende principalmente de las caracterísitcas de la estructura secundaria. Algunas NLS y la secuencia señal de localización a lisosomas son conformacionales. secuencia señal de importación a mitocondrias Alberts et al, MBC 2002 Las proteínas de andamiaje o “scaffold” contribuyen a concentrar proteínas relacionadas funcionalmente en subcompartimientos del citosol estimulación con EGF cAMP PKA AKAP79 asocia a las enzimas PKA y PKC con diferentes receptores que regulan su actividad en la membrana plasmática. Raf MEK Ksr (MAPK) Erk Pawson & Nash Genes Dev 2000 Ksr concentra componentes de la vía de activación de la MAP kinasa Erk fosforilación de Rsk y TCF. Activación de la proliferación. La proteína PSD-95 vincula receptores de neurotransmisores con diversas proteínas que organizan la post-sinapsis.
