tesis_doctoral_susana diaz_gonzalez - RUA

“NAD-glutamato
Haloferax
deshidrogenasa
propiedades
clonaje,
mediterranei:
secuenciación y expresión.
de
la
de
Purificación y
enzima
nativa
y
recombinante.”
Díaz González, Susana
ISBN: 978- 84- 690-5983- 8 · Depósito Legal: A - 545- 2007
UNIVERSIDAD DE ALICANTE
FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Agroquímica y Bioquímica
NAD-glutamato deshidrogenasa de Haloferax mediterranei: clonaje,
secuenciación y expresión. Purificación y propiedades de la enzima nativa
y recombinante.
ISBN: 978-84-690-5983- 8 · Depósito Legal: A- 454- 2007
Susana Díaz González
Alicante, 2007
1. INTRODUCCIÓN.
1.1. DOMINIO ARCHAEA.
1.1.1. Características generales y Filogenia.
1.2. ARQUEAS HALOFÍLICAS.
1.2.1.Características generales.
1.2.2. Taxonomía.
Haloferax mediterranei.
1.2.3. Adaptaciones halofílicas.
1.2.4. Metabolismo.
1.2.5. Proteínas halofílicas.
1.2.6. Aplicaciones de los organismos halofílicos.
1.3. GLUTAMATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.4.1.2-4).
1.3.1. Deshidrogenasas piridín-dependientes.
1.3.2. Glutamato deshidrogenadas.
1.3.3. Especificidad del coenzima.
1.3.4. Centro activo.
1.3.5. Regulación de la síntesis.
1.3.6. Aplicaciones.
1.4. AISLAMIENTO Y SECUENCIACIÓN DE GENES DE HALÓFILOS.
1.5.
EXPRESIÓN
Y
RENATURALIZACIÓN
RECOMBINANTES.
2. OBJETIVOS E INTERÉS DEL TRABAJO.
DE
PROTEÍNAS
3. MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NAD-GLUTAMATO
DESHIDROGENASA NATIVA.
3.1.1. Fuente de microorganismos.
3.1.2.
Medio y condiciones de cultivo.
3.1.3.
Extracto enzimático.
3.1.4.
Determinación de la concentración de proteína.
3.1.5.
Determinación de la actividad enzimática de la proteína.
3.1.6.
Cromatografía en Sepharosa 4B.
3.1.7.
Cromatografía en Blue-Sepharosa.
3.1.8.
Cromatografía en Sephacryl S-300.
3.1.9.
Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS.
3.1.10. Determinación de la masa molecular de NAD-GDH nativa y del tamaño de
subunidad.
3.1.10.1. Determinación de la masa molecular mediante tamizado molecular
3.1.10.2. Determinación del tamaño de subunidad mediante electroforesis en gel
de poliacrilamida en presencia de SDS
3.1.11. Determinación de parámetros cinéticos.
3.2. COMPORTAMIENTO FRENTE A LA CONCENTRACIÓN DE SALES,
TEMPERATURA y pH.
3.2.1. Efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática.
3.2.2. Efecto de las sales sobre la estabilidad.
3.2.3. Efecto de la temperatura en la actividad enzimática.
3.2.4. Determinación del pH óptimo de actuación.
3.3. SECUENCIACIÓN DEL EXTREMO N-TERMINAL.
3.4. AISLAMIENTO DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. Mediterranei.
3.4.1. Extracción de DNA de Hfx. Mediterranei.
3.4.2. Medida de la concentración de DNA genómico.
3.4.3. Electroforesis en gel de azarosa.
3.4.4.
Generación de un producto de PCR de 203 pb.
3.4.5.
Secuenciación del producto de PCR de 203 pb.
3.4.6.
Marcaje no radiactivo del producto generado. DOT BLOT.
3.4.7.
Preparación de una genoteca de Hfx. mediterranei en fago lambda.
3.4.8.
Preparación , crecimiento e infección de células XL1-Blue P2.
3.4.9.
Hibridación de la genoteca con el producto de PCR de 203 pb. Marcado.
3.4.10. Aislamiento de DNA de fago.
3.4.11.
Secuenciación de fagos positivos.
3.4.12.
Análisis de secuencias.
3.4.13.
Construcción del modelo estructural de NAD-glutamato deshidrogenasa de
Hfx. Mediterranei.
3.5. CLONAJE DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. Mediterranei.
3.5.1
Amplificación mediante PCR del gen que codifica la NAD-GDH de Hfx.
Mediterranei.
3.5.2
Electroforesis en gel de agarosa, purificación de la banda y secuenciación.
3.5.3
Ligación del producto de PCR correspondiente al gen de la glutamato
deshidrogenasa de Hfx. mediterranei en el vector de clonaje pCR2.1.
3.5.4. Transformación en E. coli Novablue.
3.5.5. Análisis de tranformantes: Aislamiento y purificación de plásmidos.
3.5.6. Secuenciación de los plásmidos con inserto.
3.5.7. Digestión mediante las enzimas de restricción NdeI y BamHI, del plásmido
que contiene el gen de la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei.
3.5.8. Ligación del gen de NAD-GDH en el vector de expresión pET3a.
3.5.9. Transformación en E. coli Novablue con el plásmido pET3a.
3.5.10. Análisis de transformantes: Aislamiento y purificación de plásmidos.
3.5.11. Transformación en E. coli BL21 (DE3).
3.5.11.1.
3.5.11.2.
Cepa E. coli BL21 (DE3)
Tranformación de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido pET3a con inserto
3.6. EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.
3.6.1
Crecimiento e inducción.
3.6.2
Conservación de las células y test de estabilidad del plásmido.
3.6.3
Obtención de fracciones celulares y localización de la proteína expresada.
3.6.4
Fracción celular total.
3.6.5
Fracción periplásmica.
3.6.6
Fracción citoplasmática.
3.6.6.1. Fracción citoplasmática soluble
3.6.6.2. Fracción citoplasmática insoluble o cuerpos de inclusión
3.7.
SOLUBILIZACIÓN DE LOS CUERPOS DE INCLUSIÓN Y
RENATURALIZACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.
3.7.1.
Solubilización de los cuerpos de inclusión.
3.7.2.
Renaturalización de la NAD-GDH recombinante.
3.7.3.
Renaturalización mediante diálisis.
3.7.4.
Renaturalización mediante dilución.
3.7.5.
Medida de la actividad enzimática y de la concentración de proteína.
3.8. PURIFICACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.
3.8.1.
Precipitación en presencia de sulfato amónico.
3.8.2.
Cromatografía en DEAE-Celulosa.
3.9. ANÁLISIS MEDIANTE NANOELECTROSPRAY LC/MS DE LA NADGDH NATIVA.
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
4.1.
PURIFICACIÓN DE NAD-GDH NATIVA.
4.1.1.
Cromatografía en Sepharosa 4B.
4.1.2.
Cromatografía en Blue-Sepharosa.
4.1.3.
Cromatografía en Sephacryl S-300.
4.2.
SECUENCIACIÓN DEL EXTREMO N-TERMINAL.
4.3.
AISLAMIENTO DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei.
4.3.1.
Secuenciación del producto de PCR. Análisis de secuencias.
4.3.2.
Marcaje no radiactivo del producto de PCR. DOT BLOT.
4.3.3.
Hibridación de la genoteca con el producto de PCR de 203 pb. Marcado.
4.3.4.
Electroforesis en gel de agarosa y concentración del DNA de fago.
4.3.5.
Secuenciación de fagos positivos.
4.3.6.
Análisis de secuencias. Estructura primaria y secundaria.
4.3.6.1.
Uso de codones de NAD-GDH de Hfx. Mediterranei
4.3.6.2.
Residuos implicados en la halofilicidad de las GDHs
4.3.6.3.
Residuos implicados en la termoestabilidad de las GDHs
4.3.6.4.
Comparación de la secuencia primaria de la NAD-GDH y análisis de
su estructura secundaria
4.3.7 Construcción del modelo estructural de NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx.
Mediterranei.
4.4.
CLONAJE Y EXPRESIÓN DEL GEN NAD-GDH DE Hfx.
Mediterranei.
4.4.1. Electroforesis en gel de agarosa de la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei.
4.4.2. Digestión mediante las enzimas de restricción NdeI y BamHI.
4.4.3. Ligación en el vector de expresión pET3a y transformación en células E. coli
Novablue.
4.4.4.
Transformación en E. coli BL21 (DE3).
4.4.5.
Obtención de fracciones celulares y localización de la proteína.
4.5.
SOLUBILIZACIÓN DE LOS CUERPOS DE INCLUSIÓN,
RENATURALIZACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA NAD-GDH
RECOMBINANTE.
4.5.1.
Solubilización de los cuerpos de inclusión.
4.5.2.
Renaturalización de la NAD-GDH recombinante.
4.5.3.
Renaturalización mediante diálisis.
4.5.4.
Renaturalización mediante dilución.
4.5.5.
Efecto de la composición del tampón en el proceso de renaturalización
mediante dilución rápida.
4.5.6. Efecto de las sales y el EDTA en el proceso de renaturalización.
4.5.6.1.
Efecto del tipo de sal
4.5.6.2.
Efecto de la concentración de sal
4.5.6.3.
Efecto del EDTA en el proceso de renaturalización
4.5.7.
Purificación de la NAD-glutamato
4.5.7.1.
Precipitación en presencia de sulfato amónico
4.5.7.2.
Cromatografía DEAE-celulosa
4.6.
CARACTERIZACIÓN
DE
NAD-GDH
NATIVA
Y
RECOMBINANTE.
4.6.1.
Determinación de la Mr de la NAD-glutamato deshidrogenasa mediante
tamizado molecular.
4.6.2.
Determinación del tamaño de subunidad.
4.6.3.
Efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática.
4.6.4.
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
4.6.5.
Efecto del pH en la actividad enzimática.
4.6.6.
Determinación de parámetros cinéticos.
4.6.7.
Efecto de las sales sobre la estabilidad.
4.7. ANÁLISIS MEDIANTE NANOELECTROSPRAY LC/MS DELA NADGDH NATIVA
5. CONCLUSIONES.
6. TRABAJO FUTURO.
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
8. APÉNDICE I.
9. APÉNDICE II: ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS.
10. APÉNDICE III: ABREVIATURAS.
1. INTRODUCCIÓN.
El organismo en el que se basa el presente trabajo es Haloferax mediterranei, un
microorganismo halófilo extremo clasificado dentro del dominio Archaea.
Hasta 1977 todos los organismos vivos se clasificaban dentro de dos grupos: eucariotas (células
con núcleo) y procariotas (células sin núcleo). En ese mismo año Woese y colaboradores (1977)
propusieron que los procariotas no eran un grupo homogéneo, basándose en la comparación de
fragmentos de RNA ribosómico 16S ó 18S generados por tratamiento con ribonucleasa. Entonces
propusieron la clasificación de los seres vivos en tres reinos independientes: eubacterias, arqueobacterias
y eucariotas.
Woese y col. en 1990, propusieron una nueva clasificación en la que se definía mejor las
diferencias entre eubacterias, arqueobacterias y eucariotas. Propusieron un valor taxonómico de mayor
rango que el reino al que denominaron “Dominio”. Los tres Dominios son: Bacteria, Eucarya y Archaea,
que sustituirían a Eubacterias, Eucariotas y Arqueobacterias (Figura 1).
Animals
Bacteria
Archaea
Eucarya
Fungi
Archaeglobus Halobacteriu
Gram
Methanobacterium
Thermoplasma
ProteobacteriaSpirochaetes
Methanococcus
Pyrococcus
Methanopyru
Cyanobacteria
Pyrobaculum
Chlamydia
Sulfolobus
Deinococcus
Aeropyrum
Thermotoga
Plants
Ciliates
Flagellates
Trichomonad
Diplomonads
Microsporidi
Figura 1: Representación esquemática del árbol filogenético universal de Woese y col., (1990).
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Los nombres de los Dominios se escogieron teniendo en cuenta algunas consideraciones como
son: mantener la continuidad con los nombres ya existentes, sugerir las características básicas del grupo
y evitar cualquier connotación que señale relación entre bacterias y arqueas.
Existe una gran controversia sobre la relación entre los tres Dominios aunque su existencia es
muy clara. Dicha discusión sobre la relación existente entre ellas ha llevado a la realización de diferentes
estudios como son: la microscopía electrónica de ribosomas (Lake y col., 1982; 1984), las comparaciones
de las secuencias de RNA 5S (Hori y col., 1982) que sitúan a las arqueas más estrechamente
relacionadas con eucariotas que con eubacterias. Hay datos que contradicen la relación existente entre
Archaea y Eucarya, como son las secuencias de algunas proteínas de arqueas muy similares a las
homólogas de bacterias, sobre todo a bacterias gram-positivas (Woese y col., 1990).
En el presente trabajo, seguiremos la nomenclatura propuesta por Woese y col., 1990. El
organismo objeto de estudio pertenece al Dominio Archaea, es por ello que a continuación se presentan
las características de dicho taxon.
1.1. DOMINIO ARCHAEA:
1.1.1. Características generales y Filogenia.
El Dominio Archaea está formado por un grupo heterogéneo de microorganismos capaces de
habitar ambientes extremos. Entre sus características destacan las siguientes (Bullock, 2000):
-
poseen membranas lipídicas que contienen cadenas laterales isoprenoide con enlaces éter,
en contraste con los hidrocarburos con enlaces éster de todos los demás sistemas
biológicos,
-
carecen en todos los casos de ácido murámico (peptidoglicano) como constituyente de la
pared celular,
-
presentan una morfología típica que no se ha encontrado en ninguno de los organismos que
componen el Dominio Bacteria, como por ejemplo las formas poligonales que tienen algunas
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2
arqueas halófilas o los cocos extremadamente irregulares que presentan algunos
hipertermófilos,
-
no catabolizan la glucosa mediante glicólisis, sino que emplean una vía metabólica de
oxidación simple,
-
y su maquinaria fundamental de transcripción es muy similar a la que poseen los
organismos pertenecientes al Dominio Eucarya.
En base a sus propiedades metabólicas y ecológicas, Woese y Fox en 1977 diferenciaron los
tres primeros fenotipos de arqueas: metanógenos (microorganismos estrictamente anaerobios y
productores de metano), halófilos (microorganismos capaces de vivir en lugares con concentraciones
salinas saturantes) y termoacidófilos (microorganismos aerobios que viven en ambientes ácidos y con
elevadas temperaturas). Pero se han descubierto muchos más fenotipos en las siguientes décadas, como
por ejemplo metanógenos hipertermófilos o psicrófilos, metanógenos alcalófilos y/o halófilos, e
hipertermófilos anaeróbicos, alcalófilos y neutrófilos. Finalmente el estudio basado en la amplificación
mediante PCR del rRNA 16S ha puesto de manifiesto la existencia de arqueas mesofílicas en diferentes
ambientes (mares y suelos) cuyo fenotipo es desconocido hasta el momento (Forterre y col., 2002).
De acuerdo con las comparaciones de rRNA 16S el Dominio Archaea se divide principalmente
en dos phyla (Woese y col., 1990):
¾
Phylum Crenarchaeota: comprende a los microorganismos que se han denominado
hipertermófilos y termoacidófilos. Algunos géneros son Sulfolobus, Desulfurococcus,
Pyrodictium, Thermoproteus y Thermofilum. Actualmente se incluyen en este phylum
varios grupos de microorganismos mesofílicos, y probablemente, psicrófilos que se han
detectado mediante PCR en diversos ambientes, aunque todavía no se han cultivado
(Forterre y col., 2002).
¾
Phylum Euryarchaeota: abarca un amplio rango ecológico, comprendiendo
microorganismos hipertermófilos (géneros Pyrococcus y Thermococcus), metanógenos
(género Methanosarcina), halófilos (géneros Haloferax, Halobacterium y Halococcus) e
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incluso metanógenos termofílicos (géneros Methanococcus y Methanobacterium)
(Brown y col., 1997).
Mediante la amplificación por PCR de secuencias de RNA ribosómico 16S procedentes
de organismos no aislados, se han detectado nuevas especies de arqueas que no se encuadran
dentro de los dos phyla propuestos, y que parecen estar más cercanas al Dominio Eucarya.
Estas secuencias se clasifican provisionalmente en otro phylum dentro del Dominio Archaea
denominado Korarchaeota (Barns y col., 1996) (Figura 2).
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Methanopyral
Thermococcales
Euryarchaeot
Archaeoglobales
Archaeoglobal
Methanococcale
Methanoc
hermoplasmatale
Thermoplasmatales
Methanobacteriales
Methanomicrobiales
Methanosarcinales
Halobacteriales
Uncultured
Thermoproteales
Thermoproteales
Desulfurococcales
Crenarchaeota
Sulfolobales
Figura 2: Filogenia del Dominio Archaea basada en secuencias de RNA ribosómico 16S de especies cultivadas y no cultivadas.
Los triángulos grises incluyen secuencias de especies cultivadas y sin cultivar mientras que los blancos sólo incluyen secuencias
de especies no cultivadas (Forterre y col., 2002).
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5
Huber y col., (2002) propusieron un nuevo phylum, denominado Nanoarchaeota, dentro del
Dominio Archaea. Dicho phylum está representado por la especie Nanoarchaeum equitans, un
microorganismo simbionte hipertermófilo de tan solo 400 nm de diámetro que ha sido encontrado en
chimeneas submarinas. El archaeon N. equitans crece pegado a la superficie de una arquea específica
perteneciente al género Ignicoccus, y a pesar de varios intentos, no se ha podido obtener ningún cultivo
puro del mismo. Por tanto, el contacto directo célula-célula con el huésped parece ser un requisito
imprescindible para su crecimiento. Los estudios filogenéticos basados en secuencias de rRNA que se
han realizado sitúan a N. equitans en una rama aislada. Pero, para conocer su posición exacta
deberemos esperar hasta que vayan apareciendo más miembros pertenecientes a éste grupo y se
realicen estudios filogenéticos más completos.
1.2. ARQUEAS HALOFÍLICAS.
Las arqueas halofílicas están clasificadas dentro del phylum Euryarchaeota, y muy relacionadas
con los metanógenos (Woese y col., 1990; Barns y col., 1996). El único componente dentro del órden
halobacteriales es la familia Halobacteriaceae cuyos miembros, muestran una estricta dependencia por
altas concentraciones de sal para su crecimiento y estabilidad estructural, siendo considerados por ello,
halófilos por excelencia. Filogenéticamente la familia Halobacteriaceae está clasificada dentro del phylum
Euryarchaeota, y se encuentra muy relacionada con los microorganismos metanógenos, pertenecientes a
los órdenes Methanomicrobiales y Methanosarcinales (Oren y Mana., 2002). En la actualidad dicha
familia está dividida en 18 géneros (septiembre 2004), aunque en las bases de datos aparecen dos
géneros más, denominados Haloalcalophilium y Natronoliminobium, cuya descripción todavía está
pendiente de publicación.
1.2.1. Características generales.
Abundan en salinas y lagos hipersalinos, como por ejemplo el Mar Muerto y el Gran Lago
Salado.
En general crecen en las salinas de todo el mundo, a una concentración de NaCl de
aproximadamente 4.5 M, diez veces la salinidad del agua del mar, ambientes bajo los que muy pocos
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organismos vivos pueden crecer. Se conocen desde muy antiguo en salinas solares empleadas para
extraer sal del mar, y se cultivaron por primera vez en el laboratorio a finales del siglo XIX.
Se trata de organismos quimioheterótrofos aerobios. Pueden vivir en medios prácticamente
anaerobios como en las salinas donde existe un bajo contenido en O2, cuya solubilidad en estos medios
tan saturados es prácticamente nula. Como hábitat, las salinas además de la elevada concentración de
sal presentan temperaturas elevadas, que pueden alcanzar más de 50°C pudiendo llegar a crecer
microorganismos incluso a 60°C como por ejemplo Haloterrigena thermotolerans (Montalvo-Rodríguez y
col., 2000).
Una característica fundamental de estos microorganismos es que son halófilos obligados,
necesitando en general concentraciones de NaCl mayores de 1,5 M para crecer. La concentración de
NaCl media óptima de crecimiento se sitúa entre 2 y 4,5 M dependiendo de las especies, pudiendo crecer
algunas de ellas incluso a concentraciones saturantes de sal.
Las arqueas halófilas son básicamente heterótrofas aerobias. Estos microorganismos llevan a
cabo la degradación de los compuestos carbonados mediante el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) y
la cadena transportadora de electrones, en combinación con el ciclo del glioxilato y reacciones de la vía
Embden-Meterhof y de la vía modificada de Etner-Doudoroff (Oren y Mana, 2002). Muchas de estas
especies pueden crecer en medio mínimo en presencia de glucosa (Rodríguez-Valera y col., 1980). Sobre
el crecimiento de halófilos en presencia de ácidos grasos no existen datos actualmente, aunque los genes
implicados en la β-oxidación se han encontrado en el genoma de Halobacterium NRC-1 (Ng y col., 2000).
Debido a las elevadas concentraciones de sal y a las usuales elevadas temperaturas de las
salinas, la solubilidad del oxígeno es muy baja convirtiéndose en un factor limitante para el desarrollo de
estos microorganismos. Con el fin de sobrevivir en estos medios microaerófilos, e incluso anaeróbicos,
algunas especies de la familia Halobacteriaceae han desarrollado diversas estrategias. Por ejemplo,
Haloferax mediterranei, Halobacterium salinarum o Natronobacterium vacuolatum, forman vesículas de
gas que les permiten flotar hasta la superficie donde la concentración de oxígeno es mayor (Pfeifer y col.,
1997). Otras especies son capaces de utilizar aceptores de electrones alternativos en la respiración como
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el nitrato (Mancinelli y col., 1986; Hochstein y col., 1991; Lledó y col., 2004), tiosulfato o azufre (Tindall y
col., 1986), dimetilsulfóxido (DMSO) (Oren y col., 1990) o fumarato (Oren y col., 1991). Algunas especies
como Hbt. salinarum pueden crecer anaeróbicamente por fermentación de algunos aminoácidos, como
por ejemplo L-arginina (Hartmann y col., 1980). Este último microorganismo también puede comportarse
como fotoheterótrofo, al obtener energía en forma de ATP mediante la fosforilación de ADP mediada por
la proteína de membrana bacteriorrodopsina, que se activa por efecto de la luz (Stoeckenius y col., 1979).
Finalmente, destacar que aunque los halófilos son organismos quimioheterótrofos, se han
descrito diversos casos de fijación de CO2 que implican la carboxilación reductiva de propionato, la
reacción de la enzima glicina sintetasa o el intercambio de CO2, con el grupo carboxilo del piruvato (Oren
y Mana, 2002).
Antiguamente, se asumía que las arqueas dominaban los ambientes extremos, como por
ejemplo las salinas, mientras que las bacterias estaban restringidas a ambientes moderados. Más tarde,
mediante técnicas de biología molecular, se encontró la presencia de arqueas en ambientes moderados,
tales como el agua de mar o en sedimentos (Olsen, 1994), y de bacterias en ambientes con elevadas
temperaturas (Pace, 1997). Recientemente, empleando técnicas de hibridación in situ con fluorescencia
(FISH) se ha puesto de manifiesto que las bacterias constituyen una parte significativa de la microbiota
del hábitat de las salinas. Por tanto, parece ser que las bacterias, al igual que las arqueas, también se
encuentran en ambientes extremos, como es el caso de Salinibacter ruber (Antón y col., 2000). Se ha
observado la presencia de arqueas halofílicas extremas en los sedimentos de la plataforma continental en
la costa de la India, realizándose su estudio mediante la técnica del número más probable (Raghavan y
col., 2004). Se postula que también en Marte (Steven Squyres conferencia de prensa 24 marzo de 2004.
NASA News), podrían haber existido organismos halofílicos ya que se ha comprobado que existió agua
en Marte, como se ha podido observar recientemente con el robot “Opportunity” descubriendo sobre la
superficie de Marte lo que podría haber sido un mar salado, y que al perder su atmósfera y evaporarse el
agua pudo dar lugar a la precipitación de los minerales que estaban disueltos en ella llegando a estar así
más concentrados y formando pequeños reservorios de cristales de sal. Con los datos que se conocen de
nuestro planeta, sea el caso de Rio Tinto (Amaral-Zettler y col., 2002) en el que se encuentran
organismos extremófilos, habría sido relativamente fácil para los organismos halofílicos evolucionar bajo
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las condiciones dadas en Marte. Los organismos halofílicos terrestres servirían como análogos de
posibles vestigios de vida en Marte (Mancinelli, 2003; Mancinelli, 2004).
1.2.2. Taxonomía.
Los arqueas halófilos extremos están clasificados dentro de la familia Halobacteriaceae.
Actualmente, ésta familia, se encuentra en proceso de reclasificación, distinguiéndose en este momento
los siguientes géneros:
•
Halobacterium: primer género descrito aislado de salazones de pescado (Kamekura, 1998).
Crecen entre 3,5 y 5,2 M de NaCl. Requieren aminoácidos para su crecimiento.
•
Halococcus: segundo género descrito después de Halobacterium clasificado dentro de la
familia Halobacteriaceae. Su morfología es de cocos sin motilidad, con una pared celular
formada por heteropolisacáridos en lugar de por glicoproteínas como el resto de los
halófilos.
•
Natrobacterium: requieren elevadas concentraciones de sal, alto pH y bajas concentraciones
de Mg+2 para su crecimiento (Kamekura, 1998). Tienen forma de varilla.
•
Natrococcus: como los microorganismos del género Natrobacterium, también son
alcalinofílicos. Morfología cocoide.
•
Haloarcula: requieren elevadas concentraciones de NaCl y de Mg+2 para su crecimiento.
•
Haloferax: tienen el menor requerimiento salino, encontrándose su óptimo alrededor de 2 M
de NaCl. Necesitan elevadas concentraciones de Mg+2 a diferencia de Natrobacterium.
•
Halobaculum: requieren concentraciones relativamente bajas de NaCl y muy altas de Mg+2
para su crecimiento.
•
Halorubrum: necesitan concentraciones de NaCl del órden de entre 1,5 y 5,3 M. (Kamekura
and Dyall-Smith, 1995).
•
Natrialba: tienen forma de varilla y son móviles. Éstos microorganismos no tienen
bacteriorruberinas por lo que no presentan pigmentación. Crecen entre 2 M de NaCl y
saturación.
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9
•
Natromonas: éste género está compuesto por una única especie, N. pharaonis, que
pertenecía anteriormente al género Natronobacterium del que se transfirieron dos de sus
especies a los géneros Halorubrum y Natrialba.
•
Haloterrigena: requieren al menos cantidades de 2 M de sal para su crecimiento (Ventosa y
col., 1999).
•
Halogeometricum: requieren al menos concentraciones de 1,5 M de NaCl para su
crecimiento. Crecen de forma anaeróbica en presencia de nitrato (Montalvo-Rodríguez y
col., 1998).
•
Natronorubrum: para su crecimiento necesitan al menos concentraciones de 1,5 M de sal.
Su pH óptimo se encuentra entre 9,0 y 9,5 estimulando su crecimiento la presencia de
ciertos azúcares (Xu y col., 1999).
•
Natrinema: requieren al menos 1,7 M de NaCl para su crecimiento, teniendo su óptimo entre
3,4 y 4,3 M de NaCl. Si se encuentra por debajo de 1,5 M sus células se lisan (McGenity y
col., 1998).
•
Halohabdus: este género se compone de una única especie H. utahensis, que se ha aislado
a partir de sedimentos del Gran Lago Salado. Para su óptimo crecimiento requieren
concentraciones de 4,6 M de NaCl, no creciendo en presencia de sustratos complejos como
la peptona o el extracto de levadura (Waino y col., 2000).
Existe otro género pendiente de clasificación que es Haloalcalophilum.
Haloferax mediterranei
El Archaeon halofílico extremo Haloferax mediterranei fue descrito por primera vez en 1983 por
Rodríguez Valera y col. como Halobacterium mediterranei. Posteriormente, en 1986, Torreblanca y col.
propusieron una nueva clasificación de éste microorganismo junto con Hbt. volcanii y Hbt. denitrificans,
pasando a formar parte del género Haloferax. Esta distinción se realizó basándose en un estudio sobre
los lípidos polares de la membrana celular y otras características morfológicas y fisiológicas. Actualmente
Susana Díaz González
10
el género Haloferax está compuesto por cinco especies: las tres anteriormente citadas, Hfx. gibbonsi
(Juez y col., 1986) y Hfx. lucentensis, descrita inicialmente como Hfx. alicantei (Gutierrez y col., 2002).
Haloferax mediterranei, al igual que las especies pertenecientes a su género, presenta una
amplia variedad morfológica siendo el bacilo la forma predominante. Su tamaño se encuentra entre 0,5 y
2 μm, presenta una débil motilidad durante la fase exponencial de crecimiento, y posee abundantes
vacuolas de gas.
1.2.3. Adaptaciones halofílicas.
El logro de vivir en medios con elevada concentración de sal se debe a que los organismos que
se encuentran en este tipo de medios han desarrollado dos estrategias diferentes para combatir el estrés
osmótico:
-
La primera de ellas consiste en la acumulación citoplasmática de solutos compatibles,
compuestos de bajo peso molecular como el glicerol, la ectoina o la sacarosa, utilizándose
por las bacterias halofílicas (H. elongata), algunas algas y hongos, y arqueas metanógenas
halofílicas.
-
La segunda estrategia consiste en la acumulación de sales inorgánicas en el citoplasma,
desarrollada por arqueas halófilas de la familia Halobacteriaceae, un grupo de bacterias
halofílicas anaeróbicas y la bacteria halófila Salinibacter ruber (Antón y col., 2002).
Los organismos que utilizan la primera estrategia, el K+ es el catión intracelular dominante,
pudiendo alcanzar una concentración de 5 M y el Cl− es el anión intracelular más abundante. En
concentraciones más bajas se encuentra el Na+, a 1 M aproximadamente. Éste hecho, contrasta con la
concentración de iones en el medio, en el que el Na+ es el catión dominante, y la concentración de K+ es
muy pequeña. La existencia de bombas en la membrana citoplasmática mantiene un gradiente entre el
medio extra e intracelular (Madigan y Oren, 1999).
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11
Las proteínas de éste tipo de microorganismos han desarrollado mecanismos específicos que les
permiten ser estables y solubles en presencia de altas concentraciones de KCl (Madern y col., 1995;
Danson y col., 1997).
1.2.4. Metabolismo.
Las haloarqueas por lo general son microorganismos quimioheterótrofos aerobios, es decir,
utilizan materia orgánica como fuente de carbono y energía, siendo el O2 el aceptor final de electrones en
la cadena respiratoria. No obstante, en condiciones de iluminación y de baja presión de O2 pueden
comportarse como fotótrofos (pueden realizar la fotofosforilación a través de la bacteriorrodopsina). No
son capaces de crecer autotróficamente (con CO2 como única fuente de carbono), pero algunas pueden
hacer una fijación no reductora del CO2 a glicina en presencia de amonio y de propionato (Javor, 1988).
No todas son aerobias estrictas: algunas pueden fermentar ciertos aminoácidos (Hartmann y col., 1980) y
otras pueden realizar una respiración anaerobia teniendo como aceptor final de electrones el nitrato
(Mancinelli y Hochstein, 1986).
Durante mucho tiempo se creyó que las haloarqueas eran incapaces de metabolizar
carbohidratos. Sin embargo, se ha demostrado que sí pueden hacerlo (Rodríguez-Valera y col., 1980;
Pimenov y col., 1987). El catabolismo de las hexosas lo realizan a través de una modificación de la ruta
de Entner-Doudoroff donde la glucosa es oxidada a gluconato y éste deshidratado a 2-ceto-3deoxigluconato, posteriormente fosforilado dando 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato, continuando la vía
normal de Entner-Doudoroff (Danson y Hough, 1992). En todas las arqueas la conversión de piruvato a
acetil-CoA está catalizada por la piruvato oxidorreductasa, que es distinta del sistema de la piruvato
deshidrogenasa de bacterias y eucariotas, en halófilos el aceptor de electrones es la ferredoxina
utilizándose en lugar de NAD+ (Danson y Hough, 1992). Presentan un ciclo de los ácidos tricarboxílicos
completo, idéntico al de bacterias y eucariotas, sirviendo para generar energía y suministrar precursores
para biosíntesis. También permite la utilización de aminoácidos y otros compuestos nitrogenados como
fuente de carbono y nitrógeno en el crecimiento (Danson y Hough, 1992).
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1.2.5. Proteínas halofílicas.
Los organismos que crecen en medios hipersalinos, tales como el Mar Muerto o el Gran Lago
Salado, han desarrollado varios mecanismos para superar la presión osmótica extracelular. Mientras que
las bacterias y eucariotas halofílicas sintetizan grandes cantidades de pequeños osmoprotectores
orgánicos, las arqueas halofílicas acumulan iones inorgánicos en el interior de la célula que exceden a los
del medio. Consecuentemente, toda la maquinaria bioquímica de estos organismos debe estar adaptada
para funcionar a altas concentraciones salinas. En el caso particular de las enzimas halofílicas, aunque
catalizan las mismas reacciones que sus homólogas no halofílicas, éstas requieren altas concentraciones
salinas en el rango de 1 a 4 M de sales neutras, tanto para su estabilidad como para su actividad
enzimática (Leicht y col., 1978; Dym y col., 1995). Este comportamiento debe estar en correspondencia
con marcadas diferencias en cuanto a composición y estructura de estas proteínas con respecto a las no
halofílicas. La inestabilidad de las proteínas halofílicas en bajas concentraciones salinas, ha dificultado
diversos intentos de purificar enzimas de fuentes halofílicas, debido a que la mayoría de las técnicas de
purificación se desarrollan bajo condiciones de baja salinidad que originan en las proteínas y enzimas
halofílicas una pérdida de su estructura nativa y de su actividad. Sin embargo, en algunos casos sí es
posible la utilización de estas técnicas en presencia de altas concentraciones salinas, como en la
purificación de NAD-glutamato deshidrogenasa y NADP-glutamato deshidrogenasa de Hbt. salinarum
(anteriormente Hbt. halobium) (Bonete y col., 1986; 1987). Además, hay otras enzimas halofílicas como
isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii (Camacho y col., 1995), así como glucosa deshidrogenasa
(Bonete y col., 1996) y NADP-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei (Ferrer y col., 1996), que se
pueden purificar en condiciones salinas bajas, utilizando glicerol 20% para estabilizar la estructura de la
proteína. Aunque la mayoría de las enzimas halofílicas estudiadas se inactivan irreversiblemente en
ausencia de concentraciones elevadas de sales neutras, algunas enzimas pueden renaturalizarse por un
nuevo aumento de la concentración salina (Mevarech y Neumann, 1977).
El efecto de altas concentraciones salinas puede deberse a los propios solutos, o al efecto que
tienen los solutos en la actividad del agua. Todo soluto que se disuelve atrae a las moléculas del
disolvente y por lo tanto se reduce la libertad del mismo. Se sabe que las sales pueden afectar a las
interacciones hidrofóbicas, en gran parte por su influencia en la estructura de la distribución del agua.
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Cuando los compuestos hidrofóbicos, como el tolueno, o grupos no polares de aminoácidos se disuelven
en agua se produce un descenso en la entropía debido a un incremento en la ordenación de la estructura
que forman las moléculas de agua alrededor de estos grupos.
La formación de estructuras nativas estables a partir de cadenas polipeptídicas lineales es un
proceso espontáneo basado en un balance de interacciones hidrofóbicas, hidrofílicas y electrostáticas
(Eisemberg y col., 1978). Además, se ha sugerido que la sal elimina agua de las proteínas y forma
uniones hidrofóbicas particularmente fuertes. Las proteínas halofílicas parecen tener esta característica,
aumentando la frecuencia de aminoácidos polares y disminuyendo la frecuencia de aminoácidos no
polares. Este aumento de la frecuencia de aminoácidos polares es debido a un exceso molar del 16-18%
de aminoácidos cargados negativamente, concretamente de glutamato y aspartato (Pundak y Eisenberg,
1981; Danson, 1988), mientras que en las proteínas no halofílicas el exceso es sólo de 7-9%.
Anteriormente Baxter (1959) propuso que el efecto de las sales sobre las enzimas halofílicas consistía en
el apantallamiento de las cargas negativas de la molécula proteica por los cationes del medio, que de no
ser neutralizadas se repelerían electrostáticamente, llevando a una expansión molecular, con la
consecuente desorganización de las estructuras secundaria y terciaria de la proteína. Posteriormente se
ha comprobado que estos residuos de aminoácidos acídicos aumentan la estabilización de la proteína
compitiendo con la sal y originando una capa de hidratación apropiada a fuerzas iónicas elevadas, de
forma que se unen alrededor de siete moléculas de agua por residuo, mientras que los demás
aminoácidos sólo unen de dos a cuatro moléculas de agua por residuo (Pundak y Eisenberg, 1981).
Otro mecanismo propuesto para el efecto salino en las enzimas halofílicas, está basado en el
poder "salting-out" de ciertas sales como el cloruro de sodio o el sulfato de sodio que actúan
disminuyendo la solubilidad de las proteínas. Este tipo de sales parece estabilizar mejor la conformación
nativa de las enzimas halofílicas que las sales del tipo "salting-in" que actúan incrementando la solubilidad
de las proteínas. En presencia de altas concentraciones de NaCl las cadenas polipeptídicas de una
enzima pueden formar uniones hidrofóbicas estables. Otras sales como NaSCN, NaNO3 y especialmente
NaClO4, no estabilizan bien la estructura del agua y por eso no mantienen la actividad enzimática máxima
(Lanyi y Stevenson, 1970; Leich y col., 1978). Los aniones "salting-out" hacen disminuir las interacciones
de los grupos no polares con el agua e incrementar las interacciones hidrofóbicas entre las partes no
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hidratadas de la molécula. Por otro lado, los aniones "salting in" facilitan la interacción con el agua de los
grupos no polares y debido a esto, disminuyen las interacciones hidrofóbicas internas. Altas
concentraciones de sales "salting in" pueden ser causa de la desnaturalización de muchas enzimas,
incluyendo las halofílicas.
Una investigación teórica de las secuencias primarias de las proteínas halofílicas sugiere que
estas proteínas son simplemente grandes aniones que compiten eficazmente con cualquier ion salino del
entorno por las moléculas de agua (Rao y Argos, 1981).
El incremento en la hidratación y la unión a sales es una consecuencia de la adaptación
halofílica, que se ha determinado directamente por medidas de densidad de masa, densidad electrónica y
haz de electrones de alta densidad. El sutil balance en la competición de la proteína y la sal por el agua
está forzado por el requerimiento salino de las proteínas halofílicas; a bajas concentraciones de sal ocurre
desactivación, desnaturalización y para oligómeros, disociación. Por ejemplo, para malato
deshidrogenasa de Har. marismortui, la estructura y estabilidad de la enzima difiere para distintas
disoluciones salinas sin detectarse alteraciones en la actividad catalítica (Hecht y Jaenicke, 1989).
En microorganismos del dominio Bacteria que pueden crecer en concentraciones saturantes de
NaCl aparece una tendencia a favorecer el uso de ácido aspártico y ácido glutámico en detrimento de
lisina, un hecho reconocido como distintivo de los Archaea que requieren altas concentraciones salinas.
El resto de aminoácidos que componen la masa de proteínas de una bacteria halotolerante como
Halomonas elongata es similar al de una bacteria no halotolerante como E. coli (Olsen y col., 1994;
Gandbhir y col., 1995). Estos datos son indicativos de una respuesta convergente al desafío que supone
la adaptación al medio salino. En haloarqueas, este enriquecimiento en aminoácidos acídicos es
entendido habitualmente como resultado de la presencia de altas concentraciones salinas en el interior de
la célula. H. elongata es capaz de resistir tanto la ausencia de sales como la saturación de sales
exógenas, lo que hace especialmente interesante el estudio de la composición de sus proteínas y si los
cationes metálicos intervienen en su arquitectura. Los genes de las haloarqueas parecen "invadidos" por
codones para aspártico y glutámico a través de sucesivas mutaciones acumulativas durante la evolución
a partir de un organismo no halofílico ancestral (Olson y col., 1994), con codones para estos aminoácidos
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15
que comprenderían por encima de un 25% del total de codones (Gandbhir y col., 1995). Si asumimos un
contenido del 15% de codones para estos dos aminoácidos acídicos en el ancestro, y un genoma de unos
5 millones de pares de bases (Sapienza y Doolittle, 1982), entonces serían necesarios al menos 3x105
eventos mutacionales para dar lugar a esta adaptación. Los codones para el glutámico pueden obtenerse
mediante un simple cambio de bases en los codones de lisina y alanina, y los codones para el aspártico a
través de cambios en los codones de alanina. Así, alanina y lisina pueden haber sido los blancos
primarios de las mutaciones. No puede hacerse un cómputo similar para Halomonas ya que se carece de
datos sobre su genoma. Sin embargo, el enriquecimiento en aminoácidos acídicos sugiere que el coste
genético de la adaptación en este linaje fue mucho más profunda y extensa que la simple adquisición de
halotolerancia mediante la expresión aumentada de osmolitos. Se ha observado que para tener actividad
a elevadas concentraciones de sal se requieren de un exceso de residuos ácidos frente a residuos
básicos, característica que se ha encontrado en la mayoría de proteínas halofílicas (DasSarma y col.,
2001). La conversión masiva de lisina en glutámico aparece como una atractiva posibilidad en vista de los
datos de composición de aminoácidos (Gandbhir y col., 1995).
1.2.6. Aplicaciones de los organismos halofílicos.
Tradicionalmente el estudio de los organismos halofílicos ha estado relacionado con la industria
de la alimentación ya que interferían en el correcto almacenamiento de los alimentos en salazón. Son por
lo tanto de interés los métodos para controlar su crecimiento (Kamekura y Seno, 1991). En 1992,
Rodriguez-Valera discutió como posibles aplicaciones:
i)
Utilización en el descubrimiento de agentes anticancerosos, debido a las similitudes entre
eucariotas y haloarqueas a nivel molecular.
ii)
Reemplazo de algunas enzimas usadas ahora convencionalmente por las enzimas de
haloarqueas, ya que estos últimos suelen presentar una mayor resistencia al estrés
salino.
iii)
Sustitución de polisacáridos ácidos de algas utilizados como agentes estabilizantes,
gelificantes, espesantes y emulgentes, por los de haloarqueas.
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16
iv)
Producción masiva de ésteres de polihidroxiácidos para la producción de poliplástico,
puesto que algunas cepas acumulan grandes cantidades de polihidroxialcanoato (PHA),
un copolímero de β-hidroxibutirato y β-hidroxivalerato, que se emplea para la producción
de plásticos biodegradables. También es importante su aplicación en la producción de
exopolisacáridos (Antón y col., 1988; Hezayen y col., 2000 y Eichler, 2001).
El uso biotecnológico más sofisticado y sustancial de uno de los productos de las haloarqueas es
la explotación de las bombas de protones fotoinducidas que operan en las membranas púrpura de Hbt.
halobium (actualmente denominado Hbt. salinarum). Las membranas púrpura consisten en
bacteriorrodopsina con un cromóforo retinal como aceptor de la luz, que después de una modificación
biotecnológica se puede usar en aplicaciones holográficas, procesado de señales ópticas, mecanismos
de reconocimiento óptico, memorias de asociación óptica y equipos neuronales, memorias ópticas y
dispositivos fotoeléctricos. También su posible utilización en "biochips" para una computadora óptica
(Kandler, 1993).
Recientemente, se ha utilizado una p-nitrofenilfosfato fosfatasa de Hbt. salinarum, en un medio
orgánico a muy bajas concentraciones de sal después de retener la enzima en micelas reversas
(Marhuenda-Egea y col., 2002). Bajo esas condiciones, la enzima fue activa y estable. La explotación de
las micelas reversas combinadas con enzimas halofílicas podría dar lugar a nuevas aplicaciones de estas
enzimas. A partir de la producción de herbicidas, pesticidas, explosivos, tintes etc. se generan residuos
que generalmente contienen mezclas complejas de compuestos xenobióticos, sales y disolventes
orgánicos. Las enzimas halofílicas retenidas en micelas reversas, podrían aplicarse en la eliminación
medioambiental de esos residuos (Marhuenda-Egea y Bonete, 2002). Del mismo organismo, Hbt.
salinarum, se ha purificado y caracterizado una endopeptidasa extracelular que muestra actividad
proteasa a bajas concentraciones de sal y podría tener aplicaciones en la eliminación del sabor amargo
de las proteínas hidrolíticas que se utilizan en la industria alimentaria (Capiralla y col., 2002).
A partir del organismo halofílico Haloferax mediterranei se ha purificado y caracterizado en
nuestro departamento una α-amilasa que hidroliza al azar los enlaces α-1,4-glicosídicos del almidón,
produciendo glucosa y esta enzima presenta una alta estabilidad a temperatura y concentración de sal
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17
elevadas y pH básicos que la hacen interesante en posibles aplicaciones en la industria de detergentes,
alimentaria, etc. (Pérez-Pomares y col., 2003).
Actualmente la biotecnología está siendo aplicada a multitud de industrias: alimentaria,
farmacológica, médica, medio ambiental, etc., Por ejemplo, en la industria farmacéutica se emplean
biomoléculas como el glicerol o solutos compatibles procedentes de halófilos y carotenos como aditivos
alimentarios (Fujiwara, 2002 ; Irwin y col., 2004). En nuestro departamento se ha puesto en marcha el
estudio del uso de β-carotenos obtenidos a partir de células de halófilos como suplemento en la comida
de animales como el canario con la finalidad de potenciar el color del plumaje (Martínez-Espinosa 2003;
2004).
1.3. GLUTAMATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.4.1.2-4).
1.3.1. Deshidrogenasas piridín-dependientes.
En las células se producen un gran número de reacciones de oxidación-reducción catalizadas
por enzimas que utilizan como coenzima NAD+ o NADP+. Algunas de esas enzimas pueden funcionar con
ambos coenzimas y otras sólo funcionan con uno u otro coenzima, actuando en este caso en diferentes
aspectos del metabolismo.
En general, las deshidrogenasas que utilizan NAD+ como coenzima, son enzimas catabólicas
que producen energía e intervienen principalmente en el catabolismo, mientras que las que utilizan
NADP+ participan principalmente en la transferencia de electrones desde los intermediarios del
catabolismo hasta los intermediarios de la biosíntesis (Sund, 1968).
Estas enzimas catalizan reacciones del tipo:
Sustrato reducido + NAD(P)+ ↔ Sustrato oxidado + NAD(P)H + H+
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18
Estas reacciones comprenden la transferencia reversible de dos equivalentes de reducción del
sustrato en forma de ion hidruro (H−) a la posición 4 del anillo de nicotinamida (en forma oxidada) del
nucleótido de piridina; el otro hidrógeno se separa del sustrato en forma de ion H+ libre. Esta transferencia
directa de un átomo de hidrógeno desde el sustrato al NAD+ se ha comprobado mediante el empleo de
sustratos marcados con deuterio o tritio. La forma oxidada y reducida del NAD+ y del NADP+ absorben luz
en la zona ultravioleta, cerca de los 260 nm, que es el máximo de absorción del anillo de adenina.
Cuando estos coenzimas se reducen, aparece un nuevo máximo de absorción a 340 nm. Este incremento
refleja la reducción de la porción nicotinamida del anillo aromático de la piridina. La aparición o
desaparición de la absorción a 340 nm se emplea para seguir el curso de las reacciones catalizadas por
las deshidrogenasas piridín-dependientes.
1.3.2. Glutamato deshidrogenasas.
Las glutamato deshidrogenasas (GDHs) catalizan la interconversión de 2-oxoglutarato y Lglutamato según la reacción reversible:
2-oxoglutarato + NAD(P)H + NH4+ ↔ L-glutamato + NAD(P)+ + H2O
Las glutamato deshidrogenasas proporcionan una ruta para la incorporación de nitrógeno en
compuestos orgánicos, siendo fundamental en la síntesis de todos los aminoácidos, pues en muchas
especies es la ruta principal de formación de grupos α-amino directamente a partir de amonio. Supone
además una conexión entre el metabolismo de los carbohidratos y el de aminoácidos (Smith, y col.,
1975).
1.3.3. Especificidad del coenzima.
Basándose en la especificidad del coenzima se conocen 3 tipos diferentes de glutamato
deshidrogenasas:
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19
a) NAD-específicas (NAD-GDH; E.C. 1.4.1.2)
b) NADP-específicas (NADP-GDH; E.C. 1.4.1.4)
c) No específicas, funcionan con ambos coenzimas (NAD(P)-GDH; E.C. 1.4.1.3)
Generalmente las GDHs procedentes de fuentes animales son de tipo no específico, mientras
que las procedentes del resto de fuentes suelen ser coenzimas específicas para uno de los dos.
Es conveniente indicar, sin embargo, que las enzimas pueden también diferenciarse según otros
aspectos como son por ejemplo, la inducción y represión de su síntesis por metabolitos o regulación de la
actividad por nucleótidos de purina di y trifosfatados (Smith y col., 1975). A NAD-GDH se le asigna un
papel catabólico, mientras que a NADP-GDH se la ha implicado en la síntesis de glutamato (Sanwal y
Lata, 1961). El NADPH producido a partir de las glutamato deshidrogenasas NADP-específicas es
utilizado principalmente como poder reductor para la biosíntesis (Léjohn y McCrea, 1968).
Todas las glutamato deshidrogenasas que se conocen hasta ahora son oligoméricas y
dependiendo del tamaño de la subunidad pueden ser clasificadas en los siguientes dos grupos
estructurales: GDHs hexaméricas (con seis subunidades idénticas de aproximadamente 50 kDa) y las
GDHs tetraméricas (con cuatro subunidades idénticas con una masa molecular de
115 kDa). El grupo
de las hexaméricas incluye las NAD-GDHs o las NADP-GDHs de la mayoría de especies de bacterias
conocidas (Rice y col., 1985), las NADP-GDHs de eucariotas inferiores (Kinnaird y col., 1983) y las
NAD(P)-GDHs (duales) de vertebrados (Nakatani y col., 1988). En el grupo de las tetraméricas se
incluirían las NAD-GDHs encontradas en eucariotas inferiores (Kinnaird y col., 1983).
Las deshidrogenasas que utilizan glutamato, leucina, valina y fenilalanina se han reconocido
como miembros de una superfamilia (Britton y col., 1993; Baker y col., 1995). Así pues, de acuerdo con el
orden anteriormente establecido se podrían considerar como una familia de enzimas que incluyen dos
subfamilias de la forma siguiente: GDHs pequeñas (S_GDHs que contienen miembros de las GDHs
hexaméricas) y la subfamilia de las GDHs grandes (L_GDHs que contendrían miembros de las GDHs
tetramericas) (Benachenhou-Lahfa y col., 1993).
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20
Dentro del Dominio Archaea, en termófilos como Pyrococcus furiosus se ha descrito una
glutamato deshidrogenasa que utiliza ambos cofactores NAD+ y NADP+ (Robb y col., 1992), en
Thermococcus litoralis glutamato deshidrogenasa es exclusivamente NADP-específica, no habiéndose
detectado NAD-GDH específica (Kesen y col., 1994).
En halófilos extremos como Halobacterium salinarum se ha aislado una GDH NADP-específica y
otra NAD-específica (Bonete y col., 1987, 1989). En Hfx. mediterranei también existen ambas enzimas,
NADP-glutamato deshidrogenasa (Ferrer y col., 1996) y NAD-glutamato deshidrogenasa. Recientemente,
se ha aislado una GDH NADP-específica de una levadura halotolerante, Debaryomyces hansenii, que
aumenta su actividad al aumentar la concentración de sal (Alba-Lois y col., 2004).
1.3.4. Centro activo.
En 1992, Baker y col., utilizando la estructura tridimensional de la NAD-glutamato
deshidrogenasa de Clostridium symbiosum, propusieron un modelo para el centro activo de la proteína.
Tanto el glutamato como el 2-oxoglutarato poseen cargas negativas y parece ser que la enzima puede
suministrar cargas positivas para estabilizar la unión del sustrato como sugiere la conservación en la
secuencia de residuos de Lys, Arg e His. Siete son los residuos que conservan su alineamiento en la
secuencia de las glutamato deshidrogenasas hexaméricas, y además cuatro de éstos (Lys89, Arg93,
Lys113 y Lys125 en la GDH de C. symbiosum) están cerca del bolsillo donde se introduce el anillo de
nicotinamida. El modelo de unión propuesto para el L-glutamato implica una conformación para el Lglutamato lo más extendida posible para éste y así maximizar la separación entre los grupos carboxilos
C1 y C5. En este modelo, el carboxilo C1 quedaría a una distancia de 3 a 3,5 Å de los grupos –NH3+ de la
Lys113 y Lys125 mientras que el carboxilo C5 está a una distancia similar del NH3+ de Ly89. El grupo 2amino del glutamato está a una distancia aproximada de 4,0 Å del grupo carbonilo de la cadena principal
de Gly164, además las cadenas laterales de Val376 y Ala163 producen interacciones hidrofóbicas con los
C3, C4 y C5 del glutamato.
Todos estos residuos se han conservado en la secuencia de las GDHs hexaméricas, con
excepción de la Gly164, que en algunos casos es prolina (Baker y col., 1992).
Susana Díaz González
21
1.3.5. Regulación de la síntesis.
El control de la síntesis de glutamato es fundamental en el control de la síntesis de los
aminoácidos y por lo tanto en el control de la síntesis de proteínas y del crecimiento (Tempest y col.,
1973; Tyler, 1978).
En la mayoría de los organismos estudiados, la formación de glutamato implica su utilización en
la ruta de la asimilación del amonio (Moat y col., 1988).
El amonio puede ser incorporado al glutamato por la vía de la glutamato deshidrogenasa o por
una vía alternativa que requiere la utilización de dos enzimas, la glutamina sintetasa (GS E.C. 6.3.1.2)
que cataliza la transferencia de amonio a L-glutamato formando L-glutamina, y la glutamato sintasa
(GOGAT E.C. 1.4.1.13) que interviene en la reacción de la L-glutamina con 2-oxoglutarato para dar dos
moléculas de L-glutamato.
En un medio rico en amonio como fuente de nitrógeno, la mayoría de los organismos asimilan el
amonio por la vía de la GDH, a pesar de la baja afinidad de la enzima por el amonio (Tyler, 1978; Brown,
1980). En algunas bacterias se ha encontrado que la GDH es activa a bajas concentraciones de amonio
(Kim, y col., 1982; Yamamoto y col., 1984). Sin embargo, cuando el suministro de amonio es limitado, la
asimilación por la vía GS/GOGAT es más eficiente porque GS posee una Km mucho más baja para el
amonio que la GDH. (Harder y col., 1983).
Los valores de Km de las GDHs de la mayoría de las bacterias para NADP+ y NADPH son
bastante similares, mientras que los valores de Km para el amonio y el glutamato muestran una gran
variedad (Smith y col., 1975).
La actividad NADP-GDH de Saccharomyces cerevisiae disminuyó bajo condiciones en las que la
concentración intracelular de amonio aumentaba, en respuesta a un incremento del nivel de amonio en el
medio de cultivo. Esta disminución en la actividad se debió a una represión de la síntesis de la subunidad
NADP-GDH (Bogóñez y col., 1985).
Susana Díaz González
22
La síntesis de la NAD-GDH en Neurospora crassa está sometida principalmente a una represión
por catabolito. Vierula y col., (1986), demostraron que durante la desrepresión se producía síntesis de
novo de la subunidad de NAD-GDH y que la desrepresión estaba regulada a nivel transcripcional.
1.3.6. Aplicaciones.
En todas las aplicaciones convencionales e industriales hay que tener en cuenta la economía y
eficacia del sistema a comercializar. La primera aplicación importante es la biomédica, el ácido glutámico
está considerado como un importante neurotransmisor en el sistema nervioso central de mamíferos, lo
que ha generado un interés extra por el estudio de dicho aminoácido que permita determinar ácido
glutámico en volúmenes de muestra muy pequeños (Stalikas y col., 1994). Recientemente se ha
conseguido la producción de anticuerpos monoclonales de la glutamato deshidrogenasa del archaeon
termofílico Sulfolobus solfataricus (Cho, y col., 2000). Estos anticuerpos podrían tener aplicaciones en
innumerables campos de la investigación biomédica.
Otra aplicación destacable está en la utilización de sistemas multienzimáticos para la fabricación
de biosensores. Los biosensores son dispositivos que pueden detectar o responder a ambientes químicos
que van a interaccionar con un componente biológico sensible, que está en contacto con un transductor
físico. Normalmente, los biosensores comerciales están basados en métodos electroquímicos que utilizan
enzimas. Estos electrodos enzimáticos están basados en la oxidación o reducción de especies redox en
la superficie del electrodo.
En la naturaleza, sólo unas pocas enzimas pueden generar o consumir especies
electroquímicamente activas, limitando el número de sustancias que pueden ser medidas con electrodos
monoenzimáticos. Una solución es el acoplamiento de varios sistemas enzimáticos basándose en
reacciones cíclicas. Se puede incluir aquí la glutamato deshidrogenasa; para medir concentraciones de
glutamato se podría utilizar un sistema enzimático acoplado de glutamato oxidasa y GDH inmovilizada en
una matriz unida a un electrodo de oxígeno que sería el transductor (Wollenberger y col., 1993).
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23
1.4. AISLAMIENTO Y SECUENCIACIÓN DE GENES DE HALÓFILOS.
El desarrollo de aplicaciones informáticas que posibilitan relacionar regularidades en la
estructura proteica con la función y la secuencia, permiten poder atribuir funciones a proteínas de las que
únicamente se conoce su secuencia de DNA. La posibilidad de comparar secuencias de una misma
proteína, de diferentes organismos, permite reconstruir la historia evolutiva y las relaciones filogenéticas
entre especies. Mediante la secuenciación de genomas completos se pueden realizar construcciones
filogenéticas con la finalidad de construir modelos que nos permitan conocer más datos acerca de la
evolución de los organismos (Chenna y col., 2003).
Recientemente, se ha conseguido secuenciar el genoma completo de Halobacterium salinarum
(Ng y col., 2000), organismo halofílico muy próximo a Hfx. mediterranei, objeto del presente estudio. En
este caso en particular, la secuenciación completa del genoma de Hbt. salinarum sirve como un modelo
excelente por las características que presentan los halófilos como organismos pertenecientes al Dominio
Archaea. El conocimiento de genomas permite realizar diagnósticos precisos detectando las secuencias
que codifican para determinados genes diana. Este estudio detallado de las secuencias ha llevado, por
ejemplo, a crear un ensayo específico de PCR para poder aislar la glutamato deshidrogenasa de
Streptococcus suis de multitud de muestras diferentes permitiendo realizar su diagnóstico de una forma
rápida y precisa (Okwumabua y col., 2003).
Analizando con detalle las secuencias de las proteínas halofílicas, en general, se observa un alto
contenido en residuos aminoacídicos de carácter ácido (aspártico y glutámico), apareciendo éstos en la
superficie de la proteína (Elcock y McCammon., 1998; Fukuchi y col., 2003) lo cual está sugiriendo la
inestabilidad de las proteínas halofílicas a bajas concentraciones de sal. Sin embargo, la malato
deshidrogenasa de Salinibacter ruber no contiene en su composición aminoacídica una elevada
proporción de residuos acídicos lo que explica su total estabilidad en ausencia de sal (Madern y Zaccai.,
2004).
Al comparar la composición de aminoácidos de varias glutamato deshidrogenasas de E. coli, S.
cerevisiae, Hbt. salinarum (NADP-GDH), bovina, etc., aparece un mayor número de estos residuos
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24
acidídos (Asp y Glu) que en el resto de glutamato deshidrogenasas, así mismo el número de residuos
aminoacídicos básicos (Lys y Arg) es menor en la GDH halófila que en las no halófilas y presenta un bajo
porcentaje de residuos de fenilalanina; en cuanto al resto de los aminoácidos no hay diferencias
significativas en su contenido (Benachenhou y Baldacci, 1991).
La glutamato deshidrogenasa NAD-específica de P. assaccharolyticus muestra una mayor
homología de secuencia con las GDHs bovina y de pollo, que poseen una especificidad dual de
coenzima, que con respecto a la presentada por la NADP-GDH de E. coli. Esto es especialmente
destacable debido a que la GDH de mamíferos posee una regulación alostérica por nucleótidos y la NADGDH de P. assaccharolyticus no (Snedecor y col. 1991).
En el organismo hipertermofílico P. furiosus ES4 (perteneciente al Dominio Archaea) la
secuencia primaria de la glutamato deshidrogenasa presenta una homología del 40 al 50 % con un grupo
de organismos que incluye Clostridium difficile (52%), Hbt. salinarum (48 %), Sulfolobus solfataricus (40
%) y bovina (40 %), y sólo un 33 % con otro grupo que incluye Clostridium symbiosum, E. coli y S.
cerevisiae. Su gen codifica para 420 aminoácidos y la región de control es rica en AT, detectándose un
promotor cuya secuencia es TTTATATA, denominado caja A, que es similar a la caja TATA de eucariotas
y característico de las regiones promotoras de arqueas. También se ha descrito la secuencia TGCA en el
lugar de comienzo de la transcripción, secuencia característica del Dominio Archaea (DiRuggiero y col.,
1993).
El gen que codifica para la NAD-GDH de Hbt. salinarum se transcribe en una única molécula de
RNA con una longitud de 1700 nucleótidos. Este gen codifica a un polipéptido de 435 aminoácidos.
La organización del genoma de Hfx. mediterranei se ha determinado mediante el uso de
electroforesis en campo pulsante (PFGE) y el análisis de patrones de restricción obtenidos con varias
endonucleasas. Estas técnicas ha revelado la presencia de un cromosoma circular de 2,9 Mpb., que es
muy parecido al de Hfx. volcanii, y tres plásmidos de 490, 320 y 130 Kb (López-García y col., 1992).
Haloferax mediterranei es un buen organismo modelo para estudios de organización genómica
debido a que este género muestra una mayor estabilidad en la organización del DNA que el género
Susana Díaz González
25
Halobacterium, constituyendo un modelo en estudios de Biología Molecular en general (López-García y
col., 1995).
1.5. EXPRESIÓN Y RENATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES.
La expresión de genes clonados, habitualmente en E. coli, para la producción de proteínas
recombinantes se ha convertido en una herramienta fundamental para poder llevar a cabo el estudio de
la estructura y función de las proteínas. La obtención de proteína recombinante se puede realizar de dos
formas distintas, mediante expresión homóloga o heteróloga. En el primero de los casos el huésped
utilizado para expresar la proteína de interés es el mismo organismo del que procede la proteína
problema, y en el caso de la expresión heteróloga el huésped es otro organismo diferente. En los
sistemas de expresión homóloga se realiza la modificación postraduccional de las proteínas expresadas
y su correcto plegamiento, procesos que permiten obtener la proteína problema en su estado nativo. Sin
embargo, este sistema no es el más empleado actualmente, ya que existen limitaciones en cuanto a
versatilidad de vectores de expresión se refiere y al tiempo requerido para optimizar el proceso.
Durante los últimos años, el método que más se ha aplicado para la producción de proteínas
recombinantes ha sido la expresión heteróloga. La mayoría de los métodos descritos para este tipo de
expresión utilizan como huésped E. coli por su rápido crecimiento, su amplio conocimiento genético, su
amplia variedad de cepas y de vectores de expresión, pero sobretodo por su capacidad de producir
proteínas recombinantes a gran escala. El único inconveniente es que no permite la modificación
postraduccional de las proteínas, y en muchos casos no proporciona el correcto plegamiento de la misma
dando lugar a la formación de cuerpos de inclusión (Baneyx, 1999).
Empleando E. coli como huésped de expresión se han expresado proteínas en el medio
extracelular, en el espacio periplásmico, y en el citoplasma, siendo este último caso el más habitual. Las
proteínas que normalmente son secretadas se pliegan de forma más adecuada en E. coli cuando son
exportadas al espacio periplásmico. Las proteínas expresadas en el periplasma también pueden formar
agregados como cuerpos de inclusión. Algunas cruzan las membranas internas y externas y pueden
Susana Díaz González
26
dirigirse al medio. Las proteínas exportadas al medio pueden experimentar modificaciones no deseadas
como oxidación o desaminación (Creighton, 1997).
Frecuentemente, las proteínas se expresan en el citoplasma encontrándose de forma soluble, o
formando agregados insolubles que se denominan cuerpos de inclusión. Cuando se consigue de forma
soluble, la proteína puede encontrarse activa o inactiva. En el segundo caso se necesita de un paso
posterior de reactivación para obtener la proteína en su estado nativo. Al obtenerla en forma de cuerpos
de inclusión e inactiva es necesario realizar un paso previo de solubilización, seguido de la
renaturalización in vitro para conseguir finalmente la proteína en su forma activa (Georgiou y col., 1999).
Los cuerpos de inclusión se describen como agregados proteicos densos y refráctiles
resistentes a proteasas y a algunos detergentes, compuestos mayoritariamente por la proteína
recombinante mal plegada e inactiva que se forman en el periplasma de E. coli durante su
superproducción (Marston, 1986; Carrió y col., 2000). Además como consecuencia de sus propiedades
refráctiles se pueden observar fácilmente mediante microscopía electrónica (Misawa y Kumagai, 1999).
Los cuerpos de inclusión son frecuentes en bacterias recombinantes que producen proteínas heterólogas
bajo el control de promotores fuertes, y por lo tanto representan un problema importante en procesos
biotecnológicos destinados a la producción de proteínas (Villaverde y Carrió, 2003).
La formación de cuerpos de inclusión es independiente del huésped empleado para expresar
una proteína, ya que se han obtenido incluso cuando se expresa una proteína endógena (expresión
homóloga). No existe tampoco una relación entre la formación de cuerpos de inclusión y las
características intrínsecas de la proteína a expresar, como son el peso molecular y la hidrofobicidad. Sin
embargo, se ha observado relación entre estos parámetros en caso de que la proteína forme puentes
disulfuro (Lilie y col., 1998). El desequilibrio entre la cantidad de proteínas nacientes y su plegamiento
debido a una alta expresión, parece ser la causa de la agregación de la proteína, y por tanto de la
formación de los cuerpos de inclusión.
En los procesos de producción de proteínas recombinantes la formación de cuerpos de inclusión
presenta ventajas e inconvenientes. Estos agregados son una fuente de proteína recombinante
concentrada y prácticamante pura y que se puede purificar más fácilmente que la proteína soluble.
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27
Además se evita el traslocamiento a través de la membrana lo que evita las posibles modificaciones en la
proteína y por último se encuentra protegida frente al ataque de proteasas periplasmáticas. Por el
contrario, tiene desventajas como la obtención de la proteína de forma inactiva haciendo el proceso de
plegamiento más complejo, habiéndose de optimizar cuidadosamente este proceso (De Bernardez, 2001)
y la ausencia de protección contra las proteasas citoplasmáticas, puesto que se ha visto que con el
tiempo los cuerpos de inclusión parece que pueden ser atacados por éstas proteínas (Carrió y col.,
2000).
La expresión de proteínas halofílicas en huéspedes mesofílicos como E. coli, presenta el
inconveniente de que en la mayor parte de los casos se obtiene en forma de cuerpos de inclusión,
haciéndose necesario un paso posterior de renaturalización de la proteína. Los cuerpos de inclusión se
pueden solubilizar solamente con agentes desnaturalizantes fuertes, en los que las proteínas se
despliegan hasta niveles que dependen del tipo de proteína y del agente desnaturalizante utilizado. Las
proteínas solubilizadas así son altamente flexibles, solvatadas y solubles (Tsumoto y col., 2003). Debido
a que se trata de proteínas halofílicas requieren de la presencia de elevadas concentraciones de sal para
ser activas, solubles y estables. Para solucionar éste problema, se han utilizado disoluciones con altas
concentraciones de sal durante el proceso de renaturalización in vitro. Se podría pensar que la solución
sería realizar la expresión homóloga de dichas proteínas, pero esta opción también presenta dificultades
puesto que se debería comenzar por poner a punto las técnicas de Biología Molecular necesarias en
cada caso. Tal vez, sea por eso por lo que, hasta la fecha, solamente se ha expresado una proteína
halófila de forma homóloga, la dihidrolipoamida deshidrogenasa de Hfx. volcanii (Jolley y col., 1996). Sin
embargo, el número de proteínas expresadas heterólogamente en E. coli es mayor habiéndose
expresado satisfactoriamente, entre otras, la dihidrofolato reductasa (Blecher y col., 1993), la 3-hidroxi-3metilglutaril-coenzima A reductasa (Bischoff y col., 1996), la citrato sintasa, la dihidrolipoamida
deshidrogenasa (Connaris y col., 1998), la isocitrato deshidrogenasa (Camacho y col., 2002) y la glucosa
deshidrogenasa (Pire y col., 2001), todas ellas del género Haloferax, y la malato deshidrogenasa (Cedrin
y col., 1993) de Haloarcula marismortui. La mayoría de ellas se obtuvieron en forma de cuerpos de
inclusión. Solamente la citrato sintasa y la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa se obtuvieron de
forma soluble, aunque en ambos casos se requirió de un paso posterior de reactivación para conseguir la
proteína en su estado nativo.
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28
Se han expresado muchas glutamato deshidrogenasas de diversos organismos utilizando E. coli
como huésped de expresión tales como la
NAD-GDH de Clostridium symbiosum (Teller y col., 1992),
la NADP-GDH del archaeon hipertermofílico Pyrococcus sp. KOD1 (Rahman y col., 1997), NADP-GDH
de P. furiosus y P. furiosus ES4 (DiRuggiero y Robb, 1995; DiRuggiero y col., 1993), la NAD(P)-GDH de
Symbiobacterium toebii (Ha y col., 2003), la NADP-GDH de P. horikoshii (Wang y col., 2003) y la NADGDH de Hbt. salinarum (Hayden y col., 2002).
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2. OBJETIVOS E INTERÉS DEL TRABAJO.
El estudio de la glutamato deshidrogenasa de un organismo halofílico como Haloferax
mediterranei posee gran interés desde el punto de vista de investigación básica en enzimas que
intervienen en el metabolismo del carbono y del nitrógeno.
Los objetivos del presente trabajo son:
•
Purificar y caracterizar la glutamato deshidrogenasa del organismo halofílico Haloferax
mediterranei con el objeto de suministrar información acerca de sus propiedades
moleculares.
•
Secuenciar, clonar y expresar el gen que codifica para la NAD glutamato deshidrogenasa.
•
A partir de la secuencia, realizar comparaciones con enzimas análogas de diferentes
fuentes. Estas comparaciones nos revelan los puntos clave del comportamiento de las
enzimas halofílicas.
•
Renaturalizar la enzima recombinante con el fin de llevar a cabo estudios de plegamiento de
la enzima halofílica.
•
Purificar y caracterizar la enzima NAD-GDH recombinante con la finalidad de realizar su
cristalización.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS.
Todos los reactivos son de grado Biología Molecular excepto los utilizados en los cultivos
celulares. Las disoluciones se prepararon con agua ultrapura tipo MilliQ 18mΩ y se esterilizaron mediante
autoclave (121°C, durante 20 minutos) o por filtración a través de membranas de esterilización de tamaño
de poro de 0,2 μm. Los recipientes y las puntas de micropipeta también se usaron estériles.
3.1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NAD-GLUTAMATO DESHIDROGENASA
NATIVA.
3.1.1. Fuente de microorganismos.
La cepa de Haloferax mediterranei (R-4) empleada en éste trabajo se viene manteniendo en el
Departamento de Agroquímica y Bioquímica.
3.1.2. Medio y condiciones de cultivo.
Para la preparación del medio de cultivo se utilizó una disolución al 25% de sales inorgánicas
cuyo contenido en porcentaje p/v de cada una de ellas es el siguiente (Rodríguez Valera y col., 1980):
NaCl
19,5%
MgCl2.6H2O
3,5%
MgCl2.7H2O
4,9%
CaCl2
0,09%
KCl
0,5%
NaHCO3
0,02%
NaBr
0,06%
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31
Se adicionaron al medio de cultivo 0,5% de extracto de levadura (Difco) y 1% de glucosa. El pH
del medio se ajustó entre 7-7,3 con tampón Tris-HCl 1 M pH 7,5.
Se realizó un precultivo, inoculando con una pequeña cantidad de microorganismos procedentes
de la cepa de Hfx. mediterranei, en un erlenmeyer con 100 mL. del medio de cultivo esterilizado
previamente en un autoclave Selecta Autotester, Modelo 437-G a una temperatura de 121°C y una
atmósfera de presión durante 20 minutos. La glucosa se esterilizó mediante filtración y se añadió
posteriormente al medio. El precultivo se mantuvo, en un incubador HT. Modelo Infors AG con agitación a
37°C y a una velocidad de 135 rpm durante 4 días. Al cabo de éste tiempo el precultivo se sembró en un
matraz conteniendo dos litros de cultivo, esterilizado previamente de igual modo que para el precultivo.
Los matraces se mantuvieron en el incubador a 37°C con agitación a 170 rpm. El cultivo presentaba una
curva de crecimiento típica y al alcanzar la fase estacionaria se detenía el cultivo procediendo a la
cosecha de los microorganismos. Las células cosechadas se almacenaron a –20°C hasta su uso.
3.1.3. Extracto enzimático.
Las células se cosecharon en una centrífuga refrigerada BECKMAN J2-21 con rotor de ángulo
fijo tipo JA-14 a 9000 x g durante 30 minutos, se desechó el sobrenadante y las células se
resuspendieron al 20% peso/volumen en tampón Tris-HCl 50mM pH 7,0 conteniendo sulfato de amonio
2,5 M. Posteriormente, las células fueron disgregadas en un sonicador Branson Sonifier, modelo B12 con
sonda de titanio de 12,7 mm. de diámetro y 150 W de potencia durante periodos de 3 min. con intervalos
de reposo para reestablecer el equilibrio térmico.
La suspensión sonicada se centrifugó en una ultracentrífuga Beckman modelo L5-65 B con rotor
de ángulo fijo tipo 35, durante 1 hora a 28000 x g. El sobrenadante obtenido se utilizó como extracto
enzimático y se sometió posteriormente a distintas etapas de purificación.
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32
3.1.4. Determinación de la concentración de proteína.
Se llevó a cabo mediante el método Bradford (1976) que se basa en el principio de unión
proteína-colorante. El enlace del colorante con la proteína provoca un desplazamiento del máximo de
absorción del colorante desde 465 a 595 nm permitiendo la determinación de concentración de proteína a
partir de la absorbancia a 595 nm.
El reactivo utilizado contiene 0,01 % de Coomassie Brilliant Blue G-250, 4,7 % de etanol y 8,5 %
de ácido fosfórico. El método empleado para determinar la concentración de proteína consistió en añadir
1 mL del reactivo a 100 μL de la disolución de proteína en una cubeta de 1,5 mL de capacidad,
midiéndose la absorbancia a 595 nm tras incubar 5 minutos frente a un blanco preparado con agua. La
concentración de proteína se obtuvo mediante la correspondiente curva de calibrado realizada utilizando
como patrón albúmina de suero bovino.
3.1.5. Determinación de la actividad enzimática de la proteína.
La
medida
de
actividad
de
la
NAD-glutamato
deshidrogenasa
se
realizó
espectrofotométricamente siguiendo la variación de absorbancia a 340 nm debido a la reducción de NAD+
a NADH. Se utilizó un espectrofotómetro Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech. La reacción se llevó a cabo
en cubetas de 1 cm a 40ºC en volumen total de 2 mL. La mezcla de reacción contenía tampón Gly-NaOH
0,1 M, pH 8,5 y NaCl 4 M de forma habitual o el tampón adecuado a cada uno de los ensayos de
caracterización. Los sustratos se añadieron a una concentración de 0,3 mM de NADH , 20 mM de 2oxoglutarato y 50 mM de amonio. Se incubó a 40ºC durante 2 min. antes de iniciar la reacción añadiendo
el coenzima NADH. Las condiciones de la reacción fueron optimizadas experimentalmente.
Se definió la Unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que es capaz de
transformar un micromol de sustrato por minuto, en las condiciones de ensayo descritas, de acuerdo con
la definición de la Unidad Internacional de enzima (U). El valor de absortividad molar del NADH es 6,3 x
103 M-1 x cm-1
Susana Díaz González
33
3.1.6. Cromatografía en Sepharosa 4B.
El procedimiento utilizado fue similar al realizado por Bonete y col., (1986; 1987). Se hizo pasar
el extracto enzimático a través de una columna (Pharmacia 53,4 x 2,6 cm) empaquetada con 220 mL de
Sepharosa 4B equilibrada en tampón Tris-HCl 50 mM pH 7,0 y 2,5 M de sulfato de amonio. La elución de
la proteína se realizó aplicando un gradiente lineal desde 2,5 M a
0,5 M de sulfato de amonio a
temperatura ambiente. El tampón conteniendo 0,5 M sulfato de amonio se suplementó con un 20% de
glicerol para evitar pérdidas de actividad de la enzima a bajas concentraciones de sal. Se recogieron
fracciones de 5 mL/tubo a una velocidad de 40 mL/hora.
3.1.7. Cromatografía en Blue-Sepharosa.
La unión del colorante con la matriz de Sepharosa se realizó utilizando Sepharosa 6B-CL en
suspensión acuosa a la que se añadió una disolución del colorante Cibacron-Blue F3GA (Fluka). La
mezcla se mantuvo en agitación continua durante 30 min. Posteriormente se añadió NaCl hasta una
concentración de 0,5 M y se mantuvo la agitación durante 30 min. A continuación se adicionó NaOH
hasta una concentración 0,5 M y se continuó agitando la mezcla a temperatura ambiente durante 72
horas. Tanscurrido este tiempo se filtró y lavó abundantemente con agua, NaCl 1 M, y de nuevo agua
hasta que no eluyó colorante sin unir. Seguidamente, se empaquetó en una columna de 1,5 x 50 cm
(SIGMA) y se equilibró con tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,0 y glicerol 20%. La muestra obtenida en la
etapa anterior de purificación se introdujo en esta columna a una velocidad de flujo de 20 mL/hora,
recogiéndose fracciones de 3 mL/tubo. La columna, se lavó con el tampón de equilibrado y eluyéndose la
proteína utilizando tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 y NaCl 3M. Las fracciones con mayor actividad NADglutamato deshidrogenasa se recogieron y utilizaron en el siguiente paso de purificación.
3.1.8. Cromatografía Sephacryl S-300.
La columna se HiPrepR Sephacryl-S300 (Pharmacia Biotech) se equilibró con tampón Tris-HCl
20 mM, pH 7,0 y NaCl 3 M. Esta cromatografía de tamizado molecular se llevó a cabo a una velocidad de
30 mL/hora recogiéndose fracciones de 2 mL/tubo. La salida de proteína se determinó midiendo la
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34
absorbancia a 280 nm. Los tubos con mayor actividad se recogieron y se utilizaron para su
caracterización y análisis electroforético.
3.1.9. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS.
Para determinar el grado de pureza de la enzima se efectuaron electroforesis analíticas de la
purificación. La electroforesis se realizó en geles de poliacrilamida y en condiciones desnaturalizantes. El
peso molecular de la subunidad proteica fue obtenido con la misma técnica.
El sistema empleado en la electroforesis fue el de Laemmli (1970), es un sistema de geles en
discontínuo, el gel superior concentra las muestras de proteína procurando una mejor resolución de la
banda y la separación de las moléculas de proteína se realiza en el gel inferior o gel separador. En el
apéndice I, se muestran las disoluciones empleadas y el modo de preparación de los geles.
Para el desarrollo electroforético se utilizó un equipo “Mini Protean II” de la casa Bio-Rad. Los
geles se fijaron y tiñeron siguiendo el método propuesto por De Moreno y col., en 1985.
3.1.10. Determinación de la masa molecular de NAD-GDH nativa y del tamaño de subunidad.
3.1.10.1. Determinación de la masa molecular mediante tamizado molecular.
La determinación de la masa molecular mediante tamizado molecular, se realizó exactamente
igual a como se ha descrito en la etapa de purificación del apdo. 3.1.8, aunque en este caso, la columna
se calibró previamente con proteínas de masa molecular conocida. Las proteínas utilizadas fueron:
ferritina (425 kDa), catalasa (240 kDa), aldolasa (158 kDa), albumina (68 kDa) y citocromo c (12,5 kDa).
A partir de los volúmenes de elución para cada proteína se calculó su constante de reparto (Kav) y se
representó el logaritmo de su masa molecular frente a Kav. De la recta patrón obtenida se determinó la
masa molecular de la NAD-glutamato deshidrogenasa tanto nativa como recombinante, a partir de su
correspondiente valor de Kav.
Susana Díaz González
35
3.1.10.2. Determinación del tamaño de subunidad mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida en presencia de SDS.
Se preparó un gel de poliacrilamida tal como se describe el apdo. 3.1.9 y se llevó a cabo la
electroforesis correspondiente. En este caso, se utilizaron un conjunto de proteínas patrón de masa de
subunidad conocida que se cargaron en una de las calles del gel. Los patrones utilizados fueron los
proporcionados por la casa MBI Fermentas: Protein Molecular Weight Marker (#SM0431) compuesto por:
β-galactosidasa de E. coli (116,0 kDa), BSA (66,2 kDa), ovoalbúmina (45,0 kDa), lactato deshidrogenasa
de músculo porcino (35 kDa), endonucleasa de restricción de E. coli (25,0 kDa), β-lactoglobulina de leche
bovina (18,4 kDa) y lisozima de huevo (14,4 kDa).
Una vez realizada la electroforesis y teñido el gel con azul Coomassie se determinó la movilidad
electroforética relativa (Rf) de cada una de las proteínas patrón y la de la proteína nativa, y recombinante.
De la representación del logaritmo de la masa molecular de subunidad frente a Rf se obtuvo una recta a
partir de la cual se determinó la masa molecular de subunidad de la enzima.
3.1.11. Determinación de parámetros cinéticos.
Para el cálculo de los parámetros cinéticos, Vmax (velocidad enzimática máxima), Km (constante
de Michaelis-Menten) y Vmax/Km (eficacia catalítica), se determinó la actividad de la NAD-glutamato
deshidrogenasa en el sentido de aminación reductiva, manteniendo constante y a concentración
saturante dos de los sustratos y variando el sustrato estudiado. El sustrato 2-oxoglutarato, se varió desde
una concentración de 2,2 mM hasta 20 mM, manteniendo la concentración de NADH en 0,3 mM y la de
acetato de amonio en 0,1 M.
El sustrato NH4+ se varió entre 11 mM y 100 mM manteniendo constante la concentración de 2oxoglutarato en 20 mM y NADH en 0,3 mM. Por último, se varió el coenzima desde una concentración
entre 0,03 mM y 0,3 mM manteniendo fijas las concentraciones 20 mM de 2-oxoglutarato y 0,1 M de
acetato de amonio.
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36
En todos los casos, la representación de Lineweaver-Burk dió lugar a una recta confirmando un
comportamiento cinético de la enzima de tipo Michaelis-Menten. Para el cálculo numérico de los
parámetros cinéticos se ajustaron los datos de velocidades iniciales obtenidos para cada una de las
concentraciones de los sustratos variados, utilizando la ecuación de Michaelis-Menten (Ecuación 1 ),
utilizando el programa informático SigmaPlot (Jandel Scientific, v. 1.02).
v = Vmax x S/ (Km + S)
(1)
Esta ecuación se reagrupó para el cálculo de Vmax/Km de la siguiente forma:
v = Vmax/Km x S/ (1 + S/Km)
(2)
En la Ecuación (2) aparecen como parámetros la eficacia catalítica (Vmax/Km) y la constante de
Michaelis-Menten (Km).
3.2. COMPORTAMIENTO FRENTE A LA CONCENTRACIÓN DE SALES, TEMPERATURA Y
pH.
3.2.1. Efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática.
Para estudiar el efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática, se midió la
actividad tanto de la NAD-GDH nativa como recombinante en tampones conteniendo la concentración de
sal ensayada. El tampón utilizado, fue Bis-Tris Propano 100 mM, pH 8,5 conteniendo NaCl o KCl en
concentraciones de 0,5 M hasta 4 M de cada una de las sales.
Una vez medida esta actividad, se representó frente a la concentración de sal correspondiente y
de la curva obtenida se determinó la concentración óptima de sal para la reacción catalizada por la NADGDH.
Susana Díaz González
37
3.2.2. Efecto de las sales sobre la estabilidad.
En este caso, se utilizó una muestra enzimática altamente concentrada y se ajustó la
concentración de NaCl mediante dilución al valor ensayado. Se midió la actividad justo en el momento de
ajustar la concentración de sales y se tomó como actividad inicial. Cada cierto tiempo, se tomó una
alícuota determinándose su actividad y refiriéndola a la actividad inicial como actividad residual (%). El
logaritmo de los valores de actividad residual se representó frente al tiempo, obteniéndose en todos los
casos una línea recta. A partir de la pendiente de esta recta, se estimó el tiempo de vida media que es el
tiempo necesario para que la enzima conserve el 50% de su actividad inicial. Para observar el efecto de
concentración de sales en la estabilidad de la enzima, se tomaron alícuotas en un tiempo suficiente para
apreciar cambios significativos en su actividad.
3.2.3. Efecto de la temperatura en la actividad enzimática.
De la misma forma que en el apartado anterior se utilizó una muestra enzimática muy activa y se
realizó el ensayo de actividad a diferentes temperaturas en un rango de 283K a 353K. La temperatura se
controló en cada momento mediante un termómetro digital y se mantuvo constante utilizando un baño
termostatizado a la temperatura deseada. La enzima se preincubó en el tampón de actividad a dicha
temperatura durante el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio térmico. Una vez realizadas todas las
medidas se refirieron a la actividad máxima medida como porcentaje de actividad residual. De la
representación del porcentaje de actividad residual frente a la temperatura se pudo determinar el rango
de temperaturas óptimo para la reacción.
3.2.4. Determinación del pH óptimo de actuación.
Para estudiar el efecto del pH sobre la actividad enzimática, se midió ésta para la NAD-GDH
tanto nativa como recombinante en tampones conteniendo NaCl o KCl 4 M. El tampón utilizado fue BisTris Propano 100 mM, conteniendo NaCl o KCl 4 M y en un rango de pH entre 6,2 y 9,5. Una vez medidas
las actividades a cada pH, se representaron éstas frente al pH correspondiente y de la curva obtenida se
determinó el rango de pHs óptimos para la reacción catalizada por la enzima.
Susana Díaz González
38
3.3. SECUENCIACIÓN DEL EXTREMO N-TERMINAL.
Para la secuenciación del N-terminal de la enzima nativa, se procedió a su transferencia a una
membrana PVDF (“Immobilon P”). Previamente a su transferencia se realizó una electroforesis inicial
SDS-PAGE al 12,5% acrilamida/bisacrilamida en una Protean-Biorad. Una vez terminada, se sumergió el
gel durante 20 minutos en el tampón de transferencia (50 mM Tris, 50 mM glicina, 20% metanol) y se
procedió a la transferencia. Se cortaron 2 membranas de PVDF (“Immobilon P”) del mismo tamaño que el
gel, se humedecieron de 3 a 5 segundos con metanol al 100% y se lavaron en agua para eliminar el
metanol. Las membranas se sumergieron en tampón de transferencia y se colocaron en el siguiente
órden sobre el electrodo positivo: 7 trozos de papel Whatman 3 MM del tamaño del gel humedecido en
tampón de tansferencia, las dos membranas de PVDF (“Immobilon P”), el gel de electroforesis, otros 7
trozos de papel Whatman 3 MM, se realizó la transferencia durante 2 horas a una corriente constante.
Posteriormente, se tiñó la membrana con una disolución de azul Coomassie 0,025% (p/v) en metanol
50% y acético 10%. Se destiñó con una disolución de acético 10%, metanol 50% y se lavó con agua. La
secuenciación del extremo N-terminal se llevó a cabo en el Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa"
por el Dr. J. Berenguer.
3.4. AISLAMIENTO DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei.
3.4.1. Extracción de DNA de Hfx. mediterranei.
Se preparó un cultivo del microorganismo en un medio con sales al 25% y extracto de levadura
al 0,5%, suplementado con glucosa al 1%, el pH del medio se ajustó a 7,4 con tampón Tris-HCl 1M pH
7,4. Se incubó a 37°C con agitación constante en un incubador Infors-AG.
El cultivo se detuvo en la fase exponencial del crecimiento, y la extracción del DNA se realizó,
según Ausubel y col. (1989), a partir de 15 mL de cultivo. Las células se lisaron con SDS al 10% y se
trataron con proteinasa K a una concentración de 20 mg/mL durante 1 hora a 37°C. A continuación se
trató con NaCl/CTAB durante 10 minutos a 65°C y se adicionó cloroformo/alcohol isoamílico 24:1. Los
desechos de la membrana celular, proteínas desnaturalizadas y polisacáridos acomplejados a CTAB,
Susana Díaz González
39
quedan en la fase orgánica, mientras que los ácidos nucleicos se mantienen en la fase acuosa. La
extracción se repitió con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico 25:24:1. El DNA precipitado con isopropanol
se lavó con etanol al 70%. El precipitado se resuspendió en 0,5 mL de agua ultrapura estéril. Para
resuspender el DNA se mantuvo durante varios días en un baño a 37°C hasta su total disolución.
Se empleó alternativamente otro método para la extracción del DNA en el que la lisis de las
células se realizó en agua y la extracción con fenol saturado pH 8,0. (Dyall-Smith y Doolittle, 1994).
3.4.2. Medida de la concentración de DNA genómico.
La concentración de DNA se midió espectrofotométricamente registrando la absorbancia de la
muestra a 260 nm. Para DNA puro, un valor de absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 50
μg/mL. La pureza de la muestra se estimó leyendo la absorbancia a 280 nm. Para DNA puro la relación
A260/A280 debe estar entre 1,8-2.
3.4.3. Electroforesis en gel de agarosa.
Para visualizar el DNA se realizó una electroforesis en agarosa al 0,8% en tampón TAE 1X
(apéndice I) con 0,5 μg/mL de bromuro de etidio. Las muestras se prepararon con distintas
concentraciones de DNA, tampón de carga (apéndice I), y en algunos casos agua ultrapura para ajustar
los volúmenes. El patrón empleado, Marker III (Fermentas) se preparó del mismo modo.
Dependiendo de las necesidades, se trabajó con geles de dimensiones 10x8 cm o 11x15 cm.
Los soportes de los geles fueron suministrados por la casa comercial Ecogen. La electroforesis se corrió
a 80V durante aproximadamente 2 o 3 horas, dependiendo del tamaño del gel, en tampón TAE 1X con 103
μg/mL de bromuro de etidio. La fuente empleada, Electrophoresis Power Suply EPS 500/400, fue
suministrada por Pharmacia. Una vez terminada la electroforesis, se observaron las bandas teñidas con
bromuro de etidio mediante un transiluminador UV Spectroline, Modelo TC-312A. El gel se fotografió con
una cámara Kodak Digital Science DC40, para observar de éste modo las bandas obtenidas.
Susana Díaz González
40
3.4.4. Generación de un producto de PCR de 203 pb.
A partir de la secuencia conocida del N-terminal de la NADP-glutamato deshidrogenasa de Hfx.
mediterranei (Ferrer, 1995) se diseñó un oligonucleótido en el que se introdujeron degeneraciones. Se
utilizó también en la generación del producto de PCR un oligonucleótido degenerado antisentido
construido mediante alineamiento múltiple de glutamato deshidrogenasas de las bases de datos y que
corresponde con una secuencia consenso de GDHs.
Para el diseño de los oligonucleótidos se utilizaron los programas Net Primer (PREMIER; BiosofInternational) y Oligo Calculator (Molecular Biology Core Facilities: DANA-FARBER: Cancer Institute) para
comprobar la ausencia de formación de dímeros, realizar el cálculo de la Tm del oligonucleótido a diseñar
y el contenido en GC. Los oligonucleótidos diseñados y solicitados a las casas Gibco y Applied
Biosystems fueron los siguientes:
La secuencia degenerada correspondiente al N-terminal de la NADP-GDH de Hfx. mediterranei, fue:
N-ter- 5’-GCSCAGGAGGCSAACCCSTTCGAG-3’
La secuencia consenso conservada en GDHs que se encuentra a aproximadamente 300 pb. del
N-terminal de GDHs. Es una secuencia antisentido que codifica para los aminoácidos MTWMTK.
ConsI- 5’-GCSGTCTTCCASGTCATCCA-3’
Siendo S el aminoácido degenerado que puede ser C ó G.
Se utilizó un termociclador 2400 con sistema de enfriamiento Peltier de Perkin-Elmer. Las
condiciones y cantidades de reactivos de la PCR se optimizaron modificando la temperatura de
hibridación y el tiempo de elongación. La concentración final de Mg2+ fue de 1,5 mM, empleándose 2,5 U
de Taq polimerasa y 1 μg de DNA genómico en la reacción de amplificación del fragmento. Se probaron
diferentes temperaturas de hibridación y cantidades de oligonucleótidos, localizándose diferentes bandas
en las amplificaciones.
Susana Díaz González
41
3.4.5. Secuenciación del producto de PCR de 203 pb.
En general, la secuenciación de DNA se realizó en secuenciadores ABI PRISMTM 310 y 3100
Genetic Analyzer de Applied Biosystems, empleando el método de Sanger de terminación de cadena y
utilizando terminadores didesoxi marcados, con la utilización de cebadores específicos. La secuenciación
se realizó en la Unidad de Biología Molecular y Análisis Genético de los Servicios Técnicos de
Investigación de la Universidad de Alicante.
El método se basa en la acción de los cuatro terminadores didesoxi (ddNTPs) marcados con
diferentes marcadores fluorescentes, en la reacción de PCR. La reacción de marcaje se realizó
empleando el kit de secuenciación ABI PRISMTM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit, que proporciona premezclados los cuatro terminadores marcados así como , dITP, dATP, dCTP,
dTTP, Tris-HCl pH 9,0, MgCl2, pirofosfatasa termoestable, y AmpliTaq DNA Polymerase, FS. Esta enzima
es un mutante de la Taq polimerasa que no posee actividad nucleasa 5’-3’ y en la que se ha reducido
drásticamente la discriminación por los didesoxinucleótidos.
Una vez finalizada la reacción de amplificación se purificaron diferentes bandas a partir de gel de
agarosa con kit “GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit” de Amersham Pharmacia Biotech.
La reacción de secuenciación se realizó con 50 ng de cada una de las bandas, 4 pmol. de
oligonucleótidos N-ter y consenso, 4 μL de Premix (BigDye terminator) completándose con agua hasta un
volumen final de 10 μL.
Acabada la reacción de secuenciación se llevó a cabo la purificación de la misma mediante la
eliminación de ddNTPs no incorporados en la reacción. La columnas que se emplearon para la
purificación fueron Centri-Sep Columns de Princeton Separations.
Los cebadores empleados para dicha secuenciación fueron los mismos que se utilizaron en la
amplificación del producto de PCR. El programa para la adquisición de datos primarios utilizado fue ABI
Susana Díaz González
42
Prism 310 Collection v 1.2.2, y el análisis de las secuencias obtenidas se llevó a cabo con el programa
Sequencing Analysis v 3.1 de Applied Biosystems.
3.4.6. Marcaje no radiactivo del producto generado. DOT BLOT.
Con la finalidad de localizar la glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei se realizó el
marcaje no radiactivo del producto de PCR previamente secuenciado, utilizando el “PCR DIG Probe
Synthesis Kit” de Boehringer Mannheim. Este sistema emplea digoxigenina para marcar directamente
fragmentos de DNA generados por el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la
hibridación y posterior detección.
Para comprobar que el producto de PCR se había marcado correctamente, se realizó un DOT
BLOT, que consiste en la detección de diferentes diluciones del producto marcado para así estimar la
mejor concentración de sonda a preparar. Para ello, se realizaron diluciones de la sonda 1/10, 1/100,
1/1000, 1/10000 y 1/100000 y se colocaron en una membrana de nitrocelulosa junto con una batería de
disoluciones control de concentraciones conocidas. Se llevaron a cabo los pasos de detección que se
utilizan en las técnicas de hibridación.
3.4.7. Preparación de una genoteca de Hfx. mediterranei en fago lambda.
Para la preparación y amplificación de la genoteca se siguió el protocolo recomendado por el
manual del kit empleado para la construcción de la misma: “EMBL3 BamHI Arms Genomic Cloning
System” (Promega), y los protocolos de Sambrook y col., (1989) en el que se indican los pasos a seguir
para la preparación de las células hospedadoras, la infección de éstas por la genoteca, así como la
técnica de siembra en placa. La amplificación de la genoteca permitió determinar la eficacia del
empaquetamiento y, como consecuencia, la representatividad de todo el genoma. Dicha representatividad
se calcula mediante la estimación del número de recombinantes con una probabilidad de que un clon de
la genoteca tenga una secuencia determinada. La genoteca disponible en nuestro departamento posee
una probabilidad del 99%, lo que significa que estadísticamente en 1000 calvas de lisis se encuentra todo
el genoma representado dado que la eficiencia en la construcción de la genoteca es de 2x104 unidades
Susana Díaz González
43
formadoras de calvas/mL, de tal forma que en 50 μL de la genoteca habrá al menos un clon que
contenga la secuencia buscada. Una vez amplificada la genoteca se conservó a – 80ºC.
3.4.8. Preparación, crecimiento e infección de células XL1-Blue P2.
Teniendo en cuenta el rendimiento obtenido en la construcción de la genoteca, se realizaron
diferentes diluciones en tampón SM (apéndice I), con el fin de obtener placas con calvas de lisis aisladas.
El rango de diluciones empleado fue de 1:10 a 1:1000. Una vez obtenida la dilución óptima se trabajó en
todo momento con esta, siendo en nuestro caso 1:100.
Las células hospedadoras empleadas fueron XL1-Blue P2. Se inoculó una colonia en un medio
de cultivo de LB (Luria-Bertani) (apéndice I) suplementado con 10 mM de MgSO4 y 0,2% (p/v) de maltosa.
El crecimiento se detuvo a una OD600 de entre 0,5 y 1, centrifugándose posteriormente a 500 x g durante
10 minutos. El precipitado se resuspendió suavemente en el doble del volumen inicial con 10 mM de
MgSO4, diluyendo las células hasta una OD600 de 0,5. El crecimiento con MgSO4 y maltosa facilita la
adsorción e infección del fago. Para la adsorción el fago emplea receptores codificados por el gen lamB
cuya función es el transporte de maltosa, y cuya expresión es inducida por su presencia en el medio.
Se alcanzó un volumen final de 2 mL de células hospedadoras que fueron infectadas con 2 mL
de la genoteca diluida 1:100. Se incubó la mezcla durante 30 minutos a 37ºC para permitir la infección.
Tras la infección se sembraron en placas Petri con medio de cultivo LB-agar al 2% y LB Top agar. El LB
Top agar consiste en el mismo medio de cultivo, pero con 0,7% de agarosa en lugar de agar. Esta
suspensión debe reservarse a 48ºC (para evitar la solidificación) hasta el momento de la siembra. Se
mezclaron 200 μL de las células infectadas con 3 mL de LB Top agar (cantidad recomendada para placas
Petri de 9 cm). Rápidamente se repartió uniformemente sobre placas de LB agar precalentadas a 37ºC.
Se dejó solidificar el Top agar y se incubó a 37ºC durante toda la noche. El número de placas debe ser
alrededor de 20 para que los resultados obtenidos sean estadísticamente representativos. Una vez
obtenidas las placas con calvas de lisis aisladas y en las que se encuentra representado todo el genoma
de Hfx. mediterranei se lleva a cabo la hibridación en placa empleando la sonda de 203 pb. obtenida para
glutamato deshidrogenasa.
Susana Díaz González
44
3.4.9. Hibridación de la genoteca con el producto de PCR de 203 pb. marcado.
Las calvas de lisis de las placas se transfirieron a membranas de nylon HybondN+ de Amersham
Biosciences para llevar a cabo la hibridación. Las placas se enfriaron a 4ºC durante 30 minutos para
evitar romper o deteriorar la capa de LB Top agar durante la transferencia.
Las membranas de nylon se colocan sobre la superficie de la placa evitando generar burbujas,
se deja transferir durante 1 minuto, tiempo durante el cual se señala la orientación relativa de la
membrana para su localización posterior en la placa. Las membranas se separan de las placas y se
sumergen en la disolución de desnaturalización (apéndice I) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Empleando papel Whatman 3MM se secan parcialmente las membranas y se incuban en la
disolución de neutralización (apéndice I) durante 15 minutos. A continuación, se realiza una incubación de
10 minutos a temperatura ambiente en 2XSSC. Finalmente, se secan las membranas totalmente en papel
Whatman 3MM.
Una vez secas las membranas, se fijaron las calvas de lisis transferidas, irradiándolas con luz
ultravioleta durante 1 minuto por cada lado, comenzando por la parte que no contenía las calvas. La
fuente de UV empleada fue Spectroline Modelo TC-312A.
La hibridación de las membranas se llevó a cabo en un horno de hibridación, empleando 10 mL
de una solución de hibridación (apéndice I) que contenía 40 ng de la sonda de 203pb. marcada con
digoxigenina, durante toda la noche a 68ºC. Previamente es necesario realizar una incubación durante
una hora a 68ºC en una solución de prehibridación que posee la misma composición que la de hibridación
excepto la sonda que no se adiciona en este tratamiento previo a la hibridación. Con este paso se
preparan las membranas bloqueando los sitios de unión no específicos de ácidos nucleicos sobre la
membrana. Se lavó la membrana en un horno de hibridación Hybridisier HB-2D de la marca Techne, en
tubos giratorios durante 2 horas a la temperatura de hibridación. Dicha temperatura ha de ser
determinada experimentalmente para obtener las mejores condiciones de hibridación. La solución de
hibridación se incubó en un baño hirviendo durante 10 minutos, enfriándose posteriormente en hielo
Susana Díaz González
45
durante 5 minutos antes de ser añadida a las membranas, de esta manera se consiguen desnaturalizar
las hebras de la sonda para poder llevar a cabo la hibridación con el DNA fijado en las membranas. La
solución de hibridación se incubó con las membranas en el horno de hibridación a 68°C durante la noche.
Posteriormente, se llevaron a cabo los lavados siguientes para eliminar la sonda unida
inespecíficamente:
-
2 veces, 5 minutos cada vez en 2XSSC (apéndice I), 0.1% SDS a temperatura ambiente.
-
2 veces, 15 minutos cada vez en 0.1XSSC, 0.1% SDS a 68ºC.
La detección se realizó de acuerdo a los protocolos de Roche Molecular Biochemicals (1995).
En este proceso se usa un anticuerpo frente a la digoxigenina que contiene la sonda marcada. Dicho
anticuerpo tiene unido un fragmento activo de la enzima fosfatasa alcalina. Una vez unido la antidigoxigenina-fosfatasa alcalina a la sonda, se utiliza un sustrato quimioluminiscente para la fosfatasa
alcalina (CSPD®) (apéndice I), de forma que al exponer la membrana a una placa autorradiográfica, ésta
queda impresionada en los lugares en los se encuentra la sonda hibridada. Este último paso de la
detección se realizó por exposición de las membranas a una placa autoradiográfica Curix RP2 de Agfa.
El revelado de la placa se llevó a cabo como sigue:
-
Sumergir la placa de 15 a 60 segundos en revelador G150 de AGFA diluido 1:4.
-
Baño de paro en ácido acético al 10% (v/v), durante 1 minuto.
-
Fijación durante 5 minutos en Agefix de AGFA diluido 1:5.
Todos estos pasos se realizaron en cámara oscura con luz roja, y a partir de aquí con luz blanca.
-
Lavado de la placa con agua destilada.
-
Secar al aire.
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46
En la figura 3 se resumen los principales pasos descritos.
Figura 3: Esquema de la localización de genes en una genoteca construida en fago λ.
A partir de los resultados obtenidos en las placas autorradiográficas, en las que se observaban
diferentes positivos, se realizó un segundo proceso de selección aislando varios de ellos mediante
extracción de la calva de lisis correspondiente de la placa original con ayuda de una pipeta Pasteur y
posterior difusión del fago en una disolución de cloroformo a una concentración final del 5% (v/v) en
tampón SM (apéndice I). Para esta segunda búsqueda las calvas aisladas se usaron para infectar de
nuevo células E. coli XL1-Blue P2 (5 μL de la calva resuspendida en 200 μL de células preparadas tal y
como hemos descrito anteriormente), se siguen los mismos pasos que para la primera búsqueda.
Las placas autorradiográficas, en este caso, sólo poseen positivos si la calva original es
realmente positiva para el gen de interés.
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47
3.4.10. Aislamiento de DNA de fago.
A partir de las calvas obtenidas en el segundo screening se procedió al aislamiento del DNA de
fago tal y como se detalla en el siguiente protocolo:
-
Se preparó un cultivo de células E. coli XL1-BLUE P2 en medio LB con un 20% de
maltosa y MgSO4 10mM.
-
Posteriormente a la inoculación se incubó a 37°C hasta que la Abs600 fue
aproximadamente de 0,5.
-
Una vez se tuvo el cultivo celular preparado, se realizó la infección con 50μL de lisado
de fago incubando la mezcla a 37°C con agitación durante aproximadamente 30
minutos.
-
Finalizado el tiempo de incubación se añadió la mezcla anterior a un erlenmeyer
conteniendo 100 mL de medio LB, 10 μL de DNAsa/RNAsa y MgSO4 10mM y se realizó
una nueva incubación a 37°C durante la noche.
-
Transcurrido este tiempo se añadieron 500 μL de cloroformo a los 100 mL anteriores,
incubándose a 37°C durante 15 minutos.
-
Centrifugar a > 8000 x g durante 10 minutos descartando el precipitado que
corresponde a los desechos celulares.
-
Finalizado el proceso, se guardaron 50 mL del lisado y el resto (150 mL) se pasó a
tubos de centrífuga.
Posteriormente se aplicó el kit de aislamiento de DNA de fago MAXI Lambda Kit de QIAGEN
resuspendiéndose el DNA en agua ultrapura estéril.
3.4.11. Secuenciación de fagos positivos.
Utilizando el método de secuenciación descrito en el apartado 3.4.5, se procedió a realizar la
secuenciación de los fagos que dieron señal positiva tras la hibridación. Puesto que se trata de DNAs
Susana Díaz González
48
grandes se realizaron modificaciones en el programa de PCR para secuenciación, que consistieron en la
desnaturalización previa del DNA a secuenciar y en un aumento del número de ciclos de hibridación con
el oligonucleótido utilizado en la secuenciación. La estrategia que se siguió fue la secuenciación por
Primer Walking (paseo con oligonucleótidos), en la que se fueron diseñando diferentes oligonucleótidos a
lo largo de la secuencia obtenida de la NAD-glutamato deshidrogenasa.
3.4.12. Análisis de secuencias.
Las secuencias se trataron con el grupo de programas GCG (Genetics Computer Group) de la
Universidad de Wisconsin, a los que se accedió a través del nodo español de EMBL (Centro Nacional de
Biotecnología de la Universidad Autónoma de Madrid).
Para realizar la comparación del producto de PCR con el que se había buscado en la genoteca
construida en fago lambda, se utilizó el programa BESTFIT y GAP en los que se realiza la comparación
de 2 secuencias indicadas previamente. La traducción de las secuencias a aminoácidos se realizó con el
programa MAP. El programa proporciona los 6 posibles marcos de lectura de la secuencia. Se trabajó
tanto con los seis marcos como con los ORFs (Open Reading Frame), es decir las secuencias que
codificarían para una proteína, con comienzo en ATG (metionina) y finalización en uno de los codones de
terminación: TAA, TAG o TGA.
Se utilizó el programa FASTA, que emplea el método de Pearson y Lipman (1988), para buscar
el porcentaje de similaridad y de identidad entre una secuencia y un grupo de secuencias del mismo tipo
(ácidos nucleicos o proteínas), se comparó la secuencia con las bases de datos SwissProt y PIR.
Los alineamientos múltiples con otras secuencias procedentes de las bases de datos se
realizaron con el programa CLUSTALW (Thompson y col., 1994).
Los parámetros bioquímicos como la composición aminoacídica, la masa molecular teórica de
subunidad, el índice alifático, etc. se calcularon con ayuda del programa PROTPARAM TOOL del
Servidor EXPASY (Swiss Institute of Bioinformatics).
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49
La estimación de los codones más frecuentemente utilizados en la NAD-GDH de Hfx.
mediterranei se realizó con el programa CODONFRECUENCY también del paquete informático GCG. La
tabla, se completó visualmente mediante la correspondencia con la compilación propuesta por Soppa
(1994).
La predicción de la estructura secundaria se realizó con los programas PSIPREDICTION
(McGuffin y col., 2000) (Proteomic Tools Secondary Structure Prediction) de Expasy Molecular Biology
Server del Swiss Institute of Bioinformatics, y con el programa PREDATOR (Frishman, y Argos, 1996;
1997) (Protein Secondary Structure Prediction from a single sequence or a set of sequence) de Network
Protein Sequence analysis del Pôle Bioinformatique Lyonnais.
3.4.13. Construcción del modelo estructural de NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx.
mediterranei.
Para realizar el modelo atómico se escogió la estructura tridimensional disponible de Thermotoga
marítima y el alineamiento con otras GDHs como guía para introducir pequeñas inserciones o delecciones
en el lugar adecuado utilizando el programa FRODO (Jones y col., 1985). La visualización del monómero
de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei y de la imagen tridimensional del motivo de unión del 2-oxoglutarato,
se realizó con el programa Swiss-Pdb Viewer 3.51 de Glaxo Welcome Experimental Research.
Para la representación de la imagen tridimensional de la estructura del monómero se empleó el
programa RasWin Molecular Graphics v2.6.
3.5. CLONAJE DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei.
Una vez se obtuvo el fago que contenía el gen que codificaba para la NAD-GDH de Hfx.
mediterranei, se procedió a la amplificación del gen a partir del DNA de fago y se realizó su clonaje en un
vector que permitiera su incorporación como si se tratase de un producto de PCR.
Susana Díaz González
50
Puesto que el objetivo final era realizar la expresión del gen, se diseñaron 2 oligonucleótidos que
contenían los sitios de corte para las enzimas de restricción NdeI y BamHI, con el fin de facilitar el clonaje
en el vector de expresión pET3a.
3.5.1. Amplificación mediante PCR del gen que codifica la NAD-GDH de Hfx. mediterranei.
Para realizar la amplificación del gen se utilizó el DNA de fago y los 2 oligonucleótidos que
contenían las secuencias de corte para BamHI y NdeI. La secuencia de dichos oligonucleótidos fue la
siguiente:
Nad-gdhFOR 5’ GCCACTCGACATATGCAGAC 3’
Nad-gdhREV 5’ GAGTGCAGACCTAGGGAG 3’
Se muestran en negrita las secuencias de restricción para las enzimas NdeI y BamHI.
La reacción de PCR se preparó de la siguiente manera:
Reacción
Reacción Control
62,9
66,9
Tampón PCR 10X
10
10
MgCl2 (50mM)
3
3
dNTPs
1,6
1,6
Nad-gdhFOR
8,4
8,4
Nad-gdhREV
8,4
8,4
4
------
DMSO
1,2
1,2
EcoTaq
0,5
0,5
Volumen total (μL)
100
100
H2O ultrapura
Fago 14-7
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El equipo de PCR utilizado fue un “Gene Amp PCR System 2400” de Applied Biosystems, y las
condiciones de la reacción fueron las siguientes:
96°C
96°C
3 min
1 min
72°C
72°C
2 min
7 min
53°C
1 min
35 ciclos
Figura 4: Programa de amplificación de PCR con los oligonucleótidos Nad-gdhFOR y Nad-gdhREV.
3.5.2. Electroforesis en gel de agarosa, purificación de la banda y secuenciación.
Para comprobar la especificidad de la amplificación, se realizó un gel de agarosa como se
describe en el apartado 3.4.3. La banda de interés se recortó a partir del gel de agarosa y se purificó con
el kit “GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit” de Amersham Pharmacia Biotech. Una vez
purificada se secuenció con los oligonucleótidos utilizados para la amplificación del gen, comprobando de
ésta forma que el gen se encontraba completo y sin mutaciones.
3.5.3. Ligación del producto de PCR correspondiente al gen de la glutamato deshidrogenasa de
Hfx. mediterranei en el vector de clonaje pCR2.1.
El vector utilizado fue pCR2.1 (kit TA-Cloning, Invitrogen). Dicho vector (Figura 5) es un plásmido
de 3,9 Kb, confiere resistencia a ampicilina y kanamicina y contiene el origen de replicación junto con una
porción del gen
lac Z de E. coli. Ese fragmento codifica los primeros 146 aminoácidos de la β-
galactosidasa para la α-complementación.
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pCR®2.1
3 9 Kb
Figura 5: Mapa del vector de clonaje pCR 2.1.
Además, el kit proporciona el plásmido en forma lineal y con dos residuos de timina (T) en los
extremos 3’ (Figura 6). Esto permite una ligación muy eficiente del producto de PCR con el vector, ya que
en el programa de PCR empleado para amplificar el gen se incluye un tiempo de elongación, en el que la
polimerasa añade residuos de adenina en el extremo 3’ del producto de PCR.
Figura 6: Esquema de la ligación del plásmido pCR2.1 y el producto de PCR.
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53
La enzima empleada para la ligación fue la T4 DNA ligasa (Invitrogen) de la que se utilizaron 1U,
y la reacción se llevó a cabo a 14°C durante 16 horas.
3.5.4. Transformación en E. coli NovaBlue.
3.5.4.1. Cepa E. coli novaBlue:
La cepa Escherichia coli NovaBlue fue suministrada, en forma de células competentes, por la
casa comercial Novagen. Dicha cepa carece del gen de la T7 RNA polimerasa, por lo tanto el huésped no
se emplea para expresar sino para clonar. El genotipo de esta cepa es el siguiente:
Nova Blue: end A1, hsd R17 (rK12−,mK12−), sup E44, thi1, rec A1, gyr A96, rel A1, lac F’ [pro A+B+,
lac 1q ZΔM15: Tn 10 (TcR)]
El significado de los marcadores genéticos es el siguiente:
-
end A1: mutación en endonucleasa A. Aumenta la calidad del DNA aislado a partir de ésta
cepa, impidiendo su degradación.
-
hsd R17 (rK12−,mK12−): mutación que proporciona la pérdida en la actividad de restricción,
pero no de modificación de la enzima Eco K, una enzima de restricción tipo I. El DNA
clonado será metilado, y por tanto protegido frente a la restricción si el vector fuera después
introducido en una cepa hsd +.
-
sup E44: incluye un supresor para las mutaciones ámbar (mutaciones que convierten
cualquier codón en el codón de terminación UAG) del tRNA. El supresor inserta una
glutamina en el codón UAG.
-
thi1: mutación en el metabolismo de la tiamina. Cuando se crece en medio mínimo éste
microorganismo requiere la presencia de tiamina ya que es incapaz de sintetizarla.
Susana Díaz González
54
-
rec A1: mutación en una ATPasa DNA dependiente, esencial para la recombinación
genética en E. coli. Previene la recombinación del DNA introducido con el DNA de la célula,
asegurando la estabilidad de los insertos.
-
gyr A96: mutación en DNA girasa. Confiere resistencia al ácido nalidíxico, que en
condiciones normales inhibiría la actividad enzimática.
-
rel A1: mutación que elimina el factor estricto que actúa en la inhibición de síntesis de rRNA
cuando se detiene la síntesis de proteínas. Esta mutación permite la síntesis de rRNA en
ausencia de síntesis de proteínas.
-
F’: contiene el episoma F’, plásmido de E. coli con fragmentos del cromosoma bacteriano.
El episoma F’ posee las características que se marcan entre corchetes cuyo significado es:
ƒ
pro A+B+: mutación en el metabolismo de la prolina. Cuando se crece en
medio mínimo este microorganismo requiere la presencia de prolina, ya
que es incapaz de sintetizarla.
ƒ
lac 1q: mutante del gen lac l que sintetiza aproximadamente diez veces
más represor que el tipo salvaje. Esta superproducción del represor inhibe
la transcripción del operón lac en ausencia de inductor.
ƒ
lac ZΔM15: mutación por deleción que elimina las secuencias del gen lac
Z que codifica para la porción amino-terminal de la β-galactosidasa. El
péptido expresado puede formar parte en la α-complementación para
formar la β-galactosidasa activa.
ƒ
Tn 10 (TcR): transposón que confiere resistencia frente a tetraciclina.
3.5.4.2. Transformación de E. coli con el producto de la ligación.
La transformación de E. coli NovaBlue se llevó a cabo mediante un shock térmico, siguiendo el
siguiente protocolo (Novagen, 1999):
Susana Díaz González
55
-
Las células competentes guardadas a –80°C se descongelaron lentamente en hielo.
-
Una vez descongeladas, se añadió a las células 2 μL del producto de la ligación (plásmido
con inserto), y se incubó durante 5’ en hielo.
-
Posteriormente, se sometieron las células a un shock térmico introduciéndolas en un baño a
42°C durante 30 segundos, y se transfirieron inmediatamente a hielo, donde se mantuvieron
durante 2 minutos.
-
A continuación, se añadieron 80 μL de SOC (apéndice I) a temperatura ambiente, y se
incubó a 37°C durante 60 minutos a 220 rpm en un agitador orbital.
-
Por último, se sembraron volúmenes entre 10-100 μL del medio anterior en placas de LB
con kanamicina 50 μg/mL, IPTG 0,5 mM y X-Gal 0,01% (apéndice I), y se dejaron crecer a
37°C durante 14-16 horas.
Además de la transformación con el producto de la ligación, se realizaron dos controles. El
primer control consistió en transformar las células con un plásmido sin inserto. Y en el segundo control se
siguió todo el proceso de transformación pero sin añadir ningún tipo de DNA.
3.5.5. Análisis de transformantes: Aislamiento y purificación de plásmidos.
La identificación de colonias que poseían plásmido con inserto se realizó mediante αcomplementación. Como ya se ha comentado en el apartado 3.5.3., el plásmido pCR2.1 contiene un
pequeño segmento del DNA de E. coli que contiene las secuencias reguladoras y la información que
codifica para los 146 primeros aminoácidos del gen de la β-galactosidasa (lac Z). Incluido en esta
secuencia, existe un sitio de inserción múltiple, que no interrumpe la lectura del gen pero que añade un
pequeño número de aminoácidos en el fragmento amino-terminal de la β-galactosidasa. La síntesis de
este fragmento está inducida por IPTG (isopropiltio-β-D-galactósido). Los vectores de este tipo se
emplean en células hospedadoras que codifican la porción carboxi-terminal de la β-galactosidasa,
también inducido por IPTG, como ocurre con las NovaBlue. Aunque ninguno de los dos fragmentos son
activos por separado, se pueden asociar para formar la enzima activa, en lo que se conoce como
α-complementación o complementación en trans. Las bacterias Lac+ resultantes de la α-
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56
complementación son fácilmente reconocibles porque forman colonias azules en presencia del sustrato XGal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactósido). Sin embargo, la inserción de un fragmento de DNA extraño
en el sitio de inserción del plásmido, da lugar a un fragmento amino-terminal incapaz de producir αcomplementación. Las bacterias que lleven los plásmidos recombinantes formarán por lo tanto colonias
blancas.
El análisis de transformantes se llevó a cabo por el aislamiento y purificación de plásmidos. Para
ello, se seleccionaron 10 colonias blancas (con inserto), las cuales se crecieron individualmente en medio
líquido LB (apéndice I), con ampicilina (50 μg/mL), durante toda la noche a 37°C en un agitador orbital.
La purificación de los plásmidos se realizó a partir de 3 mL de cultivo, y empleando el kit CONCERTTM
Rapid Plasmid Miniprep System de Gibco BRL (Life Technologies). La pureza de los plásmidos se
determinó espectrofotométricamente mediante la relación A260/A280, empleando un espectrofotómetro
Ultraspec 2000 suministrado por Pharmacia Biotech. Todos los clones se conservaron a –80°C en
presencia de glicerol como agente crioprotector.
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1% (apartado 3.4.3.) para analizar los
plásmidos aislados, pudiendo diferenciar aquellos que tienen inserto mediante comparación con el
plásmido pCR2.1 sin inserto.
3.5.6. Secuenciación de los plásmidos con inserto.
Con el fin de conocer la secuencia insertada en el plásmido pCR2.1 se procedió a la
secuenciación de los plásmidos con inserto, utilizando los oligonucleótidos universales de plásmido
M13For y M13Rev, tal y como se describe en el apartado 3.4.5.
Susana Díaz González
57
3.5.7. Digestión mediante las enzimas de restricción NdeI y BamHI, del plásmido que contiene el
gen de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei.
Tanto el plásmido con inserto seleccionado como el vector de expresión pET3a, se digirieron con
las enzimas de restricción NdeI (Fermentas) y BamHI (Promega). Las secuencias de reconocimiento de
estas enzimas de restricción son las siguientes:
CATATG
GGATCC
GTATAC
CCTAGG
NdeI
BamHI
Figura 7: Sitios de corte de las enzimas de restricción NdeI y BamHI.
Los tampones para estas enzimas difieren en la concentración de NaCl que contienen. Debido a
ello la digestión se llevó a cabo en dos etapas.
En primer lugar se digirió con la enzima que mejor trabaja en el tampón de menos fuerza iónica,
es decir, BamHI durante 2 horas a 37°C. Posteriormente, se añadió la cantidad apropiada de NaCl a la
segunda enzima, es decir, NdeI incubándose a 37°C durante la noche. La cantidad aproximada de DNA
digerido fue de 1,5 μg. Transcurrido ese tiempo se inactivaron las enzimas incubando la digestión a 95°C
durante 10 minutos.
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa tal y como se describe en el apartado 3.4.3. en la
que se cargó el volumen total de cada digestión (tubo control y tubo con plásmido + inserto). De este
modo, se comprobó que el inserto tenía el tamaño esperado y que la digestión se había efectuado con
éxito.
Susana Díaz González
58
Posteriormente, se recortó la banda perteneciente al inserto (gen de la NAD-glutamato
deshidrogenasa). La banda se purificó con el Kit GFXTM PCR suministrado por la casa comercial
Amersham Pharmacia Biotech.
3.5.8. Ligación del gen de NAD-GDH en el vector de expresión pET3a.
El gen de la glutamato deshidrogenasa se introdujo en el vector de expresión pET3a
previamente digerido como se indica en el apartado anterior. El tamaño del plásmido de es 4640pb. En la
Figura 8 se muestra el mapa del vector pET3a.
BamHI (510)
NdeI (560)
Figura 8: Mapa del vector de expresión pET3a.
Para llevar a cabo la ligación, se mantuvo una relación vector: inserto de 1:2. La concentración
de plásmido lineal y de inserto se determinó espectrofotométricamente. La enzima empleada fue la T4
DNA ligasa realizándose la ligación en un baño termostatizado a 16°C durante 16 horas
aproximadamente.
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59
3.5.9. Transformación en E. coli NovaBlue con el plásmido pET3a.
La reacción de la ligación se empleó para transformar la cepa E. coli NovaBlue (Novagen). Para
ello se siguió el protocolo descrito en el apartado 3.5.4. utilizando en este caso placas LB agar y
ampicilina (50 μg/mL), ya que los plásmidos sólo confieren resistencia frente a dicho antibiótico.
3.5.10. Análisis de transformantes: Aislamiento y purificación de plásmidos.
El análisis de los transformantes se llevó a cabo de la misma forma que en el apartado 3.5.5. En
este caso, la diferenciación no pudo realizarse mediante diferencia de color puesto que los vectores de
expresión no contienen la porción del gen lac Z de E. coli. Por esta razón se analizaron todas las colonias
obtenidas creciéndose en medio LB líquido con ampicilina (50 μg/mL) para la purificación de los
plásmidos.
El aislamiento del DNA plasmídico se realizó con el kit CONCERTTM Rapid Plasmid Miniprep
System de Gibco BRL (Life Technologies) del mismo modo que se realizó en el apartado 3.5.5. Mediante
electroforesis en gel de agarosa tal y como se describe en el apartado 3.4.3. se comprobó si los
plásmidos aislados tenían inserto, además de observar su pureza y concentración. Se realizó la
secuenciación de los plásmidos con inserto y se comprobó que la glutamato deshidrogenasa se había
clonado sin mutaciones.
3.5.11. Transformación en E. coli BL21 (DE3).
3.5.11.1. Cepa E. coli BL21 (DE3):
La cepa E. coli BL21 (DE3) fue suministrada en forma de células competentes por la casa
comercial Novagen. Se empleó como huésped de expresión esta cepa ya que contiene una copia
cromosómica del gen de la T7 RNA polimerasa bajo el control del promotor lacUV5, pudiendo inducir la
expresión por adición de IPTG.
Susana Díaz González
60
El genotipo de dicha cepa es:
BL(21)DE3: F- omp T, hsd SB (rB-, mB-), gal, dcm, (DE3). El significado de los marcadores
genéticos es el siguiente:
-
F-: cepa que no contiene el episoma F.
-
omp T: mutación que produce la carencia de una proteasa, lo que favorece la obtención de
proteínas recombinantes intactas.
-
hsd SB (rB-, mB-): mutación que elimina tanto la restricción como la metilación del DNA en la
secuencia TGA(N)8TGCT.
-
gal: indica la incapacidad de esta cepa para emplear galactosa.
-
dcm: mutación en la citosina metilasa. Bloquea la metilación de la citosina en la secuencia
5’....GmGAGG....3’ ó 5’....CmCTGG....3’.
-
(DE3): el gen que codifica la T7 RNA polimerasa está integrado en el genoma del
microorganismo.
3.5.11.2. Transformación de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido pET3a con inserto.
La transformación se llevó a cabo de la misma forma que se describe en el apartado 3.5.4.
utilizándose 50 ng de plásmido purificado. El crecimiento de células se realizó en placas LB agar con
ampicilina (50 μg/mL).
En este caso, todos los transformantes obtenidos tenían plásmido con inserto puesto que la
transformación se realizó con un plásmido purificado.
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61
3.6. EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.
3.6.1. Crecimiento e inducción.
La inducción de la expresión del gen de la NAD-GDH se realizó mediante el protocolo que se
describe a continuación (Novagen, 1999):
-
Con una colonia seleccionada al azar, se sembraron 3 mL de medio de cultivo LB con
ampicilina (50 μg/mL), y se incubó a 37°C a 225 rpm en un agitador orbital, hasta una
densidad óptica a 600 nm (DO600) de 0,5.
-
A continuación, se sembraron con dicho cultivo, 100 mL de LB con ampicilina (50 μg/mL),
incubándose a 37°C con agitación hasta alcanzar una DO600 entre 0,5-1.
-
Una vez crecido el cultivo, se guardó una alícuota de 5 mL para llevar a cabo el test de
estabilidad de plásmido y conservar el clon.
-
Al resto del cultivo se añadieron 400 μL de IPTG 1 mM para obtener una concentración final
de 0,4 mM, incubándose con agitación a 37°C durante 3 horas.
3.6.2. Conservación de las células y test de estabilidad del plásmido.
Las células se conservaron a –80°C en presencia del agente crioprotector glicerol. Para ello se
transfirieron 900 μL, de la alícuota recogida antes de inducir, a un criovial y se añadieron 100 μL de
glicerol al 80% (apéndice I).
Test de estabilidad del plásmido
El uso de ampicilina como antibiótico de selección requiere un cuidado adicional, ya que durante
el cultivo las células pueden segregar al medio pequeñas cantidades de β-lactamasa. Además, la
ampicilina es susceptible de hidrolizarse bajo condiciones ácidas creadas por el propio metabolismo de
Susana Díaz González
62
las bacterias. Por lo tanto, durante el crecimiento se puede perder la selección por ampicilina, y podrán
crecer células que pierdan el plásmido.
Con el fin de determinar la cantidad de células que contenían el plásmido que se deseaba
expresar, se realizó un test de estabilidad. Éste consiste en sembrar una determinada dilución de las
células, antes de inducir, en placas de LB con distintos aditivos, ampicilina, IPTG, y ampicilina más IPTG
(Novagen, 1999).
En las placas que no contienen ni ampicilina ni IPTG crecerán todas las células viables; en
presencia de ampicilina, sólo crecerán aquellas células que conserven el plásmido; con IPTG, crecerán
aquellas que han perdido el plásmido; y en presencia de ampicilina e IPTG, solo crecerán mutantes que
contienen el plásmido, pero que han perdido la capacidad para expresar el gen deseado.
En un cultivo típico, todas las células crecerán en ausencia de aditivos y en presencia de
ampicilina, menos de un 2% crecerán en las placas con IPTG, y menos de un 0,01% crecerán en
presencia de IPTG y ampicilina. Si el plásmido empleado es inestable, la fracción de células que ha
perdido dicho plásmido, se verá reflejada por un aumento de colonias en presencia de IPTG y un
descenso en presencia de ampicilina. Y si aparecen mutantes que retienen el plásmido, pero que han
perdido la capacidad para expresar el gen deseado, se verá reflejado por un aumento de colonias en
presencia de IPTG más ampicilina, pero este caso es poco frecuente.
3.6.3. Obtención de fracciones celulares y localización de la proteína expresada.
Las distintas fracciones celulares que se analizaron con el fin de comprobar si se había
expresado la glutamato deshidrogenasa y cual era su localización, fueron:
-
Fracción celular total
-
Fracción periplasmática
-
Fracción citoplasmática soluble
-
Fracción citoplasmática insoluble o cuerpos de inclusión
Susana Díaz González
63
Para localizar la proteína expresada se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes. A continuación se describe el método empleado para aislar cada una de
las fracciones y para preparar las muestras para la electroforesis:
3.6.4. Fracción celular total.
La fracción celular total se obtuvo del siguiente modo:
-
Se transfirió a un eppendorf 1 mL de cultivo procedente del cultivo inicial (apartado 3.8.1) y
se centrífugo a 10000 x g durante 1 minuto, descartándose el sobrenadante.
-
El precipitado obtenido, se resuspendió en 100 μL de PBS (apéndice I). Posteriormente se
añadieron 100 μL de 2X sample buffer (apéndice I), mezclándose en el vortex.
-
La mezcla se sonicó con un sonicador VirSonic 475 durante 15 segundos, 8-10 veces con
una amplitud de 16-18 microns.
-
A continuación, se incubó a 80-85°C durante 5-10 minutos para desnaturalizar las proteínas.
Posteriormente, se dejó enfriar y se guardó a –20°C hasta que se realizó la electroforesis en
poliacrilamida.
3.6.5. Fracción periplasmática.
La fracción periplasmática se obtuvo mediante un shock osmótico (Connaris y col., 1998) del
siguiente modo:
-
Se centrifugó el resto del cultivo a 6500 x g durante 15 minutos recogiéndose el precipitado
obtenido.
-
Se resuspendió el precipitado en 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 con sacarosa 20% (p/v) hasta
llegar a una densidad óptica a 600 nm de 3-5. Se incubó posteriormente en hielo durante 10
minutos.
-
Seguidamente, se centrífugo a 11000 x g durante 2 minutos a 4°C y se eliminó el
sobrenadante.
Susana Díaz González
64
-
El precipitado se resuspendió en 20 mM Tris-HCl pH 8,0 y se incubó en hielo durante 10
minutos.
-
Transcurrido ese tiempo, se centrífugo a 10000 x g durante 10 minutos a 4°C.
-
El sobrenadante (fracción periplásmática) se transfirió a un vaso de precipitados, y el
precipitado se conservó en hielo hasta el siguiente paso.
-
Se tomó 1 mL de dicho sobrenadante y se concentró con ácido tricloroacético al 100% (p/v)
y se lavó con acetona varias veces.
3.6.6. Fracción citoplasmática.
La fracción citoplasmática se obtuvo mediante una adaptación del protocolo propuesto por
Connaris y col., (1998). Debido a la elevada densidad de los cuerpos de inclusión, las fracciones soluble e
insoluble citoplasmática, se pueden separar por una simple centrifugación. A continuación se describe el
método empleado para obtener cada una de las fracciones:
3.6.6.1. Fracción citoplasmática soluble.
-
El precipitado procedente de la fracción periplasmática se resuspendió en 8 mL de 20 mM
Tris-HCl pH 7,4 con 2 M NaCl y 1 mM EDTA (tampón A).
-
Una vez resuspendido, se añadieron 80 μL de lisozima preparada a una concentración de
10 mg/mL y 800 μL de Tritón X100 al 1% incubándose a 30°C durante 1 hora. Con éste
paso se facilita la ruptura de la membrana de las células y se solubilizan los lípidos de
membrana. Además de eliminar impurezas asociadas a los cuerpos de inclusión (Misawa y
Kumagai, 1999).
-
Transcurrido este tiempo, la mezcla se incubó en hielo durante 15 minutos. Después se
sonicó con un sonicador VirSonic 475 durante 15 segundos entre 8 y 10 veces con una
amplitud de 16-18 microns.
-
A continuación se centrifugó a 14000 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante
obtenido (fracción soluble citoplasmática) se transfirió a un vaso de precipitados, y el
Susana Díaz González
65
precipitado (fracción insoluble citoplasmática o cuerpos de inclusión) se conservó en hielo
hasta el siguiente paso.
-
Finalmente se tomó 1 mL de sobrenadante y se precipitó con ácido tricloroacético del mismo
modo que en el apartado anterior.
3.6.6.2. Fracción citoplasmática insoluble o cuerpos de inclusión.
El precipitado obtenido en el paso anterior se lavó dos veces con 4 mL del tampón A, para ello
se centrifugó a 10000 x g durante 5 minutos, y se descartó el sobrenadante. Mediante este paso se
consiguieron eliminar algunos contaminantes.
-
El precipitado obtenido se solubilizó con 8 mL de 20 mM Tris-HCl pH 8,0 conteniendo 8 M
urea, 50 mM DTT y 2 mM EDTA (tampón de solubilización) a 37°C.
-
Para preparar la muestra para la SDS-PAGE, se transfirieron 100 μL de la muestra anterior
a un eppendorf y se añadieron 100 μL de 2XSB (apéndice I). Posteriormente, se incubó la
muestra a 80-85°C durante 5-10 minutos, y se guardó a –20°C, hasta su uso.
Estas fracciones se aislaron tanto de los cultivos empleados como control (células transformadas
con plásmido sin inserto) como de los cultivos empleados para la expresión de la glutamato
deshidrogenasa.
3.7. SOLUBILIZACIÓN DE LOS CUERPOS DE INCLUSIÓN Y RENATURALIZACIÓN DE LA
NAD-GDH RECOMBINANTE.
3.7.1. Solubilización de los cuerpos de inclusión.
Para solubilizar los cuerpos de inclusión se emplearon agentes caotrópicos con alto poder
desnaturalizante y detergentes.
Susana Díaz González
66
Además, los tampones utilizados pueden contener un agente reductor, como el DTT, el DTE o el
β-mercaptoetanol, para evitar la formación de puentes disulfuro entre residuos de cisteína, agentes
quelantes de metales como el EDTA e inhibidores de proteasas como el PMSF (Rudolph y col., 1997).
En nuestro caso, los cuerpos de inclusión se solubilizaron en dos tampones distintos
diferenciándose en el agente caotrópico empleado. Por un lado Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo
urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM y por otro Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo cloruro de guanidinio
6 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM.
En los dos casos fue necesario incubar los cuerpos de inclusión a 37ºC para conseguir su total
solubilización.
3.7.2. Renaturalización de la NAD-GDH recombinante.
Para la renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei se realizaron
diferentes ensayos y se probaron distintas vías de renaturalización. Se varió la composición del tampón:
Gly-NaOH, fosfato y Tris-HCl; el pH del tampón de renaturalización (rango de 7 a 9), el factor de dilución
(1:10-1:20) y el modo de realizar la dilución (dilución rápida y diálisis).
Puesto que la glutamato deshidrogenasa es una enzima halofílica, todos los tampones
empleados contenían una elevada concentración de sal (NaCl o KCl).
3.7.3. Renaturalización mediante diálisis.
Se dializaron 3 mL de cuerpos de inclusión solubilizados en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0,
conteniendo urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM, frente a tampón Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0,
conteniendo 3,25 mM EDTA y 4 M NaCl y además con Tris-HCl 100 mM pH 8,0, 3,25 mM EDTA y 4 M
NaCl, con el fin de renaturalizar la enzima. Para ello se emplearon bolsas de diálisis Sigma y se dializó
frente a un volumen de tampón 100 veces mayor, con un total de 3 cambios de tampón. Una vez acabada
Susana Díaz González
67
la diálisis se realizaron medidas de actividad para comprobar si la NAD-glutamato deshidrogenasa se
había renaturalizado.
3.7.4. Renaturalización mediante dilución.
Se realizaron ensayos de renaturalización mediante dilución rápida empleando distintos
tampones y diferentes condiciones de dilución.
Con el fin de determinar las condiciones óptimas en el proceso de renaturalización, se realizaron
diferentes ensayos de renaturalización de la enzima bajo distintas condiciones: diferentes diluciones,
distintas sustancias tamponantes, composición y concentración de sales, pH y la influencia de la
presencia del agente quelante EDTA. En cada caso se siguió el proceso de renaturalización mediante la
determinación de la actividad enzimática en alícuotas tomadas cada cierto tiempo.
Una vez solubilizados los cuerpos de inclusión en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo
urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM se realizaron los siguientes ensayos:
-
Se realizó una dilución 1:20 de los cuerpos de inclusión solubilizados, utilizando una serie
de tampones:
ƒ
Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, 3,25 mM EDTA, NaCl 4 M.
ƒ
Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, 3,25 mM EDTA, KCl 4 M.
ƒ
Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, NaCl 4 M.
ƒ
Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, 3,25 mM EDTA (con NaCl 3 M, 2 M y 1 M)
ƒ
Tris-HCl 100 mM, pH 7,3, Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, NaCl 4 M.
ƒ
Tris-HCl 20 mM suplementado con sulfato de sodio 1 M, pH 8,5.
ƒ
Fosfato de sodio 100 mM , pH 7,0, NaCl 4 M.,
ƒ
Sulfato de amonio 2,5 M pH 7,0.
Susana Díaz González
68
3.7.5. Medida de la actividad enzimática y de la concentración de proteína.
El proceso de renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante se siguió
mediante la medida de la actividad enzimática como se describe en el apartado 3.1.3 y la determinación
de la concentración de proteína se realizó mediante el método de Bradford (1976) tal y como se describe
en el apartado 3.1.4.
3.8. PURIFICACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.
La purificación de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei se llevó a cabo en dos pasos que se
describen a continuación:
3.8.1. Precipitación en presencia de sulfato amónico.
El primer paso de la purificación consistió en una precipitación de las proteínas no halofílicas en
presencia de sulfato amónico, quedando la proteína halofílica, NAD-GDH, en solución.
Tras realizar la renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa, se adicionó sulfato
amónico hasta alcanzar una concentración de 2,5 M; centrifugando a 27000xg durante 30 minutos se
obtuvo un precipitado correspondiente a las proteínas no halofílicas y un sobrenadante en el que se
encontraba la NAD-glutamato deshidrogenasa.
3.8.2. Cromatografía en DEAE-Celulosa.
La preparación de la columna se llevó a cabo como sigue:
Se pesaron 7,5 g de DEAE-celulosa fast flow (Sigma), resuspendiéndose en HCl 0,5 M e
incubándose durante 30 minutos y removiendo la mezcla cada 5 minutos aproximadamente. A
continuación se realizó un lavado con agua destilada hasta alcanzar un pH neutro y se eliminaron las
partículas más pequeñas con una pipeta Pasteur. Seguidamente se repitió el mismo proceso utilizando
Susana Díaz González
69
NaOH 0,5 M. Al acabar, se empaquetó una columna de 2,5 x 10 cm (Sigma), y se equilibró con tampón
fosfato 50 mM pH 6,6 que contenía (NH4)2SO4 2,5 M y EDTA 1 mM a temperatura ambiente.
Una vez equilibrada la columna, se introdujo el sobrenadante obtenido en el paso anterior con
ayuda de una bomba peristáltica LKB Pump P-1 (Pharmacia Biotech) a una velocidad de flujo de 55 mL/h
recogiéndose fracciones de 10 mL. La proteína retenida, se lavó con dos volúmenes de columna con el
tampón anterior. La elución se realizó con tampón Tris-HCl
20 mM, pH 8,0 conteniendo 4 M NaCl.
3.9. ANÁLISIS MEDIANTE NANOELECTROSPRAY LC/MS DE LA NAD-GDH NATIVA.
Con la finalidad de obtener la secuencia correspondiente al extremo N-terminal, se realizó un
ensayo de identificación y caracterización de la proteína a través de su análisis peptídico.
Para llevar a cabo la digestión del monómero con tripsina, se realizó una diálisis previa frente a
100 mM de hidrógeno carbonato de amonio pH 8,5, a 4°C durante la noche con un volumen 100 veces
mayor y se realizaron 3 cambios de tampón cada hora. Posteriormente se llevó hasta una concentración
de 30 μg/mL en un evaporador Eppendorf concentrator 5301. Para esta diálisis se utilizaron cassettes de
diálisis Slide-A-Lyzer de la casa Pierce especiales para volúmenes de 0,5 a 3 mL con un límite de
exclusión de 10000 Da.
La tripsina liofilizada grado análisis (Sigma) se reconstituyó disolviéndola en HCl 1 mM hasta una
concentración de 1 mg/mL. La NAD-GDH nativa purificada con una concentración de 30 μg/mL se digirió
con tripsina en una relación 1:20 (tripsina:enzima problema). La solución de tripsina se adicionó a la
enzima dializada y se incubó la digestión a 37°C durante 18 horas. La tripsina realiza cortes
preferentemente por el lado carboxilo de los residuos de lisina y arginina siendo mayor para arginina
especialmente a pHs elevados.
La muestra se liofilizó para realizar su posterior análisis en las Instalaciones de Laboratorio
Agilent Technologies en Alemania analizándose con un sistema HPLC/MS NanoLC/Trap de Agilent
Susana Díaz González
70
Technologies mod. 1100. con un volumen de inyección de 5 μL. Se utilizó un flujo de 10 μL/min. con una
fase móvil de 0,1% de ácido fórmico en agua.
Susana Díaz González
71
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
4.1. PURIFICACIÓN Y DE NAD-GDH NATIVA.
El proceso utilizado en la purificación de la actividad glutamato deshidrogenasa nativa se realizó
en diferentes etapas, siguiendo la metodología habitual de trabajo puesta a punto en nuestro
departamento y que ha sido aplicada con éxito en la purificación de diferentes enzimas halofílicas, tales
como: nitrato reductasa (Martínez-Espinosa, 2001), glucosa deshidrogenasa (Bonete y col., 1996), NADPglutamato deshidrogenasa (Ferrer y col., 1996), α-amilasa (Pérez-Pomares y col., 2003), todas ellas de
Hfx. mediterranei, isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii y Sulfolobus solfataricus (Camacho y col.,
1995), malato sintasa e isocitrato liasa de Hfx. volcanii (Serrano y col., 1998), NAD y NADP-glutamato
deshidrogenasa de Halobacterium salinarum (Bonete y col., 1986; Bonete y col.,1987). Además de todas
las enzimas anteriormente mencionadas y que pertenecen a organismos del Dominio Archaea, también
se han purificado mediante los mismos métodos enzimas halofílicas y termofílicas procedentes de
organismos del Dominio Bacteria, tales como: NAD-glutamato deshidrogenasa de Thermus Thermophilus
(Ruiz y col., 1998), y las NAD-glutamato deshidrogenasas I y II de Salinibacter ruber (Bonete et al, 2003).
4.1.1. Cromatografía en Sepharosa 4B.
Esta cromatografía, realizada en primer lugar, se basa en las experiencias de Mevarech y col.,
1976 en las que utilizando geles de agarosa descubrieron que éstos eran capaces de absorber proteínas
halofílicas cuando la concentración del medio era 2,5 M o superior de sulfato de amonio. En nuestro caso,
se utiliza un gradiente lineal decreciente entre 2,5 y 0,5 M suplementando este último con un 20% en
glicerol para evitar posibles pérdidas de actividad si la elución de la enzima se produce a concentraciones
de sulfato de amonio que supongan una baja concentración salina. El glicerol puede ser un buen
sustituyente de la sal, en cuanto a la estabilidad se refiere (Ferrer y col., 1996). La sustitución de iones
salinos por otros compuestos en el disolvente, concretamente el glicerol, tiene un efecto estabilizante
debido a que actúa de forma similar a los iones de tipo “salting-out”. Dicho efecto supone la exclusión del
glicerol del volumen de hidratación alrededor de la proteína, favoreciendo su estado nativo (Zaccai y
Susana Díaz González
72
Eisenberg, 1990). Como se observa en el cromatograma de la Figura 9, aparecen dos picos de actividad
glutamato deshidrogenasa, que corresponden a la NADP-glutamato deshidrogenasa y a la NADglutamato deshidrogenasa objeto del presente estudio. La NADP-GDH eluye aproximadamente en las
fracciones (215 a 225) que se corresponde con una concentración de sulfato amónico de (1,5 M),
mientras que la NAD-GDH se separó en las fracciones de (227 a 239) a una concentración de sulfato
4,0
3,5
Abs 280
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Activ. U/mL
amónico de (1,4 M).
Fracciones
fraction
number
Figura 9: Cromatografía en Sepharosa-4B utilizando un gradiente lineal de sulfato de amonio de 2,5 M a 0,5 M, representado en
la Figura por la línea recta. En color azul se muestra la actividad NADP-GDH medida en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,5 y NaCl
2M. Se representa en rojo la actividad NAD-GDH medida en tampón Gly-NaOH 0,1 M, pH 8,5 conteniendo NaCl 4M.
Las fracciones con mayor actividad, se reunieron y se utilizaron en las siguientes etapas
cromatográficas. Los valores de actividad y concentración de proteína son los que se muestran en la
Tabla I. El factor de purificación conseguido en esta etapa fue de 10 respecto del extracto inicial. Puesto
Susana Díaz González
73
que se trata de enzimas muy similares, se obtuvieron picos de elución en concentraciones muy cercanas
de sulfato amónico.
Tabla I: Purificación de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei. El factor de
purificación y el rendimiento de cada etapa cromatográfica utilizada viene referido al extracto crudo inicial.
Vol mL
Actividad
U totales [prot]
(U/ml)
mg/ml
Actividad
Factor de
específica
purificación
rendimiento
U/mg
Extracto
60
4,12
247
9,2
0,45
1
100
Sepharosa 4-B
89
1,74
155
0,37
4,70
10,4
63
Blue-Sepharosa
32
4,21
135
0,07
60
133
54
Sephacryl S-300
36
0,81
17
0,008
101
224
12
gradiente
4.1.2. Cromatografía en Blue-Sepharosa.
La muestra obtenida en el paso anterior de purificación se introdujo en una columna de BlueSepharosa, tal y como se indica en el apartado 3.1.7. Una vez introducida la muestra se lavó con un
volumen igual al volumen total de gel. Comprobado que la enzima era retenida por la columna, se
procedió a la elución de la proteína utilizando un tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 conteniendo NaCl 3 M.
En este caso, se observó un pico de actividad en las primeras fracciones de elución, obteniéndose un
factor de purificación muy elevado (Tabla I), indicando que la enzima quedaba retenida específicamente
en la matriz. Además, esta etapa también permitió la concentración de la enzima. Esta cromatografía de
pseudo-afinidad se basa en el uso de compuestos de triazina basados en colorantes textiles, como
ligandos inmovilizados en Sepharosa. Estos colorantes contienen multiples grupos aromáticos y
sulfonados confiriendo numerosas posibilidades de interacción. En este caso, se trata del colorante
Susana Díaz González
74
Cibacron-Blue F3GA que ha resultado de gran utilidad en la purificación de numerosas deshidrogenasas
NAD-dependientes. Algunas de estas enzimas son: la NAD-GDH de Phycomyces spores (Van Laere,
1988), la GDH de P. furiosus (Klump, y col., 1992), y la NAD-GDH de Thermus thermophilus (Ruiz, y col.,
1998).
4.1.3. Cromatografía en Sephacryl S-300.
La muestra obtenida del paso cromatográfico Blue-Sepharosa se introdujo en tandas en la
columna HiPrepR Sephacryl-S300, equilibrada como se indica en el apartado 3.1.8. El total del volumen
introducido fue de 32 mL, recogiendo un volumen total de muestra purificada de 36 mL (Tabla I). Este
paso, consiguió aumentar la actividad específica hasta 224 veces respecto del extracto inicial,
permitiendo una purificación a homogeneidad de la enzima. Además, se aprovechó para el cálculo de la
masa molecular de la enzima mediante el calibrado previo de la columna. En la Figura 10, se muestra el
gel de electroforesis en poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, correspondiente a la purificación
de la NAD-GDH nativa. Se observa una banda que se correponde con una masa molecular aproximada
de 54 kDa.
Susana Díaz González
75
1
kDa
2
3
116,0
66,2
45,0
35,0
25,0
18,4
14,4
Figura 10: Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en presencia de SDS.
Calle 1: Patrones de Mr conocida (Fermentas)
Calles 2 y 3: NAD-glutamato deshidrogenasa nativa purificada.
4.2. SECUENCIACIÓN DEL EXTREMO N-TERMINAL.
Para conocer el extremo N-terminal de la NAD-glutamato deshidrogenasa se realizó la
secuenciación a partir de la banda de la enzima purificada y transferida a una membrana de nitrocelulosa.
El análisis se realizó en el Centro de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid. Los
resultados no fueron concluyentes puesto que el amino-terminal parecía estar bloqueado.
4.3. AISLAMIENTO DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei.
Para realizar el aislamiento del gen de la NAD-GDH se utilizaron 2 oligonucleótidos
degenerados, uno directo y otro reverso que se corresponde con secuencias consenso para glutamato
deshidrogenasas. Los oligonucleótidos utilizados y el proceso empleado se describen el apartado 3.4.4.
La amplificación se realizó a diferentes temperaturas de hibridación puesto que los oligonucleótidos se
Susana Díaz González
76
encontraban degenerados. El resultado de los diferentes programas de PCR se muestra en la Figura 11,
correspondiente a un gel de agarosa en el que se han cargado parte de las diferentes amplificaciones
para observar las bandas amplificadas.
pb
1
21226
5148
4268
3530
2027
1904
1584
1375
831
564
2 3 4 5 6
500
400
350
300
250
200
150
100
50
Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III
(Fermentas)
Calle 2-5: Reacciones de amplificación a diferentes
temperaturas
con los olignucleótidos degenerados
Calle 6: Marcadores de peso molecular de 50-500 pb.
(Gibco)
Figura 11: Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en el que se muestran las diferentes amplificaciones a distintas temperaturas.
4.3.1. Secuenciación del producto de PCR. Análisis de secuencias.
Tras la secuenciación de las bandas purificadas detectamos un producto de PCR de un tamaño
de 203 pb. La secuenciación de este producto de PCR se analizó mediante los programas del paquete
informático GCG tal y como se describe en el apartado 3.4.12. El resultado del análisis en aminoácidos
con el programa FASTA nos proporcionó homología con glutamato deshidrogenasas de las bases de
datos.
El producto de PCR en bases fue el siguiente:
1 TGCCCAGGAG GCAGAACCCG TTCGAGGGTT GTTGAAGTCT CTGTCCCTCT
51 CAAACGGGAC AGATGGCGAA GTTGAGGTCT TCACCGGCTA TCGTGCACAA
101 CACGATAACG TTCGCGGGCC ATACAAGGGC GGACTCCGAT ACCATCCAGA
151 CGTGACCGCA GAGGAGTGTG TCGGGCTTTC GATGTGGATG ACCTGGAAGA
-
CCG
Susana Díaz González
77
En aminoácidos y comparado con las bases de datos nos mostró el siguiente resultado:
10
20
30
40
AQEANPFEWIVEVSVPLKRDDGEVEVFTGYRAQHDNVRGPY
||::|::|||| ||||||||||||:|||||
S18609 TARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPKKVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPY
30
40
50
60
70
80
sus1rb.pep
sus1rb.pep
S18609
50
60
KGGLRYHPDSTAEECVGLSMWMTWKT
||||||||| | :|||||:||||||
KGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCAVMDLPFGGAKGGVAVNPKELSPEE
90
100
110
120
130
140
El número de acceso S18609 corresponde a la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hbt.
salinarum con la que mostró un 81,8 % de identidad. Con la GDH de P. furiosus mostró un 56,9 % y un
55,2 % con la GDH de P. endeavori y con la GDH de P. horikoshii.
Una vez confirmado que el producto era GDH, el programa de PCR utilizado para obtener
suficiente cantidad para marcarlo y utilizarlo como sonda, fue:
96°C
96°C
3 min
1 min
72°C
72°C
2 min
7 min
49°C
1 min
30 ciclos
Figura 12: Programa de PCR para amplificar el producto utilizado como sonda.
Susana Díaz González
78
En la Figura 13 se observan las bandas obtenidas:
pb 1
2
3
4
500
400
350
300
250
200
150
100
50
Figura 13: Electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Calle 1: Marcadores de peso molecular de 50-500 pb. (Gibco)
Calle 2 y 4: Producto de PCR de 203 pb. utilizado como sonda para realizar la búsqueda en la genoteca
de Hfx. mediterranei
4.3.2. Marcaje no radiactivo del producto de PCR. DOT BLOT.
El producto de PCR obtenido se marcó con digoxigenina siguiendo el método de “PCR DIG
Probe Synthesis Kit” de Boehringer Mannheim tal y como se describe en el apartado 3.4.6. de Materiales
y Métodos. Para estimar el rendimiento del marcaje se realizó un DOT BLOT. Esta es una técnica
orientativa y necesaria para evitar el exceso de sonda en las hibridaciones que pueda dar lugar a ruido de
fondo o a falsos positivos. Para realizar el DOT BLOT se depositaron en una membrana de nitrocelulosa
diferentes diluciones del producto marcado, frente a diferentes diluciones conocidas de un DNA control
proporcionado por la casa comercial.
Susana Díaz González
79
1ng/μL 100pg/μL 10pg/μL 1pg/μL 0,1pg/μL
Control DNA
Sonda de 203 pb.
1/10
1/100
1/1000 1/10000 1/100000
Figura 14: Placa autorradiográfica en la que se ha realizado la estimación del marcaje gracias a la distinta intensidad obtenida en
función de la concentración de la sonda.
La dilución 1/1000 de la sonda presentó la misma intensidad que la DNA control con una
concentración de DNA marcado de 10 pg/μL. Dicha concentración se consideró adecuada por presentar
suficiente intensidad y un ruido de fondo muy bajo. Puesto que para realizar hibridaciones la
concentración óptima de sonda es de 15 ng/mL, se emplearon 1,5 μL del producto de PCR marcado por
mL de solución de hibridación preparada.
4.3.3. Hibridación de la genoteca con el producto de PCR de 203 pb. marcado.
La genoteca se amplificó consiguiendo obtener placas con una densidad de calvas que
permitieron su selección por hibridación en placa y asegurando a su vez que todo el genoma se
encuentra representado con una dilución óptima de 1:100. De la primera búsqueda de la genoteca se
seleccionaron 12 fagos positivos (Figura 15). La segunda búsqueda se realizó con todos ellos, con 2 de
los cuales se obtuvieron placas con todos los fagos positivos, indicando que se trata de fagos que
contienen el gen de la glutamato deshidrogenasa.
Susana Díaz González
80
A
B
Figura 15: Búsqueda en la genoteca de DNA genómico de Hfx. mediterranei en fago λ con la sonda de 203 pb. (A) Primera
búsqueda en la genoteca (B) Segunda búsqueda sobre las calvas aisladas de la primera búsqueda, todos los fagos son positivos.
Desde el desarrollo del primer fago λ recombinante (Campbell, 1971) en el que se comprobó que
para su viabilidad únicamente se requiere una tercera parte de su genoma, se ha llevado a cabo un
detallado análisis de su estructura y función permitiendo emplearlo como vector de clonaje. Así mismo se
han obtenido distintas variantes que deben de ser elegidas en función de: las enzimas de restricción
empleadas y el tamaño del fragmento de DNA a insertar. La capacidad de desnaturalización y posterior
hibridación que posee el DNA, ha sido aprovechado para la identificación de secuencias ya sea sobre
células completas, virus, RNA, DNA, tejidos, etc. La optimización de los métodos de hibridación
(Khandjian, 1987) ha permitido que se puedan emplear diferentes soportes para la transferencia, fijación
y posterior hibridación de los ácidos nucleicos. De hecho, actualmente la hibridación de DNA ha cobrado
gran importancia, ya que está permitiendo el desarrollo de una nueva tecnología: los chips de DNA.
Susana Díaz González
81
4.3.4. Electroforesis en gel de agarosa y concentración del DNA de fago.
Seguidamente a la hibridación, detección e identificación de fagos positivos, se realizó el
aislamiento de DNA viral según el protocolo descrito en el apartado 3.4.10. de Materiales y Métodos. En
la Figura 16 se muestra una electroforesis en gel de agarosa al 1% en la que se puede observar el
aislamiento de 2 de los fagos que dieron señal en el proceso de hibridación y que resultaron contener el
gen de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei. Este gel se realizó para comprobar la
integridad del DNA.
pb
1
2
3
21226
5148
4268
3530
2027
1904
1584
1375
831
564
Figura 16: Electroforesis en gel de agarosa de 2 de los fagos aislados del segundo screening.
Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas)
Calle 2: Fago 4.7
Calle 3: Fago 1.7
4.3.5. Secuenciación de fagos positivos.
Una vez localizados los fagos positivos de la hibridación se aisló el DNA de los mismos,
procediéndose a su secuenciación tal y como se describe en el apartado 3.4.5. Los oligonucleótidos
utilizados en las primeras reacciones de secuenciación fueron los mismos que se emplearon en la
generación del producto de PCR empleado para la búsqueda en la genoteca. Una vez comprobado que
Susana Díaz González
82
se trataba de una glutamato deshidrogenasa por comparación de secuencias utilizando los programas
informáticos detallados en el apartado 3.4.12. se procedió a la secuenciación completa del fago.
La secuencia obtenida del DNA de fago empleando el oligonucleótido consenso (apdo. 3.4.4.),
se comparó con el producto de PCR con el que se había hecho la búsqueda en la genoteca. La primera
secuencia comparada es la correspondiente al fago14-7 y la inferior es el producto de PCR.
Percent Similarity: 72.222 %
fago147co.seq x gdh_c1.txt
.
.
.
.
.
3 AAGCCCGACGCACTCATCGCGGGTcACACCCGGGTGATAGCTGGAGGCCA
||||||||| ||||| ||
|||||| | || || || | |||| ||
27 AAGCCCGACACACTCCTCTGCGGTCACGTCTGGATGGTATC.GGAGTCCG
.
.
.
.
.
53 CCTTTGTAGGGACCGCGGACGCTGTCGTGCTGGGCTCGGTAGCCGGTGTA
|| ||||| || ||||| ||| | ||||| || || || ||||||||| |
76 CCCTTGTATGGCCCGCGAACGTTATCGTGTTGTGCACGATAGCCGGTGAA
.
.
.
.
103 GACCGAAACAGACCCGTCGTCGCGCTCGATTGGGACGGTCACCTC 147
|||| |||
|| ||||| || | || ||||| | || ||
126 GACCTCAACTTCGCCATCGTCCCGTTTGAGAGGGACAGAGACTTC 170
52
75
102
125
Como se aprecia en la comparación, la secuencia del fago muestra un 72,2% de similaridad con
el producto de PCR de 203 pb., lo que significa que se trata de una glutamato deshidrogenasa pero que
no es la codificada por la secuencia del producto de PCR, por lo tanto es posible que se trate de otro gen
de glutamato deshidrogenasa como ocurre en otros organismos.
Se realizó también la comparación en aminoácidos, obteniéndose lo siguiente:
91,3 % identity in 58 aa overlap
fago147
PrPCR203
61
118
VHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKT
: ||:||::|||| | |:||||||||:||||||||||||| | :||||| |||||||
IVEVSVPLKRDDGEVEVFTGYRAQHDNVRGPYKGGLRYHPDSTAEECVGLSMWMTWKT
10
67
Susana Díaz González
83
Como se observa en la comparación, la secuencia de la glutamato deshidrogenasa obtenida del
fago no era totalmente idéntica a la secuencia del producto de PCR con el que se había generado la
sonda. Se optó por acabar de secuenciar el gen completo presente en el fago y por otra parte seguir con
la búsqueda de la GDH codificada por el producto de PCR.
Comparando la secuencia obtenida del fago 14-7 con las bases de datos se obtuvo homología
con la NAD-GDH de Hbt. salinarum del mismo modo que ocurría con el producto de PCR.
92,3 % identity in 107 aa overlap
↓60
70
80
90
40
50
fago147c DYRRRIEPRNLPRLXRSTPEPRNATRVMQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALET
|: ::: :::: |::|:||
||||||
S18609
MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALET
10
20
30
100
110
120
130
140
150
fago147c ARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPEAVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYK
||||||:||::|||| |:|||||:|: |||||:|||||||:| |:|||||||||||||||
S18609
ARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPKKVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYK
40
50
60
70
80
90
160
170
fago147c GGLRYHPGVTRDECVGLR
||||||| |||||||||
S18609
GGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCAVMDLPFGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQ
100
110
120
130
140
150
A partir de las primeras secuencias obtenidas en directo y en reverso, se generaron nuevos
oligonucleótidos comprobando que la secuencia de los mismos no se encontraba en el resto del
fragmento secuenciado hasta el momento para evitar posibles inespecificidades. Se realizó la
secuenciación completa del gen mediante la estrategia de secuenciación por “paseo con
oligonucleótidos”. Dichos cebadores empleados se muestran mediante flechas en la Figura 17.
Susana Díaz González
84
CCGCGCTCAGATATCTATGAGAGATGTTCCAGCGAACCCCGATAGCGAACGGCCGTACGAGTGCTTCCA
GTGCGGGACGATTATCGTCGCAGAATCGAACCCCGGAACCTGCCCCGACTGTAGCGGTCGACTCCGGAA
gnadForw
CCGAGGAACGCCACTCGAGTAATGCAGACATCTGAACCTGAAGGGTCGTCCCCTAACACCGCGGAGGCA
M Q T S E P E G S S P N T A E A
48
16
GCGTCTCAGTCCTCGGAGCCGAAGCCAGCGTCGGAGTCGGCGCTCGAAACGGCACGGCGACAGCTCTAC
A S Q S S E P K P A S E S A L E T A R R Q L Y
117
39
CGCGCCGCCGACCACCTCGATATCGACCCAAACGTGGTCGAGCGTCTCAAACACCCGGAAGCAGTCCAC
R A A D H L D I D P N V V E R L K H P E A V H
186
62
GAGGTGACCGTCCCAATCGAGCGCGACGACGGGTCTGTTTCGGTCTACACCGGCTACCGAGCCCAGCAC
E V T V P I E R D D G S V S V Y T G Y R A Q H
317Forw
GACAGCGTCCGCGGTCCCTACAAAGGTGGCCTCCGCTATCACCCGGGTGTGACCCGCGATGAGTGCGTC
D S V R G P Y K G G L R Y H P G V T R D E C V
Consenso
GGGCTTCGAATGTGGATGACCTGGAAGACCGAAGTGCGCCGCGATGGACCTATCTTCGGCGGCGCGAAA
G L R M W M T W K T E V R R D G P I F G G A K
390Forw
255
85
GGCGGTATCGCGGTCAACCCGAAGGACCTGACCCTCGACGAGAAAGAACGGCTCACTCGACGGTTCACA
G G I A V N P K D L T L D E K E R L T R R F T
462
154
CAAGAGATTCGAACCATCATCGGGCCGATGAAGGATATCCCGGCACCGGATATGGGGACCGACCCGCAG
Q E I R T I I G P M K D I P A P D M G T D P Q
531
177
ACGATGGCGTGGGTGATGGACGCCTATTCGATGCAGGAAGGCGAGACGGTCCCCGGCGTCGTGACGGGC
T M A W V M D A Y S M Q E G E T V P G V V T G
641Forw
AAACCGCCGATTGTCGGTGGGAGCGAAGGCCGTGATACCGCACCCGGTCGCTCGGTTGCCATCATCGCC
K P P I V G G S E G R D T A P G R S V A I I A
600
200
CGCGAAGCCATCGACTACCTCAGTTGGGATATCGAAGACACCACGGTCGCCGTGCAGGGCTTCGGTTCC
R E A I D Y L S W D I E D T T V A V Q G F G S
776Forw
GTCGGTGCCCCCGCTGCACGTCTGCTCGATGATTACGGCGCGAATGTCGTCGCCGTCTCCGACGTGAAC
V G A P A A R L L D D Y G A N V V A V S D V N
738
246
GGCGCAATCTACGACCCCGACGGACTGGACACGCACGCAATTCCGACTCACGAAGAAGAACCCGAAGCC
G A I Y D P D G L D T H A I P T H E E E P E A
876
292
GTGATGACGCACGACGCGCCGGAGACGTTTTCGAACGAGGAACTCCTCGAACTCGACGTCGACGTGCTC
V M T H D A P E T F S N E E L L E L D V D V L
945
315
324
108
393
131
669
223
807
269
ATCCCGGCGGCGGTCGGCAACGTCTTGACCGCCGAGAACGCCGACGACGTACAGGCGAACCTCATCGTC 1014
I P A A V G N V L T A E N A D D V Q A N L I V
338
GAGGGTGCTAACGGGCCGACGACGAGTGCGGCCGACGCCAACTTCGCCGAGCGTGGGGTTCCGGTCATC 1083
E G A N G P T T S A A D A N F A E R G V P V I
361
CCGGATATTCTCGCCAACGCTGGCGGCGTCACCGTGAGCTACTTCGAGTGGTTGCAGGACATCAACCGG 1152
P D I L A N A G G V T V S Y F E W L Q D I N R
384
1152Forw
Susana Díaz González
85
CGGACGTGGTCCCTCGAACGCGTCCACGACGAACTCGAAACGGAGATGCTGAACGCGTGGTCGGTCGTC 1221
R T W S L E R V H D E L E T E M L N A W S V V
407
CGCGACGAATACGAGTCGCGCGACGTCCCGTGGCGCGATGCGGCGTACATCGTTGCACTGTCGCGGATT 1290
R D E Y E S R D V P W R D A A Y I V A L S R I
430
gnadRev
GCGGCAGCACACGACGCGCGCGGGCTCTGGCCCTGATTCGTCGGCCTCCGTAGTTCTGCACTCGTCGAC 1323
A A A H D A R G L W P *
441
CACCCACGTTGCGGAGGTTGTCGCCGAATATGTTCGGGACAACACCCTCAATGGAGGGTCGAGAACCGG
GAGATGCATGTCCGATACGACACTCGACGTTCGCGAGTTACCTCCCGCAGAGCGCCATCCGAAGATTCA
CAGCGCGTTTGACGACCTCGAAAGCGGCGAGGCGCTCACGATTCTAACGACCACGACCCGAAGCCGCTG
TTCTACGAAATGCAGGCCGAGGTCGATGCATTCGATGCCGACACTACGCCGTCGAGCAGCGCGGCCCGG
CAGAATTCGCTGCGACGTTCCCGAAAAAATAGTCGCAGTCGTCGGCCGCGAGCGCCGCGAGACAGTCCG
TCGGCGCACACTCTTCACCGTACTCTTCGACGTATATCGTGCACACCGTGAGTGGCGAATATGTTCGGA
Figura 17: Secuencia de la NAD-glutamato deshidrogenasa en bases y en aminoácidos. La zona subrayada y en negrita
corresponde a un posible caja TATA conservada en arqueas. Se muestra en una caja, una posible secuencia de unión al
ribosoma (Shine-Dalgarno) a -15 pb. del codón de inicio. Los codones de inicio y stop, se han marcado en negrita. Mediante
flechas se representan los oligonucleótidos utilizados para realizar la secuenciación completa. La segunda secuencia ShineDalgarno y el codón de inicio del posible gen NarK se indican mediante doble subrayado. La secuencia de la NAD-GDH de Hfx.
mediterranei, se encuentra depositada en las bases de datos de EMBL con el número de acceso AJ315142.
4.3.6. Análisis de secuencias. Estructura primaria y secundaria.
La NAD-GDH de Hfx. mediterranei consta de 1323 pb. que codifican un ORF de 441 aa.
Se ha encontrado a –15 pb. del codón de inicio una posible secuencia de unión al ribosoma,
“secuencia Shine-Dalgarno” (Figura 17). También se ha localizado una secuencia identificada como
caja Pribnow a –74 pb. del codón de inicio, siguiendo la identificación propuesta por Palmer (1995) y
Soppa, (1999).
Al final del gen, a continuación del codón de STOP, podría encontrarse un comienzo de otro gen a
46 pb. puesto que se observa una posible secuencia Shine-Dalgarno, y a 12 pb. corriente abajo de ésta, se
localiza un posible codón de inicio. Este fragmento muestra un 57,8% de homología con un fragmento de
un gen NarK de Thermus thermophilus (numero de acceso AJ225043) que podría codificar para un
transportador de NO3-/NO2-.
Susana Díaz González
86
Una vez obtenida la secuencia del gen de la glutamato deshidrogenasa localizado en la
genoteca de Hfx. mediterranei construida en fago λ (gen NAD-GDH), se continuó además con la
búsqueda del otro gen de glutamato deshidrogenasa correspondiente a la secuencia codificada por el
producto PCR (203 pb.) (GDHII).
A partir de la amplificación de DNA genómico de Hfx. mediterranei y posterior inserción en un
vector de clonaje se ha podido obtener un fragmento de glutamato deshidrogenasa de aproximadamente
1500 pb. que codifica para la glutamato deshidrogenasa correspondiente a la secuencia del producto de
PCR de 203 pb. (GDHII). Este producto no representa el gen completo, debido a que la amplificación se
ha generado con un oligonucleótido del producto de PCR de 203 pb. que se encuentra muy cerca del
extremo N-terminal (Figura 18).
La secuencia parcial correspondiente a este gen (GDHII) es la siguiente:
Secuencia de plásmido
VEVSVPLKRDDGEVEVFTGYRAQHDNVRGPYKGGLRYHPDVTAEEC
VGLSMWMTWKCAVMDLPFGGGKGGVAVDSKDLSDAEKERLTRRFADEIRGDVGPNQDIPAPDMGTDARTM
AWFMDAYSMQQGETIPGVVTGKPPVVGGSYGREEAPGRSTAIITREAIDYYGKDITETTVAVQGYGSVGA
NAARLLDEWDATIVAVSDVNGGIYDSNGFDTHTVPSHKEK
Continuación del gen
Figura 18: Secuencia de la glutamato deshidrogenasa (GDHII) amplificada de DNA genómico y que se corresponde con el
producto de PCR.
Susana Díaz González
87
Se realizó la comparación de las 2 glutamato deshidrogenasas obteniéndose lo siguiente:
MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPEAVHEVTVPIER
||:||::|
VEVSVPLKR
DDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTEVRRDGPIFGGAKGGIAVNPKD
||| | |:||||||||:||||||||||||| || :||||| |||||| |
| |||:|||:||: ||
DDGEVEVFTGYRAQHDNVRGPYKGGLRYHPDVTAEECVGLSMWMTWKCAVMDL-P-FGGGKGGVAVDSKD
LTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTMAWVMDAYSMQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEG
|: |||||||||: ||| :|| |||||||||| |||| ||||||| |||:|||||||||:|||| |
LSDAEKERLTRRFADEIRGDVGPNQDIPAPDMGTDARTMAWFMDAYSMQQGETIPGVVTGKPPVVGGSYG
RDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWDIEDTTVAVQGFGSVGAPAARLLDDYGANVVAVSDVNGAIYDPDGLDT
|: ||||| |||:|||||| : || :|||||||:||||| ||||||:: | :||||||||:||| :| ||
REEAPGRSTAIITREAIDYYGKDITETTVAVQGYGSVGANAARLLDEWDATIVAVSDVNGGIYDSNGFDT
HAIPTHEEEPEAVMTHDAPETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAAD
|::|:|:|:
HTVPSHKEK
ANFAERGVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYESRDVPWRD
AAYIVALSRIAAAHDARGLWP
Figura 19: Comparación de las dos secuencias de las glutamato deshidrogenasas encontradas en Hfx. mediterranei. En negrita
se muestra la secuencia aminoacídica de la glutamato deshidrogenasa que está en proceso de secuenciación completa (GDHII).
De la misma forma que ocurre en Hbt. salinarum parece que existen al menos 3 GDHs, ya que
se ha purificado la NADP-GDH (Ferrer, 1995), se ha secuenciado la NAD-GDH objeto de esta tesis y
además se ha clonado otra GDH de Hfx. mediterranei que se encuentra de momento en proceso de
secuenciación completa.
Podríamos suponer que no se trata de la secuencia de la NADP-GDH de Hfx. mediterranei
puesto que al analizar el fragmento obtenido de esta nueva GDH (GDHII), se encuentra una elevada
homología en los residuos aminoacídicos implicados en el sitio de unión al coenzima con las glutamato
deshidrogenasas NAD-dependientes.
Susana Díaz González
88
De esta forma podría hacerse una primera aproximación comparando estos residuos;
pertenecientes al motivo estructural de unión al coenzima (Plegamiento de Rossman).
↓
???
NAD
NAD
NAD
NADP
NADP
NADP
GDHII
Hbt.sal
Hfx.med
Th.term
E.coli
Salty
BacFr
V
V
V
V
V
V
V
A
A
A
V
S
A
A
V
V
V
V
V
V
I
Q
Q
Q
Q
S
S
S
G
G
G
G
G
G
G
Y
Y
F
L
S
S
F
G
G
G
G
G
G
G
S
S
S
Q
N
N
N
V
V
V
V
V
V
V
G
G
G
G
A
A
A
A
A
A
A
Q
Q
W
N
N
P
A
Y
Y
G
A
A
A
V
A
A
A
A
A
A
A
I
I
A
R
R
R
L
E
E
T
L
L
L
H
K
K
K
L
L
L
A
A
A
A
D
D
D
E
M
M
T
E
K
D
R
E
A
E
W
W
Y
L
F
F
L
D
G
G
G
G
G
G
A
A
A
M
A
A
A
T
T
N
R
R
R
K
I
I
V
V
V
V
V
V
V
V
V
I
V
V
A
A
A
A
T
T
T
V
I
V
V
A
A
I
S
S
S
A
S
S
S
D
D
D
T
D
D
G
Figura 20: Comparación de los residuos implicados en la unión del coenzima de la nueva GDH (GDHII) con las glutamato
deshidrogenasas NAD-dependientes de Hbt. salinarum, Hfx. mediterranei y Thermus thermophilus; y con las NADP-dependientes
de Escherichia coli, Bacteroides fragilis y Salmonella typhimurium. Mediante cajas se muestran los residuos diferentes en las
NADP-GDHs. El residuo más típico para cada enzima es el señalado por la flecha (↓).
En la Figura 20, se observa que las NADP-GDHs poseen una Alanina en lugar de Glicina como
se ha comentado por muchos autores. Este cambio no se encuentra en el fragmento de la nueva GDH
(GDHII) por lo que podría tratarse de una enzima NAD- ó NAD(P)-dependiente. Un hecho común
encontrado también en las NADP-GDHs es la sustitución del residuo final del motivo, alanina en NADGDHs por treonina en NADP-GDHs.
El fragmento de la nueva GDH (GDHII) posee glicina al igual que las NAD-GDHs. Según un
estudio realizado por Wierenga y col., (1985), se determinó que los residuos implicados en el centro
catalítico de las deshidrogenasas NAD-dependientes mostraban una secuencia conservada GXGXXG,
que para las NADP-dependientes cambia GXGXXA. Sin embargo, existen ejemplos de deshidrogenasas
en las que esta regla parece no cumplirse, puesto que contienen una glicina en la tercera posición siendo
enzimas NADP-dependientes tal y como ocurre en la glucosa deshidrogenasa de Hfx. mediterranei (Pire y
col., 2001) y en la glutamato deshidrogenasa de Clostridium symbiosum (Teller y col., 1992).
Susana Díaz González
89
La secuenciación completa de esta nueva GDH, su expresión y renaturalización permitiría
clasificarla según su especificidad por el coenzima, así como el sentido de reacción en el que la enzima
muestra mayor actividad.
4.3.6.1. Uso de codones de NAD-GDH de Hfx. mediterranei.
Existe cierta controversia acerca de la implicación de la frecuencia de uso de codones en la
expresión de proteínas recombinantes.
Algunos autores comentan que parece existir una relación directa entre los codones más
frecuentemente utilizados en la proteína problema y el organismo en el que se realiza la expresión (E.
coli). Brinkmann y col., (1989) defienden que la expresión de proteínas heterólogas que contienen un
número elevado de codones no frecuentes en E. coli, conduce a una baja producción de proteína
recombinante. Por eso en algunos casos para solucionar este problema se pueden utilizar dos estrategias
diferentes:
-
Alterar los codones poco frecuentes de la proteína de interés sin modificar la secuencia
aminoacídica. Recientemente se ha publicado un trabajo en el que se ha realizado la
sustitución de 13 codones para optimizar la expresión de una enzima fibrinolítica de los
gusanos de tierra (Hu y col., 2004).
-
Realizar la coexpresión de la proteína de interés con genes que codifican para los tRNAs
poco frecuentes (Andrews y Asenjo, 1996).
El uso preferencial, en la proteína problema, de codones raramente utilizados en E. coli puede
constituir una barrera en la expresión heteróloga y parece ser que se produce en genes que tienen un
contenido bajo de G + C (Young y col., 1989).
Susana Díaz González
90
Recientemente, McHardy y col., (2003) han realizado un estudio comparativo de niveles de
expresión con la frecuencia de uso de codones, confirmando que existe una relación entre el nivel de
expresión y los codones que codifican la proteína problema y el vector de expresión.
Sin embargo, existen indicios de que en la expresión heteróloga del gen de glutamato
deshidrogenasa de Clostridium symbiosum en E. coli no se encuentra modulada por la frecuencia
compartida de uso de codones en ambos organismos, puesto que el gen contiene codones de uso muy
poco frecuente en E. coli y se obtuvo expresión de la enzima (Teller, y col., 1992).
Se ha realizado el análisis de la secuencia aminoacídica en cuanto al uso de frecuencia de
codones según Soppa, (1994), mediante la introducción de la secuencia aminoacídica en el programa
CODONFRECUENCY 1.0 del paquete informático GCG (apdo. 3.4.12.).
Se han buscado los codones más utilizados en la traducción a aminoácidos en la NAD-GDH de
Hfx. mediterranei y se ha observado que en la secuencia aminoacídica se utilizan con más frecuencia los
codones que contienen en la tercera posición G ó C. De esta forma se refleja probablemente el bajo
contenido de A + T en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. El DNA genómico de la familia
Halobacteriaceae posee un elevado contenido en G + C, siendo del 68% aproximadamente (Moore y
McCarth., 1969; Doolittle y col., 1992). Para 12 de los 18 aminoácidos que se encuentran codificados por
más de un codón, el uso de codones con G ó C en tercera posición es del 90% o superior (Soppa, 1994).
Se ha elaborado una tabla en la que se recogen los datos de uso de frecuencia de codones para
la NAD-GDH de Hfx. mediterranei (Tabla II). Puesto que puede ser importante la similaridad existente en
la frecuencia de uso de codones del organismo mesofílico E. coli en el que se realiza la expresión
heteróloga, se han estudiado los codones más y menos frecuentemente utilizados, marcándose en la
Tabla II.
Susana Díaz González
91
Tabla II: Frecuencia de uso de codones en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. En sombreado se marcan
los codones más utilizados por la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. Mediante el símbolo (*) se han
señalado los codones más frecuentes utilizados por la GDH de E. coli y mediante el símbolo (#) se
indican los codones que por el contrario raramente se encuentran en E. coli. Los codones más
frecuentemente utilizados en E. coli se han tomado de Di Fraia, y col., 2000.
Phe
UUU
1
Ser
UCU
3
Tyr
UAU
2
Cys
UGU
0
Phe
UUC
5*
Ser
UCC
5
Tyr
UAC
10*
Cys
UGC
1
Leu
UUA
0
Ser
UCA
0
Stop
UAA
0
Stop
UGA
1
Leu
UUG
2
Ser
UCG
11
Stop
UAG
0
Trp
UGG
9
Leu
CUU
1
Pro
CCU
3
His
CAU
0
Arg
CGU
4
Leu
CUC
18
Pro
CCC
7
His
CAC
10
Arg
CGC
14*
Leu
CUA
0#
Pro
CCA
3
Gln
CAA
1
Arg
CGA
5#
Leu
CUG
5*
Pro
CCG
17*
Gln
CAG
9*
Arg
CGG
6#
Ile
AUU
5
Thr
ACU
2
Asn
AAU
1
Ser
AGU
2
Ile
AUC
17*
Thr
ACC
13*
Asn
AAC
13*
Ser
AGC
3
Ile
AUA
0#
Thr
ACA
2
Lys
AAA
5*
Arg
AGA
0#
Met
AUG
10
Thr
ACG
12
Lys
AAG
4
Arg
AGG
0#
Val
GUU
4
Ala
GCU
3
Asp
GAU
11
Gly
GGU
9
Val
GUC
25
Ala
GCC
17
Asp
GAC
26
Gly
GGC
15*
Val
GUA
1*
Ala
GCA
11*
Glu
GAA
20*
Gly
GGA
2#
Val
GUG
11
Ala
GCG
18*
Glu
GAG
18
Gly
GGG
9#
En la Tabla II, se muestran las secuencias que codifican para los codones más frecuentes
utilizados en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei.
Susana Díaz González
92
El análisis del uso de frecuencia de codones nos proporciona información útil en el diseño de
oligonucleótidos, cuando se hace necesario el uso de oligonucleótidos degenerados bien porque se
conocen péptidos determinados y se desean construir oligonucleótidos, bien porque se desea realizar el
aislamiento de genes a partir de residuos conservados en otros genes (Soppa y col., 1993).
Se ha observado, que los codones utilizados con más frecuencia en la NAD-GDH se
corresponden con los que codifican la enzima de E. coli (Tabla II). En nuestro caso, el sistema de
expresión heteróloga es eficiente y además el análisis realizado nos confirma los resultados obtenidos en
los estudios de expresión.
En la NAD-GDH de Hfx. mediterranei, el codón de stop está codificado por UGA. De los 18
aminoácidos que se encuentran codificados por más de un codón, 16 de ellos presentan G ó C en la
tercera posición. Solamente Lys y Glu se encuentran codificados por codones que contienen A en la
ultima posición.
Se determinaron diferentes parámetros bioquímicos a partir de la secuencia de la NAD-GDH de
Hfx. mediterranei, utilizando el programa PROTPARAM. TOOL. Los resultados obtenidos fueron los
siguientes:
Peso molecular teórico de la subunidad: 47959.2 Da.
Peso molecular teórico de GDH nativa: 287755.2 Da.
PI teórico: 4.51
Numero total de residuos cargados negativamente (Asp + Glu): 75
Numero total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys): 38
Índice alifático: 80.52
Coeficientes de extinción molar:
Susana Díaz González
93
Condiciones: 6.0 M cloruro de guanidinio
0.02 M tampón fosfato; pH 6.5
Unidades de los coeficientes de extinción: M-1 cm-1.
Se considera que todas las Cys aparecen como medias cisteínas.
λ (nm)
276 nm
278 nm
279 nm
280 nm
282 nm
Coefic. extinción
66000
67200
67080
66570
64800
Abs 0.1% (=1 g/l)
1.376
1.401
1.399
1.388
1.351
4.3.6.2. Residuos implicados en la halofilicidad de las GDHs.
Como se muestra en la tabla, las glutamato deshidrogenasas halofílicas difieren de otras GDHs
de arquea en el número de residuos acídicos (Asp y Glu). En las proteínas halofílicas se ha observado
que existe un marcado carácter acídico (Baldacci y col., 1990).
Susana Díaz González
94
Bacteria
Residuos P.
C.
assarolitycus difficile
Ala
8,6
8,6
Cys
1,2
1,2
Asp
5,2
4,3
Glu
9,3
9,0
Phe
3,3
2,9
Gly
10,7
10,2
His
0,5
1,0
Ile
5,9
6,9
Lys
7,1
7,8
Leu
6,4
5,7
Met
2,6
3,8
Asn
4,8
4,3
Pro
3,8
3,3
Gln
2,1
2,6
Arg
4,5
2,9
Ser
3,3
6,2
Thr
5,2
4,8
Val
9,0
9,0
Trp
2,1
1,9
Tyr
4,3
3,8
P.
furiosus
9,4
0,2
5,8
8,4
2,5
8,2
1,2
8,2
8,2
5,8
3,1
3,4
4,3
2,8
4,8
3,4
5,5
7,7
2,4
4,8
Archaea
S.
Hbt.
solfataricus salinarum
8,1
11,3
0,2
0,7
5,2
8,5
7,8
9,2
2,1
0,9
10,2
7,6
0,8
1,6
7,8
5,1
8,8
3,0
9,0
6,2
2,6
2,5
4,7
3,0
3,1
5,5
3,1
2,8
4,0
5,5
4,7
5,1
4,3
7,1
8,5
9,0
0,9
2,1
3,8
3,4
Hfx.
mediterranei
11,1
0,2
8,4
8,6
1,4
7,9
2,3
5,0
2,0
5,9
2,3
3,2
6,8
2,3
6,6
5,4
6,6
9,3
2,0
2,7
Eucarya
Humano
9,5
1,1
5,4
6,6
4,1
9,5
2,7
6,8
5,9
7,2
2,5
3,8
4,7
2,2
6,3
6,6
4,7
5,9
0,9
3,8
Tabla III: Porcentaje de residuos aminoacídicos de diversas GDHs. Se muestran los porcentajes correspondientes a cada
residuo en cada GDH de organismos de los Dominios Bacteria, Archaea y Eucarya. En negrita se señalan los porcentajes más
significativos entre cada uno de los organismos.
En la Tabla III, se aprecia un elevado porcentaje de residuos Ala y Val en las enzimas halófilas.
Este hecho se ha observado en un estudio estadístico realizado con 26 proteínas solubles en las que se
ha comprobado la naturaleza acídica de los halófilos, que muestran un contenido bajo en lisinas, un
incremento en pequeños residuos hidrofóbicos (Gly, Ala, Val) y una disminución en residuos alifáticos
(Madern y col., 1995; Madern y col., 2000). La comparación de las proteínas halofílicas con las
mesofílicas pone de manifiesto características que cumplen las enzimas halofílicas y que son: predominio
de los residuos ácidos frente a los básicos, un incremento en residuos hidrofóbicos (Ser y Thr) y una
disminución en residuos hidrofóbicos fuertes (Ile, Leu y Phe) (Lanyi, 1974).
Susana Díaz González
95
El análisis de la composición aminoacídica de las glutamato deshidrogenasas (Tabla III) muestra
que las enzimas halófilas poseen más residuos acídicos, siendo del 17,7% y 17% para Hbt. salinarum y
Hfx. mediterranei, respectivamente, frente a los porcentajes contenidos en el resto de GDHs analizadas
que son de: 14,5% en P. assarolitycus, 13,3% en C. difficile, 14,2% en P. furiosus, 13% en S.
solfatariccus y tan solo del 12% en la GDH de humano.
La drástica reducción en el contenido de lisinas (sólo un 3% y 2% para las GDH halofílicas)
confirma lo anteriormente expuesto. Este incremento de residuos residuos acídicos se encuentra
compensado por una disminución en residuos básicos, mientras que en las proteínas termofílicas dicha
proporción se encuentra compensada La elevada halofilicidad también depende de su composición rica
en residuos acídicos que desestabilizan la estructura de la proteína en condiciones de baja salinidad,
presumiblemente por interacciones de repulsión (Fukuchi y col., 2003).
Otras diferencias encontradas en las enzimas halófilas son: el aumento en el contenido de
treoninas (Thr) y la disminución en el contenido de fenilalaninas (Phe) (Tabla III). Respecto de la GDH
hipertermófila (P. furiosus) se observa una reducción en el porcentaje de isoleucinas (Ile) y un aumento
en el contenido de serinas (Ser), confirmando los datos aportados por Lanyi, (1974).
Las secuencias nucleotídicas de los genomas halofílicos pueden haber ido cambiando hacia un
incremento del porcentaje de residuos acídicos (particularmente aspartato), pero al mismo tiempo, este
cambio de composición del DNA ha causado inevitablemente aumento y/o disminución de otros residuos
aminoacídicos, como el porcentaje en alaninas y lisinas (Fukuchi y col., 2003).
De la misma forma que ocurre con la GDH de Hbt. salinarum (Benachenhou-Lahfa y col., 1994,
la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei también muestra un cluster hidrofílico rico en
residuos acídicos en la región N-terminal, y que además parece tener un bloque repetitivo. (Figura 21), no
encontrándose, hasta el momento, en otras GDHs de Archaea.
Susana Díaz González
96
La región N-terminal de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei es la siguiente:
1MQTSEPEGSSPNTAEAAS18
QSSEPKPASESALETA33
Si se comparan dos partes de esta región N-terminal, se observa que existen zonas repetidas.
a)
2
QTSEPEGSSPNTAEAAS18
:.:::. : . :.:
QSSEPKPASESALETA
18
33
Figura 21: Repetición de residuos acídicos en la región N-terminal de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei
desde los residuos 2 al 34.
b)
T
S
E
P
E
G
S
P
N
T
A
E
A
A
(a) LosQresiduos
idénticos
se muestran
como
(:) ySlas sustituciones
conservadas
se muestran
como
(.)
CAG ACA TCT GAA CCT GAA GGG TCG TCC CCT AAC ACC GCG GAG GCA GCG
||| | en||nucleótidos
|| ||de la|misma parte
||de||
|
| los
||residuos
(b) Identidades
la secuencia. En negrita
se ||
muestran
CAG TCC TCG GAG CCG AAG CCA GCG TCG GAG TCG GCG CTC GAA ACG GCA
S
S
E
P
K
P
A
S
E
S
A
L
E
T
A
acídicos.
Q
La región acídica en el extremo amino terminal, puede jugar un papel clave en el mantenimiento
de la estabilidad de la enzima nativa a elevadas concentraciones de sal. Las glutamato deshidrogenasas
de Hbt. salinarum y Hfx. mediterranei comparten esta característica, pero su posible implicación en el
mantenimiento de la estabilidad a elevadas concentraciones de sal ha de ser confirmada y demostrada
mediante la sustitución de dichos residuos acídicos por residuos básicos o mediante la eliminación
completa de ese pequeño loop (lazo) acídico (Benachenhou, y col., 1994).
Se han analizado las secuencias de GDHs de 4 organismos halofílicos, concretamente de Hbt.
salinarum, Hfx. volcanii, S. ruber y Hfx. mediterranei. En Hbt. salinarum NRC-36014, se ha comprobado
que existen 4 genes que codifican para glutamato deshidrogenasas (Lorna Ingoldsby, comunicación
personal). En 3 de ellos se encuentra aún sin asignar la especificidad de coenzima. En Hfx. volcanii se
dispone de 3 secuencias que presentan similaridad con glutamato deshidrogenasa y que se han obtenido
del genoma secuenciado recientemente y disponible en: (http://zdna2.umbi.umd.edu/~haloweb/hvo.html ).
Se desconoce por el momento la especificidad por el coenzima.
Susana Díaz González
97
Puesto que en nuestro departamento se han comenzado a estudiar los genes de la bacteria
halofílica Salinibacter ruber y se han aislado dos actividades glutamato deshidrogenasa (Bonete y col.,
2003), hemos realizado la secuenciación, clonaje y expresión de una GDH de éste organismo a partir de
un fragmento un conting suministrado por la Dra. Antón del Dpto. de Fisiología Genética y Microbiología
de la Universidad de Alicante. Se ha comprobado la existencia del cluster acídico rico en aspárticos y
glutámicos en las secuencias antes mencionadas como se muestra en la Figura 22.
GDH-Hfx.med
GDH-Hbt.sal
GDH-Hbt.sal-a1
GDH-Hbt.sal-a2
GDH-Hbt.sal-b
GDH-Hfx.vol-1
GDH-Hfx.vol-2
GDH-Hfx.vol-3
GDH-S.ruber
MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVE
MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEPESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLK
MPEANPFESLQEQLDDAGEFLDVNADVLERLKHPERVLETTLSVEMDDGTIET
MTESGPLENMLAQMEQAREYVDIDDGIYERLKSPERTLSVSLPVRMDDGSVEV
MAQTPPPESAPSTDSEPETALETARRQLQAAAEHVDIADGVIERLTHPTRVVQ
MASAAPSTATDDEPTEETALETARRQLERAAAHLDVDPGVIERLRHPNQVHRV
MAQEANPFESLQEQIDDAATYLDVRDDVIERLKNPERVLETNLAVEMDDGDVE
MMNEDGKNRNGEAVTDGGSGSEPETALATARRQLERAASHADVDDGVVARLKH
MPFNFDVYERSAYREPAPIDHDSPFQSMERFDVAAEILELSPGFYEYLCRPAR
Figura 22: Secuencias N-terminales de GDHs de organismos halofílicos. Hfx. mediterranei (Hfx. med), Hbt. salinarum (4 genes
de GDH) (Hbt. sal, Hbt. sal-a1, Hbt. sal-a2 y Hbt. sal-b) ,Hfx. volcanii (3 ORFs de GDH) (Hfx. vol-1, Hfx. vol-2 y Hfx. vol-3) y la
bacteria halofílica Salinibacter ruber (S. ruber). En negrita se muestran los residuos acídicos (D y E) (Asp y Glu).
El número de residuos acídicos para cada una de las regiones N-terminales mostradas en la
Figura 22 es de 10 para la GDH de Hfx. mediterranei, la GDH –3 de Hfx. volcanii y para la GDH de
Salinibacter ruber.
Hbt.sala1
Hfx.vol2
Hbt.sala2
Hfx.med
Hbt.sal
Hfx.vol-3
Hfx.vol-1
Hbt.sal-b
S.ruber
-MPEANPFESLQEQLDDAGEFLDVNADVLERLKHPERVLETTLS-VEMDDGTIET---------MAQEANPFESLQEQIDDAATYLDVRDDVIERLKNPERVLETNLA-VEMDDGDVE-----------MTESGPLENMLAQMEQAREYVDIDDGIYERLKSPERTLSVSLP-VRMDDGSVEV----------MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVE----------MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLK--------MMNEDGKNRNGEAVTDGGSGSEP----ETALATARRQLERAASHADVDDGVVARLKH--------MAS--------AAPSTATDDEP--TEETALETARRQLERAAAHLDVDPGVIERLRHPNQVHRV
--MAQTPP-----PESAPSTDSEP----ETALETARRQLQAAAEHVDIADGVIERLTHPTRVVQMPFNFDVYERSAYREPAPIDHDSP-------FQSMER-FDVAAEILELSPGFYEYLCRPAR---.
:
.* :
: .
53
53
53
53
53
53
53
53
53
Figura 23.: Comparación de las secuencias correspondientes al N-terminal de diferentes glutamato deshidrogenasas halofílicas.
Hfx. mediterranei (Hfx. med), Hbt. salinarum (4 genes de GDH) (Hbt. sal, Hbt. sal-a1, Hbt. sal-a2 y Hbt. sal-b), Hfx. volcanii (3
ORFs de GDH) (Hfx. vol-1, Hfx. vol-2 y Hfx. vol-3) y la bacteria halofílica Salinibacter ruber (S. ruber).
Susana Díaz González
98
En la Figura 23 se muestra la comparación entre los N-terminales de las glutamato
deshidrogenasas halofílicas disponibles hasta el momento. Los residuos conservados o parcialmente
conservados en la mayoría de ellas, se encuentran sombreados.
4.3.6.3. Residuos implicados en la termoestabilidad de las GDHs.
Las secuencias de genomas completos disponibles, nos permiten observar las posibles
diferencias existentes relacionadas con la termoestabilidad de las proteínas, reflejándose este hecho en
los residuos aminoacídicos que contienen. Se ha encontrado cierta correlación comparando genomas de
mesófilos y termófilos, observando que estos últimos tienen más proporción de residuos cargados y
menos residuos polares no cargados. Este porcentaje de residuos cargados en termófilos es del 29,84%
frente al 24,11% de los mesófilos y en cuanto a la disminución de residuos polares no cargados es del
31,15 % en mesófilos frente al 26,79% en termófilos (Jaenicke, 2000).
Pavesi y col., (2000), analizando la secuencia de dos GDHs de Asparagus officinalis, realizaron
un estudio en el que determinaron algunos de los residuos que podrían estar implicados en la
termoestabilidad de las GDHs.
La termoestabilidad se ha evaluado utilizando el índice BCD (Balanced Charge Density)
desarrollado mediante estudios de modelado por homología en organismos con diferentes temperaturas
de crecimiento (Yip y col., 1998). Se calcula mediante la fórmula siguiente:
BCD= [(n+ + n-) - |n- - n+|]/Ntotal
donde n+ es el número de residuos cargados positivamente (Arg, His y Lys), n- es el número de residuos
cargados negativamente (Asp y Glu) y Ntotal es el número de residuos posiblemente implicados en la
termoestabilidad, que se han estudiado en la secuencia. Este índice está basado en la observación de
Susana Díaz González
99
que las GDHs de organismos termofílicos como P. furiosus y T. profundus contienen, en 24 posiciones,
cargas más compensadas que la GDH mesofílica de C. symbiosum (Yip y col., 1998).
De esta forma, analizando el alineamiento para diversas GDHs en el que se encuentran
representadas glutamato deshidrogenasas con diferentes características, se ha podido realizar una
predicción de la termoestabilidad mediante la aplicación de este índice. En la Tabla IV, se observa como
P. furiosus y T. litoralis tienen valores más elevados de BCD que el resto de las GDHs analizadas. Por lo
tanto el análisis pone de manifiesto que éstas serían las GDHs más termoestables analizadas. Por otro
lado, se observa que para T. maritima el índice BCD se encuentra más cercano a las GDHs mesofílicas
que a las termofílicas. Además se ha visto que existe una posible correlación entre la disminución de
cargas equivalentes así como un aumento en residuos hidrofóbicos y polares a medida que se pasa de
organismos hipertermofílicos a mesofílicos. Se ha encontrado también una disminución en el número de
glicinas en las enzimas termoestables. La secuencia de la GDH de C. symbiosum contiene 48 residuos
de glicina, mientras que las secuencias de P. furiosus y T. maritima contienen 34 y 39 respectivamente.
Para la NAD-GDH de Hfx. mediterranei el contenido en glicinas es de 35.
Este análisis está confirmado por estudios previos en proteínas termofílicas en las que se ha
realizado la sustitución de glicinas (Kelly y col., 1993). El índice BCD calculado para la NAD-GDH de Hfx.
mediterranei, de Hbt. salinarum y de S. ruber pone de manifiesto la proximidad, en cuanto a
termoestabilidad se refiere, de las proteínas halofílicas a las glutamato deshidrogenasas termofílicas.
Susana Díaz González
100
Organismo
Residuos aminoacídicos (*)
Residuos
Residuos
carg. +
carg. -
BCD
B.subtilis
QRKDQDGERRRSQIKWDESRLEFR
8
6
0,50
C.difficile
MRKDQDGERRDYKLVWDENKLGQR
7
6
0,50
T. litoralis
QREDQWRERRRYDVTWDEETIRRR
8
7
0,58
P. furiosus
QREDQWRERRRYDVEWDEETIRRR
8
8
0,67
Hfx. mediterranei
EAEDQSDERRQRTIKWDASMQGER
5
7
0,42
Hbt. salinarum
KKEDQSEERRQRDVQWDASMQGER
6
7
0,50
T. maritima
KRRDQVNERRSQVINWDTSMNGHR
7
3
0,25
S. ruber
AREDINGERRAFDVKWDTSMHRQR
7
5
0,42
S. solfataricus
ERRSQSEEQRQYKYLWDEIKIGKR
7
5
0,42
A. thaliana
FRPDQNSERRQHDLTWDESKFGYR
6
5
0,42
C. symbiosum
EREDQGRMRQTYRHIYGQRKIGGQ
7
3
0,25
E. coli
ERVDQSGMRQTYRHTFGMKKLNNQ
6
2
0,17
S. cerevisiae
EREDQSNRRYRSRHTYGARTYNSQ
7
3
0,25
Tabla IV: Predicción de la termoestabilidad para diferentes glutamato deshidrogenasas mediante el índice
BDC. Los residuos cargados positivamente se marcan en color magenta en la tabla y los cargados
negativamente se señalan en azul. (*) Residuos aminoacídicos correspondientes a las 24 posiciones
analizadas en cada una de las GDHs de los diferentes organismos. Estas posiciones son las que están
marcadas mediante cajas en la Figura 24 (pág. 101). Las posiciones, marcadas según la numeración
para Hfx. mediterranei son: E59, A60, E69, D71, Q84, S87, D144, E147, R148, R152, Q156, R159, T160,
I161, K166, W181, D184, A185, S187, M188, Q189, G191, E192 y R337.
Knapp y col., (1997) realizaron una comparación estructural de las GDHs termofílicas T.
maritima y P. furiosus con la GDH de C. symbiosum, revelando diferentes mecanismos que podrían estar
contribuyendo a la termoestabilidad de estas enzimas. En miembros termotolerantes de la familia de las
gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasas existe un elevado contenido de fenilalaninas (Zwickl y col.,
Susana Díaz González
101
1990), mientras que se ha observado una disminución de este residuo en las glutamato deshidrogenasas
(DiRuggiero y col., 1993).
Se ha observado que las proteínas termofílicas comparadas con las mesofílicas poseen una
elevada frecuencia de isoleucinas. (Chakravarty y Varadarajan, 2000; Kumar y col., 2000). La GDH de P.
furiosus contiene 35 residuos de isoleucinas, mientras que en T. maritima y en C. symbiosum hay 21 y 20
residuos respectivamente (Knapp y col., 1997). En la NAD-GDH de Hfx. mediterranei existen 22
isoleucinas, 8 de las cuales se encuentran conservadas en la GDH de P. furiosus. Se encuentran 11
residuos de valinas en la GDH de
Hfx. mediterranei que son isoleucinas en la de GDH de P. furiosus y
3 cambios por leucinas. Mediante mutagénesis dirigida se ha comprobado que las sustituciones de
isoleucinas por valinas han mermado la termoestabilidad (Pace, 1992).
La cantidad de residuos conteniendo azufre (metionina y cisteína), disminuye también en las
enzimas termoestables. La estructura primaria de la GDH de C. symbiosum contiene 17 metioninas
mientras que existen solamente 12 en las GDHs de P. furiosus y T. maritima respectivamente. La NADGDH de Hfx. mediterranei contiene solamente 10 residuos de metioninas. El número de cisteínas también
es inferior de tal forma que la GDH de C. symbiosum contiene 2 cisteínas y las GDHs de P. furiosus y T.
maritima contienen únicamente 1. La existencia de un solo residuo de cisteína en la composición
aminoacídica de las GDHs P. furiosus y T. maritima corrobora la teoría de la escasa presencia de este
aminoácido en las secuencias de GDHs termófilas y coincide con la cantidad presente en la NAD-GDH de
Hfx. mediterranei.
Knapp y col., (1997) concluyen en su estudio que las variaciones en la estructura secundaria y
terciaria no contribuyen a la termoestabilidad de las glutamato deshidrogenasas. Recientemente, Pack y
Yoo, (2004) han analizado las diferencias aminoacídicas en la estructura entre las proteínas termofílicas y
las mesofílicas, para observar posibles rasgos implicados en la termoestabilidad. De esta forma, han
encontrado que existe una relación entre la termoestabilidad de las proteínas y las características
siguientes:
Susana Díaz González
102
-
una baja frecuencia de serinas parcialmente expuestas,
-
una baja frecuencia de alaninas expuestas y muy alta frecuencia de alaninas en estado
interno (no expuestas),
-
elevada frecuencia de glutámicos no expuestos,
-
alta frecuencia de argininas expuestas
El estudio mediante el índice BCD ha de tomarse con cautela, puesto que harían falta estudios
de redes de pares iónicos, entre otros, para concluir que se trata de residuos firmemente implicados en el
análisis de la termoestabilidad.
4.3.6.4. Comparación de la secuencia primaria de la NAD-GDH y análisis de su estructura
secundaria.
Mediante la utilización del programa ClustalW, se realizaron diferentes alineamientos con
glutamato deshidrogenasas. Este análisis se lleva a cabo gracias a la base de datos PROSITE, que
permite clasificar la proteína objeto de estudio dentro de la familia de correspondiente proteínas. Los
alineamientos que se realizaron se revisaron visualmente con la finalidad de corregir posibles errores.
Se han obtenido, por tanto, diferentes comparaciones que aportan datos sobre la similaridad
de la NAD-glutamato deshidrogenasa halofílica con otras GDHs disponibles. Los alineamientos realizados
fueron los que se detallan a continuación:
Comparación con glutamato deshidrogenasas de diversas fuentes
Inicialmente, la secuencia obtenida se comparó con la de otras GDHs pertenecientes a los
distintos dominios incluyendo enzimas halofílicas y no halofílicas para así poder observar las posibles
semejanzas y diferencias entre la NAD-GDH de Hfx. mediterranei y las de estos organismos. Esta
comparación mostró una elevada homología con las GDHs de diversas fuentes, confirmándose como una
posible glutamato deshidrogenasa.
Susana Díaz González
103
Se encontró un grado de identidad del 73,3% con la NAD-GDH de Hbt. salinarum, un 47%
con la NADP-GDH de Pyrococcus horikoshii, un 45,6% con la NAD(P)-GDH de Pyrococcus endeavori y
un 46% con la NAD-GDH de Pyrococcus furiosus. Estas secuencias se obtuvieron de las bases de datos
disponibles Swissprot y EMBL. La NAD-GDH de Hfx. mediterranei muestra elevada homología con la
NAD-GDH de Hbt. salinarum.
DHE_BACSU
DHE_CLOSDI
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THEMA
DHE_SRUBER
DHE_SULSO
DHE_ATHA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
------------MSAKQVSKDEEKE--ALNLFLSTQTIIKEALRKLGYPGDMYELMKEPQ
------------MSGKDVN-----------VFEMAQSQVKNACDKLGMEPAVYELLKEPM
-------------VEQDP-------------FEIAVKQLERAAQYMDISEEALEFLKRPQ
------------MVEQDP-------------YEIVIKQLERAAQYMEISEEALEFLKRPQ
-MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE
MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPK
------PE--------------------KSLYEMAVEQFNRAASLMDLESDLAEVLRRPK
--MPFNFDVYERSAYREPAPIDH-----DSPFQSMMERFDVAAEILELSPGFYEYLCRPA
------------MEEVLSS----------SLYTQQVKKLYKVGELLGLDNETLETLSQPE
----------------------------MNALAATNRNFKLAARLLGLDSKLEKSLLIPF
---SKYVDRVIAEVEKKYADEPEFVQTVEEVLSSLGP--VVDAHPEYEEVALLERMVIPE
MDQTYSLESFLNHVQKRDPNQTEFAQAVREVMTTLWP--FLEQNPKYRQMSLLERLVEPE
------------------MSEPEFQQAYDEVVSSLEDSTLFEQHPKYRKV--LPIVSVPE
.
.
.
: *
46
37
34
35
59
56
34
53
38
32
55
58
40
DHE_BACSU
DHE_CLOSDI
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THEMA
DHE_SRUBER
DHE_SULSO
DHE_ATHA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
RMLTVRIPVKMDNGSVKVFTGYRSQHNDAVGPTKGGVRFHPEVNEEEVKALSIWMTLKCG
RVIEVSIPVKMDDGSIKTFKGFRSQHNDAVGPTKGGIRFHQNVSRDEVKALSIWMTFKCS
RIVEVSIPVEMDDGSVKVFTGFRVQYNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA
RIVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA
AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE
KVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCA
RVLIVEFPVRMDDGHVEVFTGYRVQHNVARGPAKGGIRYHPDVTLDEVKALAFWMTWKTA
RMHVTSIPVEMDSGRVKIFEGYRVIHNNVLGPSKGGIRFAPDVTLNEVKALAGWMTWKCS
RIIQVKIQIRGSDGKLKTFMGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTQDEVEALSMIMTWKNS
REIKVECTIPKDDGTLASFVGFRVQHDNARGPMKGGIRYHPEVDPDEVNALAQLMTWKTA
RVIEFRVPWEDDNGKVHVNTGYRVQFNGAIGPYKGGLRFAPSVNLSIMKFLGFEQAFKDS
RVIQFRVVWVDDRNQIQVNRAWRVQFSSAIGPYKGGMRFHPSVNLSILKFLGFEQTFKNA
RIIQFRVTWENDKGEQEVAQGYRVQYNSAKGPYKGGLRFHPSVNLSILKFLGFEQIFKNS
. .
.:* .. . ** ***:*:
.
*
*
106
97
94
95
119
116
94
113
98
92
115
118
100
Susana Díaz González
104
DHE_BACSU
DHE_CLOSDI
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THEMA
DHE_SRUBER
DHE_SULSO
DHE_ATHA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
I-ANLP--YGGGKGGIICDPRTMSFGELERLSRGYVRAISQIVGPTKDIPAPDVYTNSQIM
V-TGIP--YGGGKGGIIVDPSTLSQGELERLSRGYIDGIYKLIGEKVDVPAPDVNTNGQIM
V-MDLP--YGGGKGGVICNPKEMSDREKERLARGYVRAIYDVISPYTDIPAPDVYTNPQIM
V-MDLP--YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIM
VRRDGPI-FGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM
V-MDLP--FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGTDPQTM
V-MNLP--FGGGKGGVRVDPKKLSRNELERLSRRFFSEIQVIIGPYNDIPAPDVNTNADVM
L-VDLP--FGGAKGGVACNPEEMSPGELERLTRRYTADLFDVFGPDKDIPAPDMNTNEQIM
L-LLLP--YGGGKGGVRVDPKKLTREELEQLSRKYIQAIYKYLGSELDIPAPDVNTDSQTM
V-AKIP--YGGAKGGIGCDPSKLSISELERLTRVFTQKIHDLIGIHTDVPAPDMGTGPQTM
L-TTLP--MGGAKGGSDFDPNGKSDREVMRFCQAFMTELYRHIGPDIDVPAGDLGVGAREI
L-TTLP--MGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGADTDVPAGDIGVGGREV
L-TGLD--MGGGKGGLCVDLKGRSNNEIRRICYAFMRELSRHIGQDTDVPAGDIGVGGREI
:
**.***
:
: * ::
:
..
*:** *: ..
:
164
155
152
153
179
174
152
171
156
150
173
176
158
DHE_BACSU
DHE_CLOSDI
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THEMA
DHE_SRUBER
DHE_SULSO
DHE_ATHA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
AWMMDEYSRLREFDSP--GFITGKPLVLGGSQGRETATAQGVTICIEEAVKKKGIK----SWMVDEYNKLTGQSSI--GVITGKPVEFGGSLGRTAATGFGVAVTAREAAAKLGID----AWMMDEYETISRRKDPSFGVITGKPPSVGGIVARMDATARGASYTVREAAKALGMD----AWMMDEYETISRRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRIEATARGASYTIREAAKVLGWD---TAWVMDAYSMQEGETVP--GVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD----AWLMDAYSMQEGETTP--GVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQP----AWYMDTYSMNVGHTVL--GIVTGKPVELGGSKGREEATGRGVKVCAGLAMDVLGID----AWVLDTYSMHARQTEN--AVVTGKPVGLGGSKGRRQATGRGVMTVTLAAMEQIGLA----AWFLDEYIKITGKVDF--AVFTGKPVELGGIGVRLYSTGLGVATIAKEAANKFIGG----AWILDEYSKFHGYSPA---VVTGKPIDLGGSLGRDAATGRGVMFGTEALLNEHGKT----GYMYGQYRKIVGGFYNG--VLTGKARSFGGSLVRPEATGYGSVYYVEAVMKHEN---DT-GFMAGMMKKLSN-NTAC--VFTGKGLSFGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHG---MG-GYLFGAYRTYKN-SWEG--VLTGKGLNWGGSLIRPEATGYGLVYYTQAMIDYATNGKES-.: .
...***
**
* :.. .
218
209
208
210
233
228
206
225
210
203
227
229
214
DHE_BACSU
DHE_CLOSDI
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THEMA
DHE_SRUBER
DHE_SULSO
DHE_ATHA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
LQNARIIIQGFGNAGSFLAKFM-HDAGAKVIGISDANG-----GLYNPDGLDIPYLLDKR
MKKAKIAVQGIGNVGSYTVLNC-EKLGGTVVAMAEWCKSEGSYAIYNENGLDGQAMLDYM
LKGKTIAIQGYGNAGYYMAKIMSEEYGMKVVAVSDTKG-----GIYNPDGLNADEVLAWK
LKGKTIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDFGMKVVAVSDSKG-----GIYNPDGLNADEVLKWK
IEDTTVAVQGFGSVGAPAARLL-DDYGANVVAVSDVNG-----AIYDPDGLDTHAIPTHE
LDETTVAVQGYGSVGANAARLL-DKWGATIVAISDVNG-----AMYEPDGIDTASVPSHD
PKKATVAVQGFGNVGQFAALLISQELGSKVVAVSDSRG-----GIYNPEGFDVEELIRYK
PGDCTVAVQGFGNVGATAADLL-GEQGCTVVAVSDITG-----GYYNENGLDLKAMKAYT
VEEARVIIQGFGNVGYYAGKFL-SEMGAKIVGVSDSKG-----GVINEKGIDVGKAIEIK
ISGQRFVIQGFGNVGSWAAKLI-SEKGGKIVAVSDITG-----AIKNKDGIDIPALLKHT
LVGKTVALAGFGNVAWGAAKKL-AELGAKAVTLSGPDG-----YIYDPEGITTEEKINYM
FEGMRVSVSGSGNVAQYAIEKA-MEFGARVITASDSSG-----TVVDESGFT-KEKLARL
FEGKRVTISGSGNVAQFAALKV-IELGGTVVSLSDSKG-----CIISETGIT-SEQVADI
. : * *...
. *
: :
. *:
272
268
263
265
287
282
261
279
264
257
281
282
267
Susana Díaz González
105
DHE_BACSU
DHE_CLOSDI
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THEMA
DHE_SRUBER
DHE_SULSO
DHE_ATHA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
DSFG--------MVTNLF-TDVITNEELLEK-------DCDILVPAAISNQITAKNAHNI
KEHG--------NLLNFPGAKRISLEEFWAS-------DVDIVIPAALENSITKEVAESI
KKTG--------SVKDFPGATNITNEELLEL-------EVDVLAPSAIEEVITKKNADNI
NEHG--------SVKDFPGATNITNEELLEL-------EVDVLAPAAIEEVITKKNADNI
EEPE--------AVMTHDAPETFSNEELLEL-------DVDVLIPAAVGNVLTAENADDV
EEPE--------AVTTY-ADTVISNEELLTL-------DVDVLIPAALGNVITKENAEAI
KEHG--------TVVTYPKGERITNEELLEL-------DVDILVPAALEGAIHAGNAERI
QQNGG-------TLAGYEEAQHITNEELLTL-------DVDVLVPAAKEDQINREIAEDL
EKTG--------SVINYPEGRKVTNEELLIS-------DCDILIPAALENVINKFNAPKV
KEHR--------GVKGFDGADPIDPNSILVE-------DCDILVPAALGGVINRENANEI
LEMRA---SGRNKVQDYADKFG--VQFFPGEKPWG--QKVDIIMPCATQNDVDLEQAKKI
IEIKA---SRDGRVADYAKEFG--LVYLEGQQPWS--LPVDIALPCATQNELDVDAAHQL
SSAKVNFKSLEQIVGEYSTFTENKVQYISGARPWTHVQKVDIALPCATQNEVSGDEAKAL
.
:
:
*: *.*
:
*
316
313
308
310
332
326
306
325
309
302
334
335
327
:
DHE_BACSU
DHE_CLOSDI
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THEMA
DHE_SRUBER
DHE_SULSO
DHE_ATHA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
QAS---IVVERANGPTTIDATKILNERG---------VLLVPDILASAGGVTVSYFEWVQ
KAK---LVCEAANGPTTPEADEVFAERG---------IVLTPDILTNAGGVTVSYFEWVQ
KAK---IVAELANGPTTPEADEILYEKG---------ILIIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQ
KAK---IVAEVANGPVTPEADEILFEKG---------ILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQ
QAN---LIVEGANGPTTSAADANFAERG---------VPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQ
AAD---LVVEGANGPTTSTADSILADRD---------VAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQ
KAK---AVVEGANGPTTPEADEILSRRG---------ILVVPDILANAGGVTVSYFEWVQ
RAR---IVAEGANGPTHPAADEVLAEK-----------------------------EVLQ
KAK---LIVEGANGPLTADADEIMRQRG---------IAVVPDILANAGGVVGSYVEWAN
KAK---FIIEAANHPTDPDADEILSKKG---------VVILPDIYANSGGVTVSYFEWVQ
VANNVKYYIEVANMPTTNEALRFLMQQ--------PNMVVAPSKAVNAGGVLVSGFEMSQ
IANGVKAVAEGANMPTTIEAT-ELFQQ--------AGVLFAPGKAANAGGVATSGLEMAQ
VAQGVKFVAEGSNMGSTPEAIAVFETARATASTLKESVWYGPPKAANLGGVAVSGLEMAQ
*
* :*
*
:
* :
364
361
356
358
380
374
354
353
357
350
386
386
387
DHE_BACSU
DHE_CLOSDI
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THEMA
DHE_SRUBER
DHE_SULSO
DHE_ATHA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
NNQGYYWSEEEVAEKLRSVMVSSFETIYQTAAT--HKVDMR----LAAYMTGIRKSAEAS
NLYGYYWSEEEVEQKEEIAMVKAFESIWKIKEE--YNVTMR----EAAYMHSIKKVAEAM
NITGDYWTVEETRAKLDKKMTKAFWDVYNTHKE--KNINMR----DAAYVVAVSRVYQAM
NITGYYWTIEEVRERLDKKMTKAFYDVYNIAKE--KNIHMR----DAAYVVAVQRVYQAM
DINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES--RDVPWR----DAAYIVALSRIAAAH
DINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYEN--RDVTWR----DAAYIVALSRIAEAH
DLQSFFWDLDQVRNALEKMMKGAFNDVMKVKEK--YNVDMR----TAAYILAIDRVAYAT
NRQGFFWTEEEVNRRLDRMMGEAFDKVYTAADK--YDVSLR----IAAYVVGIRRVAEAL
NKMGEIISDEEAKKLIVDRMNNAFNTLYDYHQKKLEDHDLR----TAAMALAVDRVVRAM
NIQGFMWEEEKVNDELKTYMTRSFKDLKEMCKT--HSCDLR----MGAFTLGVNRVAQAT
NSERLSWTAEEVDSKLHQVMTDIHDGSAAAAERYGLGYN----LVAGANIVGFQKIADAM
NAARLGWKAEKVDARLHHIMLDIHHACVEHGGE-GEQTN----YVQGANIAGFVKVADAM
NSQRITWSSERVDQELKKIMVNCFNECIDSAKKYTKEGNALPSLVKGANIASFIKVSDAM
:
:..
*
.*
.. :
*
418
415
410
412
434
428
408
407
413
404
442
441
447
Susana Díaz González
106
DHE_BACSU
DHE_CLOSDI
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THEMA
DHE_SRUBER
DHE_SULSO
DHE_ATHA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
RFRGWV-KLRGWY-KDRGWIKK
LDRGWVKH
DARGLWPEARGLWPKKRGIYPRMRGIYAKARGIL-ILRGWGAMAQGIAWLAQGVI-FDQGDVF:*
424
421
418
420
441
435
415
414
419
411
449
447
454
(*) residuos que son idénticos en todas las secuencias del
alineamiento.
(:) residuos conservados en esa posición.
(.) residuos semiconservados.
Cajas: residuos estudiados en el apartado de
termoestabilidad.
Figura 24: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas procedentes de organismos de distintos dominios. BACSU: Bacillus
subtilis; CLOSDI: Clostridium dificcile; PYRFU: Pyrococcus furiosus; THEMA: Thermotoga marítima; SRUBER: Salinibacter ruber;
HFMED: Haloferax mediterranei; HALSA: Halobacterium salinarum THELI: Themococcus litoralis; SULSO: Sulfolobus
solfataricus; ATHA: Arabidopsis Thaliana; CLOSY: Clostridium symbiosum; ECOLI: Escherichia coli; YEAST: S. cerevisiae. Este
alineamiento realizado utilizando secuencias de GDHs disponibles en las bases de datos y procedentes de Bacteria, Archaea y
Eucarya es el que se observa en la Figura 24. El análisis comparativo de las secuencias revela que los residuos clave en el
mantenimiento de las propiedades catalíticas y el marco estructural de la enzima se encuentran en general conservados
independientemente de la procedencia del organismo.
Comparación con glutamato deshidrogenasas procedentes de HALÓFILOS
En este alineamiento se han buscado homologías entre las GDHs de organismos halofílicos
procedentes de Archaea y Bacteria. En la Figura 25 se observa la presencia de regiones peptídicas
idénticas en las GDHs que se han comparado, mostrándose dichas regiones mediante cajas.
Susana Díaz González
107
DHE_Hfx.vol.2
DHE_a1HALSA
DHE_HFMED
DHE_Hfx.vol.1
DHE_Hfx.vol.3
DHE_bHALSA
DHE_HALSA
DHE_a2HALSA
DHE_SRUBER
-----------------------------MAQEANPFESLQEQIDDAATYLDVRDDVIER
------------------------------MPEANPFESLQEQLDDAGEFLDVNADVLER
------MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVER
------MASAAP-----------STATDDEPTEETALETARRQLERAAAHLDVDPGVIER
MMNEDGKNRNGE----------AVTDGGSGSEPETALATARRQLERAASHADVDDGVVAR
------MAQTPP----------PESAPSTDSEPETALETARRQLQAAAEHVDIADGVIER
----MTMASKSD-----STHDESGDEAADSTEPESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVER
------------------------------MTESGPLENMLAQMEQAREYVDIDDGIYER
------MPFNFD------VYERSAYREPAPIDHDSPFQSMMERFDVAAEILELSPGFYEY
.: .
:: *
:: ..
31
30
54
43
50
44
51
30
48
DHE_Hfx.vol.2
DHE_a1HALSA
DHE_HFMED
DHE_Hfx.vol.1
DHE_Hfx.vol.3
DHE_bHALSA
DHE_HALSA
DHE_a2HALSA
DHE_SRUBER
LKNPERVLETNLAVEMDDGDVELFRAYRSQFNGDRGPYKGGIRYHPNVSRDEVKALSGWM
LKHPERVLETTLSVEMDDGTIETFKAFRSQFNGDRGPYKGGIRYHPGVTRDEVKALSGWM
LKHPEAVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWM
LRHPNQVHRVSVPLERDDGSTAVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRFHPDVTEAECIGLSMWM
LKHPTRVQQVSVPLRRDDGSLDVFTGFRAQHDDVRGPYKGGLRYHPEVTADECIGLSMWM
LTHPTRVVQVSVPVERDDGTVTVYDGYRAQHDDVRGPYKGGLRYHPGVSAEECVGLSMWM
LKYPKKVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWM
LKSPERTLSVSLPVRMDDGSVEVFDAYRCQFDSARGPYKGGIRYHPTVSEEEVSALAGWM
LCRPARMHVTSIPVEMDSGRVKIFEGYRVIHNNVLGPSKGGIRFAPDVTLNEVKALAGWM
* *
..:.:. *.*
: .:* .:. ** ***:*: * *: * .* **
91
90
114
103
110
104
111
90
108
DHE_Hfx.vol.2
DHE_a1HALSA
DHE_HFMED
DHE_Hfx.vol.1
DHE_Hfx.vol.3
DHE_bHALSA
DHE_HALSA
DHE_a2HALSA
DHE_SRUBER
VYKCAVV-DIP-YGGGKGGIVIDPKAYSESELERITRSFAKELRPLVGESRDIPAPDVNT
VYKTAVA-DIP-YGGGKGGIILDPEEYSDSELERITRAFATELRPFIGEDKDVPAPDVNT
TWKTEVRRDGPIFGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGT
TWKCAVM-DLP-FGGGKGGVVVDPKDLSTDEKERLTRRFAEELRPFIGPTKDIPAPDMGT
TWKCAVM-DLP-FGGGKGGVAVDPKTLSDEERERLTRRFAEEIRNVVGPKKDVPAPDMGT
TWKCAVM-DLP-FGGAKGGVVVDPKTLSADEHERLTRRFAAELRDEVGPSQDIPAPDMGT
TWKCAVM-DLP-FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGT
TWKTALV-DLP-FGGAKGGIVCNPKELSDNEIEQLTRRYTEGIRRMIGPETDIPAPDMNT
TWKCSLV-DLP-FGGAKGGVACNPEEMSPGELERLTRRYTADLFDVFGPDKDIPAPDMNT
.:* : * * :**.***: :*: : * *::** :: :
.*
*:****:.*
149
148
174
161
168
162
169
148
166
DHE_Hfx.vol.2
DHE_a1HALSA
DHE_HFMED
DHE_Hfx.vol.1
DHE_Hfx.vol.3
DHE_bHALSA
DHE_HALSA
DHE_a2HALSA
DHE_SRUBER
GQREMNWIKDTYETLENTTAPGVITGKALSNGGSEGRVEATGRSTMLTAREAFDYLGRDI
GQREMNWIKDTYETLEDTTAPGVITGKALENGGSEGRVNATGRSTMFAAREVFDYLDRDL
DPQTMAWVMDAYSMQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWDI
DAQTMAWFMDAYSMQEGETKAGVVTGKPPVVGGSEGRDTAPGRSVAIIARETIDDLGWDI
GPQEMAWFMDAYSMQQGETTPGVVTGKPPVIGGSYGREEAPGRSVAIVTREAVDFYDWDI
DAQTMAWFMDAYSMQQGETVPGVVTGKPPVAGGSHGRAEAPGRSVAIATREAINYYDIPI
DPQTMAWLMDAYSMQEGETTPGVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQPL
DPRTMAWVMDTYSVYQGYAVPEVVTGKPPEIGGTDGRVEATGRGVSIITEETFEYFDTDI
NEQIMAWVLDTYSMHARQTENAVVTGKPVGLGGSKGRRQATGRGVMTVTLAAMEQIGLAP
. : * *. *:*.
:
*:***.
**: ** *.**..
: . : .
209
208
234
221
228
222
229
208
226
Susana Díaz González
108
DHE_Hfx.vol.2
DHE_a1HALSA
DHE_HFMED
DHE_Hfx.vol.1
DHE_Hfx.vol.3
DHE_bHALSA
DHE_HALSA
DHE_a2HALSA
DHE_SRUBER
EGATVAVQGYGNAGSIAARLVEDLGASVVAVSDSSGGIYDPDGLDTRAVKDFKNETG-TV
SDATVAVQGYGNAGSVAAKLIADQGADVVAVSDSSGAVHNPDGLDTRAVKAFKTETG-SV
EDTTVAVQGFGSVGAPAARLLDDYGANVVAVSDVNGAIYDPDGLDTHAIPTHEEEPE-AV
EDTTVAVQGFGSVGAPAARLLDDEGATVVAVSDVNGAIYDPDGLDTHDVPTHEEEPE-AV
EDTTVAVQGFGSVGANAARLLDEWGAKVVAVSDVDGAIYDPDGLDTQDVEGHDERPG-MV
DDATVAVQGYGSVGANAALLLDDWGARVVAVSDVNGGVLDTDGLDTHAIPSHGNQPA-AV
DETTVAVQGYGSVGANAARLLDKWGATIVAISDVNGAMYEPDGIDTASVPSHDEEPE-AV
QDADVAIQGFGNVGSVTADLLSERGANIVAVSDVTGAIHDPTGLDIADVQAYADANGGRL
GDCTVAVQGFGNVGATAADLLGEQGCTVVAVSDITGGYYNENGLDLKAMKAYTQQNGGTL
**:**:*..*: :* *: . *. :**:** *. : *:*
: .
:
268
267
293
280
287
281
288
268
286
DHE_Hfx.vol.2
DHE_a1HALSA
DHE_HFMED
DHE_Hfx.vol.1
DHE_Hfx.vol.3
DHE_bHALSA
DHE_HALSA
DHE_a2HALSA
DHE_SRUBER
SDYEG-TEAITNEELLTLDVDLLVPAALENAIDGELAHDVKADVIVEAANGPLTPDADDV
SGYEGATEELSNEALLTMDVDLLVPAALENAIDEDLAHDVDADVVVEAANGPLTPDADDV
MTHD-APETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAADAN
MKYD-APRKLSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVRADLVVEGANGPTTSAADEI
SGYD-APESLSNEELLELDVDVLIPAAIGNVITTENVDSISAEMVVEGANGPTTFAADAV
MRHD-APNTLTNEELLELDVDVVIPAAVGNVITAANADRIQADIVVEGANGPTTSAADRI
TTY--ADTVISNEELLTLDVDVLIPAALGNVITKENAEAIAADLVVEGANGPTTSTADSI
EGYD-A-EPISNDDLLTLDVDALIPAAIEDVITVDVAERLAADVIVEAANGPTTFDAAQV
AGYEEA-QHITNEELLTLDVDVLVPAAKEDQINREIAEDLRARIVAEGANGPTHPAADEV
:
::*: ** :*** ::*** : :
.. : * ::.*.****
*
327
327
352
339
346
340
346
326
345
DHE_Hfx.vol.2
DHE_a1HALSA
DHE_HFMED
DHE_Hfx.vol.1
DHE_Hfx.vol.3
DHE_bHALSA
DHE_HALSA
DHE_a2HALSA
DHE_SRUBER
LTEREIHVFPDILANAGGVTVSYFEWVQNRQRFYWTEQRVNDELERVIVDAFEELVDACE
LTERGVTVVPDILANAGGVTVSYFEWVQNRQRFQWTEDRVNEELEAIITDAFDAMTDAHE
FAERGVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYE
FEARGILVVPDILANAGGVTVSYFEWLQDLNHRSWSLERVHDELETEMLRAWTAVRERVE
LEERGIPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRQWSLERVHEELESEMLKAWNAVREHVE
LEERAVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSPERVRDELESEMLSAWNAVRSEVD
LADRDVAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYE
LSDRGVPVVPDILANAGGVIVSYLEWVQNSQQYSWDVEEVNRDLRQRLTGAFDEMLVAYE
LAEK--------------------EVLQNRQGFFWTEEEVNRRLDRMMGEAFDKVYTAAD
: :
* :*: :
* :.*. *
: *: :
:
387
387
412
399
406
400
406
386
385
DHE_Hfx.vol.2
DHE_a1HALSA
DHE_HFMED
DHE_Hfx.vol.1
DHE_Hfx.vol.3
DHE_bHALSA
DHE_HALSA
DHE_a2HALSA
DHE_SRUBER
SHDLPNFRTAAYVVAIRRVVDSYDSAGNWP
DAGTPNLRTAAYVVAVQRVVDAYEGSGSWP
SRDVP-WRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP
EHDVT-WRDAAYMVALERVSEAHEHRGLWP
ERDLT-WRDAAYVVALSRIGGAKETRGLWP
DGDLS-WRDAAYVVALQRIGRAKEARGLWP
NRDVT-WRDAAYIVALSRIAEAHEARGLWP
DRNIPTLRTAAYTIALERSADAHEFRGLFP
KYDVS-LRIAAYVVGIRRVAEALRMRGIYA
. . . * *** :.: *
:
* :.
417
417
441
428
435
429
435
416
414
(*) residuos que son idénticos en
las secuencias del alineamiento.
(:) residuos conservados en esa
posición.
(.) residuos semiconservados.
Cajas: Regiones peptídicas conservadas
: Residuos acídicos idénticos
Figura 25: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas procedentes de organismos halofílicos de Bacteria y Archaea: Hfx.vol.2:
Haloferax volcanii (ORF 2); a1HALSA: Halobacterium salinarum-a1; HFMED: Haloferax mediterranei; Hfx.vol.1: Haloferax volcanii
(ORF 1); Hfx.vol.3: Haloferax volcanii (ORF 3); bHALSA: Halobacterium salinarum-b ; HALSA: NAD-GDH Halobacterium
salinarum; a2HALSA: Halobacterium salinarum-a2; SRUBER: Salinibacter ruber.
Susana Díaz González
109
Del mismo modo que ocurre en la NAD-GDH de Hbt. salinarum, la
NAD-GDH de Hfx.
mediterranei muestra un elevado número de residuos acídicos, (Asp y Glu) característica no presente en
otras arqueas no halofílicas. Sin embargo, este carácter acídico es común en proteínas halofílicas. En la
Figura 25, se observa el elevado número de residuos acídicos idénticos conservados en las GDHs
halofílicas. Dichos residuos se indican mediante flechas.
Comparación con diversas glutamato deshidrogenasas NAD-dependientes
Puesto que la GDH objeto de este estudio es una enzima con una especificidad por NAD, se
llevó a cabo la comparación con diversas
NAD-GDHs, realizando por tanto un estudio en base al
coenzima utilizado por las distintas GDHs.
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THER
DHE_PEPAS
DHE_CLODI
-MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE
MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPK
--MPLKAYRPPEDPG---------------LWDTYLEWLERALKVAGVHPTTLEYLAHPK
--MTDT----------------------LNPLVAAQEKVRIACEKLGCDPAVYELLKEPQ
--MSGKD---------------------VNVFEMAQSQVKNACDKLGMEPAVYELLKEPM
.
. .... ::.::....:: .
: * . . .
* * *
59
56
43
36
37
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THER
DHE_PEPAS
DHE_CLODI
AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE
KVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCA
RLVTLSLPVVMDDGKVRIFQGYRVVHDIARGPAKGGVRLDPGVTLGQTAGLAAWMTLKAA
RVIEISIPVKMDDGTVKVFKGWRSAHSSAVGPSKGGVRFHPNVNMDEVKALSLWMTFKGG
RVIEVSIPVKMDDGSIKTFKGFRSQHNDAVGPTKGGIRFHQNVSRDEVKALSIWMTFKCS
: :::*: ***.: : *:* *. . ** ***:* . .*. .: .* *** *
119
116
103
96
97
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THER
DHE_PEPAS
DHE_CLODI
VRRDGPI-FGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM
VM-DLP--FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGTDPQTM
VY-DLP--FGGAAGGIAVDPKGLSPRELERLVRRYTAELVGLIGPDSDILGPDLGADQQVM
AL-GLP--YGGGKGGICVDPAELSERELEQLSRGWVRGLYKYLGDRIDIPAPDVNTNGQIM
VT-GIP--YGGGKGGIIVDPSTLSQGELERLSRGYIDGIYKLIGEKVDVPAPDVNTNGQIM
.
* :**. **: *:* *: * *:* * :
:
:*
*: .**:.:: * *
179
174
161
154
155
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THER
DHE_PEPAS
DHE_CLODI
AWVMDAYSMQEGE-TVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWDIEDTT
AWLMDAYSMQEGE-TTPGVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQPLDETT
AWIMDTYSMTVGS-TVPGVVTGKPHALGGSEGRDDAAGLGALLVLEALAKRRGLDLRGAR
SWFVDEYVKLNGERMDIGTFTGKPVAFGGSEGRNEATGFGVAVVVRESAKRFGIKMEDAK
SWMVDEYNKLTGQ-SSIGVITGKPVEFGGSLGRTAATGFGVAVTAREAAAKLGIDMKKAK
:*.:* *
*.
*..**** .*** ** *.* .. : .
. : :
238
233
220
214
214
Susana Díaz González
110
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THER
DHE_PEPAS
DHE_CLODI
VAVQGFGSVGAPAARLLDDYGANVVAVSDVNG-----AIYDPDGLDTHAIPTHEEEPEAV
VAVQGYGSVGANAARLLDKWGATIVAISDVNG-----AMYEPDGIDTASVPSHDEEPEAV
VVVQGLGQVGAAVALHAERLGMRVVAVATSMG-----GMYAPEGLDVAEVLSAYEATGSL
IAVQGFGNVGTFTVKNIERQGGKVCAIAEWDRNEGNYALYNENGIDFKELLAYKEANKTL
IAVQGIGNVGSYTVLNCEKLGGTVVAMAEWCKSEGSYAIYNENGLDGQAMLDYMKEHGNL
:.*** *.**: ..
: * : *::
.:* :*:*
:
:
:
293
288
275
274
274
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THER
DHE_PEPAS
DHE_CLODI
MTHDAPETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAADANF
TTY-ADTVISNEELLTLDVDVLIPAALGNVITKENAEAIAADLVVEGANGPTTSTADSIL
PRL----DLAPEEVFGLEAEVLVLAAREGALDGDRARQVQAQAVVEVANFGLTPEAEAYL
IGFPGAERITDEEFWTKEYDIIVPAALENVITGERAKTINAKLVCEAANGPTTPEGDKVL
LNFPGAKRISLEEFWASDVDIVIPAALENSITKEVAESIKAKLVCEAANGPTTPEADEVF
.
:: **.
: :::: ** . : : * : *. : * **
*. .: :
353
347
331
334
334
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THER
DHE_PEPAS
DHE_CLODI
AERGVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES
ADRDVAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYEN
LGKGALVVPDLLSGGGGLLASYLEWVQDLNMFFWSPEEVRERFETRVARVVDAVCRRAER
TERGINLTPDILTNSGGVLVSYYEWVQNQYGYYWTEAEVEEKQEADMMKAIKGVFAVADE
AERGIVLTPDILTNAGGVTVSYFEWVQNLYGYYWSEEEVEQKEEIAMVKAFESIWKIKEE
:. : **:*:..**: .** **:*:
*: .*.:. * : .
:
:
413
407
391
394
394
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THER
DHE_PEPAS
DHE_CLODI
RDVPWRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP
RDVTWRDAAYIVALSRIAEAHEARGLWP
DGLDLRMGALALALERLDEATRLRGVYP
YNVTLREAVYMYAIKSIDVAMKLRGW-YNVTMREAAYMHSIKKVAEAMKLRGWY.: * ..
::. : *
** .
441
435
419
420
421
(*) residuos que son idénticos en
las secuencias del alineamiento.
(:) residuos conservados en esa posición.
(.) residuos semiconservados.
Figura 26: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas NAD-dependientes.
THER: Thermus thermophilus; HFMED: Haloferax mediterranei; HALSA: Halobacterium salinarum;
CLODI: Clostridum symbiosum; PEPAS: Peptostreptococcus asaccharolyticus.
Como se ha comentado anteriormente existe posiblemente una relación entre la presencia de
una glicina conservada en la mayoria de las NAD-GDHs, marcada en la Figura 26 con ( ). Mediante
flechas se muestran los residuos del dominio de unión al coenzima que se encuentran en las NAD-GDHs.
Comparación con diversas GDHS duales: NAD(P)-dependientes
De la misma forma, se realizó un alineamiento por especificidad de coenzima en el que se
buscaron diferencias entre la NAD-GDH halófila y otras GDHs de diversos organismos. Se realizó con
GDHs que tienen especificidad DUAL procedentes de diversas fuentes.
Susana Díaz González
111
DHE_HFMED
DHE_THERMA
DHE_THLI
DHE_PYRFU
DHE_PYRPRF
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPEA
-----PE--------------------KSLYEMAVEQFNRAASLMDLESDLAEVLRRPKR
-------------------------VEQDPFEIAVKQLERAAQYMDISEEALEFLKRPQR
------------------------MVEQDPYEIVIKQLERAAQYMEISEEALEFLKRPQR
------------------------MVEIDPFEMAVKQLERAAQYMDISEEALEWLKKPMR
-------------------MEVLALQPTDPLEEARAQLRRAVDLLGYDDYVYEVLANPDR
---------------------MEEVLSSSLYTQQVKKLYKVGELLGLDNETLETLSQPER
.
:: :. . : .
* * .*
60
35
35
36
36
41
39
DHE_HFMED
DHE_THERMA
DHE_THLI
DHE_PYRFU
DHE_PYRPRF
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
VHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTEV
VLIVEFPVRMDDGHVEVFTGYRVQHNVARGPAKGGIRYHPDVTLDEVKALAFWMTWKTAV
IVEVSIPVEMDDGSVKVFTGFRVQYNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTAV
IVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTAV
IVEVSVPIEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPAETLSTVKALATWMTWKVAV
VLQVRVTIKMDDGTVKTFLGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTMNEVIALSMWMTWKNSL
IIQVKIQIRGSDGKLKTFMGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTQDEVEALSMIMTWKNSL
: * . :. .** :..: *:* *:: . ** ***:*:** * .
.*
**** :
120
95
95
96
96
101
99
DHE_HFMED
DHE_THERMA
DHE_THLI
DHE_PYRFU
DHE_PYRPRF
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
RRDGPIFGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTMA
M-NLP-FGGGKGGVRVDPKKLSRNELERLSRRFFSEIQVIIGPYNDIPAPDVNTNADVMA
M-DLP-YGGGKGGVICNPKEMSDREKERLARGYVRAIYDVISPYTDIPAPDVYTNPQIMA
M-DLP-YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIMA
V-DLP-YGGGKGGIIVNPKELSEREQERLARAYIRAVYDVIGPWTDIPAPDVYTNPKIMG
A-GLP-YGGGKGGVRVNPKILSPRELELLSRKYFESISDIVGVDQDIPAPDVYTDPQVMS
LL-LP-YGGGKGGVRVDPKKLTREELEQLSRKYIQAIYKYLGSELDIPAPDVNTDSQTMA
.* :**.***: :** :: * * *:* :
:
:.
******: *:.. *.
180
153
153
154
154
159
157
DHE_HFMED
DHE_THERMA
DHE_THLI
DHE_PYRFU
DHE_PYRPRF
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
WVMDAYS--MQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD-IEDT
WYMDTYS--MNVGHTVLGIVTGKPVELGGSKGREEATGRGVKVCAGLAMDVLGID-PKKA
WMMDEYETISRRKDPSFGVITGKPPSVGGIVARMDATARGASYTVREAAKALGMD-LKGK
WMMDEYETISRRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRIEATARGASYTIREAAKVLGWDTLKGK
WMMDEYETIMRRKGPAFGVITGKPLSIGGSLGRGTATAQGAIFTIREAAKALGID-LKGK
WFLDEYN--RVKRGQFFGVVTGKPVELGGLNARIVSTGYGVAVSTRVAAEKFLGG-LEGR
WFLDEYI--KITGKVDFAVFTGKPVELGGIGVRLYSTGLGVATIAKEAANKFIGG-VEEA
* :* *
.:.**** :**
* :.. ..
* . : . :
237
210
212
214
213
216
214
DHE_HFMED
DHE_THERMA
DHE_THLI
DHE_PYRFU
DHE_PYRPRF
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
TVAVQGFGSVGAPAARLL-DDYGANVVAVSDVNGAIYDPDGLDTHAIPTHEEEPEAVMTH
TVAVQGFGNVGQFAALLISQELGSKVVAVSDSRGGIYNPEGFDVEELIRYKKEHGTVVTY
TIAIQGYGNAGYYMAKIMSEEYGMKVVAVSDTKGGIYNPDGLNADEVLAWKKKTGSVKDF
TIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDFGMKVVAVSDSKGGIYNPDGLNADEVLKWKNEHGSVKDF
KIAVQGYGNAGYYTAKLAKEQLGMTVVAVSDSRGGIYNPDGLDPDEVLKWKREHGSVKDF
TVAVQGYGNVGYYAAKFL-AEMGAKIVAVSDSRGGIYDPEGIDPEEALKVKRSTGTVANY
RVIIQGFGNVGYYAGKFL-SEMGAKIVGVSDSKGGVINEKGIDVGKAIEIKEKTGSVINY
: :**:*..*
. :
: * .:*.*** .*.: : .*::
:.. :* .
296
270
272
274
273
275
273
DHE_HFMED
DHE_THERMA
DHE_THLI
DHE_PYRFU
DHE_PYRPRF
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
DAPETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAADANFAER
PKGERITNEELLELDVDILVPAALEGAIHAGNAERIKAKAVVEGANGPTTPEADEILSRR
PGATNITNEELLELEVDVLAPSAIEEVITKKNADNIKAKIVAELANGPTTPEADEILYEK
PGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITKKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADEILFEK
PGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITEKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADDILREK
QRGKKISTMEILELPVDILVPAAIEEVITDENADRIKAKIISEGANGPTTTAAEKILVKK
PEGRKVTNEELLISDCDILIPAALENVINKFNAPKVKAKLIVEGANGPLTADADEIMRQR
.:. *:*
*:* *:*: .:
** ::*: : * **** *. *: : .:
356
330
332
334
333
335
333
Susana Díaz González
112
DHE_HFMED
DHE_THERMA
DHE_THLI
DHE_PYRFU
DHE_PYRPRF
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
GVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES--GILVVPDILANAGGVTVSYFEWVQDLQSFFWDLDQVRNALEKMMKGAFNDVMKVKEK--GILIIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNITGDYWTVEETRAKLDKKMTKAFWDVYNTHKE--GILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNITGYYWTIEEVRERLDKKMTKAFYDVYNIAKE--GILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNINGYYWTEEEVREKLDKKMTKAFWEVYNTHKD--GVLVLPDILANAGGVIMSHIEWVNNRMGGWITDEEALKKLEQKMVENTKTVITYWEKNLK
GIAVVPDILANAGGVVGSYVEWANNKMGEIISDEEAKKLIVDRMNNAFNTLYDYHQK--K
*: :**:*.***** *:.** ::
:..
:
*
:
:.
DHE_HFMED
DHE_THERMA
DHE_THLI
DHE_PYRFU
DHE_PYRPRF
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
-RDVPWRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP-YNVDMRTAAYILAIDRVAYATKKRGIYP-KNINMRDAAYVVAVSRVYQAMKDRGWIKK
-KNIHMRDAAYVVAVQRVYQAMLDRGWVKH
-KNIHMRDAAYVVAVSRVYQAMKDRGWVKK
PEENSLRDAAYMIAVERVFRAMKLRGWI-LEDHDLRTAAMALAVDRVVRAMKARGIL-:
* ** :*:.*: *
**
413
387
389
391
390
395
391
441
415
418
420
419
423
419
Figura 27: Alineamiento de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con GDHs NAD(P)-dependientes.
THERMA: Thermotoga maritima; HFMED: Haloferax mediterranei; THLI: Thermococcus litoralis; PYRFU:
Pyrococcus furiosus; PYRPRF: Pyrococcus profundus; AEPYR: Aeropyrum pernix; SULSO: Sulfolobus
solfatariccus.
Las GDHs duales parecen mantener la glicina discutida por Wierenga y col., 1985, del mismo
modo que se conserva en las GDHs NAD-dependientes.
Comparación con diversas GDHs NADP-dependientes
Por último, se realizó un alineamiento más observando las diferencias por especificidad de
coenzima en el que se buscaron diferencias entre la NAD-GDH halófila y otras GDHs de diversos
organismos. Se realizó con GDHs que tienen especificidad por NADP procedentes de diversas fuentes.
Susana Díaz González
113
DHE_ECOLI
DHE_SALTY
DHE_BACFR
DHE_NEUCR
DHE_HFMED
DHE_SULSH
MDQTYSLESFLNHVQKRDPNQTEFAQAVREVMTTLWP--FLEQNPKYRQMSLLERLVEPE
MDQTCSLESFLNHVQKRDPHQTEFAQAVREVMTTLWP--FLEQNPRYRHMSLLERLVEPE
----MNIEKIMSSLEAKHPGESEYLQAVKEVLLSIED--IYNQHPEFEKAKIIERLVEPD
---------------SNLPSEPEFEQAYKELAYTLENSSLFQKHPEYRTALTVASIP--E
-MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE
-------------------------------------------------LDTLEALSQPE
: :
:
58
58
54
43
59
11
DHE_ECOLI
DHE_SALTY
DHE_BACFR
DHE_NEUCR
DHE_HFMED
DHE_SULSH
RVIQFRVVWVDDRNQIQVNRAWRVQFSSAIGPYKGGMRFHPSVNLSILKFLGFEQTFKNA
RVIQFRVVWLDDKNQVQVNRAWRVQFNSAIGPYKGGMRFHPSVNLSILKFLGFEQTFKNA
RIFTFRVTWVDDKGEVQTNLGYRVQFNNAIGPYKGGIRFHASVNLSILKFLGFEQTFKNA
RVIQFRVVWEDDNGNVQVNRGYRVQFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEQIFKNA
AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE
RVIQVKIQIRGSDGKLKTFMGWRSQHNSALGPYKGGVRYSPNVTQDEVIALSMIMTWKNS
: . :
. ..:.. .:* *.... ******:* ..*. .
* :
:*.
118
118
114
103
119
71
DHE_ECOLI
DHE_SALTY
DHE_BACFR
DHE_NEUCR
DHE_HFMED
DHE_SULSH
LTTLP--MGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGADTDVPAGDIGVGGREV
LTTLP--MGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGPDTDVPAGDIGVGGREV
LTTLP--MGGGKGGSDFSPRGKSDAEIMRFCQAFMLELWRHLGPDMDVPAGDIGVGGREV
LTGLS--MGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREI
VRRDGPIFGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM
LLLLP--YGGGKGGIRVDPKKLTLKELEDLSRKYVQLIHNYLGSDVDIPAPDINTNPQTM
:
**.*** ..*: : *
:
:
:*. *:** *:... : :
176
176
172
161
179
129
DHE_ECOLI
DHE_SALTY
DHE_BACFR
DHE_NEUCR
DHE_HFMED
DHE_SULSH
GFMAGMMKKLSNNTA-CVFTGKGLSFGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHGMG-FEGMR
GFMAGMMRKLSNNSS-CVFTGKGLSFGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHGLG-FEGMR
GYMFGMYKKLTREFT-GTFTGKGLEFGGSLIRPEATGFGGLYFVNQMLQTKGID-IKGKT
GYMFGAYRKAANRFE-GVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKR
AWVMDAYSMQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD-IEDTT
AWFLDEYIKITGEVDFAVFTGKPSELGGIGVRLYSTGLGVATIAREAANKFIGG-IEGSR
.:. .
.
..***
**
* :.* .
.
.
.
.
234
234
230
220
238
188
DHE_ECOLI
DHE_SALTY
DHE_BACFR
DHE_NEUCR
DHE_HFMED
DHE_SULSH
VSVSGSGNVAQYAIEKAMEFGARVITASDSSGTVVD--ESGFTKEKLARLIEIKASRDGR
VAVSGSGNVAQYAIEKAMAFGARVVTASDSSGTVVD--ESGFTPEKLARLCEIKASRDGR
VAISGFGNVAWGAATKATELGAKVVTISGPDGYIYD--PNGISGEKIDYMLELRASGNDI
VALSGSGNVAQYAALKLIELGATVVSLSDSKGALVATGESGITVEDINAVMAIKEARQSVAVQGFGSVGAPAARLLDDYGANVVAVSDVNGAIYD--PDGLDTHAIPTHEEEPEAVMTH
VIIQGFGNVGSFTAKFLNEMGAKIIGVSDIGGGVIS--DDGIDVNKALEVVQSTGSVVNY
* :.* *.*. :
** :: *. * :
.*: .
:
292
292
288
279
296
246
DHE_ECOLI
DHE_SALTY
DHE_BACFR
DHE_NEUCR
DHE_HFMED
DHE_SULSH
VADYAKEF-GLVYLEGQQPWSLP--VDIALPCATQNELDVDAAHQLIANGVKAVAEGANM
VADYAREF-GLTYLEGQQPWSVP--VDIALPCATQNELDVDAARVLIANGVKAVAEGANM
VAPYADEFPGSTFVAGKRPWEVK--ADIALPCATQNELNGEDAKNLIDNNVLCVGEISNM
LTSFQHAG-HLKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATQNEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNM
DAPETFSNEELLELD----------VDVLIPAAVGNVLTAENADDVQAN---LIVEGANG
PEGKKVTNEELLTSD----------CDILIPAAVENVINKFNAPKVKAK---LIVEGANG
*: :*.*. * :
* :
: * :*
349
349
346
338
343
293
DHE_ECOLI
DHE_SALTY
DHE_BACFR
DHE_NEUCR
DHE_HFMED
DHE_SULSH
PTTIEATELFQQAG-------VLFAPGKAANAGGVATSGLEMAQNAARLGWKAEKVDARL
PTTIEATDLFLEAG-------VLFAPGKAANAGGVATSGLEMAQNAARLSWKAEKVDARL
GCTPEAIDLFIEHK-------TMYAPGKAVNAGGVATSGLEMSQNAMHLSWSAAEVDEKL
GCTLEAIEVFENNRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAQNSQRLNWTQAEVDEKL
PTTSAADANFAERG-------VPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDEL
PLAADADEIIKQRG-------IVVIPDILANAGGVVGSYVEWANNKSGGIISDEEAKKLI
402
402
399
398
396
346
#
#
#
Susana Díaz González
114
:
DHE_ECOLI
DHE_SALTY
DHE_BACFR
DHE_NEUCR
DHE_HFMED
DHE_SULSH
*
: :
*.
.*.***. * .*
::
.
...
HHIML-----DIHHACVEHGGEGE-QTNYVQGANIAGFVKVADAMLAQGVI---HHIML-----DIHHACVEYGGDNK-HTNYVQGANIAGFVKVADAMLAQGVI---HSIMH-----GIHAQCVKYGTEPDGYINYVKGANIAGFMKVAHAMMGQGII---KDIMKNAFFNGLNTAKTYVEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVAQAMHDQGDWWSKN
ETEMLN-----AWSVVRDEYESR--DVPWRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP--IDRMTN-----AFNALYEFHKRKFADQDLRTVAMALRVDRVVG-MKARAI----*
:
. ::.
:.
:
447
447
445
453
441
390
Figura 28: Alineamiento de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con GDHs NADP-dependientes.
ECOLI: Escherichia coli; SALTY: Salmonella thiphymorium; BACFR: Bacteroides fragilis; NEURC:
Neurospora crassa; HFMED: Haloferax mediterranei; SULSO: Sulfolobus shibatae.
En la Figura 28 se han marcado mediante (#) aquellos residuos que se encuentran modificados
en las GDHs NADP-dependientes y que son: Gln242 de Hfx. mediterranei, que suele estar sustituido por
Serina, Gly248 que suele ser Alanina y Ala264 que se encuentra en todas las NAD-dependientes y
sustituida por residuos no polares en la NADP-dependientes.
Comparación con diversas GDHs de Archaea
Puesto que la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei pertenece al Dominio
Archaea, se ha realizado un alineamiento en el que se observa la elevada homología que presenta la
enzima halofílica con otras GDHs pertenecientes al mismo Dominio, llegando a existir grandes regiones
peptídicas totalmente coincidentes en todas ellas.
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THERMA
DHE_PYRAB
DHE_PYRFU
DHE_THERPR
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
-MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE
MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPK
------PE--------------------KSLYEMAVEQFNRAASLMDLESDLAEVLRRPK
--MVE-----------------------QDPFEIAVKQLERAAQYMKISEEALEFLKRPQ
--MVE-----------------------QDPYEIVIKQLERAAQYMEISEEALEFLKRPQ
--MVE-----------------------IDPFEMAVKQLERAAQYMDISEEALEWLKKPM
MEVLALQP--------------------TDPLEEARAQLRRAVDLLGYDDYVYEVLANPD
--MEEVLS--------------------SSLYTQQVKKLYKVGELLGLDNETLETLSQPE
.
:: :. . : .
* * *
Susana Díaz González
59
56
34
35
35
35
40
38
115
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THERMA
DHE_PYRAB
DHE_PYRFU
DHE_THERPR
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE
KVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCA
RVLIVEFPVRMDDGHVEVFTGYRVQHNVARGPAKGGIRYHPDVTLDEVKALAFWMTWKTA
RIVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQYNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA
RIVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA
RIVEVSVPIEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPAETLSTVKALATWMTWKVA
RVLQVRVTIKMDDGTVKTFLGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTMNEVIALSMWMTWKNS
RIIQVKIQIRGSDGKLKTFMGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTQDEVEALSMIMTWKNS
: * . :. .** :..: *:* *:: . ** ***:*:** * .
.*
****
119
116
94
95
95
95
100
98
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THERMA
DHE_PYRAB
DHE_PYRFU
DHE_THERPR
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
VRRDGPI-FGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM
VMDL-P--FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGTDPQTM
VMNL-P--FGGGKGGVRVDPKKLSRNELERLSRRFFSEIQVIIGPYNDIPAPDVNTNADVM
VMDL-P--YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIM
VMDL-P--YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIM
VVDL-P--YGGGKGGIIVNPKELSEREQERLARAYIRAVYDVIGPWTDIPAPDVYTNPKIM
LAGL-P--YGGGKGGVRVNPKILSPRELELLSRKYFESISDIVGVDQDIPAPDVYTDPQVM
LLLL-P--YGGGKGGVRVDPKKLTREELEQLSRKYIQAIYKYLGSELDIPAPDVNTDSQTM
:
* :**.***: *:** *: * * *:* :
:
:.
******: *:.. *
179
174
152
153
153
153
158
156
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THERMA
DHE_PYRAB
DHE_PYRFU
DHE_THERPR
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
AWVMDAYS--MQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD-IED
AWLMDAYS--MQEGETTPGVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQP-LDE
AWYMDTYS--MNVGHTVLGIVTGKPVELGGSKGREEATGRGVKVCAGLAMDVLGID-PKK
AWMMDEYETIARRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRNEATARGASYTIREAAKVLGWDDLKG
AWMMDEYETISRRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRIEATARGASYTIREAAKVLGWDTLKG
GWMMDEYETIMRRKGPAFGVITGKPLSIGGSLGRGTATAQGAIFTIREAAKALGID-LKG
SWFLDEYN--RVKRGQFFGVVTGKPVELGGLNARIVSTGYGVA-VSTRVAAEKFLGGLEG
AWFLDEYI--KITGKVDFAVFTGKPVELGGIGVRLYSTGLGVATIAKEEAANKFIGGVEE
.* :* *
.:.**** :**
* :.. ..
.
236
231
209
213
213
212
215
214
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THERMA
DHE_PYRAB
DHE_PYRFU
DHE_THERPR
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
TTVAVQGFGSVGAPAARLL-DDYGANVVAVSDVNGAIYDPDGLDTHAIPTHEEEPEAVMT
TTVAVQGYGSVGANAARLL-DKWGATIVAISDVNGAMYEPDGIDTASVPSHDEEPEAVTT
ATVAVQGFGNVGQFAALLISQELGSKVVAVSDSRGGIYNPEGFDVEELIRYKKEHGTVVT
KTIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDYGMKVVAVSDSKGGIYNPDGLNADEVLKWKREHGSVKD
KTIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDFGMKVVAVSDSKGGIYNPDGLNADEVLKWKNEHGSVKD
KKIAVQGYGNAGYYTAKLAKEQLGMTVVAVSDSRGGIYNPDGLDPDEVLKWKREHGSVKD
RTVAVQGYGNVGYYAAKFL-AEMGAKIVAVSDSRGGIYDPEGIDPEEALKVKRSTGTVAN
ARVIIQGFGNVGYYAGKFL-SEMGAKIVGVSDSKGGVINEKGIDVGKAIEIKEKTGSVIN
: :**:*..*
. :
. * .:*.:** .*.: : .*::
... :*
295
290
269
273
273
272
274
273
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THERMA
DHE_PYRAB
DHE_PYRFU
DHE_THERPR
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
HDAPETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAADANFAE
Y-ADTVISNEELLTLDVDVLIPAALGNVITKENAEAIAADLVVEGANGPTTSTADSILAD
YPKGERITNEELLELDVDILVPAALEGAIHAGNAERIKAKAVVEGANGPTTPEADEILSR
FPGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITKKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADEILFE
FPGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITKKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADEILFE
FPGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITEKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADDILRE
YQRGKKISTMEILELPVDILVPAAIEEVITDENADRIKAKIISEGANGPTTTAAEKILVK
YPEGRKVTNEELLISDCDILIPAALENVINKFNAPKVKAKLIVEGANGPLTADADEIMRQ
.
.:. *:*
*:* ***: .:
** : *. : * **** *. *: :
355
349
329
333
333
332
334
333
Susana Díaz González
116
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THERMA
DHE_PYRAB
DHE_PYRFU
DHE_THERPR
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
RGVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES-RDVAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYEN-RGILVVPDILANAGGVTVSYFEWVQDLQSFFWDLDQVRNALEKMMKGAFNDVMKVKEK-KGILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNITGYYWTLEEVREKLDKKMTKAFYDVYNTAKE-KGILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNITGYYWTIEEVRERLDKKMTKAFYDVYNIAKE-KGILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNINGYYWTEEEVREKLDKKMTKAFWEVYNTHKD-KGVLVLPDILANAGGVIMSHIEWVNNRMGGWITDEEALKKLEQKMVENTKTVITYWEKNL
RGIAVVPDILANAGGVVGSYVEWANNKMGEIISDEEAKKLIVDRMNNAFNTLYDYHQK-K
:.: :**:*.***** *:.** ::
:.. . :
*
:
:..
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_THERMA
DHE_PYRAB
DHE_PYRFU
DHE_THERPR
DHE_AEPYR
DHE_SULSO
--RDVPWRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP--RDVTWRDAAYIVALSRIAEAHEARGLWP--YNVDMRTAAYILAIDRVAYATKKRGIYP--KNIHMRDAAYVVAVQRVYQAMLDRGWVKH
--KNIHMRDAAYVVAVQRVYQAMLDRGWVKH
--KNIHMRDAAYVVAVSRVYQAMKDRGWVKK
KPEENSLRDAAYMIAVERVFRAMKLRGWI-KLEDHDLRTAAMALAVDRVVRAMKARGIL-. :
* ** :*:.*: *
**
413
407
387
391
391
390
394
392
441
435
415
420
420
419
423
421
Figura 29: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas de organismos del Dominio Archaea.
HFMED: Haloferax mediterranei; HALSA: Halobacterirum salinarum; THERMA: Themotoga marítima;
PYRAB: Pyrococcus abyssi; PYRFU: Pyrococcus furiosus; THERPR: Thermococcus profundus: AEPYR:
Aeropyrum pernix; SULSO: Sulfolobus solfataricus.
En la Figura 29 se observa que en las GDHs halofílicas existen residuos acídicos (señalados
mediante flechas), que no están no presentes en las GDHs no halofílicas de Archaea. Además se han
sombreado los residuos observados por Syntichaki y col., (1996) como característicos de las glutamato
deshidrogenasas de Archaea. En rojo se señalan los residuos aminoacídicos hidrofóbicos, en azul los
residuos ácidos, en verde los no polares y en magenta los básicos.
Para estimar las distancias evolutivas entre pares de secuencias se empleó el programa
PRODIST, incluido en el paquete PHYLIP (versión 3,5c desarrollada por J. Felsenstein), utilizando el
modelo basado en la matriz de sustitución Dayhoff PAM (Dayhoff, M.O., 1974). La matriz de distancias
obtenida se utilizó para dibujar un árbol con el método "neighbor-joining" en el programa NEIGHBOR. La
confianza estadística se estimó a través del programa SEQBOOT que genera 100 posibles subconjuntos
de alineamientos al azar. El programa CONSENSE permite calcular un árbol consenso de todos los
Susana Díaz González
117
alineamientos. Todos estos programas también están incluidos en el paquete informático PHYLIP. Los
árboles filogenéticos se visualizaron con el programa Treeview 3.2 distribuido por la Universidad de
Glasgow.
Este análisis ha confirmado que las glutamato deshidrogenasas hexaméricas pueden
organizarse en dos familias (Figura 31). En la familia I, se encuentran las secuencias para las GDHs de
Bacteria y Eucarya. En la familia II se engloban GDHs de los tres dominios. La existencia de dos familias
de genes codificando GDHs hexaméricas se ha deducido del alineamiento de las secuencias primarias y
del porcentaje de similaridad entre cada par de proteínas (Benachenhou-Lahfa y col., 1993). La NADGDH de Hfx. mediterranei se encuentra relacionada con la GDH del archaeon halofílico Hbt. salinarum y
con la GDH de la bacteria hipertermofílica T. maritima. El análisis de las secuencias ha confirmado
también la pertenencia de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei a la familia II, encontrándose un péptido
típico de las GDHs englobadas en dicha familia (EGANGPTT) (Benachenhou-Lahfa, 1994). En la GDH
de Bacteriodes fragilis (Abrahams y Abratt, 1998) se han encontrado péptidos que parecen ser
característicos de la familia I y que son: ASVNL, KFLGFEQ y RPEATGF. De la misma forma, en la GDH
de Penicillium chrysogenum (Díez y col., 1999) existen también estas “huellas “ peptídicas que han
llevado a englobarla en la familia I de las GDHs hexaméricas. En la Figura 30 se muestran las regiones
para secuencias de GDHs pertenecientes a las familias I y II representadas en el árbol. En subrayado gris
se muestran los péptidos que son característicos de las GDHs de la familia II y en negro aquellos que se
encuentran en las GDHs englobadas en la familia I.
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
-------------VEQDP-------------FEIAVKQLERAAQYMDISEEALEFLKRPQ
------------MVEQDP-------------YEIVIKQLERAAQYMEISEEALEFLKRPQ
-MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE
MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPK
---SKYVDRVIAEVEKKYADEPEFVQTVEEVLSSLGP--VVDAHPEYEEVALLERMVIPE
MDQTYSLESFLNHVQKRDPNQTEFAQAVREVMTTLWP--FLEQNPKYRQMSLLERLVEPE
------------------MSEPEFQQAYDEVVSSLEDSTLFEQHPKYRKV--LPIVSVPE
34
35
59
56
55
58
40
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
RIVEVSIPVEMDDGSVKVFTGFRVQYNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA
RIVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA
AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE
KVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCA
RVIEFRVPWEDDNGKVHVNTGYRVQFNGAIGPYKGGLRFAPSVNLSIMKFLGFEQAFKDS
RVIQFRVVWVDDRNQIQVNRAWRVQFSSAIGPYKGGMRFHPSVNLSILKFLGFEQTFKNA
RIIQFRVTWENDKGEQEVAQGYRVQYNSAKGPYKGGLRFHPSVNLSILKFLGFEQIFKNS
94
95
119
116
115
118
100
Susana Díaz González
118
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
V-MDLP--YGGGKGGVICNPKEMSDREKERLARGYVRAIYDVISPYTDIPAPDVYTNPQIM
V-MDLP--YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIM
VRRDGPI-FGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM
V-MDLP--FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGTDPQTM
L-TTLP--MGGAKGGSDFDPNGKSDREVMRFCQAFMTELYRHIGPDIDVPAGDLGVGAREI
L-TTLP--MGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGADTDVPAGDIGVGGREV
L-TGLD--MGGGKGGLCVDLKGRSNNEIRRICYAFMRELSRHIGQDTDVPAGDIGVGGREI
152
153
179
174
173
176
158
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
AWMMDEYETISRRKDPSFGVITGKPPSVGGIVARMDATARGASYTVREAAKALGMD----AWMMDEYETISRRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRIEATARGASYTIREAAKVLGWD---TAWVMDAYSMQEGETVP--GVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD----AWLMDAYSMQEGETTP--GVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQP----GYMYGQYRKIVGGFYNG--VLTGKARSFGGSLVRPEATGYGSVYYVEAVMKHEN---DT-GFMAGMMKKLSN-NTAC--VFTGKGLSFGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHG---MG-GYLFGAYRTYKN-SWEG--VLTGKGLNWGGSLIRPEATGYGLVYYTQAMIDYATNGKES--
208
210
233
228
227
229
214
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
LKGKTIAIQGYGNAGYYMAKIMSEEYGMKVVAVSDTKG-----GIYNPDGLNADEVLAWK
LKGKTIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDFGMKVVAVSDSKG-----GIYNPDGLNADEVLKWK
IEDTTVAVQGFGSVGAPAARLL-DDYGANVVAVSDVNG-----AIYDPDGLDTHAIPTHE
LDETTVAVQGYGSVGANAARLL-DKWGATIVAISDVNG-----AMYEPDGIDTASVPSHD
LVGKTVALAGFGNVAWGAAKKL-AELGAKAVTLSGPDG-----YIYDPEGITTEEKINYM
FEGMRVSVSGSGNVAQYAIEKA-MEFGARVITASDSSG-----TVVDESGFT-KEKLARL
FEGKRVTISGSGNVAQFAALKV-IELGGTVVSLSDSKG-----CIISETGIT-SEQVADI
263
265
287
282
281
282
267
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
KKTG--------SVKDFPGATNITNEELLEL-------EVDVLAPSAIEEVITKKNADNI
NEHG--------SVKDFPGATNITNEELLEL-------EVDVLAPAAIEEVITKKNADNI
EEPE--------AVMTHDAPETFSNEELLEL-------DVDVLIPAAVGNVLTAENADDV
EEPE--------AVTTY-ADTVISNEELLTL-------DVDVLIPAALGNVITKENAEAI
LEMRA---SGRNKVQDYADKFG--VQFFPGEKPWG--QKVDIIMPCATQNDVDLEQAKKI
IEIKA---SRDGRVADYAKEFG--LVYLEGQQPWS--LPVDIALPCATQNELDVDAAHQL
SSAKVNFKSLEQIVGEYSTFTENKVQYISGARPWTHVQKVDIALPCATQNEVSGDEAKAL
308
310
332
326
334
335
327
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
KAK---IVAELANGPTTPEADEILYEKG---------ILIIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQ
KAK---IVAEVANGPVTPEADEILFEKG---------ILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQ
QAN---LIVEGANGPTTSAADANFAERG---------VPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQ
AAD---LVVEGANGPTTSTADSILADRD---------VAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQ
VANNVKYYIEVANMPTTNEALRFLMQQ--------PNMVVAPSKAVNAGGVLVSGFEMSQ
IANGVKAVAEGANMPTTIEAT-ELFQQ--------AGVLFAPGKAANAGGVATSGLEMAQ
VAQGVKFVAEGSNMGSTPEAIAVFETARATASTLKESVWYGPPKAANLGGVAVSGLEMAQ
356
358
380
374
386
386
387
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
NITGDYWTVEETRAKLDKKMTKAFWDVYNTHKE--KNINMR----DAAYVVAVSRVYQAM
NITGYYWTIEEVRERLDKKMTKAFYDVYNIAKE--KNIHMR----DAAYVVAVQRVYQAM
DINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES--RDVPWR----DAAYIVALSRIAAAH
DINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYEN--RDVTWR----DAAYIVALSRIAEAH
NSERLSWTAEEVDSKLHQVMTDIHDGSAAAAERYGLGYN----LVAGANIVGFQKIADAM
NAARLGWKAEKVDARLHHIMLDIHHACVEHGGE-GEQTN----YVQGANIAGFVKVADAM
NSQRITWSSERVDQELKKIMVNCFNECIDSAKKYTKEGNALPSLVKGANIASFIKVSDAM
410
412
434
428
442
441
447
DHE_THELI
DHE_PYRFU
DHE_HFMED
DHE_HALSA
DHE_CLOSY
DHE_ECOLI
DHE_YEAST
KDRGWIKK
LDRGWVKH
DARGLWPEARGLWPMAQGIAWLAQGVI-FDQGDVF-
418
420
441
435
449
447
454
Susana Díaz González
119
Figura 30: Alineamiento de GDHs procedentes de organismos de distintas familias representadas en el árbol. PYRFU:
Pyrococcus furiosus; HFMED: Haloferax mediterranei; HALSA: Halobacterium salinarum THELI: Themococcus litoralis; CLOSY:
Clostridium symbiosum; ECOLI: Escherichia coli; YEAST: S. cerevisiae. En verde se muestran las GDHS pertenecientes a la
familia I y en magenta aquellas englobadas en la familia II.
Familia I
Familia II
Figura 31: Árbol filogenético para diversas GDHs.
Susana Díaz González
120
Wierenga y col. (1985) identificaron una secuencia conservada característica para la unión con
el coenzima y que corresponde a un plegamiento βαβ denominado de Rossman (En la Figura 32 se
encuentra señalado en rojo). Este plegamiento probablemente representa un dominio primordial de unión
a dinucleótidos, que se repite en las deshidrogenasas de la glicólisis y en otras enzimas, ya que
descienden de un ancestro común.
En este motivo estructural formado por 26 aminoácidos, se
encuentran tres residuos de glicina conservados con una secuencia Gly-X-Gly-X-X-Gly, al igual que seis
residuos hidrofóbicos conservados que forman un cluster entre las helices α y las hebras β. Para la NADGDH de Hfx. mediterranei este motivo está presente en los residuos Gly243, Gly245 y Gly248, y el cluster
hidrofóbico está formado por los residuos Val239, Val241, Ala252, Leu255, Val263, Val265, estando la
ultima posición ocupada por el Asp267. En la NAD-GDH de Hfx. mediterranei el contenido de hélices α es
del 46,93%, en hebras β es del 37,83% y de plegamiento al azar es del 15,19%.
Susana Díaz González
121
α1
CCGAGGAACGCCACTCGAGTAATGCAGACATCTGAACCTGAAGGGTCGTCCCCTAACACCGCGGAGGCA
M Q T S E P E G S S P N T A E A
48
16
GCGTCTCAGTCCTCGGAGCCGAAGCCAGCGTCGGAGTCGGCGCTCGAAACGGCACGGCGACAGCTCTAC
A S Q S S E P K P A S E S A L E T A R R Q L Y
117
39
CGCGCCGCCGACCACCTCGATATCGACCCAAACGTGGTCGAGCGTCTCAAACACCCGGAAGCAGTCCAC
R A A D H L D I D P N V V E R L K H P E A V H
186
62
GAGGTGACCGTCCCAATCGAGCGCGACGACGGGTCTGTTTCGGTCTACACCGGCTACCGAGCCCAGCAC
E V T V P I E R D D G S V S V Y T G Y R A Q H
255
85
GACAGCGTCCGCGGTCCCTACAAAGGTGGCCTCCGCTATCACCCGGGTGTGACCCGCGATGAGTGCGTC
D S V R G P Y K G G L R Y H P G V T R D E C V
324
108
GGGCTTCGAATGTGGATGACCTGGAAGACCGAAGTGCGCCGCGATGGACCTATCTTCGGCGGCGCGAAA
G L R M W M T W K T E V R R D G P I F G G A K
393
131
GGCGGTATCGCGGTCAACCCGAAGGACCTGACCCTCGACGAGAAAGAACGGCTCACTCGACGGTTCACA
α1
G G I A V N P K D L T L D E K E R L T R R F T
462
154
CAAGAGATTCGAACCATCATCGGGCCGATGAAGGATATCCCGGCACCGGATATGGGGACCGACCCGCAG
Q E I R T I I G P M K D I P A P D M G T D P Q
531
177
ACGATGGCGTGGGTGATGGACGCCTATTCGATGCAGGAAGGCGAGACGGTCCCCGGCGTCGTGACGGGC
T M A W V M D A Y S M Q E G E T V P G V V T G
600
200
AAACCGCCGATTGTCGGTGGGAGCGAAGGCCGTGATACCGCACCCGGTCGCTCGGTTGCCATCATCGCC
K P P I V G G S E G R D T A P G R S V A I I A
669
223
CGCGAAGCCATCGACTACCTCAGTTGGGATATCGAAGACACCACGGTCGCCGTGCAGGGCTTCGGTTCC
R E A I D Y L S W D I E D T T V A V Q G F G S
738
246
GTCGGTGCCCCCGCTGCACGTCTGCTCGATGATTACGGCGCGAATGTCGTCGCCGTCTCCGACGTGAAC
V G A P A A R L L D D Y G A N V V A V S D V N
807
269
GGCGCAATCTACGACCCCGACGGACTGGACACGCACGCAATTCCGACTCACGAAGAAGAACCCGAAGCC
G A I Y D P D G L D T H A I P T H E E E P E A
876
292
GTGATGACGCACGACGCGCCGGAGACGTTTTCGAACGAGGAACTCCTCGAACTCGACGTCGACGTGCTC
V M T H D A P E T F S N E E L L E L D V D V L
945
315
α2
α3
β1
β2
β3
α4
β4
α5
β5
β6
α6
α7
β7
α8
β9
α9
β10
β11
α10
ATCCCGGCGGCGGTCGGCAACGTCTTGACCGCCGAGAACGCCGACGACGTACAGGCGAACCTCATCGTC 1014
I P A A V G N V L T A E N A D D V Q A N L I V
338
β12
α11
GAGGGTGCTAACGGGCCGACGACGAGTGCGGCCGACGCCAACTTCGCCGAGCGTGGGGTTCCGGTCATC 1083
E G A N G P T T S A A D A N F A E R G V P V I
361
α12
α13
CCGGATATTCTCGCCAACGCTGGCGGCGTCACCGTGAGCTACTTCGAGTGGTTGCAGGACATCAACCGG 1152
P D I L A N A G G V T V S Y F E W L Q D I N R
384
α14
CGGACGTGGTCCCTCGAACGCGTCCACGACGAACTCGAAACGGAGATGCTGAACGCGTGGTCGGTCGTC 1221
R T W S L E R V H D E L E T E M L N A W S V V
407
α15
CGCGACGAATACGAGTCGCGCGACGTCCCGTGGCGCGATGCGGCGTACATCGTTGCACTGTCGCGGATT 1290
R D E Y E S R D V P W R D A A Y I V A L S R I
430
GCGGCAGCACACGACGCGCGCGGGCTCTGGCCCTGATTCGTCGGCCTCCGTAGTTCTGCACTCGTCGAC 1323
A A A H D A R G L W P *
441
Figura 32: Predicción de la estructura secundaria de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. En verde se marcan las hélices α y en
amarillo las hebras β. La zona señalada en color rojo muestra el plegamiento de Rossman (βαβ).
Susana Díaz González
122
La determinación de la estructura secundaria se realizó con los programas PSIPREDATOR y
PSIPREP, obteniendo la misma predicción en ambos programas. La estructura secundaria de la NADglutamato deshidrogenasa de Haloferax mediterranei está formada por 15 helices α y 12 hebras β (Figura
32). En la Figura 33 se muestran los residuos implicados en la unión del 2-oxoglutarato: K93, K117, K131,
A169, P170, T199, V371 y S374, y el motivo GGXXGGXXVNPK139 que forma un conformación
extendida, siendo similares a los encontrados en la GDH de P. furiosus. Estos residuos se encuentran
conservados en todas las secuencias comparadas, con la excepción del residuo P170 de la NAD-GDH
estudiada que puede estar sustituido por Gly en algunos casos. Además las GDHs de distintas fuentes
muestran un alto grado de similitud en ciertas secuencias, lo que indicaría que estos residuos estarían
implicados en la función enzimática de la proteína. Mediante comparación con la GDH de Clostridium
symbiosum (Teller y col., 1992), podríamos asignar a los residuos D166, I167, P168, A169, P170 y D171
de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei un papel importante en la estabilización del centro catalítico.
A130
K131
G132
A135
I134
K117
G133
A169
V371
T199
S374
P170
N137
P138
Figura 33: Imagen tridimensional del motivo de unión del 2-oxoglutarato en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei obtenida
mediante el programa Swiss-Pdb Viewer 3.51 de Glaxo Welcome Experimental Research.
Susana Díaz González
123
4.3.7. Construcción del modelo estructural de NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx.
mediterranei.
Se han determinado las estructuras tridimensionales de las glutamato deshidrogenasas de C.
symbiosum (Rice y col., 1987), T. maritima (Knapp y col., 1997), T. litoralis (Sedelnikova y col., 1996) y P.
furiosus (Yip-Kitty y col., 1995). Todas ellas presentan un alto grado de similaridad en las secuencias,
además, las estructuras de las GDHs de C. symbiosum y P. furiosus presentan un alto grado de
homología, sugiriendo que las estructuras 3D están altamente conservadas, pudiendo servir como
modelos para otras glutamato deshidrogenasas hexaméricas.
Los 441 residuos que comprenden la cadena polipeptídica de la subunidad de la NAD-GDH de
Hfx. mediterranei, están organizados en dos dominios claramente diferenciados y separados por una
profunda hendidura (Figura 34). El modelado del monómero se llevó a cabo mediante sustitución atómica
con la GDH de T. marítima.
El Dominio I (color magenta), consiste en una parte del N-terminal de la cadena polipeptídica
(residuos 4 al 205) y los residuos desde el 357 hasta el 438 del extremo C-terminal. El Dominio II (color
amarillo), algo más pequeño, comprende los residuos del 206 al 356, conteniendo el sitio de unión al
coenzima.
Susana Díaz González
124
Figura 34: Modelado molecular para el monómero de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei, realizado con el programa Swiss-Pdb
Viewer 3.51 de Glaxo Welcome Experimental Research. El Dominio I se muestra en color magenta y el Dominio II en amarillo.
4.4. CLONAJE Y EXPRESIÓN DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei.
Una vez secuenciado el gen que codifica la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx.
mediterranei, se amplificó el gen mediante PCR empleando los oligonucleótidos Nad-gdhFOR y NadgdhREV, siguiendo la metodología descrita en el apartado 3.5.1. para llevar a cabo su expresión y
posterior caracterización.
Susana Díaz González
125
4.4.1. Electroforesis en gel de agarosa de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei.
Una vez finalizada la reacción de amplificación del gen se realizó una electroforesis en gel de
agarosa para comprobar que se había amplificado con éxito una única banda del tamaño esperado. La
electroforesis se realizó tal y como se describe en el apartado 3.4.3. de Materiales y Métodos. En la
Figura 35 se observa una única banda que se corresponde en tamaño con el gen de la glutamato
deshidrogenasa.
pb
1
2
3
21226
5148
4268
3530
2027
1904
1584
1375
1323 pb
831
564
Figura 35: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la PCR de amplificación.
Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas)
Calle 2: Banda correspondiente al gen de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei
Calle 3: Control de amplificación sin DNA
Se recortó la banda del gel y se purificó para realizar su secuenciación tal y como se describe en
el apartado 3.4.5. Comparando con la secuencia original obtenida a partir del fago, se comprobó que el
fragmento amplificado se correspondía totalmente con el gen de la NAD-GDH y que éste no había sufrido
ninguna mutación.
Susana Díaz González
126
Una vez realizada la ligación de la banda correspondiente al gen de la NAD-GDH en el vector
pCR2.1 (apdo. 3.5.3), se llevó a cabo la transformación en E. coli NovaBlue con la reacción de ligación
(apdo. 3.5.4.2), obteniéndose colonias blancas correspondientes a plásmido con inserto y colonias
azules, plásmidos que no llevaban inserto. Se seleccionaron 11 colonias blancas y se aisló el DNA
plasmídico tal y como se describe en el apartado 3.5.5. de Materiales y Métodos.
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa (Figura 36) comprobándose que se habían
obtenido plásmidos con inserto.
pb
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
21226
5148
4268
3530
2027
1904
1584
1375
831
564
Figura 36: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados del vector pCR2.1
Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas)
Calles 2- 12: Plásmidos aislados 1-11
Susana Díaz González
127
4.4.2. Digestión mediante las enzimas de restricción NdeI y BamHI.
Se seleccionó el plásmido que se observa en la calle 2 (Figura 37), puesto que era el que tenía
mayor concentración y se secuenció, comprobando que el gen se encontraba completo y sin ninguna
modificación. A este plásmido se le llamó p1-pCR2.1.
El plásmido p1-pCR2.1. y el vector de expresión pET3a se digirieron con las enzimas de
restricción NdeI y BamHI siguiendo la metodología descrita en el apartado 3.5.7. En la Figura 37 se
muestra una electroforesis en gel de agarosa en la que se observan dos bandas en la calle 2. La más alta
es el plásmido pCR2.1 linealizado y la banda inferior se corresponde con el gen de la NAD-GDH.
1
pb
2
3
4
21226
5148
4268
3530
2027
1904
1584
1375
Figura 37: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la digestión con NdeI y BamHI
Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas)
Calle 2: Plásmido p1-pCR2.1 digerido
Calle 3: pET3a lineal
Calle 4: Plásmido p1-pCR2.1 sin digerir
Susana Díaz González
128
4.4.3.
Ligación
en
el
vector
de
expresión
pET3a
y
transformación
en
células
E. coli NovaBlue.
Una vez recortada y purificada la banda inferior, que se observa en la calle 2 de la Figura 37
(gen de la NAD-GDH), se llevó a cabo la reacción de ligación en el vector de expresión linealizado pET3a
(calle 3 de la Figura 37). Se realizó una nueva transformación en células E. coli NovaBlue siguiendo la
metodología indicada en el apartado 3.5.4.2. La razón de ésta transformación es el aislamiento,
secuenciación y conservación del gen de la NAD-GDH en el plásmido de expresión, para futuros
ensayos. Además la transformación con un plásmido purificado permite obtener todos los transformantes
positivos. Los plásmidos aislados se muestran en la Figura 38.
La eficiencia de transformación para este ensayo fue aproximadamente del 66%, obteniendo 10
plásmidos con inserto de los 15 totales aislados. En la Figura 38 se muestran los plásmidos aislados,
observando que se habían obtenido plásmidos con inserto (calles 2, 4, 5, 6, 9, 11, 13, 14, 15 y 16)
pb 1 2
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
21226
5148
4268
3530
2027
1904
1584
1375
Figura 38: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados del vector de expresión pET3a + NAD-GDH.
Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas)
Calles 2, 4, 5, 6, 9, 11, 13, 14, 15 y 16: plásmidos pET3a con inserto (NAD-GDH)
Calles 3, 7, 8, 10 y 12: plásmidos circulares pET3a sin inserto.
Susana Díaz González
129
4.4.4. Transformación en E. coli BL21 (DE3).
Se seleccionó el plásmido de la calle 6 (Figura 38) al que se le llamó p6-pET3a. Se realizó la
transformación con dicho plásmido en células E. coli BL21 (DE3), siguiendo la metodología descrita en
los apartados 3.5.4. y 3.5.11.2. En este ensayo se obtuvieron un gran número de transformantes. Todos
los transformantes contenían el vector de expresión con el inserto.
4.4.5. Obtención de fracciones celulares y localización de la proteína.
Tras crecer en medio líquido, una colonia seleccionada al azar, hasta una DO600 entre 0,5 y 1, se
tomó una alícuota para realizar el test de estabilidad del plásmido como se describe en el apartado 3.6.2.
En nuestro ensayo con el plásmido pET3a-NAD-GDH, todas las células crecieron en ausencia de aditivos
y en presencia de ampicilina, no creciendo colonias en presencia de IPTG, lo que nos llevaba a la
conclusión de que el plásmido a expresar era estable.
Se realizó una etapa de inducción con IPTG, incubando el cultivo durante 3 horas. Finalizada la
inducción se realizó la obtención de las distintas fracciones celulares:
-
Fracción celular total
-
Fracción citoplasmática soluble
-
Fracción citoplasmática insoluble
Para localizar la fracción de expresión de la NAD-GDH recombinante se realizó una
electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE), como se describe el apartado
3.1.9. de Materiales y Métodos. En el gel se cargaron parte de cada una de las fracciones. En la Figura
39 se observan bandas muy intensas en la fracciones correspondientes a las proteínas totales y fracción
insoluble inducida con IPTG; y además, también aparece banda de expresión en las mismas fracciones
sin inducir. Esto puede ser debido a que el escape desde el promotor de este tipo de vectores es muy alto
por lo que el IPTG no actuaría como regulador de la transcripción.
Susana Díaz González
130
KDa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
116,0
66,2
45,0
35,0
25,0
18,5
Figura 39: Expresión de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei en E. coli. Las fracciones obtenidas se muestran en las calles
siguientes:
Calle 1: Marcadores de peso molecular (Fermentas)
Calles 2, 3 y 4: Fracciones celulares de E. coli BL21 (DE3) que contienen el plásmido control pET3a.
Calles 5, 6 y 7: Fracciones inducidas con IPTG, proteínas totales, fracción soluble e insoluble respectivamente.
Calles 8, 9 y 10: Fracciones sin inducir, proteínas totales, fracción soluble e insoluble respectivamente.
Las bandas de expresión obtenidas se corresponden en tamaño con la NAD-GDH de Hfx.
mediterranei. La conclusión que se extrae del ensayo es que la proteína expresada se obtiene en forma
de cuerpos de inclusión induciendo y sin inducir con IPTG.
Susana Díaz González
131
4.5. SOLUBILIZACIÓN DE LOS CUERPOS DE INCLUSIÓN,
RENATURALIZACIÓN Y
PURIFICACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.
La formación de cuerpos de inclusión es independiente del huésped empleado para expresar la
proteína, puesto que se han obtenido incluso en la expresión homóloga. No existe tampoco una relación
directa entre las características intrínsecas de las proteínas y la formación de los cuerpos de inclusión.
Uno de los casos en el que sí se ha encontrado una cierta relación ha sido en las proteínas que forman
puentes disulfuro en su estructura. Como consecuencia de la elevada expresión, la concentración de la
proteína se ve incrementada y este hecho parece ser la causa de la agregación de la proteína en forma
de cuerpos de inclusión. En condiciones óptimas la proteína expresada y acumulada en forma de cuerpos
de inclusión, puede llegar a suponer un 50% del total de las proteínas celulares. La gran mayoría de esos
cuerpos de inclusión estarán constituidos exclusivamente por la proteína recombinante. Si la proteína
expresada se encuentra en forma de cuerpos de inclusión se obtendrá mejor purificación de la proteína
expresada, ésta se encontrará también protegida frente al ataque de proteasas presentes en el
citoplasma. Los cuerpos de inclusión tienen el inconveniente de que para conseguir la proteína en forma
activa se hace necesario un paso previo de solubilización (Lilie y col., 1998).
4.5.1. Solubilización de los cuerpos de inclusión.
Como se ha comentado anteriormente, se hace necesaria la solubilización de los cuerpos de
inclusión. Para ello, se utilizan agentes caotrópicos y detergentes en los que se desnaturalizan las
proteínas. El grado de desnaturalización depende de las proteínas y del agente desnaturalizante utilizado
(Tsumoto y col., 2003). Durante el proceso de solubilización se añade un agente reductor como el DTT
para mantener los residuos de cisteína en un estado reducido y prevenir la formación no nativa de
puentes disulfuro.
Susana Díaz González
132
En nuestro caso se consiguió la solubilización total de los cuerpos de inclusión con los
siguientes tampones:
-
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM.
-
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo cloruro de guanidinio 6 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM.
De los dos tampones empleados, se consiguieron resultados óptimos de renaturalización cuando
se empleó urea en el tampón de solubilización. Con cloruro de guanidinio se conseguía la solubilización
de los cuerpos de inclusión pero no la renaturalización posterior de la proteína recombinante, no
observándose en ningún caso actividad significativa.
4.5.2. Renaturalización de la NAD-GDH recombinante.
El objetivo de la renaturalización preparativa de proteínas es obtener proteína plegada a partir de
cuerpos de inclusión de una forma rápida y utilizando procedimientos sencillos y fácilmente
automatizables (Middelberg, 2002). Los métodos que se utilizan para renaturalizar la proteína
desnaturalizada se basan en eliminar del medio las altas concentraciones de agentes desnaturalizantes y
reductores empleados en la solubilización, creando así un medio idóneo para que las proteínas se
plieguen de manera casi espontánea. Entre estos métodos están: dilución, diálisis, filtración en gel y la
inmovilización en un soporte sólido (Clark, 2001; Li y col., 2004). En la diálisis, el agente desnaturalizante
se va eliminando gradualmente, pero algunas proteínas a concentraciones intermedias de agente
desnaturalizante tienden a formar estructuras intermedias, irreversibles e inactivas que forman agregados
mediante interacciones hidrofóbicas. En estos casos, es mejor llevar a cabo una dilución rápida en la que
la concentración del agente desnaturalizante disminuye rápidamente, evitando la tendencia de la proteína
a agregarse. La dilución es el método más utilizado en estudios de plegamiento de proteínas a pequeña
escala. En él se diluye la proteína solubilizada directamente en un tampón de renaturalización. Lo más
importante es controlar la cantidad de proteína adicionada en el tampón, con la finalidad de mantener una
concentración baja de proteína desnaturalizada y evitar la agregación (Hevehan y col., 1997). En general,
la concentración de proteína óptima para evitar la formación de agregados se encuentra entre 10 y 50
Susana Díaz González
133
μg/mL. De cualquier forma las condiciones de renaturalización dependen de cada proteína y deben
optimizarse en cada caso, teniendo en cuenta parámetros externos como la fuerza iónica, el pH, la
temperatura y el tiempo de renaturalización (De Bernardez y col., 1999; De Bernardez, 2001).
Una forma de minimizar las interacciones intermoleculares que provocan la agregación durante
el proceso de renaturalización es el mantenimiento de la proteína solubilizada inmovilizada, unida a una
matriz. Para poder utilizar éste método, la proteína ha de estar fusionada con un péptido de unión a la
matriz, como puede ser una cola de histidinas o que la proteína posea un dominio de unión a la celulosa
(De Bernandez-Clark y col., 1998). Cuando la proteína solubilizada queda unida a la columna, ésta se
equilibra con tampón de renaturalización y la proteína plegada se eluye de la columna. La proteínas en
general pueden ser adsorbidas en columnas de intercambio iónico a baja fuerza iónica y adecuado pH en
presencia de elevadas concentraciones de urea (Li y col., 2004).
Para evitar la reagregación de proteínas durante el proceso de plegamiento se utiliza la adición
de moléculas de bajo peso molecular que inhiben la formación de interacciones moleculares. Estas
pequeñas moléculas son relativamente fáciles de eliminar una vez que la proteína se encuentra plegada.
Los aditivos más comunes son la L-arginina en concentraciones de 0,4 a 1 M, (Arakawa y col., 2003),
pequeñas concentraciones de agentes desnaturalizantes como la urea en concentraciones de 1 a 2 M o
el cloruro de guanidinio (0,5 a 1,5 M) y detergentes (Chaps, SDS, CTAB y tritón X-100). También se
utilizan cofactores específicos como el Zn2+ o el Ca2+ que estabilizan proteínas y previenen la agregación
(Carrió, 2002). Se ha visto además que éste último (Ca2+) participa en el plegamiento de algunas
proteínas (Smeller, y col., 2004).
Por el contrario se ha comprobado que la agregación puede aprovecharse para el plegamiento
de algunas proteínas hipertermofílicas de Archaea, en las que el plegamiento a partir de cuerpos de
inclusión se puede realizar sin llevar a cabo una desnaturalización completa, adicionando para su
solubilización cloruro de guanidinio 2 M y eliminándolo posteriormente mediante diálisis Este estudio se
ha realizado basándose en las propiedades estructurales de los agregados proteicos (Umetsu y col.,
2004).
Susana Díaz González
134
En el caso de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante, la renaturalización se llevó a
cabo mediante dilución y diálisis, siguiéndose el proceso espectrofotometricamente mediante la medida
de la actividad enzimática.
4.5.3. Renaturalización mediante diálisis.
Tras la diálisis de los cuerpos de inclusión solubilizados frente a Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0,
conteniendo 3,25 mM EDTA y 4 M NaCl al igual que en el tampón Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, conteniendo
3,25 mM EDTA y 4 M NaCl no se consiguió ningún efecto apreciable en la renaturalización de la proteína.
Debido a ésto, se descartó la renaturalización mediante diálisis.
4.5.4. Renaturalización mediante dilución.
Los primeros ensayos de renaturalización de la proteína expresada se realizaron con cuerpos de
inclusión solubilizados en presencia de urea, mediante dilución rápida (1:20) con distintas composiciones
de tampones.
4.5.5. Efecto de la composición del tampón en el proceso de renaturalización mediante dilución
rápida.
La sustancia tamponante, empleada en la preparación de los tampones utilizados, puede ser
importante en el proceso de renaturalización de la enzima puesto que su presencia puede suponer
interacciones favorables o desfavorables a la hora de realizar la correcta renaturalización de la proteína.
Para estudiar el efecto de la sustancia tamponante en la renaturalización de la NAD-GDH se
ensayaron tampones comúnmente utilizados en el estudio de enzimas halofílicas tales como: tampón
fosfato, Tris-HCl y Gly-NaOH, tampón óptimo este último para la medida de actividad de la NAD-GDH de
Hbt. salinarum (Bonete y col., 1986).
Susana Díaz González
135
Como se observa en la Figura 40 el tampón más efectivo en el proceso de renaturalización fue el
preparado con glicina. Este resultado puede estar relacionado con el efecto activador que los
aminoácidos ejercen sobre algunas glutamato deshidrogenasas como la NAD-GDH de Hbt. salinarum
(Bonete y col., 1986; Pérez-Pomares y col., 1999) y con las especiales características de la glicina, ya
que es el aminoácido más sencillo lo que podría permitir una más fácil interacción con la proteína en
plegamiento. La adición de glicina puede perturbar las fuerzas cohesivas del agua (enlaces de hidrógeno)
y por lo tanto, su tensión superficial, como ocurre con la mayoría de sales inorgánicas.
El segundo tampón en efectividad fue el fosfato, que dado el carácter halofílico de la enzima,
puede estar influyendo en la estabilización de la estructura de la misma. Como ya se ha comentado, es
sabido que las enzimas halofílicas requieren altas concentraciones salinas para su actividad y estabilidad
y poseen respuestas muy variadas para las diferentes sales. El fosfato tendría un efecto estabilizador
debido a su capacidad para producir un efecto salting-out (Ugwu y Apte, 2004). Este efecto puede
ponerse de manifiesto a pesar de que su concentración, 100 mM, es muy inferior a la de NaCl o KCl (4
M).
El tampón menos efectivo ensayado fue Tris-HCl, posiblemente debido a la carencia de los
efectos que glicina o fosfato pueden ejercer sobre la enzima.
Susana Díaz González
136
0,40
0,35
Actividad U/mL
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
Gly-NaOH 0,1M
0,05
Fosfato 0,1M
Tris-HCl 0,1M
0,00
0
10
20
30
40
Tiempo (horas)
Figura 40: Efecto del tipo de tampón usado en la disolución de renaturalización. En todos los casos la concentración de cada
sustancia fue de 100 mM. Se estudió el efecto de la Gly-NaOH (z), del fosfato (▲) y del Tris-HCl („). La concentración de
NaCl fue de 4 M conteneniendo EDTA 3,25 mM.
Susana Díaz González
137
4.5.6. Efecto de las sales y el EDTA en el proceso de renaturalización.
Puesto que se trata de una enzima halofílica, la concentración y tipo de sal presente en la
disolución está estrechamente ligada al mantenimiento de su estructura. El plegamiento correcto de la
enzima dependerá en su mayor parte de estos factores. Danson y Hough (1997), explicaron el efecto
estabilizador de la sal sobre las proteínas halofílicas en base a la tensión superficial existente en la
interfase entre la superficie de la proteína y el agua. El área superficial de la proteína desnaturalizada es
mayor que la del estado plegado y por lo tanto éste aumento de la tensión superficial del agua producido
por la sal favorece la formación de la proteína nativa compacta. Conforme aumenta la concentración de
sal, la tensión superficial del agua aumenta y la proteína se agrega para reducir la accesibilidad del
disolvente al área superficial, pudiendo llegar incluso a la precipitación. Sin embargo, la superficie de la
proteína está cargada y los grupos polares actúan atrayendo los iones salinos, contrarrestando la
exclusión preferencial de la sal o aditivo. Por lo tanto, el efecto neto de la sal en la estructura de la
proteína es un balance entre estos dos efectos y variará con la naturaleza del catión y del anión. El NaCl
y el KCl son ambos agentes “salting-out” por lo tanto, el problema de una proteína halofílica en
concentraciones extremas de sal es atraer las moléculas de agua a su superficie, probablemente en
forma de iones hidratados. Al mismo tiempo debe reducir su hidrofobicidad superficial para contrarrestar
la tendencia a precipitar a estos niveles de soluto (Danson y Hough, 1997). Por ejemplo, en la estructura
de la glucosa deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, resuelta a 1,5 Å de resolución se ha identificado un
átomo de K+, de los 5 encontrados, que tiene como ligandos moléculas de agua de la primera esfera de
hidratación (Esclapez, 2004).
4.5.6.1. Efecto del tipo de sal.
Para estudiar el efecto del tipo de sal, se han escogido el NaCl, principal componente en el
medio externo y KCl, soluto compatible que le permite mantener el equilibrio osmótico. En ambos casos,
se realizó el estudio a 4 M de sal. Una vez solubilizados los cuerpos de inclusión y disueltos 1:20 en el
tampón Gly-NaOH 100 mM pH, 8,5, conteniendo EDTA 3,25 mM, NaCl ó KCl 4 M se determinó su
actividad durante un periodo de tiempo de aproximadamente 100 horas. En ambos casos se obtuvo un
Susana Díaz González
138
incremento de la actividad de forma hiperbólica, con un rápido aumento de la actividad en las primeras 20
horas como se observa en la Figura 41. El proceso de renaturalización, seguido mediante medida de
actividad, fue a todos los tiempos ensayados superior en presencia de NaCl que con KCl.
Un hecho similar se observa en otras enzimas halofílicas como la glucosa deshidrogenasa de
Hfx. mediterranei (Pire y col., 2001) y la isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii (Camacho, y col.,
2002).
0,50
Actividad U/mL
0,40
0,30
0,20
0,10
4M NaCl
4M KCl
0,00
0,0
20,0
40,0
100,0
tiempo (horas)
Susana Díaz González
139
Figura 41: Renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa en presencia de NaCl y KCl. Los cuerpos de inclusión
solubilizados se diluyeron en tampón Gly-NaOH 100 mM, pH 8,5, conteniendo EDTA 3,25 mM y 4 M NaCl (z) y 4 M de KCl („).
La renaturalización se monitorizó mediante la medida de actividad a distintos tiempos.
Susana Díaz González
140
4.5.6.2. Efecto de la concentración de sal.
Para determinar la concentración de sal óptima en el proceso de renaturalización, se ensayaron
diferentes concentraciones de NaCl tal y como se describe en el apartado 3.7.4. de Materiales y Métodos.
Para concentraciones de NaCl de 2 y 3 M (Figura 42), se observó un 12,5% de la actividad que se
obtiene a una concentración de sal de 4 M, indicando una menor efectividad en el proceso de
renaturalización. Para 1 M de NaCl no se obtuvo una renaturalización apreciable de la enzima. Estos
resultados pondrían de manifiesto la importancia de la concentación de sal que estaría en relación con el
carácter halofílico de la enzima y la estrecha relación existente entre la estructura o su estabilidad y la sal
presente en el medio. Es de destacar que la NAD-GDH de Hfx. mediterranei también presenta una
actividad óptima a 4 M de sal. En otras enzimas halofílicas como la glucosa deshidrogenasa, la
renaturalización se obtuvo a concentraciones más bajas del órden de 2 M de NaCl (Esclapez, 2004).
Susana Díaz González
141
0,50
4M NaCl
3M NaCl
2M NaCl
Actividad U/mL
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0
10
20
30
40
Tiempo (horas)
Figura 42: Efecto de la concentración de sales en la renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa. La renaturalización
se llevó a cabo en tampón Gly-NaOH 0,1 M, pH 8,5, EDTA 3,25 mM y distintas concentraciones de NaCl: 4 M NaCl (z), 3 M de
NaCl (▲) y 2 M de NaCl („). Una vez diluida la proteína, se siguió su actividad con el tiempo.
4.5.6.3. Efecto del EDTA en el proceso de renaturalización.
Se estudió el efecto del EDTA en el proceso de renaturalización de la NAD-GDH recombinante.
El EDTA actúa como agente quelante de cationes divalentes, utilizándose de forma habitual en los
tampones de renaturalización actuando posiblemente ayudando a la estabilización de la enzima
(Esclapez, 2004).
Susana Díaz González
142
En la Figura 43 se observa que la presencia del agente quelante EDTA en el tampón de
renaturalización ejerce un efecto apreciable en la renaturalización óptima de la enzima de forma que la
adición de 3,25 mM en el tampón supone un aumento en la actividad del 37% a las 30 horas de haber
iniciado el proceso.
En muchos casos la presencia de metales interviene en la renaturalización de la enzima, bien
positivamente en enzimas que requieren metales, o en otros casos negativamente interferiendo en el
proceso de renaturalización (Britton y col., 2003). En nuestro caso, la presencia de EDTA estaría
acomplejando posibles metales traza presentes en la muestra y eliminando así su posible interferencia en
el proceso de renaturalización.
0,50
Actividad U/mL
0,40
0,30
0,20
0,10
Gly-NaOH 0,1 M NaCl 4M EDTA 3,25 mM
Gly-NaOH 0,1M NaCl 4M
0,00
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
tiempo (horas)
Figura 43: Renaturalización de la NAD-GDH en presencia/ausencia de EDTA. En presencia de 3,25 mM de EDTA (z) y en
ausencia de EDTA („).
Susana Díaz González
143
4.5.7. Purificación de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante.
La enzima recombinante se consiguió purificar a homogeneidad en dos etapas cromatográficas
como se describe en el apartado 3.8.1. de Materiales y Métodos.
4.5.7.1. Precipitación en presencia de sulfato amónico.
Las características de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei permitieron llevar a cabo una
precipitación en presencia de sulfato de amonio 2,5 M como primer paso de purificación. Durante esta
etapa, la mayoría de proteínas de
E. coli precipitan, quedándose en disolución la NAD-GDH. Esta
purificación se siguió mediante medida de actividad enzimática en el sobrenadante y en el precipitado, no
encontrándose pérdidas apreciables en el precipitado (Tabla V). Este paso de purificación se emplea con
éxito en la purificación de enzimas recombinantes a partir de cuerpos de inclusión (Pire y col., 2001) ya
que permite aprovechar las diferencias entre enzimas halofílicas y proteínas no halofílicas contaminantes
del huésped mesofílico empleado en la transformación en las células de expresión E. coli BL21 (DE3).
Tabla V:
Etapas de purificación para la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante de Hfx.
mediterranei.
Cuerpos
Activ.
Vol
(U/mL)
(mL)
0,33
50
U totales
[Prot]
Activ. Espec.
Factor
Rendimiento
(mg/mL)
(U/mg)
16,5
0,05
6,6
1
100
Inclusión
Precipitación
Sobrenad.
0,32
50
16
0,05
6,4
1,1
97
Precipitación
Pellet
0,06
10
0,06
0,01
6
--
--
2,5
5
12,5
0,03
83
12,5
76
DEAE
Susana Díaz González
144
4.5.7.2. Cromatografía DEAE-celulosa.
El siguiente paso de purificación consistió en una cromatografía en DEAE-celulosa en presencia
de sulfato de amonio. La DEAE-celulosa es una resina intercambiadora de aniones pero en este caso, a
causa de la elevada concentración de sales tanto de la muestra como del tampón de equilibrado de la
columna, las fuerzas electrostáticas responsables de la separación son parciales o nulas. En estas
condiciones la DEAE-celulosa presenta un comportamiento hidrofóbico quedando la proteína halofílica
absorbida en la resina de la que se eluye en presencia de oncentraciones adecuadas de NaCl (Pire y col.,
2001). La cromatografía se realizó de acuerdo al protocolo descrito en el apartado 3.8.2. Este paso de
purificación, además de conseguir la purificación a homogeneidad de la muestra, permitió su
concentración (Tabla V) obteniéndose una muestra en condiciones óptimas para su posterior
caracterización. La purificación se siguió mediante electroforesis en presencia de SDS tal y como se
describe en el apartado 3.1.9. de Materiales y Métodos. El gel de electroforesis se muestra en la Figura
44, en la que se observa, cada una de las etapas de purificación.
kDa
1
2
3
4
5
6
116,0
66,2
45,0
35,0
25,0
18,4
Figura 44: Purificación de la NAD-GDH recombinante.
Calle 1 y 6: Patrones de peso molecular conocido (Fermentas rango medio).
Calle 2: Cuerpos de inclusión solubilizados
Calle 3: NAD-GDH recombinante purificada mediante DEAE
Calle 4: Precipitación con sulfato amónico
Calle 5: NAD-GDH nativa
Susana Díaz González
145
4.6. CARACTERIZACIÓN DE NAD-GDH NATIVA Y RECOMBINANTE.
4.6.1. Determinación de la Mr de la NAD-glutamato deshidrogenasa mediante tamizado molecular.
Se determinó la masa molecular de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante
mediante una cromatografía de filtración en gel (Sephacryl-S300). Previamente la columna se equilibró
con una serie de patrones, calculándose a partir de sus volúmenes de elución los coeficientes de partición
Kav tal y como se indica en el apdo. 3.1.10.1 de Materiales y Métodos. La representación del logMr para
cada una de las proteínas patrón frente a la Kav dio como resultado una recta (Figura 45). A partir del
ajuste de los datos a la recta correspondiente, se obtuvo la ecuación:
LogMr= -4,17 Kav + 3,44
A partir de la ecuación anterior se obtuvieron los valores de Mr para la enzima nativa y
recombinante. En el caso de la NAD-GDH nativa la Mr calculada fue de 310 ± 40 kDa, valor idéntico
dentro del margen de error, al determinado para la NAD-GDH recombinante que fue de 290 ± 38 kDa.
Susana Díaz González
146
4,0
log Mr
3,0
2,0
1,0
0,0
recombinante
nativa
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
Kav
Figura 45: Determinación de la masa molecular de la NAD-Glutamato deshidrogenasa nativa („) y recombinante (▲) mediante
tamizado molecular en Sephacryl S300. Los patrones (z) utilizados para el calibrado de la columna fueron: ferritina (425 kDa),
catalasa (240 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina (68 kDa) y citocromo c (12,5 kDa).
4.6.2. Determinación del tamaño de subunidad.
Mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS (SDS-PAGE), se
determinó la Mr de la subunidad de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa. Como se observa en la
Figura 46, aparece una única banda electroforética para la NAD-GDH nativa indicando que se logró la
purificación de la enzima a homogeneidad. Se realizó la determinación del tamaño de subunidad a partir
de la ecuación que relaciona el logMr, para los patrones de masa molecular conocida, con la movilidad
relativa (Rf) calculada para cada proteína patrón:
LogMr= -0,972 Rf + 2,02
Susana Díaz González
147
A partir de la ecuación anterior se obtuvo el valor de Mr para la subunidad de la enzima, que fue
de 54 ± 4 kDa.
kDa
1
2
3
116,0
66,2
45,0
35,0
25,0
18,4
Figura 46: Gel de electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS (SDS-page).
Calle 1: patrones de Mr conocida (Fermentas rango medio).
Calle 2: NAD-GDH nativa purificada.
Calle 3: cuerpos de inclusión solubilizados de la NAD-GDH recombinante.
Como se observa en la Figura 46, (calles 2 y 3), la distancia electroforética es la misma para la
enzima nativa purificada que para la enzima recombinante obtenida en forma de cuerpos de inclusión.
Susana Díaz González
148
3,0
2,5
log Mr
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Rf
Figura 47: Determinación de la masa molecular de la subunidad de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante
(z) mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Los patrones (z) utilizados fueron: β-galactosidasa
(116 kDa), BSA (66,2 kDa), Ovoalbúmina (45 kDa), Lactato deshidrogenasa (35 kDa), Endonucleasa de restricción (25 kDa), βlactoglobulina (18,4 kDa).
Del análisis del gel anterior, se desprende que la movilidad electroforética relativa (Rf) de la
NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante, es exactamente la misma. Esto nos permite
confirmar que sus masas moleculares de subunidad son coincidentes. La Mr para la enzima
Susana Díaz González
149
recombinante calculada a partir de la secuencia conocida es de 47,959 kDa, valor que es inferior al
calculado a partir de su movilidad electroforética. Esta aparente discrepancia entre el valor real de Mr de
la subunidad, estimada mediante SDS-PAGE, respecto de su valor real es un hecho que se observa
frecuentemente en proteínas de origen halofílico, debido a su elevada carga
negativa intrínseca
(Camacho y col., 1995., Bonete y col., 1996, Hayden y col., 2002). La interacción entre la proteína
halofílica con esta elevada carga neta negativa y el detergente aniónico SDS, supone un aumento del
tamaño del complejo proteína-SDS, lo que se traduce en una menor movilidad electroforética relativa
(Bonete y col., 1996).
El valor real de Mr de la subunidad (47,959 kDa) es idéntico al observado en un gran número de
glutamato deshidrogenasas de otras fuentes, contenidas en la Tabla VI, que presentan valores entre 45 y
48 kDa.
Susana Díaz González
150
Tabla VI: Comparación de masas moleculares de glutamato deshidrogenasas de diversas fuentes.
Fuente
Halobacterium salinarum
(Bonete y col., 1986)
Halobacterium salinarum
(Bonete y col., 1987)
Sulfolobus
solfataricus
(Maras y col., 1992)
Archaeon ES4
(DiRuggiero y col., 1993)
Thermococcus
litoralis
(Kesen y col., 1994)
Pyrococcus
furiosus
(Consalvi y col., 1991)
Clostridium
symbiosum
(Syed y col., 1990)
Bacillus
acidocaldarius
(Consalvi y col., 1994
Thermus thermophilus
(Ruiz y col., 1998)
Pyrococus horikoshii
(Wang y col., 2003)
Symbiobacterium toebii
(Ha y col., 2003)
Thermococcus
kodakaraensis (Izumikawa
y col., 2004)
coenzima
Subunidades
----
Mr (kDa)
subunidad
----
Mr (kDa)
de la proteína
148 kDa
NAD
NADP
----
----
215 kDa
NAD(P)
6
46 kDa
266 kDa
NADP
6
46 kDa
270 kDa
NADP
6
45 kDa
270-350 kDa
NAD(P)
6
48 kDa
290 kDa
NAD
6
48 kDa
280 kDa
NAD
6
48 kDa
280 kDa
NAD
6
49 kDa
289 kDa
NAD(P)
6
48 kDa
290 kDa
NAD(P)
6
44 kDa
263 kDa
NADP
6
47 kDa
280 kDa
De acuerdo con los valores de masa molecular de la subunidad y la masa molecular de la
proteína, se puede concluir que la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei nativa y
recombinante es un homohexámero. Puesto que los resultados de la determinación de la masa molecular
en ambos casos indican el mismo número de subunidades, la proteína nativa y la recombinante
poseerían en principio la misma estructura cuaternaria, lo que nos confirma que la enzima recombinante
se encuentra renaturalizada óptimamente.
Susana Díaz González
151
Como se observa en la Tabla VI existen numerosas glutamato deshidrogenasas NADdependientes cuya estructura se corresponde con un hexámero con tamaños comprendidos entre 270 y
289 kDa, valores muy cercanos al de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei con un valor calculado a partir del
tamaño de subunidad de 287,754 kDa. Este parecido estaría relacionado con la elevada homología
existente en la familia de NAD-GDH hexaméricas. Como también se puede apreciar en la Tabla VI, este
parecido se mantiene en la mayoría de las GDHs a pesar de la variedad de los organismos estudiados.
4.6.3. Efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática.
Una vez purificada la NAD-GDH nativa según se describe anteriormente, se determinó la
actividad enzimática a distintas concentraciones de NaCl y KCl en un rango de 0,5 M a 4 M. Los
resultados son los que se muestran en la Figura 48.
Se observó un aumento en la actividad de la enzima nativa a medida que se incrementaba la
concentración de sal, siendo ésta máxima a 4 M de NaCl y 4 M de KCl, siendo las concentraciones más
altas ensayadas. Se observa una mayor actividad con KCl (Figura 48A). La diferencia de actividad
obtenida con ambas sales no fue significativa. Puesto que la sal presente en el medio intracelular es KCl,
no es de extrañar que la enzima muestre más actividad con esta sal ya que, in vivo, es la que se encarga
de estabilizar la enzima.
Igualmente, una vez purificada la NAD-GDH recombinante, se procedió a determinar su
comportamiento ante la concentración de sal, obteniéndose los resultados que se muestran en la Figura
48B. Como se puede observar, también en éste caso se obtuvo un aumento de actividad al incrementar la
concentración de sal con una mayor actividad a 4 M, la máxima concentración ensayada tanto para NaCl
como para KCl. La actividad obtenida con KCl también fue en éste caso, fue ligeramente superior a la
obtenida con NaCl (Figura 48B).
Susana Díaz González
152
Actividad U/mL
0,8
0,6 A
0,4
NaCl
0,2
0,0
KCl
0
1
2
3
4
5
Concentración sal (M)
Actividad U/mL
0,8
0,6
0,4
B
0,2
NaCl
KCl
0,0
0
1
2
3
4
5
Concentración sal (M)
Figura 48: Efecto de la concentración de NaCl (z) y de la concentración de KCl („) en la actividad de la NAD-glutamato
deshidrogenasa nativa (Gráfica A) y en la enzima recombinante (Gráfica B) de Hfx. mediterranei medida en tampón Gly-NaOH
0,1 M, pH 8.0.
Susana Díaz González
153
La NAD-glutamato deshidrogenasa tanto nativa como recombinante, presenta un
comportamiento típicamente halofílico similar al encontrado para otras enzimas de organismos halofílicos,
tanto del Dominio Archaea como de Bacteria.
En Hfx. mediterranei también se encuentra una actividad glutamato deshidrogenasa NADPdependiente (Ferrer y col., 1996) con un máximo de actividad a 2 M de NaCl y 1 M de KCl, siendo
ligeramente más activo en KCl que en NaCl (Ferrer y col., 1996).
Las glutamato deshidrogenasas presentes en el archaeon Halobacterium halobium, NADglutamato deshidrogenasa (Bonete y col., 1986) y NADP-glutamato deshidrogenasa (Bonete y col., 1987),
presentan un aumento de su actividad al aumentar la concentración de sales en el medio de reacción,
observándose por el contrario una mayor actividad con NaCl que con KCl, con valores máximos de
actividad de 3,2 M de NaCl y 0,8 M de KCl para la enzima NAD-dependiente y 1,6 M de NaCl y KCl para
la enzima NADP-dependiente.
Sin embargo, también se encuentran algunas enzimas halofílicas cuya actividad máxima se
obtiene a concentraciones de sal mucho más bajas, entre ellas la glucosa deshidrogenasa de Hfx.
mediterranei cuyo óptimo de actividad es 1,75 M de NaCl y 1,3 M de KCl. En éste caso, también son
parecidos los valores obtenidos con ambas sales aunque ligeramente menores con KCl (Bonete y col.,
1996).
En el Dominio Bacteria, encontramos también organismos halofílicos tales como Salinibacter
ruber (Antón y col., 2002). Salinibacter ruber presenta concentraciones intracelulares de ion potasio
similares a las de las arqueas halofílicas Halobacterium salinarum y Haloarcula marismortui (Antón y col.,
2002), indicando que ésta bacteria utiliza una estrategia similar de adaptación a altas concentraciones
salinas. En Salinibacter ruber se encuentran dos actividades glutamato deshidrogenasa GDHI y GDHII
(Oren y Mana, 2002; Bonete y col., 2003) una de las cuales presenta un comportamiento similar al
encontrado en nuestro caso, con una actividad más elevada a mayores concentraciones de NaCl y una
estabilidad dependiente de la concentración de sal. Sin embargo la GDHI, presenta un máximo de
Susana Díaz González
154
actividad en ausencia de sales, pero sigue mostrando un comportamiento halofílico en cuanto a
estabilidad se refiere (Bonete y col., 2003). Se ha encontrado un comportamiento contrario en la malato
deshidrogenasa del mismo organismo, siendo completamente estable en ausencia de sal (Madern y
Zaccai., 2004).
La NAD-glutamato deshidrogenasa lleva a cabo su función en un medio en el que la
concentración salina es muy elevada ya que Hfx. mediterranei, acumula altas concentraciones de KCl en
su interior para contrarrestar la elevada presión osmótica a la que se ve sometido en su medio natural
(Kushner, 1985). El hecho de que la enzima pueda ejercer su función de forma óptima tanto con NaCl
como con KCl, es una característica común observada en otras enzimas halofílicas. Aunque en el interior
de la célula el ion predominante es el K+ las enzimas halofílicas suelen presentar, in vitro, una actividad y
estabilidad similar con Na+ probablemente debido al parecido químico de ambos iones.
4.6.4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
Los ensayos de actividad a distintas temperaturas para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa
y recombinante, se muestran en la Figura 49, en la que se representa Vapp vs T. En ella se puede
observar que en el rango estudiado (283K hasta 353K) la actividad aumenta hasta alcanzar un valor
máximo a 60ºC para la enzima nativa, encontrándose exactamente el mismo valor de temperatura óptima
para la enzima recombinante. A partir de los 70ºC se produce un descenso pronunciado de la actividad
enzimática.
Susana Díaz González
155
120
NAD-GDH Recombinante
100
NAD-GDH Nativa
Vapp (%)
80
60
40
20
0
280
300
320
340
360
Ttemperatura K
Figura 49: Efecto de la temperatura en la actividad enzimática. Comparación de actividades en la NAD-glutamato
deshidrogenasa nativa („) y recombinante (z). Del máximo de cada curva se determinó la temperatura óptima para la reacción
de aminación reductiva de la enzima.
El rango de temperaturas en el que la actividad enzimática está cercana al máximo, comprende
desde 50 a 70ºC con un máximo bien definido a 60ºC. Estos valores están muy cercanos a los que se
encuentran para las glutamato deshidrogenasas NAD y NADP-dependientes de Halobacterium salinarum
que muestran un máximo de actividad a 70ºC tanto para las reacciones de aminación como para las de
desaminación (Bonete y col., 1986; 1987). Este comportamiento también se observa en la NADPglutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con una temperatura óptima de 60ºC (Ferrer y col., 1996).
Otras enzimas de este organismo, como la α-amilasa extracelular, tienen también temperaturas óptimas
del órden de 50-60ºC (Perez-Pomares y col., 2003) y para nitrito y nitrato reductasas del mismo
Susana Díaz González
156
organismo la temperatura óptima de actividad se encuentra en 60°C y 70°C, respectivamente (MartínezEspinosa y col., 2001; Lledó y col., 2004).
Esta elevada temperatura óptima que comprende un rango de entre 55-70ºC es una
característica común en las enzimas de los organismos halofílicos y suele ir acompañada de una alta
termoestabilidad. El carácter termofílico de las enzimas halófilas, ha sido descrito en varios sistemas.
Dym y col. (1995) encontraron a partir de la estructura cristalográfica de la malato deshidrogenasa de
Haloarcula marismortui, que varios de los motivos estructurales que confieren el carácter halofílico son los
mismos que aquellos que contribuyen a la estabilidad de enzimas termofílicos. Estas enzimas se
caracterizan por un incremento en el número de puentes salinos y la introducción de residuos
aminoacídicos con carga negativa en la secuencia amino terminal (Dym y col., 1995). Esta similitud de las
enzimas halofílicas con las termofílicas es tan estrecha que sus temperaturas óptimas pueden llegar a ser
incluso del mismo rango como ocurre en la NADP-glutamato deshidrogenasa del archaeon
hipertermofílico Archaeoglobus fulgidus que tiene una temperatura óptima de entre 60-80 ºC. (Schreier,
2000). Recientemente se ha caracterizado la glutamato deshidrogenasa de Symbiobacterium toebii, un
termófilo, con una temperatura óptima de actividad de 60°C (Ha y col., 2003). De todas formas la
temperatura óptima para las glutamato deshidrogenasas de otros organismos termofílicos, suelen estar
alrededor de los 90ºC (Ruiz y col., 1998).
Esta alta temperatura óptima de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, y de las
enzimas halofílicas en general, puede considerarse una respuesta adaptativa a las altas temperaturas
que éstos organismos tienen que soportar en sus hábitats salinos naturales, esto es, salinas expuestas a
intensa luz solar.
4.6.5. Efecto del pH en la actividad enzimática.
Se estudió el efecto del pH en la actividad enzimática de la NAD-glutamato deshidrogenasa tanto
para la enzima nativa como recombinante. El estudio, se realizó en presencia de 4 M de NaCl y 4 M de
KCl en un rango de pHs comprendido entre 6,3 y 9,5. La enzima nativa, exactamente igual que la
Susana Díaz González
157
recombinante, mostró el mismo comportamiento frente al pH en presencia de ambas sales, aunque la
actividad fue ligeramente superior en 4 M de KCl. Como se muestra en las Figuras 50A y 50B, el perfil de
la curva es creciente a pHs por encima de 6,3 y decrecientes a partir de pHs 8,5, encontrándose una
actividad óptima para la nativa y recombinante a pHs entre 8,0 y 8,5, tanto en el ensayo con NaCl como
en el de KCl (Figura 50).
El pH influye en la velocidad de la reacción enzimática ya que los centros activos de las enzimas
están frecuentemente formados por grupos ionizables que deben encontrarse en su forma iónica correcta
para mantener la forma adecuada del centro activo, permitir la unión de los sustratos, y catalizar la
reacción (Segel, 1993). La distribución de la enzima entre las distintas formas iónicas depende por lo
tanto del pH y de las constantes de ionización de los residuos aminoacídicos (Fersht, 1985; Camacho y
col., 1993). Este rango óptimo de pHs es idéntico al encontrado para la NADP-glutamato deshidrogenasa
de Hfx. mediteranei cuya actividad alcanza un valor máximo a pH 8,5 (Ferrer, y col., 1996). El archaeon
hipertermófilo Thermococcus litoralis posee una NADP-glutamato deshidrogenasa con un pH óptimo de
8,0 (Ma y col., 1994) y el termófilo Symbiobacterium toebii con un pH óptimo de 9,0 (Ha y col., 2003). La
levadura halotolerante Debaryomyces hansenii posee también una glutamato deshidrogenasa con un pH
óptimo de 8,0 (Alba-Lois, y col., 2004).
Susana Díaz González
158
0,24
KCl
NaCl
Vapp U/mL
0,20
0,16
0,12
0,08
0,04
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
pH
A
0,16
0,14
KCl
NaCl
Vapp U/mL
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
pH
Figura 50: Efecto del pH en la actividad de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa (Grafica A) y en la enzima recombinante
(Grafica B) medidos en Bis-Tris Propano 100 mM, a una concentración de NaCl 4M („) y a una concentración de KCl 4M (z).
B
Susana Díaz González
159
4.6.6. Determinación de parámetros cinéticos.
Se determinó la actividad de la NAD-glutamato deshidrogenasa en ambos sentidos de reacción,
encontrándose que, en todas las condiciones ensayadas (coenzima, concentración de sustratos, tipo de
tampón, temperatura), no se encontró una actividad apreciable en el sentido de desaminación oxidativa.
Por otro lado, la enzima mostró una alta actividad cuando se midió en el sentido de aminación reductiva
utilizándose como coenzima el NADH, tal y como se describe el apdo. 3.1.5. Cuando se realizaron los
ensayos con NADPH como coenzima, no se detectó actividad. Resultados similares se encontraron para
la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante.
Una vez se determinaron las condiciones óptimas de concentración de sales, temperatura, y pH,
se procedió al estudio del comportamiento cinético de la enzima. Para ello se determinó la actividad de la
enzima en tampón Bis-Tris Propano 100 mM, pH 8,0, conteniendo 4 M NaCl a 40ºC, manteniendo
constantes las concentraciones de dos de los sustratos y variando el tercero. La representación de la
actividad enzimática frente a la concentración de este sustrato mostró en todos los casos cinéticas tipo
Michaelis-Menten. El ajuste de los datos a la ecuaciones (1) y (2) detalladas en el apartado 3.1.11. de
Materiales y Métodos, permitió calcular los parámetros cinéticos, Vapp, Kmapp y Vapp/Kmapp (Tabla VII). Se
obtuvieron valores similares en ambos casos.
Susana Díaz González
160
Tabla VII: Parámetros cinéticos para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante de
Haloferax mediterranei determinada en tampón Bis-Tris Propano 100 mM, pH 8,0, conteniendo 4M NaCl.
NAD-GDH Nativa
Sustrato
Vapp (U/mL)
NAD-GDH Recombinante
Kmapp (mM)
Vapp/Kmapp
Vapp (U/mL)
Kmapp (mM)
Vapp/Kmapp
288±10
0,77±0,03
2,5 ± 0,2
306±22
1,06 ±0,07
53± 6
20,0±1,3
13,1.10-3 ±0,5.10-3
55±1,9
2-KG
0,67±0,01
2,33±0,11
NH4+
1,14 ±0,15
90±20
NADH
0,59±0,006
12,4±1,2
13,3.10-3±0,8.10-3
44±2
0,728±0,005
El hecho de que la enzima no fuese capaz de actuar utilizando como coenzima NADPH y sí con
NADH, es indicativo de la especificidad por el coenzima típica de la mayoría de las glutamato
deshidrogenasa de Archaea. En el organismo, encontramos por lo tanto, dos actividades glutamato
deshidrogenasa que difieren en su especificidad por el coenzima. La NADP-glutamato deshidrogenasa
(Ferrer y col., 1996) presenta una alta actividad en el sentido de aminación reductiva, siendo su Km para
2-oxoglutarato de 0,34 mM, valor inferior al encontrado para la NAD-glutamato deshidrogenasa de 2,5
mM, indicando una menor afinidad por este sustrato.
Para el NH4+ en cambio, la NADP-GDH presenta un valor de 4,2 mM frente a valores entre 53 y
90 mM encontrados en nuestro caso e indicativos de que la enzima precisa de elevadas concentraciones
de amonio para poner de manifiesto su actividad. Los valores de Km para el respectivo coenzima, fueron
de 18x10-3 mM para la NADP-GDH y de 13x10-3 mM para la NAD-GDH, valores muy similares.
El valor de Km para el NH4+ de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei (53 mM)
es mucho menor que el encontrado para la NAD-glutamato deshidrogenasa de Halobacterium salinarum
de 450 mM (Bonete y col., 1986), en cambio, la Km para el 2-oxoglutarato presenta un valor de 2,5 mM
en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei frente a 20,2 mM en Hbt. salinarum y la Km para el NADH, es 0,07
mM (Bonete y col., 1986) muy superior al encontrado en nuestro caso.
Susana Díaz González
161
4.6.7. Efecto de las sales sobre la estabilidad.
Para estudiar el efecto de la concentración de sales en la estabilidad de la NAD-glutamato
deshidrogenasa tanto nativa como recombinante, se determinó la actividad de la enzima en función del
tiempo de incubación en distintas concentraciones de NaCl en un rango comprendido entre 0,5 M y 3 M.
Se observó una disminución de la actividad en función del tiempo, que fue mayor a menores
concentraciones salinas mostrando la enzima total estabilidad en 3 M de NaCl.
De la representación del logaritmo de la actividad residual frente al tiempo se obtuvieron un
conjunto de rectas (Figura 51) con pendientes que mostraban un aumento en valor absoluto al disminuir
la concentración salina.
Susana Díaz González
162
2,4
log (%ActRes)
2,0
1,6
1,2
3M NaCl
2M NaCl
1M NaCl
0,5M NaCl
0,8
0,4
0,0
0
40
80
120
Tiempo (horas)
160
A
2,4
log %ActvResid
2,0
1,6
1,2
3M NaCl
2M NaCl
1M NaCl
0,5M NaCl
0,8
0,4
0,0
0
40
80
120
160
Tiempo (horas)
Figura 51: Efecto de la concentración de sal en la estabilidad de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa (A) y recombinante (B)
de Hfx. mediterranei en un rango de 0,5 M a
3 M de NaCl. La enzima ha sido incubada
Ben tampón Bis-Tris propano 100 mM,
pH 8,0 conteniendo la concentración correspondiente de sal.
Susana Díaz González
163
En la Tabla VIII se comparan los tiempos de vida media para la enzima nativa y recombinante a
0,5 y 3 M de NaCl.
Tabla VIII. Estudios de estabilidad para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante. Las
vidas medias han sido determinadas a partir de la representación del logaritmo del porcentaje de
actividad residual frente al tiempo.
Nativa
Recombinante
[NaCl] (M)
t/1/2 (horas)
t/1/2 (horas)
0,5
2,0 ± 0,2
4,9 ± 0,4
3,0
442 ± 23
927 ± 74
La estabilidad de la enzima, es aproximadamente 200 veces mayor a 3 M que a 0,5 M tanto en la
enzima recombinante como en la nativa.
A partir de éstos resultados (Figura 51), se observa una total dependencia de la enzima, por
elevadas concentraciones salinas para su estabilidad, hecho muy común en la mayoría de enzimas
halofílicas y que pone de manifiesto su carácter halofílico. Por lo tanto, la alta concentración de sal es
importante tanto para una actividad óptima como para su estabilidad (Arakawa y Tokunaga, 2004).
Por ejemplo, la malato-deshidrogenasa de Haloarcula marismortui pierde su estructura y se
disocia a concentraciones de sal por debajo de 2,5 M (Eisenberg y col., 1992). De la misma manera, la
dihidrolipoamida deshidrogenasa del mismo organismo pierde su actividad en ausencia de elevadas
concentraciones de NaCl o KCl (Danson y col., 1986).
Este comportamiento contrasta con el de la NADP-GDH de Hfx. mediterranei (Ferrer y col. 1996),
enzima que a bajas concentraciones salinas muestra cierta estabilidad de forma que a 0,5 M de NaCl
sigue manteniendo más de un 50% de su actividad residual por encima de las 47 horas o la glucosa
Susana Díaz González
164
deshidrogenasa del mismo organismo para la cual la vida media es de 163 horas a 0,5 M de NaCl
(Bonete y col., 1996).
La estabilización o desestabilización de las estructuras proteicas por disoluciones con elevadas
concentraciones salinas probablemente se debe a la modificación de las interacciones hidrofóbicas por la
presencia de iones salinos.
Ciertas sales estabilizan estructuras proteicas y otras las desestabilizan, por ejemplo, iones
fosfato y sulfato poseen un carácter “salting-out” comportándose como agentes estabilizadores de la
estructura proteica plegada a altas concentraciones de sal. Por otro lado, los iones litio, magnesio,
bromuro y tiocianato son iones “salting-in” que rompen agregados proteicos y favorecen el despliegue de
algunas proteínas. Los iones sodio, potasio y cloruro pueden ser considerados neutros o ligeramente
“salting-out” (Arawaka y col., 1984).
La estabilización de proteínas halofílicas en disoluciones conteniendo altas concentraciones
salinas se ha discutido basándose en peculiaridades de su composición tales como la alta proporción de
residuos aminoacídicos de carácter ácido en su superficie comparada con sus proteínas homólogas no
halofílicas (Esclapez, 2004).
Zaccai en 1989, propuso que la malato deshidrogenasa de Halobacterium marismortui se
estabiliza por diferentes mecanismos dependiendo del tipo de sal en el que es activa la enzima, por
ejemplo, cuando la disolución contiene fosfato de potasio, el modelo de estabilización es
predominantemente del tipo “salting-out” sin embargo cuando las sal es KCl propone un modelo en el que
la proteína estaría estabilizada por una red de hidratación en su estructura cuaternaria, formada por
dímeros de proteína, moléculas de agua e iones salinos (Zaccai y col., 1989).
El efecto predominante en el plegamiento y estabilización de la estructura proteica son las
interacciones del tipo hidrofóbico. Zaccai y Einserberg (1990), explicaron los efectos del disolvente sobre
el plegamiento y solubilidad de las proteínas dominadas por interacciones hidrofóbicas, así, por ejemplo,
Susana Díaz González
165
el agua no es un buen disolvente para los residuos aminoacídicos apolares proporcionando un aumento
de los efectos hidrofóbicos, los cuales contribuyen al plegamiento de la proteína de forma que éstos
quedan apantallados frente al disolvente. La importancia del entorno en el que está la enzima, se está
poniendo de relieve por estudios de mutagénesis dirigida en proteínas tanto halofílicas como no
halofílicas. A partir de éstos estudios en proteínas no halofílicas se ha observado que la contribución a la
estabilidad de la estructura proteica por parte de las interacciones disolvente-proteína expuesta es
mínima, siendo las interacciones hidrofóbicas las dominantes (Matthews, 1993).
4.7. ANÁLISIS MEDIANTE NANOELECTROSPRAY LC/MS DE LA NAD-GDH NATIVA.
Este análisis se aplica para realizar la identificación y caracterización de proteínas mediante
análisis peptídico. Se han realizado estudios de fragmentación de proteínas con proteasas con la finalidad
de conocer las propiedades funcionales de la enzima original, permitiendo la identificación de dominios
funcionales. Este tipo de estudio se ha llevado a cabo en la glutamato deshidrogenasa de Clostridium
symbiosum en la que se ha detectado un lazo termicamente sensible (Aghajanian y col., 2003).
Igualmente, este análisis de péptidos en diversas proteínas puede ser utilizado con la finalidad
de caracterizarlas y/o identificarlas. La glutamato deshidrogenasa de Psychrobacter sp. TAD1 se ha
digerido de igual forma permitiendo obtener un péptido identificativo de la GDH (Camardella y col., 2002).
El análisis mediante Nanoelectrospray LC/MS de la NAD-GDH de
Hfx. mediterranei ha permitido
confirmar que la NAD-GDH nativa y recombinante son la misma enzima.
La figura 52 muestra los espectros obtenidos en la secuenciación aminoacídica de los diferentes
péptidos.
Susana Díaz González
166
Figura 52: Se muestran los espectros de masas de cada uno de los 4 péptidos. En la parte superior de cada ventana
se observa la secuencia aminoacídica correspondiente
Susana Díaz González
167
Figura 53: Resultados del análisis de LC/MS.
Susana Díaz González
168
A partir de la NAD-GDH nativa purificada, se obtuvieron y secuenciaron 4 péptidos, cuya
secuencia supone un 6% del total de los residuos que componen la secuencia aminoacídica de la NADglutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei. Dichas secuencias peptídicas se encontraban contenidas
en la secuencia de la enzima halofílica previamente depositada en las bases de datos. Además dichos
péptidos parecen ser exclusivos de esta enzima, puesto que al realizar su comparación con las bases de
datos disponibles, se obtuvo coincidencia unicamente con la NAD- glutamato deshidrogenasa de
Hfx. mediterranei.
Se localizaron los peptidos en la secuencia conocida de la NAD-GDH como se indica en la
Figura 54.
1 MQTSEPEGSS PNTAEAASQS SEPKPASESA LETARRQLYR AADHLDIDPN
51 VVERLKHPEA VHEVTVPIER DDGSVSVYTG YRAQHDSVRG PYKGGLRYHP
101 GVTRDECVGL RMWMTWKTEV RRDGPIFGGA KGGIAVNPKD LTLDEKERLT
151 RRFTQEIRTI IGPMKDIPAP DMGTDPQTMA WVMDAYSMQE GETVPGVVTG
201 KPPIVGGSEG RDTAPGRSVA IIAREAIDYL SWDIEDTTVA VQGFGSVGAP
251 AARLLDDYGA NVVAVSDVNG AIYDPDGLDT HAIPTHEEEP EAVMTHDAPE
301 TFSNEELLEL DVDVLIPAAV GNVLTAENAD DVQANLIVEG ANGPTTSAAD
351 ANFAERGVPV IPDILANAGG VTVSYFEWLQ DINRRTWSLE RVHDELETEM
401 LNAWSVVRDE YESRDVPWRD AAYIVALSRI AAAHDARGLW P
Susana Díaz González
169
Figura 54: Secuencia aminoacídica de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. Los péptidos que se han identificado mediante
nanoLC/MS se muestran en negrita y subrayados. Se obtuvieron cuatro mediante la digestión con tripsina de la GDH nativa,
péptidos cuya secuencia aminoacídica coincide perfectamente con la de la enzima recombinante obtenida a partir del clonaje y
secuenciación del gen.
En la Tabla IX se indican los péptidos obtenidos en la enzima nativa y las posiciones
correspondientes en la secuencia aminoacídica recombinante.
Tabla IX: Secuencia aminoacídica de los péptidos obtenidos mediante LC/MS y su posición
correspondiente en la secuencia de la NAD-GDH recombinante de Hfx mediterranei.
Secuencia aminoacídica de los péptidos obtenidos Posición en la secuencia de la NADde la NAD-GDH nativa.
GDH recombinante
RFTQEIRT
152-160
KDLTLDEKERL
139-149
KDLTLDEKE
139-147
RAADHLDIDPNVVERL
39-55
Estos resultados nos permiten concluir que ambas enzimas son idénticas.
Susana Díaz González
170
5. CONCLUSIONES.
Las conclusiones del trabajo realizado en esta Tesis Doctoral son las siguientes:
•
Los resultados obtenidos muestran claramente que las dos actividades de glutamato
deshidrogenasa detectadas en Haloferax mediterranei, corresponden a diferentes productos
génicos y no a único gen con actividad dual por el coenzima.
•
Uno de estos genes se ha expresado de forma heteróloga en E. coli, correspondiendo a la
actividad NAD-glutamato deshidrogenasa.
•
La caracterización conjunta de ambas enzimas, nativa y recombinante, ha demostrado que
presentan las mismas propiedades cinéticas y moleculares.
•
Los resultados derivados del análisis de Nanoelectrospray LC/MS, han permitido confirmar
que la NAD-GDH nativa y la recombinante son la misma enzima.
•
El análisis comparativo de las secuencias revela que los residuos clave en el mantenimiento
de las propiedades catalíticas de la enzima se encuentran en general conservados,
independientemente del carácter halofílico de la enzima o del Dominio al que pertenece el
organismo.
•
Al igual que otras enzimas halofílicas, la NAD-glutamato deshidrogenasa de Haloferax
mediterranei posee cierto comportamiento termofílico y su composición aminoacídica
presenta similitudes que están relacionadas con la termoestabilidad de las GDHs aisladas
de organismos termófilos.
•
Los análisis filogenéticos realizados nos permiten concluir, que la NAD-glutamato
deshidrogenasa de Hfx. mediterranei es una enzima perteneciente a la Familia II de las
GDHs hexaméricas, encontrándose además una secuencia peptídica (EGANGPTT), entre
los residuos 339 al 346, característica de esta Familia y la ausencia de las regiones
peptídicas características de la Familia I de las glutamato deshidrogenasas hexaméricas.
Susana Díaz González
171
•
Los 441 residuos aminoacídicos que comprenden la cadena polipeptídica de la subunidad
de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, están localizados, según
estudios de modelado molecular, en dos dominios separados por una profunda hendidura.
El dominio I contiene la mayoría de los residuos responsables de las interacciones entre las
subunidades del hexámero. El dominio II contiene el sitio de unión del coenzima.
Susana Díaz González
172
6. TRABAJO FUTURO.
Realizar estudios de cristalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante para
poder determinar la estructura tridimensional mediante cristalografía de Rayos X.
Realizar estudios de mutagénesis dirigida encaminados a adaptar la estabilidad de la enzima en
diferentes entornos.
Determinación completa de la secuencia aminoacídica del gen que codifica la GDHII y expresión
del gen para verificar si se trata de otra glutamato NAD-dependiente o si por el contrario se trata de la
NADP-glutamato deshidrogenasa.
Susana Díaz González
173
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Susana Díaz González
196
8. APÉNDICE I.
•
SOLUCIONES EMPLEADAS EN ELECTROFORESIS DE AGAROSA:
Tampón TAE 10X:
0,25 % Azul de bromofenol
0,25 % Xileno cianol
40 % Sacarosa
Ajustar el pH a 8,4
Tampón de carga 6X:
Tris-Acetato 0,4 mM
EDTA 10 mM
Ácido acético 0,2 M
Susana Díaz González
197
•
MEDIOS DE CULTIVO:
SOC 1L
20 g Triptona
5 g Extracto de Levadura
0,6 g NaCl
0,2 g KCl
2,05 g MgCl2
2,45 g MgSO4
3,6 g Glucosa
Ajustar el pH a 7 y autoclavar
LB (Luria Bertani) 1L
10g Bacto Triptona
5g Extracto de Levadura
10 g NaCl
Ajustar el pH a 7,5 con 1M NaOH y autoclavar
Susana Díaz González
198
-
SOLUCIONES SDS-PAGE:
Tampón de muestra (2X Sample Buffer):
80mM Tris-HCl
100mM DTT
2% SDS
0,006% Azul de Bromofenol
15% Glicerol
Ajustar el pH a 6,8
Preparación del gel separador y del concentrador
Gel Separador
4 mL 30% Acrilamida/Bisacrilamida
2,5 mL Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
3,35 mL Agua destilada
100 μL SDS 10%
50 μL Sulfato amónico 10%
5 μL TEMED
Susana Díaz González
199
Gel concentrador
1,3 mL 30% Acrilamida/Bisacrilamida
2,5 mL Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
6,10 mL Agua destilada
100 μL SDS 10%
50 μL Sulfato amónico 10%
10 μL TEMED
Tampón de recorrido 5X, 1 L:
15g Tris-HCl
72g Glicina
3g SDS
Ajustar el pH a 8,3 con HCl
Azul Coomassie 0,1 %:
Diluir 0,2g de Azul Coomassie R-250 en 200 mL de la solución 40% metanol, 10% ácido acético.
Susana Díaz González
200
-
SOLUCIONES DE HIBRIDACIÓN:
20XSSC
3 M NaCl
0,3 M Na3Citrato.2H2O
Ajustar el pH a 7,0 con HCl
Solución Bloqueante
Blocking Reagent (Roche Molecular Biochemicals) 10% (p/v) en
tampón 1. Se disuelve calentando
Esterilizar y guardar a 4°C
Tampón 1
0,1 M Acido maleico
0,15 M NaCl
Ajustar el pH a 7,5 con NaOH y esterilizar
Susana Díaz González
201
Solución de Desnaturalización
0,5 N NaOH
1,5M NaCl
Solución de Neutralización
1 M Tris-HCl pH 7,5
1,5M NaCl
Solución de Hibridación
5XSSC
Blocking Solution 10% (v/v)
N-Laurilsarcosina 10% (p/v)
SDS 0,02%
-
VARIOS:
-
X-Gal 2% (Stock): Disolver 0,10 g de X-Gal en 5 mL de dimetilformamida (Preparar en
vidrio).
-
IPTG 0,1 M (Stock): Disolver 0,141 g de IPTG en 5 mL de agua ultrapura y filtrar.
-
Glicerol 80% 100 mL Medir 80 mL de glicerol y llevar hasta un volumen de 100 mL con
agua destilada y después autoclavar.
Susana Díaz González
202
-
TAMPONES
PBS (Phosphate buffered saline) 1L
8g NaCl
0,2g KCl
1,44g Na2HPO4
0,24g KH2PO4
Ajustar el pH a 7,4 con HCl y autoclavar.
Tampón SM
0,6% NaCl
0,2% MgSO4
5% (v/v) Tris-HCl 1 M pH 7,5
2% (v/v) gelatina
Esterilizar
Susana Díaz González
203
9. APÉNDICE II. Índice de tablas y figuras
-
Tabla I: Purificación de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei .
-
Tabla II: Frecuencia de uso de codones en la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei.
-
Tabla III: Porcentaje de residuos aminoacídicos de diversas GDHs pertenecientes a la Familia II.
-
Tabla IV: Predicción de la termoestabilidad para diferentes glutamato deshidrogenasas mediante
el índice BDC.
-
Tabla V: Etapas de purificación para la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante de Hfx
mediterranei.
-
Tabla VI: Comparación de masas moleculares de glutamato deshidrogenasas de diversas
fuentes.
-
Tabla VII: Parámetros cinéticos para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante.
-
Tabla VIII. Estudios de estabilidad para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y
recombinante.
-
Tabla IX: Secuencia aminoacídica de los péptidos obtenidos mediante LC/MS.
-
Figura 1: Representación esquemática del árbol filogenético universal.
-
Figura 2: Filogenia del Dominio Archaea.
-
Figura 3: Esquema de la localización de genes en una genoteca de fago λ.
-
Figura 4: Programa de amplificación de PCR con los oligonucleótidos Nad-gdhFOR y NadgdhREV.
-
Figura 5: Mapa del vector de clonaje pCR 2.1.
-
Figura 6: Esquema de la ligación del plásmido pCR2.1 y el producto de PCR.
-
Figura 7: Sitios de corte de las enzimas de restricción NdeI y BamHI.
-
Figura 8: Mapa del vector de expresión pET3a.
-
Figura 9: Cromatografía en Sepharosa-4B.
-
Figura 10: Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en presencia de SDS.
Susana Díaz González
204
-
Figura 11: Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en el que se muestran las diferentes
amplificaciones a distintas temperaturas.
-
Figura 12: Programa de PCR para amplificar el producto utilizado como sonda.
-
Figura 13: Electroforesis en gel de agarosa al 1%.
-
Figura 14: Estimación del marcaje de la sonda.
-
Figura 15: Búsqueda en la genoteca de DNA genómico de Hfx. mediterranei en fago λ con la
sonda de 203 pb.
-
Figura 16: Electroforesis en gel de agarosa de 2 de los fagos aislados del segundo screening.
-
Figura 17: Secuencia de la NAD-glutamato deshidrogenasa en bases y en aminoácidos.
-
Figura 18: Secuencia de la glutamato deshidrogenasa (GDHII) amplificada de DNA genómico y
que se corresponde con el producto de PCR.
-
Figura 19: Comparación de las dos secuencias de las glutamato deshidrogenasas encontradas
en Hfx. Mediterranei.
-
Figura 20: Comparación de los residuos implicados en la unión del coenzima de la nueva GDH
(GDHII).
-
Figura 21: Repetición de residuos acídicos en la región N-terminal de la NAD-glutamato
deshidrogenasa de Hfx. Mediterranei.
-
Figura 22: Secuencias N-terminales de GDHs de organismos Halofílicos.
-
Figura 23.: Comparación de las secuencias correspondientes al N-terminal de diferentes
glutamato deshidrogenasas halofílicas.
-
Figura 24: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas procedentes de organismos de distintos
Dominios.
-
Figura 25: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas procedentes de organismos halofílicos
de Bacteria y Archaea.
-
Figura 26: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas NAD-dependientes.
-
Figura 27: Alineamiento de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con GDHs
NAD(P)-dependientes.
Susana Díaz González
205
-
Figura 28: Alineamiento de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con GDHs
NADP-dependientes.
-
Figura 29: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas de organismos del Dominio Archaea.
-
Figura 30: Alineamiento de GDHs procedentes de organismos de distintas familias
representadas en el árbol.
-
Figura 31: Árbol filogenético para diversas DGS.
-
Figura 32: Predicción de la estructura secundaria de la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei.
-
Figura 33: Imagen tridimensional del motivo de unión del 2-oxoglutarato en la NAD-GDH de
Hfx. Mediterranei.
-
Figura 34: Modelado molecular para el monómero de la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei.
-
Figura 35: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la PCR de amplificación.
-
Figura 36: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados del vector pCR2.1.
-
Figura 37: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la digestión con NdeI y BamHI.
-
Figura 38: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados del vector de
expresión pET3a + NAD-GDH.
-
Figura 39: Expresión de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei en E. coli.
-
Figura 40: Efecto del tipo de tampón usado en la disolución de renaturalización.
-
Figura 41: Renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa en presencia de NaCl y KCl.
-
Figura 42: Efecto de la concentración de sales en la renaturalización de la NAD-glutamato
deshidrogenada.
-
Figura 43: Renaturalización de la NAD-GDH en presencia/ausencia de EDTA.
-
Figura 44: Purificación de la NAD-GDH recombinante.
-
Figura 45: Determinación de la masa molecular de la NAD-glutamato mediante tamizado
molecular.
-
Figura 46: Gel de electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS.
-
Figura 47: Determinación de la masa molecular de la subunidad de la NAD-glutamato
deshidrogenasa nativa.
Susana Díaz González
206
-
Figura 48: Efecto de la concentración de NaCl y de KCl en la actividad de la NAD-glutamato
deshidrogenada.
-
Figura 49: Efecto de la concentración de sal en la estabilidad de la NAD-glutamato
deshidrogenada.
-
Figura 50: Efecto de la temperatura en la actividad enzimática.
-
Figura 51: Efecto del pH en la actividad de la NAD-glutamato deshidrogenada.
-
Figura 52: Espectros de masas de cada uno de los 4 péptidos.
-
Figura 53: Resultados del análisis de LC/MS.
-
Figura 54: Secuencia aminoacídica de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei en la que se marcan
los péptidos obtenidos mediante nanoLC/MS.
Susana Díaz González
207
10. APÉNDICE III. Abreviaturas.
ADP: Adenosín difosfato
ATP: Adenosín trifosfato
BSA: Albúmina de suero bovino
CAT: ciclo de los ácidos tricarboxílicos
col. : colaboradores
CTAB: Bromuro de cetilmetilamonio
CSPD: 3-(4-metoxispiro-[1,2-diaminociclohexano-3-2’-(5’-cloro) triciclo [3.3.1.13,7] decano]-4-il) fenil fosfato
desódico
ddNTPs: didexosinucleótido trifosfato, dATP, dCTP, dTTP, dGTP.
dITP: 2’-desoxiinositol
DMSO: Dimetil sulfóxido
DO600: Densidad óptica a 600nm
DTT: Ditiotreitol
EDTA: Ácido etilen diamino tretaacético
FISH: hibridación in situ con fluorescencia
GCG: Genetics computer group
GdnHCl: Cloruro de guanidinio
GDH: Glutamato deshidrogenasa
GDHs: Glutamato deshidrogenasas
GOGAT: glutamato sintasa
GS: glutamina sintetasa
Har.: Haloarcula
Hbt.: Halobacterium
Hfx.: Haloferax
IPTG: isopropilo-β-D-galactósido
Susana Díaz González
208
Kav: constante de reparto
Km: constante de Michaelis-Menten
LB: Medio de cultivo Luria-Bertani
Mr: masa molecular
NAD+: Nicotín adenín dinucleótido oxidado
NADH: Nicotín adenín dinucleótido reducido
NADP+: Nicotín adenín dinucleótido fosfato oxidado
NADPH: Nicotín adenín dinucleótido fosfato reducido
N-ter: Secuencia del extremo amino terminal
pb.: pares de bases
PBS: Tampón fosfato salino
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PHA: polihidroxialcanoato
PMSF: Phenyl methyl sulfonyl fluoride (fluoruro de fenil metil sulfonilo)
PVDF: polyvinylidene fluoride (polifluoruro de vinilideno)
Rf: distancia electroforética relativa
SDS: Sodio dodecil sulfato
SDS-PAGE: Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS
SSC: Dodecil sulfato sódico
T: Temperatura
TAE: Tris-Acetato-EDTA
TEMED: N, N, N’, N-tetrametiletilen diamina
Tm : Melting temperature (temperatura de fusión de la doble hebra de DNA)
TRIS: Tris (hidroximetil) aminometano
Vapp: Velocidad aparente
Ve: volumen de elución
Vo: volumen muerto
Vt: volumen total
X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactósido
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209
AMINOÁCIDOS
SÍMBOLO
AMINOÁCIDO
CODONES
A
Ala
Alanina
GCA/GCC/GCG/GCT
C
Cys
Cisteina
TGC/TGT
D
Asp
Ácido aspártico
GAC/GAT
E
Glu
Ácido glutámico
GAA/GAG
F
Phe
Fenilalanina
TTC/TTT
G
Gly
Glicina
GGA/GGC/GGG/GGT
H
His
Histidina
CAC/CAT
I
Ile
Isoleucina
ATA/ATC/ATT
K
Lys
Lisina
AAA/AAG
L
Leu
Leucina
TTA/TTG/CTA/CTC/CTG/CTT
M
Met
Metionina
ATG
N
Asn
Asparagina
AAC/AAT
P
Pro
Prolina
CCA/CCC/CCG/CCT
Q
Gln
Glutamina
CAA/CAG
R
Arg
Arginina
AGA/AGG/CGA/CGC/CGG/CGT
S
Ser
Serina
AGC/AGT/TCA/TCC/TCG/TCT
T
Thr
Treonina
ACA/ACC/ACG/ACT
V
Val
Valina
GTA/GTC/GTG/GTT
W
Trp
Triptófano
TGG
Y
Tyr
Tirosina
TAC/TAT
Codones de terminación
TAA/TAG/TGA
Susana Díaz González
210