Identificación de regiones regulatorias del gen dlg de Drosophila

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Identificación de regiones regulatorias del
gen dlg de Drosophila melanogaster
MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE BIOQUIMICO
PABLO ANDRES MAJOO MORGADO
DIRECTOR: DRA. JIMENA SIERRALTA
Santiago, Chile
2008
“Gracias a Dios. A mi familia, quienes me han
entregado todo y son mi ejemplo. A Carla por
apoyarme incondicionalmente y por tenerme en su
corazón y a mis amigos que estando lejos o cerca se
preocupan por mi”.
i
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Jimena Sierralta por su confianza, por la paciencia, la buena voluntad, por
guiarme y escucharme.
A la Dra. Daniela Seelenfreund por la gran disposición y por ayudarme a ordenar mis
palabras.
Al Dr. Pablo Moya, por enseñarme las técnicas de Biología Molecular y por la amistad.
Al Dr. Alvaro Glavic, por enseñarme a inyectar embriones de mosca, y por los consejos.
A Carlos Oliva, Francisco Urra y Valeria Albornoz por enseñarme a disectar, y a
realizar experimentos de inmunofluorescencia.
A Angélica Figueroa por su calidad humana y por cocinar la comida de mis moscas.
A Fernando Vergara por su sentido del humor y su buena disposición.
A Rebeca Baeza por preocuparse de que nunca falte nada
A todo el grupo del laboratorio por los buenos momentos, por soportar mi humor negro,
por los consejos y por su amistad.
ii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA........................................................................................................................I
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. II
ÍNDICE DE CONTENIDOS ..................................................................................................... III
ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................. V
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................ VII
ABREVIATURAS ...................................................................................................................... VIII
RESUMEN .................................................................................................................................. X
SUMMARY................................................................................................................................. XII
1.
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
1.10
2.
Secuencias regulatorias de la transcripción en
eucariontes.................................................................................................. 1
Factores transcripcionales ........................................................................ 4
Estudio de zonas regulatorias de la transcripción
en Drosophila.............................................................................................. 4
Proteínas de andamio ................................................................................ 6
Discs-large (dlg) ......................................................................................... 6
Función de dlg en el epitelio y en el sistema
nervioso....................................................................................................... 8
dlg y sus variantes de procesamiento alternativo ................................... 8
DLGS97 en el sistema nervioso ................................................................ 10
Objetivo general......................................................................................... 11
Objetivos específicos.................................................................................. 11
MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 12
A
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
B.
2.6
Materiales................................................................................................... 12
Biología molecular ..................................................................................... 12
Transgénesis en Drosophila. ..................................................................... 13
Inmunohistoquímica.................................................................................. 14
Anticuerpos ................................................................................................ 15
Cepas de Drosophila melanogaster ........................................................... 16
Métodos ...................................................................................................... 18
Vectores de expresión pH-Pelican y pH-Stinger..................................... 18
iii
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
3.
Estrategia de clonamiento en los vectores de
inyección ..................................................................................................... 20
Transgénesis en Drosophila por inyección .............................................. 23
Inmunohistoquímica de embriones.......................................................... 25
Inmunohistoquímica de cerebro de larva................................................ 26
Inmunohistoquímica de cerebro de mosca adulta.................................. 26
Deconvolución de imágenes.......................................................................27
RESULTADOS.................................................................................................................. 28
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
Elección de dos posibles zonas regulatorias de la
transcripción de dlg. .................................................................................. 28
Clonamiento de las posibles zonas regulatorias
de la transcripción de dlg ......................................................................... 30
Inyección y mapeo de las secuencias........................................................ 32
Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el estadio
embrionario de Drosophila melanogaster. ............................................... 36
Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el cerebro de
larva de Drosophila melanogaster ............................................................ 38
Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el cerebro de
Drosophila melanogaster adulto................................................................ 40
4.
DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 42
5.
CONCLUSIONES............................................................................................................. 48
6.
PROYECCIONES……………………………………………………………………….49
7.
REFERENCIAS ................................................................................................................ 50
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1.
Ubicación del promotor y de los elementos distales de la
transcripción ..................................................................................................... 1
Fig. 2.
Intercacción entre un potenciador transcripcional y un
promotor. ......................................................................................................... 3
Fig. 3.
Familia de proteínas MAGUK similares a DLG de
Drosophila........................................................................................................ 7
Fig. 4.
Variantes originadas del locus dlg………………….…………………..………9
Fig. 5.
Esquema del ciclo de vida de Drosophila melanogaster ................................. 17
Fig. 6.
Vectores pH-Pelican y pH-Stinger................................................................... 19
Fig. 7.
Ubicación de los partidores de las zonas escogidas para
el estudio de la regulación de la transcripción de dlg ...................................... 21
Fig. 8.
Estrategia de clonamiento de las secuencias. ................................................... 22
Fig. 9.
Protocolo de inyección en embriones de Drosophila ...................................... 24
Fig. 10.
Criterios para la selección de posibles zonas
regulatorias de la transcripción ........................................................................ 29
Fig. 11.
Visualización de las construcciones generadas a partir
de las zonas regulatorias................................................................................... 31
Fig. 12.
Construcciones dlg 1/2 y dlg 5/10 en pH-Stinger
digeridas con Eco RI ........................................................................................ 33
Fig. 13.
Determinación de la ubicación cromosómica de la
inserción del elemento P .................................................................................. 34
Fig. 14.
Expresión de algunas de las líneas transgénicas en
cerebro de larva ................................................................................................ 35
Fig. 15.
Inmunofluorescencia de dlg 1/2 y dlg 5/10 en
embriones de Drosophila melanogaster .......................................................... 37
v
Fig. 16.
Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en cerebro de larva de
Drosophila melanogaster ................................................................................ 39
Fig. 17.
Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el cerebro de
Drosophila melanogaste adulto ...................................................................... 41
Fig. 18.
Modelo de regulación de la transcripción de las
isoformas de dlg ............................................................................................... 47
vi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.
Secuencias de partidores para las construcciones
realizadas.......................................................................................................... 21
Tabla 2.
Anticuerpos
utilizados
en
experimentos
de
inmunohistoquímica. ........................................................................................ 26
Tabla 3.
Tamaños esperados de las construcciones generadas y
patrón de corte resultante de la digestión con Eco RI en
el vector pBluescript SK .................................................................................. 30
Tabla 4.
Líneas obtenidas y cromosomas en que se insertó el
elemento P ........................................................................................................ 35
vii
ABREVIATURAS
BAC:
Cromosoma artificial bacteriano
Cyo:
Curly of Ester
dsRNA:
RNA de doble hebra
DEPC:
Dietilpirocarbonato.
Dlg:
Disc large.
dNTPs:
desoxirribonucleótidos trifosfato
dsRNA:
RNA de doble hebra.
DTT:
Ditiotreitol.
EST:
“Expresed sequence tag”. Secuencia marcada expresada
EGFP:
“Enhanced green fluorescent protein”. Proteína fluorescente verde incrementada
F:
Generación filial
Fas II:
Fasciclina II
GFP:
“Green fluorescent protein”. Proteína fluorescente verde
GK:
“Guanylate kinase”. Guanilato quinasa
GMC:
Célula madre ganglionar
Hsp70:
Proteína de shock térmico de 70 KDa
Kb:
Kilobases
LB:
Medio Luria Bertani
Lgl:
“Lethal giant larvae”. Larva letal gigante
L27:
Lin 27
MAGUK: ”Membrane asociated guanylate kinase”. Guanilato quinasa asociada a
membrana
PAF:
Fijador de paraformaldehido al 4%.
Pb:
Pares de bases.
viii
PBS:
Tampón fosfato salino.
PBTG:
Amortiguador fosfato de sodio, Triton X-100 0,3%, suero de cabra 5%.
PCR:
“Polymerase chain reaction” Reacción en cadena de la polimerasa.
PDZ:
PSD-95, Discs large y ZO-1.
PSD:
Proteína de la densidad postsináptica.
PEM:
PIPES, EGTA y MgSO4
PT:
Amortiguador fosfato de sodio, Triton X-100 0,3%.
TAE:
tampón tris-acetato-EDTA
SAP:
“Sinapsis asociated protein”. Proteína asociada a sinapsis
SH3:
Dominio de homología src tipo 3.
SOP:
Órganos sensoriales periféricos
Yw:
Yellow-white
ix
RESUMEN
Identificación de regiones regulatorias del gen dlg de Drosophila melanogaster
La diferenciación celular ocurre debido a la regulación de la expresión de distintos
genes en un patrón espacial y temporal definido. Entre los elementos regulatorios de la
expresión a nivel de transcripción de genes se encuentran los promotores, que poseen
elementos basales para la transcripción, elementos proximales que la regulan río arriba de
este, y los elementos distales que son capaces de regular la expresión de un gen aún estando
muy lejos del promotor, incluso río abajo de éste. Los elementos basales de los promotores
son capaces de unir factores de transcripción generales en todas las células, en cambio los
elementos distales unen factores específicos de cada célula, regulando de esta manera la
expresión tejido específica.
Las proteínas de andamio participan en funciones vitales, como el mantenimiento de la
localización adecuada de las proteínas de membrana en células pre y post sinápticas, para que
ocurra la neurotransmisión o para mantener la estabilidad de polaridad epitelial. La proteína
DLG o Discs large es miembro de una familia de proteínas asociadas a membrana homólogas
a guanilato kinasa (MAGUK). A través de sus dominios, las proteínas MAGUK reclutan
receptores, canales iónicos, componentes de cascadas de transducción de señales y proteínas
del citoesqueleto.
El producto del gen dlg, identificado como supresor de tumores en Drosophila
melanogaster cumple un rol fundamental tanto en células epiteliales como en células
neuronales. En las células epiteliales mantiene la polaridad ápico-basal y controla la
proliferación, y en la sinapsis regula la estructura de los botones sinápticos durante el
x
desarrollo. Se han localizado diversos dominios codificados por dlg en tipos celulares
diferentes, como lo es S97N, que se expresa predominantemente en el cordón ventral y en la
unión neuromuscular de embriones y larvas tardías, pero no en las células epiteliales. La
variante de expresión no neural corresponde a DLGA.
Debido a que existen transcritos de expresión tejido específica de dlg, resulta
interesante identificar las secuencias que determinan los productos epiteliales
o bien
neuronales. Para esto identificamos dos posibles zonas regulatorias que podrían definir esta
diferenciación basándonos en la conservación de su secuencia entre especies, y su
susceptibilidad a la inserción de elementos P. Una de estas zonas es una secuencia de 4200 pb
que se ubica río arriba de DLGS97 y la otra es una secuencia de 1900 pb que está río arriba de
DLGA. Luego de amplificarlas por PCR se clonaron estas regiones en vectores para producir
organismos transgénicos de Drosophila.
Tras
un
análisis
por
inmunohistoquímica
de
estas
moscas
modificadas
genéticamente, encontramos que la secuencia río arriba del inicio de transcripción de DLGA
dirige la expresión neuronal en todo el cerebro, y que la secuencia río arriba del inicio de
transcripción de DLGS97 dirige la expresión no neuronal, en zonas muy acotadas del cerebro.
Ambas secuencias dirigieron la expresión desde el estadio larval, expresión que se mantuvo
en el adulto.
Dado que estas secuencias fueron capaces de dirigir la transcripción del gen
reportero que codifica la proteína fluorescente verde (GFP), las calificamos como “enhancers”
o potenciadores de la transcripción.
xi
SUMMARY
Identification of regulatory regions of the dlg gene of Drosophila melanogaster
Cellular differentiation occurs due to the regulation of the gene expression in a defined
temporal and spatial pattern. Among the gene expression regulatory elements at
transcriptional level, are the promoters, which posses basal transcriptional elements,
proximal upstream elements that regulate the activity of the promoter, and distant elements
that are capable to regulate the gene expression far from the promoter and even downstream
of the promoter. Basal elements of promoters bind general transcription factors in all cells,
on the other hand, while distant elements bind specific factors of each cell type, regulating
tissue specific expression in this way.
Scaffold proteins are required for vital functions, such as maintaining the localization
of membrane proteins in pre and post-synaptic cells, for neurotransmission or for epithelial
polarity stability. DLG or Discs Large protein is a member of membrane associated proteins
homologous to guanylate kinase (MAGUK). By means of their interaction domains
MAGUK proteins recruit receptors, ionic channels, signals transduction cascade components
and cytoskeleton proteins.
The product of the dlg gene was identified as a tumour suppressor in Drosophila
melanogaster, and has a fundamental role in epithelial cells and in neurons. In epithelial
cells DLG protein controls apico-basal polarity and proliferation, and in synapses it
regulates the synaptic button structure during development. Many domains encoded by dlg
in different cell types have been identified, as S97N, which is predominantly expressed in
the ventral cord and in the neuromuscular junction in embryos and late larval stages, but not
in epithelial cells. The non-neural variant corresponds to DLGA.
xii
The existence of tissue specific transcripts, makes it interesting to identify regulatory
sequences that determine epithelial or neuronal products. We identified two possible regions
based on their inter species sequence conservation, and their susceptibility to harbour P
elements insertion. One sequence (4200 pb) is upstream of DLGS97 and the other (1900 pb)
is upstream of DLGA. We amplified these sequences by PCR, and cloned them in vectors
suitable to produce transgenic flies.
After immuno-histochemical analysis of the transgenic flies we found that the
sequence upstream of the transcriptional start of DLGA directs partially neuronal expression
in all the brain, and that the sequence upstream of DLGS97 directs non-neuronal expression,
in a small region of the brain. Both sequences directed expression in the brain from larval
stageto adult brain.
Since these sequences were capable to direct GFP transcription we assigned them a
transcriptional enhancer role.
xiii
INTRODUCCION
Todas las células de un individuo poseen el mismo tipo y cantidad de DNA, a excepción de
las células germinales, y la diferenciación celular ocurre debido a la regulación de la expresión de
distintos genes en un patrón espacial y temporal definido. Por lo tanto, la identidad de los distintos
tipos celulares en un organismo multicelular está dado por el arreglo particular de proteínas que se
expresa en un tejido y momento del desarrollo. Entre los mecanismos de regulación están aquellos
que involucran el silenciamiento y activación de la expresión de genes por la unión de factores de
transcripción a secuencias determinadas. Estas secuencias generalmente se encuentran cercanas a
los genes que codifican para productos tejido-específicos, de modo de activar (o reprimir) la
expresión de los productos que son necesarios para cada tipo celular en un individuo.
1.1.-Secuencias regulatorias de la transcripción en eucariontes
En genes eucariontes que codifican RNA mensajero se han descubierto distintos tipos de
secuencias regulatorias de DNA que influencian la transcripción de genes dependiendo del tipo de
célula (Weil y cols., 1979). Estas secuencias corresponden a los elementos de un promotor, que está
formado por el promotor mínimo y por los elementos proximales y distales (Figura 1).
Figura 1: Ubicación del promotor y de los elementos distales de la trancripción
De 5´a 3´ se muestran los elementos distales a una distancia mayor a 1kpb, la región, que comprende los elementos
proximales a -2oo pb (con cajas GC, CAAT y SDE, entre otros o elementos distales), y el promotor mínimo ( con cajas
TATA, el elemento
de respuesta BRE y la secuencia iniciadora Inr (esquema extraído de la página
http://av.bmbquma.es)
1
Los promotores reconocidos por la RNA polimerasa II están localizados inmediatamente río
arriba del sitio de inicio de la transcripción y contienen elementos basales de la transcripción y
elementos proximales. Los elementos basales se componen de una caja TATA, de una secuencia
iniciadora (Inr), y de un elemento de respuesta al TFIIB (factor de transcripción general tipo IIB
que define el inicio de la transcripción), llamado BRE (Butler y Kadonaga, 2002). La función de la
caja TATA es indicar el sitio preciso en el que se iniciará la transcripción, pero no determina el
sentido de la transcripción debido a la simetría de su secuencia; este sentido es indicado por la
secuencia BRE. Los elementos proximales, por su cercanía a los elementos del promotor mínimo y
por la capacidad de regular la transcripción sólo río arriba de un gen, también se consideran parte
del promotor. Estos elementos se componen de la caja CAAT, la caja GC y las secuencias distales
específicas (SDE). La caja CAAT se puede encontrar en muchas posiciones y su papel es
proporcionar eficacia al promotor, pero, curiosamente, no siempre está presente, al igual que la caja
TATA. La caja GC puede encontrarse tanto delante como detrás de la caja CAAT y es más
frecuente en promotores sin caja TATA, como la mayoría de los genes de mantenimiento. Su
función es permitir una expresión constante, pero baja. Las secuencias distales específicas (SDE) se
encuentran más alejadas (-100 a -200 pb) y son reconocidas por proteínas específicas (Corden y
cols., 1980). Los elementos distales, que funcionan como secuencias regulatorias de la
transcripción, aparecen en los genes inducibles y se encuentran muy alejados de los elementos
anteriores, tanto en la región 5’ como 3’ del gen, y funcionan independientemente de su orientación.
Con frecuencia no se les considera parte del gen, y aunque están lejos, se acercan al promotor basal
debido a curvaturas en el DNA por la unión de múltiples proteínas (Li y cols., 1991) (Figura 2).
Estos elementos se subdividen en potenciadotes y silenciadores (Ogbourne y Antalis, 1998). Los
silenciadores o inhibidores impiden que se transcriba el gen sin cambiar el grado de
empaquetamiento de la cromatina. Se describieron inicialmente en las levaduras, y se han
encontrado en otros organismos.
2
Los potenciadores o “enhancers” son secuencias de DNA que pueden activar el uso del
promotor basal, controlando la eficiencia y la tasa de transcripción desde ese promotor (Struhl,
1982). Los enhancers pueden activar promotores del mismo cromosoma desde distancias tan
grandes como 50 kilobases sin necesidad de estar localizados río arriba de un gen, pudiendo estar en
el extremo 3´, en los intrones, o incluso en la hebra complementaria de DNA (Shih y cols., 2000).
En los eucariontes pueden haber más de un promotor para un mismo gen, los cuáles permitirán la
transcripción diferencial de distintos tipos de isoformas con propiedades diferentes que permitirán
una expresión específica en el tiempo, en los distintos tejidos, en la localización celular y con
capacidad funcional diferencial (Behr y weinbauer, 2001) (Figura 4 A).
Figura 2: Interacción entre un potenciador transcripcional y un promotor.
Micrografía que muestra la interacción entre la zona de un promotor de un DNA artificial que une el factor de
transcripción Sp1 (rojo), e interacciona con la proteína E2 al estar ésta unida al potenciador (azul). A pesar de estar tan
distantes el promotor del potenciador (1860 pb) se observa que son capaces de interactuar (Adaptado de Li y cols.,
1991).
3
1.2.-Factores transcripcionales
Tanto los elementos basales de un promotor como los elementos distales de estos unen
factores transcripcionales. Los elementos basales son reconocidos por los factores generales, los
cuales, al reconocer las secuencias más conservadas, son a su vez, los más conservados. Promueven
la formación del complejo de inicio, mediando el reclutamiento de la RNA polimerasa II y el
correcto punto de inicio de la transcripción (Nikolov, 1997).
A diferencia de los factores transcripcionales de un promotor mínimo, los factores
transcripcionales de las zonas regulatorias son específicos de cada tipo celular y de cada período
específico de desarrollo (Yoshiaki y cols., 1986), o incluso un estado general del organismo
específico (estado nutricional, respuesta a un estresor o factor ambiental). En un organismo, los
factores de transcripción pueden regular la transcripción de las distintas isoformas de un gen tal
como dlg, de modo tejido específico, reconociendo las zonas potenciadoras de la transcripción en
cada tipo celular, dando origen a expresiones diferenciales de un gen.
1.3.-Estudio de zonas regulatorias de la transcripción en Drosophila
Una estrategia apropiada para el estudio de secuencias regulatorias de la transcripción en
Drosophila es el uso de elementos P. Estos elementos son secuencias móviles de DNA que poseen
señales de reconocimiento que les permiten insertarse en distintas zonas del genoma, ya sean inter o
intragénicas (O´Hare y Rubin., 1983). Este proceso es catalizado por una enzima llamada
transposasa que está codificada en el propio elemento P (Rio y cols., 1988). Por los conocimientos
de genética y por los avances en biología molecular se han ideado estrategias de estudio mediante el
uso de vectores que funcionan como elementos P en Drosophila. La estrategia de estos estudios es
crear moscas transgénicas, es decir, moscas que han incorporado en el genoma de sus células
germinales genes antes ausentes en ella, como por ejemplo un gen reportero cuya expresión esté
dirigida por las secuencias regulatorias que se deseen estudiar. Se ha construido vectores tales como
pH-Stinger y pH-Pelican, que corresponden a elementos P que poseen las zonas de reconocimiento,
4
pero que no codifican la transposasa, la que es reemplazada por un gen marcador. Al no codificar la
transposasa, una vez insertado el elemento P, éste no puede movilizarse y por lo tanto es estable en
el genoma. Uno de los genes que usualmente reemplaza al de la transposasa es un gen visible en el
fenotipo, por ejemplo, el gen white que codifica para un transportador de pigmentos que otorga
color rojo en los ojos. Además estos vectores codifican un gen reportero ausente en la mosca
silvestre, como egfp (derivado de gfp de Aequario victoria) en pH-Stinger y lac z (de E. coli) en pHPelican, respectivamente. Además poseen un promotor mínimo río arriba de estos genes, que no es
capaz de reclutar la maquinaria de transcripción por sí solo (Barolo y cols., 2000). Estos vectores se
inyectan en líneas de embriones en estado de preblastodermo, en líneas de Drosophila que carezcan
del gen marcador de expresión fenotípica que posee el elemento P (en el caso del ejemplo citado,
moscas con una mutación en el gen white y que por lo tanto poseen ojos blancos). La inyección de
estos vectores se debe realizar junto a un vector llamado ayudante (o P Helper) que codifica la
transposasa, la cual cataliza el proceso y luego se degrada (Robertson y cols., 1988). Es importante
inyectar los embriones en la etapa de preblastodermo, ya que en esta etapa el embrión es un sincicio
y el DNA inyectado entra fácilmente a los núcleos. La inyección se dirige a regiones posteriores del
embrión, donde más tarde se formarán las células germinales (Spradling, 1986). Por lo tanto, si se
inserta el vector en éstas células se restaurará el color rojo en los ojos de la descendencia del
embrión inyectado. Más aún, si las secuencias insertadas efectivamente son regulatorias de la
transcripción serán capaces de dirigir la expresión de los genes reporteros en un patrón equivalente
al del gen estudiado (Brivanlou y Darnell, 2002).
1.4.-Proteínas de andamio
En numerosos procesos fundamentales en organismos pluricelulares, como la diferenciación
celular, la formación de tejidos y la transducción de señales, se requiere de sitios de asociación que
posibiliten el contacto entre células. Dichos sitios de asociación se constituirán gracias a las
proteínas de andamio, que se caracterizan por poseer dominios modulares de interacción proteína5
proteína, por formar complejos proteicos de alto peso molecular, y por estar ancladas a regiones de
la membrana plasmática a través de su interacción con proteínas de membrana (Garner y cols.,
2000a). De este modo se organizarán con especificidad y eficiencia complejos proteicos
macromoleculares en los sitios de unión celular. Dichas organizaciones presentan reversibilidad en
respuesta a señales externas o propias del desarrollo (Koh y cols., 1999).
Una familia de proteínas de andamio de gran importancia en el desarrollo y fisiología de
numerosos tejidos corresponde a las proteínas MAGUK (“Membrane Associated Guanylate
Kinase”), involucradas en las uniones estrechas de epitelios, zonas activas presinápticas y
densidades postsinápticas (Garner y cols., 2000b).
1.5.-Discs-large (dlg)
Discs-large (dlg) de Drosophila melanogaster fue el primer gen descrito que codifica para
una proteína de la familia MAGUK (Woods y cols., 1989). El gen dlg codifica para una proteína
que se define como supresora de tumores, debido a que sus mutantes presentan un crecimiento
neoplásico del epitelio de los discos imaginales de larva. Estos discos son los responsables de
generar las distintas estructuras del adulto (Woods y Bryant, 1991). Las mutantes de este gen
mueren en estadios larvarios o al alcanzar el estado pupario tardío dependiendo de la severidad de
los alelos portadores (Woods y Bryant, 1989).
En vertebrados se han descrito cuatro proteínas MAGUK del tipo DLG: SAP-97, PSD-93,
SAP-102 y PSD-95 (Figura 3). Estas proteínas se expresan en las sinapsis centrales y periféricas y
regulan la organización y plasticidad sináptica al interactuar con receptores de glutamato, moléculas
de adhesión y elementos del citoesqueleto. Por ello son llamadas proteínas de la densidad post
sináptica (PSD) o proteínas asociadas a sinapsis (SAP) (Fanning y Anderson, 1999). SAP-97 es la
proteína homóloga de DLG de Drosophila, tanto por secuencia como por la reversión del fenotipo
mutante de Drosophila en epitelio, como en la unión neuromuscular (Thomas y cols., 1997).
6
MAGUKs
Mamífero
Drosophila
FIGURA 3: Familia de proteínas MAGUK similares a DLG de Drosophila
Esquema de la estructura proteica de los miembros de la familia MAGUK tipo DLG y sus dominios
) representa los dominios PDZ, que se unen a la región carboxilo terminal
proteicos característicos. (
de proteínas de membrana, permitiendo que éstas se localicen en regiones particulares de la célula a
), dominio guanilato quinasa (GK), sin
través de la unión al citoesqueleto) . ( ), dominio SH3. (
actividad catalítica y ( ), dominio L27, que es un dominio variable en la región amino terminal
(Adaptado de Funke y cols., 2005).
7
1.6.-Función de dlg en el epitelio y en el sistema nervioso
dlg se expresa en las células epiteliales donde es responsable del mantenimiento de la
polaridad, formando parte de las uniones septadas de insectos, que son equivalentes funcionales de
las uniones estrechas entre células de los organismos cordados. En estas uniones dlg es importante
para su mantención y para la localización de otras proteínas propias de esta estructura (Tepass y
cols., 2001, Woods y cols., 1996).
En el sistema nervioso, se ha descrito que la pérdida completa de dlg (componente materno
y cigótico) conlleva a graves defectos en la neurogénesis y en el establecimiento de la conectividad
neuronal del sistema nervioso del embrión (Perrimon, 1988).
Durante la embriogénesis dlg actúa en el establecimiento de la polaridad apico-basal del
epitelio embrionario, en la división de los precursores neurales o neuroblastos (Ohshiro y cols.,
2000, Peng y cols., 2000), y en la asimetría planar de las células precursoras de los órganos
sensoriales periféricos de la larva y el adulto (células SOP), (Bellaiche y cols., 2001). En la sinapsis
neuromuscular de la larva dlg tiene un rol en el mantenimiento estructural y funcional de la sinapsis
neuromuscular (Budnik y cols., 1996), la que se ha aceptado como modelo de sinapsis central por
ser glutamatérgica.
1.7.-dlg y sus variantes de procesamiento alternativo
Debido a que las diversas técnicas experimentales han sido dirigidas hacia los dominios
SH3-GK y los dominios PDZ1-PDZ2, las funciones descritas de dlg han sido atribuidas sólo a
DLGA (Woods y cols., 1991, Koh y cols., 1999). Sin embargo, se ha demostrado que dlg presenta
al menos cinco transcritos de diferente tamaño molecular, cuyos sitios de inserción de exones
alternativos son los mismos que se han descrito en vertebrados (Figura 4). (Wu y cols., 2000).
Un grupo de transcritos codifica para un dominio amino terminal ausente en DLGA llamado
L27, que sirve como una plataforma para la formación de grandes complejos moleculares (Feng y
8
cols., 2004, Doerks y cols., 2000). Es así como a partir del uso alternativo de diferentes promotores
en un mismo gen se pueden obtener distintos productos.
A)
B)
Figura 4. Variantes originadas del locus dlg.
A). Estructura genómica de dlg. Los círculos grises indican los exones ausentes en el transcrito DLGA. Las flechas
verticales negras marcan las putativas posiciones de los sitios de inicio de la transcripción deducidos de los extremos 5’
terminal de varios grupos de clones EST y cDNA. El cuadrado rojo es la porción 3´ del gen tim8. Las barras azules son
exones y las flechas naranjas son exones de gran tamaño. La secuencia fue obtenida de www.flybase.org y analizada en
el programa Vector NTi.
B). Composición de los transcritos de dlg aislados, incluyendo DLGA. Cada caja enumerada representa un exon
traducido, mientras que las cajas con letras muestran los exones no traducidos. Las cajas sombreadas indican las
secuencias nuevas que están ausentes en el transcrito DLGA Las barras rosadas indican la región del cDNA utilizada para
la generación de los anticuerpos anti-DlgPDZ1-2 (Koh y cols., 1999) y anti- DlgS97N.. Debajo de cada transcrito se indica la
estructura de la proteína deducida (dominios característicos) y su masa molecular (MW) calculada (Mendoza y cols.,
2003).
9
1.8.-DLGS97 en el sistema nervioso
A diferencia de la expresión de DLGA, que se expresa en el epitelio, neuronas y músculo,
DLGS97 se expresa en forma creciente, durante el desarrollo en tejido neuronal y músculo
somático, pero está ausente en el epitelio. Su expresión comienza a evidenciarse desde estadios
embrionarios tardíos (estadio 12) descartando una contribución materna. En este estadio la
expresión aparece en lo que será en el futuro el cordón ventral, que se confirma en el estadio 13
donde posteriormente DLGS97 se expresa en el cerebro. En el cerebro del adulto en comparación al
de la larva, la expresión aumenta en los lóbulos ópticos, estructuras donde su expresión es débil en
la larva. No se observa expresión de DLGS97 en células gliales de cerebro de larva, ni de adulto
(Albornoz y cols., 2007).
Esta expresión creciente de DLGS97 da cuenta de su requerimiento a medida que se
desarrolla el sistema nervioso.
Dado que existen distintas isoformas tejido específicas originadas de dlg y que no se sabe
cómo se regula la expresión de dlg, nos hemos planteado la siguiente hipótesis:
En Drosophila melanogaster existen zonas regulatorias de la transcripción del gen dlg
que son responsables de la expresión tejido específica de este gen y que dirigen su expresión
en neuronas y en células epiteliales.
10
OBJETIVOS
1.7 OBJETIVO GENERAL
Identificar secuencias regulatorias que determinan que los productos del gen dlg se
expresen diferencialmente en células epiteliales o neuronales.
1.8. OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.- Identificar por métodos informáticos posibles regiones regulatorias en regiones del
gen dlg.
2.- Amplificar estas zonas por PCR y clonar y subclonar las secuencias escogidas en
vectores apropiados para la inyección en embriones.
3.- Inyectar embriones con DNA plasmidial e identificar las moscas que tengan
inserciones. Determinar el cromosoma en que se incorporó el transgen mediante mapeo.
4.- Observar los patrones de expresión de EGFP en las cepas transgénicas.
11
MATERIALES Y METODOS
A.- Materiales
2.1.- Biología molecular
-Cloroformo (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Alcohol isopropílico (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Etanol (Merck, Darmstadt, Alemania).
-DEPC, Dietilpirocarbonato (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).
-Oligo dT (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU).
-dNTPs, desoxinucleotidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Boehringer, Mannheim,
Alemania).
-MgCl2 50Mm. (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU).
-DNA Polimerasa Taq (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU).
-Agarosa ultrapura (Fisher Scientific, Bridgewater, New Jersey, EE.UU).
-Bromuro de Etidio (GIBCO BRL, Carlsbad, California, EE.UU).
-Aceite Mineral (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).
-1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU).
-Amortiguador de electroforesis TAE 1X (Tris-acetato/EDTA): tris-acetato.
-Ampicilina (Fisher Scientific, Bridgewater, New Jersey, EE.UU).
-Placas de LB y Cultivos líquido de LB.
-Cloruro de Calcio (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).
-Enzima de restricción Sac II (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).
-Enzima de restricción Sal I (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).
-Enzima de restricción Sac II (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).
-Enzima de restricción Xho I (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).
-Enzima de restricción Kpn I (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).
-Enzima de restricción Eco RI (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).
12
-Vector pH-Stinger (Barolo y cols., 2000 ).
-Vector pH-Pelican (Barolo y cols., 2000).
-Vector pGemT easy (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).
-Vector pbluescript SK(+) (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.).
-QIAgen Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Stanford, California, EE.UU.).
-QIAgen maxiprep (QIAGEN, Stanford, California, EE.UU.).
-Promega wizard (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).
-Miniprep extracción de geles (QIAGEN, Stanford, California, EE.UU.).
-Cromosoma artificial bacteriano (BAC) con el gen dlg (www.fly base.org).
2.2.- Transgénesis en Drosophila
-Vector helper p∆2-3 (Gentileza del Dr. Alvaro Glavic, Laboratorio de Biología del Desarrollo,
Facultad de Ciencias, Universidad de Chile).
-Portaobjetos (Marienfeld, Lauda-Königshofen, Alemania).
-Estirador de capilares (Sutter Instrument Co., Novato, California, EEUU).
-Capilares de borosilicato con filamento (Sutter Instrument Co, Novato, California, EEUU).
-Aceite Halocarbonado (Halocarbon Products Corp., New Jersey, EE.UU.).
-Placas de recolección para embriones.
-Levadura (Lefersa SA., Santiago, Chile)
-Microscopio campo claro Olympus CX31 (Olympus, Center Valley, Pennsylvania, EE.UU).
-Microscopio de epifluerescencia Nikon eclipse e400 (Nikon Instruments, Melvilla, Nueva York,
EE.UU.).
-Cinta adhesiva doble faz (3M, St Paul, Minnesota, EE.UU.).
-Inyector picopump (Word Precision Instruments, Sarasota, Florida, EE.UU.).
-Hipoclorito de Sodio (Clorinda S.A., Santiago, Chile).
13
2.3.- Inmunohistoquímica
-Paraformaldehido (PAF) (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).
-Tritón X-100 (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).
-PEM (100 mM PIPES como sal disódica, 2 mM EGTA y 1 mM MgSO4) (Stock del laboratorio
de neurobiología celular y molecular).
-Suero de cabra (GIBCO BRL, MD, California, EE.UU).
-Amortiguador fosfato de sodio 0,1 M (Na2HPO4 0,2 M, NaH2PO4 0,2 M, H2O pH 7,2).
-PT: Amortiguador fosfato de sodio, Triton X-100 0,3%.
-PBTG: Amortiguador fosfato de sodio, Triton X-100 0,3%, suero de cabra 5%.
-Metanol (Merck, Darmstadt,Alemania).
-n-heptano (Merck, Darmstadt,Alemania).
-Glicerol (Merck, Darmstadt,Alemania).
-Elastomero de silicona Sylgard 184, para placas de disección de larvas y adultos (Dow Corning
Corporation, Midland, Michigan, EE.UU).
-Pinzas N°5 Dumoxel no magnéticas (World Precision Instruments, Sarasota, Florida, EE.UU.).
-Tijeras quirúrgicas. (World Precision Instruments, Sarasota, Florida, EE.UU.).
-Alambres de tungsteno. (World Precision Instruments, Sarasota, Florida, EE.UU.).
-Medio de montaje para fluorescencia Vecta Shield (Vector Lab, Burlingame, California,
EE.UU).
-Microscopio confocal Zeiss LSM Meta 510.
-Microscopio spinning disc Olympus DS-BXWI100 (Olympus, Center Valley, PA, EE.UU).
14
2.4.-Anticuerpos
Anticuerpos primarios:
-Anti-GFP. Anticuerpo monoclonal de ratón especial para localización inmunohistoquímica de
GFP. Número de catálogo A-11120 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.).
-Anti-GFP. Anticuerpo policlonal de conejo. Número de catálogo A-11122 (Molecular Probes,
Eugene, Oregon, EE.UU.).
-Anti-Elav. Anticuerpo monoclonal
de rata que reconoce la proteína Elav de Drosophila.
Número de catálogo 7E8A10 (Hybridoma Bank, Iowa City, Iowa, EE.UU).
-Anti-Repo. Reconoce la proteína Repo, factor de transcripción requerido para la diferenciación
de la Glia. Número de catálogo 8D12 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.).
Anticuerpos secundarios:
-Anti-IgG (H+L) de conejo conjugado con FITC. Número de catálogo 711-095-152. (Jackson
InmunoResearch Labs, West Grove, Pensilvania, EE.UU).
-Anti-IgG (H+L) de rata conjugado con Cy3 Número de catálogo 112-165-068. (Jackson
InmunoResearch Labs, West Grove, Pensilvania, EE.UU).
-Anti-IgG (H+L) de ratón conjugado con Rodamina Cy3 Número de catálogo 115-295-166
(Jackson InmunoResearch Labs, West Grove, Pensilvania, EE.UU).
-Anti-IgG (H+L) de ratón conjugado con FITC. Número de catálogo 115-195-150 (Jackson
InmunoResearch Labs, West Grove, Pensilvania, EE.UU).
15
2.5.-Cepas de Drosophila melanogaster
Las cepas usadas de moscas fueron mantenidas a 18ºC en botellas o viales con medio de
cultivo preparado en base a levadura fresca, glucosa, harina y agar. Trabajamos con las siguientes
cepas:
-Yw (yellow-white): Esta línea de moscas posee una mutación del gen white. Este gen se denomina
así porque su ausencia se refleja en el fenotipo de ojos blancos, en lugar de los ojos rojos de la
mosca silvestre. Al inyectar en esta línea los vectores de transgénesis podemos reconocer la
inserción por un cambio en el fenotipo.
-Cyo/If ; Mkrs/ Tm6b: Posee dos cromosomas marcadores con mutaciones visibles en el fenotipo,
estos son If (irregular facet) que en el fenotipo se manifiesta con ojos de facetas irregulares o
rugosos, y Mkrs (Mn (minute), kar(karmoisina), ry(rosy), sb(stubble ), que se manifiesta con quetas
notoriamente más cortas y gruesas que la mosca silvestre. Posee dos cromosomas balanceadores,
los que tienen inversiones importantes que impiden la recombinación; estos cromosomas
balanceadores son letales en homocigocis, y son visibles en el fenotipo como Cyo (curly oyster),
que manifiesta alas curvas, y Tm6b (third multiple 6b), que muestra un exceso de quetas en la
región del húmero. Estas cepas se utilizan para mapear una inserción, es decir, identificar el
cromosoma en el que ocurrió, mediante cruzas con la mosca transgénica (ver resultados, figura 13)
-Líneas transgénicas: Fueron generadas mediante la inserción de los vectores pH-Pelican y pHStinger con las secuencias escogidas clonadas en ellos (ver secuencias escogidas en la figura 7), en
embriones yw en estadio de pre-blastodermo. La localización de la inserción se mapeó mediante
cruzas con Cyo/If; Mkrs/ Tm6b y se estudiaron los embriones, los cerebros de las larvas del tercer
estadio y los cerebros de las moscas adultas (Figura 5).
16
Fig 5. Esquema del ciclo de vida de Drosophila melanogaster
Etapas del desarrollo desde el embrión hasta la mosca adulta. Barra 1000: µm
17
B.-Métodos
2.6.-Vectores de expresión pH-Pelican y pH-Stinger
Los vectores pH-Pelican y pH-Stinger se utilizaron para integrar las construcciones
generadas al genoma de la mosca. La incorporación al genoma ocurre debido a que estos vectores
poseen secuencias repetidas invertidas que permiten su inserción en el genoma en un proceso
catalizado por la enzima transposasa. La enzima no es codificada por el vector y debe ser
coinyectada en otro vector. Es decir, la transposasa se incorpora como un elemento P y la
integración ocurre al expresarse el gen del vector que codifica la transposasa.
Para reconocer la incorporación en el genoma, estos vectores cuentan con el gen white que
produce la restauración del fenotipo de color de ojo rojo al integrarse en el genoma de la mosca
white(-) que será inyectada. La región genómica es clonada río arriba del promotor mínimo HSP 70
seguido por la secuencia del gen lacZ que codifica una β-galactosidasa citosólica que por lo tanto
muestra contornos celulares (vector pH-Pelican) o la secuencia que codifica para EGFP (“enhanced
green fluorescent protein”) con una secuencia de localización nuclear (pH-Stinger). Toda esta
construcción está flanqueada por secuencias aislantes (Geyer, 1997), de modo de reducir el efecto
de la heterocromatina y bloquear promotores y silenciadores que pudieran encontrarse en la región
de inserción del vector (Figura 6).
Si las secuencias escogidas se comportan como activadoras de la expresión serán capaces de
dirigir la expresión de lac Z o egfp en el patrón de expresión de dlg.
18
Figura 6: Vectores pH-Pelican y pH-Singer
Las cajas negras con la letra P representan secuencias de transposición de elementos P, los
círculos con la letra I a las secuencias aisladoras de la transcripción. El rectángulo pequeño
adayacente a la primera secuencia aisladora de izquierda a derecha para ambos vectores refiere el
sitio de múltiple clonamiento. Las flechas indican el sentido de la transcripción del gen. La
cabeza de flecha negra indica secuencias de localización nuclear (Adaptado de Barolo y cols.,
2000).
19
2.7.- Estrategia de clonamiento de las secuencias a los vectores de inyección
Las zonas escogidas (Figura 7), candidatas a ser reguladoras de la transcripción de dlg y
subzonas de las mismas, se amplificaron a partir de un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que
contenía la región cromosomal de dlg, mediante la reacción de polimerasa en cadena (PCR) con
partidores diseñados para estas zonas (Tabla1). Los once fragmentos amplificados se aislaron y
separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. Luego
se ligaron al vector de productos de PCR pGEM-Teasy que provee sitios de restricción Sac II y Sal
I. Luego se transformaron células E. coli XL1 y se subclonaron posteriormente en pBluescript SK
ligando los insertos obtenidos mediante las digestiones SacII y Sal I (Figura 8). Se usaron estos dos
vectores para obtener los sitios de restricción adecuados para trabajar con enzimas que no cortaran
las secuencias. Se extrajo este vector de las células bacterianas, se transformaron y clonaron los
fragmentos a los vectores pH-Pelican y pH-Stinger siguiendo una estrategia de restricción común
para todos los fragmentos. Esta consiste en digerir el vector pBluescript con Sac II y Xho I y ligar
los insertos a los vectores de inyección digeridos con las mismas enzimas. Este procedimiento se
repitió en todos los casos, excepto para dos de las construcciones debido a que poseen sitios
internos Xho I (Figura 8), los cuáles fueron digeridos con Sac II y Kpn I y ligados a los vectores de
inyección digeridos con estas enzimas. Los plasmidios pH-Pelican y pH-Stinger fueron inyectados a
embriones de estadio de pre blastodermo de Drosophila, que poseen todos los elementos necesarios
para insertarse en el genoma de la mosca, excepto la enzima transposasa, que catalizó el proceso.
Esta se debió coinyectar con un plasmidio “helper” p∆2-3 que la codifica.
20
Figura 7: Ubicación de los partidores de las zonas escogidas para el estudio de la regulación de la
transcripción de dlg
Esquema del gen dlg completo. En azul se muestran los exones más pequeños y en naranja, los de mayor tamaño. En verde
se muestran las posiciones en el gen de los partidores usados. (b) y c) son ampliaciones de a), de las zonas del gen en las
cuales se diseñaron los partidores. Las flechas azules muestran los amplicones obtenidos al combinar los
partidores. La secuencia fue obtenida de www.flybase.org y analizada en el programa Vector NTi.
Tabla 1. Secuencias partidores para las construcciones realizadas
Nombre partidor
Secuencia
Orientación
dlg1
CACTTACACAGACATACCCAAACGC
5´-3´
dlg2
TCCGTGACGATCGATAGGTGG
3´-5´
dlg3
GCTTCTTATTTGACTTGTTCGTTGG
5´-3´
dlg4
TGACCACATGGTGATCGTTCAGT
3´-5´
dlg5
TAGATTTGTTCGCTTAATCGACACC
5´-3´
dlg6
TGGAGAAGGTTTGAGGAACACG
3´-5´
dlg7
CCTATTTTTATGGTCCACGAGTCCT
3´-5´
dlg8
CCGCTTGGTCAGTGTTCACTG
5´-3´
dlg9
AATGCATTGTGTTGTAATCCTTTGC
5´-3´
dlg10
GCAGTGCCTTTGGCTTGATAACTT
3´-5´
21
Figura 8: Estrategia de clonamiento de las secuencias
De arriba hacia abajo se muestra el sentido en que se clonaron las secuencias amplificadas por PCR, las que se
clonaron a pGem-T easy y subclonaron en pBluescript SK previas a ser clonadas en los vectores pH-Pelican y pHStinger
22
2.8.- Transgénesis en Drosophila por inyección
Para los experimentos de transgénesis por inyección se realizaron cambios de las placas de
recolección de embriones yw (carentes de gen white que codifica para el color de ojo rojo de la
mosca) cada una hora, 4 veces previo al inicio de la inyección, mientras se preparaba la mezcla de
vector de transgénesis junto al plasmidio “helper” que se inyecta el mismo día. Se centrifugó una
alícuota de esta mezcla a 12.000 x g durante 30 min (generalmente unos 5 µl) mantenida a –20º C
en tampón de inyección, se separó el sobrenadante, y se centrifugó a 12.000 x g durante 10 min, de
modo de no arrastrar impurezas que puedan tapar la aguja. La mezcla se mantuvo a 4º C previa a
ser inyectada. Se prepararon las agujas para la microinyección con un estirador de capilares con
capilares de borosilicato con filamento y llenadas con alrededor de 2 µl de la mezcla. Para las
inyecciones se recolectaron los embriones por periodos de 30 min a temperatura ambiente, lo que se
repite hasta tener doscientos embriones inyectados exitosamente, es decir que no dejen escapar
citoplasma al ser inyectados. Luego se descorionaron con solución de hipoclorito de sodio al 50%
durante 3 min, y se alinearon sobre una placa de agar (Figura 9A y B) y se eliminaron los no
alineados pues como no se inyectan pueden desarrollarse sin ser transgénicos (9C). Se adhirieron en
una placa portaobjeto con cinta adhesiva doble faz (Figura 9D), y se secaron entre 3-6 minutos en
silicagel, tiempo determinado empíricamente cada día de la inyección. Luego se cubrieron con
aceite halocarbonado y se inyectaron utilizando un inyector Picopump por el extremo posterior en
estadio de una célula o pre blastodermo con el mínimo volumen necesario para observar una
aclaración de la parte posterior del embrión en el microscopio. Este cambio de aspecto refleja la
incorporación del líquido al embrión independiente a que se inserte o no (Figura 9E). Los
embriones que no estaban en el estadio de una célula no se inyectaron y se destruyeron. Los
embriones inyectados se dejaron a alrededor de 22 ºC en una cámara húmeda hasta alcanzar el
estadio de larva (Figura 9F), aproximadamente luego de unas 45 horas post inyección, y luego se
rescataron y traspasaron a viales con comida para moscas. (Spradling, 1986).
23
A
B
C
D
E
F
Figura 9: Protocolo de inyección de embriones de Drosophila
A) Muestra de embriones descorionados, los que se movilizan sobre una placa de agar con un asa de tungsteno. B)
Fila de embriones ordenados con la parte posterior hacia el mismo lado. C) Se remueven todos los embriones que
no fueron alineados y que no serán inyectados (D) La cinta adhesiva permite inmovilizar a los embriones que serán
inyectados. E) la flecha blanca muestra una aguja ingresando a la parte posterior de un embrión, F) Cámara (que
debe mantenerse en un ambiente húmedo) donde se depositan los embriones inyectados y se cubren con aceite
halocarbonado. Barra: 1000µm.
24
2.9.- Inmunohistoquímica de embriones
Recolectamos en una placa los embriones depositados durante toda la noche a 25ºC por
moscas adultas. Luego se descorionaron los embriones con una solución de hipoclorito de sodio
50% durante tres minutos y se lavaron posteriormente con agua destilada. Luego se preparó una
solución que contiene 162 µl de PAF 37%, 338 µl de PEM 1X y 500 µl de n-heptano, se agitó
vigorosamente durante 30 segundos y con ayuda de un pincel se introdujeron los embriones en ella
desde la placa, y se incubaron durante veinte minutos. Luego se eliminó la fase inferior y se agregó
metanol hasta alcanzar un volumen de 1 ml y se agitó vigorosamente durante treinta segundos, lo
que permite que caigan al fondo los embriones fijados y desvitelizados. Se descartó la fase superior,
se lavó tres veces con metanol y se realizaron tres lavados con agitación de 10 minutos cada uno
con PT. Luego se realizó el bloqueo con PBTG durante una hora sin agitar, para posteriormente
incubar toda la noche a 4ºC y con agitación suave con los anticuerpos primarios Anti-GFP (ratón) y
Anti-Elav (rata), que marca las células del sistema nervioso central y periférico en todas las etapas
del desarrollo, una vez que se han diferenciado a neuronas (Tabla 2). Al día siguiente se lavó tres
veces con PT bloqueando posteriormente con PBTG, y se incubó con los anticuerpos secundarios
fluorescentes Anti-ratón y Anti-rata, respectivamente (Tabla 2) durante una hora a temperatura
ambiente. Posteriormente se lavó tres veces durante 15 minutos con PT con agitación, se agregó
glicerol 50% y se incubó durante media hora, luego se agregó glicerol 70% y se incubó nuevamente
durante media hora. Finalmente se montó la suspensión de embriones en medio de montaje para
fluorescencia y se guardó a -20 ºC en oscuridad para observar posteriormente. (Sullivan y cols.,
2000)
25
2.10.- Inmunohistoquímica de cerebro de larva
Se disectaron las larvas de tercer estadio en placas de Petri de 60 mm mantenidas en hielo y
cubiertas con elastómero de silicona Sylgard 184, que contenían amortiguador fosfato de sodio pH
7,2. Utilizando pinzas y agujas de tungsteno se desprendieron los cerebros del resto de la larva,
mediante su tracción. Los cerebros así dispuestos se fijaron en paraformaldehido al 4% durante 30
minutos a temperatura ambiente. Después de lavar el tejido 3 veces durante 15 minutos con PT, los
cerebros se incubaron a 4°C durante toda la noche con los anticuerpos primarios Anti-GFP (ratón) y
Anti-Elav (rata), o bién con los anticuerpos Anti-GFP (conejo) y Anti-Repo (ratón) diluido en PT.
Luego se lavó 3 veces durante 10 minutos con PT y se incubó 2 horas a temperatura ambiente con
los anticuerpos secundarios fluorescentes Anti-ratón y Anti-rata, o bién Anti-ratón y Anti-conejo,
respectivamente. Finalmente se realizó el último lavado y los cerebros se montaron en medio de
montaje sobre un portaobjeto. Las muestras se guardaron a –20°C para su posterior análisis
(Sullivan y cols., 2000).
Tabla 2: Anticuerpos utilizados en experimentos de inmunohistoquímica
Anticuerpo
primario,
procedencia
Dilución
Anticuerpo Secundario
Dilución
Anti-Elav (Rata)
1:10
Anti-Rata
1:200
Anti-Repo (Ratón)
1:10
Anti-Ratón
1:200
Anti-GFP (Ratón)
1:200
Anti-conejo
1:200
Anti-GFP (Conejo)
1:1000
2.11.- Inmunohistoquímica de cerebro de mosca adulta
Se retiraron los cerebros de la cabeza abriendo ésta con pinzas desde los pliegues de la
probosis. Luego se fijaron 20 minutos en PAF al 4% y se lavaron tres veces durante 20 minutos con
PT, bloqueando luego con PBTG para luego incubar con los anticuerpos primarios Anti-GFP
(ratón) y Anti-Elav (rata) 4ºC durante dos días. Al término de esta incubación se lavaron con PT
tres veces durante 20 minutos y se incubaron con los anticuerpos secundarios fluorescentes Anti26
ratón y Anti-rata durante dos horas, lavando posteriormente con PT durante 20 minutos tres veces y
luego se aclararon en glicerol 70% durante una hora para trasladarlos al medio de montaje en un
portaobjetos. Las muestras se guardaron a –20°C para su posterior análisis (Sullivan y cols., 2000).
2.12.-Deconvolución de imágenes.
Se empleó el sistema Huygens profesional (Scientific volume imaging, Hilversum, Holanda)
para las imágenes obtenidas por microscopía de disco giratorio.
La deconvolución es una operación matemática. Se usa en restauración de señales para
recuperar datos que han sido degradados por un proceso físico que puede describirse
matemáticamente mediante la operación inversa, una convolución. Es el caso de imágenes de
dispositivos ópticos como los empleados en microscopía o astronomía, pero también en otros tipos
de sensores como los de medidas sísmicas.
En microscopía, la convolución modela matemáticamente el proceso de formación de una
imagen que sufre degradación por desenfoque y ruido. El desenfoque, aún en las mejores
condiciones, aparece inevitablemente en el límite de resolución del dispositivo debido a la
difracción en las lentes. Incluso con la mejor electrónica y gran habilidad del operador, las
variaciones de flujo inherentes a las propiedades estadísticas de los fotones producen imágenes
ruidosas, sobre todo en los límites de baja intensidad en que habitualmente se realiza la microscopía
de fluorescencia.
La restauración mediante deconvolución aplica el proceso inverso a la imagen degradada
para obtener una mejor representación del objeto real (Cheng, 2006)
27
RESULTADOS
3.1. Elección de dos posibles zonas regulatorias de la transcripción de dlg
Para escoger las posibles zonas regulatorias de la transcripción de dlg consideramos que este
tipo de zonas son susceptibles a la inserción de elementos P (Shen y Hirsh, 1994) (Figura 10 A) y
que además debería existir conservación entre especies para estas (Figura 10 B). Basándonos en
estos principios encontramos dos grandes regiones con estos criterios, una de ellas ubicada entre el
extremo 3´ del gen tim8 y el exón 1 de dlg, y la otra zona ubicada entre el inicio del exón 7, y el
exón 8. La primera zona mencionada es de 4894 pb y la denominamos dlg 5/6; la otra zona de 1899
pb la llamamos dlg 1/2 de acuerdo a los partidores diseñados que marcan el comienzo y el final de
la zona de dlg amplificada, respectivamente.
Nuestro interés se basó en encontrar las zonas regulatorias de la transcripción de dlg
acotadas que dirijan a la expresión de la isoforma neuronal (DLGS97) o a la epitelial (DLGA). Por
lo tanto, para las dos zonas anteriores encontradas se sintetizaron partidores dirigidos hacia
secuencias ubicadas dentro de estas zonas, de modo de obtener una gran cantidad de productos
amplificados que al ser inyectados en embriones de Drosophila nos den indicio de la capacidad
regulatoria de cada una de estas subzonas, y así poder definir acotadamente las zonas regulatorias
de la transcripción de dlg.
De esta manera obtuvimos once secuencias, tres de ellas pertenecientes a la zona dlg 1/2 y el resto
pertenecientes a dlg 5/6 (Tabla 3).
28
A)
B)
Figura 10: criterios para la selección de posibles zonas regulatorias de la transcripción
A.- Muestra el esquema del gen dlg con elementos P (triángulos), capaces de insertarse en el gen. Las dos zonas con
mayor susceptibilidad a elementos P aparecen con triángulos rojos y azules, y están incluidas en las zonas escogidas
para estudiar. (Esquema modificado de http://flybase.bio.indiana.edu/)
B.- Muestra el análisis de la zona escogida de mayor tamaño, correspondiente a dlg 5/6. Una vez identificada esta zona
como susceptible a la incorporación de elementos P (A), fue comparada con Drosophila pseudooscura secuenciada en
distintos años (1 y 2) y con Drosophila yakuba (3). Los picos son las zonas conservadas entre especies, los rojos
corresponden a intrones, los azules a exones y los celestes a exones no traducidos (análisis realizado en la página
http://pipeline.lbl.gov/serlet)
29
3.2. Clonamiento de las posibles zonas regulatorias de la transcripción de dlg
Las once secuencias regulatorias fueron amplificadas por PCR a partir de un cromosoma
artificial bacteriano que posee el gen dlg y clonadas en el vector para productos de PCR
pGemTeasy. Por análisis informáticos realizados con el programa Vector Nti encontramos los sitios
de restricción en las secuencias y de este modo pudimos constatar su correcta amplificación en
función de su patrón de restricción para la enzima Eco RI (Tabla 3, Figura 11). Los sitios presentes
en las secuencias nos permitieron diseñar una estrategia para subclonar nuestras construcciones en
los vectores de inyección pH-Pelican y pH-Stinger, con una construcción intermedia en el vector
pBluescript SK. (Materiales y métodos, Figura 8). Todas las construcciones fueron secuenciadas
parcialmente (aproximadamente 600 pb) desde el vector pBluescript SK y comparadas con la
secuencia de dlg en la página www.flybase.org para comprobar su identidad.
Finalmente se utilizaron los vectores, pH-Pelican y pH-Stinger para integrar las
construcciones generadas al genoma de la mosca.
Tabla 3: Tamaños esperados de las construcciones generadas y patrón de corte resultante de la
digestión con Eco RI en el vector pBluescript SK. (Análisis realizado en el programa Vector NTi)
Construcción
Tamaño
(pb)
Tamaños
linealizados
en pBluescript
(pb)
Tamaños de fragmentos de las
construcciones digeridas con Eco RI
(pb)
dlg 1/2
1899
4899
1219, 386, 294
dlg 1/4
1615
4615
935, 386, 294
dlg 3/2
640
3640
640
dlg 5/7
2238
5238
1655, 583
dlg 5/10
4217
7217
1975, 1659, 583
dlg 8/6
2717
5717
2236, 356
dlg 8/10
2015
5015
1659, 356
dlg 9/6
4586
7586
2336, 1975, 275
dlg 9/7
1975
4975
1655, 275
dlg 9/10
3920
7920
1975, 1659, 275
dlg 5/6
4894
7894
2336, 1975, 583
30
1Kb ladder
dlg-1/2
dlg-1/4
dlg-3/2
dlg-5/7
dlg-5/10
dlg-8/6
pBluescript
1Kb ladder
dlg-8/10
dlg-9/6
dlg-9/7
dlg-9/10
dlg-5/6
Figura 11: Visualización de las construcciones generadas a partir de las zonas regulatorias
Se muestran las bandas resultantes de la digestión con Eco RI para cada construcción clonada en pBluescript. La banda
de 3000 pb corresponde al vector linearizado. Las bandas de los fragmentos obtenidos (Tabla 3) son coincidentes con
los resultados esperados.
31
3.3. Inyección y mapeo de las secuencias
Inyectamos las construcciones dlg 1/2 y dlg 5/10 clonadas en el vector pH-Stinger. dlg 1/2
abarca la totalidad de la región escogida entre el exón 7 y 8 y dlg 5/10 abarca casi la totalidad de dlg
5/6 la zona 5´ escogida como regulatoria de dlg (Figura 7). Previo a ser inyectadas, verificamos que
las construcciones en el vector pH-Stinger fueran las esperadas mediante digestiones con Eco RI,
las que posteriormente se analizan en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 12).
Las moscas inyectadas pueden o no haber sufrido la inserción del elemento P, sin embargo
en la primera generación (F0) no se observan cambios fenotípicos en las moscas que nacen de los
embriones inyectados. Por esta razón, para obtener una línea transgénica, el elemento P se debe
incorporar en las células precursoras de la línea germinal con su gen marcador white y su gen
reportero egfp. Por lo tanto, el marcador sólo se podrá observar en la siguiente generación (F1)
proveniente de la cruza entre las moscas F0 y moscas yw. En esta descendencia habrán moscas de
ojos rojos y moscas de ojos blancos, siendo las de ojos rojos de nuestro interés, pues indicarán la
incorporación del elemento P.
Una vez identificadas las líneas transgénicas con inserciones, es importante determinar el
cromosoma en el cual ocurrió la inserción, para tener la posibilidad de estudiar líneas distintas en
homocigosis o incluso aumentar el número de copias de la inserción. Para esto se cruzan las moscas
F1 con moscas balanceadoras, las cuales al tener inversiones en sus cromosomas (marcados además
con mutaciones viables que dan un fenotipo visible) impiden la recombinación, resultando una
generación F2 con la inserción incorporada en forma estable. Las líneas balanceadoras poseen la
mutación white que da un fenotipo de ojos blancos que hace posible seguir la presencia en el
genoma de un cromosoma con un elemento P en la descendencia. De esta cruza sólo interesan las
moscas que manifiesten el balanceador para el cromosoma 2 (Cyo) en el fenotipo (alas curvas) y
que posean la inserción del elemento P (ojos rojos) para el cromosoma 3 (Tm6b). Cruzando
posteriormente F2 con moscas yw, se puede determinar el cromosoma en que se insertó el elemento
P mediante el análisis de los fenotipos obtenidos (Figura 13).
32
Para ambas construcciones inyectadas encontramos varias líneas, las que fueron mapeadas.
Se analizó líneas con inserciones en los tres cromosomas principales (X, 2 y 3), y observamos que
todas las líneas analizadas para cada construcción presentaron una expresión característica, muy
similar entre sí, reflejando que esta expresión es proveniente de las zonas clonadas en el vector, y
no depende del lugar de inserción. Conservamos las líneas que expresaron EGFP con mayor
intensidad (Tabla 4, Figura 14). Estas líneas corresponden a la cepa 15 para dlg 5/10, y a la cepa 2
para dlg 1/2. Con estas líneas escogidas se realizaron posteriormente los análisis de microscopía
confocal de los estudios de inmunofluorescencia realizados en estadios tardíos de embriones, en
cerebros de larvas y en cerebros de las moscas adultas.
1Kb ladder
dlg-1/2
1Kb ladder dlg-5/10
pH-Stinger
Figura 12: Construcciones dlg 1/2 y dlg 5/10 en pH-Stinger digeridas
con Eco RI.
En el gel de agarosa 0,8% se muestran las bandas resultantes al digerir las construcciones
dlg 1/2 y dlg 5/10 clonadas en el vector pH-Stinger con la enzima de restricción Eco RI.
Las bandas de 11500pb corresponden al vector pH-Stinger y las otras bandas concuerdan
con datos de la digestión con esta enzima arrojados por el programa Vector NTi (Tabla
3).
33
Fo Genotipo transgénico
F1 Genotipo transgénico
F2 Utilizar las de fenotipo
ojos rojos y doble
X 2P 3
;
;
Y 2 3
X
X 2P 3
;
;
Y 2 3
X
X Cyo Tm6b
;
;
X
Y 2P
3
X Cyo Tm6b
;
;
2
3
moscas de ojos rojos Y
F3 No se observarán
X Cyo 3
;
;
Y 2 3
X 2 3
; ;
X 2 3
X Cyo Mkrs
;
;
X If Tm6b
X
2 3
; ;
X
2 3
X 2 3
;
;
Y 2P 3
X 2 P Tm6b
;
;
Y 2
3
Mutación en cromosoma 2
Figura 13. Determinación de la ubicación cromosómica de la inserción del
elemento P
Este esquema ejemplifica la manera de mapear una mutación en Drosophila melanogaster.
Se muestra en Fo una mosca transgénica macho cuya inserción no es visible en el fenotipo (encerrada
en un rectángulo con la letra P que indica incorporación del elemento P) proveniente de un embrión
inyectado, que se cruza con yw hembra (x/x; 2/2 ;3/3). En F1 la descendencia de la cruza anterior con
ojos rojos (encerrada en un rectángulo) se cruza con la doble balanceadora. En F2 se muestra las moscas
doble balanceadas y transgénicas (encerradas en un rectángulo) las que se deben cruzar con hembras
yw. En F3 se muestran los genotipos visualizables en los fenotipos esperados. Por análisis de estos
fenotipos se puede concluir que la inserción del elemento P ocurrió en el cromosoma 2.
34
Figura 14. Expresión de algunas de las líneas transgénicas en cerebro de larva
Se observa la expresión de EGFP de algunas de las líneas encontradas tanto como para dlg 5/10 (cuadros superiores)
como para dlg 1/2 (cuadros inferiores). Se observa que la expresión de EGFP es más fuerte en la línea 15 para dlg
5/10 y en la línea 2 en el caso de dlg 1/2. Barra: 200µm.
Construcción
Cepa
Cromosoma
dlg1-2
29
2.
dlg1-2
32
2.
dlg1-2
8
3.
dlg1-2
2
2.
dlg1-2
24
3.
dlg1-2
12
2.
dlg5-10
3
2.
dlg5-10
5
X
dlg5-10
15
3.
dlg5-10
19
3.
dlg5-10
38
X
Tabla 4: Líneas obtenidas y cromosomas en que se insertó el elemento P
Se muestran las distintas líneas transgénicas obtenidas para cada construcción. Tras analizar
la expresión de cada línea. Las construcciones indicadas en rojo corresponden a las líneas que
expresaron GFP con mayor intensidad, las que conservamos.
35
3.4. Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el estadio embrionario de Drosophila melanogaster
Debido a que en la embriogénesis dlg actúa en el establecimiento de la polaridad apicobasal de la división de los precursores neurales o neuroblastos, hicimos experimentos de
inmunofluorescencia en estadios tardíos del desarrollo embrionario para observar la expresión de
EGFP nuclear dirigida por nuestras construcciones. Para ello los embriones fueron recolectados y
descorionados para la penetración de los anticuerpos.
Comparamos la expresión del anticuerpo Anti-GFP (verde) con el Anti-Elav (rojo) (Figura
15 A y D). Este anticuerpo está dirigido contra Elav, un factor de transcripción que se expresa en
todas las neuronas (Robinow y cols., 1988).
No hubo expresión de EGFP en estadio embrionario para dlg 1/2 (Figura 15 B) ni para dlg
5/10 (Figura 15 E) en la etapa embrionaria, a pesar de que los antecedentes atribuyen funciones a
dlg en este estadio. Este resultado corresponde a la totalidad de una de las zonas escogidas, dlg 1/2,
y a 680 pb menos de dlg 5/6, la otra gran zona más río arriba de dlg, lo que sugiere diferentes
explicaciones. Las regiones escogidas podrían tal vez no estar dirigiendo la expresión a causa de ser
zonas regulatorias tardías, o bien, dentro de las mismas zonas existan zonas represoras de la
transcripción. En el caso de dlg 5/10, esta secuencia podría ser una secuencia interrumpida de un
regulador de mayor tamaño, sin descartar el resto de las posibilidades.
36
Figura 15: Inmunofluorescencia de dlg1/2 y dlg5/10 en embriones de Drosophila melanogaster
A y D: Inmunofluorescencia con anticuerpo Anti-Elav (marcador neuronal).
B y E: Inmunofluorescencia con anticuerpo Anti-GFP.
A-C: dlg 1/2
D-F: dlg 5/10
C: Colocalización de (A + B)
F: Colocalización de (D + E).
Barra: 200 µm.
37
3.5. Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en cerebro de larva de Drosophila melanogaster
A pesar que en estadio embrionario no encontramos expresión de EGFP dirigida por dlg 1/2
ni por dlg 5/10, decidimos investigar si durante el desarrollo hay cambios en la expresión dirigidos
por nuestras secuencias.
Se seleccionaron larvas del tercer estadio, a las cuales se les extrajo el cerebro unido al
cordón ventral para realizar experimentos de inmunoflorescencia usando los mismos anticuerpos al
igual que en estado embrionario.
En el caso de dlg 1/2 observamos en un microscopio de disco giratorio que hay expresión
generalizada en las células cerebrales; esta expresión es predominantemente neuronal, pues en las
zonas donde hay núcleos bien definidos en los cerebros marcados con Anti-Elav y Anti-GFP se
observa gran colocalización (Figura 16 D), a diferencia de otras regiones del cerebro donde la
marca de los anticuerpos es más difusa y se podría atribuir a que los anticuerpos no penetraron en
las células. No observamos colocalización en células gliales (Figura 16 O).
Para dlg 5/10 la expresión fue mucho más acotada que la expresión de dlg 1/2, dirigiendo la
expresión en muy pocas células del cerebro y en el cordón ventral (Figura 16 F y J). Tanto en
cerebro como en el cordón ventral se observó un patrón de expresión simétrico.
La expresión de dlg 5/10 no mostró colocalización con la expresión de Elav (Figura 16 G y
H), ni mostró colocalización mediante microscopía confocal con el anticuerpo Anti-Repo (Figura
16 K y L), un marcador nuclear de células gliales. Estos resultados indican que dlg 5/10 es una
secuencia que dirige la expresión en epitelio, a pesar de ser la zona río arriba de la isoforma S97N,
que se localiza en el sistema nervioso.
Los resultados obtenidos muestran expresión tardía de ambas posibles secuencias
regulatorias, y sólo la construcción dlg 5/10 dirigió la expresión de un tipo celular no perteneciente
al sistema nervioso, a pesar de ser muy acotado, a diferencia de dlg1/2 que dirige la expresión en
células neuronales al colocalizar con Elav que es un marcador panneuronal.
38
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
Ñ
O
D
Figura 16: Expresión de dlg1/2 y dlg5/10 en cerebro de larva de Drosophila melanogaster
Se muestran experimentos de inmunofluorescencia para larvas de tercer estadio de Drosophila melanogaster.
De A a H: Imágenes obtenidas mediante microscopio disco giratorio.
De I a O: Imágenes obtenidas mediante microscopio confocal.
A y E: Marca con el anticuerpo Anti-Elav (marcador neuronal).
B y F: Marca con el anticuerpo Anti-GFP para dlg 1/2 y dlg 5/10, respectivamente.
C y D: Colocalización de (A+ B). G y H: Colocalización de (E + F).
I y M: Anticuerpo Anti-Repo (marcador de célula de la glia).
J y N: Anticuerpo Anti-GFP para dlg 5/10 y dlg 1/2, respectivamente.
K y L: Colocalización de (I+ J).
Ñ y O: Colocalización de (M + N).
Barra: 50 µm.
39
3.6. Expresión de dlg1/2 y dlg5/10 en el cerebro de Drosophila Melanogaster adulto.
En la siguiente etapa decidimos evaluar si los patrones encontrados con ambas
construcciones en el cerebro de larva se mantienen o modifican en el cerebro de adulto. Para ello
analizamos la expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en cerebro de mosca adulta mediante reacciones de
inmunoflorescencia con los mismos anticuerpos Anti-GFP y Anti-Elav.
Al extraer los cerebros de adulto no es posible extraer junto con éste el cordón ventral como
en el caso de la larva, pero de todos modos en el cerebro de adulto es posible analizar mantenciones
o modificaciones del patrón de expresión.
Para ambas construcciones se conservó el patrón de expresión encontrado en estadios
larvales. En la Figura 17 C y D se observa que la expresión de dlg1/2 ocurre en el cerebro completo
al igual que en estadios larvarios, y se observa una amplia colocalización con el marcador neuronal
Elav en las células de Kenyon, mientras que dlg5/10 no dirigió la expresión hacia células
neuronales (Figura 17 G y H), manteniendo el patrón acotado de expresión encontrado en el cerebro
de larva.
40
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 17: Expresión de dlg1/2 y dlg5/10 en el cerebro de Drosophila melanogaster adulto.
Se muestran experimentos de inmunofluorescencia para cerebros de mosca adulta.
A y E: Marca con el anticuerpo Anti-Elav (marcador neuronal).
B y F : Marca con el anticuerpo Anti-GFP para dlg 1/2 y dlg 5/10, respectivamente.
C y D: Colocalización de (A+ B).
G y H: Colocalización de (E + F).
Barra: 50 µm.
41
DISCUSIÓN
El gen dlg produce diversas isoformas de localización tejido específico, en un proceso que
involucra el uso alternativo de promotores a partir de del reclutamiento de factores de transcripción
tejido específicos. En este trabajo estudiamos el rol regulatorio de zonas de este gen. Para ello
insertamos estas posibles secuencias regulatorias en el vector pH-Stinger y luego analizamos su rol
regulatorio mediante la capacidad de dirigir la expresión del gen reportero EGFP.
dlg 1/2 y dlg 5/10 dirigen la expresión de EGFP
Podemos atribuir un rol regulatorio a las secuencias inyectadas, pues observamos expresión
de EGFP dirigida por ellas, lo que se evidencia con la expresión similar para las distintas líneas que
poseen la misma construcción. Otra evidencia que apoya esta función regulatoria es la expresión
diferencial de las líneas que poseen construcciones diferentes, independiente de la región del
genoma en que fueron insertadas (Tabla 4, Figura 14). Aunque la región donde se insertó del
elemento P no influenció la expresión de las secuencias inyectadas, pudimos constatar que la región
donde se inserta el elemento P sí es importante, puesto que también obtuvimos líneas estériles
(datos no mostrados). Por otra parte, no pudimos obtener líneas homocigotas para las secuencias
dlg 1/2 ni dlg 5/10, diseñadas para observar mayor expresión de EGFP, lo que nos indica que la
inserción en estos casos pudo haber interrumpido genes importantes para la mosca. Por la expresión
diferencial observada para cada construcción, se puede descartar que la producción de EGFP se
deba al promotor mínimo del vector. Además hay evidencia de que la expresión dirigida por el
promotor mínimo del vector de inyección ocurre sólo en glándulas salivales de larva. (Zhu y
Halfon, 2007). Ambas secuencias clonadas en el vector pH Stinger fueron capaces de reclutar
entonces los factores de transcripción presentes en los distintos tipos celulares para dirigir la
producción de EGFP. La orientación en que se incorporaron nuestras secuencias al vector no
debería afectar su poder regulatorio, puesto que se ha descrito que los enhancers contienen
elementos bidireccionales que asisten la transcripción (Muller y cols., 1988).
42
dlg 1/2 dirige la expresión exclusivamente en el tejido nervioso
Hemos encontrado que la zona dlg 1/2 dirige la expresión en células neuronales desde
estadios larvarios. En el cerebro de la larva la expresión de EGFP inducida por esta construcción es
casi exclusivamente neuronal (Figura 16 A y B), ya que se observó una co-localización casi
completa con el marcador panneuronal Elav (Figura 16 C y D). En la inmunofluorescencia del
cerebro de larva con el Anticuerpo Anti Elav y Anti GFP se puede observar que para ambos casos
existen marcas difusas de los anticuerpos. Estas marcas se descartaron por ser inespecíficas, puesto
que ELAV es un factor transcripcional de localización nuclear, por lo que la marca principal debería
estar sólo en el núcleo. En la Figura 16 C y D resaltamos la zona en la cual los núcleos se visualizan
bien definidos para ambas marcas mediante la técnica de inmunofluorescencia. Utilizando los
mismos anticuerpos e inmunofluorescencia en el cerebro de mosca adulta, la amplia co-localización
se manifiesta mejor, puesto que los núcleos se marcaron de forma más definida. Sin embargo, aún
en este caso, a pesar de ser muy amplia la co-localización no fue total, al igual que en el cerebro de
larva (Figura 17 C y D). Esto podría deberse tal vez a que EGFP, a pesar de tener una señal de
localización nuclear, también se encuentre en el citoplasma y que por esto aparezca como marca
difusa en el corte óptico por microscopía confocal, a diferencia de Elav que es un marcador nuclear
por excelencia.
En el experimento de inmunofluorescencia de cerebro de larva con los anticuerpos AntiGFP y Anti-Repo no se observó co-localización alguna en ninguno de los planos del eje z de las
imágenes obtenidas por microscopía confocal (Figura 16 Ñ y O). Esto descarta que la secuencia dlg
1/2 dirija la expresión en células gliales, y es concordante con resultados recientes de nuestro
laboratorio en los cuáles no se observa expresión de DLGS97, la isoforma neuronal, en las células
de la glia (Albornoz y cols., 2007). En el gen dlg la secuencia dlg 1/2 se encuentra río arriba del
inicio de transcripción de la proteína Dlg-A, que, como se ha descrito, es la isoforma de dlg
epitelial.
43
dlg 5/10 dirige la expresión en un grupo celular reducido no neuronal
Para el caso de la construcción dlg 5/10, ésta no dirige la expresión en el sistema nervioso,
dado que no co-localizó con el marcador neuronal (Figura 16 G y H), ni el glial en el cerebro de
larva (Figura 16 K y L). La expresión de EGFP dirigida por dlg 5/10 mantuvo el mismo patrón en el
cerebro del adulto, donde tampoco se observó co-localización con ELAV (Figura 17 G y H). Esta
expresión se presentó sólo en grupos acotados de células, tanto en cerebro de larva como de adulto.
Similar al caso de dlg 1/2, la expresión no se evidenció desde el estadio embrionario. Esta secuencia
corresponde a la zona río arriba de la isoforma neuronal de dlg.
La expresión dirigida por dlg 1/2 en células neuronales y la expresión dirigida por dlg 5/10
en un grupo de células acotado sin identidad con neuronas ni células de la glia, así como la ausencia
de expresión en estadios embrionarios dirigidos por ambas secuencias y la ubicación en el gen dlg
de ambas secuencias, nos permiten postular distintas explicaciones:
Ambas secuencias se comportan como enhancers
Dado que dlg 1/2 dirigió la síntesis en sistema nervioso, y que dlg 5/10 dirigió la síntesis
parcial en células no neuronales, podemos sugerir que ambas secuencias podrían actuar como
enhancers a distancia para activar al promotor de las distintas isoformas de dlg. Se ha descrito que
los enhancers pueden encontrarse tanto río arriba como río abajo del inicio de transcripción de un
gen, y que pueden actuar a distancias que van desde 200 pb hasta varios Kpb, reclutando factores de
transcripción y produciendo cambios conformacionales en el DNA para acercarse a la zona
promotora y ayudar a la transcripción de genes. Tiene sentido entonces pensar que ambas
secuencias regularían la transcripción de ambas isoformas de dlg a larga distancia.
44
Ambas secuencias podrían estar reclutando parcialmente factores de transcripción
Se ha descrito que una de las diferencias entre un promotor y un potenciador, además de la
distancia del inicio de transcripción desde la que están ejerciendo su función, es la complejidad de
factores de transcripción que debe reclutar una zona potenciadora para realizar su rol (Lodish y
cols., 2004). Tal vez la capacidad de reclutamiento de estos factores en nuestras secuencias
regulatorias está siendo disminuida, tal vez por omisión de nucleótidos al momento de escogerlas,
dando como resultado una expresión acotada de EGFP para el caso de dlg 5/10, y ausente en
embriones tanto para dlg 1/2 como dlg 5/10. Como planteamos en la introducción, hay evidencia
que en la embriogénesis dlg actúa en el establecimiento de la polaridad apico-basal de la división de
los precursores neurales o neuroblastos (Ohshiro y cols., 2000, Peng y cols., 2000). Es necesario
considerar que tal vez en nuestras líneas transgénicas están ausentes los sitios de unión de factores
de transcripción que posibilitan la transcripción de EGFP en estadios embrionarios, descartando la
posibilidad de que sean enhancers de actividad tardía en el desarrollo. Es por ello que la expresión
obtenida con las dos secuencias estudiadas (de las cuales dlg 1/2 es la de mayor tamaño de una de
las zonas, y dlg 5/10 es parte de dlg 5/6, que es la secuencia de mayor tamaño de la región hacia 5´
de dlg), no basta para ser concluyente respecto del rol regulatorio de las zonas escogidas. Para el
caso de dlg 1/2 sería importante definir una zona más acotada, y que además fuera capaz de dirigir
la expresión de EGFP en embriones. Por ahora sólo podemos acotar la secuencia regulatoria
abarcada por dlg 1/2, ya que para encontrar expresión en embriones deberíamos tal vez incluir
secuencias no consideradas en los extremos 5´ó 3´ de dlg 1/2. Como se muestra en la Figura 7 C,
diseñamos partidores para zonas incluidas en dlg 1/2, como por ejemplo dlg 1/4 que abarca la zona
5´ en dlg 1/2, y dlg 3/2 que abarca la zona 3´ en dlg 1/2, de modo que si generamos transgénicos
con estas zonas, podremos comparar su expresión con la de dlg 1/2 y observar si persiste la
regulación de la expresión de EGFP.
Con nuestros resultados, junto con lo conocido acerca de la transcripción en eucariontes,
podemos plantear que para que ocurra la transcripción de las distintas isoformas de dlg, es necesaria
45
la unión de los factores transcripcionales tejido específicos a las zonas regulatorias de la
transcripción de este gen, lejanas al promotor de cada isoforma, causando un cambio
conformacional en el DNA que producirá el contacto con la RNA polimerasa II, mediado por un coactivador, incrementando la transcripción del mRNA correspondiente tejido epitelial y al neuronal,
produciendo así las isoformas características de cada tipo celular.
46
A) Rol regulatorio de dlg
B) Rol regulatorio de dlg
Figura 18: Modelo de regulación de la transcripción de las isoformas de dlg
A.- Muestra la secuencia dlg 5/10 uniendo factores transcripcion (
II (
) mediante un coactivador (
y
)interactuando con la RNA polimerasa
) y transcribiendo la isoforma no neuronal.
B.- Muestra la secuencia dlg 1/2 uniendo factores transcripcionales (
polimeras II (
,
)mediante un coactivador (
,
y
)
interactuando con la RNA
) y transcribiendo la isoforma neuronal.
47
CONCLUSIONES
1.- Hemos identificado secuencias del gen dlg capaces de dirigir la transcripción de EGFP en el
vector pH-Stinger, por lo que las podemos clasificar como zonas regulatorias.
2.- Se clonaron dos posibles regiones reguladoras del gen dlg que definen la destinación epitelial
o neuronal en D. melanogaster.
3.- Se obtuvieron moscas adultas transgénicas que presentaron las inserciones dlg 5/10 y dlg 1/2,
las cuáles fueron analizadas en este trabajo.
4.- La zona regulatoria dlg 1/2 dirigió la expresión en células neuronales, extendidas por el cerebro
de larva y mosca adulta, pero no se expresó en embriones. Por su lejanía de la isoforma neuronal,
podemos clasificar a esta zona como potenciadora de la transcripción de DLGS97.
5.- La zona regulatoria dlg 5/10 dirigió la expresión en células no neuronales, desde estadíos
larvarios, estando ausente en embriones. Esta zona no es clasificable por la expresión acotada que
presentó.
6- Debido a la ausencia de expresión en embriones para dlg 1/2 y para dlg 5/10, y a la acotada
expresión de dlg 5/10 en larvas y en adultos, podemos concluir que estas zonas están
interrumpidas en su funcionalidad para dirigir la expresión de las distintas isoformas de dlg.
48
PROYECCIONES
1.- Encontrar a partir de estas secuencias, la zona regulatoria más acotada.
2.- Identificar los elementos que son capaces de unirse a estas zonas.
3.-Identificar a qué grupo pertenecen las células que expresaron nuestras construcciones.
4.- Buscar otras zonas en el gen que tengan un carácter regulatorio.
49
REFERENCIAS
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