significación clínica y métodos de detección de kras en neoplasias

SIGNIFICACIÓN CLÍNICA Y
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE
KRAS EN NEOPLASIAS
CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A
DISTANCIA 2010-2011
TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO
Nº 2
I.S.S.N.- 1988-7469
Título: Taller del Laboratorio Clínico
Editor: Asociación Española de Biopatología Médica
Maquetación: AEBM
Fecha de Distribución: diciembre de 2010
Significación clínica y métodos de
detección de KRAS en neoplasias
Ainoha García Claver (1), Raquel Ramos Corral (1), Maria Jesús Cuesta
Rodríguez (1), Concepción Tapia-Ruano Díaz-Quetcuti (2) .-(1)Residente
de Análisis Clínicos/Bioquímica Clínica, (2) FEA Análisis Clínicos. Hospital
Virgen de la Salud, Toledo.
1. INTRODUCCIÓN
El cáncer surge por la acumulación gradual de alteraciones genéticas que llevan a la
transformación progresiva de células humanas normales en derivados de gran
malignidad. Esta transformación resulta en alteraciones esenciales de la fisiología
celular que determinan un crecimiento celular descontrolado, que puede ocasionar
invasión tisular y metástasis (1).
Ras fue el primer oncogén identificado (Figura 1). Los oncogenes son, en realidad,
formas mutadas de genes normales (llamados proto-oncogenes)
que originan
proteínas con función alterada, estimulando el crecimiento o la invasividad celular(2).
La familia Ras son los oncogenes con mayor índice de mutación en el cáncer
humano. La activación aberrante de Ras por mutación génica, expresión excesiva de
la proteína o desregulación de las señales de los factores de crecimiento está
implicada en casi todos los aspectos de la malignización celular, incluidas la
proliferación, invasión y metástasis (1).
421
Figura 1: Descubrimiento cronológico de Ras (3).
2. ESTRUCTURA, FUNCIÓN Y ESPECIFICIDAD DE LAS ISOFORMAS RAS
Las proteínas Ras son un prototipo de una gran familia de GTPasas. Estas proteínas
modulan muchos aspectos de la conducta celular, como la proliferación,
diferenciación, supervivencia y apoptosis, así como la motilidad celular y la
fagocitosis.
Las proteínas Ras clásicas están codificadas por tres genes Ras localizados en los
cromosomas humanos 11 (HRAS), 1 (NRAS) y 12 (KRAS). Todas las proteínas se
sintetizan
como
precursores
citosólicos
que
experimentan
modificaciones
postranslacionales. Las 3 proteínas Ras clásicas comparten aproximadamente el 85%
de la secuencia de aminoácidos y la mayoría de las diferencias se encuentran en el
extremo carboxi-terminal. Esto se correlaciona con las diferencias funcionales de las
isoformas Ras. La mayoría de las mutaciones se produce en el gen KRAS; mientras
que las mutaciones en el NRAS son menos frecuentes y en el HRAS, infrecuentes.
Específicamente, las mutaciones en el KRAS humano se encuentran en casi todos los
adenocarcinomas pancreáticos y son frecuentes en los cánceres de pulmón y
422
colorrectal (CCR). En cambio, las mutaciones NRAS son comunes en la leucemia y las
HRAS sólo aparecen en algunos tipos de cánceres de vejiga y riñón (1).
3. RUTA DEL EGFR (EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR)
El EGFR es un miembro de la familia erbB/HER de receptores tirosina quinasa. Esta
glicoproteína transmembrana esta compuesta por un dominio de unión extracelular,
un dominio transmembrana lipofílico y un dominio tirosina quinasa intracelular.
Participa en la señalización intracelular que regula el crecimiento celular, la
diferenciación, la proliferación y la muerte celular programada (4,5). El factor de
crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-α)
se unen selectivamente a los receptores EGFR.
Las tres rutas principales que cumplen un papel fundamental en la transformación y
tumorigénesis desencadenadas por el oncogén Ras son la ruta Ras/Raf/MAPK/ERK, la
ruta dependiente de la PI3K/Akt y la ruta Jak2/STAT3 (1).
3.1 Ruta Ras/Raf/MAPK/ERK
Cuando el ligando extracelular (EGF) se une al EGFR se produce dimerización de
éste, lo que da lugar a la activación de la tirosina quinasa de su extremo C-terminal
(Figura 2). Los residuos de fosfotirosina del receptor activado son reconocidos por
proteínas que poseen dominios SH2 o dominios PTB. A través de dos mediadores
(Grb2 y Sos1/2) el EGFR activado intercambia el GDP del RAS, por GTP, activando
esta proteína, que dirigirá su señal al núcleo a través de otras serin-treonin quinasas
(Raf, MAPK/ Erk). La consecuencia de esta activación será la diferenciación,
proliferación o apoptosis celular.
423
Figura 2: Ruta Ras/Raf/MAPK/ERK. Adaptado de Mancl et al (6).
4. MUTACIONES EN KRAS EN CÁNCERES HUMANOS
Las mutaciones de KRAS más comunes se encuentran en los codones 12, 13 y 61,
que corresponden al dominio de unión GTP/GDP de la proteína. Estas mutaciones
alteran la actividad GTPasa de KRAS, permitiendo que se mantenga constantemente
en un estado activado. La consecuencia de estas mutaciones es que aumenta el
porcentaje de activación KRAS en la célula,
estimulando la ruta de señalización
RAS/RAF/MAPK de manera permanente, promoviendo la proliferación celular e
incrementado la supervivencia, así como otros efectos pre-tumorigénicos (7).
Las mutaciones de KRAS están presentes en aproximadamente el 30% de los
cánceres del ser humano, principalmente en el CCR y cáncer de pulmón, páncreas y
endometrio (8). Vamos a comentar el papel de KRAS en cada una de estas
neoplasias.
424
4.1 Cáncer Colorrectal y KRAS
La cirugía es el único tratamiento curativo del CCR localizado. Sin embargo, la
mayoría de los enfermos no son inicialmente candidatos a la resección de la
enfermedad metastásica, y el tratamiento de elección es el sistémico con
quimioterapia. En la actualidad los agentes terapéuticos que han demostrado
actividad clínica son tres fármacos quimioterápicos (5-fluorouracilo, oxaliplatino e
irinotecán) y tres fármacos “biológicos”, anticuerpos monoclonales que actúan por
una vía diferente a la interferencia con la replicación del ADN: bevacizumab
(inhibidor de la actividad del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF)) y
cetuximab y panitumumab (inhibidores de la actividad del EGFR) (9).
Varios estudios han confirmado que la tasa de mutaciones de KRAS en CCR es
aproximadamente del 40%, localizándose casi exclusivamente en el codon 12 y 13.
La identificación de mutaciones de KRAS es de gran importancia clínica para el
tratamiento del CCR. Existen numerosos estudios y ensayos clínicos que comprueban
la distinta efectividad de combinaciones quimioterápicas en función del estado de
KRAS. Los más importantes son: el ensayo clínico de fase II denominado CRYSTAL
(Cetuximab e Irinotecan como primera línea de tratamiento en el CCR metastásico) y
el ensayo OPUS (Oxaliplatino y Cetuximab como primera línea de tratamiento en el
CCR metastásico). Estos ensayos evalúan la eficacia del Cetuximab junto con el
Irinotecan o con el Oxaliplatino respectivamente basándose en el estado de KRAS. En
ambos, en los pacientes con el genotipo salvaje (wild-type, wt) la adición de
Cetuximab al tratamiento quimioterápico aumentaba significativamente la mediana
de la supervivencia libre de progresión así como la tasa de respuesta. Sin embargo,
en los pacientes con KRAS mutado no se obtenía ningún beneficio al añadir
425
cetuximab al tratamiento (10). Por tanto, la identificación de mutaciones de KRAS en
pacientes con CCR metastásico puede utilizarse como marcador de ausencia de
respuesta a los inhibidores del EGFR. En estos pacientes la determinación del estado
de KRAS antes de iniciar el tratamiento resulta muy útil para decidir el régimen de
quimioterapia ya que si presentan el genotipo mutado no se aconseja administrar los
inhibidores de EGFR (10).
4.2 Cáncer de pulmón y KRAS
La frecuencia de mutaciones en el codón 12 o 13 del gen KRAS en el cáncer de
pulmón oscila entre un 90% en los adenocarcinomas y un 97% en NSCLC (Non small
cell lung cancer).
De igual modo que en el CCR, la presencia de mutaciones KRAS en pacientes con
cáncer de pulmón se ha identificado como un factor pronóstico negativo de la
respuesta al tratamiento con los inhibidores de EGFR (erlotinib, cetuximab,
panititumab) (11). Por tanto, los tumores que muestren la forma wt del gen KRAS
tendrán mejor respuesta a este tratamiento que los que tengan el gen mutado.
4.3 Cáncer de páncreas y KRAS
Más del 85% de los casos de cáncer de páncreas (CP) ductales presentan una
mutación KRAS en un estadio temprano. Por ello, se ha propuesto la detección de
mutaciones en el líquido duodenal o en jugo pancreático como una estrategia de
diagnóstico temprano de este tipo de neoplasia (12).
La mutación puntual de KRAS a nivel del codón 12 es la alteración molecular más
habitual en el CP, detectándose en el 75%-90% de los casos. Esta mutación actúa
promoviendo la angiogénesis, y por tanto la diseminación local y metastásica, por
sobreexpresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). A nivel
426
práctico, la detección de KRAS mutado en secreciones pancreáticas obtenidas
mediante colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE) puede establecer
el diagnóstico precoz de un CP, incluso en los casos radiológicamente indetectables,
con incremento del número de pacientes subsidiarios de resecciones curativas, y
establecer el diagnóstico diferencial con la pancreatitis, ya que en esta última no se
han encontrado mutaciones KRAS (13).
4.4 Cáncer endometrio y KRAS
Se ha observado la presencia de mutaciones en el codon 12 de KRAS entre el 1030% de los cánceres de endometrio. La presencia de estas mutaciones sugiere que
podrían estar relacionadas con el desarrollo y/o la progresión de estos tumores (14).
5. TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE KRAS
Cómo se ha dicho anteriormente, el 98.4% de las mutaciones del gen KRAS están
comprendidas en los codones 12 y 13 (del exón 1). Esta localización tan conservada
facilita en gran medida su estudio, ya que no es necesario estudiar toda la extensión
del gen.
Las técnicas de detección de mutaciones en KRAS se pueden dividir principalmente
en dos grupos según la estrategia utilizada:
-
Técnicas de secuenciación directa
-
Técnicas de cribado por PCR (convencional o cuantitativa)
5.1 Secuenciación directa
La secuenciación directa consiste en determinar cada uno de los nucleótidos que
componen un determinado fragmento de DNA. Por comparación de la secuencia
obtenida con la secuencia real (que se puede obtener en la base de datos OMIM®)
se pueden identificar todas las mutaciones contenidas en el fragmento secuenciado.
427
Existen dos técnicas mayoritarias de secuenciación: el método dideoxi y la
pirosecuenciación.
La secuenciación por el método de los nucleótidos “dideoxi”, fue ideada por
Sanger en el año 1977. Es la técnica de secuenciación más extendida, pero también
tiene un alto coste y requiere bastante tiempo de trabajo.
La pirosecuenciación, es algo más rápida que el método anterior ya que se utiliza
para secuencias cortas de nucleótidos (40-50 pb). Consiste en seguir la reacción de
la secuenciación a tiempo real. Esto se consigue añadiendo a la mezcla de
amplificación enzimas (sulfurilasa, apirasa, luciferasa) que convertirán el pirofosfato
liberando en la unión de cada desoxirribonucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dTTP,
dCTP) a la cadena en crecimiento, en señales luminosas. Estas señales se captarán
con un detector que generará una serie de picos de intensidad de luz (pirograma),
que podremos identificar con cada una de las bases (Figura 3). Ésta metodología es
favorable para el análisis de muestras en parafina, ya que el DNA que se obtiene
está muy fragmentado. Existen diversos estudios que utilizan la secuenciación para la
detección de mutaciones en KRAS (15).
Figura 3. Pirograma de codon 12 del gen KRAS. El primero representa la secuencia
original y el segundo una mutación G>T. Modificado de Ogino et al (15).
428
5.2 Cribado de mutantes por PCR.
Existen numerosas variantes para analizar los posibles polimorfismos de KRAS
mediante amplificación del DNA por PCR. A continuación, se incluyen algunos de los
más utilizados.
5.2.1 PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
Los polimorfismos genéticos suponen distintas variantes para una determinada
secuencia del DNA, que coexisten en la naturaleza. A veces estos polimorfismos
tienen efecto sobre el fenotipo, causando la aparición de alelos mutantes pero otras
veces no tienen efecto, por lo que pasan desapercibidos. Algunos de estos
polimorfismos pueden analizarse mediante el análisis de fragmentos de restricción,
cuando la zona del polimorfismo coincide con la diana de una enzima de restricción.
En este caso, se podrá diferenciar la presencia de alelo mutado o silvestre, según se
produzca el corte o no por la enzima, analizando los fragmentos de DNA resultantes
de la digestión en un gel de agarosa.
Este es uno de los métodos propuestos para el análisis de mutaciones de KRAS (8)
mediante PCR-RFLP con los siguientes pasos:
1. Se realiza una primera PCR con cebadores que introducen sitios de restricción
para las enzimas BstXI (corta el codon 12 silvestre) y XcmI (corta en codon 13
silvestre).
2. A continuación, se digieren los productos de esta PCR con las enzimas
anteriores, que cortan el DNA wt.
3. En una segunda PCR se continúa la amplificación sólo de los fragmentos
mutados porque están intactos.
429
Esta técnica permite hacer un cribado para establecer presencia o ausencia de
mutación en codones 12 y 13 de KRAS pero no indica cuál es la mutación, para lo
que habría que realizar una secuenciación del amplicón mutante.
Este tipo de análisis se ha llevado a cabo en muestras frescas de tejido obtenido a
partir de biopsias de CCR o metástasis hepáticas. La ventaja de esta técnica es que
no necesita un equipamiento excesivo, sólo un termociclador y geles de agarosa para
analizar los resultados. Como desventajas encontramos el uso de bromuro de etidio
(producto para el revelado del gel que es cancerígeno), la necesidad de hacer dos
PCR y que no identifica las mutaciones, como se ha explicado antes.
5.2.2 Análisis de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
Está técnica de PCR está basada en la distinta movilidad electroforética que tienen
dos cadenas sencillas de DNA que difieren en un único nucleótido. El esquema de
reacciones en este método es el siguiente (Figura 4):
1. Se realiza una PCR convencional de KRAS
2. Tras la amplificación, el DNA es desnaturalizado por calor.
3. Al disminuir la temperatura bruscamente, el DNA se renaturaliza favoreciendo la
formación de estructuras intracatenarias, que vendrán definidas por la propia
secuencias de bases.
4. Luego, los fragmentos obtenidos se separan en un gel de agarosa o
poliacrilamida.
5. Los distintos fragmentos tendrán movilidades electroforéticas distintas, que se
pueden identificar, por comparación con controles de KRAS salvajes y mutantes.
6. Para la visualización de los fragmentos, se utilizan cebadores con marcadores
fluorescentes (16).
430
Figura 4. Análisis de SSCP-PCR modificada de http://nationaldiagnostics.com
5.2.3 Hibridación en fase reversa
Esta técnica está basada en la amplificación por PCR de las muestras a analizar y la
posterior hibridación reversa de los fragmentos obtenidos sobre una tira de
nitrocelulosa que tiene fijados oligonucleótidos específicos para las variantes alélicas
o mutaciones conocidas del gen. Los cebadores de la PCR están unidos a biotina,
que permite el posterior revelado de la tira con un conjugado estreptavidinafosfatasa alcalina.
Este tipo de ensayo es en el que está basado el KRAS stripassay™ de ViennaLab
Diagnotics Gbmh (Figura 5), distribuido por IZASA en España (17). Este kit permite
detectar 10 mutaciones de los codones 12 y 13 de KRAS. Contiene reactivos para 20
tests y el tiempo de obtención de resultados es de 6 horas, una vez que se tiene el
DNA extraído. También cuenta con un sistema de escaneado de las tiras y un
software analizador de imágenes para evitar subjetividades en la interpretación de
las tiras.
431
Figura 5. Tiras de hibridación modificada de KRAS stripassay™ de ViennaLab
Diagnotics Gbmh
5.2.4 PCR cuantitativa
Las técnicas de PCR convencional se están sustituyendo por las técnicas de PCR
cuantitativa (RT-PCR), que permite monitorizar todo el proceso de la
amplificación, en lugar de medir el producto final como en la PCR original. Para ello,
los nuevos termocicladores contienen detectores capaces de medir la fluorescencia
emitida en cada uno de los ciclos de PCR por las moléculas específicas utilizadas para
detectar el DNA de interés.
La RT-PCR tiene una mayor sensibilidad que la
convencional y es más reproducible y precisa.
Los marcadores fluorescentes que se puede utilizar son de dos tipos:
-
no específicos: se utiliza un agente intercalante que se une a las moléculas
de DNA de doble cadena que se forman durante la PCR. El más utilizado es el
SYBR Green I, que se excita a 497 nm y emite a 520 nm.
432
-
específicos: son oligonucleótidos diseñados para hibridar específicamente
con una diana de DNA. Éstos llevan dos moléculas señal: el fluoróforo (F) y el
quencher (Q).
El análisis de “melting” o HRM (High Resolution Melting) es una RT-PCR que
utiliza agentes fluorescentes, como el SYBR GreenI, que se unen de manera
inespecífica a la doble hebra de DNA (como el bromuro de etidio en la PCR
convencional). En esta reacción, se mide la emisión de fluorescencia del marcador
conforme se desnaturaliza la doble hebra al ir aumentando la temperatura. La
temperatura de desnaturalización o de “melting” (Tm) es característica de una
determinada secuencia de DNA ya que depende del contenido GC, del número de
pares de bases, de la secuencia y la heterocigosidad. Así, la modificación de la Tm de
un fragmento de un gen conocido, nos indica que hay un cambio de bases. El
análisis de curvas melting por comparación de las Tm de las muestras problema
puede servir de cribado para estudiar en qué pacientes hay mutación o no de KRAS
(Figura 6). En este caso, el resultado obtenido es de presencia o ausencia de
mutación.
Sin embargo, si se quiere conocer la mutación concreta, habría que secuenciar en
aquellos casos en los que el cribado por HRM, haya indicado alteración de la
secuencia original.
433
Figura 6. Curvas de HRM para detección de mutaciones de KRAS. Las distintas
mutaciones muestran modificaciones en la Tm y por tanto presentan modificación en
la curva respecto a la del gen no mutado (Adaptado de Simi et al (18)).
Existen diversos protocolos de HRM para detección de KRAS en cáncer de pulmón
(19), CCR (18) y de páncreas. Se puede aplicar para muestras de parafina, o dada la
alta sensibilidad de la técnica, también para preparaciones citológicas, como lavados
broncoalveolares (19).
Kit de mutaciones del gen KRAS de TheraScreen®
El kit está basado en un ensayo RT-PCR que permite detectar siete mutaciones en
los codones 12 y 13 del oncogen KRAS (Tabla 1). Este kit, que es el primero que
tiene marcado CE para uso diagnóstico clínico, se realiza sobre muestras de tejido
colorrectal fijado en formalina e incluido en parafina. Está basado en dos tecnologías
ARMS® y Scorpions®.
434
Mutación
Gly12Ala
Gly12Asp
Gly12Arg
Gly12Cys
Gly12Ser
Gly12Val
Gly13Asp
Cambio de base
GGT>GCT
GGT>GAT
GGT>CGT
GGT>TGT
GGT>AGT
GGT>GTT
GGC>GAC
Tabla 1. Mutaciones detectadas mediante el kit Therascreen.
Este kit está indicado para su uso en dos sistemas de PCR
a tiempo real:
LightCycler®480 de Roche Diagnostics o el ABI7500 de Applied BioSystems. En el
caso del primero, cuenta también con un programa específico para el análisis de
mutaciones con este kit, LightCycler® Adapt Software v1.1. Este programa permite
automatizar el análisis de los resultados evitando subjetividades (10).
El kit está compuesto por ocho reacciones distintas:

Ensayo control: amplifica una región del exón 4 del gen KRAS, para valorar
la presencia de DNA en la muestra

Siete ensayos de mutación: contiene dos cebadores para cada mutación,
uno ARMS® (Amplification Refractory Mutation System) y otro Scorpions®
(Figura 7).
Figura 7. Esquema de los primers utilizados en kit Therascreen® (imagen
modificada de http://www.dxsdiagnostics.com/)
435
Además, en cada una de estas 8 mezclas de reacción se añade un control interno
de reacción que permite detectar la existencia de inhibidores de reacción que puedan
ocasionar falsos negativos (Figura 8).

Los cebadores tipo ARMS® están diseñados para anillar o hibridar
específicamente con la zona de DNA mutada, permitiendo que la Taqpolimerasa inicie la elongación. Este cebador no permitirá que haya
amplificación del alelo wt.
Este kit es altamente selectivo y puede detectar aproximadamente el 1% de
mutación sobre un fondo de DNA nativo. Tiene un límite de detección de 5-10
copias. Tiene una mejor sensibilidad y límite de detección si comparamos con la
secuenciación por terminadores.
Figura 8. Secuencia de reacción en la RT-PCR, con la tecnología utilizada por DxS
Diagnostics. (imagen modificada de http://www.dxsdiagnostics.com/)
436
6. RECOMENDACIONES PARA LA DETECCIÓN DE KRAS
Existen unas recomendaciones clínicas provisionales de la ASCO (American Society of
Clinical Oncology) (21) en las que se indica a qué pacientes debe dirigirse el test de
mutación en KRAS, el tipo de muestra y la técnica recomendada a utilizar:
-
Objetivo del test: Se debería realizar un estudio del estado mutacional de
KRAS en un laboratorio acreditado (CLIA) de los tumores de todos los
pacientes con carcinoma colorrectal metastático que sean susceptibles de ser
tratados con anticuerpos monoclonal anti-EGFR.
-
Resultado del test: Si se encuentran mutaciones en el codon 12 o 13,
se debería descartar la terapia con anti-EGFR
-
Muestras a estudiar:
o Las muestras tumorales deben ser seleccionadas por un patólogo, para
incluir mayoritariamente células tumorales, sin necrosis ni inflamación.
o Se pueden enviar muestras frescas congeladas o muestras fijadas en
parafina.
-
Tipos de ensayos recomendados:
o El DNA se extraerá por protocolos estandarizados y específicos de cada
laboratorio
o RT-PCR. Se deben usar sondas específicas para las mutaciones más
frecuentes en los codones 12 y13.
o Secuenciación directa del exon 1.
o En EEUU, no hay kits aprobados por la FDA. En Europa, TheraScreen
tiene marcado CE para uso de diagnóstico clínico.
437
-
Informe de resultados:
o KRAS normal: No se han encontrado mutaciones. (Especificar el tipo
de ensayo y los controles utilizados)
o KRAS anormal: Se ha encontrado mutaciones. El tratamiento con
anticuerpo monoclonal anti-EGFR no está recomendado según las
recomendaciones provisionales de la ASCO. (Especificar el tipo de
ensayo y los controles utilizados).
La importancia de la presencia de mutaciones en KRAS en algunos tipos de cáncer,
especialmente en cuanto a tratamientos con inhibidores de EGFR, ha sido probada
en numerosos estudios, como se ha mostrado en esta revisión. Los laboratorios
clínicos deberían considerar ampliar sus carteras de servicios incluyendo técnicas de
detección de mutaciones de KRAS ya que constituyen una buena herramienta para el
diagnóstico y el tratamiento de estos pacientes.
438
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