fodecyt 2001.14

INFORME FINAL
PROYECTO 1401
Recolección, aislamiento e identificación de cepas de bacterias nativas
de Jutiapa y Chimaltenango, del género Rhizobium kguminosarum biovar
phaseoü, para el aprovechamiento de la fijación biológica de nitrógeno
en el cultivo de frijol.
Unidad ejecutara: ICTA/FODECYT
-
Período: Enero 2003 Enero 2004
Investigsaores
Ing. Agr. Juan José Soto Dominguez
Inga Agra. Alma Maritza García Chaclán
Guatemala, mayo 2004
RECONOCIMIENTO
Tesista Srita. Claudia Lorena Cmanza Meléndez
Por su apoyo en la fase de microbiología
Laboratorio de Análisis h4icrobiológicos y de Referencia
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia
Universidad de San Carlos de Guatemala
Por permitir el uso de sus instalaciones para este proyecto
Ing. Agr. Edgar Edgardo carrillo
Por su colaboración en la etapa de campo
INDICE
.
No de órden
1 INTRODUCCION
No.Página
01
.
.....................................................-....................................
2. ANTECEDENTES..........................................................................................
O1
3. OBJETIVOS....................................................................................................
08
4. HIPOTESIS.....................................................................................................08
5. METODOLOGIA. ..............-.................
....................................................... O8
5.1 Reconocimiento preliminar de áreas............................................................
09
5.2 Contacto con agricultores y visitas de campo..............................................09
. de nódulos.................................................................................. 10
5.3 Recoleccion
5.4 Preparación de muestras de nódulos in situ...............-..-................,..........10
5.5 Aislamiento de los rizobios de los nódulos...................................................10
r
5.6 Identificación de Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli ....................... 10
..
................................................................................ 11
5.8 Toma de muestras de suelo......................................................................... 11
5.9 Análisis de suelos...........................................................................................11
5.10 Trabajos de gabinete...................................................................................12
6. RESULTADOS............................................................................................... 12
6.1 Resultados de microbiología..,............... .....................................................12
6.2 Resultados del muestreo de suelos...............................................................15
7. CONCLUSIONES ......................................................................................... 25
8. RECOMENDACIONES ............................................................................... 26
5.7 Preservacion de la cepas
9. BIBLIOGRAFIA
.
11.FOTOGRAFIAS
10 ANEXOS
RECOLECCION, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE CEPAS DE
BACTERIAS NATIVAS DE JUTIAPA Y CHIMALTENANGO DEL GENERO
Rhizobium leguminosarum, biovarphaseoli, PARA EL APROVECHAMIENTO DE
LA FIJACION BIOLOGICA DE NITROGENO EN EL CULTIVO DE FRIJOL
Ing. Agr. Juan José Soto Domínguez *
Inga. Agra. Alma Maritza García Chaclán*
RESUMEN
La ejecución del proyecto se realizó a través de la recolección, aislamiento e identificación
de cepas de Rhizobium nativas de nuestro país y la ubicación de zonas geográficas donde
existe mayor disponibilidad de las mismas, con el propósito de aprovechar la capacidad
que poseen de formar asociaciones simbióticas con las leguminosas.
Con el aprovechamiento de la fijación biológica de nitrógeno se tiene un beneficio social al
reducir los costos de producción, ya que la misma influye directamente en la baja del
consumo de fertilizantes químicos nitrogenados, y un beneficio ambiental al evitarse la
contaminación de los recursos suelo y agua causada por las fuentes químicas de nitrógeno.
El objetivo principal del proyecto fue el de aislar e identificar cepas de bacterias nativas de
Rhizobiurn de los departamentos de Jutiapa y Chimaltenango.
Como resultado se obtuvieron 111 muestras de nódulos de las cuales se lograron aislar 64
cepas, que según su reacción el laboratorio nos indica que son bacterias sospechosas de
pertenecer al género Rhizobium; según su reacción 4, no pertenecen al género rhizobium y
36 fueron negativas. Las bacterias sospechosas fueron sometidas a prueba de infectividad
en 6 diferentes diluciones y en medio estéril para observar su infectividad en semillas
desinfestadas de frijol de la variedad ICTA Hunapú.
De las 64 cepas aisladas, únicamente se comprobó que 21 cepas sospechosas, sí pertenecen
al género Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, ya que el resto se vio afectada por
problemas de contaminación por hongos en las semillas y por falta de tiempo en el proyecto
no fue posible realizar nuevas infecciones con las cuales hubiéramos obtenido un mayor
número de cepas.
Se realizaron determinaciones de macro y micronutrimentos, potencial de hidrógeno,
contenido de materia orgánica y clase textura1 a 11 1 muestras de suelo, determinándose
que los suelos donde se efectuaron los muestreos de suelo y nódulos son suelos con buena
fertilidad. Para textura se determinó que para el departamento de Jutiapa los suelos son
predominantemente de textura arcillo y franco arcillo arenosa, y para Chimaltenango las
texturas predominantes fueron franco arenosa y franco arcillo arenosa.
Según análisis estadístico, solamente se encontró correlación entre el contenido nutricional,
el pH y el contenido de materia orgánica, dentro de las muestras de suelo donde crecieron
los nódulos de donde se aisló cepas de Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli.
* Investigadores de ICTA
Con esta investigación se desea despertar una mayor conciencia del papel que juega la
fijación simbiótica del nitrógeno atmosférico en la producción de leguminosas, y por otra
parte, que sirva como fuente de referencia para la aplicación de la técnica cuyo objetivo
final es llegar al agricultor. Dado el carácter interdisciplinario del tema, profesionales de
diferentes especialidades estuvieron directamente involucrados en el mismo.
Palabras Claves: Rhizobium, frijol, fijación biológica, cepas, nódulos.
1. INTRODUCCION
El frijol, (Phuseolus vulguris L.) denominado como Mesoamericano, tiene su centro de
origen en Guatemala y el Sur de México y al igual que el Maíz, han pasado por una serie
de procesos en su evolución y domesticación, tanto como el proceso morfológico de la
planta, como su cultivo, a tal forma que actualmente en la mayoría de los casos, éstos se
han convertido en especies con bondades agronómica sobresalientes, principalmente para
el componente rendimiento, y estas sólo se logran con grandes cantidades de fertilizante
químico, lo cual viene a afectar dos aspectos, como lo son: el económico, aumentando en
forma considerable los costos de producción, principalmente en los últimos años que el
precio se ha incrementado considerablemente, afectando al pequeño y mediano agricultor.
El otro aspecto, quizás, sea el más importante, es el daño que ocasiona al contaminar el
medio ambiente, principalmente a fuentes de aguas, tanto subterráneas, así como la que
provoca a ríos, lagos y océanos por escorrentía.
Dentro de las necesidades más urgentes que se han determinado en países en desarrollo,
está la de encontrar alternativas para una buena producción de frijol, sin usar como fuente
de Nitrógeno, fertilizante químicos. Una buena
alternativa está en lograr una buena
simbiosis entre cepas de bacterias del género Rhizobium y genotipos de frijol (Phuseolus
vulguris L.)
2. ANTECEDENTES
En estudios anteriores efectuados por el ICTA y Facultad de Agronomía de la Universidad
de San Carlos de Guatemala, con apoyo de PNUD y del CIAT en Cali Colombia; se
evaluaron cepas de rhizobium provenientes de CIAT y del CIA de la Universidad Nacional
de Costa Rica, seleccionándose algunas cepas para las localidades donde se evaluaron, pero
el comportamiento de éstas es bastante
irregular, debido a múltiples factores,
a características de suelo, como: textura, composición química y pH. Así
como temperatura y precipitación de 10s lugares donde se evaluaron.
Pero el principal aspecto, es lograr una buena simbiosis entre leguminosa-rhizobium
principalmente si este fuera con cepas nativas, puesto que están viviendo en su mejor
medio y cualquier cepa que se introduzca no puede competir con ellas, principalmente por
su adaptación al medio y por el número de bacterias que existen en el suelo. Sin embargo
algunas de las cepas nativas no son tan efectivas, mientras que otras son bastante
competitivas y efectivas. Así como el papel que juega una planta receptiva que favorezca
la formación de nódulos en mayor cantidad para facilitar la fijación de nitrógeno del aire.
La fijación de Nitrógeno ocurre por la asociación simbiótica que establece la planta con
algunas bacterias de la familia de las Rhizobiaceae; estas bacterias infectan las raíces de la
planta e inducen la formación de nódulos radicales, en el interior de las cuales se realiza la
fijación, con la intervención de la enzima nitrogenasa, localizada en el interior de los
rizobios. Las bacterias le ceden el nitrógeno fijado a la planta y a su vez, ésta le suministra
al nódulo los carbohidratos que provee la energía necesaria para el proceso de fijación.
Por ser un proceso en el cual intervienen dos organismos diferentes
-
una planta
(leguminosa) y una bacteria (rizobio)- el estudio y manejo de esta asociación simbiótica
requiere del trabajo de agrónomos y microbiólogos.
El nitrógeno está presente en los tejidos verdes de las plantas en concentraciones
relativamente altas (entre 1 y 4%), y en algunas semillas en concentraciones mayores, por
lo que se le considera un macronutriente primario, junto con el fósforo y el potasio.
Aunque, en general, los suelos minerales tienen contenidos totales de nitrógeno muy
superiores a los requeridos por los cultivos, casi todo este elemento se encuentra en forma
de materia orgánica y anualmente sólo se mineraliza una pequeña fracción (1 a3% del
nitrógeno total (3). Debido a esta liberación lenta del nitrógeno orgánico, el nitrógeno
frecuentemente se convierte en un elemento limitante para la producción de cultivos.
La conversión N2 a la forma reducida tiene una elevada demanda de energía, debido a la
estabilidad del enlace triple de la molécula de N2. Esta energía se requiere como energía de
activación, ya que la reacción completa libera energía. La reducción del N2 ocurre de dos
maneras: a nivel industrial, mediante el proceso de fabricación de fertilizantes, o a nivel
biológico. Por la fijación de nitrógeno atmosférico.
El proceso industrial utilizado para la fabricación de fertilizantes nitrogenados, denominado
proceso de HABER-bosch, tiene una demanda de energía debido a los requerimientos de
hidrógeno, alta temperatura y presión. Por ejemplo, el requerimiento para producir una
tonelada de amonio es de aproximadamente 1000m2de gas natural o aproximadamente una
tonelada de petróleo (87 barriles) (1 8).
La fijación biólogica de nitrógeno es un proceso que también implica una alta demanda de
energía, pero en este caso se obtiene de la radiación solar en condiciones ambientales de
temperatura y presión. Esto es posible debido a la presencia de la enzima nitrogenasa,
catalizadora d e 1 a reacción. d e aquí S e origina 1a i mportancia que t iene el proceso d e 1a
fijación biológica de nitrógeno para la agricultura y la necesidad de desarrollar una
tecnología adecuada para maximizar el aprovechamiento de este recurso.
Aspectos importantes que hay que tomar en cuenta en este estudio, es la presencia de
algunos compuestos orgánicos e inorgánicos de nitrógeno inhiben la fijación de N2. Esta
inhibición puede ser en tres niveles: en el primero, se inhibe la actividad de la enzima
nitrogenasa; en el segundo se inhibe la síntesis de nueva enzima por el producto final de la
reacción, el NH3, y por otros compuestos nitrogenados; y, en el caso de la simbiosis con las
leguminosas, ocurre un tercer nivel de inhibición, ya que la presencia de N mineral inhibe
la formación de nódulos radicales.
La familia Leguminosae es muy amplia, con alrededor de 750 géneros y una 20,000
especies, incluyendo plantas cultivadas, numerosos árboles, plantas herbáceas y arbustos,
las cuales desempeñan una función importante en diversos ecosistemas. Las leguminosas
tienen una importancia particular en la alimentación humana (granos) y animal (forrajes), al
igual que 1a e conomia d el nitrógeno d el S uelo, ya q ue 1a m ineralización d e S us r esiduos
constituye un aporte de nitrógeno disponible.
Las leguminosas se caracterizan por tener hojas compuestas, fmtos en forma de vaina y, la
mayoría de ellas, nódulos radicales fijadores de nitrógeno.
Según la clasificación de (24), la familia Leguminosae consta de tres subfamilias:
Papilionoideae, con aproximadamente 400 géneros y 14,000 especies, entre las cuales se
encuentran casi todas las leguminosa de importancia agrícola. Son plantas herbáceas,
raramente arbustos o árboles, la mayoría de ellas forman nódulos fijadores de nitrógeno.
Entre sus géneros están: Lupinus, Lotus, Arachis, Pisum, Phaseolus, Vigna, Glycine,
Centrosema, Pueraria, Stylosanthes.
Los rizobios son bacterias del suelo, caracterizadas por su habilidad para infectar las
leguminosas e inducir la formación de nódulos fijadores de N2 en las raíces.
Hasta hace poco se consideró que la familia Rhizobiaceae incluía dos géneros: Rhizobium
agrobacterium, sin embargo en el manual de Bergey (Jordan, 1984), el género Rhizobium
se subdividió en dos grupos, teniendo en cuenta la tasa de crecimiento la producción de
acidez o alcalinidad en medios de cultivo levadura manitol (LM), la disposición de los
flagelos, la composición de la base del ADN y los géneros de plantas hospedantes con las
cuales establecen simbiosis: En el género Brasyrhizobium, se ubicaron las bacterias de
crecimiento lento, que producen alcalinidad en medio LM. Las bacterias de crecimiento,
rápido, que producen acidez en medio de cultivo LM, se clasificaron en el género
Rhizobium; en adelante se denominará con el nombre común de "rizobios" a las bacterias
pertenecientes a los dos géneros.
La necesidad de combatir el hambre en el mundo, requiere básicamente la estrategia de una
producción de menor costo preservando al mismo tiempo los recursos naturales. Uno de los
medios más importantes para poner en marcha esta estrategia es la nutrición integrada de
las plantas, y se espera que en los años venideros los procesos biológicos contribuyan
sustancialmente al logro de tal objetivo.
El Rhizobium es un género de bacterias que tienen la capacidad de formar nódulos en las
raíces de las leguminosas, sin embargo,
no cualquier Rhizobium forma nódulos en
cualquier leguminosa, por esta razón el Rhizobiurn se clasifica en especies o grupos de
inoculación según las leguminosas que infecte. Los Rhizobium son bacterias del suelo y
sus diferentes especies existen en diferentes proporciones según el tipo de suelo y las
leguminosas que se cultivan en él.
Para el aislamiento y caracterización de Rhizobium del suelo es necesario utilizar la
leguminosa hospedera. Si el suelo contiene el Rhizobium específico para una leguminosa,
al sembrar la leguminosa formará nódulos. Entonces es posible extraer el Rhizobium
específico de esos nódulos.
Influencia del ambiente sobre la fijación biológica de nitrógeno
Existe una gran diversidad de factores ambientales que influyen directamente en la eficacia
de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, en la fijación de nitrógeno, entre ellos se pueden
mencionar los siguientes:
Nitrógeno inorgánico: La presencia de nitrógeno inorgánico en el suelo, procedente de
fertilizantes inhibe la fijación de nitrógeno. El tamaño de los nódulos y su cantidad es
menor cuanto existen niveles relativamente altos de nitrato y amonio. Por otro lado bajas
concentraciones de nitrógeno inorgánico estimula la nodulación (19).
pH del Suelo: En la mayona de leguminosas la infección de Rhizobium no ocurre en pH
menores a 5. El crecimiento de Rhizobium también se ve influenciado por pH bajos. Esta
inhibición de la simbiosis en suelos ácidos, se debe a la concentración de iones hidronio, a
la toxicidad resultante del hierro y aluminio principalmente (3 1,19).
Temperatura: la temperatura óptima de crecimiento de Rhizobium es de 30 grados Celsius
(25).
Fósforo y potasio: son macronutrimentos esenciales para el crecimiento de la planta, por lo
que su presencia en el suelo se asocia con leguminosas vigorosas y de buen crecimiento
macronutrimentos: El cobalto estimula marcadamente la utilización de nitrógeno
atmosférico por las leguminosas, se cree que esto se debe a que estimula la proliferación y
metabolismo de Rhizobium dentro de la raíz. Los micronutrientes son necesarios tanto para
la leguminosa como para Rhizobium, y por ende para una simbiosis efectiva (19,25).
Estudios realizados en Guatemala
En Guatemala, el primer estudio sobre Rhizobium fue realizado en 1974 por Aguilera, el
cual consistió en la evaluación de 14 cepas de Rhizobium phaseoli en tres variedades de
frijol común. De estas cepas evaluadas 8 fueron traídas del Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT) y 6 fueron cepas nativas de la colección del ICTA; algunas de
estas cepas nativas resultaron ser efectivas para las variedades de frijol estudiadas, en
cambio algunas cepas del extranjero no fueron efectivas, se piensa que se debe a las
condiciones ambientales diferentes (1).
En 1980, Pellecer evalúo la eficiencia relativa que se produce en el rendimiento de grano, al
inocular dos variedades de frijol común con cepas mixtas nativas comparadas con una cepa
estándar c omo c ontrol. Este e S u no d e 1os p rimeros e studios d e evaluación d e n itrógeno
reportados en Guatemala. Se obtuvieron muestras de plantas de Jutiapa y Parramos, se
esterilizaron nódulos, a partir de ellos se prepararon suspensiones para inocular en los
terrenos de frijol. Las cepas mixtas nativas mostraron ser eficientes, resaltando aquella
proveniente del suelo de condiciones más pobres (Parramos), sin embargo no superaron a la
cepa estándar CLAT 57. Es importante resaltar que en este estudio no se purificaron ni
identificaron las cepas nativas, ya que la evaluación se realizó directamente de
suspensiones de los nódulos recolectados (27).
CENTRO cc
En 1982, Méndez evaluó 9 cepas proporcionadas por el
CIAT, de las cuales dos
(CIAT 390, 407) resultaron ser las más eficientes para las variedades de fnjol utilizadas
(15)En 1 986, C ampos r ealizó u n n uevo e studio d e aislamiento d e R hizobium d e S uelos d e
Guatemala, Chimaltenango, Santa Rosa y Sacatepéquez. Se muestrearon un total de 28
suelos, lográndose aislar 26 cepas. Primero se realizó muestre0 de suelos, posteriormente se
sembró semillas de frijol en bolsas que contenían las muestras de suelo recolectadas, luego
se evaluó la eficiencia de fijación biológica de nitrógeno; y por último se procedió a aislar
las cepas de los mejores nódulos obtenidos (6). Posterionnente en un estudio realizado por
Miyares, se analizaron trece de las cepas nativas aisladas, su evaluación se realizó a nivel
de invernadero en jarras de Leonard, seleccionándose 4 cepas efectivas para las variedades
de frijol negro Quetzal y Jutiapan (22).
En 1988, Contreras evaluó en campo cuatro cepas de Rhizobium del CIAT, este estudio fue
realizado en conjunto con la facultad de agronomía, el Instituto de Ciencia y Tecnología
Agrícola (ICTA) y el CIAT. Dos cepas son procedentes de Colombia y dos son nativas de
Guatemala aisladas por Aguilera en 1980. De las cuatro estudiadas la CIAT 632 presentó
buenos resultados, y mostró ser capaz de competir con los fertilizantes nitrogenados en la
variedad de fnjol Quinak-ché (12).
Por último en 1990, Carrillo evaluó cuatro cepas procedentes del CIAT y las comparó con
una cepa nativa; dicha cepa nativa presentó un rendimiento muy alto (7).
Además se han realizado otros estudios sobre Rhizobium, relacionados con su producción a
gran escala para uso comercial; el estudio en 1990, realizado por Castellanos se basó en
comparar e 1 cultivo continuo a gran e scala d e una c epa d e R hizobium p haseoli ( ICAITI
0063), que fue seleccionada en base a su respuesta a la fijación biológica de nitrógeno.
Obteniéndose mayor beneficio con el cultivo continuo (8).
3. OBJETIVOS
3.1 General
Aislar e identificar cepas nativas de Rhizobium en dos zonas productoras de frijol
3.2 Específicos
3.2.1 Aislamiento del Rhizobium legurninosarum procedente de nódulos de plantas de
frijol para la identificación de cepas nativas de cada sitio muestreado.
3.2.2 Identificar las localidades con mayor variabilidad de cepas nativas del género
Rhizobium leguminosarum.
3.2.3 Determinar las caractensticas físicas y químicas de los suelos donde se realizó el
muestreo.
Hi
= Se logrará aislar cepas
del género Rhizobium
Hz = Las cepas aisladas de Rhizobium no pertenecen a Rhizobium leguminosarum biovar
phaseoli.
5. METODOLOGIA
Para la realización del proyecto de investigación fue necesario colectar nódulos de plantas
de frijol, así como la toma de muestras de suelo de los sitios donde se colectaron los
mismos.
Los departamentos de Jutiapa y Chimaltenango son dos grandes áreas productoras de frijol
por lo que se trabajó un total de 25 municipios: 13 municipios en Jutiapa y 12 municipios
en Chimaltenango. Dentro de los 25 municipios se ubicaron los puntos de muestreo, para
obtener al final 111 muestras colectadas tanto de nódulos procedentes de plantas de frijol
como de muestras de suelo.
Los Municipios muestreados fueron los siguientes:
JUTIAPA
Jutiapa, Quezada,
El Progreso,
Santa Catarina Mita, Asunción Mita, Atescatempa,
Yupiltepeque, Moyuta, Agua Blanca, Comapa, Conguaco, Zapotitlán y Jerez.
CHIMALTENANGO
Parrarnos, San Andrés Itzapa, San Martín Jilotepeque, Zaragosa, San Juan Comalapa,
Patzicia, Santa Cruz Balanyá, Patzún, Tecpán, Santa Apolonia, El Tejar y Chimaltenango.
Tanto el trabajo de laboratorio como de gabinete se desarrolló en el Laboratorio de Suelo,
Agua y Planta del ICTA (Bárcena, Villa Nueva), La Estación Experimental del ICTA en
Chimaltenango, y el Laboratorio de Microbiología de La Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacia de la USAC.
5.1 Reconocimiento preliminar de las áreas
En un reconocimiento preliminar se seleccionaron los municipios donde se sembró el
cultivo de frijol del cual se extrajeron los nódulos, así como la selección del sitio para la
toma de muestras de suelo.
5.2 Contacto con Agricultores y visitas de campo
Para la realización del proyecto se hizo necesario contar con la colaboración de los
agricultores productores de frijol, por lo que fueron visitados 243 agricultores, de los cuales
se logró una participación de 125 agricultores, sin embargo por razones inherentes al tipo
de trabajo, como cambio de cultivo a sembrar, únicamente fue posible contar con 111 de
ellos para la colecta de muestras de nódulos que servirán para la fase de aislamiento e
identificación de cepas de Rhizobiwn y la toma de muestras de suelo que sirvieron para la
identificación de las características fisico-químicas de los suelos donde creció el cultivo.
Además se realizaron constantes visitas de campo con el propósito de identificar el estado
de crecimiento vegetativo del cultivo de frijol en las parcelas seleccionadas y poder así
llevar un control sobre el momento adecuado de muestre0 (etapa de inicio de floración).
5.3 Recolección de Nódulos
Para la recolección de los nódulos que servieron para el aislamiento de Rizobios se
seleccionaron de 10 a 15 plantas vigorosas con hojas verdes y sanas, de las cuales se
tomaron alrededor de 50 nódulos vivos e intactos, preservándolos en frascos de vidrio con
material desecante (gel de sílica) hasta su siembra en el Laboratorio de Microbiología para
el aislamiento e identificación.
5.4 Preparación de muestras de nódulos in situ
Por ser necesaria la preservación de los nódulos para su traslado al laboratorio, se procedió
después de cada muestre0 a la separación de las raíces de la parte vegetativa de las plantas
de fiijol, a la limpieza del número de nódulos presentes en cada una de las raíces de las
plantas muestreadas, identificación, conservación en sílica gel y por último a su
almacenamiento en hieleras para su traslado final al laboratorio. (ver foto 1)
5.5 Aislamiento de los Rizobios de los nódulos
Esta etapa se realizó en el Laboratorio de Microbiología y la técnica utilizada fue la descrita
por Vincent, Somasegaran (30,28) y El Centro Internacional de Agricultura Tropical (10 );
en la cual se procedió a rehidratar los nódulos por 24 horas, luego se desinfectaron con
Hipoclorito de calcio al 3 % y se sembraron en Agar manitol-levadura más azul de
bromotimol. Las cajas se incubaron a 26 grados centígrados por 5 días. A las colonias
sospechosas s e 1es realizó 1a T inción d e Gram y 1 a p meba d e m ovilidad. Las c epas que
presentaron morfología colonial característica de Rhizobium, coloración amarilla
(producción de ácido) y además eran bacilos Gram negativo móviles, se consideraron como
bacterias sospechosas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli.
Estas cepas se
conservaron en tubos con agar manitol-levadura y aceite mineral. (ver foto 2)
5.6 Identificación de Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli
En e 1 Laboratorio d e S uelos
S
e realizó 1a fase de autenticación d e l os cultivos a islados
mediante la infección de semillas de frijol (Phaseolus vulgaris) por las cepas aisladas. Para
ello se utilizó la técnica de Número más probable (NMP), realizándose seis diluciones y
cuatro repeticiones por dilución. Además se utilizó como control negativo una planta de
cuatro repeticiones por dilución. Además se utilizó como control negativo una planta de
Phaseolus vulgaris sin infectar. Se consideró Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli,
aquellas que fueron capaces de inducir a la nodulación en las plantas de frijol común.
(ver fotos 3, 4,5,6,7 y 8)
5.7 Preservación de las cepas
Para conservar su estabilidad y viabilidad genética se preservaran las cepas en tubos con
agar manitol-levadura y aceite mineral, en condiciones adecuadas de temperatura.
(ver foto 9)
5.8 Toma de muestras de suelo
En cada uno de los lugares donde se colectaron los nódulos se realizó un muestre0 de
suelos con el propósito de identificar las condiciones fisicas y químicas donde se han
desarrollado los mismos.
Las muestras de suelo se trasladaron al Laboratorio de Suelo, Agua y Planta del Instituto de
Ciencia y Tecnología Agrícolas (ICTA) para la determinación de potencial de hidrógeno,
contenido de materia orgánica, clase textual, porcentaje de nitrógeno total, y contenidos de
fósforo, potasio, calcio, rnagnesio, cobre, hierro, manganeso y Cinc; de acuerdo a las
siguientes metodologías.
5.9 Análisis de suelos
Para la determinación de los parámetros involucrados se siguieron las siguientes
metodologías. (ver foto 10)
b
Determinación
Potencial de Hidrógeno
Contenido de Materia Orgánica
-Análisis Granulomético
-----
1:2.5 en agua
-----
~ouvoucos
Kjeldalh
Mehlich 1 (Colorimetna)
Mehlich 1 (EAA)
Mehlich 1 (EAA)
--A
5.10 Trabajo de Gabinete
Registro de datos,
análisis de información, discusión de resultados, elaboración de
informes parciales y final.
6. RESULTADOS
6.1 Resultados de Microbiología
-
MUESTRAS
Cepas sospechosas de Rhizobium aisladas de nódulos
Cepas no sospechosas de Rhizobium aisladas de nódulos
Muestras negativas
Muestras perdidas
TOTAL
--
CANTIDAD
---
PORCENTAJE
64
58
4
4
36
7
32
6
1 O0
111
En la tabla No. 1 se puede observar que se aislaron 64 muestras de bacterias sospechosas de
pertenecer al género Rhizobium Zeguminosarum biovar phaseoli y 36 muestras de 111 fueron
negativas ( 32%).
TABLA NO, 2 CEPAS AISLADAS SOSPECHOSAS DE Rhizobium leguminosarum biovar
phaseoli PARTIR DE NÓDULOS.
MUESTRAS
Cepas sospechosas de Rhizobium aisladas de nódulos ( ler análisis)
Cepas sospechosas de Rhizobium aisladas de nódulos 12do análisis)
TOTAL DE CEPAS
--
CANTIDAD
PORCENTAJE
48
75
25
1O0
16
64
Las muestras negativas durante el primer análisis de aislamiento, se sometieron a un segundo
análisis. Inicialmente se recuperaron 48 cepas, y con el segundo análisis 16 cepas más. El
índice de recuperación se aumentó en un 25 %, por lo que se puede decir que el número de
análisis realizados a las muestras aumenta la recuperación de las bacterias (tabla No. 2).
TABLA NO. 3 IDENTIFICACIÓN DE CULTIVOS SOSPECHOSOS DE Rhizobium leguminosarum
biovar phaseoli AISLADOS
1
DESCRIPCI~N
Cepas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli
Cepas sospechosas de Rhizobium leguminosarum
biovar ~haseolino infectivas
Cepas sin infectar
Cepas muertas
TOTAL DE CEPAS SOSPECHOSAS
CANTIDAD
PORCENTAJE
21
33
11
13
19
64
17
20
30
1O0
De las 64 cepas de bacterias aisladas sospechosas de Rhizobium leguminosarum
biovar phaseoli, el 33% (tabla No. 3) se identificó positivamente, pues fueron cepas capaces
de infectar la variedad de fijjol común estudiada ( ICTA-HUNAPU). Estas 21 cepas que
infectaron el fnjol común tienen alta probabilidad de ser Rhizobium leguminosarum biovar
phaseoli
El 17% (tabla No.3) no se identificaron como Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli pues
no fueron infectivas en plantas de fiijol. Pueden existir cepas que se encuentren naturalmente
en simbiosis con el frijol, pero que su capacidad de infección sea limitada. Otro aspecto que
puede afectar es la variedad de fnjol utilizada, ya que puede ser que no sea la óptima para
estas cepas que fueron negativas.
TABLA NO. 4 NUMERO DE MUESTRAS ANALIZADAS DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA
JUTIAPA
TABLA NO. 5 NUMERO DE MUESTRAS ANALIZADAS DEL DEPARTAMENTO
DE CHIMALTENANGO
1
1 San Martín Jilotepeque 1
1 ~atzún
Tecpán
Patzicia
Santa Polonia
6
2
2
2
2
O
O
1O 0
2
1
50
O
50
O
1
p
p
o
CHIMALTENANGO
Chimaltenango
( El Tejar
Parramos
San Andrés ltzapa
Santa Cruz Balanyá
Comalapa
TOTAL
1
1
1
1
1
3
23
o
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
21
l
Del departamento d e Ju tiapa S e obtuvieron 1 7 c epas ( t abla N o. 8 ), 1os municipios d e m ayor
cantidad de cepas fueron Jutiapa y Santa Catarina Mita; del municipio de Jutiapa se analizaron
25 muestras y de estas 6 fueron capaces de infectar, por lo que se obtuvo el 24 % de positividad.
Por otro lado de Santa Catarina Mita se analizaron 15 muestras y de estas 6 fueron capaces de
infectar, por lo que en este municipio el porcentaje de positividad ( 40%) es mayor que Jutiapa.
Entonces se puede decir que el municipio donde existió mayor porcentaje de cepas de Rhizobium
es Santa Catarina Mita. Además el tamaño nodular de estas 6 muestras oscilaba entre 3-4 mm.
Lo que indica que son nódulos muy activos, y estas cepas podrían resultar ser muy efectivas en la
fijación biológica de nitrógeno.
El resto de municipios (Comapa, Quezada, Agua Blanca y el Progreso) analizados presentaron de
1-2 cepas, debido a la cantidad de sitios muestreados.
En Chimaltenango, se recolectó menos muestras por municipio,
pues únicamente 23
corresponden a este departamento; de las cuales 5 cepas se probaron para infección, y cuatro de
estas fueron positivas, las cuales corresponden a Patzún, Tecpán y Santa Polonia.
lascepas más infectivas fueron
la 43, 41, 46, 23 y 31. Se dice que fueron las más infectivas
debido a que nodularon en casi todas las diluciones y repeticiones realizadas. Estas cepas de
infectividad alta podrían ser muy efectivas para la fijación de nitrógeno. Aunque no siempre
existe relación entre infectividad y efectividad. La cepa No. 41 fue aislada de la Aldea el
Quebracho 1, Santa Catanna Mita; la cepa 41 de La Barranca, Santa Catarina Mita; la cepa 46 de
El Ovejero 1, El Progreso; la cepa 23 de El Retiro 11, Quezada y la cepa 31 de La Lagunita 11,
Jutiapa.
Por otro lado el 34% de resultados negativos, se puede deber a los siguientes aspectos:
El hipoclorito de calcio es un desinfectante fuerte, que se utilizó para esterilizar la parte
externa de los nódulos, Si estos se encuentran dañados, el hipoclonto de calcio
penetra matando las bacterias que se encuentran en su interior.
El tamaño de los nódulos: 33 de las muestras negativas fueron nódulos con un diámetro
de 1-3 mm. Y según Quispel y Martin los nódulos activos son de mayor tamaño
Además según Quispel, las plantas pueden formar pseudonódulos; estos nódulos falsos
se forman debido a la proliferación de células corticales y epiderrnales; que ocurre con
Rhizobium incapaces de nodular al huésped especificado y podría darse con ausencia
de bacteria.
6.2 Resultados del muestre0 de suelos
El objetivo de esta actividad es el de evaluar el efecto de las caractensticas físicas y
químicas del suelo sobre la formación de simbiosis del cultivo de frijol (Phaseolus vulgaris
L.) con las bacterias del género Rhizobiurn 1 egurninosarurn, b iovar p haseoli. Trabajo
realizado conjuntamente con el estudio de aislamiento e identificación de cepas de
Rhizobium.
Se analizó un total de ciento once muestras (11 1) procedentes de los departamentos de
Jutiapa y Chimaltenango. Dentro de las características químicas del suelo, se procedió a
evaluar las condiciones nutricionales de los mismos, realizándose la determinación del
contenido de macronutrimentos (potasio, calcio, magnesio, fósforo y nitrógeno), y
micronutrimentos (cobre, hierro, manganeso y cinc).
Así mismo, fueron evaluados el potencial de hidrógeno (pH), contenido de materia
orgánica, contenido de arena, arcilla y limo y se les determinó la clase textura1
correspondiente, obteniéndose una amplia gama de valores por lo que fue necesario tomar
como referencia los diferentes rangos encontrados, según la localidad muestreadas. (ver
tablas)
Dentro de los resultados obtenidos no se encontró ninguna tendencia que permitiera
apreciar alguna correlación dentro de los parámetros evaluados y la presencia o ausencia de
bacterias del género Rhizobium leguminosarum, biovarphaseoli
TABLA NO. 6 RANGOS DE LOS MACRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN
LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA
Como se aprecia en las tablas No.6 y No. 7 al analizar el contenido de calcio, magnesio,
potasio, fósforo y nitrógeno de cada uno de los suelos donde fueron colectadas las muestras
de nódulos, se encontró que se tenían rangos muy variables ya que los valores para calcio
estuvieron dentro de 0.2 a 23.5 cmolkg, para potasio de 0.01 2 cmolkg, magnesio 0.01 a
9.8 cmol/kg, fósforo de 1 a 243 mg/kg. y el rango del porcentaje para nitrógeno que según
la literatura es uno de los factores determinantes estuvo del 0.05 a 0.4 %. En base a los
resultados anteriores, se dice que la fertilidad de la mayoría de los suelos muestreados es
alta.
Es importante mencionar que tanto para el departamento de Jutiapa como para
Chimaltenango se mantuvo esta característica de fertilidad
TABLA NO. 7 RANGOS DE LOS MACRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN
LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE CHIMALTENANGO
Municipio
Santa Cruz Balanyá
Patzicia
Patzun
Tecpán
Santa Apolonia
'san Martín Jilotepeque
Zaragosa
Comalapa
El Tejar
Parramos
San Andrés ltzapa
Chimaltenango
cmollkg
Calcio (Ca)
Cmollkg
potasio (K)
2.44 - 6.21
3.19 - 4.69
0.24 - 0.3
0.04 - 0.64
0.26 - 0.48
0.63 - 0.73
0.38 - 0.42
0.28 - 0.55
0.61
0.24 - 0.52
0.39 - 0.6
0.01
0.02
0.29
4.59 - 5.94
4.51 - 8.01
3.99 - 20.39
2.48 - 6.16
3.23
2.21 - 5.05
10.09 - 19.86
7.14
13.38
8.85
cmollkg
magnesio
(Mg)
0.03 - 0.07
0.05 - 0.07
0.04 - 0.1
0.04 - 2.04
0.01 - 0.05
0.03 - 0.04
0.04
0.02 - 0.1 1
0.59 - 1.23
0.24
0.87
0.54
mglkg
fósforo (P)
% nitrógeno
22 - 37
11 - 12
15-30
O1 - 08
54 -101
O1 - 10
42
04-11
21 - 146
14
1O
21
0.08 - 0.13
0.14
0.12 - 0.16
0.15 - 0.18
0.16 - 0.24
0.08 - 0.2
0.15
0.16 - 0.19
0.06 - 0.18
0.07
0.04
O. 1
(N)
TABLA NO. 8 RANGOS DE LOS MICRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN
LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA
En la tabla No. 8 se observa que los análisis del contenido nutricional del suelo tienen los
siguientes rangos para el contenido de micronutrimentos en el departamento de Jutiapa
como sigue, cobre 0.1 a 12 mgkg, hierro 0.2 a 29.5 mgíkg, manganeso de 0.02 a 80 mgkg
y cinc de 0.012 a 18 mglkg.
TABLA NO. 9 RANGOS DE LOS MICRONUTRIMENTOS ENCONTRADOS EN
LAS MUESTRAS DE SUELOS DEL DEPARTAMENTO DE CHIMALTENANGO
Municipio
Santa Cruz Balanyá
Patzicia
Patzún
Tecpán
Santa Apolonia
San Martín Jilotepeque
Zaragosa
Comalapa
,El Tejar
Parramos
San Andrés ltzapa
Chimaltenango
mglkg cobre
(Cu)
mglkg hierro
(Fe)
0.32 - 0.37
0.33 - 0.34
0.38 - 0.4
3.82 - 4.16
0.42 - 0.44
0.19 - 0.33
0.32
0.36 - 0.4
0.1 1 - 0.37
0.4
0.32
0.16
15.2 - 22.5
16.28 - 27.05
10.82 - 29.58
9.97 - 15.08
0.26 - 12.71
15.61 - 28.59
22.1 7
20.24 - 22.84
6.82 - 13.16
5.79
7.57
7.94
mglkg.
manganeso
(Mn)
3.5 - 6.39
2.91 - 14.46
9.75 31 .O4
15.05 - 24.57
25.48 - 32.39
8.85 - 41.71
10.93
9.64 - 22.48
6.99 - 21.1 7
0.01
4.95
2.67
-
mglkg cinc (Zn)
0.05 - 0.55
0.05 - 0.08
0.1 1 - 2.95
0.08
1.43 - 14.75
0.06 - 3.6
2.23
0.06 - O1
1.41 - 3.89
0.23
0.3
0.31
El análisis del contenido nutricional del suelo para el departamento de Chimaltenango
reportó los siguientes rangos para el contenido de micronutrimentos como sigue, cobre 0.1
a 4 mgkg, hierro 0.2 a 29.6 mgkg, manganeso de 0.01 a 32 mgkg y cinc de 0.05 a 14.71
mgkg.
En base a los resultados anteriores, se dice que 1a fertilidad de la mayoría de los suelos
muestreados es alta.
TABLA NO. 10 RANGOS DE LOS VALORES PARA POTENCIAL DE
HIDR~GENO,CONTENIDO DE MATEFUA ORGÁNICA Y CLASE TEXTURAL
PREDOMINANTE EN LAS ÁREAS MUESTREADAS EN EL DEPARTAMENTO
DE JUTIAPA
Municipio
Sta. Catarina Mita
Jutiapa
Cornapa
Moyuta
Quezada
Conguaco
Asunción Mita
Zapotitlán
Jerez
El Progreso
Agua Blanca
Atescatempa
Yupiltepeque
Potencial de
hidrógeno (pH)
4.67 - 6.72
4.8 - 8.09
4.75 - 7.34
4.7 - 6.44
4.91 - 7.51
5.03
4.15 - 6.01
4.99 - 5.69
% Materia
Orgánica (M.O.)
1.21 - 7.93
1.48 - 7.93
1.88 - 6.72
2.02 - 6.59
1.75 - 6.32
4.17
2.55 - 7.53
2.02 - 4.71
5.59 - 6.43
3.53 - 6.21
4.38 - 5.77
5.85 - 5.98
2.15 - 9.01
1-75 - 7.66
1-48 - 2.1 5
1.48 - 6.72
Clase Textura1 predominante
Arcilloso
Franco arcillo arenoso y arcillosos
Arcilloso
Arcilloso
Franco arcilloso y franco arcillo arenoso
Arcilloso
Franco arenoso y franco arcilloso
Franco arcillo arenoso y arcillosos
Franco arcillo arenosos
Franco arcilloso
Franco arenoso
Franco arenoso
TABLA NO 11. RANGOS DE LOS VALORES PARA POTENCIAL DE
H I D R ~ G E N OCONTENIDO
,
DE MATERIA ORGÁNICA Y CLASE TEXTURAL
PREDOMINANTE EN LAS ÁREAS MUESTREADAS EN EL DEPARTAMENTO
DE CHIMALTENANGO.
Municipio
Santa Cruz Balanyá
Patzicia
Patzún
Tecpán
Santa Apolonia
Zaragosa
Comalapa
San Martín Jilotepeque
El Tejar
Parramos
San Andrés ltzapa
Chirnaltenango
Potencial de
hidrógeno (pH)
5.49 - 5.55
5.45 - 5.64
5.68 - 5.82
5.5 - 6.32
5.05 - 6.6
5.05
4.94 - 5.39
4.76 - 6.32
4.69 - 4.85
4.89
4.58
4.8
% Materia
Clase Textura1 predominante
Orgánica (M.O.)
2.29 - 3.63
Franco arenoso
3.77 - 4.17
Franco arcillo arenoso
4.03 - 4.17
4.3 - 6.32
4.17
3.23 - 4.98
2.69 - 3.63
3.77 - 6.59
3.77
3.23
4.84
Franco arcillo arenoso
Franco arcillo arenoso
Franco arenoso
Franco arcillo arenoso
Arcilloso
Franco arenoso y franco arcillo arenoso
franco arenoso
Franco arcillo arenoso
franco arenoso
En las tablas No. 10 y No. 11 se muestran los rangos de los valores encontrados para el
potencial de hidrógeno, el contenido de materia orgánica y la clase textural predominante
tanto para el departamento de Jutiapa como para Chimaltenango respectivamente.
Estos resultados evidencian que para Jutiapa se reportaron valores de pH de 4.15 a 8.09, y
Chimaltenango de 4.6 a 6.6. Para el contenido de materia orgánica se tienen rangos de 1.2
% a 9% en Jutiapa y 2.2% a 6.6 % en Chimaltenango.
Para los municipios del departamento de Jutiapa , la clase textural predominante fue la
arcillosa, sin embargo se encontraron suelos franco arenosos, franco arcillosos, franco
arcillo arenosos según el municipio muestreado.
Para los municipios del departamento de Chimaltenango se obtuvo que la clase textural
predominante fue la Franco arcillo arenosa, encontrándose también suelos con clase
textural de franco arenoso, franco arcillosos.
En la siguiente tabla (tabla No. 12) que corresponde a las características fisicas y químicas
de los suelos donde se logró el aislamiento e identificación de Rhizobium leguminosarum
biovarphaseoli, tenemos que para el departamento de Jutiapa, en el municipio de Asunción
Mita el porcentaje de nitrógeno en el suelo estuvo dentro del rango de 0.1 % a 0.3 % ,
valor que corresponde a un moderado contenido de nitrógeno en suelo., el rango de pH se
mantuvo entre 5.1 a 6.7 y la clase textural predominante fue arcillosa, aunque también se
presentó la clase textural franco arcillosa. El contenido de materia orgánica en estos suelos
estuvo dentro del rango de 3% al 8 %, por lo que se le clasificó de moderado a alto
TABLA NO. 12 CARACTERIZACION FÍSICA Y QUÍMICA DE LAS NUESTRAS DE SUELO DONDE SE COLECTARON LAS
MUESTRAS DE NODULOS DE LOS CUALES SE AISLÓ Rhizobium leguminosarum, biovarphaseoli .
CARACTERISTICAS FlSlCO QUlMlCAS DE LOS SUELOS DE DONDE SE AISLO RHlZOBlUM
DEPARTAMENTO DE .JüTJAPA
Procedencia
Municipio
'sta.~ a t a r i n Mita
a
71itinna
La Cuesta del Guayabo 1
El Limón 1
La Unión
La Barranca
I E ~ Ouebracho
1
.
El Quebracho 11
Pozas de Agua
- 11
(pozas de Aeua
11
a
El Ovejero 1
Amavo Ingenio 1
Carrizal
I ~ í La
o Virgen 11
Jutiapa
Comapa
quezada
La Lagunita
11
Cantón Animas Lomas 1
Guachipilín 1
El Retiro 11
ktSlcatarina
Mita
----. S ~ Catarina
~.
Mita
ctl
Catarina
Mita
".-.
\ct, ratarina
---- Mita
sta. Catarina Mita
.,----
I
OI
DrnaTRSO
u1 I .u----
El Progreso
htiana
Jutiapa
IE~
CHIMALTENANGO
Municipio
Patzh
Patzun
Tecpán
Santa Apolonia
Procedencia
Saquiyá
San Jay
Chirijuyú
La Mejorana
K
Ca
1
1
1
1
1
8.22
11.62
8.07
11.09
15.18
16.14
7.83
15.21
5.04
7.72
546
5.16
-
1
I
1
(
1
1
1
1
0.42
0.86
0.15
0.71
0.61
0.38
0.28
0.48
0.39
0.31
0.69
0.01
Mg
1
I
1
1
1
Cu
3.03
0.52
0.05
0.03
0.06
0.13
0.07
0.01
0.00
0.02
0.06
0.02
0.17
0.41
0.39
0.43
19.57
20.38
15.43
5.99
1.34
0.53
0.51
0.71
0.73
0.00
84.46
0.32
0.45
0.46
0.41
0.27
Ca
K
Mg
Cu
5.94
4.59
8.01
20.39
0.48
0.26
0.73
0.38
0.04
0.10
2.04
0.01
0.38
0.40
3.82
0.44
Fe
Zn
Mn
18.95
5.16
8.93
4.41
70.14
7.64
70.85
4.02
11.42
11.51
19.02
24.52
22.31
21.32
27.04
- 6.49
4.48
4.40
1.32
16.86
0.56
24.76
2.42
7.27
8.06
11.97
Fe
29.58
10.82
9.97
0.26
Mn
31.04
9.75
15.05
25.48
1
1
1
1.31
0.22
0.09
0.18
0.08
0.06
0.21
0.92
0.08
0.02
0.04
0.29
0.12
1.47
0.88
2.74
0.09
Zn
0.11
2.95
0.08
14.75
P
1
1
1
15
1
7
6
3
1
40
25
19
17
1
29
1
67
221
79
1
P
15
30
1
101
%N
1
1
1
0.1 8
0.18
0.10
0.1 1
0.29
0.25
0.21
0.34
0.10
0.10
0.11
0.12
0.11
0.15
0.24
0.20
0.12
%N
0.16
0.12
0.15
0.24
1
1
1
pH
%
Textura
5.01
5.72
5.08
6.72
6.36
6.09
5.59
6.43
5.8
6.4
5.97
5.12
5.37
7.64
7.3
7.34
6.1 8
M.O.
2.8
3.77
3.77
2.69
7.93
7.53
6.59
9.01
2.15
2.02
2.55
4.03
3.09
3.5
5.38
2.8
2.29
Franco arcilloso
Arcilloso
Arcilloso
Arcilloso
Arcilloso
Franco arcillosos
Franco arcillo arenoso
Franco arcillo arenoso
Franco arcillo arenoso
Francoarcilloarenoso
Arcilloso
Franco arcillo arenoso
Arcilloso
Arcilloso
Franco
Arcilloso
Arcilloso
1
1
1
1
1
1
8
1
1
pH
%
Textura
5.68
5.82
6.32
6.6
M.O.
3.63
3.36
4.03
6.32
Franco arcilloso
Franco arenoso
Franco arcillo arenoso
Franco arcillo arenoso
En la tabla No. 12 también se puede observar que para el municipio de Jutiapa se
obtuvieron rangos del porcentaje de nitrógeno clasificados como moderados (0.1% a
0.3%), pH en rangos de 6.4 a 7.3, y contenido de materia orgánica de 2% a 5% , suelos
predominantemente arcillosos, existiendo también suelos con textura franco arcillo
arenosos.
En el municipio de El Progreso, se determinó que las cepas aisladas fueron de suelos
Franco arcillo arenosos, con alto contenido de materia orgánica, y pH de 5.5 a 6.5
(ligeramente ácido). Las condiciones para Comapa y Quezada también fueron similares.
En general para el departamento de Jutiapa, se dice que se tienen suelos con características
apropiadas para el cultivo de fiijol y su estado nutricional es apto para su desarrollo.
Para el departamento de Chimaltenango se encontró que el rango de contenido de nitrógeno
en el suelo varió de 0.12 % a 0.24 % lo que represente un moderado contenido del
elemento en el suelo.
El rango de pH va de 5.6 a 6.6, y el contenido de materia orgánica de 3.3% a 6.3%, valor
considerado en la interpretación de resultados de moderado alto a alto. La clase textura1
predominante en las muestras que presentaron aislamiento de Rhizobium fue franco arcillo
arenoso (2 muestras), franco arcilloso (1 muestra) y franco arenoso (1 muestra) .
El pH es uno de los factores que tienen un papel determinante en la relación leguminosarizobio ya que como se cita en la literatura, en la mayoría de las leguminosas la infección
de Rhizobium no ocurre en pH menores a 5, tal y como se puede apreciar en (tabla 8) ya
que el valor más bajo de pH reportado fue de 5.O1
Tanto para el departamento de Jutiapa como para el departamento de Chimaltenango, el
contenido de calcio en el suelo estuvo entre el rango de 5 a 20 mgkg., lo que indica que su
contenido es apropiado para el desarrollo del cultivo ya que las leguminosas son plantas
que demandan de mucho calcio para el proceso de nodulación. Además estimula el
crecimiento del sistema radicular y la formación de nódulos en especies leguminosas
TABLA NO. 13 RESULTADOS OBTENIDOS DE LA CORRELACI~NENTRE EL
CONTENIDO NUTRICIONAL, POTENCIAL DE EIDRÓGENO Y MATERIA DE
LOS SUELOS DONDE SE COLECTARON LAS MUESTRAS DE NÓDULOS DE
DONDE SE AISLO Rhizobium legu
bia(mphusmIi
Para el análisis de correlación se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson y se tomó
para su interpretación una sigdicancia del 5%. (tabla No. 13)
En eta tabla (tabla No. 13), se aprecia que existió una alta correlación entre el contenido de
nitrógeno y el contenido de materia orgánica
(0.01%), que prácticamente es una
correlación perfecta (coeficiente de correlación =1, significancia =0.00%).
En los resultados que se obtuvieron del contenido de materia orgánica (tabla 12), se
observó que el contenido de materia orgánica estaba de moderado a alto, y por estar
correlacionado directamente con el contenido de nitrógeno en el suelo, era de esperarse un
contenido del elemento de moderado a alto, por lo que el contenido de materia orgánica es
un índice que permite estimar aproximadamente las reservas de nitrógeno y de fósforo en el
suelo y su comportamiento en la dinámica de nutrimentos.
También existió una alta correlación entre el elemento calcio y los elemento hierro, fósforo,
nitrógeno, cinc y el contenido de materia orgánica y potencial de hidrógeno. Sin embargo,
la correlación de calcio con hierro es una correlación inversa es decir, que al ir aumentando
el hierro la disponibilidad de calcio en el suelo es menor.
Así mismo, se obtuvo alta correlación del pH con el contenido de calcio, potasio, hierro, y
fósforo; siendo la correlación entre pH y contenido de hierro inversamente proporcional, es
decir que conforme aumenta el pH en el suelo, la actividad del hierro disminuye.
En b ase a 1os resultados o btenidos ( pH 5.5 - 5.9), e 1p H del suelo es a propiado p ara 1a
mayoría de los cultivos porque aquí las interferencias para la absorción de los nutrimentos
esenciales es mínimo, tal y como se muestra en la correlación del pH con el contenido de
calcio, potasio y fósforo.
Dentro de este análisis también se obtuvo que el hierro y el manganeso están
correlacionado significativamente (4.3%).
7. CONCLUSIONES
Se logró colectar un total de 111 muestras de nódulos y de suelos en 25 municipios
de las dos zonas en estudio.
En los municipios de Jutiapa y Chimaltenango, se encontraron 21 cepas de
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, pues fueron capaces de infectar a
plantas de fiijol común en condiciones controladas de laboratorio.
La fertilización nitrogenada química adicionada al cultivo de frijol (Phaseolus
vulgaris) de donde se recolectaron los nódulos, no afectó la formación de los
mismos.
En el departamento Jutiapa en
donde existió mayor porcentaje de cepas
identificadas fueron los municipios de Santa Catarina Mita (6 cepas) y el municipio
de Jutiapa (6 cepas).
Entre los posibles factores responsables del 34 % de aislamientos negativos se
pueden mencionar: el tamaño nodular, la conservación de nódulos, el efecto del
hipoclorito de calcio y el número de análisis efectuados por muestra.
Las cinco cepas (43, 41, 46, 23 y 3 1) que presentaron alta infectividad pertenecen a
los municipios de Santa Catarina Mita, Jutiapa, Quezada y el Progreso del
departamento de Jutiapa.
Trece cepas presentaron alta contaminación por hongos por lo que no existió
respuesta a la infección, lo que limitó el avance del proyecto.
Se efectuaron 111 determinaciones para cada uno de los macro y micronutrimentos,
contenido de pH, contenido de materia orgánica y clase textual, obteniéndose que
la mayoría de las muestras mostraron una fertilidad de moderada a alta.
Las clase texturales predominantes en el departamento de Jutiapa fueron: arcilloso y
franco arcillo arenoso; mientras que en departamento de Chimaltenango fueron:
franco arenosos y franco arcillo arenosos.
Basándonos en los análisis realizados de pH, se estableció que existían condiciones
apropiadas para el desarrollo de Rhizobium (pH mayores de 5).
El aislamiento de bacterias no estuvo correlacionado con el estado nutricional del
suelo donde fueron colectados los nódulos, sin embargo, si existió correlación entre
el contenido nutricional del suelo, contenido de materia orgánica y potencial de
hidrógeno de las muestras de suelo de donde se logró el aislamiento de Rhizobium.
8. RECOMENDACIONES
Realizar estudios de caracterización a las 21 cepas identificadas como Rhizobium
leguminosarum biovar phaseoli, y poder así contar con una fuente orgánica que
sirva como una alternativa para disminuir el uso de fórmulas químicas nitrogenadas
en el cultivo de h j o l .
Que para las muestras donde no se obtuvo respuesta a la infección de plantas por
Rhizobium, se trabaje en lugares que cumplan con las condiciones de asepsia con el
propósito de evitar contaminación por hongos.
Evaluar las cepas aisladas de bacterias del género Rhizobium leguminosarum,
biovarphaseoli en suelos arcillosos y de baja fertilidad, a efecto de observar su
potencial para fijar nitrógeno atmosférico a nivel de invernadero y ensayos de
campo.
Las c epas a isladas deberán c onservarse e n ampollas 1eofilizadas p ara a segurar S u
preservación por períodos mayores de 3 meses.
Repetir los muestreos de sitios en los cuales no se logró el aislamiento de cepas.
Seguir muestreando las diferentes zonas frijoleras del país.
9. BIBLIOGRAFIA
1. Aguilera R. Evaluación del efecto simbiótico de 14 cepas de Rhizobium phaseoli en
tres variedades de frijol negro en Guatemala. Guatemala: Universidad de San
Carlos, (tesis de graduación, Facultad de Agronomía) 1974. 39 p.
2. Anyango B. et al. Diversity of Rhizobia nodulating Phaseolus vulgaris in two
Kenyan soils with contrasting pHs. Appl Environ Microbiol. 1995;61: 40 16-4021.
3. Bartalomew, W.V. 1965. Mineralization and immobilization of nitrogen in the
descomposition of plant and animal residues. Chapter 7 In: Soil Nitrogen.
Bartholemew, W. V. And Clark, F.E. (eds), American Society of Agronomy,
Madison, Winsconsin. U.S.A.
4. Bécquer, C. et al. Caracterización Fisiológica-Bioquímica de cepas de Rizobios,
aislados en leguminosas forrajeras. Rev Biol. 2000;14: 1-1 1.
5. Borardi J, Galar L. Nodulation of Phaseolus vulgaris L. as affected by Rhizobium
phaseoli growth phase. Can J Microbiol. 1988;34: 63-66
6. Campos S. Aislamiento de cepas nativas de Rhizobium phaseoli de 4
departamentos de Guatemala y observación preliminar de su comportamiento en la
variedad San Martín de Phaseolus vulgaris. Guatemala: Universidad de San Carlos
de Guatemala, (tesis de graduación, Facultad de Agronomía) 1986. 38 p.
7. Carrillo H. Evaluación de Fijación de Nitrógeno de 4 cepas de Rhizobium
leguminosarum biovar phaseoli en la variedad de frijol Quinak-ché. Guatemala:
Universidad de San Carlos de Guatemala, ( tesis de graduación, Facultad de
Agronomía) 1990.40 p.
8. Castellanos, M. Efecto del cultivo continuo en la fijación biológica de nitrógeno de
la simbiosis Rhizobium leguminosarum - Phaseolus vulgaris.
Guatemala:
Universidad de San Carlos de Guatemala, ( tesis de graduación, Facultad de
Ciencia Químicas y Farmacia) 1 9 9 0 . 4 9 ~
9. Centro Internacional de Agricultura Tropical
CIAT. Simbiosis leguminosa-
rhizobio; Manual de métodos de evaluación, selección y manejo. Colombia:
Proyecto CIAT-UNDP, Doc. Tec. 1987. 178 p.
10. CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical). 1987. Simbiosis leguminosarizobio. Manual de Métodos de Evaluación, Selección y Manejo CIAT-UNDP de
evaluación, selección y manejo de simbiosis leguminosa-rizobio para aumentar la
fijación de nitrógeno. Sección de Microbiología de Suelos del Programa de Pastos
Tropicales y Sección de Microbiología de Suelos del Programa de Frijol (comps.).
Cali, Colombia. 178p
11. CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical).
1987.
Simbiosis
leguminosa-rizobio: Evaluación, Selección, y Manejo. Guía de estudio. Cali,
Colombia. 72
12. Contreras J. Evaluación de Fijación de Nitrógeno producido por cuatro cepas de
Rhizobium leguminosarum. Guatemala: Universidad de San Carlos de Guatemala,
(tesis de graduación. Facultad de Agronomía) 1988. 30 p
13. EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária). 1991. Métodos de
Pesquisa em Fertilidade do Solo. Brasilia, Brasil. 392p
14. Hara, G. et al. Selection of strains of root nodule bacteria to improve inoculant
performance and increase legume productivity in stressful environments. Australia:
ACIAR, 2002.6 pp.
15. Hirsch A. et al. What makes the Rhizobia-legume symbiosis so special ? Plant
Physiol. 2001;127: 1484-1492.
16. Horton HR, et al. Bioquímica. Hidalgo-Mondragón, trad. México: Prentice-Hall
Hispanoamericana, 1995. xiii+22 p.
17. IAEA/AO (International Atomic Energy Agency & Food Agriculture Organization)
. 1978. Isotopes in Biological dinitrogen fixation. Vienna, Austia. 3 16p
18. IFDCIUNIDO (International Fertilizer Development Center and United National
Industrial Development Organizatio). 1979. Fertilizer Manual IFDC. Reference
Manual R-1 . International Fertilizer Development Center, Muscle Shoals, Alabama,
U.S.A.
19. Martin A. Introduction to Soil Microbiology. 2 ed. United States of America: Wiley
Johns & Sons, 1977.487 p (1 1)
20. Martínez E, Martínez J. Microbios en línea: Rhizobium y su destacada simbiosis
con plantas. Centro de investigación sobre fijación de Nitrógeno, UNAM. 1998.
21. Martinez, E. Diversity Rhizohium-Phaseolus vulgaris simbiosis: overview and
perspectives. Plant and Soil. 2003;252: 11-23.
22. Miyares F. Evaluación de 13 cepas de Rhizobium phaseoli nativas de Guatemala en
variedades de frijol negro Quetzal y Jutiapan. Guatemala: Universidad de San
Carlos de Guatemala, ( tesis de graduación, Facultad de Agronomía) 1997. 29 p.
23. OIEA (Organismo Internacional de Energía Atómica). 1999. Aumento de la
Fijación Biológica del I'JitrÓgeno en el Frijol Común en América Latina. 203p
24. Puurseglove, J.W. 1968. Tropical Crops. Dicotyledons. Longman Group Ltd,
London. 719p
25. Quispel A. The biology of nitrogen fixation. Amsterdam: North-Holland Publishing
Company, 1974.769 p.
26. Soberon-Chávez
G. Isolation from soil of Rhizobium leguminosarum lacking
symbiotic information Can. J. Microbiol. 1989;35:464-468
27. Solis A. Evaluación de la efectividad de inoculación de cepas mixtas de Rhizobium
phaseoli en dos variedades de frijol común. Guatemala: Universidad de San Carlos
de Guatemala, (tesis de graduación, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia)
1980. 55p.
28. Somasegaran P, Hoben H. Methods in legume-Rhizobium Technology. Hawaii,
United States of América: University of Hawaii NiffAL projecta and
MIRCEN,1985.369 p.
29. Strugaard J. Regulators and Regulation of legume root nodule development. Plant
Physiol. 2000;124: 532-540
30. Vincent J. A manual for the practica1 study of root-nodule bacteria. Great Britain:
BURGESS AND SON, 1970. Xi+164 p.
31. Walker N. Soil Microbiology. London, United Kingdom: Buttenvorths, 1975.
262 p
32. Waterose. Microbiological analysis of nitrogen cycle: Isolation and identification of
Rhizobium and Azotobacter. 1998.
10. ANEXOS
ANEXO 1
Clasificación por grupos de Rhizobium
Grupo 1: Rhizobium de crecimiento rápido, productores de ácido con 2-6 flagelos
peritricales. Las colonias miden 2-4 mm. a los 3-5 días de incubación en agar manitollevadura. Aislados de leguminosas de regiones templadas.
ESPECIE
HUESPED
R. leguminosarum
Phaseolus vulgaris
R. trifolii
R. phaseoli
Medicago, Meliloti, Tregonella
Trifolium
Grupo 11: Rhizobium de crecimiento lento, productoras alcalinas, con flagelos, las colonias
son menores de 1 mm de diámetro a los 5-7 días en placas de agar Manitol-levadura.
Nodulan leguminosas tropicales.
ESPECIE
R. japonicum
R. Iipini
Fuente: referencia No. 1
HUESPED
Lupinus, Ornithopus
Vigna, Desmodium, Archis, Centrocema, Stylosanthes, etc
ANEXO 2
Morfología de Rhizobium obtenido directamente de nódulos
FORMA
Recto
CONTORNO
Redondeados
BORDES
TAMAÑO (ancho: LARGO)
parejas, cadenas y en racimo
AGRUPACIONES
negativo
REACCION GRAM
3-5 gránulos púrpuras redondeados dentro
de la bacteria.
OTROS
ANEXO 3
Morfología colonial de Rhizobium
Morfología de las colonias de Rhizobium en agar manitol-levadura incubados a 30 grados
por tres días
-
-
Tamaño
2-4 mm de diámetro
Forma
colonia circular
Pigmentación
blancas opacas ó leñosas translúcidas
Elevación
Elevadas o planas
Borde
liso
Superficie
lisa
Estructura
amorfa
Consistencia
viscosa
Fuente: referencia No. 1
ANEXO 4
GUIA PARA LA INTERPRETACION DE ANALISIS DE SUELOS
RANGO
CmoYKg. =
m e q 1 1 0 0 g suelo
MEDIO
4-20
ALTO
>20
0.6-2.0
2.1-4.5
>4.5
ácido
5.6-6.5
neutro
6.6-7.3
Mglkg. = ppm
1
% Materia
1
pH
1
Fuente: Kass, D. Fertilidad de Suelos
alcalino
7
.
4
8
.
3
1
l
ANEXO 5
AISLAMIENTO DE Rhizobium
Los nódulos desecados se deben rehidratar antes de esterilizarlos. Colocar los
nódulos en vasos de precipitar pequeños con agua estéril fna y dejar en el
refrigerador toda la noche para que la absorban.
Sumergir los nódulos intactos y sin daño 5-10 segundos en etanol al 95 %.
Transferirlos a una solución de hipoclorito de calcio al 3 % y dejar por 4-6 minutos.
Lavar en 5 recipientes estériles con agua estéril ( se pueden utilizar cajas de petri
plásticas).
Romper 1os n ódulos e n una gota d e agua e stéril e n una caja d e p etri. S embrar 1a
suspensión nodular en agar Manitol-levadura más azul de bromotimol. Flamear
entre cada estiada.
Incubar a 25-30 grados centígrados en oscuridad, 4 a 10 días. Buscar colonias
aisladas típicas de Rhizobium.
Aislar cada colonia diferente en agar levadura manitol más azul bromotimol.
Incubar y observar diariamente la aparición de colonias típicas de Rhizobium.
o Azul de bromotimol: un color amarillo debido a la producción de ácido
de Rhizobium de crecimiento rápido.
Se deben leer 3-5 días después para los de crecimiento rápido.
Realizar gram y montajes en fresco para observar movilidad.
Transferir a tubos de cultivo con caldo manitol levadura.
Incubar a 25 grados centígrados por 3-5 días.
IDENTIFICACIÓN DE Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli
La identificación se realizará por medio de la infección de Phaseolus vulgaris por las
cepas aisladas.
Se utilizarán bolsas de crecimiento hechas de propileno aproximadamente de 16" 18
cm, con una hoja de papel adsorbente en el interior y un canal hecho del mismo
papel en el borde superior.
Colocar en el interior de la bolsa 50 m1 de solución nutriente para planta.
Esterilizar la superficie las semillas:
o Seleccionar semillas de viabilidad buena, libres de daño; si se ha usado
pesticida, estas deben ser lavadas con agua y secadas con papel absorbente.
o Colocar las semillas en erlenmeyer autoclaveado y cubrirlo con una caja de
petri estéril.
o Lavar las semillas en alcohol al 95% por 10 segundos, quitar alcohol.
o Agregar hipoclorito de calcio al 3% en volumen suficiente para cubrir todas
las semillas, mezclar y dejar 5 minutos. Descartar la solución.
o Lavar con agua estéril, 6 veces.
o Agregar suficiente agua y c olocar las semillas e n el r efrigerador para que
absorban el agua por 4 horas.
Trasladar asépticamente las semillas a una caja de petri que contenga dos láminas de
papel filtro esterilizado ( 20 semillas por caja de petri ).
Dejar las semillas 24 a 48 horas hasta que germinen
Seleccionar las semillas germinadas y de radículas de 1- 1.5 cm. de largo.
Colocar las semillas esterilizadas y pregerminadas en un en la bolsa de crecimiento,
con la raíz en el interior de la bolsa.
Se dejan 5-7 días las plantas
PREPARACIÓN DEL INÓCULO: La técnica utilizada para esto es la sugerida por
Vincent y Somasegaran
o Suspensión inicial: A partir del cultivo puro obtenido de las cepas aisladas
sospechosas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, tomar 10 asadas
de las colonias y colocarlas en 5 ml. de caldo manitol-levadura (ML).
o A partir de la suspensión inicial se realizarán seis diluciones 1 5 , seriadas,
con cuatro repeticiones para cada dilución, de la manera siguiente:
Dilución 1: lrnl de suspensión inicial para cada bolsa de
crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 5 : 1 m1 d el anterior + 4 m1 d e caldo M L. 1 m1 p ara
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 25: lml del anterior
+ 4ml de caldo ML. lrnl para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 125: lrnl del anterior + 4ml de caldo ML. lrnl para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 625: lrnl del antenor + 4ml de caldo ML. Iml para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dilución 3 125: lrnl del antenor + 4ml de caldo ML. lrnl para
cada bolsa de crecimiento ( 4 repeticiones).
Dejar 3 semanas con luz permanente las bolsas y observar la presencia de nódulos.
Se utilizaran como control positivo: una bolsa de crecimiento con nitrógeno
inorgánico. Y como control negativo: bolsa de crecimiento sin inocular.
Las cepas se conservarán en tubos con agar manitol-levadura y aceite mineral en la
superficie
11. FOTOGRAFIAS
FOTO 1. CONSERVACION DE NODULOS COLECTADOS
FOTO 2. AISLAMIENTO DE CEPAS DE RHIZOBIUM
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FOTO 3. DESINFESTACIQN DE LA SEMILLA DE W O L
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FOTO 5. PREGERMINADO DE SEMILLAS
FOTO 6. BOLSAS DE CRECIMIENTO PARA COMPROBACION DE Rhizobium
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FOTO 7. NODULOS DE Rhizobiurn leguminmararm biovarphaseoli
FOTO 8. NODULOS DE RIrizobUrm kguminmamm b i o v a r p h d i
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FOTO 9. CONSERVACION DE CEPAS
FOTO 10. INGRESO Y CODIFICACION DE MUESTRAS PARA ANALISIS DE
SUELOS.